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Die Erfindung betrifft ein Rastermikroskop mit einer Strahlablenkeinrichtung, die einen Beleuchtungslichtstrahl über oder durch eine Probe führt, und mit einem Detektor zum Empfangen von von der Probe ausgehendem Detektionslicht.
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In der Rastermikroskopie (Scanmikroskopie) wird eine Probe mit einem Lichtstrahl beleuchtet, um das von der Probe emittierte Reflexions- oder Fluoreszenzlicht zu beobachten. Der Fokus eines Beleuchtungslichtstrahles wird mit Hilfe einer steuerbaren Strahlablenkeinrichtung, im Allgemeinen durch Verkippen zweier Spiegel, in einer Objektebene bewegt, wobei die Ablenkachsen meist senkrecht aufeinander stehen, so dass ein Spiegel in x-, der andere in y-Richtung ablenkt. Die Verkippung der Spiegel wird beispielsweise mit Hilfe von Galvanometer-Stellelementen bewerkstelligt. Die Leistung des vom Objekt kommenden Lichtes wird in Abhängigkeit von der Position des Abtaststrahles gemessen. Üblicherweise werden die Stellelemente mit Sensoren zur Ermittlung der aktuellen Spiegelstellung ausgerüstet.
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Speziell in der konfokalen Scanmikroskopie wird ein Objekt mit dem Fokus eines Lichtstrahles in drei Dimensionen abgetastet.
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Ein konfokales Rastermikroskop umfasst im Allgemeinen eine Lichtquelle, eine Fokussieroptik, mit der das Licht der Quelle auf eine Lochblende - die sog. Anregungsblende - fokussiert wird, einen Strahlteiler, eine Strahlablenkeinrichtung zur Strahlsteuerung, eine Mikroskopoptik, eine Detektionsblende und die Detektoren zum Nachweis des Detektions- bzw. Fluoreszenzlichtes. Das Beleuchtungslicht wird über einen Strahlteiler eingekoppelt. Das vom Objekt kommende Fluoreszenz- oder Reflexionslicht gelangt über die Strahlablenkeinrichtung zurück zum Strahlteiler, passiert diesen, um anschließend auf die Detektionsblende fokussiert zu werden, hinter der sich die Detektoren befinden. Detektionslicht, das nicht direkt aus der Fokusregion stammt, nimmt einen anderen Lichtweg und passiert die Detektionsblende nicht, so dass man eine Punktinformation erhält, die durch sequentielles Abtasten des Objekts zu einem dreidimensionalen Bild führt. Meist wird ein dreidimensionales Bild durch schichtweise Bilddatennahme erzielt, wobei die Bahn des Abtastlichtstrahles auf bzw. in dem Objekt idealerweise einen Mäander beschreibt. (Abtasten einer Zeile in x-Richtung bei konstanter y-Position, anschließend x-Abtastung anhalten und per y-Verstellung auf die nächste abzutastende Zeile schwenken und dann, bei konstanter y-Position, diese Zeile in negativer x-Richtung abtasten u.s.w.). Um eine schichtweise Bilddatennahme zu ermöglichen, wird der Probentisch oder das Objektiv nach dem Abtasten einer Schicht verschoben und so die nächste abzutastende Schicht in die Fokusebene des Objektivs gebracht.
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Aus
DE 202 16 583 U1 ist ein Mikroskop mit einer Lichtquelle, die Licht zur Beleuchtung einer Probe emittiert und mit einem Spektrometer, das von der Probe ausgehendes Detektionslicht empfängt, bekannt. Das Mikroskop weist eine optische Anordnung mit einem akustooptischen Bauteil auf, die das Licht der Lichtquelle zur Probe leitet und das von der Probe ausgehende Detektionslicht spektral unaufgespalten dem Spektrometer zuführt.
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Aus der
US 2003/0107732 A1 ist ein Laserscanmikroskop bekannt, mit welchem ein bestimmter Spektralbereich des Detektionslichts gleichzeitig auf einen ersten Detektor und einen weiteren Detektor gelenkt werden kann.
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Die
DE 101 20 424 A1 betrifft ein Scanmikroskop mit einem Auskoppelelement, um zwischen Descan- und Non-Descan-Modus umschalten zu können.
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Die
DE 198 29 981 A1 betrifft ein Verfahren zur konfokalen Mikroskopie, bei welchem für jedes zu untersuchende Pixel eine Anregungsfrequenz und eine Anregungsintensität ausgewählt werden kann.
