KR20080072639A - 생리활성 기질-혈액 단백질 복합체 및 이를 이용하는생리활성 기질의 안정화 방법 - Google Patents

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김흥재
임채진
강종필
최호일
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Abstract

본 발명은 생체내 반감기가 짧고 안정성이 낮은 저분자량 생리활성 기질의 효과적인 혈액내 전달을 위한 변형 설계 기술에 관한 것으로, 보다 상세하게는, 인간을 포함하는 포유류에 대하여 치료 또는 예방 목적의 약물(drug)로서 이용 가능한 천연물, 합성 유기 화합물,적절한 reactive group을 사용하여 생체에 유용한 저분자량 생리활성 기질과 혈액 단백질 상의 특정 관능기(functional group)를 생체외(ex vivo) 연결(conjugation)시켜 안정화된 생리활성 기질-혈액 단백질 복합체를 제조하는 기술 및 상기 복합체를 이용하여 저분자량 생리활성 기질을 효과적으로 혈액내(in vivo) 전달하는 기술에 관한 것이다.

Description

생리활성 기질-혈액 단백질 복합체 및 이를 이용하는 생리활성 기질의 안정화 방법{BIOACTIVE SUBSTANCE-BLOOD PROTEIN CONJUGATE AND STABILIZATION OF A BIOACTIVE SUBSTANCE USING THE SAME}
본 발명은 생체 내 반감기가 짧고 안정성이 낮은 저분자량 생리활성 기질의 효과적인 혈액 내 전달을 위한 변형 설계 기술에 관한 것으로, 보다 상세하게는, 인간을 포함하는 포유류에 대하여 치료 또는 예방 목적의 약물(drug)로서 이용 가능한 천연물, 합성 유기 화합물, 적절한 reactive group을 사용하여 생체에 유용한 저분자량 생리활성 기질과 혈액 단백질 상의 특정 관능기(functional group)를 생체외(ex vivo) 연결(conjugation)시켜 안정화된 생리활성 기질-혈액 단백질 복합체를 제조하는 기술 및 상기 복합체를 이용하여 저분자량 생리활성 기질을 효과적으로 혈액 내(in vivo) 전달하는 기술에 관한 것이다. 특히, 상기 연결은 생리활성 기질과 혈액 단백질의 일종인 알부민, 바람직하게는 유전자 재조합 기술을 통하여 얻어진 알부민 상의 free thiol group (Cys34) 간의 안정한 disulfide (S-S) 결합인 것이 바람직하다.
인슐린 도입을 시작으로 소개된 바이오 의약품(biopharmaceutics)은 생명공 학의 발달과 인간 게놈 유전자 해석의 완성으로 급속히 발전되고 있으며 2000 년대 들어서 500 개 이상의 바이오 의약품이 임상 중에 있고 매년 10 여 개의 치료제가 FDA 로부터 승인을 받고 있다. 바이오 의약품 중 특히 펩타이드 계열 의약품은 강력한 치료 및 예방 효과와 생체친화적 (biocompatible) 특성으로 갖고 있으므로 많은 병증에 대한 치료 및 예방 영역에서 새로운 치료제 또는 대체 치료제로서 연구 되고 있다.
그러나, 이들과 같은 펩타이드 약물 및 불안정한 저분자량 약물들은 생체 내 존재하는 protease 와 같은 다양한 효소들에 의해 쉽게 생분해되어 일반적으로 반감기(half-life)가 짧다. 또한, 펩타이드 계열 약물의 경우에는 다른 저분자량 약물에 비하여 유효 혈중 농도의 유지가 특히 어렵다는 단점이 있다. 또한, 이들은 대부분 거대분자(macromolecule)이기 때문에 생체막 투과가 용이하지 않고, 면역원성(immunogenicity)을 유발시킬 수도 있으며, 일반적으로 용해도가 낮아 제형화 하는데 많은 제한점들을 갖고 있다. 특히, 이상의 단점들 중에서 짧은 반감기(half-life), 생체 내 낮은 안정성( in vivo stability) 및 낮은 생체 이용률(bioavailability: BA) 등은 예방 및 치료제 개발에서 개선되어야 하는 부분들로 인식되고 있다.
일반적으로 대부분의 많은 약품들은 경구 또는 주사 형태로 체내에 약리 성분이 공급되며 일정 농도 이상으로 혈액 내에 존재하여야 치료 및 예방 효과를 나타낼 수 있다. 많은 경우 치료 효과를 높이기 위하여 투약량을 높여 공급하지만, 이에 따른 다양한 부작용들이 빈번하게 나타나기 때문에 사용상 제한이 따른다.
이러한 문제점들을 개선하기 위한 서방형 캡슐(slow-release capsule), depot, pump 등과 같은 다양한 약물 전달 시스템(drug delivery system: DDS)을 이용한 투약 방법들이 제안되어 왔다. 그러나, 이와 같은 접근 방식들은 장기간 동안 치료 약물의 농도를 유지시키기 위하여 일반적으로 응용하기에는 많은 단점들을 갖고 있다. 예를 들어, 피부부착형 제형의 경우, 피부에 부착되어 적합한 속도로 약물이 피부조직을 투과할 수 있는 성질을 보유하고 있어야 하며, 서방성 제형에서 제형 particle 들은 방출되는데 시간상 제한적이고, 또한 혈관 내로 유입되어도 대식 세포들에 의해 빠르게 제거된다. 또한, 주사를 통해 치료 약물을 투여해야 하는 경우는 특히 반복적이며 지속적으로 주사 처방을 받아야 하는 많은 경우는 바람직하지 못하다. 특히, 자가 투여(self administration)의 경우는 그로 인한 부작용 발생의 원인이 되기도 하며 많은 경우 투여 방법에 대하여 개인적으로 많은 훈련이 필요하다.
이상과 같이 약품 자체에 대한 단점들 즉, 짧은 반감기(half-life), 낮은 생체 내 안정성(in vivo stability) 및 생체 이용률(bioavailability: BA)과 장기간 반복적인 주사 투여 방법을 효과적으로 개선할 수 있는 약물 전달 시스템 기술의 개발이 절실히 요구된다.
본 발명의 목적은 생체에 유용한 저분자량 생리활성 기질과 혈액 단백질 상의 특정 관능기 간의 안정한 결합 형성이 가능한 reactive group을 사용하여 상기 저분자량 생리활성 기질을 상기 혈액 단백질에 ex vivo 결합시켜, 상기 저분자량 생리활성 기질의 약물 동력학적 성질을 개선시키는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 생체에 유용한 저분자량 생리활성 기질과 혈액 단백질이 안정한 공유결합으로 연결되어 있는 생리활성 기질-혈액 단백질 복합체를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 생리활성 기질-혈액 단백질 복합체를 사용하여 생리활성 기질의 체내 반감기(half-time) 및 안정성을 증진시키는 것을 특징으로 하는 생리활성 기질의 혈액내(in vivo) 전달용 조성물 및 전달 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 혈액내 안정성이 증진된 생리활성 기질-혈액 단백질 복합체의 유효량을 투여하는 것을 포함하는 치료용 조성물 및 치료 방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 목적은 혈액 단백질 상의 특정 관능기와 저분자량 생리활성 기질 간의 안정한 결합 형성을 실험관내 (in vitro) 방법을 통하여 정성 및 정량할 수 있는 간편하고 효과적인 분석 방법을 제공하는 것이다.
도 1는 Intraperitoneal glucose tolerance test(IPGTT)를 통하여 본 발명의 화합물 35가 Exendin-4와 비교하여 혈당 저하 효과의 10시간 long-acting 정도를 비교하여 보여주는 그래프이다.
● control: Phosphate buffer saline 투여군
● 각 sample: 10시간 전에 Exendin-4, 화합물 35를 각각 1회 피하 투여
● 모든 군에 대하여 glucose를 0분에 각각 복강 내 투여
● 각 군의 마우스 개체 수: 각 4마리
도 2는 Intraperitoneal glucose tolerance test(IPGTT)를 통하여 본 발명의 화합물 35가 Exendin-4와 비교하여 혈당 저하 효과의 24시간 long-acting 정도를 비교하여 보여주는 그래프이다.
● control: Phosphate buffer saline 투여군
● 각 sample: 24시간 전에 Exendin-4, 화합물 35를 각각 1회 피하 투여
● 모든 군에 대하여 glucose를 0분에 각각 복강 내 투여
● 각 군의 마우스 개체 수: 각 4마리
A more complete appreciation of the invention, and many of the attendant advantages thereof, will be readily apparent as the same becomes better understood by reference to the following detailed description.
한 측면에 있어서, 본 발명은 생체에 유용한 저분자량 생리활성 기질과 혈액 단백질 상의 특정 관능기 간의 안정한 결합 형성이 가능한 reactive group을 사용하여, 상기 저분자량 생리활성 기질을 상기 혈액 단백질에 ex vivo 결합시켜, 상기 저분자량 생리활성 기질의 안정성을 증진시키는 기술에 관한 것이다.
보다 구체적으로, 본 발명의 저분자량 생리활성 기질의 안정화 방법은 1) 저분자량 생리활성 기질에 적절한 functional group을 linking group을 사용하거나 사용하지 아니하고 연결시켜 변형 생리활성 기질 화합물을 제조하는 단계; 2) 혈액 단백질에 적절한 reactive group을 결합시켜 혈액 단백질의 결합 작용기를 활성화시키는 단계; 및 3) 상기 변형 생리활성 기질 화합물과 활성화된 혈액 단백질을 생체 외에서 반응시켜 생리활성 기질과 혈액 단백질 간 안정한 공유 결합을 형성시켜 안정화된 생리활성 기질-혈액 단백질 복합체를 형성하는 단계를 포함할 수 있다. 이러한 방법에 의하여, 체내, 특히 혈액내 수용성 환경에서 불안정한 저분자량 생리활성 기질이 안정화되어 반감기가 증가하고 체내 체류 기간이 길어져서, 상기 저분자량 생리활성 기질의 본래의 기능을 효과적으로 발휘할 수 있게 된다.
보다 구체적으로, 본 발명은 혈액 단백질 상의 hydroxyl group(-OH), thiol group(-SH), amino group(-NH2) 및 carboxyl group(-CO2H)로 이루어진 군 중에서 선택된 관능기를 이와 공유결합을 형성할 수 있는 reactive group와 반응시켜 상기 혈액 단백질을 활성화시키는 단계와, 생체외 (ex vivo) 에서, 상기 활성화된 혈액 단백질과, 천연 또는 합성 펩타이드 분자, 천연 또는 합성 호르몬 및 의약 원료물질로 이루어진 군 중에서 선택된 분자량 100,000 이하의 저분자량 생리활성 기질 간 안정한 공유결합을 형성시키고, 상기 reactive group은 이탈되는 단계를 포함하는, 저분자량 생리활성 기질의 안정화 방법을 제공한다.
또 다른 측면에 있어서, 본 발명은 생체외 (ex vivo) 에서, 혈액 단백질 상의 hydroxyl group(-OH), thiol group(-SH), amino group(-NH2) 및 carboxyl group(-CO2H)로 이루어진 군 중에서 선택된 관능기와 공유결합을 형성할 수 있는 reactive group에 의하여 활성화된 상기 혈액 단백질 상의 관능기와, 저분자량 생 리활성 기질간 안정한 공유결합이 형성되어 상기 생리활성 기질의 안정성이 증진된 것을 특징으로 하는, 생리활성 기질-혈액 단백질 복합체를 제공한다.
