JP4854878B2 - レーザー顕微鏡 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、それぞれ異なる振動数を有する基準レーザービームとストークスビームとを試料に照射して、試料から得られる反ストークスビームを検出して、像を得るレーザー顕微鏡に関する。
【０００２】
【従来の技術】
これまで、医学、生物の研究分野では、細胞機能の研究が盛んに行なわれてきた。近年では、細胞機能だけを研究するのではなく、問題とする機能とタンパク質分子構造との関係を直接観察する要求が高まりつつある。
【０００３】
ところで、分子の指紋と呼ばれるラマン散乱光を直接観察する方法は、広く用いられている。特に、試料からの蛍光を容易に除去できる、ＣＡＲＳ（Ｃｏｈｅｒｅｎｔ Ａｎｔｉ−Ｓｔｏｋｅｓ Ｒａｍａｎ Ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ）分光が注目されている。これは、基準レーザービームとストークスビームとを試料に照射し、試料から得られる反ストークスビーム（反ストークスラマン散乱光）を検出するものである。
【０００４】
図５および図６に示すように、特公平４−５１７８４号公報には、レーザー計測装置１００が開示されている。このレーザー計測装置１００は、レーザー光源として、波長１０６４ｎｍのレーザービームを発振するパルスＹＡＧレーザー１０２を備えている。このレーザー１０２の前方には、レーザービームの波長を５３２ｎｍに変換し、基準レーザービームω１１（波長λ１１）を出射させる第２高調波発生器１０４が設けられている。このビームω１１の光路上には、ビームスプリッタ１０６がビームω１１を２方向に分割するように配置されている。このビームスプリッタ１０６に入射されたビームω１１は、反射ビームω１１と透過ビームω１１’とに分割される。
【０００５】
反射ビームω１１の光路上には、この反射ビームω１１を反射させる、ミラー１０８が設けられている。
前記透過ビームω１１’の光路上には、このビームω１１’を振動数の異なるストークスビームω２２（波長６０７ｎｍ）に変換して出射させる、色素レーザー１１０が設けられている。そして、ストークスビームω２２の光路上には、このストークスビームω２２の横断面パターンを半分遮断し、半円形にするナイフエッジ１１２が配置されている。
【０００６】
そして、これら基準レーザービームω１１とストークスビームω２２との光路上の交叉したところには、基準レーザービーム（反射ビーム）ω１１を透過し、ストークスビームω２２を反射して１本のビームω１１，ω２２にする、ダイクロイックミラー１１４が設けられている。
このビームω１１，ω２２の光路上には、ビームω１１，ω２２を所定の距離で集光するレンズ１１６が設けられている。そして、この集光位置には、試料Ｍが配設されている。この試料Ｍには、ビームω１１，ω２２が照射され、この試料Ｍから反ストークスビームω３３が発生される。なお、試料Ｍを透過するビームには、反ストークスビームω３３の他に、基準レーザービームω１１およびストークスビームω２２が含まれている。
【０００７】
これらビームω１１，ω２２，ω３３の光路上には、これらビームω１１，ω２２，ω３３を平行光にするレンズ１１８が設けられている。また、これらビームω１１，ω２２，ω３３の光路上には、基準レーザービームω１１およびストークスビームω２２の混合部のみを遮断するナイフエッジ１２０が設けられている。そして、これらビームω１１，ω３３の光路上には、基準レーザービームω１１のみを遮断する適当な波長選択器１２２が配設されている。
そして、残された反ストークスビームω３３の光路上には、反ストークスビームω３３を反射する２つの反射ミラー１２４が設けられている。また、このビームω３３の光路上には、反ストークスビームω３３をスペクトルに分光する分光器１２６が設けられている。そして、この分光器の前方には、検出器１２８が設けられており、分光されたスペクトルが検出される。
さらに、この検出器１２８には、ミニコンピュータ１３０が接続されている。
また、このミニコンピュータ１３０には、画像表示装置１３２が接続され、検出器１２８で検出されたスペクトルは、ミニコンピュータ１３０を用いて電気信号に変換され、この信号が画像表示装置１３２で表示される。
【０００８】
これらビームω１，ω２，ω３の位相を整合するための調整は、上記の構成からナイフエッジ１２０が除かれ、基準レーザービームω１１の横断面パターンに含まれる全ての反ストークスビームω３３が検出されて、行なわれる。この調整が行なわれた後、ナイフエッジ１２０によって、基準レーザービームω１１とストークスビームω２２との混合部のみが遮断されて、空間上の微小な交叉点から生じる空間分解能の高い反ストークスビームω３３が容易に得られる。
【０００９】
従って、このレーザー計測装置１００は、基準レーザービームω１１（波長λ１１）の横断面パターンの一部にストークスビームω２２（波長λ２２）が混合されて、試料Ｍに入射される手段を備えている。また、出射側では、基準レーザービームω１１とストークスビームω２２との混合部のみが遮断され、その他の基準レーザービームω１１の横断面パターンに含まれる反ストークスビームω３３が抽出される手段を備えている。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
このような構成は、空間分解能の高い最小交叉角法を精度良く調整することに関するものである。しかしながら、基本的に、光学軸のミスアライメントが生じる可能性を除くことができない。例えば、理想的な調整が行なわれたとしても、環境温度の変化や振動などの影響でミスアライメントが生じる可能性がある。このため、基準レーザービームω１１とストークスビームω２２との出射方位が一致していても、ミスアライメントが生じる可能性がある。
【００１１】
従って、ミスアライメントによって、反ストークスビームの強度が弱められてしまうだけでなく、反ストークスビームの発生に寄与しない基準レーザービームとストークスビームとがノイズ成分として検出されてしまう可能性がある。すなわち、反ストークスビームの検出において、ＳＮ比の低下をまねくという欠点を有する。
【００１２】
また、従来技術では、ミスアライメントを生じると、反ストークスビームの発生に寄与しない基準レーザービームとストークスビームとが試料に照射されてしまうことがある。このため、試料が化学物質の場合はまだ良いが、生きた細胞や組織の場合は、これら２つのビームで試料にダメージを与えてしまう可能性がある。
【００１３】
本発明は、このような事情によりなされ、ミスアライメントの発生を抑えることができるとともに、反ストークスビーム（反ストークスラマン散乱光）を安定して高いＳＮ比で検出することができる、レーザー顕微鏡を提供することを目的とする。
【００１４】
また、本発明は、反ストークスビームの生成に寄与する基準レーザービームおよびストークスビームのみが試料に照射され、生きた細胞や組織を観察するのに最適なレーザー顕微鏡を提供することを目的とする。
【００１５】
【課題を解決するための手段】
上記課題を解決するために、本発明によるレーザー顕微鏡は、それぞれ異なる振動数を有する基準レーザービームおよびストークスビームを出射させるレーザー光源と、反ストークスビームを試料から得るためのこれら２つのビームを、対物レンズを介して試料上に集光して照射する照射手段と、試料からの反ストークスビームを導き、かつ前記基準レーザービームおよびストークスビームを遮断するビーム選択手段と、試料からの反ストークスビームを検出する光検出器とを備えている。そして、前記基準レーザービームおよびストークスビームは、前記レーザー光源と照射手段との間に配設された共通の光ファイバーの入射端に入射され、この光ファイバーに入射された２つのビームは、出射端から出射されて、前記照射手段に導かれることを特徴とするものである。
【００１６】
