JP5665733B2 - 高度にグリコシル化されたヒト凝固第ix因子 - Google Patents
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Description
Y1、S3、G4、F9、V10、Q11、G12、R16、K22、R29、T35、R37、T39、F41、W42、Q44、V46、D47、G48、D49、Q50、E52、S53、N54、L57、N58、G59、S61、K63、D65、I66、N67、S68、Y69、E70、W72、P74(F77)G79、K80、N81、E83、L84、D85、V86、T87、N89、I90、K91、N92、R94、K100、N101、S102、A103、D104、N105、K106、V108、S110、E113、G114、R116、E119、N120、Q121、K122、S123、E125、P126、V128、P129、F130、R134、V135、S136、S138、Q139、T140、S141、K142、A146、E147、A148、V149、F150、P151、D152、V153、D154、Y155、V156、S158、T159、E160、A161、E162、T163、I164、L165、D166、I168、T169、Q170、S171、T172、Q173、S174、F175、N176、D177、F178、T179、R180、G183、E185、D186、K188、P189、K201、V202、D203、E213、E224、T225、G226、K228、E239(E240)T241、H243、K247、N249、I251、R252、I253、P255、H257、N258、N260、A261、A262、I263、N264、K265、A266、D276、E277、P278、V280、N282、S283、Y284、D292、K293、E294、N297、I298、K301、F302、G303、S304、Y306、R312、F314、H315、K316、G317、R318、S319、L321、V322、Y325、R327、P329、L330、D332、R333、A334、T335、L337、R338、K341、F342、T343、Y345、N346、H354、E355、G357、R358、Q362、E372、E374、G375、E388、M391、K392、G393、K394、R403、N406、K409、E410、K411及びK413。
Y1N、S3N+K5S/T、G4N+L6S/T、F9N+Q11S/T、V10N+G12S/T、G12N+L14S/T、R16N+C18S/T、K22N、R29N+V31S/T、T35N+R37S/T、R37N、T39N+F41S/T、F41N+K43S/T、W42N+Q44S/T、Q44N+V46S/T、V46N+G48S/T、D47N+D49S/T、G48N+Q50S/T、D49N+C51S/T、Q50N+E52S/T、E52N+N54T、S53N+P55S/T、C56S/T、L57N+G59S/T、G60S/T、S61N+K63S/T、K63N+D65S/T、D65N+N67S/T、I66N+S68S/T、Y69S/T、Y69N+C71S/T、S68N+E70S/T、E70N+W72S/T、W72N+P74S/T、P74N+G76S/T、F77N+G79S/T、G79N+N81S/T、K80N+C82S/T、E83S/T、E83N+D85S/T、L84N+V86S/T、D85N、V86N+C88S/T、T87N+N89S/T、I90N+N92S/T、K91S/T、I90N+N92S/T、K91N+G93S/T、R94S/T、R94N+E96S/T、K100N、A103S/T、S102N+D104S/T、A103N+N105S/T、D104N+K106S/T、V107S/T、K106N+V108S/T、V108N+V110S/T、S110N、E113N+Y115S/T、G114N+R116S/T、R116N+A118S/T、E119N+Q121S/T、K122S/T、Q121N+S123S/T、K122N+C124S/T、S123N+E125S/T、E125N+A125S/T、P126N+V128S/T、V128N+F130S/T、P129N+P131S/T、F130N+C132S/T、R134N、V135N+V137S/T、S136N、S138N、Q139N、T140N+L142S/T、S141N+L143S/T、K142N、A146N+A148S/T、E147N+V149S/T、A148N+F150S/T、V149N+P515S/T、F150N+D152S/T、P151N+V153S/T、D152N+D154S/T、V153N+Y155S/T、D154N+V156S/T、Y155N+N157S/T、V156N、S158N+E160S/T、T159N+A161S/T、E160N+E162S/T、A161N、E162N+I164S/T、T163N+L165S/T、I164N+D166S/T、L165N+N167S/T、D166N+I168S/T、I168N+Q170S/T、T169N、Q170N、S171N+Q173S/T、T172N、Q173N+F175S/T、S174N+N176S/T、F175N+D177S/T、F178S/T、D177N、F178N+R180S/T、T179N+V181S/T、R180N+V182S/T、G183+E185S/T、E185N+A187S/T、D186N+K188S/T、K188N+G190S/T、P189N+Q181S/T、K201N+D203S/T、V202N+A204S/T、D203N+F205S/T、E213N+W215S/T、E224N+G226S/T、T225N+V227S/T、G226N+K228S/T、K228N、E239N、E240N+E242S/T、T241N+H243S/T、H243N+E245S/T、K247N+N249S/T、I251S/T、I251N