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Es ist die Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Rastermikroskop mit einer universellen Detektionsmöglichkeit anzugeben, um während der Bildaufnahme möglichst viele verschiedene Informationen erhalten zu können.
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Diese Aufgabe wird durch ein Rastermikroskop gelöst, das dadurch gekennzeichnet ist, dass das Rastermikroskop einen Auskoppelport oder einen weiteren Detektor aufweist und dass eine Umlenkvorrichtung vorgesehen ist, die mit der Strahlablenkeinrichtung synchronisiert ist und die das Detektionslicht in Abhängigkeit von der Ablenk-Stellung der Strahlablenkeinrichtung entweder zu dem Detektor oder zu dem Auskoppelport oder dem weiteren Detektor lenkt.
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Es ist ein Vorteil der vorliegenden Erfindung, dass während der Bildaufnahme gezielt zwischen Detektoren unterschiedlicher Bauart umgeschaltet werden kann.
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In einer besonders bevorzugten Ausführungsvariante ist an den Auskoppelport ein weiterer Detektor ankoppelbar. Bei dem weiteren Detektor kann es sich beispielsweise um einen Einzeldetektor, oder um ein Spektrometer handeln. Der weitere Detektor kann auch als Multibanddetektor ausgestaltet sein.
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In einer besonderen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Rastermikroskops umfasst die Umlenkvorrichtung ein akustooptisches Bauteil. Vorzugsweise ist die Umlenkvorrichtung drehbar oder schwenkbar angeordnet. In einer besonders bevorzugten Ausgestaltungsvariante umfasst die Umlenkvorrichtung einen Spiegel, der vorteilhafterweise als Segmentspiegel ausgestaltet sein kann.
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Die Umlenkvorrichtung beinhaltet vorzugsweise einen Filter und/oder eine Filterbeschichtung. So kann beispielsweise ein beschichtetes Substrat vorgesehen sein, das segmentweise derart beschichtet ist, dass einige Segmente Licht der Beleuchtungslichtwellenlänge reflektieren, andere dieses Licht passieren lassen. In einer besonderen Variante könnten die Segmente ideal für einen sequenziellen Linienscan mit Beleuchtungslicht unterschiedlicher Wellenlängen derart ausgelegt sein, dass jeweils ein Segment als Anregungsfilter (Blocken von Licht der Anregungswellenlänge, hohe Transmission für das jeweilige langwelligere Fluoreszenzlicht) für die gerade eingeschaltete Beleuchtungslichtwellenlänge wirksam ist.
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Die Segmente können beispielsweise als Bandpassfilter ausgeführt sein.
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In einer Ausführungsvariante ist ein Segment als Polarisationsfilter, insbesondere als Pol-Analysator, ausgeführt. Der Pol-Analysator weist hierbei vorzugsweise eine um 90 Grad gedrehte Durchlassrichtung zur Orientierung des Anregungslichtes auf. Ein weiteres Segment weist ebenfalls einen Pol-Analysator mit einer zum ersten Pol-Analysator gekreuzten Durchlassrichtung auf. Ferner kann ein drittes Segment einen dritten Pol-Analysator unter spezieller Orientierung (z.B. magic angle) aufweisen. Diese Anordnung bietet die Möglichkeit zur Messung von Fluoreszenzdepolarisation. Vorzugsweise wird hierbei zeilenweise zwischen den Segmenten umgeschaltet.
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Vorzugsweise ist die Rückseite eines Spiegels bzw. Filtersubstrats antireflexbeschi chtet.
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In einer besonders bevorzugten Ausgestaltungsform ist ein Antriebsmittel zum Drehen und/oder Schwenken der Umlenkvorrichtung vorgesehen. Das Antriebsmittel kann vorzugsweise als Galvanometer oder als Motor ausgestaltet sein.
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In einer besonderen Variante beinhaltet die Umlenkvorrichtung ein rundes Substrat, das kuchenstückartig segmentweise beschichtet ist. Das runde Substrat ist in seinem Mittelpunkt senkrecht auf einer Drehwelle gelagert, die von einem Motor, der mit der Strahlablenkeinrichtung synchronisiert ist, gedreht wird. Das Substrat wird von dem Detektionslichtstrahl unter schiefem Winkel (vorzugsweise 45 Grad) getroffen. Die gedachte Verlängerung der Drehwelle schneidet die optische Achse des Detektionslichtstrahls in Abhängigkeit von der Ablenkstellung der Strahlablenkeinrichtung, wird in dieser Variante durch den Motor die verschiedenen Segmente in den Strahlengang des Detektionslichts gedreht.