また、前記照射手段は、対物レンズを介して前記基準レーザービームおよびストークスビームを前記試料上で集光して、試料上を走査させる走査手段を備えていることを特徴とするものである。
【００１７】
さらに、前記照射手段は、前記基準レーザービームおよびストークスビームの一方または両方のビームの一部を遮断する瞳変調手段を備えていることを特徴とするものである。
【００１８】
【発明の実施の形態】
以下、図面を参照しながら本発明の実施の形態について説明する。
【００１９】
（第１の実施の形態）
まず、第１の実施の形態について、図１ないし図３を用いて説明する。
図１に示すように、レーザー顕微鏡は、レーザー光源として、出射口（図示せず）から所定の方向にレーザービームを出射させるモードロックアルゴンレーザー２を備えている。このレーザー２の前方には、ビームスプリッタ４が配設されている。このビームスプリッタ４は、入射されたレーザービームを透過ビームと、このビームに対して直角方向に反射される反射ビームとの２つのビームに分割する。
【００２０】
透過ビームの光路上には、基準レーザービームω１（波長５７０ｎｍ）を出射する第１の色素レーザー６が配設されている。
また、前記反射ビームの光路上には、ビームスプリッタ４に平行となるように傾斜された反射ミラー７が配設されている。反射ミラー７は、入射されたビームを直角に反射させる。このビームの光路上には、ストークスビームω２（波長６２０ｎｍ〜６８０ｎｍに可変可能）を出射する第２の色素レーザー８が配設されている。
なお、前記第１および第２の色素レーザー６，８は、それぞれモードロックアルゴンレーザー２と同じ繰り返し周波数でパルス発振される。
【００２１】
そして、第２の色素レーザー８の前方には、プリズム１０および反射ミラー１２を有する光学遅延装置１４が設けられている。このプリズム１０は、ストークスビームω２を反射させる。このストークスビームω２の光路上には、ビームスプリッタ４と平行となるように傾斜された反射ミラー１２が配設されている。この反射ミラー１２は、入射されたストークスビームω２を直角に反射させる。 また、第１の色素レーザー６から出射された基準レーザービームω１と、このストークスビームω２との光路上の交叉したところには、ダイクロイックミラー１６が基準レーザービームω１に対して１３５°、ストークスビームω２に対しては、４５°傾けられて配置されている。このダイクロイックミラー１６は、基準レーザービームω１を透過させ、ストークスビームω２を基準レーザービームω１と同一方向に反射させ、基準レーザービームω１とストークスビームω２とを合成させる。
【００２２】
このように合成された基準レーザービームω１およびストークスビームω２（以下、ビームω１，ω２と称する）の光路上には、入射されたビームω１，ω２を所定の焦点距離で集光させる、集光レンズ１８が設けられている。このビームω１，ω２が集光される集光位置には、任意の長さを有する光ファイバー（例えば、シングルモードファイバー）２０の一端（入射端）２０ａが配設されている。また、このシングルモードファイバー２０の他端には、出射端２０ｂが配設され、入射端２０ａに入射されたビームω１，ω２を出射端２０ｂに伝送して出射させる。
この場合、このビームω１，ω２（基準レーザービームω１およびストークスビームω２）の出射位置は、完全に一致するので、光学軸のミスアライメントが発生する可能性を防止することができる。
【００２３】
そして、このビームω１，ω２の光路上には、後述する試料３４にビームω１，ω２を導く照射手段が設けられている。
この照射手段は、まず、コリメートレンズ２２を備えている。コリメートレンズ２２は、入射されたビームω１，ω２を平行ビームにする。そして、このコリメートレンズ２２の前方には、例えばガラス材からなる平行平面体２４が配設されている。この平行平面体２４は、図示しないが、紙面に垂直な軸回りに回転可能に保持されている。そして、この平行平面体２４は、一方の側から入射されたビームω１，ω２を基準レーザービームω１とストークスビームω２とに分光させる。これら２つのビームω１，ω２を他方の側でそれぞれ屈折させ、互いのビームω１，ω２に対して平行に出射させる。
【００２４】
そして、平行平面体２４を透過した２つのビームω１，ω２の出射先には、ミラー２６が配設されている。このミラー２６は、これらビームω１，ω２を試料３４上に導くために設けられ、図１中の矢印の方向に移動させることにより、入射されたビームω１，ω２を所定距離だけ平行移動させる。
【００２５】
また、これらビームω１，ω２の光路上には、リレーレンズ２８，３０が配設されている。これらリレーレンズ２８，３０は、入射されたビームω１，ω２を中継させる。
そして、リレーレンズ３０を透過したこれら２つのビームω１，ω２の出射先には、図２の（ａ）に示すようにそれぞれのビームω１，ω２が入射される、対物レンズ３２が配設されている。図１に示すように、対物レンズ３２を透過したビームω１，ω２の出射先には、図示しない電動ステージに配設された試料３４が配置されている。この対物レンズ３２は、入射された基準レーザービームω１およびストークスビームω２を試料３４上に集光、照射して、反ストークスビーム（反ストークスラマン散乱光）ω３を試料から発生させる。
【００２６】
この試料３４を透過した基準レーザービームω１およびストークスビームω２と反ストークスビームω３との光路上には、入射された各種ビームω１，ω２，ω３を所定の焦点距離で集光する、集光レンズ３６が配設されている。この集光レンズ３６を透過した各種ビームω１，ω２，ω３の出射先には、基準レーザービームω１とストークスビームω２とを遮断し、反ストークスビームω３のみを透過させる、波長選択フィルタ（ビーム選択手段）３８が設けられている。また、透過された反ストークスビームω３の光路上には、光検出器４０が設けられている。
電動ステージの位置信号と、光検出器４０で検出される反ストークスビームω３の光信号とは、信号処理器（図示せず）で処理されて電気信号に変換され、試料３４の反ストークスラマン散乱画像を得ることができる。
【００２７】
なお、ストークスビームω２は、基準レーザービームω１との角振動数の差（ω２−ω１）がラマン活性な分子振動の角振動数と一致するように、６２０ｎｍ〜６８０ｎｍの間でチューニングされる。また、ストークスビームω２と基準レーザービームω１とは、共にパルス発振されるので、これらのパルスが同時に試料３４に照射されるように光学遅延装置１４を調整する。
【００２８】
そして、第１の実施の形態では、平行平面体２４が回転可能に保持されているので、基準レーザービームω１とストークスビームω２との光軸間隔を自由に変えることができる。このため、使用される対物レンズ３２に合わせてミラー２６の位置を調整し、瞳を合わせることができる。
【００２９】
さらに、以下に、第１の実施の形態の変形例を記す。
コリメートレンズ２２は、図示しないズーム光学系を備え、焦点距離が可変にされていてもよい。このため、対物レンズ３２へ入射される、基準レーザービームω１およびストークスビームω２のビーム径は、使用される対物レンズ３２の瞳径に合わせて調整され得る。
【００３０】
従って、例えば、図２の（ａ）に示すよりも大きい瞳径の対物レンズ３２に対しても、最適なビーム径で入射され得る。また、図３に示すように、２つのビームω１，ω２の一部は、光路の途中に部分的に設けられた瞳変調手段として機能する遮断部材４２で遮断され、図２の（ｂ）に示すように対物レンズ３２の瞳に入射される。この場合、対物レンズ３２の焦点位置以外では、基準レーザービームω１とストークスビームω２とが交叉しないので、空間分解能の高い反ストークスビームω３を得ることができる。
【００３１】
なお、図２の（ｂ）に示す場合は、基準レーザービームω１とストークスビームω２とのほぼ中央に遮断部材４２が設けられて、両方のビームの一部が遮断されることを示している。この遮断部材４２を基準レーザービームω１およびストークスビームω２のどちらかに偏らせて、どちらか一方のビームのみを遮断する瞳変調手段を行なってもよい。
