JP4429105B2 - 有機物固定化構造体及びその製造方法、ペプチド及びdna - Google Patents
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Description
このような疎水的な表面上へ非特異的な吸着を低減する方法の一つとして、対象物質タンパク質を含む液と接触させる、有機物固定化基板の少なくとも流路や反応場等の部位に対しては、基板表面に親水化処理を施す手法がある。親水化処理を施されている基板表面では、表面に物理的に吸着される対象物質タンパク質は、所望の組成からなる洗浄用の水溶液を用いて、基板表面を置換し、洗浄する操作によって、比較的容易に除去することができる。基板表面に対する親水化処理方法としては、表面に酸化珪素に代表される酸化金属層を設ける方法や、シランカップリング剤に代表されるカップリング剤処理を行って、親水性に富むカップリング剤被覆層を設ける方法は、一般的に利用されている。
このような数nmオーダーの孔径が形成されている多孔体を基板とすることで、微小な領域においても、高感度の検出に十分な量の生体物質が固定化されている反応場を作製することができる。
基体の表面に有機物が固定化された構造体であって、
前記基体の表面の少なくとも一部が、酸化珪素を含む一以上の部材によって構成され、
前記有機物は、酸化珪素に対して結合能を有するアミノ酸配列からなるペプチドを少なくとも一つ含んでなる結合ドメインを介して、前記基体の表面に結合され、
前記ペプチドは、下記配列番号:1または配列番号:2
(配列番号:1)Val−Ser−Pro−Met−Arg−Ser−Ala−Thr−Thr−His−Thr−Val
(配列番号:2)Ile−Pro−Met−His−Val−His−His−Lys−His−Pro−His−Val
に示すアミノ酸配列からなる群より選択される少なくとも一つのアミノ酸配列、
前記アミノ酸配列において、1または数個のアミノ酸の欠失、置換若しくは付加がなされた改変アミノ酸配列、
あるいは、それらアミノ酸配列の繰り返し構造または複合体を含んでなるペプチドである
ことを特徴とする、有機物が固定化された構造体である。
基体の表面に有機物が固定化された構造体であって、
前記基体の表面の少なくとも一部が、酸化珪素を含む一以上の部材によって構成され、
前記有機物は、酸化珪素に対して結合能を有するアミノ酸配列からなるペプチドを少なくとも一つ含んでなる結合ドメインを介して、前記基体の表面に結合され、
前記ペプチドは、下記配列番号:1または配列番号:2
(配列番号:1)Val−Ser−Pro−Met−Arg−Ser−Ala−Thr−Thr−His−Thr−Val
(配列番号:2)Ile−Pro−Met−His−Val−His−His−Lys−His−Pro−His−Val
に示すアミノ酸配列からなる群より選択される少なくとも一つのアミノ酸配列、
前記アミノ酸配列において、1または数個のアミノ酸の欠失、置換若しくは付加がなされた改変アミノ酸配列、
あるいは、それらアミノ酸配列の繰り返し構造または複合体を含んでなるペプチドである
ことを特徴とする、有機物が固定化された構造体における、好ましい態様の一例として、下記の態様を挙げることができる。
前記基体の少なくとも一部が多孔質であることが、一般に好ましい。
基体の表面上に有機物を固定化してなる構造体の製造方法であって、
酸化珪素に対して結合能を有するアミノ酸配列からなるペプチドを少なくとも一つ以上含んでなる結合ドメインと有機物とが連結してなる、有機物−結合ドメイン融合体を調製する工程と、
前記結合ドメインの少なくとも一部を、前記表面の少なくとも一部が酸化珪素を含む一以上の部材によって構成された基体に結合させることにより、前記結合ドメインを介して、前記基体の表面に前記有機物を固定化する工程とを有し、
前記ペプチドは、下記配列番号:1または配列番号:2
(配列番号:1)Val−Ser−Pro−Met−Arg−Ser−Ala−Thr−Thr−His−Thr−Val
(配列番号:2)Ile−Pro−Met−His−Val−His−His−Lys−His−Pro−His−Val
に示すアミノ酸配列からなる群より選択される少なくとも一つのアミノ酸配列、
前記アミノ酸配列において、1または数個のアミノ酸の欠失、置換若しくは付加がなされた改変アミノ酸配列、
あるいは、それらアミノ酸配列の繰り返し構造または複合体を含んでなるペプチドである
ことを特徴とする製造方法である。
下記配列番号:1または配列番号:2
(配列番号:1)Val−Ser−Pro−Met−Arg−Ser−Ala−Thr−Thr−His−Thr−Val
(配列番号:2)Ile−Pro−Met−His−Val−His−His−Lys−His−Pro−His−Val
に示すアミノ酸配列からなる群より選択される少なくとも一つのアミノ酸配列、
前記アミノ酸配列において、1または数個のアミノ酸の欠失、置換若しくは付加がされた改変アミノ酸配列、
あるいは、それらアミノ酸配列の繰り返し構造または複合体を含んでなる
ことを特徴とする酸化珪素に親和性のペプチドである。
下記配列番号:1または配列番号:2
(配列番号:1)Val−Ser−Pro−Met−Arg−Ser−Ala−Thr−Thr−His−Thr−Val
(配列番号:2)Ile−Pro−Met−His−Val−His−His−Lys−His−Pro−His−Val
に示すアミノ酸配列からなる群より選択される少なくとも一つのアミノ酸配列、
前記アミノ酸配列において、1または数個のアミノ酸の欠失、置換若しくは付加がされた改変アミノ酸配列、
あるいは、それらアミノ酸配列の繰り返し構造または複合体を含んでなる酸化珪素に親和性のペプチド鎖をコードする塩基配列を含む
ことを特徴とする酸化珪素親和性ペプチドをコードするDNAである。
下記配列番号:1または配列番号:2
(配列番号:1)Val−Ser−Pro−Met−Arg−Ser−Ala−Thr−Thr−His−Thr−Val
(配列番号:2)Ile−Pro−Met−His−Val−His−His−Lys−His−Pro−His−Val
に示すアミノ酸配列からなる群より選択される少なくとも一つのアミノ酸配列、
前記アミノ酸配列において、1または数個のアミノ酸の欠失、置換若しくは付加がなされた改変アミノ酸配列、
あるいは、それらアミノ酸配列の繰り返し構造または複合体を含んでなる酸化珪素に親和性のペプチド鎖をコードするDNAを含むベクターである。