또 다른 측면에 있어서, 본 발명은 상기와 같은 생리활성 기질-혈액 단백질 복합체를 사용하는 생리활성 기질의 생리활성 기질의 혈액 내(in vivo) 전달 방법, 및 상기 생리활성 기질이 치료적 효과를 갖는 질병에 대한 예방 또는 치료 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 상기와 같은 생리활성 기질-혈액 단백질 복합체를 함유하는 생리활성 기질의 혈액 내(in vivo) 전달용 조성물, 및 상기 생리활성 기질이 치료적 활성을 갖는 질병에 대한 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 저분자량 생리활성 기질은 포유류, 특히, 인간의 증상 또는 질병에 대하여 개선, 치료 및 예방 효과를 갖는 모든 천연 유래 또는 합성 유기 화합물 및 천연 유래 또는 합성 펩타이드로서, 특히, 분자량 100,000 이하인 물질을 의미한다. 보다 구체적으로, 본 발명의 저분자량 생리활성 기질은 천연 유래의 천연물, 펩타이드, 호르몬, 합성 펩타이드, 합성 호르몬 및 의약 원료물질 등일 수 있다. 예를 들어, 상기 저분자량 생리활성 기질은 포유류에 대하여 혈당 강하효과가 있는 glucagons like peptide-1(GLP-1)를 포함하는 insulinotropic peptide, exendin-3 또는 exendin-4 등과 같은 glucagon family peptide hormone, 또는 LHRH (Luteinizing Hormone-Releasing Hormone) 등을 포함한다.
본 발명의 구체 예에 있어서, 상기 저분자량 생리활성 기질과 알부민, 바람직하게는 유전자 재조합 기술을 통하여 얻어진 알부민 상의 free thiol group (Cys34) 간의 안정한 disulfide (S-S) 공유 결합을 형성할 수 있는 reactive group을 사용하여 상기 저분자량 생리활성 기질을 알부민에 ex vivo 결합시켜, 상기 저분자량 생리활성 기질의 약물 동력학적 성질(반감기 및 체내 안정성 등)을 개선시킬 수 있다. 본 발명의 바람직한 구체 예에 있어서, 저분자량 생리활성 기질과 혈액 단백질 간의 안정한 공유결합, 특히 안정한 disulfide 공유결합이 생체외(ex vivo)에서 효과적으로 형성되도록 하기 위하여, 상기 혈액 단백질을 reactive group에 의하여 활성화시킬 수 있다. 예컨대, 혈액 단백질인 알부민의 34번 위치의 시스테인 상의 free thiol group을 reactive group의 하나인 disulfanyl group으로 활성화시킴으로써 생리활성 기질과의 결합을 효과적으로 유도하여 보다 효과적으로 생리활성 기질을 안정화시킬 수 있다.
상기 reactive groups은 혈액 단백질 상의 특정 작용기와 안정한 공유결합을 형성하는 부분과 공유 결합 형성 후 이탈하는 leaving group을 포함하는 것일 수 있다. 본 발명의 구체예에 있어서, 상기 혈액 단백질은 알부민 또는 유전자 재조합 기술을 통하여 얻어진 알부민일 수 있고, 상기 안정한 공유결합은 알부민 상의 free thiol group (Cys34)과의 S-S 공유결합일 수 있다. 본 발명의 또 다른 구체예에 있어서, 생리활성 기질과 reactive group을 연결시키는 linking group을 추가로 사용할 수 있다.
바람직하게는, 상기 혈액 단백질은 알부민, 특히, 유전자 재조합 기술을 통하여 얻어진 알부민이며, 알부민의 34번 위치의 시스테인에 reactive group으로서 disulfanyl group이 결합되어 free thiol group이 활성화된 알부민을 제조하여 사용할 수 있다.
또 다른 측면에 있어서, 본 발명은 생체에 유용한 저분자량 생리활성 기질과 혈액 단백질이 안정한 공유결합으로 연결되어 형성된 안정화된 생리활성 기질-혈액 단백질 복합체에 관한 것이다. 본 발명의 바람직한 구체 예에 있어서, 상기 생리활성 기질-혈액 단백질 복합체는 생리활성 기질과 알부민의 34번 위치의 시스테인 상의 free thiol group 간에 안정한 disulfide (S-S) 공유 결합을 형성한 것이다. 본 발명의 또 다른 구체 예에 있어서, 상기 알부민은 저분자량 생리활성 기질과 albumin 간의 '안정한 disulfide 공유결합'이 효과적으로 형성되도록 하기 위하여 활성화된 것일 수 있다. 예컨대, 상기 알부민은 reactive group에 의하여 활성화 된 것일 수 있으며, 바람직하게는, 34번 위치의 시스테인 상의 free thiol group이 reactive group의 하나인 disulfanyl group으로 활성화된 것일 수 있다. 본 발명의 또 다른 구체 예에 있어서, 상기 생리활성 기질-혈액 단백질 복합체는 적절한 linking group을 추가로 포함할 수 있다.
또 다른 측면에 있어서, 본 발명은 상기 생리활성 기질-혈액 단백질 복합체의 제조 방법에 관한 것이다. 본 발명의 바람직한 구체예에 있어서, 1) 저분자량 생리활성 기질에 적절한 functional group을 linking group을 사용하거나 사용하지 아니하고 연결시켜 변형 생리활성 기질 화합물을 제조하는 단계; 2) 혈액 단백질에 적절한 reactive group을 결합시켜 혈액 단백질의 결합 작용기를 활성화시키는 단계; 및 3) 상기 변형 생리활성 기질 화합물과 활성화된 혈액 단백질을 생체 외에서 반응시켜 생리활성 기질과 혈액 단백질 간 안정한 공유 결합을 형성시키는 단계를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 상기 혈액 단백질은 알부민, 특히 유전자 재조합 기술을 통하여 얻어진 알부민이며, 알부민의 34번 위치의 시스테인에 reactive group으로서 disulfanyl group이 결합되어 free thiol group이 활성화된 알부민을 제조하여 사용할 수 있다. 상기와 같이 free thiol group이 활성화된 알부민은 체외에서의 저분자량 생리활성 기질과의 결합력이 증진되어, 저분자량 생리활성 기질과 안정된 S-S 공유결합을 형성할 수 있다.
또 다른 측면에 있어서, 본 발명은 상기 생리활성 기질-혈액 단백질 복합체를 함유하는 체내 반감기(half-time) 및 안정성이 증진된 생리활성 기질의 혈액 내( in vivo) 전달용 조성물 및 상기 생리활성 기질-혈액 단백질 복합체를 사용하는 안정성이 증진된 생리활성 기질의 혈액내 전달 방법에 관한 것이다.
본 발명은 생체 내 안정성이 낮고 반감기가 짧은 저분자량 생리활성 기질을 생체 내에 투여하여 생체 내에서 혈액 단백질과 결합하여 안정화시키는 방법이 아닌, 생체 외에서 생리활성 기질을 혈액 단백질과 안정한 공유 결합에 의하여 결합시켜 복합체 형태로 사용하는 것을 특징으로 한다. 저분자량 생리활성 기질을 생체 내에 투여하여 생체 내에서 혈액 단백질과 결합하여 안정화시키는 경우, 생리활성 기질과 혈액 단백질과 결합률이 낮아서 안정화 정도가 낮으며, 혈액 단백질과 결합하지 아니한 유리 생리활성 기질이 뇌에 침투하여 알츠하이머병 등 여러가지 뇌 관련 질환을 유발하는 문제가 있다. 그러나, 본 발명은 생체 외에서 안정화된 생리활성 기질-혈액 단백질 복합체를 제조하여 사용하고, 모든 생리활성 기질이 혈액 단 백질과 결합되어 있으므로, 투여시 생체 내 안정성이 현저히 향상되고, 유리 생리활성 기질이 발생하지 아니하여, 뇌질환 유발 위험성이 없다는 이점이 있다.
또한, 본 발명은 유효성분으로서 상기 생리활성 기질-혈액 단백질 복합체를 함유하는 약학 조성물 및 상기 생리활성 기질-혈액 단백질 복합체의 유효량을 상기 생리활성 기질의 투여를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는 진단 또는 치료 방법에 관한 것이다. 상기 진단 또는 치료 활성은 생리활성 기질의 본래의 활성에 따라 달라진다. 예컨대, 상기 저분자량 생리활성 기질로서 glucagons like peptide-1(GLP-1)를 포함하는 insulinotropic peptide 또는 exendin-3 또는 exendin-4 등과 같은 glucagon family peptide hormone를 사용하는 경우, 상기 진단 또는 치료 활성은 혈당 강하 및 당뇨병 등의 혈당 증가에 의하여 발생하는 질병에 대한 것일 수 있고, LHRH (Luteinizing Hormone-Releasing Hormone)을 사용하는 경우에는 포유류의 배란시기 조절, 성호르몬 관련 질환에 대한 것으로, 예컨대, 시상하부, 뇌하수체 및 생식기 기능의 부진 여부를 감별 진단 및 전립선암 및 자궁내막증 등의 병증에 대한 치료 효과를 가질 수 있다.
또 다른 측면에 있어서, 본 발명은 알부민의 34번째 위치의 시스테인의 free thiol group에 2-pyridyl disulfanyl group, N-alkylpyridinium disulfanyl group, 5-nitro-2-pyridyl disulfanyl group, 3-nitro-thiophenyl disulfanyl, 1-piperido disulfanyl group, 3-cyano-propyl disulfanyl group, 2-thiouredyl disulfanyl group, 4-carboxylbenzyl disulfanyl group, 1-phenyl-1H-tetrazolyl disulfanyl group, 1-amino-2-naphthyl disulfanyl group, 3-calboxyl-6-pyridyl disulfanyl group, 2-benzothiazolyl disulfanyl group, 및 4-nitro-thiophenyl disulfanyl group로 이루어진 군 중에서 선택된 reactive group이 결합되어 Cys34 free thiol group이 활성화된 것을 특징으로 하는 변형 알부민을 제공한다.
또 다른 측면에 있어서, 본 발명은 혈액 단백질 상의 특정 관능기와 저분자량 생리활성 기질 간의 안정한 결합 형성을 실험관내 (in vitro) 방법을 통하여 정성 및 정량할 수 있는 간편하고 효과적인 분석 방법에 관한 것이다.
1. 용어의 정의
1) 생리활성 기질 (Bioactive Substances): 본 발명에 있어서, "생리활성 기질(bioactive substances)"은 포유류, 특히, 인간의 증상 또는 질병에 대하여 개선, 치료 및 예방 효과를 갖는 모든 천연 유래 또는 합성 유기 화합물 및 천연 유래 또는 합성 펩타이드로서, 특히, 분자량 100,000 이하의 저분자량 물질을 의미한다. 보다 구체적으로, 본 발명의 생리활성 기질은 천연 유래의 천연물, 펩타이드, 호르몬, 합성 펩타이드, 합성 호르몬 및 의약 원료물질 등일 수 있다. 예를 들어, 포유류에 대하여 혈당 강하효과가 있는 glucagons like peptide-1(GLP-1)를 포함하는 insulinotropic peptide, exendin-3 또는 exendin-4 등과 같은 glucagon family peptide hormone, 또는 LHRH (Luteinizing Hormone-Releasing Hormone) 등이 이에 속할 수 있다. 본 발명에 따른 생리활성 기질-생리활성 기질 전달체 복합체 또는 상기 생리활성 기질을 상기 생리활성 기질 전달체와 함께 투여함으로써 상기 생리활성 기질이 갖는 고유의 생체 활성 효과를 보다 효과적으로 발휘하도록 할 수 있다.
Glucagon like peptide-1 (GLP-1): GLP-1은 GI-tract의 L-세포에서 생성된 proglucagon으로부터 방출되며 31개의 아미노산으로 구성된 intestinal hormone peptide로서 혈중 glucose 농도에 의존적으로 인슐린을 자극하여 혈당을 저하시키며 위 공복감을 지연시키고 음식물 섭취를 감소시키며 특히 β-세포의 기능을 자극하는 기능을 갖는다. 따라서, 생리활성 기질로서 GLP-1이 결합된 생리활성 기질-생리활성 기질 전달체 복합체 또는 GLP-1를 생리활성 기질 전달체와 함께 투여함으로써, 우수한 혈당 저하 효과를 얻을 수 있으며, 이로 인하여, 당뇨병 등과 같이 고혈당과 관련된 질환 또는 비만을 효과적으로 치료 또는 예방할 수 있다.
