KR20080108147A - 페질화된 인자 ｖｉｉｉ - Google Patents

페질화된 인자 ｖｉｉｉ Download PDF

Info

Publication number
KR20080108147A
KR20080108147A KR1020087026600A KR20087026600A KR20080108147A KR 20080108147 A KR20080108147 A KR 20080108147A KR 1020087026600 A KR1020087026600 A KR 1020087026600A KR 20087026600 A KR20087026600 A KR 20087026600A KR 20080108147 A KR20080108147 A KR 20080108147A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
fviii
factor viii
rfviii
peg
polyethylene glycol
Prior art date
Application number
KR1020087026600A
Other languages
English (en)
Inventor
위르겐 직크만
카탈린 파라디
헤르베르트 그리취
페터 투레세크
Original Assignee
백스터 인터내셔널 인코포레이티드
박스터 헬쓰케어 에스.에이.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 백스터 인터내셔널 인코포레이티드, 박스터 헬쓰케어 에스.에이. filed Critical 백스터 인터내셔널 인코포레이티드
Publication of KR20080108147A publication Critical patent/KR20080108147A/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/745—Blood coagulation or fibrinolysis factors
    • C07K14/755—Factors VIII, e.g. factor VIII C (AHF), factor VIII Ag (VWF)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/04—Antihaemorrhagics; Procoagulants; Haemostatic agents; Antifibrinolytic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/745—Blood coagulation or fibrinolysis factors

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

본 발명은 10,000 달톤 이상의 분자량을 갖는 폴리에틸렌 글리콜과 같은 수용성 중합체에 컨쥬게이트된 온전한 B 영역의 적어도 일부분을 갖는 인자 VIII 분자를 포함하는 단백질성 구조물에 관한 것이다. 이 구조물은 천연 인자 VIII의 생물학적 활성의 적어도 80%의 생물학적 활성을 가지며, 구조물의 생체내 반감기는 천연 인자 VIII의 생체내 반감기에 비해서 적어도 1.5-배 증가된다.
Figure P1020087026600
단백질성 구조물, 응고인자 VIII, 수용성 중합체, 폴리에틸렌 글리콜, B 영역, 출혈성 질환.