+I253S/T、R252N+I254S/T、I253N+P255S/T、P255N+H257S/T、H257N+Y259S/T、N260S/T、A262S/T、A261N+I263S/T、A262N+N264S/T、I263N+K265S/T、K265N+N267S/T、A266N+H268S/T、D276N+P278S/T、P278N+V280S/T、E277N+L279S/T、V280N+N282S/T、Y284S/T、S283N+V285S/T、Y284N、D292N+K294S/T、K293N+Y295S/T、E294N、F299S/T、I298N+L300S/T、K301N+G303S/T、F302N、G303N+G305S/T、S304N+Y306S/T、Y306N+S308S/T、R312N+F314S/T、F314N+K316S/T、H315N+G317S/T、K316N+R138S/T、G317N、R318N+A320S/T、S319N+L321S/T、L321N+L323S/T、V322N+Q324S/T、Y325N+R327S/T、R327N+P329S/T、P329N+V331S/T、L330N+D332S/T、D332N+A334S/T、R333N、A334N+C336S/T、T335N+L337S/T、L337N、R338N、K341N、F342N+I344S/T、T343N+Y345S/T、Y345N+N347S/T、M348S/T、H354N+G356S/T、E355N+G357S/T、G357N+D359S/T、R358N、Q362N+D364S/T、E372N+E374S/T、E374N、G375N、E388N+A390S/T、M391N+G393S/T、K392N+K394S/T、G393N+Y395S/T、K394N+G396S/T、R403N+V405S/T、I408S/T、K409N+K411S/T、E410N、K411N+K413S/T及びK413N。
Y1、S3、G4、F9、V10、Q11、K22、R37、Q44、V46、D47、G48、Q50、E52、S53、N54、L57、G59、S61、I66、N67、S68、E70、W72、P74、K80、L84、T87、N89、I90、K91、R94、K100、N101、S102、A103、D104、N105、K106、V108、E113、R116、E119、N120、Q121、S123、E125、P129、S138、T140、S141、K142、A146、E147、A148、V149、F150、P151、D152、V153、D154、Y155、V156、S158、T159、E160、A161、E162、T163、I164、L165、D166、I168、T169、Q170、S171、T172、Q173、S174、F175、N176、D177、F178、T179、R180、G183、E185、D186、K188、P189、K201、V202、D203、E224、T225、G226、K228、E239、E240、T241、H243、K247、N249、R252、P255、H257、N260、A261、A262、I263、K265、E277、V280、D292、K293、E294、K301、G303、F314、K316、R318、L321、R327、D332、R333、R338、K341、F342、T343、H354、E355、G357、E372、E374、G375、M391、K392、G393、N406、E410及びK413。
Y1N、S3N+K5S/T、G4N+L6S/T、F9N+Q11S/T、V10N+G12S/T、K22N、R37N、Q44N+V46S/T、V46N+G48S/T、D47N+D49S/T、G48N+Q50S/T、Q50N+E52S/T、E52N+N54T、S53N+P55S/T、C56S/T、L57N+G59S/T、S61N+K63S/T、I66N+S68S/T、Y69S/T、S68N+E70S/T、E70N+W72S/T、W72N+P74S/T、P74N+G76S/T、K80N+C82S/T、L84N+V86S/T、T87N+N89S/T、K91S/T、I90N+N92S/T、K91N+G93S/T、R94N+E96S/T、K100N、A103S/T、S102N+D104S/T、A103N+N105S/T、D104N+K106S/T、V107S/T、K106N+V108S/T、V108N+V110S/T、E113N+Y115S/T、R116N+A118S/T、E119N+Q121S/T、K122S/T、Q121N+S123S/T、S123N+E125S/T、E125N+A125S/T、P129N+P131S/T、S138N、T140N+L142S/T、S141N+L143S/T、K142N、A146N+A148S/T、E147N+V149S/T、A148N+F150S/T、V149N+P515S/T、F150N+D152S/T、P151N+V153S/T、D152N+D154S/T、V153N+Y155S/T、D154N+V156S/T、Y155N+N157S/T、V156N、S158N+E160S/T、T159N+A161S/T、E160N+E162S/T、A161N、E162N+I164S/T、T163N+L165S/T、I164N+D166S/T、L165N+N167S/T、D166N+I168S/T、I168N+Q170S/T、T169N、Q170N、S171N+Q173S/T、T172N、Q173N+F175S/T、S174N+N176S/T、F175N+D177S/T、F178S/T、D177N、F178N+R180S/T、T179N+V181S/T、R180N+V182S/T、G183+E185S/T、E185N+A187S/T、D186N+K188S/T、K188N+G190S/T、P189N+Q181S/T、K201N+D203S/T、V202N+A204S/T、D203N+F205S/T、E224N+G226S/T、T225N+V227