Exendin-3 and Exendin-4 peptide: Exendin-3, Exendin-4 및 그의 유도체들은 도마뱀 (Heloderma suspectum)의 독 성분으로 혈당 강하 효과를 갖는 39개의 아미노산으로 구성된 천연 유래의 펩타이드이다. 또한 GLP-1과 53％ 정도의 상동성(homology)을 갖고 있다. 따라서, 생리활성 기질로서 Exendin-3, Exendin-4 또는 그의 유도체가 결합된 생리활성 기질-생리활성 기질 전달체 복합체 또는 Exendin-3, Exendin-4 또는 그의 유도체를 생리활성 기질 전달체와 함께 투여함으로써, 우수한 혈당 저하 효과를 얻을 수 있으며, 이로 인하여, 당뇨병 등과 같이 고혈당과 관련된 질환을 효과적으로 치료 또는 예방할 수 있다.
LHRH (Luteinizing Hormone-Releasing Hormone): LHRH는 시상하부에서 형성되는 황체호르몬 분비호르몬으로 뇌하수체 전엽에서 난포자극호르몬과 황체형성호르몬의 방출을 자극하는 역할을 한다. 아세트산염의 제제는 시상하부, 뇌하수체 및 생식기 기능의 부진 여부를 감별 진단하는데 효과적으로 이용되며 최근에는 전립선 암 및 자궁내막증 등의 병증의 치료제로서 이용되고 있다. 따라서, 생리활성 기질로서 LHRH가 결합된 생리활성 기질-생리활성 기질 전달체 복합체 또는 LHRH를 생리활성 기질 전달체와 함께 투여함으로써, 포유류의 배란시기 조절, 성호르몬 관련 질환 치료 또는 진단 효과를 얻을 수 있으며, 최근에는 전립선암, 자궁내막증, 자궁근종 등의 병증을 효과적으로 치료 또는 예방할 수 있다.
Modified substances: 변형 생리활성 기질 화합물(modified substances)은 활성화된 혈장 단백질의 반응기(reactive group)들 중에서, 바람직하게는 치환-disulfanyl group과 생체 외(ex vivo)에서 결합(conjugation)될 수 있도록 바람직한 관능기(functional group)을 부착시킴으로써 설계된 화합물을 지칭한다. 일반적으로 이와같이 변형 생리활성 기질 화합물들은 각종 peptidase에 안정하도록 설계되었으며 이는 활성화된 혈장 단백질의 치환-disulfanyl group과 '새롭고 안정한 disulfide 공유결합'으로 conjugation되어 복합체(complex)로 존재함에 기인된다 할 수 있다. 또한, 본 발명에서는 이와 같은 안정한 disulfide 공유결합이 정량적으로 이루어 질 수 있도록 생리활성 기질 화합물은 free-thiol group을 포함하는 것이 일반적이다.
본 발명에서 주로 다루어질 변형 생리활성 기질 화합물들로는 포유류, 바람직하게는 인간에게 어떠한 치료 및 예방의 목적으로 사용할 수 있는 약리활성을 갖는 분자량 100,000 이하의 천연물, 합성 유기 화합물, 천연 유래 펩타이드, 합성 펩타이드 등이 포함될 수 있다. 이들은 주로 linker group을 매개로 관능기(functional group)에 연결될 수도 있으며 경우에 따라서는 linker group없이 직접 관능기(functional group)에 결합되어 변형될 수 있다. 또한, 본 발명은 생체 외(ex vivo)에 서 생리활성 기질 화합물 및 활성화 albumin이 선택적으로 disulfide conjugation되는 'S-S 공유결합' 여부를 시험관 내(in vitro)의 간단한 정성 및 정량 방법을 통하여 직접 혹은 간접적으로 분석 가능하도록 생리활성 기질 화합물을 변형하였다.
변형 생리활성 기질 화합물은 생리활성 기질-functional group, 또는 생리활성 기질-liking group-functional group의 형태일 수 있다.
2) Reactive group: 본 발명에 있어서, "reactive group"은 혈액 내 존재하는 혈액 성분 단백질 상의 특정 관능기 (functional group), 예컨대, hydroxyl group(-OH), thiol group(-SH), amino group(-NH2) 또는 carboxyl group(-CO2H)과 새롭고 안정한 공유결합, 바람직하게는 혈장 단백질 (plasma protein) 상의 free thiol group (-SH group)과 "S-S 공유결합"을 형성할 수 있는 기능을 갖는 모든 chemical group를 지칭한다. 바람직한 구체 예에 있어서, 상기 rcactive group은 activated serum albumin 상의 대표적인 chemical reactive group으로는 치환된 disulfanyl group일 수 있으며, 일반적으로 변형 생리활성 기질 화합물의 관능기(functional group)인 free thiol group과 수용액 환경 또는 생체 외(ex vivo)에서 반응하여 새롭고 안정한 disulfide 공유결합을 형성할 수 있다. 본 발명의 reactive group들은 예를 들어, 2-pyridyl disulfanyl group, N-alkylpyridinium disulfanyl group, 5-nitro-2-pyridyl disulfanyl group, 3-nitro-thiophenyl disulfanyl, 1-piperido disulfanyl group, 3-cyano-propyl disulfanyl group, 2-thiouredyl disulfanyl group, 4-carboxylbenzyl disulfanyl group, 1-phenyl-1H-tetrazolyl disulfanyl group, 1-amimo-2-naphthyl disulfanyl group, 3-carboxyl-6-pyridyl disulfanyl group, 2-benzothiazolyl disulfanyl group, 또는 4-nitro-thiophenyl disulfanyl group등을 포함할 수 있고 대부분 free thiol group과 반응하여 이탈기로 작용할 수 있는 functional group을 포함할 수 있다.
3) Linker group: Linker group은 생리활성 기질 화합물의 free thiol group과 연결되거나 결합된 chemical moiety를 지칭한다. Linker group은 methyl, ethyl, propyl, butyl 등과 같은 하나 또는 그 이상으로 구성된 alkyl group, alkoxy group, cycloalkyl group, polycyclic group, aryl group, polyaryl group, substituted aryl group, heterocyclic group 또는 치환된 heterocyclic group등으로 구성될 수 있다. 또한, linker group은 A(E)nA[2-amino (ethoxy)n acetic acid] 등을 포함하는 poly ethoxy amino acid를 포함할 수 도 있다. 본 발명의 바람직한 linker group은 에톡시기를 한 개 내지 세 개 포함하는 AE(E)nA (n=0∼2) ([2-(2-amino)-ethoxy](ethoxy)n acetic acid)일 수 있다. 특히 AEEE acetic acid(AEEEA)를 사용하는 경우 가용성이 증진되고, 생리활성 기질과 혈액성분 간의 안정한 공유 결합 형성에 유리한 효과가 있으며, AEEA 보다 더 좋은 혈당강하 효과를 나타낼 수 있다.
상기 linker group은 상기 substance의 말단에 결합하거나 substance 내부에 위치하여 substance와 reactive group을 연결시켜 주는 것 일 수 있다.
4) Functionality: Functionality는 혈액 단백질, 특히, activated albumin상의 reactive group들과 반응하여 새롭고 안정한 공유 결합, 특히, disulfide 공유결합을 형성할 수 있는 변형 생리활성 기질 화합물들 상의 관능기(functional group)라고 설명될 수 있다. 일반적으로 변형 생리활성 기질 화합물들 상에는 hydroxyl group(-OH), thiol group(-SH), amino group(-NH2) 및 carboxyl group(-CO2H)이 다양하게 존재한다. 본 발명의 바람직한 구체 예에 있어서, 변형 생리활성 기질 화합물들의 C-말단, 중간 부분 또는 N-말단에 존재할 수 있는 free thiol group(-SH)과 activated albumin상의 reactive group들이 반응하여 새롭고 안정한 disulfide 공유결합을 형성한다.
5) Blood components: 혈액 성분(blood components)은 혈액 내에서 유동성을 갖고 있거나 혹은 고정되어 존재할 수 있다. 고정형 혈액성분(fixed blood component)은 혈액 내에서 이동할 수 없는 tissues membrane receptors, interstitial proteins, fibrin proteins, collagens, platelets, endothelial cells 및 epithelial cells 등이 있다. 또한, 그들과 연관된 세포막, 세포막 수용체, somatic body cells, skeletal, smooth muscle cells, neuronal components, osteocytes 및 osteoclasts 등이 있다. 이동성 혈액성분(mobile blood components)은 혈액 내에서 고정적이지 않고 지속적으로 이동하는 혈액성분이라 할 수 있다. 일반적으로 이들은 세포막과 연관성이 없으며 적어도 혈액 내에 0.1 ㎍/ml이상 존 재하고 seram albumin, transferrin, ferritin 그리고 IgM 및 IgG와 같은 immunoglobulin을 포함하고 있다. 일반적으로 이들 이동성 혈액성분의 생체 내 반감기는 적어도 12시간 이상이다. 또한 유전자 재조합 기술을 통하여 얻어진 알부민도 포함한다.
6) Plasma pretein: 혈장 단백질(plasma protein)은 혈장에 함유되어 있는 단백질이라 지칭할 수 있다. 혈액 내 존재하는 혈장 단백질의 대부분은 serum albumin과 globulin이 대부분을 차지하고 있다. 혈장 100 μM 내에는 대략 7 g이 함유되어 있으며 그 중 albumin은 50∼70％ 정도, globulin이 대략 20∼50％ 정도 그리고 섬유소원(fibrinogen)이 10％ 이내로 포함되어 있다. 섬유소원이 포함되어 있지 않은 혈액 단백질을 혈청 단백질(serum protein)이라 한다.
본 발명에서 다루고자 하는 혈장 단백질은 transferrin, IgG, celuroplasmin, serum albumin등이고, 바람직하게 주로 다루어진 혈장 단백질로는 serum albumin이며, 인간이 대상체로 선택될 경우는 HSA(human serum albumin), 바람직하게는 인간의 혈액 성분으로부터 추출되거나 또는 유전자 재조합 기술을 통하여 얻어진 HSA가 이용될 수 있고, 인간 외의 타 포유류 동물이 대상체로 선택될 경우는 선택된 포유류 동물의 serum albumin, 바람직하게는 대상 동물의 혈액성분으로부터 추출되거나 또는 유전자 재조합 기술을 통해 얻어진 serum albumin이 이용될 수 있다.
7) Pretective group: 보호기(protective group)는 펩타이드 합성에서 아미노산들 간의 반응으로부터 유래된 화학적인 관능기(functional group)라 정의할 수 있으며 대표적인 보호기들로는 acetyl(Ac), allyoxycarbonyl(Aloc), fluorenyl-methyloxyacrbonyl(Fmoc), t-butyloxycarbonyl(Boc), benzyloxycarbonyl(Cbz), t-butyl (t-Bu), tri-phenylmethyl(Trt), 2,2,4,6,7-pentamethyldihydrobenzofuran-S-sulfonyl(Pbf)등이 있다. 본 발명에서 사용된 일반적인 펩타이드의 보호기 및 그의 약어를 아래의 Table 1에 정리하였다.
Table 1. Natural amino acids and their abbreviations
Figure 112008029353587-PCT00001
2. 변형 생리활성 기질 화합물(Modified substances) 및 활성화 albumin의 구조적인 형태와 구성
본 발명의 변형 생리활성 기질 화합물 및 활성화 albumin의 구조적 형태와 구성은 다음과 같이 모식적으로 나타낼 수 있다.