Description

페질화된 인자 ＶＩＩＩ {PEGYLATED FACTOR VIII}
본 발명은 폴리에틸렌 글리콜과 같은 폴리(알킬렌 옥사이드) 등의 적어도 하나의 가용성 중합체에 결합된 응고인자 VIII (FVIII)을 포함하는 단백질성 구조물에 관한 것이다. 추가로, 본 발명은 FVIII의 기능적 결함 또는 결핍과 연관된 출혈성 질환을 갖는 포유동물의 혈액에서 FVIII의 생체내 반감기를 연장시키는 방법에 관한 것이다.
응고인자 VIII (FVIII)은 매우 낮은 농도로 혈장 내에서 순환하며, 폰 빌리브란트 인자 (von Willebrand factor; VWF)에 비-공유적으로 결합한다. 지혈 중에 FVIII은 VWF로부터 분리되어 칼슘 및 포스포리피드 또는 세포막의 존재 하에서 활성화의 비율을 증가시킴으로써 활성화된 인자 IX (FIXa)-매개된 인자 X (FX) 활성화를 위한 보조인자로 작용한다.
FVIII는 영역 구조 (domain structure) A1-A2-B-A3-C1-C2를 갖는 약 270-330 kD의 단일쇄 전구체로 합성된다. 혈장으로부터 정제되는 경우에, FVIII은 중쇄 (A1-A2-B) 및 경쇄 (A3-C1-C2)로 구성된다. 경쇄의 분자량은 80 kD인 반면에, B 영역 내에서의 단백질분해로 인하여 중쇄는 90-220 kD의 범위이다.
FVIII은 또한, 출혈성 질환에서의 치료학적 사용을 위해서 재조합 단백질로 합성된다. 다양한 시험관내 시험이 치료학적 의약으로서의 재조합 FVIII (rFVIII)의 잠재적인 효능을 측정하도록 고안되었다. 이들 시험은 내인성 FVIII의 생체내 효과를 모방한 것이다. FVIII의 시험관내 트롬빈 처리는 시험관내 시험에 의해서 측정되는 바와 같이, 그의 전구응고제 (procoagulant) 활성의 빠른 증가 및 이어서 감소를 야기한다. 이러한 활성화 및 불활성화는, FVIII에서 다양한 결합성 에피토프의 이용가능성을 변화시키는, 예를 들어, FVIII이 VWF로부터 분리하여 포스포리피드 표면에 결합하도록 하거나, 특정의 모노클로날 항체에 대한 결합능을 변화시키는 중쇄 및 경쇄 둘 다에서의 특이적인 제한된 단백질분해와 일치한다.
FVIII의 결여 또는 기능부전은 가장 빈번한 출혈성 질환인 A형 혈우병과 연관이 있다. A형 혈우병의 관리를 위해 선택되는 치료방법은 혈장 유래 또는 rFVIII 농축물을 사용한 대체요법이다. 1% 이하의 FVIII 수준을 갖는 중증의 A형 혈우병 환자는 일반적으로, 투약들 사이에 FVIII을 1% 이상으로 유지시키는 목적을 갖는 예방적 치료를 한다. 순환 중의 다양한 FVIII 생성물의 평균 반감기를 고려하여, 이것은 통상적으로 FVIII을 1 주일에 2 내지 3 회 제공함으로써 달성될 수 있다.
A형 혈우병의 치료를 위한 다수의 농축물이 시판되고 있다. 이들 농축물 중의 하나는 CHO-세포에서 생산되며, 박스터 헬스케어 코포레이션 (Baxter Healthcare Corporation)에 의해서 제조되는 재조합 생성물인 애드베이트 (Advate®)이다. 어떤 인간 또는 동물 혈장 단백질 또는 알부민도 이 생성물의 세포 배양과정, 정제, 또는 최종 제제화에 첨가되지 않는다.
FVIII 농축물 및 치료학적 폴리펩타이드 약물의 다수의 제조자의 목적은 다른 모든 생성물 특징은 유지시키면서 증진된 약동학적 및 약력학적 특성을 갖는 차세대 생성물을 개발하는 것이다.
치료학적 폴리펩타이드 약물은 단백질분해 효소에 의해서 빠르게 분해되고, 항체에 의해서 중화된다. 이것은 그들의 반감기 및 순환시간을 감소시킴으로써 그들의 치료학적 유효성을 제한한다. 폴리펩타이드에 대한 가용성 중합체 또는 탄수화물의 첨가는 분해를 방지하며, 폴리펩타이드 반감기를 증가시키는 것으로 나타났다. 예를 들어, 폴리펩타이드 약물의 페질화는 이들을 보호하며, 이들의 약동학적 및 약력학적 프로필을 개선시킨다 [Harris JM et Chess RB, Nat Rev Drug Discov 2003;2:214-21]. 페질화 과정은 폴리펩타이드 약물에 대한 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)의 반복단위를 부착시킨다. 분자의 페질화는 효소적 분해에 대한 약물의 저항성 증가, 생체내 반감기의 증가, 투약 빈도의 감소, 면역원성의 감소, 물리적 및 열 안정성의 증가, 용해도 증가, 액체 안정성 증가, 및 응집의 감소를 유도할 수 있다.
따라서, 페질화를 통하는 것과 같은 가용성 중합체의 첨가는 FVIII 생성물의 특성을 개선시키는 한가지 접근방법이다. 선행기술의 상태는 다양한 특허 및 특허출원에 의해서 입증된다:
US6037452에는 폴리(알킬렌 옥사이드)-FVIII 또는 FIX 컨쥬게이트가 기술되어 있는데, 여기에서는 단백질이 상기 FVIII의 카보닐-기를 통해서 폴리(알킬렌 옥사이드)에 공유적으로 결합된다.
EP1258497B1에는 FVIII과 생체적합성 중합체의 컨쥬게이트를 제조하는 방법이 기술되어 있다. 이 특허는 뢰스틴 (Rostin) 등의 문헌 [Bioconj. Chem 2000;11:387-96]에 의해서 보완되었다. 이 컨쥬게이트는 모노메톡시 폴리에틸렌 글리콜에 의해서 변형된 B-영역 결실 재조합 FVIII을 포함한다. 이 컨쥬게이트는 감소된 FVIII 기능을 가졌으며, 응고제 활성은 변형의 정도에 따라서 빠르게 감소하였다.
WO04075923A3은 다수의 컨쥬게이트를 포함하는 중합체-FVIII 분자 컨쥬게이트를 기술하고 있으며, 여기에서 각각의 컨쥬게이트는 FVIII 분자에 공유적으로 부착된 1 내지 3 개의 수용성 중합체를 갖는다. FVIII 분자는 B-영역-결실된다.
US4970300은 FVIII 활성을 갖는 단백질을 포함하는 불용해성 컨쥬게이트가 비항원성 리간드에 공유적으로 결합된 변형된 FVIII을 기술하고 있다.
US6048720은 폴리펩타이드와 생체적합성 중합체의 컨쥬게이트를 기술하였다.
WO94/15625에는 5,000 달톤 이하의 바람직한 분자량을 갖는 폴리에틸렌 글리콜에 결합된 FVIII이 기술되었다.
생체 내에서 FVIII의 반감기를 연장시키기 위해서 부착된 가용성 중합체를 갖는 FVIII, 예를 들어, 기능적 활성은 유지하면서 비-페질화된 FVIII에 비해 연장된 생체내 반감기를 제공하는, 10,000 달톤 이상의 PEG가 컨쥬게이트되어 있는 전체-길이 FVIII과 같은 페질화된 FVIII에 대한 필요성이 여전히 남아있다.
도 1은 SDS-PAGE에 이어서 면역블럿팅 (immunoblotitng)에 의해서 측정된 것 으로서, PEG와의 컨쥬게이션 후의 rFVIII의 확장 및 질량 증가를 나타낸다.
도 2는 혈우병 마우스에서 비-컨쥬게이트된 FVIII와 비교한 PEG-rFVIII 컨쥬게이트의 약력학을 나타낸다. 오픈된 사각형: PEGrFVIII, 용량 200 IU FVIII/㎏, 밀폐된 다이아몬드: 천연 rFVIII, 용량 200 IU FVIII/㎏.
도 3은 다양한 안티 FVIII 항체를 사용한 SDS-PAGE에 의한 페질화 부위의 상세한 분석을 나타낸다.
도 4는 천연 및 페질화된 rFVIII의 트롬빈-유도된 활성화 및 불활성화를 나타낸다.
도 5는 천연 및 페질화된 rFVIII의 영역을 표시하는 밴드를 나타낸다.
도 6은 천연 및 페질화된 rFVIII의 다양한 영역의 페질화 정도를 나타낸다.
도 7은 천연 및 페질화된 rFVIII의 트롬빈 불활성화율을 나타낸다.
본 발명은 폴리알킬렌 옥사이드, 폴리비닐 피롤리돈, 폴리비닐 알콜, 폴리옥사졸리딘, 폴리 아크릴로일모르폴린, 또는 폴리시알산 (PSA)과 같은 탄수화물인 수용성 중합체에 결합된, 온전한 B 영역의 적어도 일부분을 갖는 FVIII 분자를 포함하는 단백질성 구조물이다. 본 발명의 한가지 구체예에서, 수용성 중합체는 10,000 달톤 이상의 분자량을 갖는 폴리에틸렌 글리콜 분자이다. 구조물은 표준 치료학적 FVIII 생성물의 완전한 기능적 활성을 유지하며, 표준 치료학적 FVIII 생성물에 비해서 연장된 생체내 반감기를 제공한다.
본 발명의 출발물질은 특허 US4757006; US5733873; US5198349; US5250421; US5919766; EP 306 968에 기술된 바와 같이, 인간 혈장으로부터 유래하거나 재조합 공학기술에 의해서 생산될 수 있는 FVIII이다.
여기에서, 용어 "인자 VIII" 또는 "FVIII"은 온전한 B 영역의 적어도 일부분을 가지며, 천연 FVIII과 연관된 생물학적 활성을 나타내는 모든 FVIII 분자를 가리킨다. 본 발명의 한가지 구체예에서, FVIII 분자는 전체-길이 인자 VIII이다. FVIII 분자는 인자 VIII:C를 코드화하는 DNA에 대해 하이브리드화할 수 있는 DNA 서열에 의해서 코드화된 단백질이다. 이러한 단백질은 영역 A1-A2-B-A3-C1-C2 사이 또는 그 안의 다양한 부위에서 아미노산 결실을 함유할 수 있다. FVIII 분자는 또한, 하나 또는 그 이상의 아미노산 잔기가 부위-지시된 돌연변이유발에 의해서 대체된 천연 FVIII의 유사체이다.
예를 들어, FVIII 분자는 다양한 화학적 방법에 의해서 페질화될 수 있다 [Roberts JM et al., Advan Drug Delivery Rev 2002;54:459-76]. 예를 들어, FVIII은 선행 산화반응 후에 말레이미드 화학을 사용한 PEG의 유리 SH 기에 대한 컨쥬게이션 또는 FVIII의 탄수화물 부위에 대한 PEG 하이드라지드 또는 PEG 아민의 커플링에 의해서 페질화될 수 있다.
