JP4481980B2 - 長い生体内半減期を有する生理活性ポリペプチド結合体 - Google Patents
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Description
活性ポリペプチドの安定性を向上させるとともに、生体内活性を保持するための改善された方法として、本発明は、生理活性ポリペプチド、非−ペプチド重合体および免疫グロブリンが共有結合で互いに連結されたタンパク質結合体を提供する。
本発明の他の目的は、生理活性ポリペプチド、生体親和性非ペプチド性重合体および免疫グロブリンが共有結合で互いに連結されたタンパク質結合体の製造方法を提供することである。
本発明のさらに他の目的は、生理活性ポリペプチドの活性を減少させることなく、その生体内安定性を向上させ、血中半減期を増加させる方法を提供することである。
(b)共有結合で互いに連結された生理活性ポリペプチド、免疫グロブリンおよび非ペプチド性重合体を必須的に含むタンパク質結合体を分離する段階を含む、請求項1記載のタンパク質結合体の製造方法が提供される。
前記「結合体」という用語と区別される用語「連結体」は、生理活性ポリペプチド、非ペプチド性重合体および免疫グロブリンから選ばれた2種類の構成要素のみを含む化合物を意味する。
本発明の一実施態様に従って、共有結合で互いに連結された、i)生理活性ポリペプチド、ii)非ペプチド性重合体、およびiii)免疫グロブリンを含み、前記生理活性ポリペプチドの生体内半減期が延長されたタンパク質結合体が提供される。
1種類の重合体だけではなく、異なる種類の重合体の組合せが非ペプチド性重合体として使用され得る。
(a)少なくとも一つの生理活性ポリペプチド、少なくとも一つの免疫グロブリン、および両末端に反応基を有する少なくとも一つの非ペプチド性重合体を共有結合で連結する段階;および
(b)共有結合で連結された生理活性ポリペプチド、免疫グロブリンおよび非ペプチド性重合体を必須的に含むタンパク質結合体を単離する段階を含む、前記タンパク質結合体の製造方法を提供する。
(a1)非ペプチド性重合体の一方の末端を免疫グロブリンまたは生理活性ポリペプチドと共有結合で連結する段階;
(a2)反応混合物から非ペプチド性重合体と連結された免疫グロブリンまたは生理活性ポリペプチドを含む連結体を分離する段階;および
(a3)連結体の非ペプチド性重合体の自由末端を免疫グロブリンまたは生理活性ポリペプチドと共有結合で連結して非ペプチド性重合体が生理活性ポリペプチドおよび免疫グロブリンを共有結合で互いに連結するタンパク質結合体を生産する段階;を含み得る。
(段階1)hGH−PEG連結体の製造
ヒト成長ホルモン(hGH、分子量22kDa)を5mg/mlの濃度に100mMリン酸塩緩衝液に溶解し、両末端にアルデヒド反応基を有する分子量3.4kDaのポリエチレングリコール(ALD-PEG-ALD, Shearwater Inc.、米国)をhGH:PEGのモル比が1:1、1:2.5、1:5、1:10または1:20になるように加えた。これに還元剤としてナトリウムシアノボロハイドライド(NaCNBH3、Sigma)を最終濃度20mMになるように加え、この混合物を4℃で3時間攪拌した。PEGがhGHのアミノ末端部位に1:1のモル比で選択的に結合したhGH−PEG連結体を得るために、得られた反応混合物をスーパーデックス(Superdex(登録商標)、Pharmacia社製、米国)サイズ排除(size exclusion)クロマトグラフィーを行った。溶離液として10mMリン酸カリウム緩衝液(pH6.0)を用いてhGH−PEG連結体をカラムから溶離および精製し、修飾されていないhGH、未反応のPEGおよび二分子のhGHがPEGの両末端に連結された二量体副産物を除去した。精製されたhGH−PEG連結体を5mg/mlに濃縮した。最良の結果を得るためのhGH:PEGの最適のモル比は1:2.5〜1:5であることが確認された。
分子量150kDaの免疫グロブリンG(IgG、緑十字、韓国)を100mMリン酸塩緩衝液に溶解した。段階1で精製されたPEG−hGH連結体のアルデヒド基にIgGを結合させるために、hGH−PEG連結体:IgGのモル比が1:1、1:2、1:4または1:8になるようにhGH−PEG連結体をIgG−含有緩衝液に加えた。還元剤としてNaCNBH3を最終濃度が20mMになるように加え、この混合物を4℃で20時間徐々に攪拌した。結合反応後hGH−PEG−IgG結合体を汚染物から分離精製するために、反応混合物を用いて20mMトリス緩衝液(pH7.5)で平衡化したDEAEカラム(Pharmacia、米国)を用いた陰イオン交換クロマトグラフィーを行った。移動相を緩衝液A(20mMトリス緩衝液、pH7.5)から線形濃度勾配法(NaCl濃度0M→0.5M)で緩衝液B(1.0M NaClを含む20mMトリス緩衝液、pH7.5)に変えた。溶離したhGH−PEG−IgG結合体から少量の未反応のIgGおよび修飾されていないhGHを除去するために、溶離液として10mM酢酸ナトリウム(pH4.5)で平衡化したpolyCATカラム(PolyLC、米国)を用いた陽イオン交換樹脂クロマトグラフィーを行った。移動相を緩衝液A(10mM酢酸ナトリウム、pH4.5)から線形濃度勾配法(NaCl濃度0M→0.5M)で緩衝液B(1.0M NaClを含む10mM酢酸ナトリウム、pH4.5)に変えてhGH−PEG−IgG結合体を精製した(図1)。