S/T、G226N+K228S/T、K228N、E239N、E240N+E242S/T、T241N+H243S/T、H243N+E245S/T、K247N+N249S/T、I251S/T、R252N+I254S/T、P255N+H257S/T、H257N+Y249S/T、A262S/T、A261N+I263S/T、A262N+N264S/T、I263N+K265S/T、K265N+N267S/T、E277N+L279S/T、V280N+N282S/T、D292N+K294S/T、K293N+Y295S/T、E294N、K301N+G303S/T、G303N+G305S/T、F314N+K316S/T、K316N+R138S/T、R318N+A320S/T、L321N+L323S/T、R327N+P329S/T、D332N+A334S/T、R333N、R338N、K341N、F342N+I344S/T、T343N+Y345S/T、H354N+G356S/T、E355N+G357S/T、G357N+D359S/T、E372N+E374S/T、E374N、G375N、M391N+G393S/T、K392N+K394S/T、G393N+Y395S/T、I408S/T、E410N及びK413N。
Y1、K22、R37、N54、N58、N67、N81、D85、N89、N92、K100、N101、N105、S110、N120、R134、S136、S138、Q139、K142、V156、A161、T169、Q170、T172、N176、D177、K228、E239、N249、N258、N260、N282、Y284、E294、N297、F302、G317、R333、L337、R338、K341、N346、R358、E374、G375、N406、E410及びK413。
Y1N、K22N、R37N、C56S/T、G60S/T、Y69S/T、E83S/T、D85N、K91S/T、R94S/T、K100N、A103S/T、V107S/T、S110N、K122S/T、R134N、S136N、S138N、Q139N、K142N、V156N、A161N、T169N、Q170N、T172N、F178S/T、D177N、K228N、E239N、I251S/T、N260S/T、A262S/T、Y284S/T、Y284N、E294N、F299S/T、F302N、G317N、R333N、L337N、R338N、K341N、M348S/T、G358N、E374N、G375N、I408S/T、E410N及びK413N。
T172N、K228N、I251T及びA262T。
T172、K228、N249及びN260。
(a)ヒト 第IX因子をコード化しているDNAに一つ以上のN−X−S/Tモチーフを組み込むヒト第IX因子の部位特異的変異誘発;
(b)合成された核構造物の産生細胞へのトランスフェクション;及び
(c)トランスフェクションされた産生細胞の培地からのポリペプチド類似体の精製。
一実施態様において、医薬製剤は、事前に溶解することなく使用可能な状態の乾燥製剤(例えば冷凍乾燥又はスプレー乾燥)である。
液状医薬組成物の貯蔵の間のポリペプチドによる凝集体形成は、そのポリペプチドの生物学的活性度に悪影響を与え、医薬組成物の治療有効性の損失を生じ得る。さらにまた、ポリペプチドを含む医薬組成物が注入システムを使用して投与される場合、凝集体形成によって管、膜又はポンプの閉塞など、他の問題が生じ得る。
医薬組成物は、その中の治療的活性ポリペプチドの安定性を増強するさらなる安定化剤を含んでもよい。本発明の特に興味深い安定化剤は、ポリペプチドをメチオニン酸化から保護するメチオニン及びEDTA、及びポリペプチドを凍結融解又は機械的分断と関連する凝集から保護する非イオン性界面活性剤を含むが、これに限定されるものではない。
野生型ヒト第IX因子に存在しないN−グリコシル化部位を有する高度にグリコシル化されたヒト凝固第IX因子をコード化する発現構築物の生成
高度にグリコシル化されたヒト凝固第IX因子をコード化する構築物は、野生型ヒト凝固第IX因子をコード化するインサートを有するpTT5からなるpTS87の部位特異的突然変異誘発によって作製された。したがって、pTS87は、アミノ酸残基157及び167において、N−グリコシル化部位を有するヒト凝固第IX因子をコード化する。表1に示されるフォワード及びリバースプライマーペアを使用して、製造業者によって推奨されるように、pTS87はQuikChange Site−Directed Mutagenesisキット(Stratagene)で突然変異された。突然変異誘発手法によって作製されるプラスミドは、コンピテント大腸菌及びDNA塩基配列決定によって変異のスクリーニングが行われた選択されたクローンからのプラスミドに形質転換された。このように、それぞれ野生型ヒト凝固第IX因子に存在しないN−グリコシル化部位を有するヒト凝固第IX因子をコード化する、表2に記載される構築物pGB071、pGB072、pGB073、pGB074及びpGB075が確立された。
変異によって誘導される突然変異誘発プライマー(変異したヌクレオチドは下線を引かれている)及びアミノ酸変異
野生型ヒト凝固第IX因子と関連するアミノ酸変異及び野生型又は構築物によってコード化される高度にグリコシル化されたヒト凝固第IX因子の潜在的N−グリコシル化部位
野生型ヒト第IX因子に存在しないN−グリコシル化部位を有する高度にグリコシル化されたヒト凝固第IX因子の哺乳動物HEK293細胞における一過性発現
