JP2006208012A

JP2006208012A - Selective bondable substance immobilizing carrier

Info

Publication number: JP2006208012A
Application number: JP2005016406A
Authority: JP
Inventors: Fumio Nakamura; 史夫中村; Makiko Ichikawa; 真紀子市川
Original assignee: Toray Industries Inc
Current assignee: Toray Industries Inc
Priority date: 2005-01-25
Filing date: 2005-01-25
Publication date: 2006-08-10
Anticipated expiration: 2025-01-25
Also published as: JP4736439B2

Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a selective bondable substance immobilizing carrier for amplifying the signal at detection. <P>SOLUTION: In the selective bondable substance immobilizing carrier which keeps a selective bondable substance immobilized on the surface of a solid, a polymer is bonded to the surface of the solid by a covalent bond and the functional group in the polymer is fixed to the selective bondable substance by the covalent bond. <P>COPYRIGHT: (C)2006,JPO&NCIPI

Description

本発明は、被検物質と選択的に結合する物質（本明細書において「選択結合性
物質」）を固定化した担体に関する。 The present invention relates to a carrier on which a substance that selectively binds to a test substance (herein, “selective binding substance”) is immobilized.

各種生物の遺伝情報解析の研究が始められており、ヒト遺伝子をはじめとして、多数の遺伝子とその塩基配列、また遺伝子配列にコードされる蛋白質およびこれら蛋白質から二次的に作られる糖鎖に関する情報が急速に明らかにされつつある。配列の明らかにされた遺伝子、蛋白質、糖鎖などの高分子体の機能については、各種の方法で調べることができる。主なものとしては、核酸についてはノーザンハイブリダイゼーション、あるいはサザンハイブリダイゼーションのような、各種の核酸／核酸間の相補性を利用して各種遺伝子とその生体機能発現との関係を調べることができる。蛋白質については、ウエスタンブロッティング法に代表されるような、蛋白質／蛋白質間の反応を利用し蛋白質の機能および発現について調べることができる。 Research on genetic information analysis of various organisms has been started, and information on many genes and their base sequences including human genes, proteins encoded by the gene sequences, and sugar chains that are secondarily produced from these proteins Is being revealed rapidly. The functions of macromolecules such as genes, proteins, and sugar chains whose sequences have been clarified can be examined by various methods. Mainly, with respect to nucleic acids, the relationship between various genes and their expression of biological functions can be examined by utilizing complementarity between various nucleic acids / nucleic acids such as Northern hybridization or Southern hybridization. With respect to proteins, the function and expression of proteins can be examined using protein / protein reactions, as typified by Western blotting.

近年、多数の遺伝子発現を一度に解析する手法としてＤＮＡマイクロアレイ法（ＤＮＡチップ法）と呼ばれる新しい分析法、ないし方法論が開発され、注目を集めている。これらの方法は、いずれも核酸／核酸間ハイブリダイゼーション反応に基づく核酸検出・定量法である点で原理的には従来の方法と同じであり、蛋白質／蛋白質間あるいは糖鎖／糖鎖間や糖鎖／蛋白質間の相互作用に基づく蛋白質や糖鎖検出・定量にも応用が可能ではある。また、抗原-抗体相互作用ではELISA法(Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay)という、抗体と抗原及び酵素標識された抗原との結合により、標識酵素の活性を測定することで抗原を定性・定量分析する方法が主に用いられている。この手法においても標識体として蛍光物質が用いられ、この標識体からの蛍光を検出することで定性・定量が行われている。他には蛍光分子から他の分子へ励起エネルギーが移動する現象を利用した分析法、例えば、蛍光エネルギー移動法（FRET）や、分子ビーコン法などが挙げられるが、いずれも、検体に蛍光標識を施し、微弱な蛍光を高感度に検出することが必要不可欠になっている。これらの技術は、マイクロアレイ又はチップと呼ばれるガラスの平面基板片上に、多数のＤＮＡ断片や蛋白質、糖鎖が高密度に整列固定化されたものが用いられている点に大きな特徴がある。マイクロアレイ法の具体的使用法としては、例えば、研究対象細胞の発現遺伝子等を蛍光色素等で標識したサンプルを平面基板片上でハイブリダイゼーションさせ、互いに相補的な核酸（ＤＮＡあるいはＲＮＡ）同士を結合させ、その箇所を高解像度解析装置で高速に読みとる方法や、電気化学反応にもとづく電流値等の応答を検出する方法が挙げられる。こうして、サンプル中のそれぞれの遺伝子量を迅速に推定できる。 In recent years, a new analysis method or methodology called a DNA microarray method (DNA chip method) has been developed and attracted attention as a method for analyzing many gene expressions at once. In principle, these methods are the same as conventional methods in that they are nucleic acid detection and quantification methods based on nucleic acid / nucleic acid hybridization reactions, and are performed between proteins / proteins or between sugar chains / sugar chains and sugars. It can also be applied to protein and sugar chain detection and quantification based on chain / protein interactions. In addition, for antigen-antibody interactions, ELISA (Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay) is a method for qualitative and quantitative analysis of antigen by measuring the activity of the labeled enzyme by binding the antibody to the antigen and the enzyme-labeled antigen. Is mainly used. Also in this technique, a fluorescent substance is used as a label, and qualitative / quantitative analysis is performed by detecting fluorescence from the label. Other examples include analytical methods that use the phenomenon of excitation energy transfer from fluorescent molecules to other molecules, such as the fluorescent energy transfer method (FRET) and the molecular beacon method. It is essential to detect weak fluorescence with high sensitivity. These techniques have a great feature in that a large number of DNA fragments, proteins, and sugar chains are arranged and fixed at high density on a flat glass substrate called a microarray or chip. As a specific method of using the microarray method, for example, a sample obtained by labeling a gene expressed in a cell to be studied with a fluorescent dye or the like is hybridized on a flat substrate piece, and complementary nucleic acids (DNA or RNA) are bound to each other. There are a method of reading the part at high speed with a high resolution analyzer and a method of detecting a response such as a current value based on an electrochemical reaction. Thus, the amount of each gene in the sample can be quickly estimated.