【００３２】
このようにすることで、どちらかのレーザーのパワーが十分でなくともこの顕微鏡を有効に使用することができる。
【００３３】
（第２の実施の形態）
次に、第２の実施の形態について、図４を用いて説明する。以下、同様な作用および機能を有する部材には、第１の実施の形態で用いた符号と同じ符号を使用して、詳しい説明を省略する。
図４に示すように、レーザー顕微鏡は、レーザー光源として、モードロックチタンサファイアレーザー５０と光パラメトリックオシレータ５２とを備えている。
【００３４】
モードロックチタンサファイアレーザー５０は、出射口（図示せず）から所定の方向に、所定の振動数を有する基準レーザービームω１（波長８５０ｎｍ）を出射させる。また、光パラメトリックオシレータ５２には、図示しないモードロックチタンサファイアレーザーが接続されており、当該光パラメトリックオシレータ５２の出射口（図示せず）から基準レーザービームω１と振動数が異なるストークスビームω２（波長１１００ｎｍ〜１３５０ｎｍに変調可能）を所定の方向に出射させる。
【００３５】
これらレーザー５０およびオシレータ５２は、共に８２ＭＨｚの繰り返し周波数でパルスを発振する。なお、これらレーザー５０およびオシレータ５２は、パルス幅が１００〜１５０ｆｓ程度の超短パルスを発振する。
これらレーザー５０およびオシレータ５２を出射されたそれぞれ基準レーザービームω１およびストークスビームω２の光路上には、それぞれ４つのプリズム５４，５６が設けられ、分散補償光学系５８を形成している。これらプリズム５４，５６は、それぞれ所定の間隔で、隣接するプリズムに対してそれぞれ所定の角度傾けられて設置されている。そして、これらプリズム５４，５６は、それぞれのビームω１，ω２に対して負の分散を発生させる。この分散補償光学系５８については、後述する。
【００３６】
プリズム５６から出射されたストークスビームω２は、それぞれプリズム１０の直角を挟む面に入射され、反射される。そして、反射ミラー１２に入射され、ストークスビームω２が直角に反射される。
そして、基準レーザービームω１およびストークスビームω２をダイクロイックミラー１６に入射し、基準レーザービームω１を透過させ、ストークスビームω２を基準レーザービームω１と同一方向に反射させ、基準レーザービームω１とストークスビームω２とを合成させる。
【００３７】
そして、集光レンズ１８を介して、集光されたビームω１，ω２をその集光位置で、光ファイバー（例えば、シングルモードファイバー）２０の入射端２０ａに入射させる。シングルモードファイバー２０は、入射されたビームω１，ω２を出射端２０ｂに伝送して、出射させる。
【００３８】
このビームω１，ω２の光路上には、後述する試料３４にビームω１，ω２を導く照射手段が設けられている。
この照射手段は、まず、コリメートレンズ２２を介して入射されたビームω１，ω２を平行ビームにする。そして、このコリメートレンズ２２の前方には、例えば、ＳＦ１０のような高分散ガラス６０が設けられている。この高分散ガラス６０は、正の分散を発生させる分散補償光学系として作用される。この分散補償光学系については、後述する。
【００３９】
そして、このビームω１，ω２を平行平面体２４に入射させる。一方の側から入射されたビームω１，ω２は、任意の角度で基準レーザービームω１およびストークスビームω２の２つのビームに分光され、それぞれ屈折された後、他方の側より互いのビームω１，ω２に対して平行に出射される。
【００４０】
これら２つのビームω１，ω２の光路上には、ミラー６１が設けられており、当該ミラー６１を図４中の矢印の方向に移動させることにより、これらビームω１，ω２を試料３４上で所定距離だけ平行移動させることができる。
【００４１】
次いで、ミラー６１を通過したこれら２つのビームω１，ω２の光路上には、走査ミラー６２ａ，６２ｃを備えたＸ−Ｙ走査装置６２が設けられており、走査ミラー６２ａをＸ方向に揺動させてミラー６１からの２つのビームω１，ω２を試料３４上でＸ方向に走査させ、同様に、走査ミラー６２ｃを走査ミラー６２ａの揺動に直交する方向、すなわちＹ方向に揺動させてミラー６１からの２つのビームω１，ω２を試料３４上でＹ方向に走査させる。
【００４２】
なお、走査ミラー６１と走査ミラー６２ｃとの間におけるこれら２つのビームω１，ω２の光路上には、１組のリレーレンズ６２ｂが設けられており、これらリレーレンズ６２ｂによって、走査ミラー６２ｃからのＸ方向に走査された２つのビームω１，ω２を走査ミラー６２ｃに中継する。
【００４３】
このようにして、Ｘ−Ｙ走査装置６２でＸ−Ｙ方向に光偏向されたこれらビームω１，ω２をリレーレンズ２８，３０を介して対物レンズ３２に入射させる。
なお、ミラー６２ｃの像は、リレーレンズ２８，３０により、対物レンズ３２のほぼ瞳位置に投影される。対物レンズ３２の瞳には、図２の（ａ）に示すように、これら２つのビームω１，ω２が入射される。
【００４４】
対物レンズ３２は、入射されたこれら基準レーザービームω１とストークスビームω２とを試料３４上に集光、照射することによって、反ストークスビーム（反ストークスラマン散乱光）ω３を試料３４から発生させる。
この試料３４を透過した基準レーザービームω１およびストークスビームω２と、反ストークスビームω３との光路上には、集光レンズ３６が配設され、入射されたビームω１，ω２，ω３を集光させる。集光レンズ３６を透過した各ビームω１，ω２，ω３の出射先には、波長選択フィルタ３８が設けられ、この波長選択フィルタ３８で、基準レーザービームω１とストークスビームω２とが遮断され、反ストークスビームω３のみが透過される。
【００４５】
光検出器４０は、反ストークスビームω３の光路上の集光レンズ３６に入射されたビームω３を集光させる位置に好ましくは設けられている。
そして、Ｘ−Ｙ走査装置６２の走査信号と、光検出器４０で検出される反ストークスビームω３の光信号とは、信号処理器（図示せず）で処理されて電気信号に変換され、試料３４の反ストークスラマン散乱画像を得ることができる。
【００４６】
なお、ストークスビームω２は、基準レーザービームω１との角振動数の差（ω２−ω１）がラマン活性な分子振動の角振動数と一致するように、１１００ｎｍ〜１３５０ｎｍの間でチューニングされる。また、ストークスビームω２と基準レーザービームω１とは、共にパルス発振されるので、これらのパルスが同時に試料３４に照射されるように光学遅延装置１４を調整する。
【００４７】
次に、上述した分散補償光学系５８，６０について説明する。
シングルモードファイバー２０にパルス幅が１００〜１５０ｆｓ程度の高密度の光が伝送されると、自己位相変調が生じる。このため、ファイバー２０からビームω１，ω２が出射された後に適当な分散補償が行われても元のパルス幅を再現できない可能性がある。これは、レーザー出力を強めるほど顕著に現れる。
【００４８】
そこで、本実施の形態では、シングルモードファイバー２０から出射されるビームω１，ω２がピコ秒レベルのパルス幅で出射されるように、大きな負の分散が与えられる分散補償光学系５８が基準レーザービームω１およびストークスビームω２に対してそれぞれ配置されている。
そして、この負の分散補償光学系５８の分散量は、それぞれ光路中に配置されている光学素子の分散量の総和を相殺する値が選択されるのが好ましい。
【００４９】
しかし、本実施の形態では、集光レンズ１８からコリメートレンズ２２までと、平行平面体２４から対物レンズ３２までとの分散量の合計が、分散補償光学系５８の分散を相殺するまでには至らない。このため、正の分散を与えることができる、例えばＳＦ１０のような高分散ガラス６０が光路に配置されている。
【００５０】
このため、レーザー５０およびオシレータ５２からそれぞれ出射される、基準レーザービームω１およびストークスビームω２が有するレーザーパルス幅は、広がることなく対物レンズ３２から出射され、試料３４上に照射される。