検体中の標的物質を検出するための装置であって、
上述の構成を有する本発明にかかる、基体の表面に有機物が固定化された構造体と検体とを接触させることにより、前記有機物と前記標的物質とを結合させるための手段と、
前記結合された標的物質を検出するための手段とを有する
ことを特徴とする検出装置である。
検体中の標的物質を検出する方法であって、
上述の構成を有する本発明にかかる、基体の表面に有機物が固定化された構造体と検体とを接触させることにより、前記有機物と前記標的物質とを結合させる工程と、
前記結合された標的物質を検出する工程とを有する
ことを特徴とする検出方法である。
基体の表面上に有機物を固定化してなる構造体であって、
前記基体表面の少なくとも一部は、酸化珪素を含む一以上の部材によって構成される面であり、
前記基体表面への有機物の固定化は、該有機物に連結される、少なくとも一以上のアミノ酸からなるペプチドを含んでなる結合ドメインを介して、基体表面に対して、該結合ドメインの少なくとも一部が結合することによってなされている
ことを特徴とする、有機物固定化構造体の形態とすることができる。
前記結合ドメインに含まれるペプチドは、
前記酸化珪素を含む一以上の部材中の酸化珪素に対して結合能を有するアミノ酸配列を含んでなるペプチドであることが好ましい。
下記配列番号:1、配列番号:2
Val−Ser−Pro−Met−Arg−Ser−Ala−Thr−Thr−His−Thr−Val (配列番号:1)
Ile−Pro−Met−His−Val−His−His−Lys−His−Pro−His−Val (配列番号:2)
に示すアミノ酸配列からなる群より選択される、少なくとも一つのアミノ酸配列の全部、またはその一部を含むアミノ酸配列を含んでなるペプチドであることがより好ましい。
前記結合ドメイン中の前記酸化珪素に対して結合能を有するアミノ酸配列を含んでなるペプチドと前記生体物質の間には、一以上のアミノ酸からなるリンカーが含まれていてもよい。
基体の表面上に有機物を固定化してなる構造体であって、
前記基体表面の少なくとも一部は、酸化珪素を含む一以上の部材によって構成される面であり、
前記基体表面への有機物の固定化は、該有機物に連結される、少なくとも一以上のアミノ酸からなるペプチドを含んでなる結合ドメインを介して、基体表面に対して、該結合ドメインの少なくとも一部が結合することによってなされている、有機物固定化構造体を製造する方法であって、
(1)前記結合ドメインを該有機物に連結してなる構成の有機物−結合ドメイン融合体を作製する工程、及び
(2)前記有機物−結合ドメイン融合体を前記基体の表面に接触させ、該有機物−結合ドメイン融合体中に含まれる結合ドメインの少なくとも一部を、前記基体表面に結合させて、前記結合ドメインを介して、基体の表面に前記有機物の固定化を行う工程を含む
ことを特徴とする、有機物固定化構造体の製造方法の形態とすることができる。
前記有機物が、タンパク質を含んでなる生体物質である場合、
前記(1)有機物−結合ドメイン融合体を作製する工程は、
(1−1)前記生体物質に含まれるタンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列と、
前記結合ドメインに含まれるペプチド部分のアミノ酸配列をコードする塩基配列とが、前記二つのアミノ酸配列を連結してコードするように、連結されてなる塩基配列を有する連結遺伝子に基づき、前記結合ドメインに含まれるペプチド部分を前記生体物質に含まれるタンパク質に連結してなる融合体型タンパク質を発現させる工程、及び
(1−2)前記融合体型タンパク質によって、前記生体物質に含まれるタンパク質と前記結合ドメインに含まれるペプチドとの間において連結がなされる前記有機物−結合ドメイン融合体を作製する工程
を含むことが好ましい。
すなわち、かかる形態の本発明にかかる酸化珪素親和性ペプチドは、
下記配列番号:1、配列番号:2
Val−Ser−Pro−Met−Arg−Ser−Ala−Thr−Thr−His−Thr−Val (配列番号:1)
Ile−Pro−Met−His−Val−His−His−Lys−His−Pro−His−Val (配列番号:2)
に示すアミノ酸配列からなる群より選択される、少なくとも一つのアミノ酸配列を含んでなることを特徴とする酸化珪素親和性ペプチドである。さらには、かかる形態に対応する、本発明にかかるDNA分子は、下記配列番号:1、配列番号:2
Val−Ser−Pro−Met−Arg−Ser−Ala−Thr−Thr−His−Thr−Val (配列番号:1)
Ile−Pro−Met−His−Val−His−His−Lys−His−Pro−His−Val (配列番号:2)
に示すアミノ酸配列からなる群より選択される、少なくとも一つのアミノ酸配列の全部、またはその一部を含むアミノ酸配列、
もしくは、それらアミノ酸配列の繰り返し構造を含んでなる酸化珪素親和性ペプチド鎖をコードするDNAを含む
ことを特徴とするDNA分子である。あるいは、かかる形態に対応する、本発明にかかるベクターは、
下記配列番号:1、配列番号:2
Val−Ser−Pro−Met−Arg−Ser−Ala−Thr−Thr−His−Thr−Val (配列番号:1)
Ile−Pro−Met−His−Val−His−His−Lys−His−Pro−His−Val (配列番号:2)
に示すアミノ酸配列からなる群より選択される、少なくとも一つのアミノ酸配列の全部、またはその一部を含むアミノ酸配列、
もしくは、それらアミノ酸配列の繰り返し構造を含んでなる酸化珪素親和性ペプチド鎖をコードするDNAを含むベクターである。
Val−Ser−Pro−Met−Arg−Ser−Ala−Thr−Thr−His−Thr−Val (配列番号:1)、
Ile−Pro−Met−His−Val−His−His−Lys−His−Pro−His−Val (配列番号:2)、
からなる群より選ばれた少なくとも一つの全部または一部を含むものがより好ましいが、
Val−Ser−Pro−Met−Arg−Ser−Ala−Thr−Thr−His−Thr−Val(配列番号:1)の全部または一部を含むペプチドであっても、もしくは
Ile−Pro−Met−His−Val−His−His−Lys−His−Pro−His−Val(配列番号:2)の全部または一部を含むペプチドであってもよい。
