JP5300205B2 - 標的物質検出素子、標的物質検出方法、標的物質検出素子の製造方法 - Google Patents
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Description
検体中の標的物質の有無もしくは濃度を検出する標的物質検出素子であって、
前記標的物質検出素子が、少なくとも、複数の層からなる検出基板と、該検出基板の表面
に固定された標的物質捕捉体とからなり、
前記標的物質捕捉体が、前記標的物質を捕捉するための標的物質捕捉部位と、前記検出基板を構成する複数の層のうちの第一の層を特異的に認識して結合する第一のペプチド領域と、前記複数の層のうちの前記第一の層とは異なる第二の層を特異的に認識して結合する第二のペプチド領域とを少なくとも有し、
前記第一の層と前記第二の層は隣接していることを特徴とする標的物質検出素子である。
標的物質検出素子の製造方法であって、
前記標的物質を捕捉するための標的物質捕捉部位と、検出基板を構成する複数の層のうちの第一の層を特異的に認識して結合する第一のペプチド領域と、前記複数の層のうちの前記第一の層とは異なる第二の層を特異的に認識して結合する第二のペプチド領域とを有する標的物質捕捉体を用意する工程と、
前記標的物質捕捉体を、前記検出基板に接触させることで、前記標的物質捕捉体が有する
第一のペプチド領域を前記検出基板が有する第一の層に結合させ、かつ前記標的物質捕捉
体が有する第二のペプチド領域を前記検出基板が有する第二の層に結合させる工程と、
前記標的物質捕捉体が少なくとも前記第一の層および第二の層の両方を特異的に認識して
結合している場合の結合強度と、前記標的物質捕捉体が前記第一の層もしくは前記第二の
層のいずれかのみを特異的に認識して結合している場合の結合強度の差を利用して、前記
第一の層のみもしくは第二層のみを特異的に認識して結合している標的物質捕捉体を取り
除く工程と、
を有することを特徴とする標的物質検出素子の製造方法である。
検体中の標的物質の有無もしくは濃度を検出する標的物質検出方法であって、
少なくとも、複数の層からなる検出基板と、該検出基板の表面に固定された標的物質捕捉
体とからなる前記標的物質検出素子に検体を接触させる工程と、
前記標的物質検出素子からシグナルを得る工程と、
を有し、
前記標的物質検出素子が有する前記標的物質捕捉体が、前記標的物質を捕捉するための標的物質捕捉部位と、前記検出基板を構成する複数の層のうちの第一の層を特異的に認識して結合する第一のペプチド領域と、前記複数の層のうちの前記第一の層とは異なる第二の層を特異的に認識して結合する第二のペプチド領域と
を有し、
前記第一の層と前記第二の層は隣接していることを特徴とする標的物質検出方法である。
(標的物質検出素子)
本発明の標的物質検出素子は、検体中の標的物質の有無もしくは濃度を検出する標的物質検出素子であって、少なくとも、複数の層からなる検出基板と、該検出基板の表面に固定された標的物質捕捉体とからなる。標的物質捕捉体は、検出基板を構成する複数の層のうちの第一の層を特異的に認識して結合する第一のペプチド領域と、第一の層とは異なる第二の層を特異的に認識して結合する第二のペプチド領域とを少なくとも有する。そして、第一の層と第二の層は隣接していることを特徴とする。ここで、第一の層と第二の層が異なるとは第一の層を構成する材料と第二の層を構成する材料が異なるという意味である。例えば、第一の層を構成する分子もしくは原子と第二の層を構成する分子もしくは原子が異なるという場合などである。
胎児期に肝細胞で産生され胎児血中に存在する酸性糖蛋白であり、肝細胞癌(原発性肝癌)、肝芽腫、転移性肝癌、ヨークサック腫瘍のマーカーとなるα−フェトプロテイン(AFP)、
肝実質障害時に出現する異常プロトロンビンであり、肝細胞癌で特異的に出現することが確認されるPIVKA−II、