【００５１】
従って、光学系の分散が補償される分散補償光学系５８は、２つのレーザービームω１，ω２に対してそれぞれ配置されている。シングルモードファイバー２０には、ピコ秒レベルに広がる光パルスが伝送されるので、自己位相変調の問題が生じ難い。このため、対物レンズ３２から出射されるレーザービームのパルス幅は、それぞれレーザー５０およびオシレータ５２から出射されるパルス幅としてほぼ再現される。
【００５２】
反ストークスラマン散乱は、非線形光学過程なので、上記に示すような超短パルスレーザービームを使用することにより、高い光子密度で試料３４上に照射されるので、強い反ストークスビームω３が試料３４から得られる。従って、ＳＮ比の良いデータが得られる。これは、平均出力が低いレーザーを使用しても、データ取得が可能であることを示している。ゆえに、試料３４が生きた生物標本などの場合に極めて有利である。
【００５３】
さらに、以下に、第２の実施の形態の変形例を記す。
分散補償光学系には、いくつかの変形例が挙げられる。シングルモードファイバー２０に２つのビームω１，ω２が入射される前に、正の分散が発生される分散部材（例えば、ＳＦ１０のような高分散ガラス）が配置されてもよい。そして、シングルモードファイバー２０からこのビームω１，ω２が出射された後に、負の分散が発生される、例えば、４つのプリズムのような光学系が配置されてもよい。また、プリズムの代わりに回折格子が用いられてもよい。
【００５４】
そして、レーザー出力が極めて低く、シングルモードファイバーの自己位相変調が問題にならない場合には、正の分散が発生される部材を除いてもよい。そして、集光レンズ１８から対物レンズ３２までの分散量の合計を相殺する負の分散が与えられる分散補償光学系がそれぞれのレーザーに対して配置されてもよい。
【００５５】
ところで、第１および第２の実施の形態では、光ファイバーとしてシングルモードファイバー２０を用いて説明したが、このファイバーは、シングルモードの範囲内だけでなく、ほぼシングルモードとして扱える範囲内であれば、第１および第２の実施の形態で使用したもの以外のものも用いることができる。
【００５６】
また、シングルモードファイバーでかつ、偏波面が保存されるファイバーが用いられてもよい。このため、レーザービームが直線偏光の場合には、偏光が保持され、ファイバーの屈曲状態が変わっても出力の変動が少なく、安定してデータの取得を行なうことができる。
【００５７】
また、第１および第２の実施の形態では、それぞれ図１および図４に示すような光学系を説明したが、このような光学系は一例であって、要旨を逸脱しない範囲であれば、他の光学系を用いてももちろん構わない。
【００５８】
また、第１および第２の実施の形態では、それぞれ図１および図４に示すような照射手段を説明したが、このような照射手段は、一例であって、要旨を逸脱しない範囲であれば、他の照射手段を用いてももちろん構わない。
【００５９】
以上説明したように、基準レーザービームとストークスビームとが光ファイバーを介して出射されるので、対物レンズの集光位置で、これらビームの位置の重合性が保証される。従って、反ストークスビームを得るのに寄与する基準レーザービームおよびストークスビームのみが試料に照射される。このため、試料に余計なレーザービームが照射されることを防ぐので、生きた生物細胞や組織を観察する場合に極めて有利である。また、検出信号が安定した高いＳＮ比で検出される。
【００６０】
また、環境温度の変化や振動などの影響で、ミスアライメントが生じたとしても、光ファイバーへのレーザービームの入射効率に影響を及ぼすのみである。これは、対物レンズの集光位置でのビームの位置重合性に影響を及ぼすことを防ぐものである。従って、検出信号を高いＳＮ比で安定して検出することができる。
【００６１】
これまで、いくつかの実施の形態について図面を参照しながら具体的に説明したが、本発明は、上述した実施の形態に限定されるものではなく、その要旨を逸脱しない範囲で行なわれるすべての実施を含む。
【００６２】
上記説明によれば、下記の事項の発明が得られる。また、各項の組み合わせも可能である。
【００６３】
［付記］
１．それぞれ異なる振動数を有する基準レーザービームおよびストークスビームを出射させるレーザー光源と、
反ストークスビームを試料から得るためのこれら２つのビームを、対物レンズを介して試料上に集光して照射する照射手段と、
試料からの反ストークスビームを導き、かつ前記基準レーザービームおよびストークスビームを遮断するビーム選択手段と、
試料からの反ストークスビームを検出する光検出器と、
を具備するレーザー顕微鏡において、
前記基準レーザービームおよびストークスビームは、前記レーザー光源と照射手段との間に配設された共通の光ファイバーの入射端に入射され、
この光ファイバーに入射された２つのビームは、出射端から出射されて、前記照射手段に導かれることを特徴とするレーザー顕微鏡。
【００６４】
２．前記照射手段は、対物レンズを介して前記基準レーザービームおよびストークスビームを前記試料上で集光して、試料上を走査させる走査手段を備えていることを特徴とする付記項１に記載のレーザー顕微鏡。
【００６５】
３．前記照射手段は、前記基準レーザービームおよびストークスビームの一方または両方のビームの一部を遮断する瞳変調手段を備えていることを特徴とする付記項１もしくは２に記載のレーザー顕微鏡。
【００６６】
４．前記光ファイバーには、シングルモードファイバーが用いられていることを特徴とする付記項１ないし３のいずれか１に記載のレーザー顕微鏡。
【００６７】
【発明の効果】
以上説明したように、本発明によれば、ミスアライメントの発生を抑えることができるとともに、反ストークスビームを安定して高いＳＮ比で検出することができる、レーザー顕微鏡を提供することができる。
【００６８】
また、本発明によれば、反ストークスビームの生成に寄与する基準レーザービームおよびストークスビームのみが試料に照射され、生きた細胞や組織を観察するのに最適なレーザー顕微鏡を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】第１の実施の形態にかかる、レーザー顕微鏡の構成を示す概略図。
【図２】（ａ）は対物レンズの瞳にレーザービームが入射されたときの概略的な説明図、（ｂ）は図３に示す遮断部材が設けられた場合に、対物レンズの瞳にレーザービームが入射されたときの概略的な説明図。
【図３】光路の途中に部分的にビームを遮断する遮断部材が設けられた場合の概略図。
【図４】第２の実施の形態にかかる、レーザー顕微鏡の構成を示す概略図。
【図５】従来のレーザー計測装置を示す説明図。
【図６】図５に示すレーザー計測装置の主要部を示す概略図。
【符号の説明】
ω１…基準レーザービーム、ω２…ストークスビーム、ω３…反ストークスビーム、２…モードロックアルゴンレーザー、２０…シングルモードファイバー、３２…対物レンズ、３４…試料、３８…波長選択フィルタ、４０…光検出器
【発明の属する技術分野】
本発明は、それぞれ異なる振動数を有する基準レーザービームとストークスビームとを試料に照射して、試料から得られる反ストークスビームを検出して、像を得るレーザー顕微鏡に関する。
【０００２】
【従来の技術】
これまで、医学、生物の研究分野では、細胞機能の研究が盛んに行なわれてきた。近年では、細胞機能だけを研究するのではなく、問題とする機能とタンパク質分子構造との関係を直接観察する要求が高まりつつある。
【０００３】
ところで、分子の指紋と呼ばれるラマン散乱光を直接観察する方法は、広く用いられている。特に、試料からの蛍光を容易に除去できる、ＣＡＲＳ（Ｃｏｈｅｒｅｎｔ Ａｎｔｉ−Ｓｔｏｋｅｓ Ｒａｍａｎ Ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ）分光が注目されている。これは、基準レーザービームとストークスビームとを試料に照射し、試料から得られる反ストークスビーム（反ストークスラマン散乱光）を検出するものである。