胎児期に肝細胞で産生され胎児血中に存在する酸性糖蛋白であり、肝細胞癌(原発性肝癌)、肝芽腫、転移性肝癌、ヨークサック腫瘍のマーカーとなるα−フェトプロテイン(AFP)、
肝実質障害時に出現する異常プロトロンビンであり、肝細胞癌で特異的に出現することが確認されるPIVKA−II、
免疫組織化学的に乳癌特異抗原である糖蛋白で、原発性進行乳癌、再発・転移乳癌のマーカーとなるBCA225、
ヒト胎児の血清、腸および脳組織抽出液に発見された塩基性胎児蛋白であり、卵巣癌、睾丸腫瘍、前立腺癌、膵癌、胆道癌、肝細胞癌、腎臓癌、肺癌、胃癌、膀胱癌、大腸癌のマーカーである塩基性フェトプロテイン(BFP)、
進行乳癌、再発乳癌、原発性乳癌、卵巣癌のマーカーとなる糖鎖抗原であるCA15−3、
膵癌、胆道癌、胃癌、肝癌、大腸癌、卵巣癌のマーカーとなる糖鎖抗原であるCA19−9、
卵巣癌、乳癌、結腸・直腸癌、胃癌、膵癌のマーカーとなる糖鎖抗原であるCA72−4、
卵巣癌(特に漿液性嚢胞腺癌)、子宮体部腺癌、卵管癌、子宮頸部腺癌、膵癌、肺癌、大腸癌のマーカーとなる糖鎖抗原であるCA125、
上皮性卵巣癌、卵管癌、肺癌、肝細胞癌、膵癌マーカーとなる糖蛋白であるCA130、
卵巣癌(特に漿液性嚢胞腺癌)、子宮体部腺癌、子宮頸部腺癌のマーカーとなるコア蛋白抗原であるCA602、
卵巣癌(特に粘液性嚢胞腺癌)、子宮頸部腺癌、子宮体部腺癌のマーカーとなる母核糖鎖関連抗原であるCA54/61(CA546)、
大腸癌、胃癌、直腸癌、胆道癌、膵癌、肺癌、乳癌、子宮癌、尿路系癌等の腫瘍関連のマーカー抗原として現在、癌診断の補助に最も広く利用されている癌胎児性抗原(CEA)、
膵癌、胆道癌、肝細胞癌、胃癌、卵巣癌、大腸癌のマーカーとなる糖鎖抗原であるDUPAN−2、
膵臓に存在し、結合組織の弾性線維エラスチン(動脈壁や腱などを構成する)を特異的に加水分解する膵外分泌蛋白分解酵素であり、膵癌、膵嚢癌、胆道癌のマーカーとなるエラスターゼ1、
ヒト癌患者の腹水や血清中に高濃度に存在する糖蛋白であり、肺癌、白血病、食道癌、膵癌、卵巣癌、腎癌、胆管癌、胃癌、膀胱癌、大腸癌、甲状腺癌、悪性リンパ腫のマーカーとなる免疫抑制酸性蛋白(IAP)、
膵癌、胆道癌、乳癌、大腸癌、肝細胞癌、肺腺癌、胃癌のマーカーとなる糖鎖抗原であるNCC−ST−439、
前立腺癌のマーカーとなる糖蛋白質であるγ−セミノプロテイン(γ−Sm)、
ヒト前立腺組織から抽出された糖蛋白であり、前立腺組織のみに存在し、それゆえ前立腺癌のマーカーとなる前立腺特異抗原(PSA)、
前立腺から分泌される酸性pH下でリン酸エステルを水解する酵素であり、前立腺癌の腫瘍マーカーとして用いられる前立腺酸性フォスファターゼ(PAP)、
神経組織及び神経内分泌細胞に特異的に存在する解糖系酵素であり、肺癌(特に肺小細胞癌)、神経芽細胞腫、神経系腫瘍、膵小島癌、食道小細胞癌、胃癌、腎臓癌、乳癌のマーカーとなる神経特異エノラーゼ(NSE)、
子宮頸部扁平上皮癌の肝転移巣から抽出・精製された蛋白質であり、子宮癌(頸部扁平上皮癌)、肺癌、食道癌、頭頸部癌、皮膚癌のマーカーとなる扁平上皮癌関連抗原(SCC抗原)、
肺腺癌、食道癌、胃癌、大腸癌、直腸癌、膵癌、卵巣癌、子宮癌のマーカーとなる糖鎖抗原であるシアリルLeX−i抗原(SLX)、
膵癌、胆道癌、肝癌、胃癌、大腸癌のマーカーとなる糖鎖抗原であるSPan−1、
食道癌、胃癌、直腸・結腸癌、乳癌、肝細胞癌、胆道癌、膵癌、肺癌、子宮癌のマーカーであり、特に他の腫瘍マーカーと組み合わせて進行癌を推測し、再発予知・治療経過観察として有用である単鎖ポリペプチドである組織ポリペプタイド抗原(TPA)、
卵巣癌、転移性卵巣癌、胃癌、大腸癌、胆道系癌、膵癌、肺癌のマーカーとなる母核糖鎖抗原であるシアリルTn抗原(STN)、
肺の非小細胞癌、特に肺の扁平上皮癌の検出に有効な腫瘍マーカーであるシフラ(cytokeratin;CYFRA)、
胃液中に分泌される蛋白消化酵素であるペプシンの2種(PG I・PG II)の不活性型前駆体であり、胃潰瘍(特に低位胃潰瘍)、十二指腸潰瘍(特に再発、難治例)、ブルンネル腺腫、ゾーリンガーエリソン症候群、急性胃炎のマーカーとなるペプシノゲン(PG)、
組織障害や感染により、血漿中で変化する急性相反応蛋白であり、急性心筋梗塞等により心筋に壊死が起こると、高値を示すC−反応性蛋白(CRP)、
組織障害や感染により、血漿中で変化する急性相反応蛋白である血清アミロイドA蛋白(SAA)、
主に心筋や骨格筋に存在する分子量約17500のヘム蛋白であり、急性心筋梗塞、筋ジストロフィー、多発性筋炎、皮膚筋炎のマーカーとなるミオグロビン、骨格筋,心筋の可溶性分画を中心に存在し、細胞の損傷によって血液中に遊出する酵素であって、急性心筋梗塞、甲状腺機能低下症、進行性筋ジストロフィー症、多発性筋炎のマーカーとなるクレアチンキナーゼ(CK)(骨格筋由来のCK−MM型,脳、平滑筋由来のCK−BB型,心筋由来のCK−MB型の、三種のアイソザイム、ならびに、ミトコンドリア・アイソザイムや免疫グロブリンとの結合型CK(マクロCK))、
横紋筋の薄いフィラメント上でトロポニンI,Cとともにトロポニン複合体を形成し,筋収縮の調節に関与している分子量39,000の蛋白であり、横紋筋融解症、心筋炎、心筋梗塞、腎不全のマーカーとなるトロポニンT、
骨格筋・心筋いずれの細胞にも含まれる蛋白であり、測定結果の上昇は骨格筋、心筋の障害や壊死を意味するため、急性心筋梗塞症、筋ジストロフィー、腎不全のマーカーとなる心室筋ミオシン軽鎖I、
また、近年、ストレス・マーカーとして注目されてきているクロモグラニンA、チオレドキシン、8−OhdG、等が挙げられる。
メソポーラス・シリカ(SBA−15)の作製
ポリ(エチレンオキサイド)−ポリ(プロピレンオキサイド)−ポリ(エチレンオキサイド);<エチレンオキサイド20単位、プロピレンオキサイド70単位、エチレンオキサイド20単位からなるブロック共重合体、以下、EO20−PO70−EO20>4g、0.041mol テトラエトキシシラン(TEOS)/0.24mol HCl、6.67mol H2Oからなるシリカ反応液を調製した。
PHA合成酵素生産能を有する形質転換体の作製、及びPHA合成酵素の生産
PHA合成酵素生産能を有する形質転換体を以下の方法で作製した。
5'−TGCTGGAACT GATCCAGTAC−3'
(配列番号:12)リバース・プライマーの塩基配列
5'−GGGTTGAGGA TGCTCTGGAT GTG−3'