核酸を基板上に固定化するための技術としては、スライドガラス等の平坦な基板の上にポリ−Ｌ−リジン、アミノシラン等をコーティングして、スポッターと呼ばれる点着装置を用い、各核酸を固定化する方法などが開発されている（例えば、特許文献１参照）。 As a technique for immobilizing nucleic acid on a substrate, poly-L-lysine, aminosilane, etc. are coated on a flat substrate such as a glass slide, and each nucleic acid is dispersed using a spotting device called a spotter. A method for immobilization has been developed (see, for example, Patent Document 1).

また、ＤＮＡチップに用いられる核酸プローブ（基板上に固定化された核酸）は、従来の数百〜数千塩基の長さのｃＤＮＡおよびその断片から、検出の際のエラーを下げることと、合成機で容易に合成できるという理由から、核酸プローブとしてオリゴＤＮＡ（オリゴＤＮＡとは塩基数が１００塩基までのものをいう）を用いようとしている。この際、オリゴＤＮＡとガラス基板とを共有結合にて、結合させている（例えば特許文献２参照）。固体基板上にグラフトポリマーを介してのオリゴＤＮＡ固定化手法として、末端アミノ化ＤＮＡとグラフトポリマー共有結合させて固定化する方法がある。（例えば特許文献３および４）
特表平１０−５０３８４１号公報（特許請求の範囲）特開２００１−１０８６８３号公報（特許請求の範囲および実施例）特開２００３−１３０８７８号公報（特許請求の範囲および実施例）特開２００３−１３０８７９号公報（特許請求の範囲および実施例） In addition, nucleic acid probes (nucleic acid immobilized on a substrate) used for DNA chips can reduce detection errors and synthesize from conventional cDNAs and fragments thereof of several hundred to several thousand bases. Because of the fact that it can be easily synthesized by a machine, oligo DNA (oligo DNA means that having up to 100 bases) is used as a nucleic acid probe. At this time, the oligo DNA and the glass substrate are bonded by a covalent bond (see, for example, Patent Document 2). As a method for immobilizing oligo DNA via a graft polymer on a solid substrate, there is a method of immobilizing terminal aminated DNA by covalent bonding with the graft polymer. (For example, Patent Documents 3 and 4)
JP 10-503841 A (Claims) JP 2001-108683 A (Claims and Examples) JP-A-2003-130878 (Claims and Examples) JP 2003-130879 A (Claims and Examples)

しかし、検体DNAの濃度が非常に薄い場合、ハイブリダイゼーション後のシグナルが微弱になり、検出が困難になるという問題点がある。本発明が解決しようとする課題は、上記のような重合体を固体表面に固定化し、その重合体に結合しているアシル基と末端アミノ化されたＤＮＡとを共有結合させることにより、ＤＮＡが固定化された基板を作製し、ハイブリダイゼーションのシグナルを増幅する基板を提供することである。 However, when the concentration of the sample DNA is very low, there is a problem that the signal after hybridization becomes weak and detection becomes difficult. The problem to be solved by the present invention is to immobilize a polymer as described above on a solid surface, and covalently bond the acyl group bonded to the polymer and the terminal aminated DNA. It is to provide an immobilized substrate and a substrate for amplifying a hybridization signal.