【０００４】
図５および図６に示すように、特公平４−５１７８４号公報には、レーザー計測装置１００が開示されている。このレーザー計測装置１００は、レーザー光源として、波長１０６４ｎｍのレーザービームを発振するパルスＹＡＧレーザー１０２を備えている。このレーザー１０２の前方には、レーザービームの波長を５３２ｎｍに変換し、基準レーザービームω１１（波長λ１１）を出射させる第２高調波発生器１０４が設けられている。このビームω１１の光路上には、ビームスプリッタ１０６がビームω１１を２方向に分割するように配置されている。このビームスプリッタ１０６に入射されたビームω１１は、反射ビームω１１と透過ビームω１１’とに分割される。
【０００５】
反射ビームω１１の光路上には、この反射ビームω１１を反射させる、ミラー１０８が設けられている。
前記透過ビームω１１’の光路上には、このビームω１１’を振動数の異なるストークスビームω２２（波長６０７ｎｍ）に変換して出射させる、色素レーザー１１０が設けられている。そして、ストークスビームω２２の光路上には、このストークスビームω２２の横断面パターンを半分遮断し、半円形にするナイフエッジ１１２が配置されている。
【０００６】
そして、これら基準レーザービームω１１とストークスビームω２２との光路上の交叉したところには、基準レーザービーム（反射ビーム）ω１１を透過し、ストークスビームω２２を反射して１本のビームω１１，ω２２にする、ダイクロイックミラー１１４が設けられている。
このビームω１１，ω２２の光路上には、ビームω１１，ω２２を所定の距離で集光するレンズ１１６が設けられている。そして、この集光位置には、試料Ｍが配設されている。この試料Ｍには、ビームω１１，ω２２が照射され、この試料Ｍから反ストークスビームω３３が発生される。なお、試料Ｍを透過するビームには、反ストークスビームω３３の他に、基準レーザービームω１１およびストークスビームω２２が含まれている。
【０００７】
これらビームω１１，ω２２，ω３３の光路上には、これらビームω１１，ω２２，ω３３を平行光にするレンズ１１８が設けられている。また、これらビームω１１，ω２２，ω３３の光路上には、基準レーザービームω１１およびストークスビームω２２の混合部のみを遮断するナイフエッジ１２０が設けられている。そして、これらビームω１１，ω３３の光路上には、基準レーザービームω１１のみを遮断する適当な波長選択器１２２が配設されている。
そして、残された反ストークスビームω３３の光路上には、反ストークスビームω３３を反射する２つの反射ミラー１２４が設けられている。また、このビームω３３の光路上には、反ストークスビームω３３をスペクトルに分光する分光器１２６が設けられている。そして、この分光器の前方には、検出器１２８が設けられており、分光されたスペクトルが検出される。
さらに、この検出器１２８には、ミニコンピュータ１３０が接続されている。
また、このミニコンピュータ１３０には、画像表示装置１３２が接続され、検出器１２８で検出されたスペクトルは、ミニコンピュータ１３０を用いて電気信号に変換され、この信号が画像表示装置１３２で表示される。
【０００８】
これらビームω１，ω２，ω３の位相を整合するための調整は、上記の構成からナイフエッジ１２０が除かれ、基準レーザービームω１１の横断面パターンに含まれる全ての反ストークスビームω３３が検出されて、行なわれる。この調整が行なわれた後、ナイフエッジ１２０によって、基準レーザービームω１１とストークスビームω２２との混合部のみが遮断されて、空間上の微小な交叉点から生じる空間分解能の高い反ストークスビームω３３が容易に得られる。
【０００９】
従って、このレーザー計測装置１００は、基準レーザービームω１１（波長λ１１）の横断面パターンの一部にストークスビームω２２（波長λ２２）が混合されて、試料Ｍに入射される手段を備えている。また、出射側では、基準レーザービームω１１とストークスビームω２２との混合部のみが遮断され、その他の基準レーザービームω１１の横断面パターンに含まれる反ストークスビームω３３が抽出される手段を備えている。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
このような構成は、空間分解能の高い最小交叉角法を精度良く調整することに関するものである。しかしながら、基本的に、光学軸のミスアライメントが生じる可能性を除くことができない。例えば、理想的な調整が行なわれたとしても、環境温度の変化や振動などの影響でミスアライメントが生じる可能性がある。このため、基準レーザービームω１１とストークスビームω２２との出射方位が一致していても、ミスアライメントが生じる可能性がある。
【００１１】
従って、ミスアライメントによって、反ストークスビームの強度が弱められてしまうだけでなく、反ストークスビームの発生に寄与しない基準レーザービームとストークスビームとがノイズ成分として検出されてしまう可能性がある。すなわち、反ストークスビームの検出において、ＳＮ比の低下をまねくという欠点を有する。
【００１２】
また、従来技術では、ミスアライメントを生じると、反ストークスビームの発生に寄与しない基準レーザービームとストークスビームとが試料に照射されてしまうことがある。このため、試料が化学物質の場合はまだ良いが、生きた細胞や組織の場合は、これら２つのビームで試料にダメージを与えてしまう可能性がある。
【００１３】
本発明は、このような事情によりなされ、ミスアライメントの発生を抑えることができるとともに、反ストークスビーム（反ストークスラマン散乱光）を安定して高いＳＮ比で検出することができる、レーザー顕微鏡を提供することを目的とする。
【００１４】
また、本発明は、反ストークスビームの生成に寄与する基準レーザービームおよびストークスビームのみが試料に照射され、生きた細胞や組織を観察するのに最適なレーザー顕微鏡を提供することを目的とする。
【００１５】
【課題を解決するための手段】
上記課題を解決するために、本発明によるレーザー顕微鏡は、それぞれ異なる振動数を有する基準レーザービームおよびストークスビームを出射させるレーザー光源と、反ストークスビームを試料から得るためのこれら２つのビームを、対物レンズを介して試料上に集光して照射する照射手段と、試料からの反ストークスビームを導き、かつ前記基準レーザービームおよびストークスビームを遮断するビーム選択手段と、試料からの反ストークスビームを検出する光検出器とを備えている。そして、前記基準レーザービームおよびストークスビームは、前記レーザー光源と照射手段との間に配設された共通の光ファイバーの入射端に入射され、この光ファイバーに入射された２つのビームは、出射端から出射されて、前記照射手段に導かれることを特徴とするものである。
【００１６】
また、前記照射手段は、対物レンズを介して前記基準レーザービームおよびストークスビームを前記試料上で集光して、試料上を走査させる走査手段を備えていることを特徴とするものである。
【００１７】
さらに、前記照射手段は、前記基準レーザービームおよびストークスビームの一方または両方のビームの一部を遮断する瞳変調手段を備えていることを特徴とするものである。
【００１８】
【発明の実施の形態】
以下、図面を参照しながら本発明の実施の形態について説明する。
【００１９】
（第１の実施の形態）
まず、第１の実施の形態について、図１ないし図３を用いて説明する。
図１に示すように、レーザー顕微鏡は、レーザー光源として、出射口（図示せず）から所定の方向にレーザービームを出射させるモードロックアルゴンレーザー２を備えている。このレーザー２の前方には、ビームスプリッタ４が配設されている。このビームスプリッタ４は、入射されたレーザービームを透過ビームと、このビームに対して直角方向に反射される反射ビームとの２つのビームに分割する。
