JP2006234712A - Dna immobilization method - Google Patents
Dna immobilization method Download PDFInfo
- Publication number
- JP2006234712A JP2006234712A JP2005052664A JP2005052664A JP2006234712A JP 2006234712 A JP2006234712 A JP 2006234712A JP 2005052664 A JP2005052664 A JP 2005052664A JP 2005052664 A JP2005052664 A JP 2005052664A JP 2006234712 A JP2006234712 A JP 2006234712A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- dna
- group
- substrate
- immobilized
- modified
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Landscapes
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
Abstract
Description
本発明は、オリゴＤＮＡ鎖を所定のプラスチック基板表面に固定化する方法に関する。 The present invention relates to a method for immobilizing oligo DNA strands on a predetermined plastic substrate surface.
現在、細胞や生体組織試料に由来する多数の遺伝子産物であるｍＲＮＡの測定には、選択的な核酸のハイブリダイゼーション法と多数の核酸固定化技術を組み合わせたＤＮＡマイクロアレイやＤＮＡチップと呼ばれる同時に多数の遺伝子発現量を測定方法が存在する。多様な生物の全遺伝子機能や一遺伝子変異多型（ＳＮＰ）などを効率的に解析するためのＤＮＡマイクロアレイに関した技術開発が進んでおり、従来は、スライドガラスなどの基板表面に固定化した遺伝子の一部分と標的遺伝子断片の間でのハイブリダイゼーションによる検査・分析が利用されている。ＤＮＡチップとは、スライドガラス等の平板担体に多数のオリゴヌクレオチド又はＤＮＡ分子を整列させたマイクロアレイである。マイクロアレイ基板を用いる遺伝子解析技術は、創薬研究、疾病の診断法やその予防法の開発、環境問題対策（水質汚染、微生物、環境ホルモン等）の研究開発に新しい手段を提供するものとして期待されている。 At present, many gene products derived from cells and biological tissue samples are measured for mRNA, and a large number of DNA microarrays and DNA chips, which are a combination of selective nucleic acid hybridization methods and many nucleic acid immobilization techniques, are used at the same time. There are methods for measuring gene expression levels. Technological development related to DNA microarrays for efficient analysis of all-gene functions and single-gene variant polymorphisms (SNPs) of diverse organisms has progressed, and conventionally, genes immobilized on the surface of substrates such as glass slides Examination / analysis by hybridization between a part of the target gene fragment and the target gene fragment is used. A DNA chip is a microarray in which a large number of oligonucleotides or DNA molecules are aligned on a flat carrier such as a slide glass. Gene analysis technology using microarray substrates is expected to provide new means for drug discovery research, development of disease diagnosis and prevention methods, and research and development of countermeasures for environmental problems (water pollution, microorganisms, environmental hormones, etc.) ing.
ＤＮＡチップ技術が具体化してきたのは、ＤＮＡの塩基配列をオリゴヌクレオチドやＤＮＡ断片とのハイブリダイゼーションによって決定できるという発見に始まった。ＤＮＡチップ、マイクロアレイの作製技術が開発され、（多数の）遺伝子発現を対象としてその変異や多型などを短時間で効率よく調べることが可能となった。ＤＮＡチップは、種々の遺伝子に対応した多数のオリゴヌクレオチドまたはＤＮＡの断片（プローブともいう）を、チップの固体表面に整列させて固定化し、固定した多数のプローブをマトリックスに形成した素子である。通常、1枚のＤＮＡチップ上には、数千から数万のオリゴヌクレオチド個体が固定化されていた。 The realization of DNA chip technology began with the discovery that the base sequence of DNA can be determined by hybridization with oligonucleotides or DNA fragments. Development techniques for DNA chips and microarrays have been developed, and it has become possible to efficiently examine mutations and polymorphisms in a short time with respect to gene expression. A DNA chip is an element in which a large number of oligonucleotides or DNA fragments (also referred to as probes) corresponding to various genes are aligned and immobilized on a solid surface of the chip, and a large number of immobilized probes are formed in a matrix. Usually, thousands to tens of thousands of oligonucleotide individuals were immobilized on one DNA chip.
ＤＮＡチップを用いる方法では、逆転写酵素反応を用いて、生体試料としてのｍＲＮＡ（メッセンジャーＲＮＡ）のｃＤＮＡ（相補的なＤＮＡ）を合成し、断片化した後に各断片に蛍光標識をつけて標識化ＤＮＡ断片とする。これらの標識化ＤＮＡ断片をＤＮＡチップに接触させ、固定化させてあるオリゴヌクレオチドまたはＤＮＡ断片にハイブリダイゼーションさせる。標識化ＤＮＡ断片は配列が相補的なオリゴヌクレオチドまたはＤＮＡ断片と二本鎖を形成・保持され、過剰量の標識化ＤＮＡ断片は、洗浄操作で除去される。その後、蛍光測定によって保持された標識化ＤＮＡ断片の量及び位置を検出し、対応するオリゴヌクレオチドまたはＤＮＡ断片の種類を調べる。この方法は配列既知の遺伝子の発現をモニターするのに適している。ｃＤＮＡの代わりに、ゲノムＤＮＡ断片のポリメラーゼ複製連鎖反応（Polymerase Chain Reaction；ＰＣＲと略す）を用いて増幅・蛍光標識化して、同様にプローブとの遺伝子相同性を調べることもできる。 In the method using a DNA chip, cDNA (complementary DNA) of mRNA (messenger RNA) as a biological sample is synthesized using a reverse transcriptase reaction, fragmented, and then labeled with a fluorescent label. DNA fragment. These labeled DNA fragments are brought into contact with a DNA chip and hybridized to immobilized oligonucleotides or DNA fragments. The labeled DNA fragment forms and retains a double strand with an oligonucleotide or DNA fragment having a complementary sequence, and an excessive amount of the labeled DNA fragment is removed by a washing operation. Thereafter, the amount and position of the labeled DNA fragment retained by fluorescence measurement is detected, and the type of the corresponding oligonucleotide or DNA fragment is examined. This method is suitable for monitoring the expression of genes of known sequence. Instead of cDNA, amplification and fluorescence labeling can be carried out by using polymerase chain reaction (PCR) for genomic DNA fragments, and gene homology with the probe can be similarly examined.
ＤＮＡ固定化マイクロアレイは、スライドガラス或いはシリコン基板表面等にポリ−L−リジン等の高分子を塗布し、その後にＤＮＡを固定する方法により製造されている。また、フォトリソグラフ等の半導体技術を用いてガラス基板上にオリゴヌクレオチドを合成する製造方法も知られている。マイクロアレイの作製法は、既に種々のものが公知である（例えば、特許文献１、非特許文献１、非特許文献２を参照）。 The DNA-immobilized microarray is manufactured by a method in which a polymer such as poly-L-lysine is applied to a glass slide or a silicon substrate surface and the DNA is then immobilized. In addition, a production method for synthesizing an oligonucleotide on a glass substrate using a semiconductor technique such as photolithography is also known. Various microarray fabrication methods are already known (see, for example, Patent Document 1, Non-Patent Document 1, and Non-Patent Document 2).
一般的なＤＮＡチップ作成方法は、固定化するオリゴヌクレオチドを有機合成により事前に準備し、そのオリゴヌクレオチドまたはＤＮＡ断片をスライドガラスなどの基板表面に微量滴下し、その位置に共有結合等によって固定化する。例えば、基板表面にアミノ基と反応する官能基のイソチオシアネート基または活性エステル基を導入しておき、オリゴヌクレオチドの５'末端をアミノ基にしておけば、任意の位置にオリゴヌクレオチドを共有結合によって容易に固定化することができる。 A general method for preparing a DNA chip is to prepare an oligonucleotide to be immobilized in advance by organic synthesis, drop a small amount of the oligonucleotide or DNA fragment onto the surface of a substrate such as a glass slide, and immobilize it by covalent bonding or the like. To do. For example, if an isothiocyanate group or active ester group of a functional group that reacts with an amino group is introduced on the substrate surface, and the 5 ′ end of the oligonucleotide is an amino group, the oligonucleotide is covalently bonded to an arbitrary position. It can be easily fixed.