본 발명의 한가지 구체예에서, FVIII은 석신이미딜 석시네이트, 석신이미딜 글루타레이트 또는 석신이미딜 프로피오네이트와 같은 활성 N-하이드록시석신이미드 에스테르 (NHS)를 함유하는 폴리에틸렌 글리콜 유도체를 사용함으로써 라이신 잔기를 통해서 변형되었다. 이들 유도체는 안정한 아미드 결합을 형성함으로써 온화한 조건 하에서 FVIII의 라이신 잔기와 반응한다. 본 발명의 한가지 구체예에서, PEG 유도체의 쇄 길이는 5,000 Da이다. 선형 및 분지된 구조를 포함한 500 내지 2,000 Da, 2,000 내지 5,000 Da, 5,000 이상에서 10,000 Da 이하, 또는 10,000 이상에서 20,000 Da 이하, 또는 20,000 이상에서 150,000 Da 이하까지의 쇄 길이를 갖는 다른 PEG 유도체를 사용할 수 있다.
아미노기의 페질화를 위한 대용 방법은 우레탄 결합의 형성에 의한 PEG 카보네이트와의 화학적 컨쥬게이션, 또는 2급 아미드 결합을 형성하는 환원적 아미노화에 의한 알데히드 또는 케톤과의 반응이다.
본 발명에서, FVIII 분자는 상업적으로 이용할 수 있는 PEG 유도체를 사용하여 화학적으로 변형된다. 이들 PEG 유도체는 선형 또는 분지된 구조를 가질 수 있다. NHS 기를 함유하는 PEG-유도체의 예는 이하에 열거한다:
이하의 PEG 유도체는 넥타 테라포이틱스 (Nektar Therapeutics, Huntsville, AI; 참조 www.nektar.com/PEG reagent catalog; Nektar Advanced PEGylation, 가격 리스트 2005-2006)로부터 상업적으로 이용할 수 있는 것의 예이다:
mPEG-석신이미딜 프로피오네이트 (mPEG-SPA)
Figure 112008075438188-PCT00001
mPEG-석신이미딜 α-메틸부타노에이트 (mPEG-SMB)
Figure 112008075438188-PCT00002
mPEG-CM-HBA-NHS (CM = 카복시메틸; HBA = 하이드록시 부티르산)
Figure 112008075438188-PCT00003
분지된 PEG-유도체의 구조 (Nektar Therapeutics):
분지된 PEG N-하이드록시석신이미드 (mPEG2-NHS)
Figure 112008075438188-PCT00004
분지된 구조를 갖는 이 시약은 코즐로브스키 (Kozlowski) 등에 의해 더 상세하게 기술되었다 [BioDrugs 2001;5:419-29].
PEG 유도체의 다른 예는 NOF 코포레이션 (NOF Corporation, Tokyo, Japan; 참조 www.nof.co.jp/english: Catalogue 2005)으로부터 상업적으로 이용할 수 있다.
선형 PEG-유도체의 일반적 구조 (NOF Corp.):
Figure 112008075438188-PCT00005
X = 카복시메틸
Figure 112008075438188-PCT00006
X = 카복시펜틸
Figure 112008075438188-PCT00007
X = 석시네이트
Figure 112008075438188-PCT00008
mPEG 석신이미딜 석시네이트
X = 글루타레이트
Figure 112008075438188-PCT00009
mPEG 석신이미딜 글루타레이트
분지된 PEG-유도체의 구조 (NOF Corp.):
2,3-비스(메틸폴리옥시에틸렌-옥시)-1-(1,5-디옥소-5-석신이미딜옥시, 펜틸옥시) 프로판
Figure 112008075438188-PCT00010
2,3-비스(메틸폴리옥시에틸렌-옥시)-1-(석신이미딜 카복시펜틸옥시) 프로판
Figure 112008075438188-PCT00011
이들 프로판 유도체는 1,2 치환 패턴을 갖는 글리세롤 골격구조를 나타낸다. 본 발명에서는, 1,3-치환이 있는 글리세롤 구조 또는 US2003/0143596A1에 기술된 그 밖의 다른 분지된 구조를 기본으로 하는 분지된 PEG 유도체가 사용될 수도 있다.
문헌 [Tsubery et al., J Biol Chem 2004;279:38118-24; 및 Shechter et al., WO04089280A3]에 기술된 바와 같이 분해성 (예를 들어, 가수분해성) 링커를 갖는 PEG 유도체가 본 발명에서 사용될 수도 있다.
놀랍게도, 본 발명의 페질화된 FVIII은 생체내에서 증가된 FVIII 반감기와 함께 완전한 기능적 활성을 나타낸다. 또한, 페질화된 rFVIII은 트롬빈 불활성화에 대해서 더 저항성인 것으로 보인다. 이것은 다양한 시험관내 및 생체내 방법에 의해서 나타났으며, 이하의 실시예에 의해서 설명된다.
실시예 1:
mPEG 석신이미딜 석시네이트에 의한 rFVIII 내의 라이신 잔기의 페질화
애드베이트 제조공정으로부터 유래하는 rFVIII의 용액 (3,400 U/㎖)을 0.5% 슈크로즈 및 0.1% 폴리소르베이트 80을 함유하는, 20 mM Hepes 완충액, 150 mM NaCl (pH 7.4)를 사용하는 이코노-팩 (Econo-Pac) 10DG 칼럼 (Bio-Rad)을 사용함으로써 겔여과하였다. 그 후, 5,000 Da의 쇄 길이 (PEG-SS 5000)를 갖는 mPEG 석신이미딜 석시네이트 [Abuchowski et al. Cancer Biochim Biophys 1984;7:175-86]를 온화하게 교반하면서 이 용액에 첨가하고 (5 ㎎ PEG-SS/㎎ 단백질), 0.5 M NaOH를 적가함으로써 pH 값을 7.4로 조정하였다. 그 후, 실온에서 1 시간 동안 온화하게 교반하면서 페질화를 수행하였다.
이어서, 반응 혼합물을 0.5% 슈크로즈 및 0.1% 폴리소르베이트 80을 함유하는, 20 mM Hepes 완충액, 150 mM NaCl (pH 7.4) 중에서 평형화된 이온-교환 크로마토그래피 수지 (Fractogel EMD TMAE 650M / Pharmacia XK-10 칼럼, 베드 높이: 15.0 ㎝) 상에 적용하였다. 그 후, 칼럼을 20 CV 평형 완충액으로 세척하여 과잉의 시약을 제거하고, 페질화된 rFVIII을 용출 완충액 (20 mM Hepes, 1.0 M NaCl, 0.5% 슈크로즈, 0.1% 폴리소르베이트 80, pH 7.4)으로 용출시켰다. 용출액을 20 mM Hepes, 150 mM NaCl, 0.5% 슈크로즈 (pH 7.4)로 구성된 완충 시스템을 사용하여, 재생 셀룰로즈로 구성되고, 분자량 컷-오프 (cut-off)가 30 kD인 막을 사용하는 한외여과/정용여과 (diafiltration)에 의해서 농축시켰다.
실시예 2:
시험관내에서 페질화된 rFVIII 의 생화학적 특정화
애드베이트 제조공정으로부터 유래하는 rFVIII을 실시예 1에 따라서 페질화시키고, 페질화된 FVIII 생성물을 생화학적으로 특정화시켰다. PEG-rFVIII의 기능적 활성은 FVIII 발색성 시험 [Rosen S, Scand J Haematol 1984;33 (Suppl 40):139-45]을 사용하여 측정하였다. 이 방법은 문헌 [Ph. Eur. 5th edition (5.05) 2.7.4. Assay of Blood Coagulation Factor VIII]을 기본으로 한다.
인자 VIII (FVIII:C)을 함유하는 샘플을 칼슘을 함유하는 완충액 중의 트롬빈, 활성화된 인자 IX (FIXa), 포스포리피드 및 인자 X (FX)와 혼합시킨다. FVIII은 트롬빈에 의해서 활성화되며, 이어서 포스포리피드, FIXa 및 칼슘 이온과의 컴 플렉스를 형성한다. 이 컴플렉스는 인자 X를 인자 Xa로 활성화시키며, 이것은 다시 발색성 기질 FXa-1 (AcOH*CH3OCO-D-CHA-Gly-Arg-pNA)를 분해시킨다. 방출된 파라-니트로아닐린 (pNA)의 시간적 과정은 405 ㎚에서 마이크로 플레이트 판독기에 의해서 측정한다. 반응의 기울기는 샘플 내의 인자 VIII 농도에 비례한다. FVIII 항원 값은 사소하게 변형시킨, 상업적으로 이용할 수 있는 ELISA 시스템 (Cedarlane, Hornby, Ontario, Canada)을 사용하여 측정하였다. 이들 값으로부터 FVIII 색원체/FVIII 항원 비를 계산하였다. 제제 내의 단백질 함량은 280 ㎚에서 광학 밀도를 측정함으로써 결정되었다. 이들 데이타로부터 단백질 함량을 계산하였으며 [Hoyer LW in: Human Protein Data. Installments 1-6; Heberli Ed.; Wiley VCH, Weinheim, Germany, 1998], ㎎/㎖로 나타내었다.
천연 rFVIII PEG-rFVIII PEG-SS 5K (단백질 ㎎당 5 ㎎)
FVIII:Chr 활성 [U/㎖] 3,430 64
FVIII:Ag [U/㎖] 4,067 81
비 FVIII:Chr/FVIII:Ag 0.84 0.79
생물학적 활성의 회복율 (%) 100 94
표 1의 데이타는, 페질화된 rFVIII 제제에서 생물학적 활성 (FVIII 발색활성 대 FVIII 항원의 비로 표현됨)이 천연 rFVIII의 생물학적 활성 (100%)과 비교하여 90% 이상까지 회복됨을 나타낸다.
실시예 3:
SDS - PAGE 및 면역블럿팅 기술에 의한 페질화된 rFVIII 의 특정화