（１）固体表面に選択結合性物質を固定化した選択結合性物質固定化担体であって、該固体表面に重合体が共有結合で結合しており、該重合体に結合している官能基と選択結合性物質が共有結合にて固定化されていることを特徴とする選択結合性物質固定化担体。
（２）該固体表面が樹脂からなる(１)に記載の選択結合性物質固定化単体
（３）該固体表面が下記一般式（１）を構造単位として有する請求項１に記載の選択結合性物質固定化担体。
(1) A selective binding substance-immobilized support having a selective binding substance immobilized on a solid surface, wherein a polymer is covalently bonded to the solid surface, and the functional group is bonded to the polymer. And a selective binding substance-immobilized carrier, wherein the selective binding substance is immobilized by a covalent bond.
(2) The selective binding substance-immobilized simple substance according to (1), wherein the solid surface is made of a resin (3) The selective binding property according to claim 1, wherein the solid surface has the following general formula (1) as a structural unit Substance immobilization carrier.

（式中、Ｒ^１、Ｒ^２およびＲ^３はそれぞれ炭素数１から２０のアルキル基、炭素数６から１８のアリール基、又は水素原子を表す。また、Ｘは、Ｏ、ＮＲ^３またはＣＨ₂を表す。）
（４）該重合体に結合している官能基がアシル基である(１)から(３)のいずれかに記載の選択結合性物質固定化担体。
（５）該重合体がペプチドおよびペプチド誘導体由来のものである(１)から(３)のいずれかに記載の選択結合性物質固定化担体。
（６）選択結合性物質が核酸である(１)から(５)のいずれかに記載の選択結合性物質固定化担体。 (Wherein R ¹ , R ² and R ³ each represents an alkyl group having 1 to 20 carbon atoms, an aryl group having 6 to 18 carbon atoms, or a hydrogen atom. X represents O, NR ³ or CH _2. Represents.)
(4) The selective binding substance-immobilized carrier according to any one of (1) to (3), wherein the functional group bonded to the polymer is an acyl group.
(5) The selective binding substance-immobilized carrier according to any one of (1) to (3), wherein the polymer is derived from a peptide and a peptide derivative.
(6) The selective binding substance-immobilized carrier according to any one of (1) to (5), wherein the selective binding substance is a nucleic acid.

本発明により、固体表面に結合した重合体を介して選択結合性物質を固定化された選択結合性物質固定化担体を提供でき、選択結合性物質の選択的結合シグナルを増幅させることが可能となる。 According to the present invention, it is possible to provide a selective binding substance-immobilized carrier in which a selective binding substance is immobilized via a polymer bound to a solid surface, and it is possible to amplify a selective binding signal of the selective binding substance. Become.

本発明の選択結合性物質固定化担体およびその製造方法を具体的に以下に述べる。 The selective binding substance-immobilized carrier of the present invention and the production method thereof will be specifically described below.