懸濁液に適合したヒト胚性腎臓(HEK293F)細胞(Freestyle、Invitrogen)は、製造業者の説明書によって、野生型ヒト凝固第IX因子をコード化するpTS87発現プラスミド、又は高度にグリコシル化されたヒト凝固第IX因子をコード化するpGB071、pGB072、pGB073、pGB074及びpGB075構築物でトランスフェクションされた。簡潔には、それぞれのプラスミド30μgは、40μlの293フェクチン(Invitrogen)で20分間インキューベートされ、ビタミンKを補充した無血清Freestyle293発現培地で、125mlのエーレンマイヤーフラスコ中で3×107の細胞に添加された。トランスフェクション細胞は、振盪培養器においてインキューベートされた(37℃、8%CO2及び125rpm)。トランスフェクションの4日後に、細胞は沈澱され、無血清培地は採取された。細胞は、ウシ胎仔血清及びビタミンKを補充されたulbeccoのMEM(Invitrogen)中に再懸濁され、振盪培養器においてインキューベートされた。その翌日、細胞は沈澱され、血清を含む培地は採取された。
野生型及び一過性にトランスフェクションされたHEK293細胞からの培地において高度にグリコシル化されたヒト凝固第IX因子の特性
野生型ヒト第IX因子に存在しない複数のN−グリコシル化部位を有する高度にグリコシル化されたヒト凝固第IX因子をコード化する発現構築物の生成
高度にグリコシル化されたヒト凝固第IX因子をコード化する構築物は、野生型ヒト凝固第IX因子をコード化するインサートを有するpTT5からなるpTS87の部位特異的突然変異誘発によって作製された。したがって、pTS87はアミノ酸残基157及び167でN−グリコシル化部位を有するヒト凝固第IX因子をコード化する。表4に示されるプライマーを使用して、製造業者によって推奨されるように、pTS87はQuikChange Multi Site−Directed Mutagenesisキット(Stratagene)で突然変異させた。突然変異誘発手法によって作製されたプラスミドは、コンピテント大腸菌及びDNA塩基配列決定によって変異のスクリーニングが行われた選択されたクローンからのプラスミドに形質転換された。それぞれ野生型ヒト凝固第IX因子に存在しない少なくとも2つのN−グリコシル化部位を有するヒト凝固第IX因子をコード化する、表5に記載される構築物pGB019、pGB020、pGB021及びpGB022が確立された。
変異によって誘導される突然変異誘発プライマー(変異したヌクレオチドは下線が引かれている)及びアミノ酸変異
野生型ヒト凝固第IX因子と関連するアミノ酸変異、及び構築物によりコード化される野生型又は高度にグリコシル化されたヒト凝固第IX因子における潜在的N−グリコシル化部位
野生型ヒト第IX因子に存在しない複数のN−グリコシル化部位を有する高度にグリコシル化されたヒト凝固第IX因子の哺乳動物HEK293細胞における一過性発現
懸濁液に適合したヒト胚性腎臓(HEK293F)細胞(Freestyle、Invitrogen)は、製造業者の説明書によって、野生型ヒト凝固第IX因子をコード化するpTS87発現プラスミド又は高度にグリコシル化されたヒト凝固第IX因子をコード化するpGB022構築物でトランスフェクションされた。簡潔には、それぞれのプラスミド30μgは、40μlの293フェクチン(Invitrogen)で20分間インキューベートされ、ビタミンKを補充した無血清Freestyle293発現培地で、125mlのエーレンマイヤーフラスコ中で3×107の細胞に添加された。トランスフェクション細胞は、振盪培養器においてインキューベートされた(37℃、8%CO2及び125rpm)。トランスフェクションの4日後に採取された培地は、ペプチド:N−グリコシダーゼF(PNGase F)存在下又は非存在下において、37℃で1時間インキューベートされ、SDS−PAGEゲル上にロードされ、電気泳動にかけられた。電気泳動後、ゲル中のタンパク質は、エレクトロブロッティングによってPVDF膜に転写された。膜上の凝固第IX因子は、ウサギ抗FIX抗体及びHRP接合ブタ抗ウサギIgG抗体(DAKO)との膜の経時的なインキュベーションに続くECL Western Blotting Detection Reagent(Amersham Biosciences)とのインキュベーションによって視覚化された。解読は、Las−1000 Luminescentイメージアナライザー(Fujifilm)を用いて実行され、図3に示される。pGB022でトランスフェクションされた細胞によって分泌される凝固第IX因子の電気泳動移動度は、pTS87でトランスフェクションされた細胞によって分泌される野生型凝固第IX因子と比較して減少していた。PNGaseFはN結合型グリカンを取り除き、NGaseF処理された変異及び野生型凝固第IX因子タンパク質の移動性は、PNGaseF処理前の2つのタンパク質の異なる電気泳動移動度がN−グリカンに関連していることを証明している。したがって、高度にグリコシル化されたヒト凝固第IX因子は、pGB022でトランスフェクションされた細胞によって製造された。
哺乳動物HEK293細胞において一過性に発現された、野生型ヒト第IX因子に存在しない複数のN−グリコシル化部位を有する高度にグリコシル化されたヒト凝固第IX因子の凝血塊活性の決定
懸濁液に適合したヒト胚性腎臓(HEK293F)細胞(Freestyle、Invitrogen)は、製造業者の説明書によって、野生型ヒト凝固第IX因子をコード化するpTS87発現プラスミド又は高度にグリコシル化されたヒト凝固第IX因子をコード化するpGB022構築物でトランスフェクションされた。簡潔には、それぞれのプラスミド30μgは、40μlの293フェクチン(Invitrogen)で20分間インキューベートされ、ビタミンKを補充した無血清Freestyle 293 Expression Medium(Invitrogen)で、125mlのエーレンマイヤーフラスコ中で3×107の細胞に添加された。トランスフェクション細胞は、振盪培養器においてインキューベートされた(37℃、8%CO2及び125rpm)。トランスフェクションの2日間後に、培地はウシ胎仔血清及びビタミンKを補充されたDulbeccoのMEM(Invitrogen)で置換された。培養はさらに2日間振盪培養器においてインキューベートされ、培地は採取された。培地は、同じ製造業者からの試薬を使用して、ACL 9000 clotting instrument(Instrumentation Laboratory)での活性化部分トロンボプラスチン時間(APTT)アッセイにより、凝固第IX因子活性について解析された。培地は酵素結合抗体免疫吸着アッセイにより凝固第IX因子抗原含有量についても解析され、培地における凝固第IX因子タンパク質の比活性は表6に示すようにELISA及び凝血塊アッセイのデータを組み合わせることによって算出された。pGB022によってコード化される位置172、228、249及び260の追加のN−グリコシル化部位を有する高度にグリコシル化された凝固第IX因子変異体の比活性は、野生型ヒト凝固第IX因子の比活性と比較して、適度に減少していた。したがって、選択されたアミノ酸位における4つまでの追加のN−グリカンの存在は、ヒト凝固第IX因子の凝血塊活性に対して特に有害ではない。