しかし、スライドガラス或いはシリコン基板表面にポリ−L−リジン等の高分子を塗布して長鎖ＤＮＡを固定する方法並びにイソチオシアネート基または活性エステル基を導入しておき、５'末端アミノ化したオリゴヌクレオチドを固定化する方法では、核酸（長鎖ＤＮＡ又は短鎖オリゴヌクレオチド）の固定化状態が不安定であり、ターゲット遺伝子とハイブリダイゼーション工程中やその後の洗浄工程において、核酸が剥がれ落ちやすい。結果として検出感度が下がることがあり、又、再現性が得られない等の欠点がある。更に、この方法では、比較的長い核酸は固定できるが、１００ｍｅｒ以下の５’末端無修飾またはリン酸修飾した短いオリゴヌクレオチドになると、効率よく固定化できないという欠点がある。一方、半導体技術を用いたＤＮＡ固定化マイクロアレイに於いては、固相合成できるオリゴヌクレオチドの塩基鎖長は２０数塩基であるという技術的課題に加えて、極めて特殊な機械と試薬を必要で製造工程の煩雑さから非常に高価であるという問題がある。 However, a method of immobilizing long-chain DNA by applying a polymer such as poly-L-lysine on the surface of a glass slide or a silicon substrate, and an oligo in which an isothiocyanate group or an active ester group is introduced and the 5 ′ terminal is aminated In the method for immobilizing nucleotides, the immobilization state of the nucleic acid (long-chain DNA or short-chain oligonucleotide) is unstable, and the nucleic acid tends to peel off during the hybridization with the target gene or in the subsequent washing step. As a result, the detection sensitivity may be lowered, and there are disadvantages such that reproducibility cannot be obtained. Furthermore, in this method, a relatively long nucleic acid can be immobilized, but there is a drawback that it cannot be immobilized efficiently if it becomes a short oligonucleotide of 5mer end unmodified or phosphate modified of 100 mer or less. On the other hand, in the DNA-immobilized microarray using semiconductor technology, in addition to the technical problem that the base chain length of oligonucleotides capable of solid-phase synthesis is more than 20 bases, it requires extremely special machines and reagents. There is a problem that it is very expensive due to the complexity of the process.
以上の問題に鑑み、短鎖の５’末端無修飾またはリン酸修飾された合成オリゴヌクレオチドを容易に固定化できるＤＮＡの固定化方法が切望されている。
本発明は、短鎖の５’末端無修飾またはリン酸修飾されたＤＮＡの固定化量が高く、それらＤＮＡと基板表面間の結合強度が著しく向上し、更に、熱安定性の高いＤＮＡの固定化方法を提供することを目的とする。 The present invention has a high amount of immobilization of short-chain 5'-end unmodified or phosphate-modified DNA, markedly improves the bond strength between the DNA and the substrate surface, and further immobilizes DNA with high thermal stability. The purpose is to provide a conversion method.
本発明者は、前記従来技術の問題点を克服するために鋭意研究した結果、ホスホリルコリン基を有する第一単位と電子求引性の置換基がカルボニル基に結合して活性化されたカルボン酸誘導基を有する第二単位とを含む高分子物質を表面に有する基板と５’末端無修飾またはリン酸修飾されたＤＮＡの塩基部位に存在するアミノ基の間で共有結合させ固定化する方法を見出した。即ちＤＮＡの塩基部分(アデニン、グアニン、シトシン)のアミノ基NH2と基板表面の電子求引性の置換基がカルボニル基に結合して活性化されたカルボン酸誘導基との間でアミド結合を作成させることによってＤＮＡを基板に固定化させた短鎖の５’末端無修飾またはリン酸修飾された合成オリゴヌクレオチドは、強固にＤＮＡを保持す能力を持ちかつ、ハイブリ効率も高いＤＮＡマイクロアレイ用基板の作製が可能であることをあることを見出した。 As a result of diligent research to overcome the problems of the prior art, the present inventor has found that a first unit having a phosphorylcholine group and an electron-attracting substituent are bonded to a carbonyl group and activated. A method of covalently bonding and immobilizing between a substrate having a macromolecular substance containing a second unit having a group on the surface and an amino group present at the base site of DNA not modified or phosphate-modified at the 5 ′ end. It was. That is, an amide bond is formed between the amino group NH 2 of the base portion of DNA (adenine, guanine, cytosine) and the carboxylic acid derivative group activated by binding of the electron-withdrawing substituent on the substrate surface to the carbonyl group. Synthetic oligonucleotides with short 5 'end unmodified or phosphate modified DNA immobilized on the substrate by making them have the ability to hold DNA firmly and have high hybridization efficiency DNA microarray substrate It has been found that there is a possibility of production.
この方法により、安価な無修飾合成オリヌクレオチドを使用した非常に経済的なＤＮＡマイクロアレイ作成が可能となり、遺伝子工学、分子生物学、生化学の諸分野や遺伝子診断の医療分野において効率的に遺伝子機能解明ができるＤＮＡマイクロアレイ基板が提供されることを見出して本発明を完成するに至った。 This method enables the creation of highly economical DNA microarrays using inexpensive unmodified synthetic oligonucleotides, and enables efficient gene function in various fields of genetic engineering, molecular biology, biochemistry, and medical fields of genetic diagnosis. The present invention has been completed by finding that a DNA microarray substrate that can be solved is provided.
本発明のＤＮＡの固定化方法によれば、安定した経済的なＤＮＡマイクロアレイ作製が可能となる。遺伝子工学、分子生物学、生化学の諸分野や遺伝子診断の医療分野において効率的に遺伝子機能解明ができるＤＮＡマイクロアレイが提供される。 According to the DNA immobilization method of the present invention, a stable and economical DNA microarray can be produced. Provided is a DNA microarray capable of efficiently elucidating gene functions in various fields of genetic engineering, molecular biology, biochemistry, and medical fields of genetic diagnosis.
以下、本発明の実施形態について詳細に説明する。 Hereinafter, embodiments of the present invention will be described in detail.
本発明においてＤＮＡの固定化を行う方法は、固定化するオリゴヌクレオチドを化学合成する時に、その５'末端側に無修飾（ＯＨ）またはリン酸基を有する分子を共有結合させておく。 In the method of immobilizing DNA in the present invention, when chemically immobilizing an oligonucleotide to be immobilized, a molecule having an unmodified (OH) or phosphate group is covalently bonded to the 5 ′ end side.
本発明に使用される基板の表面には、ホスホリルコリン基を有する第一単位とカルボン酸誘導基を有する第二単位とを含む高分子物質が存在するようになっている。 A polymer material containing a first unit having a phosphorylcholine group and a second unit having a carboxylic acid-derived group is present on the surface of the substrate used in the present invention.
このホスホリルコリン基を含む第一単位と電子求引性の置換基がカルボニル基に結合して活性化されたカルボン酸誘導基を含む第二単位とを有する高分子物質は、検体溶液中の核酸の非特異的吸着を抑制する性質とＤＮＡ鎖を固定化する性質とを併せ持つポリマーである。特に、第一単位に含まれるホスホリルコリン基は検体溶液中の核酸の非特異的吸着を抑制する役割を果たし、第二単位に含まれる電子求引性の置換基がカルボニル基に結合して活性化されたカルボン酸誘導基は短鎖の５'末端無修飾又はリン酸修飾されたＤＮＡが化学的に固定化する役割を果たす。すなわち、短鎖の５'末端無修飾又はリン酸修飾されたＤＮＡは、前記このコーティング層のカルボン酸誘導基の部位で共有結合して、当該基板の表面に固定化される。 The polymer substance having the first unit containing the phosphorylcholine group and the second unit containing the carboxylic acid derivative group activated by binding of an electron-withdrawing substituent to the carbonyl group is a nucleic acid in the sample solution. It is a polymer having both the property of suppressing non-specific adsorption and the property of immobilizing DNA strands. In particular, the phosphorylcholine group contained in the first unit plays a role in suppressing non-specific adsorption of nucleic acids in the sample solution, and the electron-withdrawing substituent contained in the second unit binds to the carbonyl group and is activated. The resulting carboxylic acid-derived group serves to chemically immobilize short-chain 5′-terminal unmodified or phosphate-modified DNA. That is, short-chain 5′-end unmodified or phosphate-modified DNA is covalently bonded at the site of the carboxylic acid derivative group of the coating layer and immobilized on the surface of the substrate.