本発明者らは、鋭意実験を重ねた結果、図１に示すように重合体を固体表面に形成させ、その重合体に結合しているアシル基と核酸を共有結合により固定化し、ハイブリダイゼーションのシグナルを増幅させることを見いだした。本発明で重合体とは合成ポリマーでは、ポリメチルメタクリレート、セルロースアセテートブチレート、セルローストリアセテート、セルローストリブチレート、ポリアセタール、ポリエチレングリコール、ポリアミドなどが挙げられる。さらに、その他の樹脂材料として、エポキシ樹脂、アクリル樹脂、ウレタン樹脂、フェノール樹脂、スチレン系樹脂、ビニル系樹脂、ポリエステル樹脂、ポリアミド系樹脂、メラミン系樹脂、フォルマリン樹脂などが挙げられ、生体物質としてはポリペプチドやポリヌクレオチド、糖鎖などが挙げられる。その他としてはアルキル鎖が挙げられる。これらの中で水溶液中での重合体の屈曲性の良さから、ポリエチレングリコール、ポリペプチドやポリヌクレオチド、糖鎖などの親水性ポリマーが好ましく用いることができる。これらの中でも特に固体表面への導入の容易さやコスト面からアミノ酸から形成されるオリゴペプチドまたはポリペプチドがより好ましく用いることができる。また、ペプチドはペプチド結合関与部位以外が、ホルミルメトキシカルボニルやｔ−ブトキシカルボニル等で保護されているペプチド誘導体でも良い。本発明で重合体の重合度は、特に制限はないが、作製の容易さから１〜１０００が好ましい。この重合体は次に挙げる反応経路で表面に形成することが可能である。まず、固体表面に足がかりとなる官能基を生成する。ついでこの官能基と結合できる官能基を有する重合体を結合させる。そして重合体に結合している中の官能基と結合できる官能基を有する選択結合性物質と反応させることにより、固体基板上に重合体を介して選択結合性物質を固定化することができる。重合体に結合されている官能基は重合体の主鎖末端でも良いし、側鎖末端でも良い。分岐構造を持つ重合体の場合は枝分かれ端でも良い。官能基の種類としては、特にアシル基（ＲＣＯ−：Ｒは炭化水素）が、その作製の容易さや選択結合性物質の固定化の観点から好ましく用いることができる。ここでアシル基を有するアシル化合物としては、アルデヒド基（ＲＣＯＨ）、カルボキシル基（ＲＣＯＯＨ）カルボシキル基の水素原子が置換した各種カルボン酸塩（ＣＯＯＭ：ＭはＮａやＫなど金属）やエステル（ＲＣＯＯＲ’）があり、またカルボキシル基のヒドロキシ基が置換した酸アミド（ＲＣＯＮＨ_２）、酸アジド（ＲＣＯＮ_３）、酸塩化物（ＲＣＯＣｌ）酸無水物、ニトリル（ＲＣＮ）などが挙げられる。また、アミノ基やチオール基と縮合反応を促進するアシル化合物としてアシル基にマレイミド基やスクシイミド基などが挙げられる。この固体基板上への重合体の固定化方法は、具体的には以下のようになる。すなわち、カルボキシル基を固体の表面に生成し、エステル活性化剤などでカルボキシル基を活性化し、その後、アミノ基およびカルボキシル基を持つアミノ酸のアミノ基を、表面の活性化カルボキシル基と反応させることにより、固体表面にカルボキシル基を生成させることができる。ここでエステル活性化剤の例としてはスクシンイミジル４−［マレイミドフェニル］ブチレート（ＳＭＰＢ）、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ）、スクシンイミジル４−（マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）、Ｎ−（γ−マレイミドブチロキシ）スクシンイミドエステル（ＧＭＢＳ）、ｍ−マレイミドプロピオニックアシド−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＰＳ）及びＮ−スクシンイミジル（４−ヨードアセチル）アミノベンゾエート（ＳＩＡＢ）、Ｎ−ヒドロキシスルフォツクシイミド（Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ）、Ｎ−ヒドロキシクシイミド（ＮＨＳ）などが挙げられる。一般的には、これらの結合の反応を助長するため、ジシクロヘキシルカルボジイミド、Ｎ−エチル−５−フェニルイソオキサゾリウム−３'−スルホナートなどの様々な縮合剤が用いられている。これらの中でも、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド(ＥＤＣ)や４−（４，６−ジメトキシ−１，３，５−トリアジン−２−イル）−４−メチルモルホリニウムクロライド（ＤＭＴ−ＭＭ）は、毒性が少ないことや、反応系からの除去が比較的容易なことから、選択結合性物質と固体表面のカルボキシル基との縮合反応にはもっとも有効な縮合剤の１つである。これらＥＤＣなどの縮合剤は、選択結合性物質の溶液と混ぜて使用しても良いし、カルボキシル基が表面に生成された固体表面を予めＥＤＣの溶液に浸漬しておき、重合体に結合しているカルボキシル基を活性化しておいても良い。 As a result of repeated experiments, the present inventors have formed a polymer on a solid surface as shown in FIG. 1, immobilized the acyl group and nucleic acid bonded to the polymer by covalent bonds, and performed hybridization. Found to amplify the signal. Examples of the polymer in the present invention include synthetic polymers such as polymethyl methacrylate, cellulose acetate butyrate, cellulose triacetate, cellulose tributyrate, polyacetal, polyethylene glycol, and polyamide. Furthermore, other resin materials include epoxy resins, acrylic resins, urethane resins, phenol resins, styrene resins, vinyl resins, polyester resins, polyamide resins, melamine resins, formalin resins, etc. Examples include polypeptides, polynucleotides and sugar chains. Others include alkyl chains. Of these, hydrophilic polymers such as polyethylene glycol, polypeptides, polynucleotides and sugar chains can be preferably used because of the good flexibility of the polymer in an aqueous solution. Among these, an oligopeptide or a polypeptide formed from an amino acid can be more preferably used because of its ease of introduction onto a solid surface and cost. In addition, the peptide may be a peptide derivative that is protected with formylmethoxycarbonyl, t-butoxycarbonyl, or the like except for the site associated with the peptide bond. In the present invention, the degree of polymerization of the polymer is not particularly limited, but is preferably 1 to 1000 for ease of production. This polymer can be formed on the surface by the following reaction route. First, a functional group serving as a foothold is generated on the solid surface. Next, a polymer having a functional group capable of bonding to this functional group is bonded. The selective binding substance can be immobilized on the solid substrate via the polymer by reacting with a selective binding substance having a functional group capable of binding to the functional group in the polymer. The functional group bonded to the polymer may be the main chain end or the side chain end of the polymer. In the case of a polymer having a branched structure, it may be a branched end. As the type of the functional group, an acyl group (RCO-: R is a hydrocarbon) can be preferably used from the viewpoint of ease of production and immobilization of a selective binding substance. Examples of acyl compounds having an acyl group include various carboxylates (COOM: M is a metal such as Na or K) or esters (RCOOR ') in which hydrogen atoms of aldehyde group (RCOH), carboxyl group (RCOOH), and carboxyl groups are substituted. And acid amide (RCONH ₂ ), acid azide (RCON ₃ ), acid chloride (RCOCl) acid anhydride, and nitrile (RCN) substituted with a hydroxy group of the carboxyl group. Examples of acyl compounds that promote condensation reactions with amino groups and thiol groups include maleimide groups and succinimide groups. Specifically, the method for immobilizing the polymer on the solid substrate is as follows. That is, by generating a carboxyl group on the surface of the solid, activating the carboxyl group with an ester activator, etc., and then reacting the amino group of the amino group and the amino acid having the carboxyl group with the activated carboxyl group on the surface A carboxyl group can be generated on the solid surface. Examples of the ester activator include succinimidyl 4- [maleimidophenyl] butyrate (SMPB), m-maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimide ester (MBS), succinimidyl 4- (maleimidomethyl) cyclohexane-1-carboxylate ( SMCC), N- (γ-maleimidobutyroxy) succinimide ester (GMBS), m-maleimidopropionic acid-N-hydroxysuccinimide ester (MPS) and N-succinimidyl (4-iodoacetyl) aminobenzoate (SIAB), Examples thereof include N-hydroxysulfuccinimide (Sulfo-NHS) and N-hydroxysuccinimide (NHS). In general, various condensing agents such as dicyclohexylcarbodiimide and N-ethyl-5-phenylisoxazolium-3′-sulfonate are used to facilitate the reaction of these bonds. Among these, 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC) and 4- (4,6-dimethoxy-1,3,5-triazin-2-yl) -4-methylmorpholinium Chloride (DMT-MM) is one of the most effective condensing agents for the condensation reaction between the selective binding substance and the carboxyl group on the solid surface because of its low toxicity and relatively easy removal from the reaction system. One. These condensing agents such as EDC may be used by mixing with a solution of a selective binding substance, or a solid surface on which a carboxyl group is generated is immersed in an EDC solution in advance to bind to a polymer. The activated carboxyl group may be activated.