それぞれ、pTS87及びpGB022で一過性にトランスフェクションされた細胞からの培地における野生型及び高度にグリコシル化されたヒト凝固第IX因子の特性
高度にグリコシル化されたヒト凝固第IX因子を発現する安定した哺乳動物細胞株の作成
チャイニーズハムスター卵巣(CHO−K1)細胞は、FuGENE 6 Transfection Reagent(Roche)を使用して、ネオマイシン耐性遺伝子を含むpSV2−neo及び高度にグリコシル化されたFIX−T172N−K228N−I251T−A262T変異体をコード化しているpGB024で同時形質導入された。トランスフェクション細胞は、600μg/mlG418で選択され、限界希釈によってクローニングされた。耐性クローンは、ELISAによって凝固第IX因子抗原について細胞培養上清を試験することによってスクリーニングされ、凝固第IX因子を産生する12の細胞株が増殖した。12のクローンの組織培養フラスコからの培地は、同じ製造業者からの試薬を使用して、ELISAにより凝固第IX因子抗原について、及びACL 9000 clotting instrument(Instrumentation Laboratory)での活性化部分トロンボプラスチン時間(APTT)アッセイにより凝固第IX因子活性について解析された。培地中の凝固第IX因子タンパク質の比活性は、表7に示すように、ELISA及び凝血塊アッセイのデータを組み合わせることによって算出された。クローン15はローラー・ボトルに播種され、高度にグリコシル化されたFIX−T172N−K228N−I251T−A262T変異体はローラー・ボトルから採取された培地から精製された。
pGB024でトランスフェクションされたCHO−K1細胞株からの培地の高度にグリコシル化されたヒト凝固第IX因子の特性
高度にグリコシル化されたヒト凝固第IX因子の薬物動態学的特性についての野生型ヒト凝固第IX因子との比較
高度にグリコシル化されたヒト凝固第IX因子(FIX−T172N−K228N−I251T−A262T)及びヒト野生型凝固第IX因子(BeneFIX(登録商標)、Wyeth)は、10mMヒスチジン、0.26Mグリシン、1%スクロース、0.005Tween80、pH 6.8で、0.2mg/ml(FIX−T172N−K228N−I251T−A262T)又は0.4mg/ml(野生型凝固第IX因子)の濃度まで希釈された。それぞれの化合物は、15匹の凝固第IX因子ノックアウト・マウスの尾静脈から、1.0mg/kg(FIX−T172N−K228N−I251T−A262T)又は1.5mg/kg(野生型凝固第IX因子)の用量で投与された。投与後の様々な時点において、3匹のマウスは麻酔され、血液は眼窩静脈叢からサンプリングされた。3つの血液サンプルはそれぞれのマウスから採取され、3回目の血液サンプリング後、マウスは頚椎脱臼によって安楽死した。血液サンプルは、クエン酸ナトリウムで安定化され、50mMHEPES、150nMNaCl、0.5%ウシ血清アルブミン、pH 7.4で5回希釈された。安定化及び希釈された血液は、ペレット血液細胞となるまで遠心分離された。得られた血漿試料は、化合物特異的な標準曲線を用いたELISAにより、FIX抗原について解析された。平均FIX抗原濃度対時間が図4に示される。推定の薬物動態学的パラメーターは、表8に記載される。データは、野生型凝固第IX因子と比較して、高度にグリコシル化されたFIX−T172N−K228N−I251T−A262T変異体のインビボ半減期の延長及び減少したクリアランスを示す。
ELISAにより測定された凝固第IX因子ノックアウト・マウスの薬物動態学的パラメーター
1. 一つ以上の変異を有しているヒト第IX因子ポリペプチド類似体であって、前記変異がポリペプチドに一つ以上のグリコシル化部位の導入を生じている、ヒト第IX因子ポリペプチド類似体。
2. 前記グリコシル化がN−グリコシル化を含む、1項に記載されるポリペプチド。
3. 野生型ポリペプチドと比較して、一つ以上の変異が第IX因子ポリペプチド類似体の分子量の増加を生じさせる、1項に記載のポリペプチド。
4. 野生型ポリペプチドと比較して、一つ以上の変異が第IX因子ポリペプチド類似体のより酸性の等電点をもたらす、1項に記載されるポリペプチド。
5. 野生型ポリペプチドと比較して、一つ以上の変異が第IX因子ポリペプチド類似体のタンパク分解性活性及び/又は凝血塊活性の0、1、2、5、10、20、50又は100倍の減少を生じさせる、1項に記載されるポリペプチド。
6. 野生型ポリペプチドと比較して、一つ以上の変異が第IX因子ポリペプチド類似体のタンパク分解性活性及び/又は凝血塊活性の0倍の減少を生じさせる、1項に記載されるポリペプチド。
7. 前記一つ以上変異が一つ以上のN−X−S/Tモチーフの組み込みを含む、1項又は2項に記載のポリペプチド。
8. 一つ以上のN−X−S/Tモチーフが、「N」残基となることが目的とされる前記残基が25%以上又は50%以上の相対側鎖表面接触性を有する位置で確立される、7項に記載されるポリペプチド。