免疫組織化学的に乳癌特異抗原である糖蛋白で、原発性進行乳癌、再発・転移乳癌のマーカーとなるBCA225、
ヒト胎児の血清、腸および脳組織抽出液に発見された塩基性胎児蛋白であり、卵巣癌、睾丸腫瘍、前立腺癌、膵癌、胆道癌、肝細胞癌、腎臓癌、肺癌、胃癌、膀胱癌、大腸癌のマーカーである塩基性フェトプロテイン(BFP)、
進行乳癌、再発乳癌、原発性乳癌、卵巣癌のマーカーとなる糖鎖抗原であるCA15−3、
膵癌、胆道癌、胃癌、肝癌、大腸癌、卵巣癌のマーカーとなる糖鎖抗原であるCA19−9、
卵巣癌、乳癌、結腸・直腸癌、胃癌、膵癌のマーカーとなる糖鎖抗原であるCA72−4、
卵巣癌(特に漿液性嚢胞腺癌)、子宮体部腺癌、卵管癌、子宮頸部腺癌、膵癌、肺癌、大腸癌のマーカーとなる糖鎖抗原であるCA125、
上皮性卵巣癌、卵管癌、肺癌、肝細胞癌、膵癌マーカーとなる糖蛋白であるCA130、
卵巣癌(特に漿液性嚢胞腺癌)、子宮体部腺癌、子宮頸部腺癌のマーカーとなるコア蛋白抗原であるCA602、
卵巣癌(特に粘液性嚢胞腺癌)、子宮頸部腺癌、子宮体部腺癌のマーカーとなる母核糖鎖関連抗原であるCA54/61(CA546)、
大腸癌、胃癌、直腸癌、胆道癌、膵癌、肺癌、乳癌、子宮癌、尿路系癌等の腫瘍関連のマーカー抗原として現在、癌診断の補助に最も広く利用されている癌胎児性抗原(CEA)、
膵癌、胆道癌、肝細胞癌、胃癌、卵巣癌、大腸癌のマーカーとなる糖鎖抗原であるDUPAN−2、
膵臓に存在し、結合組織の弾性線維エラスチン(動脈壁や腱などを構成する)を特異的に加水分解する膵外分泌蛋白分解酵素であり、膵癌、膵嚢癌、胆道癌のマーカーとなるエラスターゼ1、
ヒト癌患者の腹水や血清中に高濃度に存在する糖蛋白であり、肺癌、白血病、食道癌、膵癌、卵巣癌、腎癌、胆管癌、胃癌、膀胱癌、大腸癌、甲状腺癌、悪性リンパ腫のマーカーとなる免疫抑制酸性蛋白(IAP)、
膵癌、胆道癌、乳癌、大腸癌、肝細胞癌、肺腺癌、胃癌のマーカーとなる糖鎖抗原であるNCC−ST−439、
前立腺癌のマーカーとなる糖蛋白質であるγ−セミノプロテイン(γ−Sm)、
ヒト前立腺組織から抽出された糖蛋白であり、前立腺組織のみに存在し、それゆえ前立腺癌のマーカーとなる前立腺特異抗原(PSA)、
前立腺から分泌される酸性pH下でリン酸エステルを水解する酵素であり、前立腺癌の腫瘍マーカーとして用いられる前立腺酸性フォスファターゼ(PAP)、
神経組織及び神経内分泌細胞に特異的に存在する解糖系酵素であり、肺癌(特に肺小細胞癌)、神経芽細胞腫、神経系腫瘍、膵小島癌、食道小細胞癌、胃癌、腎臓癌、乳癌のマーカーとなる神経特異エノラーゼ(NSE)、
子宮頸部扁平上皮癌の肝転移巣から抽出・精製された蛋白質であり、子宮癌(頸部扁平上皮癌)、肺癌、食道癌、頭頸部癌、皮膚癌のマーカーとなる扁平上皮癌関連抗原(SCC抗原)、
肺腺癌、食道癌、胃癌、大腸癌、直腸癌、膵癌、卵巣癌、子宮癌のマーカーとなる糖鎖抗原であるシアリルLeX−i抗原(SLX)、
膵癌、胆道癌、肝癌、胃癌、大腸癌のマーカーとなる糖鎖抗原であるSPan−1、
食道癌、胃癌、直腸・結腸癌、乳癌、肝細胞癌、胆道癌、膵癌、肺癌、子宮癌のマーカーであり、特に他の腫瘍マーカーと組み合わせて進行癌を推測し、再発予知・治療経過観察として有用である単鎖ポリペプチドである組織ポリペプタイド抗原(TPA)、
卵巣癌、転移性卵巣癌、胃癌、大腸癌、胆道系癌、膵癌、肺癌のマーカーとなる母核糖鎖抗原であるシアリルTn抗原(STN)、
肺の非小細胞癌、特に肺の扁平上皮癌の検出に有効な腫瘍マーカーであるシフラ(cytokeratin;CYFRA)、
胃液中に分泌される蛋白消化酵素であるペプシンの2種(PG I・PG II)の不活性型前駆体であり、胃潰瘍(特に低位胃潰瘍)、十二指腸潰瘍(特に再発、難治例)、ブルンネル腺腫、ゾーリンガーエリソン症候群、急性胃炎のマーカーとなるペプシノゲン(PG)、