천연 rFVIII는 제조자의 설명서에 따라 인비트로겐 (Invitrogen, Carlsbad, California, USA)으로부터 입수한 4-12% 폴리아크릴아미드 구배 겔을 사용함으로써, 환원성 조건 하에서 SDS PAGE에 의해 특정화되었다. 분자량 마커 (MW)로는 바이오-래드 (Bio-Rad, Hercules, CA, USA)로부터 입수한 프리시죤 플러스 마커 (Precision Plus markers; 10 kD-250 kD)가 사용되었다. 그 후, 단백질을 일렉트로블럿팅 (electroblotting)에 의해서, 바이오-래드 (Bio-Rad, Hercules, CA, USA)로부터 입수한 PVDF 막 상에 옮기고, 이어서 세달레인 (Cedarlane, Hornby, Ontario, Canada)으로부터 입수한 폴리클로날 양 안티-인간 FVIII:C 항체와 함께 배양하였다. 면역염색과정의 마지막 단계는 어큐레이트 (Accurate, Westbury, NY, USA)로부터 입수한 알칼리성 포스파타제 (ALP) 컨쥬게이트된 안티-양 항체와의 배양에 이은 ALP 기질 키트 (Bio-Rad, Hercules, CA, USA)를 사용한 최종 시각화 (visualization)였다. 결과는 도 1에 요약하였다. 블럿트 (blot)는 천연 및 페질화된 rFVIII의 영역 구조를 설명한다. 페질화된 rFVIII은 천연 재조합 단백질에 비해서 더 넓은 밴드 및 더 큰 분자량을 갖는 것으로 나타난다.
실시예 4:
FVIII 결핍 녹아웃 마우스 모델에서 페질화된 rFVIII 의 약력학
문헌 [Bi et al., Nat Genet 1995;10:119-21]에 상세히 기술된 FVIII 결핍 마우스가 중증의 인간 A형 혈우병의 모델로 사용되었다. 5 마리의 마우스 군에게 꼬리 정맥을 통해서 실시예 1에 따라 제조된 PEG-rFVIII (PEG-SS, 5K) 또는 천연 rFVIII을 200 IU FVIII/체중 ㎏의 용량으로 일시 주사 (10 ㎖/㎏)하였다. 마취시킨 후의 심장 천자에 의해 주사한 지 5 분, 3, 6, 9 및 24 시간 후에 각각의 군으로부터 시트레이트 혈장을 준비하였다. FVIII 활성 수준을 혈장 샘플에서 측정하였다. 이 실험의 결과는 도 2에 요약하였다. 평균 반감기는 1.9 시간 (천연 rFVIII)에서 4.9 시간 (페질화된 rFVIII의 경우)으로 상승하였으며, 곡선하면적 (AUC)은 13.0에서 25.2 시간*IU/㎖로 증가하였다. 반감기 계산은 약력학 라이브러리 (pharmacokinetic library, MicroMath, Saint Louis, MO, USA)로부터의 마이크로매스 사이언티스트 (MicroMath Scientist), 모델 1에 의해 수행되었다.
실시예 5:
SDS - PAGE 및 면역블럿팅 기술에 의한 rFVIII 의 페질화의 상세한 분석
천연 및 페질화된 rFVIII을 60℃에서 60 분 동안 1 nM 트롬빈으로 분해시켰으며, 이에 의해 잘 규정된 분해 생성물을 갖는 FVIII 분자의 특이적 절단을 야기하였다. 이들 중쇄 및 경쇄 단편은 실시예 3에 기술된 바와 같이 SDS-PAGE에 이은 일렉트로블럿팅에 의해서 분리시켰다. 절단된 단편을 가시화하기 위해서, 중쇄 A1 및 A2 영역, B 영역 및 경쇄 N-말단 A3 영역에 대한 폴리클로날 항체 및 모노클로날 항체가 사용되었다.
도 3에 나타낸 바와 같이, 모든 영역은 비록 상이한 정도이지만 페질화되었다. B 영역은 강력하게 페질화되었다. 중쇄의 A1 및 A2 영역은 둘 다 부분적으로 페질화되었다. 다양한 페질화-정도 (모노-, 디-, 트리- ...)가 경쇄 A3-영역에서 관찰될 수 있었다. 실시예 6과 일치하게, 페질화된 FVIII은 트롬빈에 대해서 더 저항성인 것으로 생각되었다.
실시예 6:
페질화된 rFVIII 의 트롬빈 -저항성
시험관 내에서 FVIII의 트롬빈 처리는 그의 전구응고제 활성의 빠른 증가, 및 이어서 감소를 야기한다. 트롬빈 농도 및 FVIII의 무결성 (integrity)에 따라 결정되는 활성화 및 불활성화의 비율은 다음과 같이 FIXa 보조인자 시험에 의해서 모니터하였다.
FVIII을 37℃에서 0.5 또는 1 nM 트롬빈과 함께 배양하였다. 서브샘플 (subsample)은 0.5 내지 40 분 간격으로 채취하여 추가의 트롬빈-매개된 반응을 중지시키기 위해서 특정의 트롬빈 억제제를 또한 함유하는 FIXa, FX, PL-베시클 (vesicles) 및 CaCl2의 혼합물에 첨가하고, 3 분 동안 배양하였다. 서브샘플을, FXa 및 함유된 EDTA에 의해서 선택적으로 절단되어 추가의 Xa 활성을 중지시키는 발색성 기질에 첨가하였다. 15 분 동안 배양한 후에, 아세트산에 의해서 반응을 종결시켰다. Fxa 농도에 비례하는 흡광도 (A405) 값을 ELISA 판독기에서 측정하였으며, 정제된 Fxa 기준 곡선을 사용하여 Fxa 농도로 전환시켰다. 산출된 Fxa 농도를 트롬빈과의 배양시간에 대비하여 도시하였다.
FVIII의 유사-일차 불활성화 비율은 곡선의 하강하는 부분을 단일지수 적합도 (single exponential fit)와 피팅 (fitting)함으로써 결정되었다.
일차 불활성화 비율 kl (1/분) 상대적 kl
트롬빈 천연 FVIII PEG-FVIII PEG/천연
0.5 nM 0.14 0.08 0.57
1 nM 0.24 0.14 0.58
도 4 및 표 2에 나타낸 바와 같이, 페질화된 rFVIII은 적용된 트롬빈 농도 둘 다에서 더 느린 불활성화 비율을 나타내었다.
실시예 7:
분지된 2,3- 비스 ( 메틸폴리옥시에틸렌옥시 )-1-(1,5- 디옥소 -5- 석신이미딜옥시 , 펜틸옥시) 프로판에 의한 rFVIII 내의 라이신 잔기의 페질화
150 mM NaCl, 0.5% 슈크로즈 및 0.1% 폴리소르베이트 80을 함유하는 20 mM Hepes 완충액 (pH 7.4) 내의 rFVIII의 용액을 애드베이트 제조공정으로부터 유래하는 489 IU FVIII/㎖를 함유하는 벌크 물질로부터 제조되었다. 153 ㎖의 이 용액에 NOF 코포레이션 (NOF Corporation, Tokyo, Japan)으로부터 입수한 분자량 20 kD의 분지된 PEG 석신이미딜 글루타레이트 (PEG-SG) 시약 (2,3-비스(메틸폴리옥시에틸렌-옥시)-1-(1,5-디옥소-5-석신이미디옥시, 펜틸옥시) 프로판)을 온화하게 교반하면서 첨가하고 (5 ㎎ 시약/㎎ 단백질), 10 분 후에 0.5 M NaOH를 적가함으로써 pH 값을 7.4로 조정하였다. 그 후, rFVIII의 페질화는 온화하게 교반하면서 실온에서 1 시간 동안 수행하였다.
이어서, 반응 혼합물을 0.5% 슈크로즈 및 0.1% 폴리소르베이트 80을 함유하는, 20 mM Hepes 완충액, 150 mM NaCl (pH 7.4) 중에서 1 ㎝/분의 선형 유속으로 평형화된 이온-교환 크로마토그래피 수지 (Fractogel EMD TMAE 650M / Pharmacia XK-50 칼럼, 베드 높이: 14.5 ㎝) 상에 적용하였다. 칼럼을 25 CV 평형 완충액으로 세척하여 과잉의 시약을 제거하고 (선형 유속: 2 ㎝/분), 페질화된 rFVIII을 0.5 ㎝/분의 선형 유속으로 용출 완충액 (20 mM Hepes, 1.0 M NaCl, 0.5% 슈크로즈, 0.1% 폴리소르베이트 80, pH 7.4)에 의해 용출시켰다. 그 후, 용출액을 20 mM Hepes, 150 mM NaCl, 0.5% 슈크로즈 (pH 7.4)로 구성된 완충 시스템을 사용하여, 재생 셀룰로즈로 구성되고, 분자량 컷-오프가 30 kD인 막을 사용하는 한외여과/정용여과에 의해서 농축시켰다.
실시예 8:
분지된 PEG - SG 20 kD 에 의해서 페질화된 rFVIII 의 시험관내 특정화
애드베이트 제조공정으로부터 유래하는 rFVIII을 실시예 7에 따라 분지된 PEG-SG 시약을 사용하여 라이신 잔기를 통해 페질화시키고, 페질화된 rFVIII 생성물을 실시예 2에 기술된 바와 같이 생화학적으로 특정화시켰다.
천연 rFVIII PEG-rFVIII PEG-SG 20K (단백질 ㎎당 5 ㎎)
FVIII:Chr 활성 [U/㎖] 9,950 1,040
FVIII:Ag [U/㎖] 20,807 1,763
비 FVIII:Chr/FVIII:Ag 0.48 0.59
생물학적 활성의 회복율 (%) 100 120
표 3의 데이타는, 페질화된 rFVIII 제제에서 생물학적 활성 (FVIII 발색활성 대 FVIII 항원의 비로 표현됨)이 천연 rFVIII의 생물학적 활성 (100%)과 비교하여 완전하게 회복되었음을 나타낸다.
페질화된 rFVIII은 실시예 3에 기술된 바와 같이 4-12% 폴리아크릴아미드 구배 겔을 사용하여 환원성 조건 하에서 SDS PAGE 및 면역블럿팅 기술에 의해 특정화되었다. 결과는 도 5에 요약하였다. 블럿트는 천연 및 페질화된 rFVIII의 영역 구조를 설명한다. 페질화된 rFVIII은 천연 재조합 단백질에 비해서 더 넓은 밴드 및 더 큰 분자량을 갖는 것으로 나타난다.
SDS-PAGE 및 면역블럿팅 기술에 의해 rFVIII 제제의 페질화에 대한 더 상세한 분석을 하기 위해서, 천연 및 페질화된 rFVIII을 실시예 5에 기술된 바와 같이, 60℃에서 60 분 동안 1 nM 트롬빈으로 분해시켜 이에 의해 잘 규정된 분해 생성물을 갖는 FVIII 분자의 특이적 절단을 야기하였다. 단편을 SDS-PAGE에 이은 일렉트로블럿팅에 의해서 분리시키고, 다양한 안티-FVIII 항체에 의해서 가시화하였다. 도 6에 나타낸 바와 같이, 모든 영역은 비록 상이한 정도이지만 페질화되었다. B 영역은 강력하게 페질화되었다. 다양한 페질화-정도 (모노-, 디-, 트리-페질화)가 경쇄 A3-영역에서 관찰될 수 있었다. 이 결과는 페질화된 rFVIII이 트롬빈에 대해서 더 저항성인 것으로 생각됨을 시사한다.
트롬빈에 의한 활성화 및 불활성화의 비율은 실시예 6에 기술된 바와 같이 FIXa 보조인자 시험에 의해서 모니터하였다. FVIII의 유사-일차 불활성화 비율은 곡선의 하강하는 부분을 단일지수 적합도와 피팅함으로써 결정되었다.
일차 불활성화 비율 kl (1/분) 상대적 kl
트롬빈 천연 FVIII PEG-FVIII PEG/천연
0.5 nM 0.13 0.09 0.67
1 nM 0.21 0.15 0.71
도 7 및 표 4에 나타낸 바와 같이, 페질화된 rFVIII은 적용된 트롬빈 농도 둘 다에서 더 느린 불활성화 비율을 나타내었다.