【００２０】
透過ビームの光路上には、基準レーザービームω１（波長５７０ｎｍ）を出射する第１の色素レーザー６が配設されている。
また、前記反射ビームの光路上には、ビームスプリッタ４に平行となるように傾斜された反射ミラー７が配設されている。反射ミラー７は、入射されたビームを直角に反射させる。このビームの光路上には、ストークスビームω２（波長６２０ｎｍ〜６８０ｎｍに可変可能）を出射する第２の色素レーザー８が配設されている。
なお、前記第１および第２の色素レーザー６，８は、それぞれモードロックアルゴンレーザー２と同じ繰り返し周波数でパルス発振される。
【００２１】
そして、第２の色素レーザー８の前方には、プリズム１０および反射ミラー１２を有する光学遅延装置１４が設けられている。このプリズム１０は、ストークスビームω２を反射させる。このストークスビームω２の光路上には、ビームスプリッタ４と平行となるように傾斜された反射ミラー１２が配設されている。この反射ミラー１２は、入射されたストークスビームω２を直角に反射させる。 また、第１の色素レーザー６から出射された基準レーザービームω１と、このストークスビームω２との光路上の交叉したところには、ダイクロイックミラー１６が基準レーザービームω１に対して１３５°、ストークスビームω２に対しては、４５°傾けられて配置されている。このダイクロイックミラー１６は、基準レーザービームω１を透過させ、ストークスビームω２を基準レーザービームω１と同一方向に反射させ、基準レーザービームω１とストークスビームω２とを合成させる。
【００２２】
このように合成された基準レーザービームω１およびストークスビームω２（以下、ビームω１，ω２と称する）の光路上には、入射されたビームω１，ω２を所定の焦点距離で集光させる、集光レンズ１８が設けられている。このビームω１，ω２が集光される集光位置には、任意の長さを有する光ファイバー（例えば、シングルモードファイバー）２０の一端（入射端）２０ａが配設されている。また、このシングルモードファイバー２０の他端には、出射端２０ｂが配設され、入射端２０ａに入射されたビームω１，ω２を出射端２０ｂに伝送して出射させる。
この場合、このビームω１，ω２（基準レーザービームω１およびストークスビームω２）の出射位置は、完全に一致するので、光学軸のミスアライメントが発生する可能性を防止することができる。
【００２３】
そして、このビームω１，ω２の光路上には、後述する試料３４にビームω１，ω２を導く照射手段が設けられている。
この照射手段は、まず、コリメートレンズ２２を備えている。コリメートレンズ２２は、入射されたビームω１，ω２を平行ビームにする。そして、このコリメートレンズ２２の前方には、例えばガラス材からなる平行平面体２４が配設されている。この平行平面体２４は、図示しないが、紙面に垂直な軸回りに回転可能に保持されている。そして、この平行平面体２４は、一方の側から入射されたビームω１，ω２を基準レーザービームω１とストークスビームω２とに分光させる。これら２つのビームω１，ω２を他方の側でそれぞれ屈折させ、互いのビームω１，ω２に対して平行に出射させる。
【００２４】
そして、平行平面体２４を透過した２つのビームω１，ω２の出射先には、ミラー２６が配設されている。このミラー２６は、これらビームω１，ω２を試料３４上に導くために設けられ、図１中の矢印の方向に移動させることにより、入射されたビームω１，ω２を所定距離だけ平行移動させる。
【００２５】
また、これらビームω１，ω２の光路上には、リレーレンズ２８，３０が配設されている。これらリレーレンズ２８，３０は、入射されたビームω１，ω２を中継させる。
そして、リレーレンズ３０を透過したこれら２つのビームω１，ω２の出射先には、図２の（ａ）に示すようにそれぞれのビームω１，ω２が入射される、対物レンズ３２が配設されている。図１に示すように、対物レンズ３２を透過したビームω１，ω２の出射先には、図示しない電動ステージに配設された試料３４が配置されている。この対物レンズ３２は、入射された基準レーザービームω１およびストークスビームω２を試料３４上に集光、照射して、反ストークスビーム（反ストークスラマン散乱光）ω３を試料から発生させる。
【００２６】
この試料３４を透過した基準レーザービームω１およびストークスビームω２と反ストークスビームω３との光路上には、入射された各種ビームω１，ω２，ω３を所定の焦点距離で集光する、集光レンズ３６が配設されている。この集光レンズ３６を透過した各種ビームω１，ω２，ω３の出射先には、基準レーザービームω１とストークスビームω２とを遮断し、反ストークスビームω３のみを透過させる、波長選択フィルタ（ビーム選択手段）３８が設けられている。また、透過された反ストークスビームω３の光路上には、光検出器４０が設けられている。
電動ステージの位置信号と、光検出器４０で検出される反ストークスビームω３の光信号とは、信号処理器（図示せず）で処理されて電気信号に変換され、試料３４の反ストークスラマン散乱画像を得ることができる。
【００２７】
なお、ストークスビームω２は、基準レーザービームω１との角振動数の差（ω２−ω１）がラマン活性な分子振動の角振動数と一致するように、６２０ｎｍ〜６８０ｎｍの間でチューニングされる。また、ストークスビームω２と基準レーザービームω１とは、共にパルス発振されるので、これらのパルスが同時に試料３４に照射されるように光学遅延装置１４を調整する。
【００２８】
そして、第１の実施の形態では、平行平面体２４が回転可能に保持されているので、基準レーザービームω１とストークスビームω２との光軸間隔を自由に変えることができる。このため、使用される対物レンズ３２に合わせてミラー２６の位置を調整し、瞳を合わせることができる。
【００２９】
さらに、以下に、第１の実施の形態の変形例を記す。
コリメートレンズ２２は、図示しないズーム光学系を備え、焦点距離が可変にされていてもよい。このため、対物レンズ３２へ入射される、基準レーザービームω１およびストークスビームω２のビーム径は、使用される対物レンズ３２の瞳径に合わせて調整され得る。
【００３０】
従って、例えば、図２の（ａ）に示すよりも大きい瞳径の対物レンズ３２に対しても、最適なビーム径で入射され得る。また、図３に示すように、２つのビームω１，ω２の一部は、光路の途中に部分的に設けられた瞳変調手段として機能する遮断部材４２で遮断され、図２の（ｂ）に示すように対物レンズ３２の瞳に入射される。この場合、対物レンズ３２の焦点位置以外では、基準レーザービームω１とストークスビームω２とが交叉しないので、空間分解能の高い反ストークスビームω３を得ることができる。
【００３１】
なお、図２の（ｂ）に示す場合は、基準レーザービームω１とストークスビームω２とのほぼ中央に遮断部材４２が設けられて、両方のビームの一部が遮断されることを示している。この遮断部材４２を基準レーザービームω１およびストークスビームω２のどちらかに偏らせて、どちらか一方のビームのみを遮断する瞳変調手段を行なってもよい。
【００３２】
このようにすることで、どちらかのレーザーのパワーが十分でなくともこの顕微鏡を有効に使用することができる。
【００３３】
（第２の実施の形態）
次に、第２の実施の形態について、図４を用いて説明する。以下、同様な作用および機能を有する部材には、第１の実施の形態で用いた符号と同じ符号を使用して、詳しい説明を省略する。
図４に示すように、レーザー顕微鏡は、レーザー光源として、モードロックチタンサファイアレーザー５０と光パラメトリックオシレータ５２とを備えている。
【００３４】
モードロックチタンサファイアレーザー５０は、出射口（図示せず）から所定の方向に、所定の振動数を有する基準レーザービームω１（波長８５０ｎｍ）を出射させる。また、光パラメトリックオシレータ５２には、図示しないモードロックチタンサファイアレーザーが接続されており、当該光パラメトリックオシレータ５２の出射口（図示せず）から基準レーザービームω１と振動数が異なるストークスビームω２（波長１１００ｎｍ〜１３５０ｎｍに変調可能）を所定の方向に出射させる。