ホスホリルコリン基を含む第一の単位は、たとえば、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン基、６−メタクリロイルオキシヘキシルホスホリルコリン基等の（メタ）アクリロイルオキシアルキルホスホリルコリン基；
２−メタクリロイルオキシエトキシエチルホスホリルコリン基および１０−メタクリロイルオキシエトキシノニルホスホリルコリン基等の（メタ）アクリロイルオキシアルコキシアルキルホスホリルコリン基；
アリルホスホリルコリン基、ブテニルホスホリルコリン基、ヘキセニルホスホリルコリン基、オクテニルホスホリルコリン基、およびデセニルホスホリルコリン基等のアルケニルホスホリルコリン基；
等の基を有し、ホスホリルコリン基がこれらの基中に含まれている構成とすることができる。
The first unit containing a phosphorylcholine group is, for example, a (meth) acryloyloxyalkylphosphorylcholine group such as a 2-methacryloyloxyethyl phosphorylcholine group, a 6-methacryloyloxyhexyl phosphorylcholine group;
(Meth) acryloyloxyalkoxyalkylphosphorylcholine groups such as 2-methacryloyloxyethoxyethyl phosphorylcholine group and 10-methacryloyloxyethoxynonylphosphorylcholine group;
Alkenylphosphorylcholine groups such as allylphosphorylcholine group, butenylphosphorylcholine group, hexenylphosphorylcholine group, octenylphosphorylcholine group, and decenylphosphorylcholine group;
And a phosphorylcholine group is included in these groups.
また、これらの基のうち、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンが好ましい。第一単位が２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンを有する構成とすることにより、基板表面における検体溶液中の核酸の非特異的吸着をより一層確実に抑制することができる。 Of these groups, 2-methacryloyloxyethyl phosphorylcholine is preferable. By adopting a configuration in which the first unit has 2-methacryloyloxyethyl phosphorylcholine, nonspecific adsorption of nucleic acid in the sample solution on the substrate surface can be more reliably suppressed.
電子求引性の置換基がカルボニル基に結合して活性化されたカルボン酸誘導基は、カルボン酸のカルボキシル基が活性化されたものであり、Ｃ＝Ｏを介して脱離基を有するカルボン酸である。カルボン酸誘導体は、具体的には、アルコキシル基よりも電子求引性の高い基がカルボニル基に結合して求核反応が活性化された化合物である。カルボン酸誘導基は、アミノ基、チオール基、水酸基等に対する反応性を有する化合物である。 The carboxylic acid derivative group in which the electron-withdrawing substituent is activated by bonding to the carbonyl group is an activated carboxyl group of carboxylic acid, and has a carboxyl group having a leaving group via C═O. It is an acid. Specifically, the carboxylic acid derivative is a compound in which a nucleophilic reaction is activated by bonding a group having higher electron withdrawing property than an alkoxyl group to a carbonyl group. The carboxylic acid derivative group is a compound having reactivity with an amino group, a thiol group, a hydroxyl group and the like.
活性化されたカルボン酸誘導体として、さらに具体的には、カルボン酸であるアクリル酸、メタクリル酸、クロトン酸、マレイン酸、フマル酸などのカルボキシル基が、酸無水物、酸ハロゲン化物、活性エステル、活性化アミドに変換された化合物が挙げられる。カルボン酸誘導基は、こうした化合物に由来する活性化された基であり、たとえば、ｐ−ニトロフェニル基やＮ−ヒドロキシスクシンイミド基等の活性エステル基；
―Ｃｌ、−Ｆ等のハロゲン；
等の基を有することができる。
More specifically, as the activated carboxylic acid derivative, carboxyl groups such as acrylic acid, methacrylic acid, crotonic acid, maleic acid, and fumaric acid, which are carboxylic acids, are acid anhydrides, acid halides, active esters, Examples include compounds converted to activated amides. Carboxylic acid-derived groups are activated groups derived from such compounds, for example, active ester groups such as p-nitrophenyl groups and N-hydroxysuccinimide groups;
-Halogen such as Cl, -F;
And the like.
また、カルボン酸誘導基は、下記式（１）に示される基とすることができる。 The carboxylic acid derivative group can be a group represented by the following formula (1).
上記式（１）に示される一価の基は、たとえば下記式（ｐ）または式（ｑ）から選択されるいずれかの基とすることができる。 The monovalent group represented by the above formula (1) can be, for example, any group selected from the following formula (p) or formula (q).
（ただし、上記式（ｐ）および式（ｑ）において、Ｒ1およびＲ2は、それぞれ独立して、一価の有機基であり、直鎖状、分岐状、および環状のいずれであってもよい。また、上記式（ｐ）において、Ｒ1はＣとともに環を形成する二価の基であってもよい。また、上記式（ｑ）において、Ｒ2はＮとともに環を形成する二価の基であってもよい。） (However, in the above formulas (p) and (q), R 1 and R 2 are each independently a monovalent organic group, which may be linear, branched, or cyclic. In Formula (p), R 1 may be a divalent group that forms a ring with C. In Formula (q), R 2 is a divalent group that forms a ring with N. It may be a group of
上記式（ｐ）に示される基として、たとえば下記式（ｒ）、（ｓ）、および（ｗ）に示される基が挙げられる。また、上記式（ｑ）に示される基として、たとえば下記式（ｕ）に示される基が挙げられる。 Examples of the group represented by the formula (p) include groups represented by the following formulas (r), (s), and (w). Moreover, as group shown by the said formula (q), group shown by following formula (u) is mentioned, for example.
上記式（１）に示される基は、たとえば下記式（ｒ）、式（ｓ）等に示される酸無水物由来の基；
下記式（ｔ）に示される酸ハロゲン化物由来の基；
下記式（ｕ）、式（ｗ）に示される活性エステル由来の基；または
下記式（ｖ）に示される活性化アミド由来の基とすることができる。
A group derived from an acid halide represented by the following formula (t);
A group derived from an active ester represented by the following formula (u) or formula (w); or a group derived from an activated amide represented by the following formula (v).
カルボン酸誘導基のうち、活性エステル基は、穏やかな条件における反応性に優れるため、好ましく用いられる。穏やかな条件としては、たとえば中性またはアルカリ性の条件、具体的にはｐＨ７．０以上１０．０以下、さらに具体的にはｐＨ７．６以上９．０以下、さらにまた具体的にはｐＨ８．０とすることができる。 Of the carboxylic acid-derived groups, an active ester group is preferably used because of its excellent reactivity under mild conditions. The mild conditions include, for example, neutral or alkaline conditions, specifically pH 7.0 or more and 10.0 or less, more specifically pH 7.6 or more and 9.0 or less, and more specifically pH 8.0. It can be.
また、本明細書において規定するところの「活性エステル基」は、その定義について厳密な規定はなされていないが、慣用の技術表現としては、エステル基のアルコール側に酸性度の高い電子求引性基を有して求核反応を活性化するエステル群、すなわち反応活性の高いエステル基を意味するものとして、各種の化学合成、たとえば高分子化学、ペプチド合成等の分野で慣用されているものである。なお、ペプチド合成の分野においては、泉屋信夫、加藤哲夫、青柳東彦、脇道典著、「ペプチド合成の基礎と実験」、１９８５年発行、丸善、に記載されているように、活性エステル法はアミノ酸またはペプチドのＣ末端を活性化する方法の一つとして用いられている。 In addition, the definition of “active ester group” as defined in this specification is not strictly defined. However, as a conventional technical expression, an electron withdrawing property having high acidity on the alcohol side of the ester group. An ester group having a group and activating a nucleophilic reaction, that is, an ester group having a high reaction activity, is commonly used in various chemical synthesis fields such as polymer chemistry and peptide synthesis. is there. In the field of peptide synthesis, as described in Nobuo Izumiya, Tetsuo Kato, Toshihiko Aoyagi, Noriaki Waki, “Basics and Experiments of Peptide Synthesis”, published in 1985, Maruzen, It is used as one of the methods for activating the C-terminus of amino acids or peptides.