Claims (10)

  1. (a) 온전한 B 영역의 적어도 일부분을 갖는 인자 VIII 분자; 및
    (b) 상기 인자 VIII 분자에 결합된, 10,000 달톤 이상의 분자량을 갖는 적어도 하나의 폴리에틸렌 글리콜 분자를 포함하며,
    천연 인자 VIII의 생물학적 활성의 적어도 80%의 생물학적 활성을 갖고 (여기에서, 구조물 및 천연 인자 VIII의 생물학적 활성은 FVIII 항원 값에 대한 발색활성의 비 (FVIII:Chr/FVIII:Ag)에 의해서 결정된다), 천연 인자 VIII의 생체내 반감기에 비해서 적어도 1.5-배 증가된 생체내 반감기를 갖는 단백질성 구조물.
  2. 제1항에 있어서, 천연 인자 VIII의 생물학적 활성의 적어도 90%의 생물학적 활성을 갖는 단백질성 구조물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 인자 VIII 분자가 재조합 인자 VIII인 단백질성 구조물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 인자 VIII 분자가 전체-길이 인자 VIII인 단백질성 구조물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 폴리에틸렌 글리콜 분자가 10,000 Da 이상 내지 약 125,000 Da의 분자량을 갖는 단백질성 구조물.
  6. 제1항에 있어서, 상기 폴리에틸렌 글리콜 분자가 약 15,000 내지 약 20,000 Da의 분자량을 갖는 단백질성 구조물.
  7. 제1항에 있어서, 상기 폴리에틸렌 글리콜 분자가 약 18,000 내지 약 25,000 Da의 분자량을 갖는 단백질성 구조물.
  8. 제1항에 있어서, 상기 폴리에틸렌 글리콜 분자가 약 20,000 Da의 분자량을 갖는 단백질성 구조물.
  9. 제1항에 있어서, 상기 폴리에틸렌 글리콜 분자가 약 20,000 내지 약 150,000 Da의 분자량을 갖는 단백질성 구조물.
  10. 제1항에 있어서, 상기 폴리에틸렌 글리콜 분자가 선형 또는 분지된 구조를 갖는 단백질성 구조물.
KR1020087026600A 2006-03-31 2007-03-29 페질화된 인자 ｖｉｉｉ KR20080108147A (ko)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US78796806P 2006-03-31 2006-03-31
US60/787,968 2006-03-31
US79023906P 2006-04-06 2006-04-06
US60/790,239 2006-04-06

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20080108147A true KR20080108147A (ko) 2008-12-11

Family

ID=38330191

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020087026600A KR20080108147A (ko) 2006-03-31 2007-03-29 페질화된 인자 ｖｉｉｉ

Country Status (11)

Country Link
US (2) US7683158B2 (ko)
EP (1) EP2010222A1 (ko)
JP (1) JP2009532351A (ko)
KR (1) KR20080108147A (ko)
AU (1) AU2007245190B2 (ko)
BR (1) BRPI0708832A2 (ko)
CA (1) CA2647314A1 (ko)
MX (1) MX2008012600A (ko)
NO (1) NO20084608L (ko)
NZ (1) NZ572050A (ko)
WO (1) WO2007126808A1 (ko)