【００３５】
これらレーザー５０およびオシレータ５２は、共に８２ＭＨｚの繰り返し周波数でパルスを発振する。なお、これらレーザー５０およびオシレータ５２は、パルス幅が１００〜１５０ｆｓ程度の超短パルスを発振する。
これらレーザー５０およびオシレータ５２を出射されたそれぞれ基準レーザービームω１およびストークスビームω２の光路上には、それぞれ４つのプリズム５４，５６が設けられ、分散補償光学系５８を形成している。これらプリズム５４，５６は、それぞれ所定の間隔で、隣接するプリズムに対してそれぞれ所定の角度傾けられて設置されている。そして、これらプリズム５４，５６は、それぞれのビームω１，ω２に対して負の分散を発生させる。この分散補償光学系５８については、後述する。
【００３６】
プリズム５６から出射されたストークスビームω２は、それぞれプリズム１０の直角を挟む面に入射され、反射される。そして、反射ミラー１２に入射され、ストークスビームω２が直角に反射される。
そして、基準レーザービームω１およびストークスビームω２をダイクロイックミラー１６に入射し、基準レーザービームω１を透過させ、ストークスビームω２を基準レーザービームω１と同一方向に反射させ、基準レーザービームω１とストークスビームω２とを合成させる。
【００３７】
そして、集光レンズ１８を介して、集光されたビームω１，ω２をその集光位置で、光ファイバー（例えば、シングルモードファイバー）２０の入射端２０ａに入射させる。シングルモードファイバー２０は、入射されたビームω１，ω２を出射端２０ｂに伝送して、出射させる。
【００３８】
このビームω１，ω２の光路上には、後述する試料３４にビームω１，ω２を導く照射手段が設けられている。
この照射手段は、まず、コリメートレンズ２２を介して入射されたビームω１，ω２を平行ビームにする。そして、このコリメートレンズ２２の前方には、例えば、ＳＦ１０のような高分散ガラス６０が設けられている。この高分散ガラス６０は、正の分散を発生させる分散補償光学系として作用される。この分散補償光学系については、後述する。
【００３９】
そして、このビームω１，ω２を平行平面体２４に入射させる。一方の側から入射されたビームω１，ω２は、任意の角度で基準レーザービームω１およびストークスビームω２の２つのビームに分光され、それぞれ屈折された後、他方の側より互いのビームω１，ω２に対して平行に出射される。
【００４０】
これら２つのビームω１，ω２の光路上には、ミラー６１が設けられており、当該ミラー６１を図４中の矢印の方向に移動させることにより、これらビームω１，ω２を試料３４上で所定距離だけ平行移動させることができる。
【００４１】
次いで、ミラー６１を通過したこれら２つのビームω１，ω２の光路上には、走査ミラー６２ａ，６２ｃを備えたＸ−Ｙ走査装置６２が設けられており、走査ミラー６２ａをＸ方向に揺動させてミラー６１からの２つのビームω１，ω２を試料３４上でＸ方向に走査させ、同様に、走査ミラー６２ｃを走査ミラー６２ａの揺動に直交する方向、すなわちＹ方向に揺動させてミラー６１からの２つのビームω１，ω２を試料３４上でＹ方向に走査させる。
【００４２】
なお、走査ミラー６１と走査ミラー６２ｃとの間におけるこれら２つのビームω１，ω２の光路上には、１組のリレーレンズ６２ｂが設けられており、これらリレーレンズ６２ｂによって、走査ミラー６２ｃからのＸ方向に走査された２つのビームω１，ω２を走査ミラー６２ｃに中継する。
【００４３】
このようにして、Ｘ−Ｙ走査装置６２でＸ−Ｙ方向に光偏向されたこれらビームω１，ω２をリレーレンズ２８，３０を介して対物レンズ３２に入射させる。
なお、ミラー６２ｃの像は、リレーレンズ２８，３０により、対物レンズ３２のほぼ瞳位置に投影される。対物レンズ３２の瞳には、図２の（ａ）に示すように、これら２つのビームω１，ω２が入射される。
【００４４】
対物レンズ３２は、入射されたこれら基準レーザービームω１とストークスビームω２とを試料３４上に集光、照射することによって、反ストークスビーム（反ストークスラマン散乱光）ω３を試料３４から発生させる。
この試料３４を透過した基準レーザービームω１およびストークスビームω２と、反ストークスビームω３との光路上には、集光レンズ３６が配設され、入射されたビームω１，ω２，ω３を集光させる。集光レンズ３６を透過した各ビームω１，ω２，ω３の出射先には、波長選択フィルタ３８が設けられ、この波長選択フィルタ３８で、基準レーザービームω１とストークスビームω２とが遮断され、反ストークスビームω３のみが透過される。
【００４５】
光検出器４０は、反ストークスビームω３の光路上の集光レンズ３６に入射されたビームω３を集光させる位置に好ましくは設けられている。
そして、Ｘ−Ｙ走査装置６２の走査信号と、光検出器４０で検出される反ストークスビームω３の光信号とは、信号処理器（図示せず）で処理されて電気信号に変換され、試料３４の反ストークスラマン散乱画像を得ることができる。
【００４６】
なお、ストークスビームω２は、基準レーザービームω１との角振動数の差（ω２−ω１）がラマン活性な分子振動の角振動数と一致するように、１１００ｎｍ〜１３５０ｎｍの間でチューニングされる。また、ストークスビームω２と基準レーザービームω１とは、共にパルス発振されるので、これらのパルスが同時に試料３４に照射されるように光学遅延装置１４を調整する。
【００４７】
次に、上述した分散補償光学系５８，６０について説明する。
シングルモードファイバー２０にパルス幅が１００〜１５０ｆｓ程度の高密度の光が伝送されると、自己位相変調が生じる。このため、ファイバー２０からビームω１，ω２が出射された後に適当な分散補償が行われても元のパルス幅を再現できない可能性がある。これは、レーザー出力を強めるほど顕著に現れる。
【００４８】
そこで、本実施の形態では、シングルモードファイバー２０から出射されるビームω１，ω２がピコ秒レベルのパルス幅で出射されるように、大きな負の分散が与えられる分散補償光学系５８が基準レーザービームω１およびストークスビームω２に対してそれぞれ配置されている。
そして、この負の分散補償光学系５８の分散量は、それぞれ光路中に配置されている光学素子の分散量の総和を相殺する値が選択されるのが好ましい。
【００４９】
しかし、本実施の形態では、集光レンズ１８からコリメートレンズ２２までと、平行平面体２４から対物レンズ３２までとの分散量の合計が、分散補償光学系５８の分散を相殺するまでには至らない。このため、正の分散を与えることができる、例えばＳＦ１０のような高分散ガラス６０が光路に配置されている。
【００５０】
このため、レーザー５０およびオシレータ５２からそれぞれ出射される、基準レーザービームω１およびストークスビームω２が有するレーザーパルス幅は、広がることなく対物レンズ３２から出射され、試料３４上に照射される。
【００５１】
従って、光学系の分散が補償される分散補償光学系５８は、２つのレーザービームω１，ω２に対してそれぞれ配置されている。シングルモードファイバー２０には、ピコ秒レベルに広がる光パルスが伝送されるので、自己位相変調の問題が生じ難い。このため、対物レンズ３２から出射されるレーザービームのパルス幅は、それぞれレーザー５０およびオシレータ５２から出射されるパルス幅としてほぼ再現される。
【００５２】
反ストークスラマン散乱は、非線形光学過程なので、上記に示すような超短パルスレーザービームを使用することにより、高い光子密度で試料３４上に照射されるので、強い反ストークスビームω３が試料３４から得られる。従って、ＳＮ比の良いデータが得られる。これは、平均出力が低いレーザーを使用しても、データ取得が可能であることを示している。ゆえに、試料３４が生きた生物標本などの場合に極めて有利である。
【００５３】