本発明の選択結性物質固定化担体の基板としては特には限定されないが、例えば、ガラス、シリコン、金属としては金、銀、白金、銅、樹脂としてはポリメチルメタクリレート、ポリエチルメタクリレート、ポリスチレン、ポリアクリルニトリル、ポリ酢酸ビニル、ポリカーボネートなどが挙げられる。ガラスやシリコンに官能基を生成させる方法としてはシランカップリング剤等の溶液に浸漬することにより、表面に水酸基やカルボキシル基、アミノ基を生成させることができる。金属基板上への官能基の導入は末端にチオール基を持つ化合物溶液に基板を浸漬することにより、容易に水酸基やカルボキシル基、アミノ基を生成させることが可能である。 The substrate for the selective binding substance-immobilized carrier of the present invention is not particularly limited. For example, glass, silicon, gold as the metal, silver, platinum, copper, and the resin as polymethyl methacrylate, polyethyl methacrylate, polystyrene, Examples include polyacrylonitrile, polyvinyl acetate, and polycarbonate. As a method of generating a functional group on glass or silicon, a hydroxyl group, a carboxyl group, or an amino group can be generated on the surface by dipping in a solution such as a silane coupling agent. Introducing a functional group onto a metal substrate can easily generate a hydroxyl group, a carboxyl group, or an amino group by immersing the substrate in a compound solution having a thiol group at the terminal.

また、樹脂担体の表面に官能基を生成する方法としては、プラズマ処理などで、強制的に酸化させることにより担体表面にカルボキシル基や、水酸基等を生成することもできる。その他の方法としては、樹脂担体の側鎖を加水分解するなどの方法を用いることができ、この方法は簡便な方法であることから好ましく用いることができる。 In addition, as a method of generating a functional group on the surface of the resin carrier, a carboxyl group, a hydroxyl group, or the like can be generated on the surface of the carrier by forcibly oxidizing by plasma treatment or the like. As other methods, methods such as hydrolysis of the side chain of the resin carrier can be used, and this method can be preferably used because it is a simple method.