実際的には、エステル基のアルコール側に、電子求引性の基を有し、アルキルエステルよりも活性化されたエステル基である。活性エステル基は、アミノ基、チオール基、水酸基等の基に対する反応性を有する。さらに具体的には、フェノールエステル類、チオフェノールエステル類、Ｎ−ヒドロキシアミンエステル類、シアノメチルエステル、複素環ヒドロキシ化合物のエステル類等がアルキルエステル等に比べてはるかに高い活性を有する活性エステル基として知られている。 Actually, the ester group has an electron-attracting group on the alcohol side of the ester group and is activated more than the alkyl ester. The active ester group has reactivity with groups such as amino group, thiol group, and hydroxyl group. More specifically, an active ester group in which phenol esters, thiophenol esters, N-hydroxyamine esters, cyanomethyl esters, esters of heterocyclic hydroxy compounds, etc. have much higher activity than alkyl esters etc. Known as.
ここでは、高分子物質中の活性化カルボン酸誘導体基が活性エステル基である場合を例に、説明する。活性エステル基としては、たとえばｐ−ニトロフェニル基、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド基、コハク酸イミド基、フタル酸イミド基、5−ノルボルネン-2,3-ジカルボキシイミド基等が挙げられるが、たとえばｐ−ニトロフェニル基が好ましく用いられる。 Here, the case where the activated carboxylic acid derivative group in the polymer substance is an active ester group will be described as an example. Examples of the active ester group include p-nitrophenyl group, N-hydroxysuccinimide group, succinimide group, phthalimide group, 5-norbornene-2,3-dicarboximide group, and the like. A nitrophenyl group is preferably used.
第一単位と第二単位のさらに具体的な構成の組み合わせとして、たとえば、ホスホリルコリン基を含む第一単位が２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン基を有し、活性エステル基がｐ−ニトロフェニル基である構成とすることができる。 As a combination of more specific configurations of the first unit and the second unit, for example, a configuration in which the first unit containing a phosphorylcholine group has a 2-methacryloyloxyethyl phosphorylcholine group and the active ester group is a p-nitrophenyl group It can be.
また、本実施形態の基板のコーティング層に使用される高分子物質は、ホスホリルコリン基およびカルボン酸誘導基以外に他の基を含んでもよい。また、高分子物質は共重合体とすることができる。具体的には、高分子物質がブチルメタクリレート基を含む共重合体であることが好ましい。こうすることにより、高分子物質を適度に疎水化し、この高分子物質の基板表面への吸着性をさらに好適に確保することができる。 Further, the polymer substance used for the coating layer of the substrate of this embodiment may contain other groups in addition to the phosphorylcholine group and the carboxylic acid derivative group. The polymer substance can be a copolymer. Specifically, the polymer substance is preferably a copolymer containing a butyl methacrylate group. By so doing, the polymer substance can be appropriately hydrophobized, and the adsorptivity of the polymer substance to the substrate surface can be more suitably ensured.
具体的には、高分子物質を、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン（ＭＰＣ）基を有する第一単量体と、ｐ−ニトロフェニルカルボニルオキシエチルメタクリレート（ＮＰＭＡ）基を有する第二単量体と、ブチルメタリレート（ＢＭＡ）基を有する第三単量体との共重合体とすることができる。これらの共重合体であるｐｏｌｙ（ＭＰＣ−ｃｏ−ＢＭＡ−ｃｏ−ＮＰＭＡ）（ＰＭＢＮ）は、模式的に下記一般式（２）で示される。 Specifically, the polymer substance is composed of a first monomer having a 2-methacryloyloxyethyl phosphorylcholine (MPC) group, a second monomer having a p-nitrophenylcarbonyloxyethyl methacrylate (NPMA) group, A copolymer with a third monomer having a butyl metallate (BMA) group can be obtained. These copolymers, poly (MPC-co-BMA-co-NPMA) (PMBN), are schematically represented by the following general formula (2).
ただし、上記一般式（２）において、ａ、ｂ、およびｃは、それぞれ独立して、正の整数である。また、上記一般式（２）において、第一〜第三単量体がブロック共重合していてもよいし、これらの単量体がランダムに共重合していてもよい。 However, in the said General formula (2), a, b, and c are respectively independently a positive integer. In the general formula (2), the first to third monomers may be block copolymerized, or these monomers may be copolymerized randomly.
上記一般式（２）で示される共重合体は、高分子物質の適度な疎水化と、検体溶液中の核酸の非特異吸着を抑制する性質と、短鎖の５'末端無修飾又はリン酸修飾されたＤＮＡを固定化する性質とのバランスとに、より一層優れた構成である。このため、このような共重合体を用いることにより、基板表面をより一層確実に高分子物質で被覆するとともに、高分子物質がコーティングされた基板上への検体溶液中の核酸の非特異的吸着を抑制しつつ、短鎖の５'末端無修飾又はリン酸修飾されたＤＮＡをさらに確実に共有結合により固定化して基板上に導入することができる。 The copolymer represented by the general formula (2) has an appropriate hydrophobic property of a high molecular weight substance, a property of suppressing nonspecific adsorption of a nucleic acid in a sample solution, an unmodified short 5 ′ end or a phosphate. The structure is even more excellent in balance with the property of immobilizing the modified DNA. Therefore, by using such a copolymer, the surface of the substrate is more reliably coated with the polymer material, and nonspecific adsorption of the nucleic acid in the sample solution onto the substrate coated with the polymer material is performed. In this way, short-chain 5′-end unmodified or phosphate-modified DNA can be more reliably immobilized by covalent bonding and introduced onto the substrate.
なお、上記一般式（２）で示される共重合体は、ＭＰＣ、ＢＭＡ、およびＮＰＭＡの各単量体を混合し、ラジカル重合等の公知の重合方法により得ることができる。上記一般式（２）で示される共重合体をラジカル重合により作製する場合、たとえば、Ａｒ等の不活性ガス雰囲気にて、３０℃以上９０℃以下の温度条件で溶液重合を行うことができる。 The copolymer represented by the general formula (2) can be obtained by mixing MPC, BMA, and NPMA monomers and using a known polymerization method such as radical polymerization. When the copolymer represented by the general formula (2) is prepared by radical polymerization, solution polymerization can be performed, for example, in an inert gas atmosphere such as Ar under a temperature condition of 30 ° C. or higher and 90 ° C. or lower.
溶液重合に使用される溶媒は適宜選択されるが、たとえば、メタノール、エタノール、イソプロパノール等のアルコールや、ジエチルエーテル等のエーテル、クロロホルム等の有機溶媒を単独でまたは複数混合して用いることができる。具体的には、ジエチルエーテルとクロロホルムを体積比で８対２とした混合溶媒とすることができる。 The solvent used for the solution polymerization is appropriately selected. For example, alcohols such as methanol, ethanol and isopropanol, ethers such as diethyl ether, and organic solvents such as chloroform can be used alone or in combination. Specifically, a mixed solvent in which diethyl ether and chloroform are in a volume ratio of 8 to 2 can be obtained.
また、ラジカル重合反応に使用されるラジカル重合開始剤としては、通常使用されるものを用いることができる。たとえば、アゾビスイソブチロニトリル（ＡＩＢＮ）、アゾビスバレロニトリル等のアゾ系開始剤；
過酸化ラウロイル、過酸化ベンゾイル、ｔ−ブチルペルオキシネオデカノエート、ｔ−ブチルペルオキシピバレート等の油溶性の有機過酸化物；
などが用いられる。
Moreover, what is used normally can be used as a radical polymerization initiator used for radical polymerization reaction. For example, azo initiators such as azobisisobutyronitrile (AIBN) and azobisvaleronitrile;
Oil-soluble organic peroxides such as lauroyl peroxide, benzoyl peroxide, t-butylperoxyneodecanoate, t-butylperoxypivalate;
Etc. are used.
さらに具体的には、ジエチルエーテルとクロロホルムを体積比で８対２とした混合溶媒およびＡＩＢＮを用い、Ａｒ中、６０℃にて２〜６時間程度重合を行うことができる。 More specifically, polymerization can be carried out in Ar at 60 ° C. for about 2 to 6 hours using a mixed solvent of diethyl ether and chloroform in a volume ratio of 8 to 2 and AIBN.