Families Citing this family (74)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7179617B2 (en) * 2001-10-10 2007-02-20 Neose Technologies, Inc. Factor IX: remolding and glycoconjugation of Factor IX
PH12014500352A1 (en) 2004-11-12 2015-07-20 Bayer Healthcare Llc Site-directed modification of fviii
US7846445B2 (en) * 2005-09-27 2010-12-07 Amunix Operating, Inc. Methods for production of unstructured recombinant polymers and uses thereof
US7855279B2 (en) 2005-09-27 2010-12-21 Amunix Operating, Inc. Unstructured recombinant polymers and uses thereof
WO2007126808A1 (en) 2006-03-31 2007-11-08 Baxter International Inc Pegylated factor viii
US7985839B2 (en) * 2006-03-31 2011-07-26 Baxter International Inc. Factor VIII polymer conjugates
US7645860B2 (en) * 2006-03-31 2010-01-12 Baxter Healthcare S.A. Factor VIII polymer conjugates
US7982010B2 (en) * 2006-03-31 2011-07-19 Baxter International Inc. Factor VIII polymer conjugates
BRPI0720282B8 (pt) 2006-12-15 2021-05-25 Baxalta GmbH construção proteica, composição farmacêutica, e, kit
WO2008116913A2 (en) * 2007-03-28 2008-10-02 Novo Nordisk A/S Peptide compounds with transient biodegradable pegylation
WO2008154639A2 (en) 2007-06-12 2008-12-18 Neose Technologies, Inc. Improved process for the production of nucleotide sugars
US20100268055A1 (en) * 2007-07-19 2010-10-21 Arizona Board of Regents, a body corporate acting for and on behalf of Arizona State University Self-Anchoring MEMS Intrafascicular Neural Electrode
KR20100058541A (ko) * 2007-08-15 2010-06-03 아뮤닉스 인코포레이티드 생물학적 활성 폴리펩티드의 특성을 변경하기 위한 조성물 및 방법
KR20100095441A (ko) * 2007-11-09 2010-08-30 백스터 인터내셔널 인코포레이티드 변형된 재조합 인자 ⅷ 및 폰 빌레브란트 인자 및 사용 방법
EP2245456B1 (en) 2007-12-27 2013-02-13 Baxter International Inc. Method and compositions for specifically detecting physiologically acceptable polymer molecules
CN101965200B (zh) 2008-02-27 2013-06-19 诺沃-诺迪斯克有限公司 缀合的因子ⅷ分子
US20110183906A1 (en) * 2008-04-24 2011-07-28 Celtic Pharma Peg Ltd. Factor ix conjugates with extended half-lives
JP5832285B2 (ja) 2008-06-24 2015-12-16 ツェー・エス・エル・ベーリング・ゲー・エム・ベー・ハー 延長されたインビボ半減期を有する第ｖｉｉｉ因子、フォン・ヴィレブランド因子又はそれらの複合体
AU2014268202B2 (en) * 2008-08-01 2017-08-03 Takeda Pharmaceutical Company Limited Factor VIII Polymer Conjugates
WO2010045321A2 (en) * 2008-10-15 2010-04-22 Baxter International Inc. Pegylation of recombinant blood coagulation factors in the presence of bound antibodies
KR101929641B1 (ko) * 2008-10-17 2018-12-14 박스알타 인코퍼레이티드 낮은 수준의 수용성 중합체를 포함하는 개질된 혈액 인자
CA2748662A1 (en) * 2009-01-19 2010-07-22 Bayer Healthcare Llc Protein conjugate having an endopeptidase-cleavable bioprotective moiety
US8703717B2 (en) * 2009-02-03 2014-04-22 Amunix Operating Inc. Growth hormone polypeptides and methods of making and using same
US8680050B2 (en) * 2009-02-03 2014-03-25 Amunix Operating Inc. Growth hormone polypeptides fused to extended recombinant polypeptides and methods of making and using same
ES2610356T3 (es) 2009-02-03 2017-04-27 Amunix Operating Inc. Polipéptidos recombinantes extendidos y composiciones que comprenden los mismos
US20110306551A1 (en) * 2009-02-19 2011-12-15 Novo Nordisk A/S Modification of Factor VIII
TW201042257A (en) * 2009-05-26 2010-12-01 Baxter Int Detection of antibody that binds to water soluble polymer-modified polypeptides
PT2440228T (pt) * 2009-06-08 2018-12-24 Amunix Operating Inc Polipéptidos de regulação da glicose e métodos de preparação e utilização dos mesmos
US9849188B2 (en) 2009-06-08 2017-12-26 Amunix Operating Inc. Growth hormone polypeptides and methods of making and using same
US8809501B2 (en) 2009-07-27 2014-08-19 Baxter International Inc. Nucleophilic catalysts for oxime linkage
PL2459224T3 (pl) * 2009-07-27 2017-08-31 Baxalta GmbH Koniugaty białka związanego z krzepnięciem krwi
US8642737B2 (en) 2010-07-26 2014-02-04 Baxter International Inc. Nucleophilic catalysts for oxime linkage
RU2533619C2 (ru) * 2009-07-27 2014-11-20 Лайпоксен Текнолоджиз Лимитед Гликополисиалирование белков, не являющихся белками свертывания крови
CA2769326A1 (en) 2009-07-27 2011-02-10 Baxter International Inc. Blood coagulation protein conjugates
WO2011028229A1 (en) 2009-08-24 2011-03-10 Amunix Operating Inc. Coagulation factor ix compositions and methods of making and using same
HUE036233T2 (hu) 2009-12-06 2018-06-28 Bioverativ Therapeutics Inc VIII-FC Faktor kimérás és hibrid polipeptidek, és ezek használati módszerei
US20130040888A1 (en) 2010-02-16 2013-02-14 Novo Nordisk A/S Factor VIII Molecules With Reduced VWF Binding
US8557961B2 (en) 2010-04-02 2013-10-15 Amunix Operating Inc. Alpha 1-antitrypsin compositions and methods of making and using same
GB201007357D0 (en) * 2010-04-30 2010-06-16 Leverton Licence Holdings Ltd Conjugated factor VIII
GB201007356D0 (en) 2010-04-30 2010-06-16 Leverton Licence Holdings Ltd Conjugated factor VIIa
WO2012007324A2 (en) * 2010-07-15 2012-01-19 Novo Nordisk A/S Stabilized factor viii variants
KR20130125789A (ko) * 2010-12-16 2013-11-19 노보 노르디스크 에이/에스 수성 인자ⅷ 용액
CA2822591C (en) 2010-12-22 2020-12-29 Baxter International Inc. Materials and methods for conjugating a water soluble fatty acid derivative to a protein
EP3412314A1 (en) * 2011-05-27 2018-12-12 Baxalta GmbH Therapeutic proteins conjugated to polysialic acid and methods of preparing same
AU2012311484B2 (en) 2011-09-23 2017-04-13 Novo Nordisk A/S Novel glucagon analogues
WO2013120939A1 (en) 2012-02-15 2013-08-22 Csl Behring Gmbh Von willebrand factor variants having improved factor viii binding affinity
EP3549953A1 (en) 2012-02-15 2019-10-09 Bioverativ Therapeutics Inc. Recombinant factor viii proteins
CA2864904C (en) 2012-02-15 2023-04-25 Amunix Operating Inc. Factor viii compositions and methods of making and using same
CN107496932A (zh) 2012-02-27 2017-12-22 阿穆尼克斯运营公司 Xten缀合组合物和制造其的方法
EP2838566A2 (en) * 2012-04-16 2015-02-25 Cantab Biopharmaceuticals Patents Limited Optimised subcutaneous therapeutic agents
TWI609083B (zh) 2012-09-28 2017-12-21 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Blood coagulation reaction assessment method
CN105007896B (zh) * 2012-12-28 2019-04-09 雅培心血管***公司 包含抗体的治疗组合物
EP2970430A4 (en) * 2013-03-15 2017-01-11 Bayer HealthCare LLC Recombinant factor viii formulations
RS59124B1 (sr) 2013-04-18 2019-09-30 Novo Nordisk As Stabilni, produženi koagonisti glp-1/glukagonskih receptora za medicinsku upotrebu
DK2796145T3 (da) 2013-04-22 2018-01-29 Csl Ltd Et kovalent kompleks af von Willebrand-faktor og faktor VIII linket af en disulfidbro
US10548953B2 (en) 2013-08-14 2020-02-04 Bioverativ Therapeutics Inc. Factor VIII-XTEN fusions and uses thereof
EP3151852A1 (en) 2014-06-04 2017-04-12 Novo Nordisk A/S Glp-1/glucagon receptor co-agonists for medical use
JP6676551B2 (ja) 2014-07-02 2020-04-08 ツェー・エス・エル・ベーリング・レングナウ・アクチエンゲゼルシャフト 改変フォンウィルブランド因子
BR112017002090B1 (pt) 2014-08-04 2021-06-01 Csl Limited Composição aquosa de fator viii de coagulação e método de estabilizar uma molécula de fviii
SG11201706659WA (en) 2015-03-06 2017-09-28 Csl Behring Recombinant Facility Ag Modified von willebrand factor having improved half-life
JP6573989B2 (ja) 2015-05-22 2019-09-11 ツェー・エス・エル・ベーリング・レングナウ・アクチエンゲゼルシャフト 血友病を処置するための切断型フォン・ヴィルブランド因子ポリペプチド
ES2912300T3 (es) 2015-05-22 2022-05-25 CSL Behring Lengnau AG Procedimientos de preparación de factor von Willebrand modificado
JP2015155469A (ja) * 2015-06-01 2015-08-27 バクスター・インターナショナル・インコーポレイテッドＢａｘｔｅｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｃｏｒｐ０Ｒａｔｅｄ 第ｆｖｉｉｉ因子ポリマー結合体
JP6552286B2 (ja) * 2015-06-05 2019-07-31 公立大学法人奈良県立医科大学 凝固第ｖｉｉｉ因子の複合体形成能に関する情報の取得方法および試薬キット
WO2017024060A1 (en) 2015-08-03 2017-02-09 Biogen Ma Inc. Factor ix fusion proteins and methods of making and using same
IL307276A (en) 2015-08-28 2023-11-01 Amunix Operating Inc Chimeric polypeptide composition and methods for its preparation and use
US10808023B2 (en) 2016-01-07 2020-10-20 CSL Behring Lengnau AG Mutated von Willebrand factor
SG10201912498YA (en) 2016-01-07 2020-02-27 CSL Behring Lengnau AG Mutated truncated von willebrand factor
CA3043250A1 (en) 2016-11-11 2018-05-17 CSL Behring Lengnau AG Truncated von willebrand factor polypeptides for treating hemophilia
WO2018087271A1 (en) 2016-11-11 2018-05-17 Csl Behring Recombinant Facility Ag Truncated von willebrand factor polypeptides for extravascular administration in the treatment or prophylaxis of a blood coagulation disorder
AR113142A1 (es) * 2017-09-29 2020-01-29 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Moléculas de unión al antígeno multiespecíficas que tienen actividad de sustitución de la función de cofactor del factor viii de coagulación de sangre (fviii), y formulaciones farmacéuticas que contienen dicha molécula como ingrediente activo
JP2018115170A (ja) * 2018-03-02 2018-07-26 バクスアルタ ゲーエムベーハー 第ｆｖｉｉｉ因子ポリマー結合体
JP2022538357A (ja) 2019-07-04 2022-09-01 ツェー・エス・エル・ベーリング・レングナウ・アクチエンゲゼルシャフト 第ＶＩＩＩ凝固因子のｉｎ ｖｉｔｒｏでの安定性を向上させるための切断型フォン・ヴィレブランド因子（ＶＷＦ）
EP4058049A1 (en) 2019-11-11 2022-09-21 CSL Behring Lengnau AG Polypeptides for inducing tolerance to factor viii