9. 前記一つ以上変異が以下の一つ以上から選択される8項に記載されるポリペプチド:Y1N、S3N+K5S/T、G4N+L6S/T、F9N+Q11S/T、V10N+G12S/T、G12N+L14S/T、R16N+C18S/T、K22N、R29N+V31S/T、T35N+R37S/T、R37N、T39N+F41S/T、F41N+K43S/T、W42N+Q44S/T、Q44N+V46S/T、V46N+G48S/T、D47N+D49S/T、G48N+Q50S/T、D49N+C51S/T、Q50N+E52S/T、E52N+N54T、S53N+P55S/T、C56S/T、L57N+G59S/T、G60S/T、S61N+K63S/T、K63N+D65S/T、D65N+N67S/T、I66N+S68S/T、Y69S/T、Y69N+C71S/T、S68N+E70S/T、E70N+W72S/T、W72N+P74S/T、P74N+G76S/T、F77N+G79S/T、G79N+N81S/T、K80N+C82S/T、E83S/T、E83N+D85S/T、L84N+V86S/T、D85N、V86N+C88S/T、T87N+N89S/T、I90N+N92S/T、K91S/T、I90N+N92S/T、K91N+G93S/T、R94S/T、R94N+E96S/T、K100N、A103S/T、S102N+D104S/T、A103N+N105S/T、D104N+K106S/T、V107S/T、K106N+V108S/T、V108N+V110S/T、S110N、E113N+Y115S/T、G114N+R116S/T、R116N+A118S/T、E119N+Q121S/T、K122S/T、Q121N+S123S/T、K122N+C124S/T S123N+E125S/T、E125N+A125S/T、P126N+V128S/T、V128N+F130S/T、P129N+P131S/T、F130N+C132S/T、R134N、V135N+V137S/T、S136N、S138N、Q139N、T140N+L142S/T、S141N+L143S/T、K142N、A146N+A148S/T、E147N+V149S/T、A148N+F150S/T、V149N+P515S/T、F150N+D152S/T、P151N+V153S/T、D152N+D154S/T、V153N+Y155S/T、D154N+V156S/T、Y155N+N157S/T、V156N、S158N+E160S/T、T159N+A161S/T、E160N+E162S/T、A161N、E162N+I164S/T、T163N+L165S/T、I164N+D166S/T、L165N+N167S/T、D166N+I168S/T、I168N+Q170S/T、T169N、Q170N、S171N+Q173S/T、T172N、Q173N+F175S/T、S174N+N176S/T、F175N+D177S/T、F178S/T、D177N、F178N+R180S/T、T179N+V181S/T、R180N+V182S/T、G183+E185S/T、E185N+A187S/T、D186N+K188S/T、K188N+G190S/T、P189N+Q181S/T、K201N+D203S/T、V202N+A204S/T、D203N+F205S/T、E213N+W215S/T、E224N+G226S/T、T225N+V227S/T、G226N+K228S/T、K228N、E239N、E240N+E242S/T、T241N+H243S/T、H243N+E245S/T、K247N+N249S/T、I251S/T、I251N+I253S/T、R252N+I254S/T、I253N+P255S/T、P255N+H257S/T、H257N+Y259S/T、N260S/T、A262S/T、A261N+I263S/T、A262N+N264S/T、I263N+K265S/T、K265N+N267S/T、A266N+H268S/T、D276N+P278S/T、P278N+V280S/T、E277N+L279S/T、V280N+N282S/T、Y284S/T、S283N+V285S/T、Y284N、D292N+K294S/T、K293N+Y295S/T、E294N、F299S/T、I298N+L300S/T、K301N+G303S/T、F302N、G303N+G305S/T、S304N+Y306S/T、Y306N+S308S/T、R312N+F314S/T、F314N+K316S/T、H315N+G317S/T、K316N+R138S/T、G317N、R318N+A320S/T、S319N+L321S/T、L321N+L323S/T、V322N+Q324S/T、Y325N+R327S/T、R327N+P329S/T、P329N+V331S/T、L330N+D332S/T、D332N+A334S/T、R333N、A334N+C336S/T、T335N+L337S/T、L337N、R338N、K341N、F342N+I344S/T、T343N+Y345S/T、Y345N+N347S/T、M348S/T、H354N+G356S/T、E355N+G357S/T、G357N+D359S/T、R358N、Q362N+D364S/T、E372N+E374S/T、E374N、G375N、E388N+A390S/T、M391N+G393S/T、K392N+K394S/T、G393N+Y395S/T、K394N+G396S/T、R403N+V405S/T、I408S/T、K409N+K411S/T、E410N、K411N+K413S/T及びK413N。
10. 一つ以上のN−X−S/Tモチーフが、「N」残基とすることが目的とされる前記残基が50%以上の相対側鎖表面接触性を有する位置で確立される、7項に記載されるポリペプチド。