なお、本実施形態では、高分子物質がブチルメタクリレート基を含む第三単位を有する例を説明したが、ホスホリルコリン基を含む第一単位とカルボン酸誘導基を含む第二単位とを有する高分子物質を第一の高分子物質とし、これに加えて、ホスホリルコリン基を含む第一単位とブチルメタクリレート基を含む第三単位とを有する第二の高分子物質を含んでいてもよい。 In this embodiment, the example in which the polymer substance has a third unit containing a butyl methacrylate group has been described. However, the polymer substance having a first unit containing a phosphorylcholine group and a second unit containing a carboxylic acid derivative group. In addition to this, a second polymer material having a first unit containing a phosphorylcholine group and a third unit containing a butyl methacrylate group may be included.
なお、上記第一の高分子物質の第一単位と上記第二の高分子物質の第一単位とは同一構造であってもよいし、異なる構造であってもよい。また、上記第一の高分子物質がブチルメタクリレート基を含む第三単位を含むとき、この第一の高分子物質の第三単位と上記第二の高分子物質の第三単位とは同一構造であってもよいし、異なる構造であってもよい。 The first unit of the first polymer substance and the first unit of the second polymer substance may have the same structure or different structures. In addition, when the first polymer substance includes a third unit containing a butyl methacrylate group, the third unit of the first polymer substance and the third unit of the second polymer substance have the same structure. There may be a different structure.
このような第二の高分子物質は、検体溶液中の核酸の非特異的吸着を抑制するポリマーとして用いられる。このようなポリマーとしては、たとえばホスホリルコリン基が３０モル％、ブチルメタクリレート基が７０モル％の割合で含まれているものであるＭＰＣポリマー（日本油脂社製）を用いることができる。 Such a second polymer substance is used as a polymer that suppresses non-specific adsorption of nucleic acids in the sample solution. As such a polymer, for example, an MPC polymer (manufactured by NOF Corporation) containing 30 mol% phosphorylcholine groups and 70 mol% butyl methacrylate groups can be used.
なお、高分子物質が上記第一の高分子物質、第二の高分子物質からなる場合、これらの高分子物質が混合されている構成とすることができる。各々の高分子物質のポリマーは、たとえばエタノール溶液に溶解できるため、それぞれのポリマー溶液を混合することにより容易に混合ポリマーを得ることができる。 In addition, when a high molecular substance consists of said 1st high molecular substance and 2nd high molecular substance, it can be set as the structure by which these high molecular substances are mixed. Since the polymer of each polymer substance can be dissolved in, for example, an ethanol solution, a mixed polymer can be easily obtained by mixing the respective polymer solutions.
以上のような高分子物質からなるコーティング層を表面に含む基板は、所定の形状に加工された基板の表面に高分子物質を含む液体を塗布し、乾燥することにより得られる。また、高分子物質を含む液体中に基板を浸漬し、乾燥してもよい。 The substrate including the coating layer made of the polymer material as described above can be obtained by applying a liquid containing the polymer material to the surface of the substrate processed into a predetermined shape and drying it. Alternatively, the substrate may be immersed in a liquid containing a polymer substance and dried.
また、基板として、プラスチック材料を用いた場合には、形状やサイズの変更に対する柔軟性が確保される上に、ガラス基板のものに比べて安価で提供することができるという観点から好ましい。このようなプラスチック材料としては、表面処理の容易性および量産性の観点から、熱可塑性樹脂を用いることができる。 In addition, when a plastic material is used as the substrate, flexibility in changing the shape and size is secured, and it is preferable from the viewpoint that it can be provided at a lower cost than that of a glass substrate. As such a plastic material, a thermoplastic resin can be used from the viewpoint of easy surface treatment and mass productivity.
熱可塑性樹脂としては、蛍光発生量の少ないものを用いることができる。蛍光発生量の少ない樹脂を用いることにより、ＤＮＡ鎖の検出反応におけるバックグランドを低下させることができるため、検出感度をさらに向上させることができる。蛍光発生量の少ない熱可塑性樹脂としては、たとえば、ポリエチレン、ポリプロピレン等の直鎖状ポリオレフィン；
環状ポリオレフィン；
含フッ素樹脂；
等を用いることができる。上記樹脂の中でも、飽和環状ポリオレフィンは、耐熱性、耐薬品性、低蛍光性、透明性および成形性に特に優れるため、光学的な分析に好適であり、基板の材料として好ましく用いられる。
As a thermoplastic resin, a thing with little fluorescence generation amount can be used. By using a resin with a small amount of fluorescence generation, the background in the detection reaction of the DNA strand can be lowered, and therefore the detection sensitivity can be further improved. Examples of the thermoplastic resin with a small amount of generated fluorescence include linear polyolefins such as polyethylene and polypropylene;
Cyclic polyolefin;
Fluorine-containing resin;
Etc. can be used. Among the above resins, saturated cyclic polyolefin is particularly excellent in heat resistance, chemical resistance, low fluorescence, transparency, and moldability, and therefore is suitable for optical analysis and is preferably used as a substrate material.
ここで、飽和環状ポリオレフィンとは、環状オレフィン構造を有する重合体単独または環状オレフィンとα−オレフィンとの共重合体を水素添加した飽和重合体を指す。前者の例としては、たとえばノルボルネン、ジシクロペンタジエン、テトラシクロドデセンに代表されるノルボルネン系モノマー、及び、これらのアルキル置換体を開環重合して得られる重合体を水素添加して製造される飽和重合体である。後者の共重合体はエチレンやプロピレン、イソプロピレン、１−ブテン、３−メチル−１−ブテン、１−ペンテン、３−メチル−１−ペンテン、１−ヘキセン、１−オクテン等のα−オレフィンと環状オレフィン系モノマーのランダム共重合体を水素添加することにより製造される飽和重合体である。共重合体では、エチレンとの共重合体が最も好ましい。これらの樹脂は単独で用いてもよく、2種類またはそれ以上の共重合体あるいは混合物であってもよい。また、環状オレフィン構造を有する単量体が開環重合して得られる飽和環状ポリオレフィンだけでなく、環状オレフィン構造を有する単量体の付加重合により得られる飽和環状ポリオレフィンを用いることもできる。 Here, the saturated cyclic polyolefin refers to a saturated polymer obtained by hydrogenating a polymer having a cyclic olefin structure or a copolymer of a cyclic olefin and an α-olefin. Examples of the former are produced by hydrogenating norbornene monomers represented by, for example, norbornene, dicyclopentadiene, and tetracyclododecene, and polymers obtained by ring-opening polymerization of these alkyl-substituted products. It is a saturated polymer. The latter copolymer is composed of α-olefin such as ethylene, propylene, isopropylene, 1-butene, 3-methyl-1-butene, 1-pentene, 3-methyl-1-pentene, 1-hexene and 1-octene. It is a saturated polymer produced by hydrogenating a random copolymer of cyclic olefin monomers. As the copolymer, a copolymer with ethylene is most preferable. These resins may be used alone, or two or more copolymers or a mixture may be used. Further, not only a saturated cyclic polyolefin obtained by ring-opening polymerization of a monomer having a cyclic olefin structure, but also a saturated cyclic polyolefin obtained by addition polymerization of a monomer having a cyclic olefin structure can be used.
以上のような高分子物質を表面に含むプラスチック材料からなる基板は、所定の形状に加工された基板の表面に高分子物質を含む液体を塗布し、乾燥することにより得られる。また、高分子物質を含む液体中に基板を浸漬し、乾燥してもよい。 A substrate made of a plastic material including a polymer substance as described above can be obtained by applying a liquid containing the polymer substance to the surface of the substrate processed into a predetermined shape and drying it. Alternatively, the substrate may be immersed in a liquid containing a polymer substance and dried.
なお、基板の材料をプラスチックとした場合、形状は板状には限られず、たとえばフィルム状やシート状であってもよい。具体的には、基板を可とう性のプラスチックフィルムとすることもできる。また、基板は、一つの部材から構成されていてもよいし、複数の部材から構成されていてもよい。 When the substrate material is plastic, the shape is not limited to a plate shape, and may be a film shape or a sheet shape, for example. Specifically, the substrate can be a flexible plastic film. Moreover, the board | substrate may be comprised from one member and may be comprised from the some member.
次に、基板の表面へのＤＮＡの固定化方法について、一例として、電子求引性の置換基がカルボニル基に結合して活性化されたカルボン酸誘導基を有する第二単位が活性エステル基の場合について説明する。 Next, with regard to the method for immobilizing DNA on the surface of a substrate, as an example, the second unit having a carboxylic acid derivative group activated by binding an electron-withdrawing substituent to a carbonyl group is an active ester group. The case will be described.