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Bei dieser Variante erhält man einen ortsfesten Detektionsstrahl, während die Verwendung eines in den Strahlengang schwenkbaren Spiegels zu einem bewegten Detektionslichtstrahl führt, der beispielsweise auf einen Zeilendetektor oder auf eine Streakkamera (z.B. für FLIM Untersuchungen) abgebildet werden kann.
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In einer bevorzugten Variante ist die Probe ebenenweise abtastbar. Hierbei kann vorgesehen sein, dass eine Umschaltung der Lenkung des Detektionslichts zu dem Detektor bzw. zu dem Auskoppelport synchron mit der ebenenweisen Abtastung erfolgt. Beispielsweise kann zunächst eine Abtastung der Probe bei Detektion mit dem Detektor erfolgen, während anschließend beim Abtasten der selben Ebene oder einer weiteren Ebene die Detektion über den weiteren Detektor erfolgt.
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In einer anderen ganz besonders bevorzugten Variante ist die Probe linienweise abtastbar. Hierbei ist vorzugsweise vorgesehen, dass eine Umschaltung der Lenkung des Detektionslichts zu dem Detektor bzw. zu dem Auskoppelport bzw. zu dem weiteren Detektor synchron mit der linienweisen Abtastung erfolgt. In dieser Variante ist es beispielsweise ermöglicht, in regelmäßiger Folge je zwei Scanlinien nacheinander mit dem weiteren Detektor und eine dritte Scanlinie mit dem Detektor zu detektieren. Die Ausgestaltung der Substratbeschichtung des Umlenkmittels ist in dieser Variante als Zweidrittel/Eindrittelunterteilung ausgeführt, so dass für die Dauer zum Abscannen von zwei Scanzeilen der externe Detektor und für die Zeitdauer zum Abscannen der jeweils folgenden Scanzeile der Detektor mit Detektionslicht beaufschlagt wird.
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Auch der Detektor kann ebenso wie der weitere Detektor als Einzeldetektor und/oder als Spektrometer und/oder als Multibanddetektor ausgeführt sein.
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In einer ganz besonders vorteilhaften Variante ist die Probe bidirektional abtastbar. Hierbei kann vorgesehen sein, dass Detektionslicht beim Hinlauf der bidirektionalen Abtastung zu dem Detektor und beim Rücklauf der bidirektionalen Abtastung zu dem Auskoppelport bzw. zu dem weiteren Detektor zu lenken.
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Das Umlenkmittel kann auch eine „Chopperscheibe“ beinhalten. Dies hat den Vorteil, dass kein optischer Strahlversatz hervorgerufen wird. Stege der Chopperscheibe können beispielsweise verspiegelt sein. Die Aufteilung von Stegen und freien Segmenten ist hierbei frei wählbar. Es ist auch denkbar, dass unterschiedliche Kreisausschnitte verschiedene Aufteilungen von Stegen und freien Segmenten aufweisen. Durch Verschieben der Chopperscheibe parallel zur Drehachse können somit unterschiedliche Betriebsarten ausgewählt werden.
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In einer besonders bevorzugten Ausgestaltungsform ist das Rastermikroskop als konfokales Rastermikroskop ausgeführt.
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In den Zeichnungen ist der Erfindungsgegenstand schematisch dargestellt und wird anhand der Figuren nachfolgend beschrieben, wobei gleich wirkende Bauteile mit denselben Bezugszeichen versehen sind. Dabei zeigt:
- 1 ein erfindungsgemäßes Rastermikroskop,
- 2 ein weiteres erfindungsgemäßes Rastermikroskop,
- 3 eine Detaildarstellung einer Umlenkvorrichtung,
- 4 eine Detaildarstellung einer Umlenkvorrichtung und
- 5 das Scanfeld einer abzutastenden Probe.