組織障害や感染により、血漿中で変化する急性相反応蛋白であり、急性心筋梗塞等により心筋に壊死が起こると、高値を示すC−反応性蛋白(CRP)、
組織障害や感染により、血漿中で変化する急性相反応蛋白である血清アミロイドA蛋白(SAA)、
主に心筋や骨格筋に存在する分子量約17500のヘム蛋白であり、急性心筋梗塞、筋ジストロフィー、多発性筋炎、皮膚筋炎のマーカーとなるミオグロビン、骨格筋,心筋の可溶性分画を中心に存在し、細胞の損傷によって血液中に遊出する酵素であって、急性心筋梗塞、甲状腺機能低下症、進行性筋ジストロフィー症、多発性筋炎のマーカーとなるクレアチンキナーゼ(CK)(骨格筋由来のCK−MM型,脳、平滑筋由来のCK−BB型,心筋由来のCK−MB型の、三種のアイソザイム、ならびに、ミトコンドリア・アイソザイムや免疫グロブリンとの結合型CK(マクロCK))、
横紋筋の薄いフィラメント上でトロポニンI,Cとともにトロポニン複合体を形成し,筋収縮の調節に関与している分子量39,000の蛋白であり、横紋筋融解症、心筋炎、心筋梗塞、腎不全のマーカーとなるトロポニンT、
骨格筋・心筋いずれの細胞にも含まれる蛋白であり、測定結果の上昇は骨格筋、心筋の障害や壊死を意味するため、急性心筋梗塞症、筋ジストロフィー、腎不全のマーカーとなる心室筋ミオシン軽鎖I、
また、近年、ストレス・マーカーとして注目されてきているクロモグラニンA、チオレドキシン、8−OhdG、等が挙げられる。
本発明の標的物質検出素子の製造方法は、
(A)検出基板を構成する複数の層のうちの第一の層を特異的に認識して結合する第一のペプチド領域と、前記複数の層のうちの前記第一の層とは異なる第二の層を特異的に認識して結合する第二のペプチド領域とを有する標的物質捕捉体を用意する工程と、
(B)前記標的物質捕捉体を、前記検出基板に接触させることで、前記標的物質捕捉体が有する第一のペプチド領域を前記検出基板が有する第一の層に結合させ、かつ前記標的物質捕捉体が有する第二のペプチド領域を前記検出基板が有する第二の層に結合させる工程と、
(C)前記標的物質捕捉体が少なくとも前記第一の層および第二の層の両方を特異的に認識して結合している場合の結合強度と、前記標的物質捕捉体が前記第一の層もしくは前記第二の層のいずれかのみを特異的に認識して結合している場合の結合強度の差を利用して、前記第一の層のみもしくは第二層のみを特異的に認識して結合している標的物質捕捉体を取り除く工程と、
を有することを特徴とする標的物質検出素子の製造方法である。
標的物質捕捉体を用意する工程は、
(A−1)第一のペプチド領域および第二のペプチド領域を用意する工程、
(A−2)第一のペプチド領域および第二のペプチド領域と標的物質捕捉部位を結合する工程、
によって構成される場合と、
(A’−1)前記第一のペプチド領域および前記第二のペプチド領域をコードする遺伝子を、標的物質捕捉部位をコードする遺伝子の上流もしくは下流に読み枠を一致させて挿入した発現ベクターを構築することにより、安定に第一および第二のペプチド領域と、標的物質捕捉部位とを有する標的物質捕捉体を得る工程、
によって構成される場合の2つがある。
標的物質捕捉体を構成する第一のペプチド領域は、例えば、ランダム・ペプチド・ライブラリーをスクリーニングすることによって簡便に取得することができる。
(a)ランダム・ペプチドを可溶性の形で化学的に合成したランダム合成ペプチド・ライブラリー。
(b)樹脂ビーズ上で合成した固相固定化ペプチド・ライブラリー。
(c)化学合成されたランダム配列のDNAをリボソ−ム無細胞系で生合成したペプチド・ライブラリー。
(d)M13系ファージの表面蛋白質(例えば、geneIII蛋白質)のN末端側遺伝子にランダム合成遺伝子を連結して調製されたファージ・ディスプレイ・ペプチドライブラリー。