ここで取得したPHA合成酵素遺伝子DNA断片を、不和合性グル−プであるIncP、IncQ、あるいはIncWの何れにも属さない、広宿主域複製領域を含むベクター pBBR122(Mo Bi Tec)に組み換えた。この組み換えプラスミドを、シュードモナス・チコリアイ YN2ml株(PHA合成能欠損株)にエレクトロポレーション法により形質転換したところ、形質転換したYN2ml株では、PHA合成能が復帰し、相補性を示した。従って、選抜された遺伝子DNA断片は、少なくとも、シュードモナス・チコリアイ YN2ml株内において、PHA合成酵素に翻訳可能な、PHA合成酵素遺伝子領域を含むことが確認される。
5'−GGACCAAGCT TCTCGTCTCA GGGCAATGG−3'
(配列番号:13) 下流側プライマーの塩基配列
5'−CGAGCAAGCT TGCTCCTACA GGTGAAGGC−3'
同様に、配列番号:8で示される塩基配列のPHA合成酵素遺伝子についても、染色体DNAをテンプレートとして、PCR増幅を行い、完全長のPHA合成酵素遺伝子を再調製した。配列番号:8で示される塩基配列に対して、上流側プライマーとなる、その開始コドンよりも上流の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド(配列番号:14)および下流側プライマーとなる、終止コドンよりも下流の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド(配列番号:16)をそれぞれ設計・合成した(アマシャム・ファルマシア・バイオテク)。このオリゴヌクレオチドをプライマーとして、PCRを行い、PHA合成酵素遺伝子の完全長を増幅した(LA−PCRキット;宝酒造)。
5'−GTATTAAGCT TGAAGACGAA GGAGTGTTG−3'
(配列番号:16) 下流側プライマーの塩基配列
5'−CATCCAAGCT TCTTATGATC GGGTCATGCC−3'
次に、上述する二種の得られた完全長のPHA合成酵素遺伝子を含むPCR増幅断片を、それぞれ、制限酵素HindIIIを用いて完全分解した。また、発現ベクター pTrc99Aも制限酵素HindIIIで切断し、脱リン酸化処理(Molecular Cloning、 1巻、 572頁、 1989年; Cold Spring Harbor Laboratory出版)した。この発現ベクター pTrc99AのHindIII切断部位に、両末端の不用な塩基配列を除いた、完全長のPHA合成酵素遺伝子を含むDNA断片を、それぞれ、DNAライゲ−ション・キット Ver.II(宝酒造)を用いて連結して、二種の組換えプラスミドを作製した。
5'−AGTGGATCCT CCGAGCTCAG TAACAAGAGT AACGATGAGT TGAAG−3'
下流側プライマー(配列番号:18):
5'−ATACTCGAGA CTACTAGTCC GTTCGTGCAC GTACGTGCCT GGCGC−3'
同様に、pYN2−C2に対して、上流側プライマーとなる、オリゴヌクレオチド(配列番号:19)および下流側プライマーとなる、オリゴヌクレオチド(配列番号:20)をそれぞれ設計・合成した(アマシャム・ファルマシア・バイオテク)。この二種のオリゴヌクレオチドをプライマー対に用いて、pYN2−C2をテンプレートとしてPCR増幅を行い、上流にBamHI制限部位、下流にXhoI制限部位を有する、完全長のPHA合成酵素遺伝子を含むDNAを増幅産物として得た(LA−PCRキット;宝酒造)。
5'−ATACTCGAGA CTACTAGTGC GCACGCGCAC GTAAGTCCCG GGCGC−3'
下流側プライマー(配列番号:20):
5'−AGTGGATCCT CCGAGCTCCG CGATAAACCT GCGAGGGAGT CACTA−3'
精製したそれぞれのPCR増幅産物を、制限酵素BamHIおよびXhoIにより消化し、プラスミドpGEX−6P−1(アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製)の対応する部位に挿入した。これらの二種のベクター(pGEX−C1およびpGEX−C2)を用いて、大腸菌(JM109)を形質転換し、発現用菌株を得た。各菌株における発現ベクター導入の確認は、Miniprep(Wizard Minipreps DNA Purification Systems、PROMEGA社製)を用いて大量に調製したプラスミドDNAを、制限酵素BamHI、XhoIで処理して得られるDNA断片の分子量確認によって行った。得られた発現用菌株をLB−Amp培地10mlで一晩プレ・カルチャ−した後、その培養物0.1mlを、10mlのLB−Amp培地に添加し、37℃、170rpmで3時間振とう培養した。その後、IPTG(終濃度 1mM)を添加し、37℃で4〜12時間培養を続けた。
各精製酵素タンパク質の活性は以下の方法で測定した。
試薬2:3’−ヒドロキシオクタノイルCoAを、0.1 M トリス塩酸バッファー(pH8.0)に3.0 mM溶解、
試薬3:トリクロロ酢酸を、0.1 M トリス塩酸バッファー(pH8.0)に10 mg/ml溶解、
試薬4:5、5’−ジチオビス−(2−ニトロ安息香酸)を、0.1 M トリス塩酸バッファー(pH8.0)に2.0 mM溶解。
メソポーラス・シリカ(SBA−15)に対する親和性を有するアミノ酸配列の取得
(ステップ1)
前記参照例1に記載するメソポーラス・シリカSBA−15を、0.1%Tween−20/TBSバッファー(50 mM Tris−HCl pH 7.5、150 mM NaCl)<以下、TBSTバッファー>に5 mg/mlの濃度に成るように懸濁した。この10μlをエッペンドルフチューブに加え、990μl TBSTバッファー(TBSバッファー+0.1%Tween−20)を加えて希釈した。
PhD.−12ファージ・ディスプレイ・ペプチド・ライブラリー(NEW ENGLAND BIOLAB社製)の4×1010pfu相当を、前記チューブに添加し、25℃で30分間静置した。
前記チューブを遠心分離(20,630×g、5分間)した後、上清を捨て、沈澱画分としてSBA−15を回収した。回収した沈澱を再びTBSTバッファーに懸濁し、遠心分離し、沈澱画分を回収する操作を繰り返すことによって、SBA−15をTBSTバッファーで10回洗浄した。