最良の結果を得るためのhGH−PEG連結体:IgGの最適のモル比は1:4であることが確認された。
(段階1)IgG−PEG連結体の製造
IgG(緑十字、韓国)を100mMリン酸塩緩衝液に15mg/mlの濃度に溶解し、生成した溶液に3.4kDaのALD−PEG−ALD(Shearwater Inc.、米国)をIgG:PEGのモル比が各々1:1、1:2.5、1:5、1:10または1:20になるように加えた。これに還元剤としてNaCNBH3を最終濃度が20mMになるように加えた後、この混合物を4℃で3時間攪拌した。PEGがIgGのアミノ末端部位に1:1のモル比で選択的に結合したIgG−PEG連結体を分離するために、得られた反応混合物をスーパーデックス(Superdex(登録商標)、Pharmacia社製、米国)サイズ排除クロマトグラフィーを行った。溶離液として10mMリン酸カリウム緩衝液(pH6.0)を用いてIgG−PEG連結体を溶離および精製し、修飾されていないIgG、未反応のPEG、および二分子のIgGがPEGの両末端に連結された二量体副産物を除去した。精製されたIgG−PEG連結体を15mg/mlに濃縮した。最良の結果を得るためのIgG:PEGの最適のモル比は1:5〜1:10であることが確認された。
前記段階1で精製されたIgG−PEG連結体にhGH(分子量22kDa)を結合させるために、100mMリン酸塩緩衝液に溶解したhGHをIgG−PEG連結体と各々1:1、1:1.5、1:3または1:6のモル比で反応させた。これに還元剤としてNaCNBH3を最終濃度が20mMになるように加え、反応混合物を4℃で20時間攪拌した。得られた反応混合物を実施例1の段階2と同様な精製方法を行って未反応物質および副産物を除去し、IgG−PEG−hGH結合体を精製した。
hGHの代わりにインターフェロンアルファ2b(IFNα2b、分子量20kDa)を用い、IFNα2b:ALD−PEG−ALD(分子量3.4kDa)のモル比を1:5にしたことを除いては、実施例1と同様な方法でIFN−α−PEG−IgG結合体を製造および精製した。
hGHの代わりにヒト顆粒球コロニー刺激因子(G−CSF、分子量18.7kDa)を用い、G−CSF:ALD−PEG−ALD(分子量3.4kDa)のモル比を1:5にしたことを除いては、実施例1と同様な方法でG−CSF−PEG−IgG結合体を製造および精製した。
また、野生型G−CSFの17番目のアミノ酸がセリンで置換されたG−CSF誘導体(17S−G−CSF)を用いて前記と同様な方法でG−CSF誘導体−PEG−IgG結合体を製造および精製した。
hGHの代わりにヒト赤血球生成因子(Erythropoietin(EPO)、分子量35kDa)を用い、EPO:ALD−PEG−ALD(分子量3.4kDa)のモル比を1:5にしたことを除いては、実施例1と同様な方法でEPO−PEG−IgG結合体を製造および精製した。
両末端にアルデヒド基以外の異なる反応基を有するPEGを用いてhGH−PEG−IgG結合体を次のように製造した。100mMリン酸塩緩衝液に溶解したhGH10mgを両末端にスクシンイミジルプロピオネート(SPA)基を有するPEG(SPA−PEG−SPA、Shearwater Inc.、米国、分子量3.4kDa)とhGH:PEGのモル比が各々1:1、1:2.5、1:5、1:10または1:20になるように反応させた。反応混合物を室温で2時間攪拌した。hGHのリジン残基にPEGが1:1のモル比で選択的に結合したhGH−PEG連結体を得るために、反応混合物をスーパーデックス(登録商標)(Pharmacia社製、米国)サイズ排除クロマトグラフィーを行って分離した。溶離液として10mMリン酸カリウム緩衝液(pH6.0)を用いてhGH−PEG連結体を溶離および精製し、修飾されていないhGH、未反応のPEGおよび二分子のhGHがPEGの両末端に連結された二量体副産物を除去した。精製されたhGH−PEG連結体を5mg/mlに濃縮した。濃縮hGH−PEG連結体を用いて実施例1と同様な方法でhGH−PEG−IgG結合体を製造した。最良の結果を得るためのhGH:PEGの最適のモル比は1:2.5〜1:5であることが確認された。
両末端にN−ヒドロキシスクシンイミジル(N-hydroxysuccinimidyl;NHS)基を有するPEG(NHS−PEG−NHS;Shearwater Inc.、米国)を用いたことを除いては、前記と同様な方法を行って他のhGH−PEG−IgG結合体を製造および精製した。