(e)(d)と同様の手法で細菌の層タンパク質、Omp A(Francisco ら, 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 10444−10448あるいはPistor と Hoborn, 1989, Klin. Wochenschr., 66, 110−116)、PAL(Fuchs ら, 1991, Bio/Technology, 9, 1369−1372)、Lamb(Charbit ら, 1988, Gene, 70, 181−189及び Bradbury ら, 1993, Bio/Technology, 1565−1568)、フィンブリン(Hedeg AardとKlem M., 1989, Gene, 85, 115−124及び Hofnung, 1991, Methods Cell Biol.、 34, 77−105)、およびIgAプロテア−ゼβ領域(Klauser ら, 1990, EMBO J., 9, 1991−1999)に融合して提示したランダム・ペプチド・ライブラリー。
第一のペプチド領域、第二のペプチド領域および標的物質捕捉部位とを結合させる場合は、次の修飾を予め行う。すなわち、標的物質捕捉部位もしくは第一のペプチド領域および第二のペプチド領域を含む結合ドメイン、あるいは双方に対して、その機能に重大な影響を及ぼさない範囲で両者の連結に利用される反応性官能基の導入等の化学的修飾・変換を予め施す。具体的には、両者の連結に利用される反応性官能基として、マレイミド基とスルファニル基(−SH)、スクシイミド基とアミノ基、イソシアネート基とアミノ基、ハロゲンとヒドロキシ基、ハロゲンとスルファニル基(−SH)、エポキシ基とアミノ基、エポキシ基とスルファニル基(−SH)の組み合わせが挙げられる。このような組み合わせになるように、標的物質捕捉部位もしくは第一のペプチド領域および第二のペプチド領域のいずれか、あるいは双方に予め化学的修飾・変換を施した後に官能基間で化学的な結合を形成させることで標的物質捕捉体を形成することができる。
前記(A−1)および(A−2)の工程の代わりに、(A’−1)の工程を用いることも可能である。
アミノ酸数は、少なくとも7個以上、より好ましくは8個以上であることが好ましい。また、これらのアミノ酸配列の全部または一部の繰り返し構造を有していてもよい。
(B)の工程では、第一のペプチド領域および第二のペプチド領域を有する標的物質捕捉体を水性溶液に含有させ、該溶液を第一のペプチド領域が親和性を有する第一の層と第二のペプチド領域が親和性を有する第二の層とからなる検出基板に接触させる。それにより、標的物質捕捉体が有する第一のペプチド領域が前記第一の層を特異的に認識して結合し、標的物質捕捉体が有する第二のペプチド領域が前記第二の層を特異的に認識して結合する。よって、第一の層と第二の層との境界近傍に対して標的物質捕捉体を特異的に固定化することができる。
(C)の工程では、標的物質捕捉体が少なくとも第一の層および第二の層の両方を特異的に認識して結合している場合の結合強度と、標的物質捕捉体が第一の層もしくは第二の層のいずれかのみを特異的に認識して結合している場合の結合強度の差を利用する。この差を利用して、前記第一の層のみもしくは第二の層のみを特異的に認識して結合している標的物質捕捉体を取り除く工程である。
HEL結合性scFv(HyHEL10)を標的物質捕捉部位、第一のペプチド領域として金(Au)結合性ペプチド、第二のペプチド領域として酸化ケイ素(SiO2)結合性ペプチド領域を用い、融合体タンパク質を作製する。具体的には、HEL結合性scFv(Biophysical Journal Vol.83,2946-2968
(2002))のC末端側にリンカー配列(GGGGS)×3を介して、Au結合性ペプチド領域(MHGKTQATSGTIQS)×3を連結する。更に、第一のペプチド領域と第二のペプチド領域間のリンカー配列(SASGSGGGGSGGGSGGGSEGGGSEGGGSGGGSGS)を介してSiO2結合性ペプチド領域(IPMHVHHKHPHV)×2を連結した融合体を以下の工程で作製する。