さらに、以下に、第２の実施の形態の変形例を記す。
分散補償光学系には、いくつかの変形例が挙げられる。シングルモードファイバー２０に２つのビームω１，ω２が入射される前に、正の分散が発生される分散部材（例えば、ＳＦ１０のような高分散ガラス）が配置されてもよい。そして、シングルモードファイバー２０からこのビームω１，ω２が出射された後に、負の分散が発生される、例えば、４つのプリズムのような光学系が配置されてもよい。また、プリズムの代わりに回折格子が用いられてもよい。
【００５４】
そして、レーザー出力が極めて低く、シングルモードファイバーの自己位相変調が問題にならない場合には、正の分散が発生される部材を除いてもよい。そして、集光レンズ１８から対物レンズ３２までの分散量の合計を相殺する負の分散が与えられる分散補償光学系がそれぞれのレーザーに対して配置されてもよい。
【００５５】
ところで、第１および第２の実施の形態では、光ファイバーとしてシングルモードファイバー２０を用いて説明したが、このファイバーは、シングルモードの範囲内だけでなく、ほぼシングルモードとして扱える範囲内であれば、第１および第２の実施の形態で使用したもの以外のものも用いることができる。
【００５６】
また、シングルモードファイバーでかつ、偏波面が保存されるファイバーが用いられてもよい。このため、レーザービームが直線偏光の場合には、偏光が保持され、ファイバーの屈曲状態が変わっても出力の変動が少なく、安定してデータの取得を行なうことができる。
【００５７】
また、第１および第２の実施の形態では、それぞれ図１および図４に示すような光学系を説明したが、このような光学系は一例であって、要旨を逸脱しない範囲であれば、他の光学系を用いてももちろん構わない。
【００５８】
また、第１および第２の実施の形態では、それぞれ図１および図４に示すような照射手段を説明したが、このような照射手段は、一例であって、要旨を逸脱しない範囲であれば、他の照射手段を用いてももちろん構わない。
【００５９】
以上説明したように、基準レーザービームとストークスビームとが光ファイバーを介して出射されるので、対物レンズの集光位置で、これらビームの位置の重合性が保証される。従って、反ストークスビームを得るのに寄与する基準レーザービームおよびストークスビームのみが試料に照射される。このため、試料に余計なレーザービームが照射されることを防ぐので、生きた生物細胞や組織を観察する場合に極めて有利である。また、検出信号が安定した高いＳＮ比で検出される。
【００６０】
また、環境温度の変化や振動などの影響で、ミスアライメントが生じたとしても、光ファイバーへのレーザービームの入射効率に影響を及ぼすのみである。これは、対物レンズの集光位置でのビームの位置重合性に影響を及ぼすことを防ぐものである。従って、検出信号を高いＳＮ比で安定して検出することができる。
【００６１】
これまで、いくつかの実施の形態について図面を参照しながら具体的に説明したが、本発明は、上述した実施の形態に限定されるものではなく、その要旨を逸脱しない範囲で行なわれるすべての実施を含む。
【００６２】
上記説明によれば、下記の事項の発明が得られる。また、各項の組み合わせも可能である。
【００６３】
［付記］
１．それぞれ異なる振動数を有する基準レーザービームおよびストークスビームを出射させるレーザー光源と、
反ストークスビームを試料から得るためのこれら２つのビームを、対物レンズを介して試料上に集光して照射する照射手段と、
試料からの反ストークスビームを導き、かつ前記基準レーザービームおよびストークスビームを遮断するビーム選択手段と、
試料からの反ストークスビームを検出する光検出器と、
を具備するレーザー顕微鏡において、
前記基準レーザービームおよびストークスビームは、前記レーザー光源と照射手段との間に配設された共通の光ファイバーの入射端に入射され、
この光ファイバーに入射された２つのビームは、出射端から出射されて、前記照射手段に導かれることを特徴とするレーザー顕微鏡。
【００６４】
２．前記照射手段は、対物レンズを介して前記基準レーザービームおよびストークスビームを前記試料上で集光して、試料上を走査させる走査手段を備えていることを特徴とする付記項１に記載のレーザー顕微鏡。
【００６５】
３．前記照射手段は、前記基準レーザービームおよびストークスビームの一方または両方のビームの一部を遮断する瞳変調手段を備えていることを特徴とする付記項１もしくは２に記載のレーザー顕微鏡。
【００６６】
４．前記光ファイバーには、シングルモードファイバーが用いられていることを特徴とする付記項１ないし３のいずれか１に記載のレーザー顕微鏡。
【００６７】
【発明の効果】
以上説明したように、本発明によれば、ミスアライメントの発生を抑えることができるとともに、反ストークスビームを安定して高いＳＮ比で検出することができる、レーザー顕微鏡を提供することができる。
【００６８】
また、本発明によれば、反ストークスビームの生成に寄与する基準レーザービームおよびストークスビームのみが試料に照射され、生きた細胞や組織を観察するのに最適なレーザー顕微鏡を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】第１の実施の形態にかかる、レーザー顕微鏡の構成を示す概略図。
【図２】（ａ）は対物レンズの瞳にレーザービームが入射されたときの概略的な説明図、（ｂ）は図３に示す遮断部材が設けられた場合に、対物レンズの瞳にレーザービームが入射されたときの概略的な説明図。
【図３】光路の途中に部分的にビームを遮断する遮断部材が設けられた場合の概略図。
【図４】第２の実施の形態にかかる、レーザー顕微鏡の構成を示す概略図。
【図５】従来のレーザー計測装置を示す説明図。
【図６】図５に示すレーザー計測装置の主要部を示す概略図。
【符号の説明】
ω１…基準レーザービーム、ω２…ストークスビーム、ω３…反ストークスビーム、２…モードロックアルゴンレーザー、２０…シングルモードファイバー、３２…対物レンズ、３４…試料、３８…波長選択フィルタ、４０…光検出器
Claims (4)
- それぞれ異なる振動数を有する基準レーザービームおよびストークスビームを出射させるレーザー光源と、
反ストークスビームを試料から得るためのこれら２つのビームを、対物レンズを介して試料上に集光して照射する照射手段と、
試料からの反ストークスビームを導き、かつ前記基準レーザービームおよびストークスビームを遮断するビーム選択手段と、
試料からの反ストークスビームを検出する光検出器と、
を具備するレーザー顕微鏡において、
前記基準レーザービームおよびストークスビームは、前記レーザー光源と照射手段との間に配設された共通の光ファイバーの入射端に入射され、
この光ファイバーに入射された２つのビームは、出射端から出射されて、前記照射手段に導かれることを特徴とするレーザー顕微鏡。 - 前記基準レーザービームと前記ストークスビームとは、同じ繰り返し周波数でパルス発振しており、
前記レーザー光源と前記光ファイバーの入射端との間に配置されて前記基準レーザービームの光路と前記ストークスビームの光路とを合成する光路合成手段と、
前記レーザー光源と前記光路合成手段との間であって、前記基準レーザービームの光路と前記ストークスビームの光路との少なくとも一方に配置された光学遅延装置と
をさらに備える、請求項１に記載のレーザー顕微鏡。 - 前記照射手段は、対物レンズを介して前記基準レーザービームおよびストークスビームを前記試料上で集光して、試料上を走査させる走査手段を備えていることを特徴とする請求項１もしくは請求項２に記載のレーザー顕微鏡。
- 前記照射手段は、前記基準レーザービームおよびストークスビームの一方または両方のビームの一部を遮断する瞳変調手段を備えていることを特徴とする請求項１ないし請求項３のいずれか１に記載のレーザー顕微鏡。
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