分子量が10,000ダルトンであり、両末端にアルデヒド反応基を有するPEGであるALD−PEG−ALD(Shearwater Inc.、米国)を用いたことを除いては、実施例1の段階1と同様な方法でhGH−PEG連結体を製造および精製した。この際、最良の結果を得るためのhGH:PEGの最適のモル比は1:2.5〜1:5であることが確認された。精製されたhGH−PEG連結体を5mg/mlになるように濃縮した。濃縮されたhGH−PEG連結体を用いて実施例1の段階2と同様な方法でhGH−PEG−IgG結合体を製造した。
(段階1)Fab’の発現および精製
抗−TNF−αFab’を発現する大腸菌BL21/poDLHF(寄託番号:KCCM10511)をLB培地100mlに接種して一晩振盪培養した。培養したLBブロスを5lフェメンター(Marubishi)に移して温度30℃、空気投入量20vvm、攪拌速度500rpmの条件下で培養した。発酵が進むにつれて、微生物の成長によって惹起されたエネルギー源の不足を補充するために適当量のブドウ糖(glucose)と酵母抽出液(yeast extract)を培養水に加えた。吸光度600nmで培養液の吸光度が80に至ると、IPTGを培養液に加えてタンパク質発現を誘導した。培養液の吸光度が600nmで120〜140になるまで40〜45時間培養を続けた。得られた発酵液を遠心分離(20,000xg、30分)して上澄液を得た。
免疫グロブリン(IgG、分子量150kDa、緑十字、韓国)150mgを100mM PBS(pH6.0)に5mg/mlの濃度で溶解し、これにNHS−PEG−MAL(分子量3,400ダルトン、Shearwater Inc.、米国)をIgG:PEGのモル比が1:10になるように加えた。反応混合物を4℃で12時間徐々に攪拌した。
反応終了後、反応緩衝液を20mM PBS(pH6.0)に取り替えて未反応のNHS−PEG−MALを除去した。その後、この反応混合物をpolyCAT 21x250カラム(PolyLC Inc.、米国)に充填し、20mM PBS(pH6.0)で線形濃度勾配法(NaCl濃度0.15M→0.5M)を用いて溶離してIgG−PEG連結体を得た。未反応のIgGがIgG−PEG連結体よりも遅く溶離され、除去された。
段階1で得られた精製されたFab’を100mM PBS(pH7.3)に2mg/mlの濃度に溶解し、生成した溶液に段階2で製造されたIgG−PEG連結体をFab’:連結体のモル比が1:5になるように加えた。反応混合物をタンパク質濃度が50mg/mlになるように濃縮し、4℃で24時間徐々に攪拌した。
(段階1)Fab’−PEG連結体(N−末端)の製造
前記実施例8の段階1で得られた精製されたFab’ 40mgを100mM PBS(pH6.0)に5mg/mlの濃度に溶解した後、生成した溶液にButyl ALD−PEG−ButylALD(分子量3,400Da、Shearwater Inc.、米国)をFab’:PEGのモル比が1:5になるように加えた。還元剤としてNaCNBH3を最終濃度が20mMになるように加えた後、反応混合物を4℃で2時間徐々に攪拌した。
反応終了後、反応緩衝液を20mM PBS(pH6.0)に取り替えた。緩衝液を取り替えた後、混合物をpolyCAT 21x250カラム(PolyLC Inc.、米国)に充填し、20mM PBS(pH4.5)で線形濃度勾配法(NaCl濃度0.15M→0.4M)を用いて溶離してFab’−PEG連結体を含む分画を得た。未反応のFab’が連結体よりも遅く溶離され、除去された。
段階1で得られた精製されたFab’−PEG連結体を100mM PBS(pH6.0)に10mg/mlの濃度で溶解した後、生成した溶液にIgG(分子量150kDa、緑十字、韓国)を連結体:IgGのモル比が1:5になるように加えた。反応混合物を最終タンパク質濃度が50mg/mlになるように濃縮した。還元剤としてNaCNBH3を最終濃度が20mMになるように加えた後、反応混合物を4℃で24時間徐々に攪拌した。
IgG(緑十字、韓国)200mgを100mMリン酸塩緩衝液(pH7.5)に2mg/mlの濃度になるように溶解し、これに300U/mgの脱糖鎖化酵素PNGase F(NEB Inc.、イギリス)を加えた。反応混合物を37℃で24時間徐々に攪拌しながら反応させた。反応終了後、反応混合物をSPセファロースFFカラム(ファルマシア、ドイツ)に加え、1M NaClを用いる線形濃度勾配法(0.1M→0.6M)を用いて10mMアセテート緩衝液(pH4.5)で溶離し、野生型IgGよりも遅く溶離した糖鎖除去されたIgGの分画を得た。
前記実施例3で製造されたIFNα−PEG連結体に前記実施例10で製造された糖鎖除去されたIgG(AG IgG)を結合することによって次のようにIFNα−PEG−AG IgG結合体を製造した。
AG IgG(分子量:約147kDa)を10mMリン酸塩緩衝液に溶解した。IFNα−PEG連結体をAG IgG−含有緩衝液にIFNα−PEG連結体:AG IgGのモル比が各々1:1、1:2、1:4および1:8になるように加えた。生成した混合物を100mMリン酸塩緩衝溶液の状態にし、還元剤としてNaCNBH3を最終濃度が20mMになるように加えた。反応混合物を4℃で20時間徐々に攪拌した。最良の結果を得るためのIFNα−PEG連結体:AG IgGの最適のモル比は1:2であることが確認された。