HEL結合性scFv(HyHEL10))のDNA配列は公知であり、且つ上記するAu結合性ペプチド領域およびSiO2結合性領域の配列、ならびに各リンカー配列には図7に記載した配列を用いることができる。よって、例えば合成オリゴヌクレオチドを設計しオーバーラップPCRにより標的物質捕捉体をコードするDNA配列を得ることができる(Sambrookら1989、前出)。各機能領域の順列を図4に、この融合体配列(配列番号1)を図5及び6に示す。上記融合体をコードするDNA配列は最後の工程として5’末端に制限酵素NcoIサイト、3’末端に制限酵素EagIサイトを導入するためプライマー1,2(配列番号2,3;表1)を用いてPCRをおこなう。なお、PCR反応は、市販のPCRキット(タカラバイオ LA−Taqキット)を使用し、業者推奨のプロトコールに従って行う。
プレート上のコロニーを無作為に選択し、3.0mL LB/amp.培地にて、28℃で、一晩振盪培養を行う。
上記予備培養溶液をTB+0.5%グルコース培地 1Lに植え継ぎ、更に、28℃で培養を継続する。培養液のOD600が0.8を超えた時点で、終濃度が1mMとなるようにIPTGを加え、更に、28℃で、終夜培養を行う。
形質転換菌株中において、発現した融合体は培地上清に分泌されている。下記の工程に従って、本融合体の単離、精製を行う。
上記本培養で得られる菌体培養液1Lにプロテアーゼ阻害剤カクテル(EDTAフリー 100×)(ナカライテスク社 code;03969−21)を10ml添加する。続いて、クロスフロー濾過(ビバフロー200フリップフローろ過 MWCO10000 PES 型番VF20P0)装置を用いておよそ20mlまで濃縮する。
次に、濃縮培地中の低分子などを除去するため、Trisバッファー(pH8.0)を外液として4℃で透析を行う。
Hisタグを利用するカラム精製に用いる、金属キレートカラム担体として、His−Bind(Novagen社製)を用いている。カラム調製、サンプル負荷、ならびに、カラム洗浄工程、条件は、業者の推奨方法に準拠し、4℃にて行う。サンプル負荷、カラム洗浄工程後、該金属キレートカラムに吸着されている、Hisタグ融合のポリペプチドの溶出は、100mM イミダゾール/Tris溶液を用いて行う。溶出液について、SDS−PAGE(アクリルアミド15%)上での泳動によって分析し、単一バンドが観測されることを確認する。観測される、ほぼ単一バンドの見掛けの分子量は目的のポリペプチド鎖に相当することから、精製されていることが確認される。
上記カラム溶出したサンプルをゲルろ過カラム(Superdex 200 pg10/300 GL)を装着するアクタ-10s装置(GEヘルスケア)にセットする。次にTrisバッファー(pH8.0)で流速0.5ml/minでゲルろ過を行い、目的サイズのフラクションを取得する。SDS−PAGE(アクリルアミド15%)とウェスタン解析(HRP標識抗His抗体)により、目的タンパク質の単一画分取得を確認する。
(v)透析
回収されたタンパク質溶液に対して、更に外液をリン酸バッファー(以下、PBS pH7.4)に替え、透析を行い、緩衝液の変換を行う。融合体タンパク質のPBS pH7.4溶液が得られる。
(i)第一の層および第二の層を有する検出基板の作製