11. 前記一つ以上変異が以下の一つ以上から選択される、10項に記載のポリペプチド:Y1N、S3N+K5S/T、G4N+L6S/T、F9N+Q11S/T、V10N+G12S/T、K22N、R37N、Q44N+V46S/T、V46N+G48S/T、D47N+D49S/T、G48N+Q50S/T、Q50N+E52S/T、E52N+N54T、S53N+P55S/T、C56S/T、L57N+G59S/T、S61N+K63S/T、I66N+S68S/T、Y69S/T、S68N+E70S/T、E70N+W72S/T、W72N+P74S/T、P74N+G76S/T、K80N+C82S/T、L84N+V86S/T、T87N+N89S/T、K91S/T、I90N+N92S/T、K91N+G93S/T、R94N+E96S/T、K100N、A103S/T、S102N+D104S/T、A103N+N105S/T、D104N+K106S/T、V107S/T、K106N+V108S/T、V108N+V110S/T、E113N+Y115S/T、R116N+A118S/T、E119N+Q121S/T、K122S/T、Q121N+S123S/T、S123N+E125S/T、E125N+A125S/T、P129N+P131S/T、S138N、T140N+L142S/T、S141N+L143S/T、K142N、A146N+A148S/T、E147N+V149S/T、A148N+F150S/T、V149N+P515S/T、F150N+D152S/T、P151N+V153S/T、D152N+D154S/T、V153N+Y155S/T、D154N+V156S/T、Y155N+N157S/T、V156N、S158N+E160S/T、T159N+A161S/T、E160N+E162S/T、A161N、E162N+I164S/T、T163N+L165S/T、I164N+D166S/T、L165N+N167S/T、D166N+I168S/T、I168N+Q170S/T、T169N、Q170N、S171N+Q173S/T、T172N、Q173N+F175S/T、S174N+N176S/T、F175N+D177S/T、F178S/T、D177N、F178N+R180S/T、T179N+V181S/T、R180N+V182S/T、G183+E185S/T、E185N+A187S/T、D186N+K188S/T、K188N+G190S/T、P189N+Q181S/T、K201N+D203S/T、V202N+A204S/T、D203N+F205S/T、E224N+G226S/T、T225N+V227S/T、G226N+K228S/T、K228N、E239N、E240N+E242S/T、T241N+H243S/T、H243N+E245S/T、K247N+N249S/T、I251S/T、R252N+I254S/T、P255N+H257S/T、H257N+Y249S/T、A262S/T、A261N+I263S/T、A262N+N264S/T、I263N+K265S/T、K265N+N267S/T、E277N+L279S/T、V280N+N282S/T、D292N+K294S/T、K293N+Y295S/T、E294N、K301N+G303S/T、G303N+G305S/T、F314N+K316S/T、K316N+R138S/T、R318N+A320S/T、L321N+L323S/T、R327N+P329S/T、D332N+A334S/T、R333N、R338N、K341N、F342N+I344S/T、T343N+Y345S/T、H354N+G356S/T、E355N+G357S/T、G357N+D359S/T、E372N+E374S/T、E374N、G375N、M391N+G393S/T、K392N+K394S/T、G393N+Y395S/T、I408S/T、E410N及びK413N。
12. 前記一つ以上変異が以下の一つ以上から選択される、1項に記載のポリペプチド:Y1N、K22N、R37N、C56S/T、G60S/T、Y69S/T、E83S/T、D85N、K91S/T、R94S/T、K100N、A103S/T、V107S/T、S110N、K122S/T、R134N、S136N、S138N、Q139N、K142N、V156N、A161N、T169N、Q170N、T172N、F178S/T、D177N、K228N、E239N、I251S/T、N260S/T、A262S/T、Y284S/T、Y284N、E294N、F299S/T、F302N、G317N、R333N、L337N、R338N、K341N、M348S/T、G358N、E374N、G375N、I408S/T、E410N及びK413N。
13. 前記一つ以上変異が以下の一つ以上から選択される、1項に記載されるポリペプチド:T172N、K228N、I251T及びA262T。
14. 野生型ヒト第IX因子ポリペプチドと比較して、N157又はN167以外の一つ以上の位置でグリコシル化されている、グリコシル化ヒト第IX因子ポリペプチド類似体。
15. 前記ポリペプチドが以下の一つ以上から選択される一つ以上の位置でグリコシル化される、14項に記載されたポリペプチド:Y1、S3、G4、F9、V10、Q11、G12、R16、K22、R29、T35、R37、T39、F41、W42、Q44、V46、D47、G48、D49、Q50、E52、S53、N54、L57、N58、G59、S61、K63、D65、I66、N67、S68、Y69、E70、W72、P74、F77、G79、K80、N81、E83、L84、D85、V86、T87、N89、I90、K91、N92、R94、K100、N101、S102、A103、D104、N105、K106、V108、S110、E113、G114、R116、E119、N120、Q121、K122、S123、E125、P126、V128、P129、F130、R134、V135、S136、S138、Q139、T140、S141、K142、A146、E147、A148、V149、F150、P151、D152、V153、D154、Y155、V156、S158、T159、E160、A161、E162、T163、I164、L165、D166、I168、T169、Q170、S171、T172、Q173、S174、F175