前記実施例5で精製されたEPO−PEG連結体と、前記実施例10で製造された糖鎖が除去されたIgGを用いて実施例11と同様な方法でEPO−PEG−AG IgG結合体を得た。
hGH5mgを100mMリン酸カリウム緩衝液(pH6.0)に溶解して溶液5mlを得、40kDa PEGを有する活性化されたメトキシ−PEG−ALD(Shearwater社製、米国)をhGH:PEGのモル比が1:4になるように前記溶液に加えた。これに還元剤であるNaCNBH3を最終濃度が20mMになるように加えた後、反応混合物を4℃で18時間徐々に攪拌した。これにエタノールアミンを最終濃度が50mMになるように加えて未反応のPEGを失活させた。
未反応のPEGを除去するために、得られた反応混合物をセファデックスG−25カラム(Pharmacia社製)クロマトグラフィーで処理した。まず、カラムを2カラム体積(column volume;CV)の10mM Tris−HCl(pH7.5)緩衝液で平衡化した後反応混合物を加えた。UV分光光度計を用いて260nmで溶離分画の吸光度を分析した。分子量がさらに大きいPEG−修飾されたhGHが先に溶離され、未反応のPEGが後で溶離された。
前記混合物からモノ−PEG結合hGH連結体をさらに精製するために、カラム溶離物を用いてサイズ排除クロマトグラフィーを行った。前記溶離液を濃縮して10mMリン酸ナトリウム緩衝液で平衡化したスーパーデックス200(Superdex 200、Pharmacia社製)に加え、同じ緩衝液で流速1ml/分で溶離した。トリ−、ジ−PEGが連結されたhGH連結体はモノ−PEGが連結されたhGH連結体よりも溶離時間が速いので、これを除去してモノ−PEGが連結されたhGH連結体のみを純粋分離した。
同様な方法でIFNαまたはG−CSFのアミノ末端に40kDa PEGが各々結合したPEG−IFN、PEG−17S−G−CSF誘導体およびPEG−G−CSF連結体を製造した。
実施例1で得られたhGH−PEG連結体にアルブミンを結合させるために、hGH−PEG連結体を10mMリン酸塩緩衝液に溶解したヒトアルブミン(HAS、分子量約67kDa)(緑十字、韓国)とhGH−PEG連結体:アルブミンのモル比が各々1:1、1:2、1:4または1:8になるようにして反応させた。得られた反応混合物を100mMリン酸塩緩衝液の状態で濃縮し、これに還元剤としてNaCNBH3を最終濃度が20mMになるように加えた。反応混合物を4℃で20時間徐々に攪拌した。最良の結果を得るためのhGH−PEG連結体:アルブミンの最適のモル比は1:2であることが確認された。
同様な方法でIFNα、G−CSFまたは17S−G−CSF誘導体に各々アルブミンが結合したIFNα−PEG−アルブミン、G−CSF−PEG−アルブミンおよび17S−G−CSF誘導体−PEG−アルブミン結合体を製造および精製した。
実施例8の段階1で得られた精製されたFab’を活性化緩衝液(20mM酢酸ナトリウム(pH4.0)、0.2mM DTT)に1時間放置して遊離−SH基を活性化させた。緩衝液をPEG修飾緩衝(50mMリン酸カリウム(pH6.5))に取り替えた。生成した溶液にマレイミド−PEG(分子量40kDa、Shearwater Inc.、米国)をFab’:PEGのモル比が1:10になるように添加した。この反応混合物を4℃で24時間徐々に攪拌した。
(1)タンパク質結合体の確認
4〜20%の濃度勾配を有するゲルを用いるSDS−PAGEおよびELISA法(R & D system、米国)を用いて前記実施例で製造したタンパク質結合体の修飾状態を分析した。
hGH、hGH−PEG、IFNおよびIFN−PEGにDTT(Dithiothreitol)を各々50mMの量で添加した後、SDS−PAGEを行い、IgG、hGH−PEG−IgGおよびIFN−PEG−IgGはDTTなしで展開した。
図2から分かるように、hGH−PEG−IgG結合体の見かけ分子量は約170kDaである。しかし、IgGタンパク質結合体と野生型IgGの分子量差異はSDS−PAGEで区別しにくいため、hGH−PEG−IgG結合体およびIgGを各々DTTで処理して還元させて軽鎖および重鎖に分離し、その結合状態をSDS−PAGEで各々確認した(図4)。
前記実施例で製造した各タンパク質結合体の量はサイズ排除クロマトグラフィー(カラム:Superdex、溶離液:10mMリン酸カリウム緩衝液(pH6.0))から観察された結合体のピーク面積をコントロールと比較して計算する方法で測定した。予め定量されたhGH、IFN、G−CSF、17S−G−CSF、EPOおよびIgGで各々サイズ排除クロマトグラフィーを行った後、ピーク面積の相対的感応(response)係数を測定した。各タンパク質結合体を一定量用いて同じ条件下でサイズ排除クロマトグラフィーを行い、ここから得られた各タンパク質結合体のピーク面積からIgGに該当するピーク面積を引いた値を各タンパク質結合体に存在する生理活性タンパク質の定量値とした。