したがって、本発明の選択結合性物質固定化担体の樹脂としては、側鎖構造を有する樹脂であることが好ましく、側鎖構造を有する樹脂としては、具体的にはポリスチレン、ポリアクリロニトリル、ポリ酢酸ビニル等のビニル系樹脂等が挙げられるが、特に下記一般式（１）で表せられる構造を持つ樹脂が特に好ましい。 Therefore, the resin for the selective binding substance-immobilized carrier of the present invention is preferably a resin having a side chain structure, and specifically, the resin having a side chain structure is polystyrene, polyacrylonitrile, polyvinyl acetate. Examples of the resin include vinyl resins such as the above, and resins having a structure represented by the following general formula (1) are particularly preferable.

（一般式（１）のＲ¹、Ｒ²、Ｒ³は、アルキル基、アリール基もしくは水素原子を表す。）
上記の構造単位を持つ樹脂であると、酸やアルカリの加水分解にて、容易に側鎖がカルボキシル基となる。 (R ¹ , R ² and R ³ in the general formula (1) represent an alkyl group, an aryl group or a hydrogen atom.)
When the resin has the above structural unit, the side chain easily becomes a carboxyl group by hydrolysis of acid or alkali.

本発明において、一般式（１）で表せられる樹脂の平均重合度の好ましい範囲は、１００から１万である。特に好ましくは、２００以上、５０００以下である。なお、数平均重合度はＧＰＣ（ゲルパーメイションクロマトグラフ）を用い定法にて樹脂の分子量を測定することにより、容易に測定できる。

一般式（１）において、Ｒ¹およびＲ²はアルキル基、アリール基または水素原子を表し、それぞれ同一であっても異なっていても良い。前記アルキル基は直鎖状であってもまたは枝別れしていても良く、好ましくは１から２０の炭素数を有する。前記アリール基は、好ましくは６から１８、さらに好ましくは６から１２の炭素数を有する。官能基ＸはＯ、ＮＲ³ 、またはＣＨ₂の中から任意に選ばれる。Ｒ³は前記Ｒ¹およびＲ²と同様に定義される官能基である。 In the present invention, the preferred range of the average degree of polymerization of the resin represented by the general formula (1) is 100 to 10,000. Particularly preferably, it is 200 or more and 5000 or less. The number average degree of polymerization can be easily measured by measuring the molecular weight of the resin by a conventional method using GPC (gel permeation chromatograph).

In the general formula (1), R ¹ and R ² represent an alkyl group, an aryl group, or a hydrogen atom, and may be the same or different. The alkyl group may be linear or branched and preferably has 1 to 20 carbon atoms. The aryl group preferably has 6 to 18, more preferably 6 to 12 carbon atoms. The functional group X is arbitrarily selected from O, NR ³ , or CH ₂ . R ³ is a functional group defined in the same manner as R ¹ and R ² .

前記各種のような官能基を含む樹脂で、好ましいものとしては、例えば、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、ポリエチルメタクリレート（ＰＥＭＡ）またはポリプロピルメタクリレートのポリメタクリル酸アルキル（ＰＡＭＡ）等がある。これらの中で特に好ましいものは、ポリメチルメタクリレートである。さらに、ポリ酢酸ビニル、ポリメタクリル酸シクロヘキシルまたはポリメタクリル酸フェニル等も用いることができる。また、前記樹脂構成要素を組み合わせた、または前記樹脂の構成要素に他の一種または複数種の樹脂の構成要素を加えた構造の共重合体も用いることができる。前記他の樹脂としては、ポリスチレン、ポリアクリロニトリルまたはポリアミド等がある。 Preferred examples of the resin containing functional groups as described above include polymethyl methacrylate (PMMA), polyethyl methacrylate (PEMA), or polypropyl methacrylate polyalkyl methacrylate (PMMA). Of these, polymethyl methacrylate is particularly preferred. Furthermore, polyvinyl acetate, polycyclohexyl methacrylate, polyphenyl methacrylate, or the like can also be used. Moreover, the copolymer of the structure which combined the said resin component or added the component of another 1 type or multiple types of resin to the component of the said resin can also be used. Examples of the other resin include polystyrene, polyacrylonitrile, and polyamide.