Figure 112008029353587-PCT00002
"X 1 , bioactive substances"은 100,000 이하의 분자량을 갖는 생리활성을 갖는 반응 화합물로서 포유류에서, 바람직하게는 인간에서 나타나는 병증에 대하여 예방 및 치료의 목적으로 사용 가능하며 free thiol group이 존재하지 않고 약리활성이 있는 천연 유래의 천연물, 펩타이드, 호르몬, 합성 펩타이드, 합성 호르몬 및 의약 원료물질 등을 지칭한다. 예를 들어, 포유류에 대하여 혈당 강하효과가 있는 glucagons like peptide-1(GLP-1)를 포함하는 insulinotropic peptide, exendin-3 또는 exendin-4 등과 같은 glucagon family peptide hormone, 또는 LHRH (Luteinizing Hormone-Releasing Hormone) 등이 이에 속할 수 있다.
"X 2 , linker group"은 생리활성 기질 화합물과 functional group 사이에 위치하여 화학적인 결합으로 연결되는 chemical linker group을 지칭한다. Linker group은 methyl, ethyl, propyl, butyl 등과 같은 하나 또는 그 이상으로 구성된 alkyl group, alkoxy group, cycloalkyl group, polycyclic group, aryl group, polyaryl group, substituted aryl group, heterocyclic group 또는 치환된 heterocyclic group등을 구성될 수 있다. 또한, linker group은 AEA((2-amino) ethoxy acetic acid)등을 포함하는 poly ethoxy amino acid를 포함할 수 도 있다. 본 발명의 바람직한 linker group은 에톡시기를 한 개 내지 세 개 포함하는 AE(E)nA (n=0∼2) ([2-(2-amino)-ethoxy](ethoxy)nacetic acid)일 수 있다. 특히 AEEE acetic acid (AEEEA)를 사용하는 경우 가용성이 증진되고, 생리활성 기질과 혈액성분 간의 안정한 공유 결합 형성에 유리한 효과가 있으며, AEEA 보다 더 좋은 혈당강하 효과를 나타낼 수 있다.
"X 3 , fanctional group"은 activated albumin상의 reactive group과 반응하여 새롭고 안정한 disulfide 공유결합을 형성할 수 있는 변형 생리활성 기질 화합물들 상의 관능기(functional group)라고 설명될 수 있다. 일반적으로 변형 생리활성 기질 화합물들 상에는 hydroxyl group(-OH), thiol group(-SH), amino group(-NH2) 및 carboxyl group(-CO2H)이 다양하게 존재한다. 하지만 본 발명에서는 주로 변형 생리활성 기질 유도체들의 C-말단 또는 N-말단에 존재할 수 있는 free thiol group(-SH)과 activated albumin상의 reactive group들이 반응하여 새롭고 안정한 disulfide 공유결합을 형성한다.
"X 4 , reactive group"은 변형 생리활성 기질 화합물 상의 hydroxyl group(-OH), thiol group(-SH), amino group(-NH2) 또는 carboxyl group(-CO2H)과 새롭고 안정한 공유결합을 형성할 수 있는 능력을 갖고 있는 activated serum albumin 단백질 상에 연결된 chemical group들을 지칭하는 것으로, 바람직하게는 변형 생리활성 기질 화합물 상의 free thiol group과 새롭고 안정한 disulfide 공유결합을 형 성할 수 있는 능력을 갖는 것일 수 있다. 본 발명에 있어서, activated serum albumin 상의 대표적인 reactive group은 변형 생리활성 기질 화합물의 free thiol group과 수용액 환경 또는 생체 외(ex vivo)에서 반응하여 새롭고 안정한 disulfide 공유결합을 형성할 수 있는 치환된 disulfanyl group일 수 있다. 본 발명의 reactive group들은 예를 들어, 2-pyridyl disulfanyl group, N-alkylpyridinium disulfanyl group, 5-nitro-2-pyridyl disulfanyl group, 3-nitro-thiophenyl disulfanyl, 1-piperido disulfanyl group, 3-cyano-propyl disulfanyl group, 2-thiouredyl disulfanyl group, 4-carboxylbenzyl disulfanyl group, 1-phenyl-1H-tetrazolyl disulfanyl group, 1-amino-2-naphthyl disulfanyl group, 3-carboxyl-6-pyridyl disulfanyl group, 2-benzothiazolyl disulfanyl group, 또는 4-nitro-thiophenyl disulfanyl group등을 포함할 수 있고 이상의 언급된 reactive group의 화학구조를 하기의 화학식 1과 같이 정리할 수 있으며, 대부분 free thiol group과 반응하여 이탈기로 작용할 수 있는 functional group을 포함할 수 있다.
화학식 1. reactive group (X 4 )의 화학구조 예시
Figure 112008029353587-PCT00003
3. Activated Albumin의 합성
본 발명에서 다루고자 하는 혈장 단백질은 transferrin, IgG, celuroplasmin, serum albumin등이고, 바람직하게 주로 다루어진 혈장 단백질로는 serum albumin이며, 인간이 대상체로 선택될 경우는 HSA(human serum albumin), 바람직하게는 인간의 혈액 성분으로부터 추출되거나 또는 유전자 재조합 기술을 통하여 얻어진 HSA가 이용될 수 있고, 인간 외의 타 포유류 동물이 대상체로 선택될 경우는 선택된 포유류 동물의 serum albumin, 바람직하게는 대상 동물의 혈액성분으로부터 추출되거나 또는 유전자 재조합 기술을 통해 얻어진 serum albumin이 이용될 수 있다.
본 발명의 구체예에 있어서, HSA(human serum albumin)의 34번 cysteine의 잔기인 free thiol group(Cys34)을 생체 외(ex vivo)에서 fiee thiol group이 있는 생리활성 기질 화합물에 대하여 수용액 또는 완충용액 조건에서 선택적으로 연결 (conjugation)이 될 수 있도록 관능기(functional group)를 변형시키는 효과적인 방법이 제공된다.
4. Albumin Binding Test
본 발명의 변형 생리활성 기질 화합물이 활성화된 알부민 상의 치환 disulfanyl group에 생체 외(ex vivo)에서 conjugation되어 혈액 내 안정성이 증가한다는 것을 albumin 결합 정도를 측정함으로써 알 수 있다. 또한 본 발명의 변형 생리활성 기질 화합물의 알부민 결합정도를 변형되지 않은 천연 생리활성 기질의 경우와 비교함으로써, 본 발명의 변형 생리활성 기질 화합물이 천연 생리활성 기질에 비하여 albumin에 보다 효과적으로 결합되어 안정성이 증가됨을 알 수 있다. 이러한 알부민에의 결합 정도는 시험관내(in vitro)에서 간편한 HPLC의 분석을 통해 간편하게 정량 및 결합여부를 측정할 수 있다.
기존의 albumin-생리활성 기질 화합물 conjugation complex의 존재 여부를 측정하기 위하여 별도로 albumin complex를 정제해서 LC-MS 및 MALDI-TOF을 이용하여 분석해야 하는 실험적 제한점 및 문제점들이 있었다. 그러나, 본 발명에서 제시하는 albumin binding test는 간단한 sample 전처리 및 HPLC 분석을 통해 conjugation 여부를 in vitro에서 측정할 수 있다는 실험적인 의미를 갖는다.
Albumin의 농도를 고정하고 생리활성 기질 화합물의 농도를 증가시키며 conjugation 정도를 조사한 결과, disulfide conjugation 정도는 실험에 사용된 albumin의 상태와 밀접할 것으로 판단되며 특히, free thiol에 대한 content와 연관이 있을 것으로 생각된다.
5. Albumin-생리활성 기질 화합물 Conjugation Complex의 정량방법:
본 발명에서는 ex vivo에서 conjugation된 albumin 및 변형 생리활성 기질 화합물의 disulfide complex에 대하여 in vitro에서 conjugation complex의 효과적인 정량 방법을 제공할 수 있다.
기존의 albumin-생리활성 기질 화합물 conjugation complex의 존재여부를 측정하기 위하여 별도로 albumin complex를 정제해서 LC-MS 및 MALDI-TOF을 이용하여 분석해야 하는 실험적 제한점 및 문제점들이 있었나, 본 발명에서는 DTT(dithiothreitol; Cleland's reagent)의 처리를 통해 disulfide complex간 결합을 선택적으로 환원시켜 유리되어 방출되는 생리활성 기질 화합물의 양을 정량 할 수 있다. 상기 분석 방법은 albumin에 conjugation되어 있는 생리활성 기질 화합물을 실험관내(in vitro) 방법으로 HPLC 분석을 통해 효과적으로 정량 할 수 있는 실험적 의미를 갖는다.
본 발명에서는 albumin-생리활성 기질 화합물간의 disulfide conjugation 여부를 측정하기 위하여 DTT 처리를 통하여 정량 분석을 실시할 수 있다.
The present invention is further explained in more detail with reference to the following examples. These examples, however, should not be interpreted as limiting the scope of the present invention in any manner.
EXAMPLE
Example 1
화합물 1: D-Ala 8 -GLP-1 (7-36)-Lys 37 -[ε-AEEA-CO(CH 2 ) 2 -SH]-NH 2 .4TFA: His-D-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Lys-[ε-AEEA-CO(CH 2 ) 2 ]-SH]-NH 2 .4TFA (SEQ ID NO: 1).
Novabiochem colporation으로부터 구입한 rink amide MBHA resin(0.6 mmol/g)을 100 μmol을 측량하여 반응용기에 넣었다. Resin을 5 ml의 DMF로 용매화시키고 5분간 충분히 sweeling시켰다. Swelling된 수지에 20％ 피페리딘 DMF 용액을 3 ml 첨가하고 10분간 shaking시키고 피페리딘 용액을 제거한 후 다시 20％ 피페리딘 DMF 용액을 첨가하여 10분간 반응시켜 수지에 보호되어 있는 Fmoc 보호기를 완전히 제거하고 10 ml 의 DMF 용매를 이용하여 5회 이상 세척하였다. 이 단계에서 Fmoc 보호기의 탈보호 반응 여부를 Kaiser test [E. Kaiser et al., Anal. Biochem. (1970) 34,595]로 확인하였다.
Fmoc-Lys(Aloc)-OH(500 μmol), HOBt(500 μmol), HBTU(500 μmol) 및 DIEA(1 mmol)를 5 ml의 DMF 용매에 완전히 녹인 후, Fmoc 보호기가 탈보호 된 수지에 첨가하였다. 반응액을 실온에서 2 시간 정도 shaking시킨 후, 10 ml의 DMF 용매로 5회 이상 세척하였다. 이 단계에서 Kaiser test를 위와 동일하게 실시하여 Fmoc-아미노산의 커플링 여부를 확인하였다.
다음으로는 아래와 동일한 합성 주기에 따라 연속적으로 커플링 시켰다: (1) DMF 용매(10 ml)로 5회 이상 세척; (2) 20％ piperidine DMF 용액(3 ml)을 사용하 여 10분간 2회 탈보호; (3) DMF 용매(10 ml)로 5회 이상 세척; (4) Fmoc-아미노산의 첨가; (5) 커플링 시약을 첨가하여 아미노산 활성화 및 2 시간 커플링; (6) DMF 용매(10ml)로 5회 이상 세척하였다.