実施例3で得られたIFNα−PEG−IgG結合体の純度を分析するために、逆相カラム(259VHP54カラム、Vydac社、米国)を用いて逆相HPLCを行った。結合体を0.5%TFAの存在下でアセトニトリル溶媒で線形濃度勾配法法(アセトニトリル濃度:40%→100%)を用いて溶離し、280nmで検出した。図5から分かるように、結合体の純度は95%以上である。
各々の実施例で得られたタンパク質結合体に対してサイズ排除クロマトグラフィーを行った後、280nmで吸光度を分析した。hGH−PEG−IgG、IFN−PEG−IgG、G−CSFおよび17S−G−CSF−PEG−IgGは各々170,000〜180,000ダルトンの分子量に該当する単一ピークを示した。EPO−PEG−IgGのピークは分子量200,000ダルトンに該当する位置から観察された。
また、前記MALDI−TOF法で測定された実施例10で製造したAG IgGの分子量は野生型IgGよりも3,000Daが少ない147kDaであった(図9)。減少した分子量3,000Daは糖鎖の理論的サイズに該当するので、IgGの糖鎖が完全に除去されたことを確認できた。
下記表2は前記実施例11〜12で製造したIFNα−PEG−AG IgGおよびEPO−PEG−AG IgG結合体の分子量を示す。
前記実施例および比較例で製造したIgG−タンパク質結合体、PEG−タンパク質連結体およびアルブミン−タンパク質結合体(試験群)の生体内安定性および薬物動力学係数を野生型生理活性タンパク質(対照群)と比較した。下記実験では、各群当り5匹のスプラーグ・ドーリー(SD)ラットを用いた。対照群、PEG−連結体、アルブミン−タンパク質結合体およびIgG−タンパク質結合体を各々100ug/kgずつラットに皮下注射した。対照群から注射後0.5、1、2、4、6、12、24、30、48、72および96時間後に血液試料を得、試験群からは注射後1、6、12、24、30、48、72、96、120、240および320時間後に血液試料を得た。血液試料をヘパリンでコーティングされたチューブに集めて凝固を防止し、高速マイクロ遠心分離器で4℃、3000xgで30分間遠心分離して細胞を除去した。血漿中のタンパク質濃度は各生理活性タンパク質に対する抗体を用いてELISA方法で測定した。
実施例8および9で各々製造したFab’−S−PEG−N−IgG、Fab’−N−PEG−N−IgG結合体(−SH基、N−末端)、および比較例3で製造したFab’−S−40K PEG連結体の血中半減期を測定するために、Fab’を対照群とし、前記結合体または連結体を用いて試験例2と同様な方法で薬物動力学分析を行った。その結果を図12に示す。
図12から分かるように、Fab’−S−PEG−N−IgG、Fab’−N−PEG−N−IgG結合体はFab’およびFab’−S−40K PEG連結体に比べて2〜3倍延長された血中半減期を示した。
(1)hGHタンパク質結合体の試験管内活性比較
hGH−PEG−IgG結合体(実施例1)、40kDa PEG−hGH連結体(比較例1)およびhGH−PEG−アルブミン結合体(比較例2)の試験管内活性をhGH依存性有糸***をする細胞であるラット結節リンパ腫(rat node lymphoma)細胞株Nb2(European Collection of Cell Cultures(ECACC) #97041101)を用いて次のように測定した。
IFNαタンパク質結合体の試験管内活性を比較するために、IFNα−PEG−IgG結合体(実施例3)、40kDa PEG−IFNα連結体(比較例1)およびIFNα−PEG−アルブミン結合体(比較例2)の抗ウイルス活性を水胞性口炎ウイルスで飽和させたマディン−ダービ(Madin-Darby)ウシ腎臓細胞(MDBK、Madin Darby Bovine Kidney、ATCC CCL−22)を用いる細胞培養生検法(cell cultrue biopsy method)で測定した。PEGで修飾されていないIFNα 2b(NIBSC IFN)を対照群として用いた。
このような結果は、本発明のIgGタンパク質結合体が延長された半減期とともに高い生体内活性を示すことを示す。
野生型G−CSF(Filgrastim)、17Ser−G−CSF誘導体、20kDa PEG−G−CSF連結体(Neulasta, USA)、40kDa PEG−17S−G−CSF誘導体連結体(比較例1)、17Ser−G−CSF誘導体−PEG−アルブミン結合体(比較例2)および17S−G−CSF誘導体−PEG−IgG結合体(実施例4)の試験管内活性を測定した。
このようにして製造された試料10μlずつを培養中のHL−60細胞が入っている各ウェルに加え、最終濃度を1000ng/mlから連続的に半減させた。タンパク質試料で処理された細胞を37℃培養器で72時間さらに培養した。
培養後、細胞の成長程度を調査するために、CellTiter96(商標)(PROMEGA社、米国)を用いて670nmで吸光度を測定することによって細胞数を決定した。
野生型EPO(BRP、UK)、高糖鎖化EPO(Aranesp、USA)およびEPO−PEG−IgG結合体の試験管内活性を測定した。