このような材質からなる樹脂表面にカルボキシル基を生成する手段としては、アルカリ、酸などで処理するほか、温水中での超音波処理、酸素プラズマ、アルゴンプラズマ、放射線に樹脂基板を晒す方法などが挙げられるが、樹脂表面の損傷が少なく、また、容易に実施できるという点からアルカリ、もしくは酸に樹脂基板を漬け込んで表面にカルボキシル基を生成させることが好ましい。具体的な例としては、水酸化ナトリウムや硫酸の水溶液（好ましい濃度は、１Ｎ〜２０Ｎ）に樹脂基板を漬け込み、好ましくは３０℃から８０℃の温度にして、１時間から１００時間の間保持すればよい。
ついで、本発明の選択結合性物質固定化担体の具体的な使用方法の好ましい形態について述べる。本発明の選択結合性物質固定化担体は、選択結合性物質が多数固定化されている、マイクロアレイと呼ばれる固体に用いることが好ましい。ここで、「選択結合性物質」とは、被検物質と直接的又は間接的に、選択的に結合し得る物質を意味し、代表的な例として、核酸、タンパク質、糖類及び他の抗原性化合物を挙げることができる。核酸は、ＤＮＡやＲＮＡでもＰＮＡでもよい。特定の塩基配列を有する一本鎖核酸は、該塩基配列又はその一部と相補的な塩基配列を有する一本鎖核酸と選択的にハイブリダイズして結合するので、本発明でいう「選択結合性物質」に該当する。また、タンパク質としては、抗体及びFabフラグメントやF(ab')2フラグメントのような、抗体の抗原結合性断片、並びに種々の抗原を挙げることができる。抗体やその抗原結合性断片は、対応する抗原と選択的に結合し、抗原は対応する抗体と選択的に結合するので、「選択結合性物質」に該当する。糖類としては、多糖類が好ましく、種々の抗原を挙げることができる。また、タンパク質や糖類以外の抗原性を有する物質を固定化することもできる。本発明に用いる選択結合性物質は、市販のものでもよく、また、生細胞などから得られたものでもよい。「選択結合性物質」として、特に好ましいものは、核酸である。この核酸の中でも、オリゴ核酸と呼ばれる、長さが１０塩基から１００塩基までの核酸は、合成機で容易に人工的に合成が可能であり、また、核酸末端のアミノ基修飾が容易であるため、固体表面への固定化が容易となることから好ましい。さらに、２０塩基未満ではハイブリダイゼーションの安定性が低いという観点から２０〜１００塩基がより好ましい。ハイブリダイゼーションの安定性を保持するため、特に好ましくは４０〜１００塩基の範囲である。核酸の末端修飾可能な官能基にはアミノ基の他に、アルデヒド基、エポキシ基、カルボキシル基、水酸基あるいはチオール基も好ましく導入することができる。オリゴ核酸の末端修飾の際、これら官能基と核酸の間にアルキル鎖を導入するが、一般的にはそのアルキル基の炭素数は３〜１８である。 Means for generating carboxyl groups on the resin surface made of such materials include treatment with alkali, acid, etc., ultrasonic treatment in warm water, oxygen plasma, argon plasma, and a method of exposing the resin substrate to radiation. Although there are few damages on the surface of the resin, and it is easy to carry out, it is preferable to immerse the resin substrate in an alkali or acid to generate a carboxyl group on the surface. As a specific example, the resin substrate is immersed in an aqueous solution of sodium hydroxide or sulfuric acid (preferably the concentration is 1N to 20N), preferably at a temperature of 30 ° C. to 80 ° C. and held for 1 to 100 hours. That's fine.
Next, a preferred form of a specific method for using the selective binding substance-immobilized carrier of the present invention will be described. The selective binding substance-immobilized carrier of the present invention is preferably used for a solid called a microarray on which a large number of selective binding substances are immobilized. Here, the “selective binding substance” means a substance that can selectively bind to a test substance directly or indirectly, and representative examples thereof include nucleic acids, proteins, saccharides and other antigenic properties. A compound can be mentioned. The nucleic acid may be DNA, RNA or PNA. A single-stranded nucleic acid having a specific base sequence selectively hybridizes and binds to a single-stranded nucleic acid having a base sequence complementary to the base sequence or a part thereof. Falls under the category of Examples of the protein include an antibody and an antigen-binding fragment of an antibody such as a Fab fragment or F (ab ′) 2 fragment, and various antigens. Since an antibody or an antigen-binding fragment thereof selectively binds with a corresponding antigen, and the antigen selectively binds with a corresponding antibody, it corresponds to a “selective binding substance”. As the saccharide, a polysaccharide is preferable, and various antigens can be exemplified. In addition, substances having antigenicity other than proteins and saccharides can be immobilized. The selective binding substance used in the present invention may be a commercially available substance or may be obtained from a living cell or the like. Particularly preferred as the “selective binding substance” is a nucleic acid. Among these nucleic acids, nucleic acids called oligonucleic acids having a length of 10 to 100 bases can be easily artificially synthesized with a synthesizer, and the amino group at the end of the nucleic acid can be easily modified. It is preferable because it can be easily immobilized on a solid surface. Furthermore, if it is less than 20 bases, 20 to 100 bases are more preferable from the viewpoint that the stability of hybridization is low. In order to maintain the stability of hybridization, the range of 40 to 100 bases is particularly preferable. In addition to the amino group, an aldehyde group, an epoxy group, a carboxyl group, a hydroxyl group, or a thiol group can be preferably introduced into the functional group capable of terminal modification of a nucleic acid. In the terminal modification of the oligonucleic acid, an alkyl chain is introduced between these functional groups and the nucleic acid. Generally, the alkyl group has 3 to 18 carbon atoms.