まず、スライドガラスをアセトン溶液内で30分間超音波をかけながら洗浄し有機物を除去する。ついで、IPA、EtOH、超純水にスライドガラスを入れ替え順次超音波洗浄を行う。次工程を行うまで新しい超純水中で保管する。スライドガラスの水分をN2ガスで除き、真空蒸着装置にスライドガラスの半分を成膜せずにガラス表面を残すためにアルミ箔で被覆しセットする。電子ビーム照射により、クロム、金の順にスライドガラスに成膜する。各層の厚みは、クロム2nm、金200nmとする。作製した構造体のアルミ箔で被覆した領域を第一の層とし、成膜した金層を第二の層とすることができる。最終的に作製した構造体をO/Nで濃塩酸に浸漬し、ついてアセトン、IPA、EtOH、超純水に置換し超音波処理を施し、金表面、ガラス表面の洗浄を完了する。標的物質捕捉体を固定するまで、超純水中で保管する。
実施例1で得られる標的物質捕捉体溶液(PBS pH7.4)を最終濃度が1μMになるように調製する。その際、界面活性剤Tween20を最終濃度0.1%になるよう添加する(PBSTバッファー)。上記で作製した構造体をN2ガスで水分を除き、各タンパク質溶液を材料境界領域に100μlスポットし、カバーガラスをかけモイスチャーチャンバー内で乾燥しないように30分間室温放置する。
(ii)で洗浄が完了したスライドガラスの金層とガラス層との境界領域付近に標的物質500nM HELタンパク質を200μl滴下し、カバーガラスをかけ室温で30分反応後、各バッファーで洗浄する。次に、100nM FITC標識したHELポリクローナル抗体1mlをスポットし、モイスチャーチャンバー内でインキュベートする。その後、各バッファーで洗浄し、蛍光顕微鏡で520nmのFITC蛍光を観察する。
(i)LSPR素子作製と検出装置(図10)
図6に本実施例で用いる検出装置の概略の構造を示す。素子18は、膜厚20nmの金薄膜を625μm厚の石英基板22上に形成し、この金薄膜を所定の金属構造体としてのパターンに電子線描画装置を用いてパターニングすることで製作できる。本実施例で作製する素子18の金属構造体の平面形状外形は200nm×200nmの正方形状であり金薄膜の下地に2nmのクロム層を設けている。各パターンは、250nmのスペースを開けてアレイ状に3mm×3mmの領域に配置されている(図10参照)。このようなパターンにおいて金属構造体の周辺領域において電場強度に分布を有し、金属構造体の略四角柱のエッジ領域、特に反応領域側の頂点付近を筆頭に辺領が電場強度が高いことが知られている。
上記LSPR素子の金属構造体表面に捕捉能を付与するため、実施例1で得られる標的物質捕捉体をPBS−T0.1−N100バッファーに1μMになるように調製した溶液を素子に作用し、モイスチャーチャンバー内で室温で30分インキュベートする。次にPBS−T0.1−N100のバッファーを用いて37℃で実施例2の洗浄工程を行い、金層とガラス層との境界近傍以外の領域に結合する融合体タンパク質を除く。
(1)作製した素子に標的物質であるHELを含んだ検体をインレット19より導入し、HELを構造体上に捕捉させる。
(2)検体を排出し、PBS−T0.1−N100バッファーをインレット19より導入し、反応ウェル21内部を洗浄する。
(3)最終濃度が100nMになるようにPBS−T0.1−N100バッファーに調製した標識物質ビオチン化抗HELポリクローナル抗体を両素子上の固定化HELと反応させる。
(4)標識物質を排出し、PBS−T0.1−N100バッファーをインレット19より導入し、反応ウェル21内部を洗浄する。
(5)最後にPBS−T0.1−N100バッファーを充填して、金の構造体の吸収スペクトルを測定する。
(i)ホールセンサー素子作製と検出装置