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1 zeigt ein erfindungsgemäßes Rastermikroskop mit einer Lichtquelle 1, die als Mehrlinienlaser 3 ausgeführt ist. Der Mehrlinienlaser 3 emittiert einen mehrere Lichtwellenlängen beinhaltenden Beleuchtungslichtstrahl 5. Der Beleuchtungslichtstrahl 5 gelangt nach Passieren der Beleuchtungslochblende 7 zu dem Hauptstrahlteiler 9, der den Beleuchtungslichtstrahl 5 zur Strahlablenkeinrichtung 11 lenkt. Die Strahlablenkeinrichtung 11 beinhaltet einen kardanisch aufgehängten Scanspiegel 13, der den Beleuchtungslichtstrahl 5 durch die Scanoptik 15, die Tubusoptik 17 sowie durch das Mikroskopobjektiv 19 über bzw. durch die Probe 21 führt. Das von der Probe ausgehende Detektionslicht 23 gelangt auf dem selben Lichtweg, nämlich durch das Mikroskopobjektiv 19, die Tubuslinse 17 sowie die Scanoptik 15 zurück zur Strahlablenkeinrichtung 11 und zum Hauptstrahlteiler 9, passiert diesen und die nachfolgende Detektionslochblende 25 und gelangt schließlich zur Umlenkvorrichtung 27. Die Umlenkvorrichtung 27 beinhaltet einen von einem nicht gezeigten Galvanometer angetriebenen Schwingspiegel 29, dessen Schwenkachse abseits der optischen Achse des Detektionslichts 23 liegt. Die Umlenkvorrichtung 27 ist über die elektronische Synchronisationseinheit 31 mit der Strahlablenkeinrichtung 11 derart synchronisiert, dass das Detektionslicht 23 in Abhängigkeit von der Ablenkstellung der Strahlablenkeinrichtung 11 entweder zu dem Detektor 33, der als Multibanddetektor 35 ausgeführt ist, oder zu dem weiteren Detektor 37, der in diesem Ausführungsbeispiel als Spektrometer ausgestaltet ist. Um das Detektionslicht 23 zu dem weiteren Detektor 37 zu lenken, dreht das nicht gezeigte Galvanometer den Schwingspiegel 29 in den Strahlengang des Detektionslichts 23. Um das Detektionslicht 23 zu dem Multibanddetektor 35 gelangen zu lassen, wird der Schwingspiegel 29 aus dem Strahlengang des Detektionslichts 23 gedreht. In der Zeichnung ist gerade die Stellung illustriert, bei der das Detektionslicht 23 zum Spektrometer 39 gelenkt wird. In den Zeiten, in denen der Schwingspiegel 29 aus dem Strahlengang des Detektionslichts 23 herausgedreht ist, verläuft das Detektionslichts so, wie es durch die gestrichelten Linien angedeutet ist. Der Multibanddetektor 35 beinhaltet ein Prisma 41, dass das Detektionslicht 23 räumlich spektral auffächert. Das räumlich spektral aufgefächerte Detektionslicht 23 wird mit der Feldlinse 43 zu einer Fokuslinie fokussiert, in der ein erster Spiegelschieber 45 und ein zweiter Spiegelschieber 47 angeordnet sind. Der spektrale Anteil, der von den Spiegelschiebern durchgelassen wird, wird von einem ersten Photomultipler 49 detektiert. Der Anteil des Detektionslichts 23, der von dem zweiten Spiegelschieber 47 reflektiert wird, gelangt nach Passieren einer weiteren Blendenanordnung 51 zu dem zweiten Photomultipler 53. Durch Einstellen der Spiegelschieber 45, 47, 51 kann eingestellt werden, welche Spektralanteile des Detektionslichts 23 zu dem ersten Photomultipler 49 bzw. zu dem zweiten Photomultipler 53 gelangen. Die Anordnung des Multibanddetektors 35 kann noch weitere Spiegelschieber und Detektoren beinhalten und demgemäss noch weiter kaskadiert sein. Der besseren Übersichtlichkeit halber wurden hier noch zwei Detektionskanäle illustriert.
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2 zeigt ein anderes erfindungsgemäßes Rastermikroskop 55 mit einer Lichtquelle 1, die als Mehrlinienlichtquelle 57 ausgeführt ist. Die Mehrlinienlichtquelle 57 emittiert einen mehrere Beleuchtungslichtwellenlängen beinhaltenden Beleuchtungslichtstrahl 5, der analog zu dem in 1 illustrierten Rastermikroskop über bzw. durch die Probe geführt wird. Das in 2 dargestellte Rastermikroskop weist eine Umlenkvorrichtung 27 mit einer Chopperscheibe 59, die über eine Drehwelle 61 von einem Motor 63 gedreht wird, auf. Die Chopperscheibe 59 weist eine in dieser Figur nicht gezeigte kuchenstückartige Segmentierung auf, so dass je nachdem welches Segment gerade in den Strahlengang des Detektionslichts 23 gedreht ist, das Detektionslicht in Abhängigkeit von der Ablenkstellung der Strahlablenkeinrichtung 11 entweder zu dem Detektor 33, der als Multibanddetektor 35 ausgeführt ist oder über den Umlenkspiegel 65 zu dem Auskoppelport 67 gelenkt wird. An den Auskoppelport 67 ist ein weiterer Detektor 37, der als Spektrometer 39 ausgeführt ist, angekoppelt.