Step 1: Coupling step
Fmoc으로 보호된 아미노산(5 당량 이상)은 다음에 기술된 순서로 수지 반응용기에 첨가하여 커플링시켰다: (1) Fmoc-Lys(Aloc)-OH; (2) Fmoc-Arg(Pbf)-OH; (3) Fmoc-Gly-OH; (4) Fmoc-Lys(tBoc)-OH; (5) Fmoc-Val-OH; (6) FmocLeu-OH; (6) Fmoc-Trp-OH; (7) Fmoc-Ala-OH; (8) Fmoc-Ile-OH; (9) Fmoc-Phe-OH: (10) Fmoc-Glu(OtBu)-OH; (11) Fmoc-Lys(tBoc)-OH; (12)Fmoc-Ala-OH; (13) Fmoc-Ala-OH; (14) Fmoc-Gln(Trt)-OH; (15) Fmoc-Gly-OH; (16) Fmoc-Glu(OtBu)-OH; (17) Fmoc-Leu-OH; (18) Fmoc-Tyr(tBu)-OH; (19) Fmoc-Ser(tBu)-OH; (20) Fmoc-Ser(tBu)-OH: (21) Fmoc-Val-OH; (22) Fmoc-Asp(OtBu)-OH; (23) Fmoc-Ser(tBu)-OH; (24) Fmoc-Thr(tBu)-OH; (25)-Fmoc-Phe-OH; (26) Fmoc-Thr(tBu)-OH; (27) Fmoc-Gly-OH; (28) Fmoc-Glu(OtBu)-OH; (29) Fmoc-D-Ala-OH; (30) Boc-His(N-Trt)-OH.
Step 2: Selective deprotection step of Aloc group
Pd(PPh3)4(300 μmol)을 5 ml의 CHCl3:NMM:AcOH(18:1:0.5)에 녹인 후, step 1에서 합성된 resin에 첨가하여 실온에서 2시간 이상 shaking 시켰다. 반응 레진은 CHCl3(10 ml X 6회); 20％ acetic acid CH2Cl2 solution(10ml X 6회); CH2Cl2(10 ml X 6회); DMF(10 ml) 6회 이상 세척해 주었다. 선택적인 Aloc group에 대한 탈 보호 여부는 Kaiser test를 위와 동일하게 실시하여 확인하였다.
Step 3: Introduction step of linker group
Fmoc-(AEEA)-OH(Fmoc-miniPEG-OH, 3 mmol), HOBt(3 mmol), HBTU(3 mmol) 및 DIEA(6 mmol)를 10 ml의 DMF 용매에 완전히 녹인 후, Fmoc 보호기가 탈 보호된 수지에 첨가하였다. 반응액을 실온에서 4시간 이상 shaking시킨 후, 10 ml의 DMF 용매로 10회 이상 세척하였다. 이 단계에서 Kaiser test를 위와 동일하게 실시하여 Fmoc-아미노산의 커플링 여부를 확인하였다. 10 ml의 20％ piperidine DMF 용액을 처리하여 30분 이상 shaking하여 Fmoc 보호기를 제거한 후 10 ml의 DMF로 5회 이상 세척하였다.
Fmoc 보호기를 탈 보호시킨 후, 3-(Tritylthio)propionic acid(2 mmol), HBTU(2 mmol), HOBt(2 mmol) 및 DIEA(4 mmol)를 10 ml의 DMF 용매에 완전히 녹여 합성된 레진에 첨가하였다. 반응액을 실온에서 4시간 이상 shaking시킨 후, 10 ml의 DMF 용매로 10회 이상 세척하였다.
Step 4: Cleavage step
합성 종결 즉시, 펩타이드가 커플링된 레진을 3시간 동안 TFA/물(95:5)의 혼합물을 사용하여 레진으로부터 절단하였다. 이렇게 얻어진 혼합 용액은 냉장 보관된 diethyl ether 용매를 과량 처리함으로써 침전물을 생성시켰다. 얻어진 침전물을 원심분리 시켜 완전히 침전시키고 과량의 TFA를 일차 제거하고 이상과 같은 절차를 2회 정도 반복하여 고형화시킨 펩타이드를 얻었다.
얻어진 펩타이드를 C-18 칼럼을 사용하고 50분에 걸쳐 0.01％ TFA를 함유하 는 5％ 내지 100％의 아세토니트릴/물 농도 구배 용매 시스템을 사용하는 HPLC로 정제하였다. 순수 정제된 분획물을 동결건조시켜 백색 분말형의 TFA 염형태로 화합물 1, D-Ala8-GLP-1 (7-36)-Lys37[ε-AEEA-CO-(CH2)2-SH]-NH2.4TFA을 얻었다:
화합물 1: D-Ala 8 -GLP-1 (7-36)-Lys 37 {ε-AEEA-CO(CH 2 ) 2 -SH]-NH 2 .4TFA; MALDI-TOF= 3,660.
상기의 화합물 1의 합성과정을 다음의 반응식 1에 나타내었다.
반응식 1. D-Ala8-GLP-1 (7-36)-Lys37-[ε-AEEA-CO(CH2)2-SH] -NH2.4TFA (화합물 번호 1)의 합성 과정.
Figure 112008029353587-PCT00004
이상과 동일한 합성 과정을 통하여 다음의 펩타이드를 제조하였다.
화합물 2: D-Ala 8 -GLP-1 (7-36)-Lys 37 -[ε-AEEEA-CO-(CH 2 ) 2 -SH]-NH 2 .4TFA: His-D-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Lys-[ε-AEEEA-CO-(CH 2 ) 2 -SH]-NH 2 .4TFA (SEQ ID NO: 2). Rt=23.93분 (0.01％ TFA를 함유하는 5％ 내지 100％의 아세토니트릴/물로부터 30분에 걸쳐 다양한 농도 구배); MALDI-TOF=3,705.
화합물 3: D-Ala 8 -Lys 26 -[ε-AEEA-CO-(CH 2 ) 2 -SH]-GLP-1 (7-36)-NH 2 .4TFA: His-D-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-[ε-AEEA-CO-(CH 2 ) 2 -SH]-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-NH 2 .4TFA (SEQ ID NO: 3). Rt=24.25분 (0.01％ TFA를 함유하는 5％ 내지 100％의 아세토니트릴/물로부터 30분에 걸쳐 다양한 농도 구배); MALDI-TOF=3,532.
화합물 4: D-Ala 8 -Lys 26 -[ε-AEEEA-CO-(CH 2 ) 2 -SH]-GLP-1 (7-36)-NH 2 .4TFA: His-D-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-[ε-AEEEA-CO-(CH 2 ) 2 -SH]-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-NH 2 .4TFA (SEQ ID NO: 4). Rt=24.11분 (0.01％ TFA를 함유하는 5％ 내지 100％의 아세토니트릴/물로부터 30분에 걸쳐 다양한 농도 구배); MALDI-TOF=3,577.
화합물 5: GLP-1 (7-36)-Lys 37 -[ε-AEEA-CO-(CH 2 ) 2 -SH]-NH 2 .4TFA: His-Ala- Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Lys-[ε-AEEA-CO-(CH 2 ) 2 -SH]-NH 2 .4TFA (SEQ ID NO: 5). Rt=24.01분 (0.01％ TFA를 함유하는 5％ 내지 100％의 아세토니트릴/물로부터 30분에 걸쳐 다양한 농도 구배); MALDI-TOF=3,660.
화합물 6: GLP-1 (7-36)-Lys 37 -[ε-AEEEA-CO-(CH 2 ) 2 -SH]-NH 2 .4TFA:
His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Lys-[ε-AEEEA-CO-(CH 2 ) 2 -SH]-NH 2 .4TFA (SEQ ID NO: 6). Rt=23.91분 (0.01％ TFA를 함유하는 5％ 내지 100％의 아세토니트릴/물로부터 30분에 걸쳐 다양한 농도 구배); MALDI-TOF= 3,705.
화합물 7: Exendin-4 (1-39)-Lys 40 -[ε-AEEA-CO-(CH 2 ) 2 -SH]-NH 2 .5TFA: His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pre-Pro-Pro-Ser-Lys-[ε-AEEA-CO-(CH 2 ) 2 -SH]-NH 2 .5TFA (SEQ ID NO: 7). Rt=16.95분 (0.01％ TFA를 함유하는 5％ 내지 100％의 아세토니트릴/물로부터 30분에 걸쳐 다양한 농도 구배); MALDI-TOF=4,548.
화합물 8: Exendin-4 (1-39)-Lys 40 -[ε-AEEEA-CO-(CH 2 ) 2 -SH]-NH 2 .5TFA: His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg- Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-Lys-[ε-AEEEA-CO-(CH 2 ) 2 -SH]-NH 2 .5TFA (SEQ ID NO: 8). Rt=6.86분 (0.01％ TFA를 함유하는 5％ 내지 100％의 아세토니트릴/물로부터 30분에 걸쳐 다양한 농도 구배); MALDI-TOF=4,592.
화합물 9: Lys 27 -[ε-AEEA-CO-(CH 2 ) 2 -SH]-Exendin-4 (1-39)-NH 2 .5TFA: His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-[ε-AEEA-CO-(CH 2 ) 2 -SH]-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-NH 2 .5TFA (SEQ ID NO: 9). Rt=21.41분 (0.01％ TFA를 함유하는 5％ 내지 100％의 아세토니트릴/물로부터 30분에 걸쳐 다양한 농도 구배); MALDI-TOF=4,420.
화합물 10: Lys 27 -[ε-AEEEA-CO-(CH 2 ) 2 -SH]-Exendin-4 (1-39)-NH 2 .5TFA: His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-[ε-AEEEA-CO-(CH 2 ) 2 -SH]-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-NH 2 .5TFA (SEQ ID NO: 10). Rt=21.48분 (0.01％ TFA를 함유하는 5％ 내지 100％의 아세토니트릴/물로부터 30분에 걸쳐 다양한 농도 구배); MALDI-TOF=4,465.
화합물 11: Exendin-3 (1-39)-Lys 40 -[ε-AEEA-CO-(CH 2 ) 2 -SH]-NH 2 .5TFA: His-Ser-Asp-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-Lys-[ε-AEEA-CO-(CH 2 ) 2 -SH]-NH 2 .5TFA (SEQ ID NO: 11). Rt=21.21분 (0.01％ TFA를 함유하는 5％ 내지 100％의 아세토니트릴/물로부터 30분에 걸쳐 다양한 농도 구배); MALDI-TOF=4,564.
화합물 12: Exendin-3 (1-39)-Lys 40 -[ε-AEEEA-CO-(CH 2 ) 2 -SH]-NH 2 .5TFA: His-Ser-Asp-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-Lys-[ε-AEEEA-CO-(CH 2 ) 2 -SH]-NH 2 .5TFA (SEQ ID NO: 12). Rt=21.18분 (0.01％ TFA를 함유하는 5％ 내지 100％의 아세토니트릴/물로부터 30분에 걸쳐 다양한 농도 구배); MALDI-TOF=4,6094.
화합물 13: Lys 27 -[ε-AEEA-CO-(CH 2 ) 2 -SH]-Exendin-3 (1-39)-NH 2 .5TFA: His-Ser-Asp-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-[ε-AEEA-CO-(CH 2 ) 2 -SH]-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-NH 2 .5TFA (SEQ ID NO: 13). Rt=21.12분 (0.01％ TFA를 함유하는 5％ 내지 100％의 아세토니트릴/물로부터 30분에 걸쳐 다양한 농도 구배); MALDI-TOF=4,436.
화합물 14: Lys 27 -[ε-AEEEA-CO-(CH 2 ) 2 -SH]-Exendin-3 (1-39)-NH 2 .5TFA: His-Ser-Asp-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-[ε-AEEEA-CO-(CH 2 ) 2 -SH]-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-NH 2 .5TFA (SEQ ID NO: 14). Rt=21.10분 (0.01％ TFA를 함유하는 5％ 내지 100％의 아세토니트릴/물로부터 30분에 걸쳐 다양한 농도 구배); MALDI-TOF=4,481.
Example 2
화합물 15: Leuprolide-GSG-Lys-[ε-AEEA-CO-(CH 2 ) 2 -SH]-NH 2 .2TFA: Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-Leu-Leu-Arg-Pro-Gly-Ser-Gly-Lys-[ε-AEEA-CO-(CH 2 ) 2 -SH]-NH 2 .2TFA (SEQ ID NO: 15). (Pyr=pyroglutamic acid, pE)
Novabiochem corporation으로부터 구입한 rink amide MBHA resin(0.6 mmol/g)을 100 μmol을 측량하여 반응용기에 넣었다. Resin을 5 ml의 DMF로 용매화시키고 5분간 충분히 swelling시켰다. Swelling된 수지에 20％ 피페리딘 DMF 용액을 3 ml 첨가하고 10분간 shaking시키고 피페리딘 용액을 제거한 후 다시 20％ 피페리딘 DMF 용액을 첨가하여 10분간 반응시켜 수지에 보호되어 있는 Fmoc 보호기를 완전히 제거하고 10 ml의 DMF 용매를 이용하여 5회 이상 세척하였다.