図10に本実施例で用いるホールセンサーの構造および検出回路を示す。本実施例で用いるホールセンサーは、高感度な磁界測定で一般的に用いられるp-HEMT構造のホール素子であるが、本発明はこの構造あるいは材料に限られるものではなく、ホールセンサーであればどのような構造あるいは材料であっても適用可能である。p-HEMT構造のホールセンサーは以下の様にして作製する。GaAs基板上にCVD成膜法を用いて、GaAs薄膜とAlGaAs薄膜からなる超格子膜、GaAs膜を800nm、InGaAs膜を12nm、AlGaAs膜を40nmそしてn-GaAs膜を20nm連続して成膜する。作製した多層膜を一般的に用いられる半導体プロセスで、十字型の素子に加工する。エッチング深さは約80nmとする。素子の幅は20μmで、中央部は20μm×20μmの正方形とする。この正方形の領域が磁界検出領域となる。また、素子の周辺は80nmのSiO2絶縁膜(層間絶縁膜)で覆う。その後、AuGe膜を50nm蒸着し、素子の端部4箇所に電極を形成する。この4つの電極のうち2つは検出電流を流す為に用いられ、他の2つはホール電圧(検出信号)を取得する為に用いられる。ホール素子を覆うようにCVD成膜法によって、50nmのSiO2膜を成膜し、さらにホール素子の磁界検出領域とホール電圧取得電極の界面付近に20nmの膜厚のAu膜をスパッタ成膜法によって成膜する。その後、再びホール素子を覆うように50nmのSiO2膜を成膜する。ドライエッチング法でホール素子の磁界検出領域上部のSiO2膜とAu膜を除去し、磁界検出領域周辺の一部にAu膜の断面を露出させる。
図10に例示するホールセンサー素子上に実施例1で得られる標的物質捕捉体をPBS−T0.1−N100バッファーに1μMになるように調製した溶液を滴下し、モイスチャーチャンバー内で室温で30分インキュベートする。次にPBS−T0.1−N100のバッファーを用いて37℃で実施例2の洗浄工程を行い、材料境界領域以外の領域に結合する融合体タンパク質を除いた。参照実験として、ホールセンサー素子を1mMアミノウンデカチオールに浸漬し2時間攪拌する。超純水で洗浄後、EDC/NHSし、金表面のアミノ基を活性化し、標的物質捕捉体を30分間作用させ固定する。次いで、超純水で洗浄し、未結合の活性化アミノ基をエタノールアミンでブロッキングする。標的物質捕捉体がランダム固定化された対照センサー素子を用意することができる。最後に、両センサー素子ともに非特異吸着防止のため0.5%BSA溶液(PBS−T0.1−N100バッファー)と反応させ、洗浄する。次に標的物質であるHELタンパク質をセンサー面に滴下し、カバーガラスをかけ室温で30分反応後、バッファーで洗浄する。
(1)作製した素子に標的物質であるHELを含んだ検体を作用させ、HELを構造体上に捕捉させる。
(2)PBS−T0.1−N100バッファーで洗浄し、未反応の検体を除去する。
(3)最終濃度が100nMになるようにPBS−T0.1−N100バッファーに調製した標識物質ビオチン化抗HELポリクローナル抗体を両センサー素子上の固定化HELと反応させる。
(4)PBS−T0.1−N100バッファーで洗浄し、未反応の標識物質を除去する。
(5)次いでストレプトアビジンコート磁性微粒子(SA-Beads;Invitrogen社 code No. DB65001(Dynabeads MyOne Streptavidin 1μm))を固定化HELに標識されたビオチンに作用させる。この作用により生じるビオチンーアビジン反応により磁性微粒子を特異的に結合させる。
(6)最後にPBS−T0.1−N100バッファーで洗浄後、磁気センサー面をN2ガスで乾燥させて磁気検出する。
本実施例の標的物質検出素子を利用すると、標的物質の濃度に依存して検出できる磁気強度に良好な相関を示すことが期待できる。ホールセンサーでは、磁界検出領域よりも小さな領域に局所定な磁界が印加される場合には、その磁界の印加場所によって、信号強度が異なる。つまり、従来のように磁界検出領域内でランダムに磁気微粒子が固定される場合には、磁気微粒子の固定される位置によって信号強度が異なり、磁気微粒子の数を精度良く検出することができない。一方、本発明にかかるセンサー素子では、印加磁界の大きさと検出信号の大きさの比が一定である位置に磁気微粒子を固定することができるので、磁気微粒子の数を精度良く検出することが可能となる。さらに、本実施例の標的物質検出素子は固定化した標的物質捕捉体の配向性の向上と磁場強度の強い領域への効果的な固定により、検出限界を従来のものに比べてよくする効果が期待できる。