洗浄済みのSBA−15に100μlの溶出バッファー(0.2M Glycine−HCl(pH2.2)、1mg/ml BSA)を加えて、10分間緩やかに振盪させた後、遠心分離(20,630×g、5分間)し、上清を別のエッペンドルフチューブに移した。分取された上清に、15μlの1M Tris−HCl(pH9.1)を加えて中和し、SBA−15上から溶出されたファージを得た。
溶出されたファージを、対数増殖初期の大腸菌ER2537(NEW ENGLAND BIOLAB社製)に感染させ、下記の手順に従って増幅した。
上記のファージの提示するペプチドについて、メソポーラス・シリカSBA−15に対する親和性に関する、一次スクリーニングされた該懸濁液に含まれるファージについて、前記ステップ1〜ステップ5のスクリーニング操作を更に4回繰り返した。但し、二次スクリーニング以降、洗浄に用いる、TBSTバッファー中のTween−20濃度を0.5%に上げることによって、ステップ3における洗浄条件を厳しくし、メソポーラス・シリカSBA−15に対して、より高い親和性を示すファージを選別した。また、三次スクリーニング(2回目)以降では、前記ステップ3における洗浄によって、SBA−15から離脱したファージに関しても、同様の操作を行い、その力価(Titer)を測定し、コントロールとした。
1)ファージELISAによる酸化珪素親和性評価
(ステップ1)
SBA−15を、0.1%Tween−20/TBSバッファー(50 mM Tris−HCl pH 7.5、150 mM NaCl)<以下、TBST>に5 mg/mlの濃度になるように懸濁した。この懸濁液10μlをエッペンドルフチューブに加え、990μl TBSTバッファー(TBSバッファー+0.1%Tween−20)を加えて希釈した。
PhD.−12ファージ・ディスプレイ・ペプチド・ライブラリー(NEWENGLAND BIOLAB)から選別された上記15クローンの各クローンのファージ懸濁液について、該懸濁液の4×1010pfu相当を前記チューブに添加し、25℃で30分間静置した。
前記チューブを遠心分離(20,630×g、5分間)した後、上清を捨て、沈澱画分としてSBA−15を回収した。回収した沈澱を再びTBSTバッファーに懸濁し、遠心分離し、沈澱画分を回収する操作を繰り返すことによって、SBA−15をTBSTバッファーで10回洗浄した。
上記チューブ中の洗浄済みSBA−15に、100μlのHRP結合抗M13抗体溶液(抗M13抗体(NEW ENGLAND BIOLAB社製)1μLをTBST10mLに懸濁)を加えて、60分間緩やかに振盪させた。次に、チューブを遠心分離(20,630×g、5分間)した後、上清を捨て、沈澱画分としてSBA−15を回収した。回収した沈澱を再びTBSTバッファーに懸濁し、遠心分離し、沈澱画分を回収する操作を繰り返すことによって、SBA−15をTBSTバッファーで5回洗浄した。
SBA−15上に結合しているファージに前記HRP結合抗M13抗体を反応させる処理を施した、SBA−15の沈澱を、50μLのDetction Reagent1(Amersham Pharmacia #RPN2209)で懸濁し、96穴タイタープレートの各ウェルに移す。
2)酸化珪素との結合能を示すアミノ酸配列
選別された15のファージ・クローンについて、該ファージのDNA配列解析結果から、各ファージのランダム・ペプチド提示領域のアミノ酸配列を対比して、酸化珪素に対する親和性に関与すると推定されるアミノ酸配列を特定した。表4に、特定された酸化珪素に対する親和性を示すアミノ酸配列と、その出現頻度を示す。
前記SBA−15に対する親和性を示すアミノ酸配列を含むペプチドを付加したPHA合成酵素を、以下の手順により調製した。
ペプチド融合タンパク質01−YN2−C1、02−YN2−C2のSBA−15に対する親和性評価
SBA−15を0.1%Tween−20/TBSバッファーに0.5%(w/v)になるように懸濁した。この懸濁液10mlをテフロン製遠沈管にとり、ここに、実施例2で調製した、ペプチド融合PHA合成酵素01−YN2−C1、02−YN2−C1、あるいは、参照例2で調製したPHA合成酵素YN2−C1の0.5U相当量を加え、室温で30分間振とうした。遠心分離操作(10,000×g、4℃、10分間)によって、SBA−15粒子を沈澱として回収し、SBA−15に結合しなかった酵素タンパク質を含む上清と分離した。沈澱画分として、回収されるSBA−15を再び0.1%Tween−20を含むTBSバッファーに懸濁し、遠心分離して、沈澱画分を回収する操作を繰り返すことによって、SBA−15を洗浄した。表6に、洗浄したSBA−15の懸濁液について、上記参照例2に記載する測定方法で、酵素活性を測定した結果を示す。
SBA−15に対する親和性を有する二種類のアミノ酸配列、Val−Ser−Pro−Met−Arg−Ser−Ala−Thr−Thr−His−Thr−Val(配列番号:1)およびIle−Pro−Met−His−Val−His−His−lys−His−Pro−His−Val(配列番号:2)の全部を、スペーサー配列Gly−Gly−Gly−Ser−Gly−Gly−Gly−Serを介して、この順番に直列に繋いだ配列 Val−Ser−Pro−Met−Arg−Ser−Ala−Thr−Thr−His−Thr−Val−Gly−Gly−Gly−Ser−Gly−Gly−Gly−Ser−Ile−Pro−Met−His−Val−His−His−lys−His−Pro−His−Val(配列番号:21)を、さらにリンカー配列GSを介して、PHA合成酵素のN末端に融合した融合タンパク質を発現する、大腸菌用発現ベクターを次のようにして構築した。
5’−GATCCGTGAGCCCCATGAGGAGCGCCACCACCCACACCGTGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCAGCATCCCCATGCACGTGCACCACAAGCACCCCCACGTGGGAGCTGAGCT−3’(配列番号:22)および
5’−AGCTCCCACGTGGGGGTGCTTGTGGTGCACGTGCATGGGGATCTGCCGCCGCCGCTGCCGCCGCCGCACGGTGTGGGTGGTGGCGCTCCTCATGGGGCTCAC−3’(配列番号:23)を