Fmoc-Lys(Aloc)-OH(500 μmol), HOBt(500 μmol), HBTU(500 μmol) 및 DIEA(500 μmol)를 5 ml의 DMF 용매에 완전히 녹인 후, Fmoc 보호기가 탈보호 된 수지에 첨가하였다. 반응액을 실온에서 2 시간 정도 shaking시킨 후, 10 ml의 DMF 용매로 5회 이상 세척하였다. 이 단계에서 Kaiser test를 위와 동일하게 실시하여 Fmoc-아미노산의 커플링 여부를 확인하였다.
다음으로는 아래와 동일한 합성 주기에 따라 연속적으로 커플링 시켰다: (1) DMF 용매(10 ml)로 5회 이상 세척; (2) 20％ piperidine DMF 용액(3 ml)을 사용하여 10분간 2회 탈 보호; (3) DMF 용매(10 ml)로 5회 이상 세척; (4) Fmoc-아미노산의 첨가; (5) 커플링 시약을 첨가하여 아미노산 활성화 및 2 시간 커플링; (6) DMF 용매(10 ml)로 5회 이상 세척 하였다.
Step 1: Coupling step
Fmoc으로 보호된 아미노산(5 당량 이상)은 다음에 기술된 순서로 수지 반응용기에 첨가하여 커플링 시킨다: (1) Fmoc-Lys(Aloc)-OH; (2) Fmoc-Gly-OH; (3) Fmoc-Ser(tBu)-OH; (4) Fmoc-Gly-OH; (5) Fmoc-Pro-OH; (6) Fmoc-Arg(Pbf)-OH; (6) Fmoc-Leu-OH; (7) Fmoc-D-Leu-OH; (8) Fmoc-Tyr(tBu)-OH; (9) Fmoc-Ser(tBu)-OH; (10) Fmoc-Trp(Boc)-OH; (11) Fmoc-His(Trt)-OH; (12) Boc-Pyr(tBu)-OH.
Step 2: Selective deprotection step or Aloc group
Pd(PPh3)4(300 μmol)을 5 ml의 CH3Cl:NMM:AcOH(18:1:0.5)에 녹인 후, Step 1에서 합성된 resin에 첨가하여 실온에서 2시간 이상 shaking 시켰다. 반응 레진은 CHCl3(10 ml X 6회); 20％ acetic acid CH2Cl2 solution(10 ml X 6회); CH2Cl2(10 ml X 6회); DMF(10 ml) 6회 이상 세척해 주었다. 선택적인 Aloc group에 대한 탈 보호 여부는 Kaiser test를 위와 동일하게 실시하여 확인하였다.
Step 3: Introduction step of linker group
Fmoc-(AEEA)-OH(Fmoc-miniPEG-OH, 3 mmol), HOBt(3 mmol), HBTU(3 mmol) 및 DIEA(6 mmol)를 10 ml의 DMF 용매에 완전히 녹인 후, Fmoc 보호기가 탈 보호된 수지에 첨가하였다. 반응액을 실온에서 4시간 이상 shaking시킨 후, 10 ml 의 DMF 용매로 10회 이상 세척하였다. 이 단계에서 Kaiser test를 위와 동일하게 실시하여 Fmoc-아미노산의 커플링 여부를 확인하였다. 10 ml의 20％ Piperidine DMF 용액을 처리하여 30분 이상 shaking하여 Fmoc 보호기를 제거한 후 10 ml의 DMF로 5회 이상 세척하였다.
Fmoc 보호기를 탈 보호시킨 후, 3-(Tritylthio)propionic acid(2 mmol), HOBt(2 mmol), HBTU(2 mmol) 및 DIEA(4 mmol)를 10 ml의 DMF 용매에 완전히 녹여 합성된 레진에 첨가하였다. 반응액을 실온에서 4시간 이상 shaking시킨 후, 10ml의 DMF 용매로 10회 이상 세척하였다.
Step 4: Cleavage step
합성 종결 즉시, 펩타이드가 커플링된 레진을 3시간 동안 TFA/물(95:5)의 혼합물을 사용하여 레진으로부터 절단하였다. 이렇게 얻어진 혼합 용액은 냉장 보관된 diethyl ether 용매를 과량 처리함으로써 침전물을 생성시켰다. 얻어진 침전물을 원심분리 시켜 완전히 침전시키고 과량의 TFA를 일차 제거하고 이상의 절차를 2회 정도 반복하여 고형화시킨 펩타이드를 얻었다.
얻어진 펩타이드를 C-18 칼럼을 사용하고 50분에 걸쳐 0.01％ TFA를 함유하는 5％ 내지 100％의 아세토니트릴/물 농도 구배 용매 시스템을 사용하는 HPLC로 정제하였다. 순수 정제된 분획물을 동결건조시켜 백색 분말형의 TFA 염 형태로 목적 생리활성 기질 화합물 15, Leuprolide-GSG-Lys-[ε-AEEA-CO-(CH2)2-SH]-NH2.2TEA을 얻었다.
화합물 15: Leuprolide-GSG-Lys-[ε-AEEA-CO-(CH 2 ) 2 -SH]-NH 2 .2TFA: MS(ESI)m/e, [M+H]+= 1,744.
상기와 같은 화합물 15의 합성과정을 다음의 반응식 2에 나타내었다.
반응식 2. Leuprolide-GSG-Lys-[ε-AEEA-CO(CH2)2-SH]-NH2.2TFA(화합물 15)의 합성 과정
Figure 112008029353587-PCT00005
이상과 동일한 합성 과정을 통하여 아래와 같은 펩타이드를 제조하였다.
화합물 16: Leuprolide-GSG-Lys-[ε-AEEEA-CO-(CH 2 ) 2 -SH]-NH 2 .2TFA: Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-Leu-Leu-Arg-Pro-Gly-Ser-Gly-Lys-[ε-AEEEA-CO-(CH 2 ) 2 -SH]-NH 2 .2TFA (SEQ ID NO: 16).
화합물 17: Leuprolide-GG-Lys-[ε-AEEA-CO-(CH 2 ) 2 -SH]-NH 2 .2TFA: Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-Leu-Leu-Arg-Pro-Gly-Gly-Lys-[ε-AEEA-CO-(CH 2 ) 2 -SH]-NH 2 .2TFA (SEQ ID NO: 17).
화합물 18: Leuprolide-GG-Lys-[ε-AEEEA-CO-(CH 2 ) 2 -SH]-NH 2 .2TFA: Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-Len-Leu-Arg-Pro-Gly-Gly-Lys-[ε-AEEEA-CO-(CH 2 ) 2 -SH]-NH 2 .2TFA (SEQ ID NO: 18).
화합물 19: Leuprolide-Lys-[ε-AEEA-CO-(CH 2 ) 2 -SH]-NH 2 .2TFA: Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-Leu-Leu-Arg-Pro-Lys-[ε-AEEA-CO-(CH 2 ) 2 -SH]-NH 2 .2TFA (SEQ ID NO: 19).
화합물 20: Leuprolide-Lys-[ε-AEEEA-CO-(CH 2 ) 2 -SH]-NH 2 .2TFA: Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-Leu-Leu-Arg-Pro-Lys-[ε-AEEEA-CO-(CH 2 ) 2 -SH]-NH 2 .2TFA (SEQ ID NO: 20).
Example 3: Activated Albumin의 제조
Sigma Aldrich사로부터 구입한 HSA(human serum albumin, 500 mg) 또는 유전자 재조합 기술을 통하여 얻어진 알부민을 2차 증류수(10 ml)에 녹인 후, Aldrithiol(7.5 mg)을 300 μl의 CH3CN에 녹인 solution을 상온 중에서 천천히 첨가하였다. 이 반응 용액을 실온에서 30분간 천천히 shaking하면서 반응시키고 반응 수용액 10 μl을 취하여 Ellman's 시약(10 μl) 을 처리하여 albumin의 free thiol group(Cys34)이 새로운 disulfanyl group으로 치환되었는지 여부를 Ellman's 시약의 색깔 변화를 통하여 확인하였다.
반응의 종결 여부는 Ellman's 시약의 색깔 변화를 통하여 확인할 수 있는데 반응의 미 종결 상태는 무색의 Ellman's 시약이 진한 노랑색으로 변화하며 완전히 반응이 종결되었을 때에는 무색을 유지하는 상태가 된다. 이상과 같은 Ellman's test을 통하여 반응 종결 여부를 확인하고 하루 이상 동결 건조시켰다.
동결 건조된 activated albumin은 MeOH(10 ml X 3회)로 세척하여 과량 첨가했던 Aldrithiol 및 반응 부산물로 생성된 pyridyl-2-thione을 각각 제거하였다. 다시 albumin sample을 2차 증류수에 녹인 후, 하루 이상 동결 건조시켜 활성화된 알부민을 제조하였으며, 'activated albumin 21'이라 명명하였다.
상기 방법으로 제조 가능한 활성화된 알부민의 예는 다음의 화학식 2에 나타낸 바와 같다:
화학식 2. 합성된 activated albumin의 화학구조의 예시
Figure 112008029353587-PCT00006
Example 4: 생리활성 기질 화합물 15 (Leuprolide-GSG-Lys-[ε-AEEA-CO-(CH 2 ) 2 -SH]-NH 2 )과 Activated Albumin의 Conjugation
본 실시예는 Example 2의 제조 방법을 통해 합성된 변형 생리활성 기질 화합물 15(Leuprolide-GSG-Lys-[ε-AEEA-CO-(CH2)2-SH]-NH2.2TFA)와 Example 3의 제조 방법을 통해 얻어진 activated albumin 21을 PBS 완충 용액 상에서 효과적으로 conjugation하는 구체예를 제공한다.
4.1. Substrate-Albumin Conjugate 22의 합성:
Example 3의 제조 방법을 통해 합성된 activated albumin 21(50 mg)을 PBS 완충용액(1 ml)에 녹인 후, Example 2의 제조 방법으로 얻은 변형 생리활성 기질 화합물 15(2 mg)을 100 μl의 PBS 완충용액에 녹인 solution을 상온 중에서 천천히 첨가하였다. 이 반응 용액을 실온에서 30분간 천천히 shaking하면서 반응시키고 반응 수용액 10 μl을 취하여 Ellman's 시약(10 μl)을 처리하여 albumin의 free thiol group(Cys34)이 새로운 disulfanyl group으로 치환되었는지 여부를 Ellman's 시약의 색깔 변화를 통하여 확인하였다.
반응의 종결 여부는 Ellman's 시약의 색깔 변화를 통하여 확인할 수 있는데 반응의 미 종결 상태는 무색의 Ellman's 시약이 진한 노랑색으로 변화하며 완전히 반응이 종결되었을 때에는 무색을 유지하는 상태가 된다. 이상과 같은 Ellman's test을 통하여 반응 종결 여부를 확인하고 하루 이상 동결 건조시켰다.
동결 건조된 modified albumin은 MeOH(10 ml X 3회)로 세척하여 미반응 화합물 15 및 반응 부산물로 생성된 pyridyl-2-thione을 각각 제거하였다. 다시 albumin sample을 2차 증류수에 녹인 후, 하루 이상 동결 건조시켜 변형된 알부민을 crude 상태로 제조하였으며, 이를 'substrate-albumin conjugate 22'라 명명하였다.