Family Cites Families (72)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4179337A (en) * 1973-07-20 1979-12-18 Davis Frank F Non-immunogenic polypeptides
US4356170A (en) 1981-05-27 1982-10-26 Canadian Patents & Development Ltd. Immunogenic polysaccharide-protein conjugates
US4757006A (en) * 1983-10-28 1988-07-12 Genetics Institute, Inc. Human factor VIII:C gene and recombinant methods for production
US4965199A (en) 1984-04-20 1990-10-23 Genentech, Inc. Preparation of functional human factor VIII in mammalian cells using methotrexate based selection
US4970300A (en) * 1985-02-01 1990-11-13 New York University Modified factor VIII
WO1986006096A1 (en) 1985-04-11 1986-10-23 The Children's Medical Center Corporation Von willebrand factor
US5198349A (en) * 1986-01-03 1993-03-30 Genetics Institute, Inc. Method for producing factor VIII:C and analogs
US5250421A (en) * 1986-01-03 1993-10-05 Genetics Institute, Inc. Method for producing factor VIII:C-type proteins
CA1339946C (en) 1987-03-31 1998-07-07 Michael J. Griffith Ultrapurification process for polypeptides
JPH0387173A (ja) 1987-09-10 1991-04-11 Teijin Ltd ヒト活性化天然型ファクター８ｃの製造方法及びそれに用いる形質転換体
US5605884A (en) 1987-10-29 1997-02-25 Rhone-Poulenc Rorer Pharmaceuticals Inc. Factor VIII formulations in high ionic strength media
US4877608A (en) 1987-11-09 1989-10-31 Rorer Pharmaceutical Corporation Pharmaceutical plasma protein formulations in low ionic strength media
US5153265A (en) 1988-01-20 1992-10-06 Cetus Corporation Conjugation of polymer to colony stimulating factor-1
US5122614A (en) * 1989-04-19 1992-06-16 Enzon, Inc. Active carbonates of polyalkylene oxides for modification of polypeptides
SE465222C5 (sv) * 1989-12-15 1998-02-10 Pharmacia & Upjohn Ab Ett rekombinant, humant faktor VIII-derivat och förfarande för dess framställning
DE4001451A1 (de) 1990-01-19 1991-08-01 Octapharma Ag Stabile injizierbare loesungen von faktor viii und faktor ix
SE466754B (sv) 1990-09-13 1992-03-30 Berol Nobel Ab Saett att kovalent binda biopolymerer till hydrofila ytor
EP0513332A4 (en) 1990-11-14 1993-03-17 Cargill, Incorporated Conjugates of poly(vinylsaccharide) with proteins for the stabilization of proteins
WO1992016555A1 (en) 1991-03-18 1992-10-01 Enzon, Inc. Hydrazine containing conjugates of polypeptides and glycopolypeptides with polymers
US5595732A (en) 1991-03-25 1997-01-21 Hoffmann-La Roche Inc. Polyethylene-protein conjugates
DE4111393A1 (de) 1991-04-09 1992-10-15 Behringwerke Ag Stabilisierte faktor viii-praeparationen
US5846951A (en) 1991-06-06 1998-12-08 The School Of Pharmacy, University Of London Pharmaceutical compositions
AU2297792A (en) 1991-06-28 1993-01-25 Rhone-Poulenc Rorer International (Holdings) Inc. Therapeutic polypeptides based on von willebrand factor
US6037452A (en) * 1992-04-10 2000-03-14 Alpha Therapeutic Corporation Poly(alkylene oxide)-Factor VIII or Factor IX conjugate
WO1994005332A2 (en) 1992-09-01 1994-03-17 Berlex Laboratories, Inc. Glycolation of glycosylated macromolecules
SK282483B6 (sk) * 1992-10-02 2002-02-05 Genetics Institute, Inc. Stabilná kompozícia koagulačného faktora VIII, spôsob jej prípravy a stabilizácie
NZ250375A (en) 1992-12-09 1995-07-26 Ortho Pharma Corp Peg hydrazone and peg oxime linkage forming reagents and protein derivatives
US5298643A (en) * 1992-12-22 1994-03-29 Enzon, Inc. Aryl imidate activated polyalkylene oxides
FR2700268B1 (fr) 1993-01-13 1995-03-31 Lvmh Rech Composition cosmétique ou pharmaceutique, notamment dermatologique, contenant un extrait de Vismia.
WO1994015625A1 (en) 1993-01-15 1994-07-21 Enzon, Inc. Factor viii - polymeric conjugates
US5621039A (en) 1993-06-08 1997-04-15 Hallahan; Terrence W. Factor IX- polymeric conjugates
US5919455A (en) 1993-10-27 1999-07-06 Enzon, Inc. Non-antigenic branched polymer conjugates
DE4435485C1 (de) 1994-10-04 1996-03-21 Immuno Ag Verfahren zur Gewinnung von hochreinem von Willebrand-Faktor
US6127153A (en) 1995-06-07 2000-10-03 Neose Technologies, Inc. Method of transferring at least two saccharide units with a polyglycosyltransferase, a polyglycosyltransferase and gene encoding a polyglycosyltransferase
AU6255096A (en) 1995-06-07 1996-12-30 Mount Sinai School Of Medicine Of The City University Of New York, The Pegylated modified proteins
SE9503380D0 (sv) * 1995-09-29 1995-09-29 Pharmacia Ab Protein derivatives
US6005077A (en) 1995-11-10 1999-12-21 Immuno Aktiengesellschaft Use of von willebrand factor and pharmaceutical formulation
US6562781B1 (en) 1995-11-30 2003-05-13 Hamilton Civic Hospitals Research Development Inc. Glycosaminoglycan-antithrombin III/heparin cofactor II conjugates
US6214966B1 (en) 1996-09-26 2001-04-10 Shearwater Corporation Soluble, degradable poly(ethylene glycol) derivatives for controllable release of bound molecules into solution
AT405740B (de) 1996-12-13 1999-11-25 Immuno Ag Von willebrand-faktor-derivat sowie ein verfahren zur isolierung von proteinen
AT405403B (de) 1997-02-27 1999-08-25 Immuno Ag Reinigung von von willebrand-faktor durch kationenaustauscherchromatographie
WO1998049198A1 (en) 1997-04-30 1998-11-05 Enzon, Inc. Single-chain antigen-binding proteins capable of glycosylation, production and uses thereof
US6183738B1 (en) 1997-05-12 2001-02-06 Phoenix Pharamacologics, Inc. Modified arginine deiminase
AT405485B (de) 1997-05-28 1999-08-25 Immuno Ag Eine das vwf-propeptid enthaltende pharmazeutische präparation
EP0985697B1 (en) 1998-03-24 2006-01-04 Nof Corporation Oxirane derivatives and process for producing the same
EE05201B1 (et) 1998-10-16 2009-08-17 Biogen Idec Ma Inc. Glkoslitud interferoon-beeta, selle kasutamine ja seda sisaldav farmatseutiline kompositsioon, meetod interferoon-beeta-1a aktiivsuse pikendamiseks ja leiutisekohase valgu valmistamiseks
DE19852729A1 (de) 1998-11-16 2000-05-18 Werner Reutter Rekombinante Glycoproteine, Verfahren zu ihrer Herstellung, sie enthaltende Arzneimittel und ihre Verwendung
AT407750B (de) 1999-02-19 2001-05-25 Immuno Ag Verfahren zur herstellung einer vwf-präparation
CN101810854A (zh) 1999-02-22 2010-08-25 巴克斯特国际公司 新的无白蛋白的因子viii制剂
WO2001005434A2 (en) 1999-07-20 2001-01-25 Amgen Inc. Hyaluronic acid-protein conjugates
US6531122B1 (en) 1999-08-27 2003-03-11 Maxygen Aps Interferon-β variants and conjugates
US7230081B1 (en) 1999-11-12 2007-06-12 Maxygen Holdings, Ltd. Interferon gamma conjugates
SE515295C2 (sv) 1999-11-23 2001-07-09 Medicarb Ab Förfarande för framställning av konjugat av en biologiskt aktiv polysackarid och ett fast substrat, samt sådana konjugat
EP2319541A1 (en) 2000-02-11 2011-05-11 Bayer HealthCare LLC Factor VII or VIIA-like conjugates
US6586398B1 (en) 2000-04-07 2003-07-01 Amgen, Inc. Chemically modified novel erythropoietin stimulating protein compositions and methods
US7118737B2 (en) 2000-09-08 2006-10-10 Amylin Pharmaceuticals, Inc. Polymer-modified synthetic proteins
DE60137525D1 (de) * 2000-10-16 2009-03-12 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Peg-modifiziertes erythropoietin
AUPR610501A0 (en) 2001-07-04 2001-07-26 Smart Drug Systems Inc Treatment of parasitic disease
US6913915B2 (en) 2001-08-02 2005-07-05 Phoenix Pharmacologics, Inc. PEG-modified uricase
US7265084B2 (en) 2001-10-10 2007-09-04 Neose Technologies, Inc. Glycopegylation methods and proteins/peptides produced by the methods
SG159381A1 (en) * 2001-10-10 2010-03-30 Novo Nordisk As Remodeling and glycoconjugation of peptides
WO2003040211A2 (en) * 2001-11-07 2003-05-15 Nektar Therapeutics Al, Corporation Branched polymers and their conjugates
ES2911435T3 (es) 2003-02-26 2022-05-19 Nektar Therapeutics Conjugados de polímero-resto de Factor VIII
US20050176108A1 (en) 2003-03-13 2005-08-11 Young-Min Kim Physiologically active polypeptide conjugate having prolonged in vivo half-life
SI1620118T1 (sl) 2003-04-08 2014-11-28 Yeda Research And Development Co., Ltd. Reverzibilna pegilirana zdravila
EP1673453A2 (en) 2003-10-07 2006-06-28 Novo Nordisk Health Care AG Hybrid molecules having factor vii/viia activity
CA2549011A1 (en) 2003-12-10 2005-06-30 Nektar Therapeutics Al, Corporation Compositions comprising two different populations of polymer-active agent conjugates
DK1835938T3 (da) 2004-12-27 2013-11-04 Baxter Int Polymer-von Willebrand-faktor-konjugater
US7645860B2 (en) 2006-03-31 2010-01-12 Baxter Healthcare S.A. Factor VIII polymer conjugates
WO2007126808A1 (en) 2006-03-31 2007-11-08 Baxter International Inc Pegylated factor viii
JP5570809B2 (ja) 2006-09-01 2014-08-13 ノボ ノルディスク ヘルス ケア アーゲー 修飾タンパク質
BRPI0720282B8 (pt) 2006-12-15 2021-05-25 Baxalta GmbH construção proteica, composição farmacêutica, e, kit