2 検出基板
3 標的物質捕捉体
4 第一の層
5 第二の層
6 標的物質捕捉部位
7 第一のペプチド領域
8 第二のペプチド領域
9 検出部
10 基材
11 中間層
12 ブロッキング層
13 ブロッキング層との外側隣接層
14 リンカー
15 第三のペプチド領域
17 コリメータレンズ
18 素子
19 インレット
20 アウトレット
21 反応ウエル
22 基板
23 分光光度計
Claims (7)
- 検体中の標的物質の有無もしくは濃度を検出する標的物質検出素子であって、
前記標的物質検出素子が、少なくとも、複数の層からなる検出基板と、該検出基板の表面
に固定された標的物質捕捉体とからなり、
前記標的物質捕捉体が、前記標的物質を捕捉するための標的物質捕捉部位と、前記検出基板を構成する複数の層のうちの第一の層を特異的に認識して結合する第一のペプチド領域と、前記複数の層のうちの前記第一の層とは異なる第二の層を特異的に認識して結合する第二のペプチド領域とを少なくとも有し、
前記第一の層と前記第二の層は隣接していることを特徴とする標的物質検出素子。 - 前記第一の層と前記第二の層は層を構成する材料が異なることを特徴とする請求項1に
記載の標的物質検出素子。 - 前記標的物質捕捉体は、前記第一のペプチド領域と前記第二のペプチド領域との間に、
一以上のアミノ酸からなるリンカーを有していることを特徴とする請求項1または2に記
載の標的物質検出素子。 - 前記第一のペプチド領域と第二のペプチド領域とはアミノ酸配列が異なることを特徴と
する請求項1乃至3のいずれかに記載の標的物質検出素子。 - 前記第一の層が検出部であることを特徴とする請求項1乃至4のいずれかに記載の標的
物質検出素子。 - 標的物質検出素子の製造方法であって、
前記標的物質を捕捉するための標的物質捕捉部位と、検出基板を構成する複数の層のうちの第一の層を特異的に認識して結合する第一のペプチド領域と、前記複数の層のうちの前記第一の層とは異なる第二の層を特異的に認識して結合する第二のペプチド領域とを有する標的物質捕捉体を用意する工程と、
前記標的物質捕捉体を、前記検出基板に接触させることで、前記標的物質捕捉体が有する第一のペプチド領域を前記検出基板が有する第一の層に結合させ、かつ前記標的物質捕捉体が有する第二のペプチド領域を前記検出基板が有する第二の層に結合させる工程と、
前記標的物質捕捉体が少なくとも前記第一の層および第二の層の両方を特異的に認識して結合している場合の結合強度と、前記標的物質捕捉体が前記第一の層もしくは前記第二の層のいずれかのみを特異的に認識して結合している場合の結合強度の差を利用して、前記第一の層のみもしくは前記第二の層のみを特異的に認識して結合している標的物質捕捉体を取り除く工程と、
を有することを特徴とする標的物質検出素子の製造方法。 - 検体中の標的物質の有無もしくは濃度を検出する標的物質検出方法であって、
少なくとも、複数の層からなる検出基板と、該検出基板の表面に固定された標的物質捕捉
体とからなる前記標的物質検出素子に検体を接触させる工程と、
前記標的物質検出素子からシグナルを得る工程と、
を有し、
前記標的物質検出素子が有する前記標的物質捕捉体が、前記標的物質を捕捉するための標的物質捕捉部位と、前記検出基板を構成する複数の層のうちの第一の層を特異的に認識して結合する第一のペプチド領域と、前記複数の層のうちの前記第一の層とは異なる第二の層を特異的に認識して結合する第二のペプチド領域とを有し、
前記第一の層と前記第二の層は隣接していることを特徴とする標的物質検出方法。
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