4.2. Sobstrate-Albumin Conjugate 22의 정제:
위 제조 방법에 의해 합성된 substrate-albumin conjugate 22는 다음과 같은 조건하에서 AKTA purifier(Amersham Biosciences, Uppsala, Sweden)를 이용하여 정제할 수 있다. 먼저, sodium octanoate(5 mM)과 (NH4)2SO4(750 mM)으로 조성된 sodium phosphate buffer solution(20mM, pH 7)을 50 mL의 butyl sepharose 4 fast flow resin resin column(Amersham Biosciences, Uppsala, Sweden)에 충진 시킨 후, substrate-albumin conjugate 22를 로딩시키고 분당 2.5 ml의 flow rate로 분리 정제하였다.
이와 같은 조건에서 목적하는 substate-albumin conjugate 22는 모두 hydro phobic resin에 흡착되며 기본적으로 conjugation되지 않았거나 반응하지 않은 HAS는 컬럼 상에서 방출시켜 제거할 수 있다. 정제된 목적하는 substrate-albumin conjugate 22을 desalting시키고 하루 이상 동결 건조시켜 질소로 충진 된 상태에서 -80℃ 냉동고에 저장하였다.
이상과 같은 conjugation 반응 및 분리 정제 방법을 통하여 다양한 substrate-albumin conjugates를 제조할 수 있으며, 그 예로서, 상기 실시 예 1 내지 2에서 제조된 화합물 1 내지 20을 사용하여 제조 가능한 substrate-albumin conjugate 22 내지 41을 아래의 화학식 3에 정리하였다.
화학식 3. substrate-albumin conjugate의 예시
Figure 112008029353587-PCT00007
Figure 112008029353587-PCT00008
화합물 35 : MALDI-TOF=70,850
Example 5: Albumin Binding Test
Example 2의 제조 방법을 통해 합성된 변형 생리활성 기질 화합물 15(Leuprolide-GSG-Lys-[ε-AEEA-CO-(CH2)2-SH]-NH2.2TFA)이 Example 3의 제조 방법에 의해 activated HAS (human serum albumin)상의 disulfanyl group에 conjugation되어 생체 외 및 혈액 내에서 그 안정성이 증가할 수 있음을 생리활성 기질 화합물-albumin conjugation 정도로 측정할 수 있다. 또한 본 실험 방법을 통하여 합성된 화합물 15이 변형되지 않은 천연 Leuprolide에 비해 activated albumin에 보다 효과적으로 결합되어 안정성이 증가됨을 알 수 있었다.
5.1. Stock solution의 제조:
Example 3로부터 제조 가능한 activated human serum albumin(66.5 mg)을 PBS 완충 용액(pH 7.2, 1 ml)에 녹여 activated HSA(1 mM) solution을 제조하여 이용하였다. 동일한 방법으로 1 mM의 생리활성 기질 화합물 15(1.8 mg/ml) 및 Leuprolide(1.2 mg/ml) stock solution을 각각 제조하여 이용하였다.
5.2. Albumin binding test:
상기 방법에 의해 제조된 stock solution을 Table 2과 같은 조성을 갖도록 PBS 완충용액으로 희석하여 측정 sample solution(100 μl)을 만들고 각각의 reaction mixture를 혼합하여 37 ℃의 온도 조건을 유지시키며 배양기 내에서 30분간 천천히 shaking시켜 주었다. 배양 후, 각각의 sample vial에 methanol (150 μl)을 첨가하고 10분간 voltexing하여 HSA를 침전시켰다. 침전된 albumin을 원심분리기(12,000 rpm, 10 ℃, 10분)를 이용하여 spin down시키고 상층액 (50 μl)을 취하여 HPLC을 통하여 동일한 조건에서 분석하였다.
Table 2. Stock solution의 구성
Figure 112008029353587-PCT00009
5.3. Result
Albumin의 농도를 고정하고 생리활성 기질 화합물의 농도를 증가시키며 conjugation 정도를 조사한 결과, disulfide conjugation 정도는 실험에 사용된 albumin의 상태와 밀접할 것으로 판단되며 특히, free thiol에 대한 content와 연관이 있을것으로 생각된다. 상기에서 얻어진 결과들은 다음의 Table 3에 정리하였다.
Table 3. Albumin binding test 결과
Figure 112008029353587-PCT00010
Example 6: Albumin-생리활성 기질 화합물 Conjugation Complex의 정량
Example 4의 실험 방법을 통해 conjugation된 activated HSA 및 생리활성 기 질 화합물 15(Leuprolide-GSG-Lys-[ε-AEEA-CO-(CH2)2-SH]-NH2.2TFA)의 disulfide 복합체(complex)에 대하여 DTT(dithiothreitol; Cleland's reagent)의 처리를 통해 disulfide complex간 결합을 선택적으로 환원시켜 유리되어 방출되는 생리활성 기질 화합물 15을 정량 할 수 있다. 상기 분석 방법은 albumin에 conjugation되어 있는 생리활성 기질 화합물을 실험관내(in vitro) 방법으로 HPLC 분석을 통해 효과적으로 정량할 수 있는 실험적 의미를 갖는다.
6.1. Stock solution의 제조:
Example 3으로부터 제조된 activated albumin 21(66.5 mg)을 PBS 완충 용액(pH 7.2, 1 ml)에 녹여 HSA (1 mM) solution을 제조하여 이용하였다. 동일한 방법으로 1 mM의 생리활성 기질 화합물 15(1.8 mg/ml) 및 100 mM의 DTT(15.4 mg/ml) stock solution을 각각 제조하여 이용하였다.
6.2. Conjugation complex (albumin-생리활성 기질 화합물 15)의 정량:
상기 방법에 의해 제조된 stock solution을 이용하여 Example 5의 albumin binding test 방법과 동일한 조건으로 10개의 tube에 각각 activated albumin solution(50 μl) 및 생리활성 기질 화합물 5 solution(10 μl)를 혼합한 후 37 ℃의 온도 조건에서 30분간 천천히 shaking하며 incubation시켰다.
배양 후, DTT를 0 nmole, 100 nmole(2X), 200 nmole(4X), 500 nmole(10X), 및 1,000 nmole씩 각각 첨가하여 혼합하고 37 ℃ 온도조건에서 1시간 가량 반응시켰다. 1시간 경과 후, 각각의 sample에서 25 μl씩을 취하여 50 μl의 MeOH을 첨가 하고 10분간 voltexing하여 HSA를 침전시켰다. 침전된 albumin을 원심분리기(12,000 rpm, 10 ℃, 10 분)를 이용하여 spin down시키고 상층액(50 μl)을 취하여 HPLC을 통하여 동일한 조건에서 분석하였다.
본 실시예의 albumin-생리활성 기질 화합물간의 disulfide conjugation 여부를 측정하기 위하여 DTT 처리를 통하여 정량 분석에 있어서, DTT의 처리 과정 및 정량 분석 과정을 다음의 반응식 3에 나타내었다.
반응식 3. Albumim-생리활성 기질 화합물 conjugation complex의 DTT 처리 정량방법
Figure 112008029353587-PCT00011
Activated albumin과 생리활성 기질 화합물 15와의 결합 실험에서 화합물 15가 결합한다는 것이 관측되었다. Albumin의 특성과 실험 결과를 미루어 볼 때 화합물 15는 activated albumin의 34 위치 Cys에 변형된 치환 disulfanyl group과 conjugation되어 새롭고 안정한 disulfide 공유결합을 이루고 있는 것으로 추정된다. 이상과 같이 activated albumin과 화합물 15이 disulfide 결합을 하고 있다면 적절한 농도의 DTT 시약의 처리를 통해 free thiol group 형태를 갖는 화합물 15-1이 disulfide conjugation으로부터 방출될 것으로 추론 할 수 있다. 이러한 목적을 가지고 우선 albumin과 화합물 15를 30분간 incubation시켜 disulfide conjugation을 형성 시키고, 100 nmol부터 1,000 nmol까지 네 가지의 각기 다른 양의 DTT를 첨가한 후 1시간 동안 incubation하였다.
6.3. Result
1,000 nmole이상의 고농도로 DTT를 처리할 경우, albumin 단백질이 DTT에 의해 변성되어 많은 양의 albumin 침전이 형성되었으며 이로 인해 분석 및 관측이 용이하지 않았다. 상기에서 얻어진 결과를 하기의 Table 4에 나타내었다. Table 4에서 정리된 바와 같이, 모든 DTT 처리 농도에서 방출될 것으로 예상되었던 화합물 15-1이 HPLC 분석을 통해 관측되었으며, 저농도로 처리했을 때 보다 고농도로 처리했을 경우에 방출 예상 화합물 15-1이 용이하게 관측되었다.
Table 4. DTT 처리 결과
Figure 112008029353587-PCT00012
Example 7: 동물실험: 혈당 강하 활성 측정 실험(IPGTT: In-traperitoneal glucose tolerance test):
7.1. 실험 방법
본 발명에서는 화합물 35의 혈당강하 활성을 측정하기 위한 실험으로 혈당저하 효과의 지속성 여부를 측정하기 위하여 본 실시예를 수행하였다. 혈당강하 활성 및 활성 지속 여부를 측정하기 위한 대조샘플로 Exendin-4를 사용하였으며, Intraperitoneal glucose tolerance test(IPGTT)에 의해 각 펩타이드 샘플의 활성을 측정하였다.
실험동물로 ICR female mouse (6 weeks old, DaehanBioLink, Korea)를 7일간 실험실에서 적응기간을 거친 후 사용하였다. 실험 전에 group당 8마리씩을 선별한 후 꼬리에서 혈액을 채취하여 혈중 glucose 농도를 glucometer (Accucheck Sensor, Roche)로 측정한 후, 미리 정해진 양의 펩타이드 샘플을 피하주사로 투여하고, 음수는 계속 공급하며 절식을 시켰다. 10시간 혹은 24시간 후에 꼬리 정맥에서 혈액을 채취하여 glucometer로 혈당을 측정하여 혈당의 강하를 확인한 후, glucose (2g/kg of mouse in PBS, pH 7.2)를 복강 투여하고, (glucose 투여시점을 0분으로 하였다.) 각 정해진 시간에 꼬리 정맥에서 혈액을 채취하여 glucometer로 혈당을 측정하였다. 혈당강하 활성 및 활성 지속 여부의 측정을 위한 실험은 하기 Table5와 같이 정리할 수 있다.
Table 5. 혈당강하 활성 측정 샘플
Figure 112008029353587-PCT00013
7.2. Result: Hypoglycemic effect
본 발명에서는 화합물 35의 혈당강하 활성을 측정하기 위한 실험으로 혈당강하 활성의 지속 여부를 측정하기 위한 대조샘플로 Exendin-4를 사용하였으며 intraperitoneal glucose tolerance test(IPGTT) 측정방법을 통해 각 peptide 샘플의 활성이 측정되었다.
Intraperitoncal glucose tolerance test(IPGTT)를 통해 측정한 본 발명의 화합물 35와 Exendin-4를 10nmol/kg 씩 mouse에 투여했을 때의 혈당 강하 효과의 지속성에 대한 동물 실험 결과를 Fig.1, Fig2에 나타내었다. Fig.1, Fig2에서 화합물 화합물 35 또는 Exendin-4 대신에 saline을 투여한 군을 control group으로 하고, 각 sample은 10 혹은 24시간 전에 시험 화합물을 피하 투여하였으며, glucose는 0분에 1회 각 sample에 복강 투여하였고, 각 군의 mouse 수는 8마리로 하였다. Exendin-4(10 nmol)를 투여한 군은 saline만을 투여한 control군에 비해 혈당저하 곡선에서 뚜렷한 차이를 보이지 않았다. 반면, 화합물 35를 10 nmol 투여한 군의 경우에는 10시간뿐만 아니라 24시간 후에도 뚜렷한 혈당 저하 곡선을 보여주었다. 따라서 화합물 35는 투여량 10 mnol 기준에서 Exendin-4에 비해 월등히 우수한 혈당조절 효과를 보임을 확인할 수 있다.