それぞれT4ポリヌクレオチドキナ−ゼ(Gibco製)を用いて、末端をリン酸化した後、等モル混合し、80℃で5分間加熱し、その後、室温までゆっくり冷却させることによって二本鎖DNA断片として形成させた。形成された二本鎖DNA断片は、実施例2と同様にして、プラスミドpGEX−C1のBamHI/SacIサイトに挿入し、このベクターを用いて大腸菌(JM109)を形質転換し、発現用菌株を得た。実施例2と同様にして、配列番号:21のアミノ酸配列とリンカー配列GSからなるペプチドをN末端に融合した発現タンパク質21−YN2−C1を精製し、10 U/mlの精製酵素溶液を得た。実施例3と同様にして、SBA−15上に結合されている酵素タンパク質に起因する酵素活性を測定して、この精製酵素タンパク質のSBA−15に対する親和性を評価した。表7に、測定結果を示す。
本実施例5は、酸化珪素層被覆したシリコン基板上に酸化珪素層親和性ペプチドを融合したポリヒドロキシアルカネ−ト(PHA)合成酵素を固定して得られる有機物固定化構造体及びその製造方法の一例である。図1は、本実施例5の有機物固定化構造体の構成を模式的に示す断面図である。
本実施例5の有機物固定化構造体における基板11として、シリコン基板を用いる。
実施例2に記載の方法により得られた、配列番号:1のアミノ酸配列を有するペプチドがN末端に連結されてなるPHA合成酵素タンパク質01−YN2−C1を用いて、以下の評価を行った。
試薬2:3’−ヒドロキシオクタノイルCoA/0.1 M Tris−HClバッファー(pH8.0)溶液、基質を3.0mM溶解、に加えて、
試薬2−1;3’−ヒドロキシオクタノイルCoA/0.1 M Tris−HClバッファー(pH8.0)溶液、基質を1.5mM溶解、
試薬2−2;3’−ヒドロキシオクタノイルCoA/0.1 M Tris−HClバッファー(pH8.0)溶液、基質を6.0mM溶解
を用いた系においても、それぞれ、シリカ被覆基板上に固定化された酵素タンパク質01−YN2−C1によるPHA合成酵素活性を測定した。表9に、異なる基質濃度に対する、シリカ被覆基板上に固定化された酵素タンパク質01−YN2−C1の酵素活性の評価結果を示す。
HEL結合性scFv/SBA−15親和性ペプチド融合タンパク質の作製
SBA−15親和性ペプチドIPMHVHHKHPHV(配列番号:2)をHEL結合性scFvのC末端に融合したタンパク質を以下の工程により作製する。
予め、HEL結合性scFvの構成要素となるVL(クローン名:VL_HEL、配列番号:24にそのアミノ酸配列、ならびに配列番号:25に前記アミノ酸配列をコードする塩基配列を示す)、VH(クローン名:VH_HEL、配列番号:26にそのアミノ酸配列、ならびに配列番号:27に前記アミノ酸配列をコードする塩基配列を示す)のコード遺伝子断片を、それぞれ、pET−15b(Novagen社)のマルチ・クローニングサイトを部分的に変更したべクター中に挿入する。図2に示すように、VLコード遺伝子が挿入されているベクター:pUT−VL_HEL、VHコード遺伝子が挿入されているベクター:pUT−VH_HELとする。
SiscFv−B(配列番号:28)
5'- NNNNNACGGC CGGCGGGGGC GGTAGCGGCG GTGGCGGGTC GGGCGGTGGC GGATCGGATA TCCAGCTGCA GGAGT -3'
SiscFv−F(配列番号:29)
5'- NNNNNCCGCG GGTGGGGGTG CTTGTGGTGC ACGTGCATGG GGATGCTACC CGCGGAGACG GTGACGAGGG T -3'
前記フォワード側プライマー:SiscFv−Bは、5’末端部にリンカー配列(GGGGS)×3をコードする塩基配列を含み、一方、リバース側プライマー:SiscFv−Fは、5’末端部にスペーサー配列GS、SBA−15親和性ペプチド(配列番号:2:IPMHVHHKHPHV)をコードする塩基配列に対して、相補的な塩基配列を含んでいる。従って、得られるPCR産物は、リンカー配列(GGGGS)×3、VHのアミノ酸配列(配列番号:26)、GSリンカー、SBA−15親和性ペプチド(配列番号:2:IPMHVHHKHPHV)からなるアミノ酸配列をコードする塩基配列を包含している。なお、PCR反応は、市販のPCRキット(タカラバイオ LA−Taqキット)を使用し、業者推奨のプロトコールに従って行う。
プレート上のコロニーを無作為に選択し、3.0mL LB/amp.培地にて、28℃で、一晩振盪培養を行う。
上記予備培養溶液を2×YT培地 750mLに植え継ぎ、更に、28℃で培養を継続する。培養液のOD600が0.8を超えた時点で、終濃度が1mMとなるようにIPTGを加え、更に、28℃で、終夜培養を行う。
形質転換菌株中において、発現ベクターpUT−scFvSp2から翻訳されるポリペプチド鎖は、不溶性顆粒を形成している。下記の工程に従って、不溶性顆粒画分から、目的のポリペプチド鎖の単離、精製を行う。
上記本培養で得られる菌体培養液750mLを6000rpm×30minにて遠心し、菌体を沈澱(不溶性画分)として分離する。分離された菌体を、氷中にて、トリス溶液(20mM トリス/500mM NaCl)15mLに懸濁する。この懸濁液中の菌体をフレンチプレスによって破砕する。破菌後、菌破砕液を12,000rpm×15minで遠心を行い、上清を除き、不溶性顆粒を含む沈澱(不溶性画分)を回収する。
回収される不溶性顆粒を含む沈澱(不溶性画分)に、6M 塩酸グアニジン/トリス溶液 10mLを加えて、一晩浸漬する。前記変性処理により、不溶性顆粒を形成するポリペプチドの可溶化がなされる。次に、12,000rpm×10minで遠心し、可溶化されたポリペプチドを含む上清を、可溶化成分溶液として分取する。
Hisタグを利用するカラム精製に用いる、金属キレートカラム担体として、His−Bind(Novagen社製)を用いている。カラム調製、サンプル負荷、ならびに、カラム洗浄工程、条件は、業者の推奨方法に準拠し、室温(20℃)にて行う。サンプル負荷、カラム洗浄工程後、該金属キレートカラムに吸着されている、Hisタグ融合のポリペプチドの溶出は、60mM イミダゾール/Tris溶液を用いて行う。溶出液について、SDS−PAGE(アクリルアミド15%)上での泳動によって分析し、単一バンドが観測されることを確認する。観測される、単一バンドの見掛けの分子量は目的のポリペプチド鎖に相当することから、精製されていることが確認される。
前記溶出液中に含まれるイミダゾールを透析により除去する。6M 塩酸グアニンジン/Tris溶液を外液として、4℃で透析を行い、該ポリペプチド鎖の塩酸グアニンジン/Tris溶液を得る。