、N176、D177、F178、T179、R180、G183、E185、D186、K188、P189、K201、V202、D203、E213、E224、T225、G226、K228、E239、E240、T241、H243、K247、N249、I251、R252、I253、P255、H257、N258、N260、A261、A262、I263、N264、K265、A266、D276、E277、P278、V280、N282、S283、Y284、D292、K293、E294、N297、I298、K301、F302、G303、S304、Y306、R312、F314、H315、K316、G317、R318、S319、L321、V322、Y325、R327、P329、L330、D332、R333、A334、T335、L337、R338、K341、F342、T343、Y345、N346、H354、E355、G357、R358、Q362、E372、E374、G375、E388、M391、K392、G393、K394、R403、N406、K409、E410、K411及びK413。
16. 前記ポリペプチドが以下の一つ以上から選択される一つ以上の位置でグリコシル化される、14項に記載されたポリペプチド:Y1、S3、G4、F9、V10、Q11、K22、R37、Q44、V46、D47、G48、Q50、E52、S53、N54、L57、G59、S61、I66、N67、S68、E70、W72、P74、K80、L84、T87、N89、I90、K91、R94、K100、N101、S102、A103、D104、N105、K106、V108、E113、R116、E119、N120、Q121、S123、E125、P129、S138、T140、S141、K142、A146、E147、A148、V149、F150、P151、D152、V153、D154、Y155、V156、S158、T159、E160、A161、E162、T163、I164、L165、D166、I168、T169、Q170、S171、T172、Q173、S174、F175、N176、D177、F178、T179、R180、G183、E185、D186、K188、P189、K201、V202、D203、E224、T225、G226、K228、E239、E240、T241、H243、K247、N249、R252、P255、H257、N260、A261、A262、I263、K265、E277、V280、D292、K293、E294、K301、G303、F314、K316、R318、L321、R327、D332、R333、R338、K341、F342、T343、H354、E355、G357、E372、E374、G375、M391、K392、G393、N406、E410及びK413。
17. 前記ポリペプチドが以下の一つ以上から選択される一つ以上の位置でグリコシル化される、14項に記載されたポリペプチド:Y1、K22、R37、N54、N58、N67、N81、D85、N89、N92、K100、N101、N105、S110、N120、R134、S136、S138、Q139、K142、V156、A161、T169、Q170、T172、N176、D177、K228、E239、N249、N258、N260、N282、Y284、E294、N297、F302、G317、R333、L337、R338、K341、N346、R358、E374、G375、N406、E410及びK413。
18. 前記ポリペプチドが以下の一つ以上から選択される一つ以上の位置でグリコシル化される、14項に記載されたポリペプチド:T172、K228、N249及びN260。
19. 高度にグリコシル化されたポリペプチドが少なくとも一つのグリカンを含む14ないし18項の何れか一項に記載されたポリペプチド。
20. 前項の何れかに記載されるポリペプチドの治療的有効量を患者に投与することを含む、血友病の治療方法。
21. 血友病の治療に用いられる、1ないし19項の何れか一項に記載のポリペプチド。
22. 血友病の治療のための医薬の製造における、1ないし19項の何れか一項に記載のポリペプチドの使用。
23. 1ないし19項の何れか一項に記載のポリペプチドを含む、血友病の治療に用いるための医薬組成物。
24. 以下のステップを含む、1ないし19項の何れか一項に記載のポリペプチド類似体を調製するための方法:
(a) ヒト第IX因子をコード化するDNAに一つ以上のN−X−S/Tモチーフを組み込むヒト第IX因子の部位特異的突然変異誘発;
(b) 合成された核構築物の産生細胞へのトランスフェクション;及び
(c) トランスフェクションされた産生細胞からのポリペプチド類似体の精製。
25. 1ないし19項の何れか一項に記載のヒト第IX因子ポリペプチド類似体をコード化する核酸構築物。
26. 25項に記載される核構築物を含む組換えベクター。
27. 26項に記載されるベクターでトランスフェクションされた細胞。
28. 真核性産生細胞である、27項に記載される細胞。
29. チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞(例えばCHO−K1)などの哺乳動物細胞又はヒト胚性腎臓(HEK)細胞(例えばHEK293F)である27又は28項に記載の細胞。
30. 1ないし19項の何れか一項に記載のポリペプチドを含む医薬製剤。
Claims (5)
- 変異T172N+K228N+I251T+A262Tを有するヒト凝固第IX因子ポリペプチド。
- 172、228、251及び262の位置でグリコシル化されている、グリコシル化ヒト第IX因子ポリペプチド。
- 血友病の治療に用いるための、請求項1又は2に記載のポリペプチド。
- 請求項1又は2に記載のポリペプチドを含む、医薬組成物。
- 請求項1又は2に記載のヒト凝固第IX因子ポリペプチドをコード化する核酸構築物。
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