이상의 결과로 미루어 볼 때, Exendin-4에 비하여 화합물 35가 월등한 혈당 조절 효과를 나타내는 것은 반감기가 짧아 생체 내 안정성이 좋지 않은 Exendin-4에 비하여 동량 투여된 화합물 35가 2-pyridyl disulfanyl group을 통해 albumin의 free thiol group(Cys34)과 'disulfide 공유결합'으로 conjugation시켜 투여하였기에 생체 내 안정성이 현저히 증진되었음에 기인된 것으로 판단된다.

Claims (26)

  1. 혈액 단백질 상의 hydroxyl group(-OH), thiol group(-SH), amino group(-NH2) 및 carboxyl gruop(-CO2H)로 이루어진 군 중에서 선택된 관능기를 이와 공유결합을 형성할 수 있는 reactive group과 반응시켜, 상기 혈액 단백질을 활성화시키는 단계; 및
    생체외 (ex vivo) 에서, 상기 활성화된 혈액 단백질과, 천연 또는 합성 펩타이드 분자, 천연 또는 합성 호르몬 및 의약 원료물질로 이루어진 군 중에서 선택된 분자량 100,000 이하의 저분자량 생리활성 기질 간 안정한 공유결합을 형성시키고, 상기 reactive group은 이탈되는 단계를 포함하는, 저분자량 생리활성 기질의 안정화 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 저분자량 생리활성 기질이 insulinotropic peptide, glucagon family peptide hormome, 및 LHRH (Luteinizing Hormone-Releasing Hormone)으로 이루어진 군 중에서 선택된 것이고, 상기 혈액 단백질이 albumin, trasferrin, ferritin 및 immunoglobulin으로 이루어진 군 중에서 선택된 것인, 저분자량 생리활성 기질의 안정화 방법.
  3. 제2항에 있어서, 상기 저분자량 생리활성 기질이 glucagons like peptide- 1(GLP-1), exendin-3, exendin-4, 및 LHRH (Luteinizing Hormone-Releasing Hormone)로 이루어진 군 중에서 선택된 것이고, 상기 혈액 단백질이 알부민인 것을 특징으로 하는 저분자량 생리활성 기질의 안정화 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 혈액 단백질 상의 관능기가 thiol group (-SH)이고, 상기 reactive group이 상기 thiol group과 안정한 disulfide 결합 형성이 가능한 disulfanyl group인 것을 특징으로 하는 저분자량 생리활성 기질의 안정화 방법.
  5. 제4항에 있어서, 상기 reactive group은 2-pyridyl disulfanyl group, N-alkylpyridinium disulfanyl group, 5-nitro-2-pyridyl disulfanyl group, 3-nitro-thiophenyl disulfanyl, 1-piperido disulfanyl group, 3-cyano-propyl disulfanyl group, 2-thiouredyl disulfanyl group, 4-carboxylbenzyl disulfanyl group, 1-phenyl-1H-tetrazolyl disulfanyl group, 1-amino-2-naphthyl disulfanyl group, 3-carboxyl-6-pyridyl disulfhnyl group, 2-bsnzothiazolyl disulfanyl group, 및 4-nitro-thiophenyl disulfanyl group으로 이루어진 군 중에서 선택된 것인 생리활성 기질의 안정화 방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 저분자량 생리활성 기질은 hydroxyl group(-OH), thiol group(-SH), amino group(-NH2) 및 carboxyl group(-CO2H)로 이루어진 군 중 에서 선택된 관능기와 결합되어 있는 것이고, 상기 관능기가 상기 reactive group에 의하여 활성화된 혈액 단백질 상의 관능기와 안정한 공유 결합하는 것을 특징으로 하는, 저분자량 생리활성 기질의 안정화 방법.
  7. 제6항에 있어서, 상기 혈액 단백질 상의 관능기와 저분자량 생리활성 기질 상의 관능기가 모두 thiol group(-SH)이고, 상기 공유 결합이 안정한 disulfide 공유 결합인 것을 특징으로 하는 저분자량 생리활성 기질의 안정화 방법.
  8. 제6항에 있어서, 상기 저분자량 생리활성 기질 상의 관능기는 linker group을 통하여 상기 저분자량 생리활성 기질에 연결되어 있는 것을 특징으로 하는, 저분자량 생리활성 기질의 안정화 방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 linker group은 C1 내지 C6의 alkyl group, alkoxy group, cycloalkyl group, polycyclic group, aryl group, polyaryl group, substituted aryl group, heterocyclic group, 치환된 heterocyclic group 및 AE(E)nA ([2-(2-amino)-ethoxy] (ethoxy)nacetic acid) (n is an integer between 0 and 2)로 이루어진 군 중에서 선택된 것인 저분자량 생리활성 기질의 안정화 방법.
  10. 생체외 (ex vivo) 에서, 혈액 단백질 상의 hydroxyl group(-OH), thiol group(-SH), amino group(-NH2) 및 carboxyl group(-CO2H)로 이루어진 군 중에서 선택된 관능기와 공유결합을 형성할 수 있는 reactive group에 의하여 활성화된 상기 혈액 단백질 상의 관능기와, 천연 또는 합성 펩타이드 분자, 천연 또는 합성 호르몬 및 의약 원료물질로 이루어진 군 중에서 선택된 분자량 100,000 이하의 저분자량 생리활성 기질간 안정한 공유결합이 형성되어 상기 생리활성 기질의 안정성이 증진된 것을 특징으로 하는, 생리활성 기질-혈액 단백질 복합체.
  11. 제10항에 있어서, 상기 저분자량 생리활성 기질이 insulinotropic peptide, glucagon family peptide hormone, 및 LHRH (Luteinizing Hormone-Releasing Hormone)으로 이루어진 군 중에서 선택된 것이고, 상기 혈액 단백질이 albumin, transferrin, ferritin 및 immunoglobulin으로 이루어진 군 중에서 선택된 것인, 생리활성 기질-혈액 단백질 복합체.
  12. 제11항에 있어서, 상기 저분자량 생리활성 기질이 glucagons like peptide-1(GLP-1), exendin-3, exendin-4, 및 LHRH (Luteinizing Hormone-Releasing Hormone)로 이루어진 군 중에서 선택된 것이고, 상기 혈액 단백질이 알부민인 것을 특징으로 하는 생리활성 기질-혈액 단백질 복합체.
  13. 제10항에 있어서, 상기 혈액 단백질 상의 관능기가 thiol group (-SH)이고, 상기 reactive group이 상기 thiol group과 안정한 disulfide 공유 결합 형성이 가능한 disulfanyl group이고, 상기 혈액 단백질 상의 관능기와 생리활성 기질 간에 안정한 disulfide 공유결합이 형성된 것을 특징으로 하는 생리활성 기질-혈액 단백질 복합체.
  14. 제13항에 있어서, 상기 reactive group은 2-pyridyl disulfanyl group, N-alkylpyridinium disulfanyl group, 5-nitro-2-pyridyl disulfanyl group, 3-nitro-thiophenyl disulfanyl, 1-piperido disulfanyl group, 3-cyano-propyl disulfanyl group, 2-thiouredyl disulfanyl group, 4-carboxylbenzyl disulfanyl group, 1-phenyl-1H-tetrazolyl disulfanyl group, 1-amino-2-naphthyl disulfanyl group, 3-calboxyl-6-pyridyl disulfanyl group, 2-benzothiazolyl disulfanyl group, 및 4-nitro-thiophenyl disulfanyl group으로 이루어진 군 중에서 선택된 것인 생리활성 기질-혈액 단백질 복합체.
  15. 제10항에 있어서, 상기 저분자량 생리활성 기질은 hydroxyl group(-OH), thiol group(-SH), amino group(-NH2) 및 carboxyl group(-CO2H)로 이루어진 군 중에서 선택된 관능기와 결합되어 있는 것이고, 상기 관능기가 상기 reactive group에 의하여 활성화된 상기 혈액 단백질 상의 관능기와 안정한 공유 결합을 형성하는 것을 특징으로 하는, 생리활성 기질-혈액 단백질 복합체.
  16. 제15항에 있어서, 상기 혈액 단백질 상의 관능기와 저분자량 생리활성 기질 상의 관능기가 모두 thiol group(-SH)이고, 상기 공유 결합이 안정한 disulfide 공유 결합인 것을 특징으로 하는, 생리활성 기질-혈액 단백질 복합체.
  17. 제16항에 있어서, 상기 저분자량 생리활성 기질 상의 관능기는 linker group을 통하여 상기 저분자량 생리활성 기질에 연결되어 있는 것을 특징으로 하는, 생리활성 기질-혈액 단백질 복합체.
  18. 제17항에 있어서, 상기 linker group은 C1 내지 C6의 alkyl group, alkoxy group, cycloalkyl group, polycyclic group, aryl group, polyaryl group, substituted aryl group, heterocyclic group, 치환된 heterocyclic group 및 AE(E)nA ([2-(2-amino)-ethpxy] (ethoxy)nacetic acid) (n is an integer between 0 and 2)로 이루어진 군 중에서 선택된 것인, 생리활성 기질-혈액 단백질 복합체.
  19. 제18항에 있어서, 상기 혈액 단백질 상의 관능기와 저분자량 생리활성 기질 상의 관능기가 모두 thiol group(-SH)이고, 상기 공유 결합이 안정한 disulfide 공유 결합이며, 상기 linker group은 AEEEA인 것을 특징으로 하는, 생리활성 기질-혈액 단백질 복합체.
  20. 제10항 내지 제19항 중 어느 한 항에 따른 생리활성 기질-혈액 단백질 복합체를 투여하여, 생리활성 기질의 체내 반감기(half-time) 및 안정성이 증진된 것을 특징으로 하는, 생리활성 기질의 혈액 내(in vivo) 전달 방법.
  21. 제10항 내지 제19항 중 어느 한 항에 따른 생리활성 기질-혈액 단백질 복합체를 함유하는, 생리활성 기질의 체내 반감기(half-time) 및 안정성이 증진된 것을 특징으로 하는, 생리활성 기질의 혈액 내(in vivo) 전달용 조성물.
  22. 제10항 내지 제19항 중 어느 한 항에 기재된 생리활성 기질-혈액 단백질 복합체의 유효량을 상기 생리활성 기질의 투여를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 상기 생리활성 기질이 치료적 효과를 갖는 질병에 대한 예방 또는 치료 방법.
  23. 제22항에 있어서, 상기 질병이 당뇨병, 전립선암, 자궁내막증 또는 자궁근종인 것을 특징으로 하는 예방 또는 치료 방법.
  24. 제10항 내지 제19항 중 어느 한 항에 기재된 생리활성 기질-혈액 단백질 복합체의 유효량을 함유하는 상기 생리활성 기질이 치료적 효과를 갖는 질병에 대한 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  25. 제24항에 있어서, 상기 질병이 당뇨병, 전립선암, 자궁내막증 또는 자궁근종인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
  26. 알부민의 34번째 위치의 시스테인의 free thiol group에 2-pyridyl disulfanyl group, N-alkylpyridinium disulfanyl group, 5-nitro-2-pyridyl disulfanyl group, 3-nitro-thiophenyl disulfanyl, 1-piperido disulfanyl group, 3-cyano-propyl disulfanyl group, 2-thiouredyl disulfanyl group, 4-carboxylbenzyl disulfanyl group, 1-phenyl-1H-tetrazolyl disulfanyl group, 1-amino-2-naphthyl disulfanyl group, 3-carboxyl-6-pyidyl disulfanyl group, 2-benzothiazolyl disulfanyl group, 및 4-nitro-thiophenyl disulfanyl group로 이루어진 군 중에서 선택된 reactive group이 결합되어 Cys34 free thiro group이 활성화된 것을 특징으로 하는 변형 알부민.
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