前記塩酸グアニンジン/Tris溶液中では、HEL結合性scFvのC末にSBA−15親和性ペプチド(配列番号:2:IPMHVHHKHPHV)が連結された、上記scFv−Sp2のポリペプチド鎖は変性されている。この変性されている、ポリペプチド鎖を、下記する工程に従って、透析(4℃)によって、段階的に脱塩酸グアニンジンを行いつつ、HEL結合性scFvタンパク質部分のリフォールディングを行う。
構造体の作製
(ステップ1) 参照例1に記載の作製法より作製した多孔体(SBA−15) 200mgを、0.1%Tween20/リン酸バッファー:PBST(pH7.4)中に一晩浸漬する。
HEL検出用検査キット
(ステップ1) 終濃度がそれぞれ0.1、0.5、1μMとなるように、PBST中にHEL(生化学工業)を溶解した溶液を、3本のエッペンドルフチューブ内で調製する。
(ステップ1) 参照例1に記載の作製法より作製した多孔体(SBA−15)と、濃度100nMのFITC標識したHELポリクローナル抗体溶液500μLとを混合し、室温にてインキュベートする。
HEL結合性scFv/SBA−15親和性ペプチド融合タンパクの作製
SBA−15親和性ペプチド:IPHVHHKHPRをHEL結合性scFvのC末端に融合したタンパク質を、以下の工程に従って作製する。
発現ベクターの構築は、上述の実施例6と同様の手順で行う。
先ず、リンカー配列(GGGGS)×3、VHのアミノ酸配列(配列番号:26)、GSリンカー、SBA−15親和性ペプチド(配列番号:30:IPMHVHHKHPR)からなるアミノ酸配列をコードする塩基配列を包含している二本鎖DNAを下記する方法で調製する。
SiscFv−B (配列番号:31)
5'- NNNNNACGGC CGGCGGGGGC GGTAGCGGCG GTGGCGGGTC GGGCGGTGGC GGATCGGATA TCCAGCTGCA GGAGT -3'
SiscFv−F (配列番号:32)
5’- NNNNNCCGCG GGTGGTGCTT GTGGTGCACG TGCATGGGGA TGCTACCCGC GGAGACGGTG ACGAGGGT -3’
前記フォワード側プライマー:SiscFv−Bは、5’末端部にリンカー配列(GGGGS)×3をコードする塩基配列を含み、一方、リバース側プライマー:SiscFv−Fは、5’末端部にスペーサー配列GS、SBA−15親和性ペプチド(配列番号:30:IPMHVHHKHPR)をコードする塩基配列に対して、相補的な塩基配列を含んでいる。従って、得られるPCR産物は、リンカー配列(GGGGS)×3、VHのアミノ酸配列(配列番号:26)、GSリンカー、SBA−15親和性ペプチド(配列番号:30:IPMHVHHKHPR)からなるアミノ酸配列をコードする塩基配列を包含している。なお、PCR反応は、市販のPCRキット(タカラバイオ LA−Taqキット)を使用し、業者推奨のプロトコールに従って行う。
HEL結合性scFv/SBA−15親和性ペプチド融合タンパクの作製(2)
SBA−15親和性ペプチドとして、配列番号2のアミノ酸配列に基づき、改変を施した配列番号33:IPMHVHHRHPHVを選択し、かかるSBA−15親和性ペプチドをHEL結合性scFvのC末端に融合したタンパク質を、以下に記した工程以外は、実施例6に記載の工程に従って作製する。
SBA−15親和性ペプチドとして用いる、配列番号33:IPMHVHHRHPHVのアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する合成DNAを用い、それ以外は実施例6に記載と同様の手順で発現べクターを作製する。この発現ベクターから、実施例6に開示する手法に準じて、HEL結合性scFvタンパク質のC末にSBA−15親和性ペプチド(配列番号:33:IPMHVHHRHPHV)が連結された融合タンパク質のPBS溶液を得る。
SiscFv−B2 (配列番号:31)
5'- NNNNNACGGC CGGCGGGGGC GGTAGCGGCG GTGGCGGGTC GGGCGGTGGC GGATCGGATA TCCAGCTGCA GGAGT 3'
SiscFv−F3 (配列番号:34)
5'- NNNNNGACGT GGGGGTGCCT GTGGTGCACG TGCATGGGGA TGCTACCCGC GGAGACGGTG ACGAGGGT 3'
前記フォワード側プライマー:SiscFv−B2は、5’末端部にリンカー配列(GGGGS)×3をコードする塩基配列を含み、一方、リバース側プライマー:SiscFv−F3は、5’末端部にスペーサー配列GS、SBA−15親和性ペプチド(配列番号:33:IPMHVHHRHPR)をコードする塩基配列に対して、相補的な塩基配列を含んでいる。
HEL結合性scFv/SBA−15親和性ペプチド融合タンパクの作製(2)
SBA−15親和性ペプチドとして、配列番号2のアミノ酸配列に基づき、改変を施した配列番号35:IPMRVHHKHPHVを選択し、かかるSBA−15親和性ペプチドをHEL結合性scFvのC末端に融合したタンパク質を、以下に記した工程以外は、実施例6に記載の工程に従って作製する。
SBA−15親和性ペプチドとして用いる、配列番号35:IPMRVHHKHPHVのアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する合成DNAを用い、それ以外は実施例6に記載と同様の手順で発現べクターを作製する。この発現ベクターから、実施例6に開示する手法に準じて、HEL結合性scFvタンパク質のC末にSBA−15親和性ペプチド(配列番号:35:IPMRVHHKHPHV)が連結された融合タンパク質のPBS溶液を得る。
SiscFv−B2 (配列番号:31)
5'- NNNNNACGGC CGGCGGGGGC GGTAGCGGCG GTGGCGGGTC GGGCGGTGGC GGATCGGATA TCCAGCTGCA GGAGT -3'
SiscFv−F4 (配列番号:36)
5'- NNNNNGACGT GGGGGTGCTT GTGGTGCACT CTCATGGGGA TGCTACCCGC GGAGACGGTG ACGAGGGT -3'
前記フォワード側プライマー:SiscFv−B2は、5’末端部にリンカー配列(GGGGS)×3をコードする塩基配列を含み、一方、リバース側プライマー:SiscFv−F3は、5’末端部にスペーサー配列GS、SBA−15親和性ペプチド(配列番号:35:IPMRVHHKHPR)をコードする塩基配列に対して、相補的な塩基配列を含んでいる。