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3 zeigt eine Umlenkvorrichtung 27, die aus einem kuchenstückartig segmentiert beschichteten Substrat 69, das über eine Drehwelle 61 von einem Motor 63 gedreht wird, besteht. Das Substrat 69 weist ein erstes Segment 71 auf, das das Detektionslicht 23 ungehindert passieren läßt. Das Substrat 69 weist ein zweites Segment 73 auf, das derart beschichtet ist, das Licht, das eine Wellenlänge oberhalb einer ersten Beleuchtungslichtwellenlänge (beispielsweise 488 nm) passieren kann und Detektionslichtanteile der ersten Beleuchtungslichtwellenlänge abblockt werden. Das Substrat 69 weist ein drittes Segment 75, das Licht oberhalb einer zweiten Beleuchtungslichtwellenlänge (z. B. 561 nm) passieren läßt und Licht dieser Wellenlänge und unterhalb dieser Wellenlänge abblockt, auf. Das Substrat 69 weist darüber hinaus ein viertes Segment 77 auf, das Licht oberhalb einer dritten Beleuchtungslichtwellenlänge von beispielsweise 630 nm passieren läßt und Detektionslicht mit Wellenlängen unterhalb der dritten Beleuchtungslichtwellenlänge abblockt. In diesem Beispiel könnte das von dem Segment 71 durchgelassene Detektionslicht anschließend beispielsweise zu einem Spektrometer gelangen, während das zweite, dritte und vierte Segment 73, 75, 77 das Detektionslicht 23 zu einem weiteren Detektor, der als Multibanddetektor ausgeführt sein könnte, umlenkt, so wie es in 4 illustriert ist.
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5 zeigt das Scanfeld 79 innerhalb einer mit dem Fokus eines Beleuchtungslichtstrahls abzutastenden Probe. Der Fokus des Beleuchtungslichtstrahls wird entlang einer Scanbahn 81 durchgeführt. Die Scanbahn 81 ist nicht ideal mäanderförmig, sondern gleicht im wesentlichen aufgrund der Trägheit der Strahlablenkeinrichtung eher einer Sinuskurve. In diesem Ausführungsbeispiel wird beim jeweiligen Hinlauf, also beim Lauf des Fokus des Beleuchtungslichtstrahls in positiver X-Richtung das erzeugte Detektionslicht einem Detektor, der beispielsweise ein Multibanddetektor sein kann, während das beim Rücklauf, also beim Lauf des Fokus des Beleuchtungslichtstrahls in negativer X-Richtung entstehende Detektionslicht einem weiteren Detektor, der beispielsweise ein Spektrometer sein kann, zugeführt.
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Die Erfindung wurde in Bezug auf eine besondere Ausführungsform beschrieben. Es ist jedoch selbstverständlich, dass Änderungen und Abwandlungen durchgeführt werden können, ohne dabei den Schutzbereich der nachstehenden Ansprüche zu verlassen.
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Bezugszeichenliste
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- 1
- Lichtquelle
- 3
- Mehrlinienlaser
- 5
- Beleuchtungslichtstrahl
- 7
- Beleuchtungslochblende
- 9
- Hauptstrahlteiler
- 11
- Strahlablenkeinrichtung
- 13
- Scanspiegel
- 15
- Scanoptik
- 17
- Tubusoptik
- 19
- Mikroskopobjektiv
- 21
- Probe
- 23
- Detektionslicht
- 25
- Detektionslochblende
- 27
- Umlenkvorrichtung
- 29
- Schwingspiegel
- 31
- Synchronisationseinheit
- 33
- Detektor
- 35
- Multibanddetektor
- 37
- Detektor
- 39
- Spektrometer
- 41
- Prisma
- 43
- Feldlinse
- 45
- erster Spiegelschieber
- 47
- zweiter Spiegelschieber
- 49
- erster Photomultipler
- 51
- Blendenanordnung
- 53
- zweiter Photomultipler
- 55
- Rastermikroskop
- 57
- Mehrlinienlichtquelle
- 59
- Chopperscheibe
- 61
- Drehwelle
- 63
- Motor
- 65
- Umlenkspiegel
- 67
- Auskoppelport
- 69
- Substrat
- 71
- erstes Segment
- 73
- zweites Segment
- 75
- drittes Segment
- 77
- viertes Segment
- 79
- Scanfeld
- 81
- Scanbahn