Also Published As

Publication number Publication date
AU2007245190A1 (en) 2007-11-08
US20070244301A1 (en) 2007-10-18
NZ572050A (en) 2011-09-30
US8053561B2 (en) 2011-11-08
AU2007245190B2 (en) 2011-07-21
EP2010222A1 (en) 2009-01-07
JP2009532351A (ja) 2009-09-10
MX2008012600A (es) 2008-12-12
BRPI0708832A2 (pt) 2011-06-14
CA2647314A1 (en) 2007-11-08
NO20084608L (no) 2008-12-30
WO2007126808A1 (en) 2007-11-08
US7683158B2 (en) 2010-03-23
US20100168391A1 (en) 2010-07-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR20080108147A (ko) 페질화된 인자 ｖｉｉｉ
KR101879838B1 (ko) 인자 ⅷ 중합체 접합체
EP1835938B1 (en) Polymer-von willebrand factor-conjugates
JP5702066B2 (ja) 解離可能な連結を有するフォンウィルブランド因子および第ｖｉｉｉ因子のポリマー共役体
KR102068133B1 (ko) 혈액 응고 단백질 복합체
US8859731B2 (en) Selective modification of proteins
CN101415445A (zh) 聚乙二醇化的因子ⅷ
JP2015155469A (ja) 第ｆｖｉｉｉ因子ポリマー結合体
JP2018115170A (ja) 第ｆｖｉｉｉ因子ポリマー結合体

Legal Events

Date Code Title Description
WITN Application deemed withdrawn, e.g. because no request for examination was filed or no examination fee was paid