まず、ヒト骨髄起源の細胞株であるTF−1細胞(ATCC CRL-2003、erythroleukemia)を10%のFBS、12ng/mlのGM−CSFを含むRPMI1640培地で培養した後、GM−CSFを除去した同じRPMI1640培地で1日間培養した。約2×104個の細胞を有する培養液50μlずつを96−ウェルプレート(Corning/low evaporation 96 well plate)の各ウェルに加え、37℃、5%CO2培養器で72時間培養した。
このように製造された試料を培養中のTF−1細胞が入っている各ウェルに50μlずつ加え、最終濃度を5μg/mlから連続的に半減させた。タンパク質試料で処理されたプレートを37℃、5%CO2培養器で72時間さらに培養した。
培養後、細胞の成長程度を調査するために、CellTiter96(商標)AQueous One(Cat. No. G3581、PROMEGA社製、米国)を用いて490nmで吸光度を測定することによって細胞数を決定した。
実施例8および9で製造したFab’−S−PEG−N−IgGおよびFab’−N−PEG−N−IgG結合体、および比較例3で製造したFab’−S−40K PEG連結体がマウス繊維芽細胞株L929(ATCC CRL−2148)に対するTNF−αの細胞毒性を中和させる能力を測定することによって、これらの試験管内活性を調査した。
(1)hGHタンパク質結合体の生体内活性比較
各実験群当り10匹ずつの脳下垂体が除去された雄スプラーグ・ドーリーラット(5週齢、SLC社製、日本)を用いて体重増加試験を行ってhGH−PEG−IgG結合体、hGH−40K PEG連結体および野生型hGHの生体内活性を測定した。溶媒対照群、野生型hGH、hGH−PEG−IgG結合体、およびhGH−40K PEG連結体を、下記表12のような投与スケジュールおよび容量に従って、ラットの肩背部の皮下に26G注射器(1ml、(株)韓国ワクチン)で各々投与した。投与前および投与16時間後ラットの体重を測定した。最終投与から24時間後、ラットをエーテル麻酔で致死させ、肉眼で脳下垂体の残存有無を検査して、脳下垂体の残存物が観察された個体は結果から除外した。
17番目のアミノ酸がセリンで置換された17Ser−G−CSFを用いて本発明のタンパク質結合体の効果を調査するために、野生型G−CSF、市販中の20kDa PEG−G−CSF連結体および17Ser−G−CSF−PEG−IgG結合体の生体内活性を比較した。本発明の17Ser−G−CSF−PEG−IgG結合体は溶媒(20mMリン酸ナトリウム、1%グリシン、0.25%マンニトール、pH7.0)に溶解した。比較群としては、野生型メチオニルG−CSF連結体(Filgrastim、Amgen、USA)および20kDaのPEGで修飾されたG−CSF(Neulasta、Amgen、USA)を前記と同じ溶媒に希釈して使用した。7週齢の雌ICRマウスをセムタコBio(韓国)から購入して一週間の順化期間を経た後試験に用いた。試験開始時、ICRマウスの体重は30〜35gであった。順化期間および試験期間中には実験動物用飼料(三養社、韓国)および水を自由に摂取させ、温度22±3℃、相対湿度55±5%、換気回数10〜12回/時間、照度150〜200ルクス(lux)および12時間明/12時間暗の明暗周期の条件下で檻に閉じ込めた。各実験群は5匹のマウスからなり、複合抗癌剤と各試料を下記表13のような投与スケジュールおよび容量でマウスに投与した。好中球減少症(Neutropenia)動物モデルはシクロヘキサミド(CPA;Sigma、米国)130mg/kg、ドキソルビシン(DXR;Sigma、米国)4.5mg/kgおよびビンクリスチン(VCR;Sigma、米国)1mg/kgの混合物をICRマウスの腹腔内に単回投与して製造した。無処置群は抗癌剤を投与せず、好中球数の減少を示さない。溶媒対照群は抗癌剤を投与して好中球の数を低め、薬物の代わりに賦形剤のみを投与した群である。抗癌剤投与後1日目から5日目まで午前10時頃に野生型G−CSFを100μg/kg/日の容量で皮下注射した。17Ser−G−CSF−PEG−IgG結合体と20kDa PEG−G−CSF連結体(Neulasta、Amgen、USA)は抗癌剤投与後1日目に1回のみ投与したが、投与容量は1000μg/kg/日であって、野生型1日投与容量の2倍量で(200μg/kg/日)5日分を一回に投与した。抗癌剤投与後1、2、3、4、5、6および8日目に0.3〜0.5mlの血液をマウスの眼窩静脈層から採血した。採血時間は薬物投与6時間後である午後4時頃であった。自動血球測定器で白血球(WBC)、赤血球(RBC)および血小板(Platelet)の数を測定した。また、血液塗抹標本を製作してギムザ(Giemsa)染色を行った。各血球を分別計数して得られた好中球(neutrophil)の比率を得、これに基づいて下記式1によって好中球の数を算出した。
好中球の数(細胞/mm3)=総WBCの数(細胞/mm3)×好中球比率(%)×1/100
無処置群、溶媒対照群、および17Ser−G−CSF誘導体−PEG−IgG群から得られた値の統計的有意義性を検証するために、各群の血球数および体重に対してStudent’s t-testを用いて統計的分析を行った。