HEL検出用検査キット
前記実施例9、10、11の調製法によって得られる、HEL結合性scFvタンパク質のC末にSBA−15親和性ペプチドとして、配列番号:30:IPMHVHHKHPR、配列番号:33:IPMHVHHRHPHV、または配列番号:35:IPMRVHHKHPHVのアミノ酸配列のペプチドが連結された融合タンパク質三種を用いて、上記実施例7に記載の手順に準じて、該融合タンパク質を多孔体(SBA−15)の表面に結合してなる構造体を作製する。
12 酸化珪素層
14 機能ドメイン(酵素タンパク質)
15 結合ドメイン(酸化珪素親和性ペプチド)
Claims (10)
- 基体の表面に有機物が固定化された構造体であって、
前記基体の表面の少なくとも一部が、酸化珪素を含む一以上の部材によって構成され、
前記有機物は、酸化珪素に対して結合能を有するアミノ酸配列からなるペプチドを少なくとも一つ含んでなる結合ドメインを介して、前記基体の表面に結合され、
前記酸化珪素は、メソポーラス・シリカSBA−15であり、
前記ペプチドは、下記配列番号:1または配列番号:2
(配列番号:1)Val−Ser−Pro−Met−Arg−Ser−Ala−Thr−Thr−His−Thr−Val
(配列番号:2)Ile−Pro−Met−His−Val−His−His−Lys−His−Pro−His−Val
に示すアミノ酸配列からなる群より選択される少なくとも一つのアミノ酸配列、
あるいは、それらアミノ酸配列の繰り返し構造からなるペプチドである
ことを特徴とする、有機物が固定化された構造体。 - 前記有機物は、生体物質である
ことを特徴とする請求項1に記載の構造体。 - 前記生体物質と結合ドメインとの連結部において、前記結合ドメイン中の前記ペプチドと前記生体物質の間に、一以上のアミノ酸からなるリンカーが更に含まれる
ことを特徴とする請求項2に記載の構造体。 - 前記基体の少なくとも一部が多孔質である
ことを特徴とする請求項1〜3のいずれか一項に記載の構造体。 - 基体の表面上に有機物を固定化してなる構造体の製造方法であって、
酸化珪素に対して結合能を有するアミノ酸配列からなるペプチドを少なくとも一つ以上含んでなる結合ドメインと有機物とが連結してなる、有機物−結合ドメイン融合体を調製する工程と、
前記結合ドメインの少なくとも一部を、前記表面の少なくとも一部が酸化珪素を含む一以上の部材によって構成された基体に結合させることにより、前記結合ドメインを介して、前記基体の表面に前記有機物を固定化する工程とを有し、
前記酸化珪素は、メソポーラス・シリカSBA−15であり、
前記ペプチドは、下記配列番号:1または配列番号:2
(配列番号:1)Val−Ser−Pro−Met−Arg−Ser−Ala−Thr−Thr−His−Thr−Val
(配列番号:2)Ile−Pro−Met−His−Val−His−His−Lys−His−Pro−His−Val
に示すアミノ酸配列からなる群より選択される少なくとも一つのアミノ酸配列、
あるいは、それらアミノ酸配列の繰り返し構造からなるペプチドである
ことを特徴とする有機物固定化構造体の製造方法。 - 酸化珪素に対して親和性を有するペプチドであって、
前記酸化珪素は、メソポーラス・シリカSBA−15であり、
前記ペプチドは、
下記配列番号:1または配列番号:2
(配列番号:1)Val−Ser−Pro−Met−Arg−Ser−Ala−Thr−Thr−His−Thr−Val
(配列番号:2)Ile−Pro−Met−His−Val−His−His−Lys−His−Pro−His−Val
に示すアミノ酸配列からなる群より選択される少なくとも一つのアミノ酸配列、
あるいは、それらアミノ酸配列の繰り返し構造からなるペプチドである
ことを特徴とする酸化珪素に親和性のペプチド。 - 酸化珪素に対して親和性を有するペプチドをコードするDNAであって、
前記酸化珪素は、メソポーラス・シリカSBA−15であり、
該DNAによりコードされる、前記酸化珪素に対して親和性を有するペプチドは、
下記配列番号:1または配列番号:2
(配列番号:1)Val−Ser−Pro−Met−Arg−Ser−Ala−Thr−Thr−His−Thr−Val
(配列番号:2)Ile−Pro−Met−His−Val−His−His−Lys−His−Pro−His−Val
に示すアミノ酸配列からなる群より選択される少なくとも一つのアミノ酸配列、
あるいは、それらアミノ酸配列の繰り返し構造からなるペプチドであり、
前記DNAは、前記酸化珪素に対して親和性を有するペプチドをコードする塩基配列を含む
ことを特徴とする酸化珪素親和性ペプチドをコードするDNA。 - 酸化珪素に対して親和性を有するペプチド鎖をコードするDNAを含むベクターであって、
前記酸化珪素は、メソポーラス・シリカSBA−15であり、
前記DNAによりコードされる、前記酸化珪素に対して親和性を有するペプチド鎖は、
下記配列番号:1または配列番号:2
(配列番号:1)Val−Ser−Pro−Met−Arg−Ser−Ala−Thr−Thr−His−Thr−Val
(配列番号:2)Ile−Pro−Met−His−Val−His−His−Lys−His−Pro−His−Val
に示すアミノ酸配列からなる群より選択される少なくとも一つのアミノ酸配列、
あるいは、それらアミノ酸配列の繰り返し構造からなるペプチド鎖であり、
該ベクター中に含まれる、前記DNAは、前記酸化珪素に対して親和性を有するペプチド鎖をコードする塩基配列を含むDNAである
ことを特徴とする酸化珪素に親和性のペプチド鎖をコードするDNAを含むベクター。 - 検体中の標的物質を検出するための装置であって、
請求項1に記載の基体の表面に有機物が固定化された構造体と検体とを接触させることにより、前記有機物と前記標的物質とを結合させるための手段と、
前記結合された標的物質を検出するための手段とを有する
ことを特徴とする検出装置。 - 検体中の標的物質を検出する方法であって、
請求項1に記載の基体の表面に有機物が固定化された構造体と検体とを接触させることにより、前記有機物と前記標的物質とを結合させる工程と、
前記結合された標的物質を検出する工程とを有する
ことを特徴とする検出方法。
Priority Applications (3)
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