例えば、（ｉ）基板上の高分子物質に含まれる複数の活性エステル基のうち、少なくとも一部の活性エステル基と短鎖の５'末端無修飾又はリン酸修飾されたＤＮＡとを反応させて共有結合を形成させることにより、基板表面で短鎖の５'末端無修飾又はリン酸修飾されたＤＮＡを固定化し、続いて（ｉｉ）短鎖の５'末端無修飾又はリン酸修飾されたＤＮＡを固定化した以外の基板表面の活性エステル基を不活性化する、すなわち残りの活性エステル基を不活性化することによって、短鎖の５'末端無修飾又はリン酸修飾されたＤＮＡを基板の表面に固定することができる。以下、それぞれの工程について説明する。 For example, (i) among a plurality of active ester groups contained in a polymer substance on a substrate, at least a part of the active ester groups is reacted with short-chain 5′-terminal unmodified or phosphate-modified DNA. Immobilization of short 5′-end unmodified or phosphate-modified DNA on the substrate surface by forming a covalent bond, followed by (ii) short 5′-end unmodified or phosphate-modified DNA Inactivate the active ester group on the substrate surface other than the one immobilized on the substrate, i.e., inactivate the remaining active ester group, thereby converting the short-chain unmodified or phosphate-modified DNA into the substrate. Can be fixed on the surface. Hereinafter, each process will be described.
この短鎖の５'末端無修飾又はリン酸修飾されたＤＮＡを溶解または分散した液体は、例えば中性からアルカリ性、例えばｐＨが７．６以上とすることができる。 The liquid in which the short 5′-end unmodified or phosphate-modified DNA is dissolved or dispersed can be, for example, neutral to alkaline, for example, pH 7.6 or higher.
また、点着後、基板表面に固定化されなかった短鎖の５’末端無修飾又はリン酸修飾されたＤＮＡを除去するため、純水や緩衝液で洗浄してもよい。 In addition, after the spotting, in order to remove short-chain 5′-end unmodified or phosphate-modified DNA that has not been immobilized on the substrate surface, it may be washed with pure water or a buffer solution.
また、上記工程（ｉｉ）に示したように、洗浄後は短鎖の５’末端無修飾又はリン酸修飾されたＤＮＡを固定化した以外のプラスチック基板表面の活性エステルの不活性化処理をアルカリ化合物、あるいは一級アミノ基を有する化合物で行う。 In addition, as shown in the above step (ii), after the washing, the inactive treatment of the active ester on the surface of the plastic substrate other than the immobilization of the short-chain 5′-end unmodified or phosphate-modified DNA is performed with an alkali. The reaction is performed using a compound or a compound having a primary amino group.
アルカリ化合物としては、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、水酸化カルシウム、水酸化マグネシウム、ホウ酸ナトリウム、水酸化リチウム、リン酸カリウムなどを用いることができる。 Examples of the alkali compound include sodium hydroxide, potassium hydroxide, sodium carbonate, sodium bicarbonate, disodium hydrogen phosphate, calcium hydroxide, magnesium hydroxide, sodium borate, lithium hydroxide, and potassium phosphate. it can.
一級アミノ基を有する化合物としては、グリシン、９−アミノアクアジン、アミノブタノール、４−アミノ酪酸、アミノカプリル酸、アミノエタノール、５−アミノ２，３−ジヒドロー１，４−ペンタノール、アミノエタンチオール塩酸塩、アミノエタンチオール硫酸、２−（２−アミノエチルアミノ）エタノール、リン酸二水素２−アミノエチル、硫酸水素アミノエチル、４−（２−アミノエチル）モルホリン、５-アミノフルオレセイン、６−アミノヘキサン酸、アミノヘキシルセルロース、ｐ−アミノ馬尿酸、２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−１，３−プロパンジオール、５−アミノイソフタル酸、アミノメタン、アミノフェノール、２−アミノオクタン、２−アミノオクタン酸、１−アミノ２−プロパノール、３−アミノ−１−プロパノール、３−アミノプロペン、３−アミノプロピオニトリル、アミノピリジン、１１−アミノウンデカン酸、アミノサリチル酸、アミノキノリン、４−アミノフタロニトリル、３−アミノフタルイミド、ｐ−アミノプロピオフェノン、アミノフェニル酢酸、アミノナフタレンなどを用いることができる。これらのうち、アミノエタノール、グリシンを用いることが好ましい。 Examples of the compound having a primary amino group include glycine, 9-amino aquadine, aminobutanol, 4-aminobutyric acid, aminocaprylic acid, aminoethanol, 5-amino2,3-dihydro-1,4-pentanol, aminoethanethiol Hydrochloride, aminoethanethiolsulfuric acid, 2- (2-aminoethylamino) ethanol, 2-aminoethyl dihydrogen phosphate, aminoethyl hydrogensulfate, 4- (2-aminoethyl) morpholine, 5-aminofluorescein, 6- Aminohexanoic acid, aminohexyl cellulose, p-aminohippuric acid, 2-amino-2-hydroxymethyl-1,3-propanediol, 5-aminoisophthalic acid, aminomethane, aminophenol, 2-aminooctane, 2-amino Octanoic acid, 1-amino-2-propanol, 3-amino-1-propyl Lopanol, 3-aminopropene, 3-aminopropionitrile, aminopyridine, 11-aminoundecanoic acid, aminosalicylic acid, aminoquinoline, 4-aminophthalonitrile, 3-aminophthalimide, p-aminopropiophenone, aminophenylacetic acid , Aminonaphthalene and the like can be used. Of these, aminoethanol and glycine are preferably used.
本発明に使用する短鎖の５’末端無修飾又はリン酸修飾されたＤＮＡの鎖長は、ハイブリダイゼーションが可能な長さであれば特に制限されないが、通常５〜５００００塩基、好ましくは６〜１００塩基である。 The length of the short-chain 5′-end unmodified or phosphate-modified DNA used in the present invention is not particularly limited as long as it is a length capable of hybridization, but usually 5 to 50000 bases, preferably 6 to 100 bases.
短鎖の５'末端無修飾又はリン酸修飾されたＤＮＡを溶解する溶媒も特に制限されず、蒸留水、又は通常ＤＮＡ溶液の調製に用いられる緩衝液、例えばTE緩衝液（10mM Tris塩酸, pH8.0／1mM EDTA）等のTris緩衝液、食塩を含む水溶液、カルボン酸塩を含む水溶液（クエン酸ナトリウム、クエン酸アンモニウム、酢酸ナトリウム等）、スルホン酸塩を含む水溶液（ドデシル硫酸ナトリウム、ドデシル硫酸アンモニウム等）、ホスホン酸塩を含む水溶液（リン酸ナトリウム、リン酸アンモニウム等）を挙げることができる。また、一般に市販されている溶媒、Spotting Solution等も挙げることができる。また、ＤＮＡ溶液の濃度も特に制限されないが、通常１ｍＭ〜１ｐＭ、好ましくは10mＭ〜1ｎＭの濃度である。 The solvent for dissolving the short 5′-end unmodified or phosphate-modified DNA is not particularly limited. Distilled water or a buffer usually used for preparing a DNA solution such as TE buffer (10 mM Tris hydrochloric acid, pH 8 .0 / 1 mM EDTA) Tris buffer solution, aqueous solution containing salt, aqueous solution containing carboxylate (sodium citrate, ammonium citrate, sodium acetate, etc.), aqueous solution containing sulfonate (sodium dodecyl sulfate, ammonium dodecyl sulfate) Etc.) and aqueous solutions containing phosphonates (sodium phosphate, ammonium phosphate, etc.). Moreover, the solvent, Spotting Solution, etc. which are generally marketed can also be mentioned. The concentration of the DNA solution is not particularly limited, but is usually 1 mM to 1 pM, preferably 10 mM to 1 nM.