野生型EPO、高糖鎖化EPO(Aranesp、USA)、およびEPO−PEG−IgG結合体の生体内活性を比較するために、前記試験試料を投与したラットにおける血液成分の変化を調査した。本実験は、文献〔J.C. Egrie and Browne, British Journal of Cancer (2001) B4 (Supplement 1), 3-10〕に記述された方法を若干変形して次のように行った。
Claims (32)
- 共有結合で互いに連結されたi)生理活性ポリペプチド、ii)ポリ(エチレングリコール)、およびiii)完全なIgG分子をこの順番で含み、前記生理活性ポリペプチドの生体内半減期が延長されたタンパク質結合体。
- 前記ポリ(エチレングリコール)が両末端に各々反応基を有し、これらを通じて前記ポリ(エチレングリコール)が生理活性ポリペプチドおよび完全なIgG分子と共有結合で連結されている、請求項1記載のタンパク質結合体。
- 前記完全なIgG分子が、少なくとも二つの生理活性ポリペプチドとポリ(エチレングリコール)からなる連結体に共有結合で連結されている、請求項2記載のタンパク質結合体。
- 前記完全なIgG分子がIgG1、IgG2、IgG3、IgG4およびこれらの混合物からなる群から選ばれる、請求項1記載のタンパク質結合体。
- 前記完全なIgG分子がヒトIgGである、請求項1記載のタンパク質結合体。
- 前記完全なIgG分子が、野生型糖鎖を有するIgG、増加または減少した糖鎖を有するIgG、糖鎖が除去されたIgG、およびこれらの組合せからなる群から選ばれる、請求項1記載のタンパク質結合体。
- 前記IgGの糖鎖の増減または除去が、化学的方法、酵素的方法、遺伝工学的方法およびこれらの組合せからなる群から選ばれる方法によって行われる、請求項6記載のタンパク質結合体。
- 前記PEGの反応基がアルデヒド、プロピオンアルデヒド、ブチルアルデヒド、マレイミドおよびスクシンイミド誘導体からなる群から選ばれる、請求項2記載のタンパク質結合体。
- 前記スクシンイミド誘導体がスクシンイミジルプロピオネート、スクシンイミジルカルボキシメチル、ヒドロキシスクシンイミジルまたはスクシンイミジルカーボネートである、請求項8記載のタンパク質結合体。
- 前記PEGが両末端に各々アルデヒド基を有する、請求項8記載のタンパク質結合体。
- 前記PEGが、その両末端で前記完全なIgG分子のアミノ末端、リジン残基、ヒスチジン残基またはシステイン残基、および前記生理活性ポリペプチドのアミノ末端、リジン残基、ヒスチジン残基またはシステイン残基と各々共有結合で連結される、請求項1記載のタンパク質結合体。
- 前記生理活性ポリペプチドがホルモン、サイトカイン、酵素、抗体、成長因子、転写調節因子、血液因子、ワクチン、構造タンパク質、リガンドタンパク質およびレセプターからなる群から選ばれる、請求項1記載のタンパク質結合体。
- 前記生理活性ポリペプチドがヒト成長ホルモン、成長ホルモン放出ホルモン、成長ホルモン放出ペプチド、インターフェロン類、コロニー刺激因子、インターロイキン類、グルコセレブロシダーゼ(glucocerebrosidase)、マクロファージ活性化因子、マクロファージペプチド、B細胞因子、T細胞因子、タンパク質A、アレルギー抑制因子、細胞壊死糖タンパク質、免疫毒素、リンホトキシン、腫瘍壊死因子、腫瘍抑制因子、転移成長因子、アルファ−1アンチトリプシン、アルブミン、アポリポタンパク質−E、エリトロポイエチン、高糖鎖化エリトロポイエチン、血液因子VII、血液因子VIII、血液因子IX、プラスミノゲン活性化因子、ウロキナーゼ、ストレプトキナーゼ、タンパク質C、C−反応性タンパク質、レニン抑制剤、コラゲナーゼ抑制剤、スーパーオキシドジスムターゼ、レプチン、血小板由来成長因子、表皮成長因子、骨形成成長因子、骨形成促進タンパク質、カルシトニン、インシュリン、アトリオペプチン、軟骨誘導因子、結合組織活性化因子、卵胞刺激ホルモン、黄体形成ホルモン、FSH放出ホルモン、神経成長因子、副甲状腺ホルモン、リラクシン、セクレチン、ソマトメジン、インシュリン−類似成長因子、副腎皮質刺激ホルモン 、グルカゴン、コレシストキニン、膵臓ポリペプチド、ガストリン放出ペプチド、コルチコトロピン放出因子、甲状腺刺激ホルモン、レセプター類、レセプター拮抗物質、細胞表面抗原、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、Fab、Fab’、F(ab’)2、FdおよびscFvを含む抗体断片、およびウイルス由来のワクチン抗原からなる群から選ばれる、請求項12記載のタンパク質結合体。
- 前記生理活性ポリペプチドがヒト成長ホルモン、インターフェロンアルファ、インターフェロンベータ、顆粒球コロニー刺激因子または赤血球生成因子である、請求項13記載のタンパク質結合体。
- (a)少なくとも一つの生理活性ポリペプチド、および少なくとも一つの完全なIgG分子を両末端に反応基を有する少なくとも一つのPEGと共有結合で連結する段階;および