ＤＮＡ溶液をマイクロアレイ基板上にスポットする方法としては、ピペットでＤＮＡ溶液を担体上に滴下する方法、又は市販のスポッター(アレイヤー)を用いる方法等が挙げられる。スポットの形状及びスポット量としては、ＤＮＡ溶液をスポットした位置を把握することができる程度であれば、特に制限されないが、形状としては点状又は円状が好ましい。また、好ましいスポット量は10nl〜10mlである。ＤＮＡ溶液は、マイクロアレイ基板上に１箇所又は複数箇所にスポットされる。スポットされるＤＮＡ溶液は、１種類でも２種類又はそれ以上であってもよい。尚、担体にＤＮＡが固定されたことを示す陽性コントロールとして、標識したＤＮＡを固定化しておいてもよい。 Examples of the method of spotting the DNA solution on the microarray substrate include a method of dropping the DNA solution on a carrier with a pipette or a method using a commercially available spotter (arrayer). The shape and amount of the spot are not particularly limited as long as the position where the DNA solution is spotted can be grasped, but the shape is preferably a dot or circle. A preferred spot amount is 10 nl to 10 ml. The DNA solution is spotted at one place or a plurality of places on the microarray substrate. The DNA solution to be spotted may be one kind or two kinds or more. As a positive control indicating that the DNA is immobilized on the carrier, the labeled DNA may be immobilized.
本発明の好ましい形態においては、ＤＮＡ溶液をマイクロアレイ基板上にスポットした後に、２８０nmの波長を含む紫外線を照射することで固定化率を上げることも出来る。また、前記ＤＮＡ溶液をスポット後紫外線照射前に乾燥させることができる。前記ＤＮＡ溶液の乾燥方法としては、自然に乾燥させてもよく、加熱して乾燥させてもよい。加熱する場合の温度は、通常３０〜１００℃、好ましくは７０〜１００℃である。 In a preferred embodiment of the present invention, the immobilization rate can be increased by irradiating ultraviolet rays containing a wavelength of 280 nm after spotting the DNA solution on the microarray substrate. The DNA solution can be dried after spotting and before ultraviolet irradiation. As a method for drying the DNA solution, it may be naturally dried or heated and dried. The temperature for heating is usually 30 to 100 ° C, preferably 70 to 100 ° C.
次に、マイクロアレイ基板、少なくとも基板のＤＮＡを固定した部位に、波長280nmの成分を含む紫外線を照射する。具体的には、波長280nmを含むブロードな波形を有する紫外線であっても良い。照射量は、累積照射量として通常100mJ/cm2以上、好ましくは200mJ/cm2以上である。 Next, ultraviolet light containing a component having a wavelength of 280 nm is irradiated onto the microarray substrate, at least the portion of the substrate where DNA is fixed. Specifically, it may be an ultraviolet ray having a broad waveform including a wavelength of 280 nm. Irradiation dose is usually 100 mJ / cm 2 or more as the cumulative dose, preferably 200 mJ / cm 2 or more.
上記のようにして、ＤＮＡをマイクロアレイ基板上に固定化することにより、ＤＮＡ固定化マイクロアレイが製造される。本発明の方法により得られるＤＮＡ固定化マイクロアレイは、例えば、ハイブリダイゼーションによる核酸の分析に用いることができる。本発明の方法によりマイクロアレイ基板に固定化されたＤＮＡは、通常のハイブリダイゼーションの条件下で担体から脱離しにくいため、紫外線照射を行わない場合に比べて検出感度が良好で、再現性も良い。ハイブリダイゼーション及びその検出は、通常の固相化ＤＮＡ(プローブ)を用いたハイブリダイゼーションと同様にして行うことができる。 As described above, a DNA-immobilized microarray is produced by immobilizing DNA on a microarray substrate. The DNA-immobilized microarray obtained by the method of the present invention can be used, for example, for nucleic acid analysis by hybridization. Since the DNA immobilized on the microarray substrate by the method of the present invention is less likely to be detached from the carrier under normal hybridization conditions, the detection sensitivity is better and the reproducibility is better than when UV irradiation is not performed. Hybridization and its detection can be carried out in the same manner as in hybridization using ordinary solid-phased DNA (probe).
本発明では、ＤＮＡを固定化するのに用いるマイクロアレイ基板として、安価な熱可塑性合成樹脂のプラスチックを用いているため、低コスト化が可能である。また、プラスチック素材は軽量で形成が容易なため、様々な形態のＤＮＡマイクロアレイの作製が容易となる。また、長期保存が可能であり、保存安定性に優れている。 In the present invention, since a cheap thermoplastic synthetic resin plastic is used as the microarray substrate used for immobilizing DNA, the cost can be reduced. In addition, since the plastic material is light and easy to form, various forms of DNA microarrays can be easily produced. In addition, it can be stored for a long period of time and has excellent storage stability.
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。 Hereinafter, the present invention will be described more specifically with reference to examples.
下記の実験にて、５’末端無修飾あるいは比較対象としてアミノ基修飾されたオリゴＤＮＡを、ホスホリルコリン基を含有した高分子物質により表面コーティング済みのプラスチック基板の表面に固定化して、熱安定性、再利用性、ハイブリダイゼーション効果について比較検討した。 In the following experiment, oligo DNA with 5 ′ end unmodified or amino group modified for comparison was immobilized on the surface of a plastic substrate surface-coated with a polymer substance containing phosphorylcholine group, The reusability and hybridization effect were compared.
（実験例１）
（基板の作製）
飽和環状ポリオレフィン樹脂を用い、射出成形によりスライドガラス形状の基板（寸法：76ｍｍ×２６ｍｍ×１ｍｍ）を得た。基板を２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン−ブチルメタクリレート−p−ニトロフェニルカルボニルオキシエチルメタクリレート共重合体（各基は、モル％で２５：７４：１）の０．５重量％エタノール溶液に浸漬することにより、基板表面にホスホリルコリン基と活性エステル基とを有する高分子物質を導入して、プラスチック基板を得た。
(Experimental example 1)
(Production of substrate)
A glass substrate (size: 76 mm × 26 mm × 1 mm) was obtained by injection molding using a saturated cyclic polyolefin resin. By immersing the substrate in a 0.5 wt% ethanol solution of 2-methacryloyloxyethyl phosphorylcholine-butyl methacrylate-p-nitrophenylcarbonyloxyethyl methacrylate copolymer (each group is 25: 74: 1 in mol%). Then, a polymer substance having a phosphorylcholine group and an active ester group was introduced into the substrate surface to obtain a plastic substrate.
（ＤＮＡの固定）
５’末端が無修飾またはアミノ基で修飾されたオリゴＤＮＡ（１５〜５０塩基鎖）をＳＳＣバッファー中に溶解させ、１０μＭのオリゴＤＮＡ溶液を調製した。この溶液はマイクロピペットを用い、前記のホスホリルコリン基を含有した高分子物質により表面コーティング済みのプラスチック基板の表面上に、それぞれ0.2μlスポットした。スポット径は直径約0.5mmであった。この平板を乾燥機に入れ、８０℃で1時間加熱乾燥して、オリゴＤＮＡ（プライマー）を固定化させた。その後、０．１Ｎの水酸化ナトリウム溶液中に５分間浸とうさせ活性エステル基を不活化することによりブロッキングを行った後、前記平板を沸騰水中に1分間浸とうして洗浄後、乾燥した。各スポットのオリゴＤＮＡ固定化量は、定法のターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（TdT）とＣｙ３標識dUTPヌクレオチドを併用してプローブの３‘末端にＣｙ３標識を導入して検定した。表１に結果を示した。
(Immobilization of DNA)
Oligo DNA (15 to 50 base strands) whose 5 ′ end was unmodified or modified with an amino group was dissolved in SSC buffer to prepare a 10 μM oligo DNA solution. Using a micropipette, 0.2 μl of this solution was spotted on the surface of a plastic substrate that had been surface-coated with the above-described polymer substance containing phosphorylcholine groups. The spot diameter was about 0.5 mm. This flat plate was put into a drier and dried by heating at 80 ° C. for 1 hour to immobilize oligo DNA (primer). After blocking by immersing in a 0.1N sodium hydroxide solution for 5 minutes to inactivate the active ester group, the flat plate was immersed in boiling water for 1 minute, washed and dried. The amount of oligo DNA immobilized on each spot was assayed by introducing a Cy3 label at the 3 ′ end of the probe using a conventional terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) and Cy3 labeled dUTP nucleotide in combination. Table 1 shows the results.
オリゴＤＮＡプローブ塩基鎖長に依存した固定化率が観察される。無修飾オリゴの15mer並びに20merはアミノ基修飾オリゴに比べ、固定化率は低いが、25mer以上の塩基鎖長のオリゴプローブでは固定化率はほぼ同等である。
又、ホスホリルコリン基を含有した高分子物質により表面コーティング済みのプラスチック基板をブロッキング溶液で活性エステル基を不活性化した後では、オリゴＤＮＡは基板表面に全く固定化できなかった。
An immobilization rate depending on the oligo DNA probe base chain length is observed. The 15-mer and 20-mer unmodified oligos have a lower immobilization rate than the amino group-modified oligos, but the immobilization rate is almost the same for oligo probes having a base chain length of 25 mer or longer.
Further, after the active ester group was inactivated with a blocking solution on a plastic substrate surface-coated with a polymer substance containing a phosphorylcholine group, the oligo DNA could not be immobilized on the substrate surface at all.
（実験例２）
(ハイブリダイゼーション)
実験例１の５’末端が無修飾またはアミノ基で修飾されたオリゴＤＮＡ（１５〜５０塩基鎖）を固定化したホスホリルコリン基を含有した高分子物質により表面コーティング済みのプラスチック基板を、ハイブリダイゼーションチャンバーに着装し、5’末端がＣｙ5蛍光ラベル化された５０塩基鎖ＤＮＡと相補的な塩基配列を有するターゲット溶液(５００ｐＭ、２０ml)をチャンバー内に注入し、1000rpm振動下、45℃で２時間過熱した。結果を表２に示した。
(Experimental example 2)
(Hybridization)
In the hybridization chamber, a plastic substrate surface-coated with a polymer substance containing a phosphorylcholine group to which oligo DNA (15 to 50 base strands) having an unmodified or amino group-modified 5 ′ end was immobilized. A target solution (500 pM, 20 ml) having a base sequence complementary to a 50 base-chain DNA labeled with Cy5 fluorescence at the 5 ′ end is injected into the chamber and heated at 45 ° C. for 2 hours under vibration at 1000 rpm. did. The results are shown in Table 2.
完全に相補的なターゲットがハイブリダイゼーションした量は、プラスチック基板表面に固定されているオリゴＤＮＡの固定化量に依存しており、５’末端が無修飾またはアミノ基修飾オリゴ間の基板表面との結合様式の違いがあるにも係らず、ハイブリダイゼーション効果に差異は見出されない。 The amount of hybridization of the completely complementary target depends on the amount of oligo DNA immobilized on the surface of the plastic substrate, and the 5 ′ end is unmodified or between the amino group-modified oligo and the substrate surface. Despite differences in binding mode, no difference is found in the hybridization effect.
Claims (7)
A microarray on which DNA is immobilized by the DNA immobilization method according to claim 1.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2005052664A JP2006234712A (en) | 2005-02-28 | 2005-02-28 | Dna immobilization method |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2005052664A JP2006234712A (en) | 2005-02-28 | 2005-02-28 | Dna immobilization method |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2006234712A true JP2006234712A (en) | 2006-09-07 |
Family
ID=37042509
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2005052664A Pending JP2006234712A (en) | 2005-02-28 | 2005-02-28 | Dna immobilization method |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2006234712A (en) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2019016359A (en) * | 2017-07-07 | 2019-01-31 | 伊藤 孝一 | Screening method |
Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH04164090A (en) * | 1990-10-29 | 1992-06-09 | Fuji Photo Film Co Ltd | Phosphorylating agent and method for forming phosphodiester bond using the same |
| JP2001178474A (en) * | 1999-12-27 | 2001-07-03 | Fuji Photo Film Co Ltd | Method for immobilizing dna fragment to surface of solid- phase carrier and dna chip |
| JP2002126510A (en) * | 2000-10-18 | 2002-05-08 | Toyo Kohan Co Ltd | Particulate carrier for separation, refining and extraction, and method for producing the same |
| JP2003014767A (en) * | 2001-04-26 | 2003-01-15 | Nof Corp | Non-particular hybridization inhibitor, clinical examination solution and clinical examination method |
| JP2004198402A (en) * | 2002-12-02 | 2004-07-15 | Sumitomo Bakelite Co Ltd | Microarray and its manufacturing method |
| JP2004524012A (en) * | 2000-12-08 | 2004-08-12 | アプライド・リサーチ・システムズ・エイアールエス・ホールディング・ナムローゼ・フェンノートシャップ | Isothermal amplification of nucleic acids on solid supports |
| WO2005029095A1 (en) * | 2003-09-19 | 2005-03-31 | Sumitomo Bakelite Co., Ltd. | Biochip |
-
2005
- 2005-02-28 JP JP2005052664A patent/JP2006234712A/en active Pending
Patent Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH04164090A (en) * | 1990-10-29 | 1992-06-09 | Fuji Photo Film Co Ltd | Phosphorylating agent and method for forming phosphodiester bond using the same |
| JP2001178474A (en) * | 1999-12-27 | 2001-07-03 | Fuji Photo Film Co Ltd | Method for immobilizing dna fragment to surface of solid- phase carrier and dna chip |
| JP2002126510A (en) * | 2000-10-18 | 2002-05-08 | Toyo Kohan Co Ltd | Particulate carrier for separation, refining and extraction, and method for producing the same |
| JP2004524012A (en) * | 2000-12-08 | 2004-08-12 | アプライド・リサーチ・システムズ・エイアールエス・ホールディング・ナムローゼ・フェンノートシャップ | Isothermal amplification of nucleic acids on solid supports |
| JP2003014767A (en) * | 2001-04-26 | 2003-01-15 | Nof Corp | Non-particular hybridization inhibitor, clinical examination solution and clinical examination method |
| JP2004198402A (en) * | 2002-12-02 | 2004-07-15 | Sumitomo Bakelite Co Ltd | Microarray and its manufacturing method |
| WO2005029095A1 (en) * | 2003-09-19 | 2005-03-31 | Sumitomo Bakelite Co., Ltd. | Biochip |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2019016359A (en) * | 2017-07-07 | 2019-01-31 | 伊藤 孝一 | Screening method |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US10953379B2 (en) | Methods and compositions of localizing nucleic acids to arrays | |
| JP4420020B2 (en) | How to stir the solution | |
| US20060286570A1 (en) | Use of photopolymerization for amplification and detection of a molecular recognition event | |
| US8765417B2 (en) | Method of elongating DNA through immobilizing primer DNA chains on a substrate, a method of amplifying a DNA chain | |
| JP4184089B2 (en) | Substrate, preparation and use | |
| US20090137406A1 (en) | RNA Detection Method | |
| JP4510080B2 (en) | PNA chip using plastic substrate coated with epoxy group-containing polymer, method for producing the PNA chip, and method for detecting single base gene mutation using the PNA chip | |
| JP2006230335A (en) | Method for detecting gene | |
| JP5155660B2 (en) | Method for producing cDNA and RNA strand | |
| JP2001108683A (en) | Dna fragment fixing solid-phase carrier, dna fragment fixing method, and nucleic-acid fragment detecting method | |
| JP4916689B2 (en) | DNA strand amplification method | |
| JP4534818B2 (en) | Polymer compound for biomaterial and polymer solution using the same | |
| JP2006234712A (en) | Dna immobilization method | |
| JP2007222010A (en) | Method for detecting gene and carrier for detecting gene | |
| JP4419715B2 (en) | Biochip substrate and biochip | |
| JP2007289088A (en) | Gene detection method | |
| JP2009219358A (en) | Method for detecting gene and carrier for detecting gene | |
| JP2007105057A (en) | Dna chain elongation method, dna chain amplification method and microarray for dna chain elongation | |
| JP2009124957A (en) | METHOD FOR DETECTING microRNA, AND microARRAY AND KIT USABLE THEREFOR | |
| JP5568873B2 (en) | Biochip manufacturing method | |
| JP2006246774A (en) | Method of extending dna strand, method of amplifying dna strand, and microarray for extending dna strand | |
| JP2009011247A (en) | Method for detecting gene | |
| JP2006266682A (en) | Substrate for biochip and biochip | |
| TWI245771B (en) | Micro-region selectively activating hydrophobic chip and its preparing method | |
| JP2007037473A (en) | Method for detecting gene sequence |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20071109 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20100824 |
|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20110301 |