(b)共有結合で互いに連結された生理活性ポリペプチド、完全なIgG分子およびPEGを必須的に含むタンパク質結合体を分離する段階を含む、請求項1記載のタンパク質結合体の製造方法。 - 前記段階(a)が、
(a1)PEGの一方の末端を完全なIgG分子または生理活性ポリペプチドのいずれか一つと共有結合で連結する段階;
(a2)生成した反応混合物からPEGと連結された完全なIgG分子または生理活性ポリペプチドを含む連結体を分離する段階;および
(a3)前記連結体のPEGの自由末端を完全なIgG分子または生理活性ポリペプチドと共有結合で連結して、共有結合で互いに連結された生理活性ポリペプチド、PEGおよび完全なIgG分子を含むタンパク質結合体を生成する段階をさらに含む、請求項15記載の方法。 - 前記段階(a1)において生理活性ポリペプチドとPEGのモル比が1:2.5〜1:5である請求項16記載の方法。
- 前記段階(a1)において完全なIgG分子とPEGのモル比が1:5〜1:10である請求項16記載の方法。
- 前記段階(a3)において、段階(a2)で得られた連結体と完全なIgG分子または生理活性ポリペプチドのモル比が1:1〜1:3である請求項16記載の方法。
- 前記段階(a1)および(a3)が各々還元剤の存在下で行われる請求項16記載の方法。
- 前記還元剤がナトリウムシアノボロハイドライド、ナトリウムボロハイドライド、ジメチルアミンボレートおよびピリジンボレートである請求項20記載の方法。
- 請求項1〜14のいずれか一項に記載のタンパク質結合体および薬剤学的に許容可能な担体を含む、半減期が延長された生理活性ポリペプチドを含む医薬組成物。
- 両末端に反応基を有するPEGを生理活性ポリペプチドおよび完全なIgG分子と共有結合で連結することを含む、生理活性ポリペプチドの生体内半減期を延長させる方法。
- 前記完全なIgG分子が、少なくとも二つの生理活性ポリペプチドとPEGからなる連結体に共有結合で連結されている請求項23記載の方法。
- 前記完全なIgG分子がIgG1、IgG2、IgG3、IgG4およびこれらの混合物からなる群から選ばれる請求項23記載の方法。
- 前記完全なIgG分子がヒトIgGである請求項25記載の方法。
- 前記完全なIgG分子が、野生型糖鎖を有するIgG、増加または減少した糖鎖を有するIgG、糖鎖が除去されたIgG、およびこれらの組合せからなる群から選ばれる請求項23記載の方法。
- 前記IgGの糖鎖の増減または除去が、化学的方法、酵素的方法、遺伝工学的方法およびこれらの組合せからなる群から選ばれる方法によって行われる請求項27記載の方法。
- 前記PEGの反応基がアルデヒド、プロピオンアルデヒド、ブチルアルデヒド、マレイミドおよびスクシンイミド誘導体からなる群から選ばれる請求項23記載の方法。
- 前記生理活性ポリペプチドがホルモン、サイトカイン、酵素、抗体、成長因子、転写調節因子、血液因子、ワクチン、構造タンパク質、リガンドタンパク質およびレセプターからなる群から選ばれる請求項23記載の方法。
- 前記生理活性ポリペプチドがヒト成長ホルモン、成長ホルモン放出ホルモン、成長ホルモン放出ペプチド、インターフェロン類、コロニー刺激因子、インターロイキン類、グルコセレプロシダーゼ(glucocerebrosidase)、マクロファージ活性化因子、マクロファージペプチド、B細胞因子、T細胞因子、タンパク質A、アレルギー抑制因子、細胞壊死糖タンパク質、免疫毒素、リンホトキシン、腫瘍壊死因子、腫瘍抑制因子、転移成長因子、アルファ−1アンチトリプシン、アルブミン、アポリポタンパク質−E、エリトロポイエチン、高糖鎖化エリトロポイエチン、血液因子VII、血液因子VIII、血液因子IX、プラスミノゲン活性化因子、ウロキナーゼ、ストレプトキナーゼ、タンパク質C、C−反応性タンパク質、レニン抑制剤、コラゲナーゼ抑制剤、スーパーオキシドジスムターゼ、レプチン、血小板由来成長因子、表皮成長因子、骨形成成長因子、骨形成促進タンパク質、カルシトニン、インシュリン、アトリオペプチン、軟骨誘導因子、結合組織活性化因子、卵胞刺激ホルモン、黄体形成ホルモン、FSH放出ホルモン、神経成長因子、副甲状腺ホルモン、リラクシン、セクレチン、ソマトメジン、インシュリン−類似成長因子、副腎皮質刺激ホルモン、グルカゴン、コレシストキニン、膵臓ポリペプチド、ガストリン放出ペプチド、コルチコトロピン放出因子、甲状腺刺激ホルモン、レセプター類、レセプター拮抗物質、細胞表面抗原、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、Fab、Fab’、F(ab’)2、FdおよびscFvを含む抗体断片、およびウイルス由来のワクチン抗原からなる群から選ばれる、請求項30記載の方法。
- 前記生理活性ポリペプチドがヒト成長ホルモン、インターフェロンアルファ、インターフェロンベータ、顆粒球コロニー刺激因子、または赤血球生成因子である請求項31記載の方法。
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