本発明の固体表面とこのような選択結合性物質とを固定化するためには、先に述べたＥＤＣやＤＭＴ−ＭＭのような縮合剤を用いて固定化すればよい。そして固体表面の重合体分子のアシル基と選択結合性物質のアミノ基とを反応させた場合は、アミド結合により固体表面と選択結合性物質が固定化されることになり、固体表面の重合体のカルボキシル基と選択結合性物質の水酸基とを反応させた場合は、エステル結合により固体表面と選択結合性物質とが固定化されることになる。選択結合性物質を含む試料を固体表面に作用させる際の温度は、５℃〜９５℃が好ましく、１５℃〜６５℃が更に好ましい。処理時間は通常５分〜２４時間であり、１時間以上が好ましい。 In order to immobilize the solid surface of the present invention and such a selective binding substance, it may be immobilized using a condensing agent such as EDC or DMT-MM described above. When the acyl group of the polymer molecule on the solid surface is reacted with the amino group of the selective binding substance, the solid surface and the selective binding substance are immobilized by an amide bond, and the polymer on the solid surface is fixed. When the carboxyl group of this group is reacted with the hydroxyl group of the selective binding substance, the solid surface and the selective binding substance are fixed by the ester bond. The temperature at which the sample containing the selective binding substance is allowed to act on the solid surface is preferably 5 ° C to 95 ° C, more preferably 15 ° C to 65 ° C. The treatment time is usually 5 minutes to 24 hours, preferably 1 hour or longer.

前述した方法により、固体表面に重合体を介して選択結合性物質を固定化することにより、固体表面に直接固定化した場合に比べ、固定化された選択結合性物質の空間的な自由度が高いという推定理由のために、検体と高いハイブリダイゼーション効率を提供する選択結合性物質固定化担体を得ることができる。 By immobilizing the selective binding substance on the solid surface through the polymer by the above-described method, the spatial freedom degree of the immobilized selective binding substance can be increased as compared with the case of immobilizing the selective binding substance directly on the solid surface. For the presumed reason of high, a selective binding substance-immobilized carrier that provides a high hybridization efficiency with a specimen can be obtained.

以下、本発明を実施例に基づきさらに具体的に説明する。ただし、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。 Hereinafter, the present invention will be described more specifically based on examples. However, the present invention is not limited to these examples.

実施例１
（DNA固定化基板１、２の作製）
重合体分子固定化PMMA基板の作製スキームを図２に示す。ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）板（（株）クラレ製；コモグラス押し出し板、厚さ１mm、平均分子量３万）を１０Ｎの水酸化ナトリウム水溶液に７０℃で１５時間浸漬した。次いで、純水、０．１ＮＨＣｌ水溶液、純水の順で洗浄した。このようにして、基板表面のＰＭＭＡの側鎖を加水分解して、カルボキシル基を生成した。次いで（Ａ）Ｎ−ヒドロキシスルホツクシイミド（以降Sulfo-NHSと略す）１００ｍｇ、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド(ＥＤＣ)３５０ｍｇを２−モルホリノエタンスルホン酸・一水和物（ＭＥＳ）バッファー（０．１Ｎ水酸化ナトリウムでｐＨ６．０に調整）に溶解させた。これらの混合溶液に上記加水分解後のＰＭＭＡ基板を浸漬し、マイクロスターラーで撹拌した。（Ｂ）１時間撹拌後、上記基板をアミノ酸の一種であるグリシン８０ｍｇを含むホウ酸水溶液（１Ｎ水酸化ナトリウムでｐＨ８．３に調整）に浸漬し、マイクロスターラーで撹拌した。１時間攪拌後、ＤＮＡ固定化基板１を作製した。また、上記（Ａ）、（Ｂ）の操作をさらに３回繰り返すことにより、ＰＭＭＡ表面にグリシン４分子結合した、ＤＮＡ固定化基板２を得た。
実施例２
（DNA固定化基板３の作製）
重合体分子固定化PMMA基板の作製スキームを図３に示す。
実施例１と同様の方法でＰＭＭＡ基板表面にカルボキシル基を生成させた。次いで（ａ）Sulfo-NHS１００ｍｇ、ＥＤＣ３５０ｍｇをＭＥＳバッファー（ｐＨ６．０）に溶解させた。これらの混合溶液に上記加水分解後のＰＭＭＡ基板を浸漬し、マイクロスターラーで１時間撹拌撹拌した。（ｂ）ＭＥＳ（ｐＨ８．３）にグリシン８０ｍｇを溶解させ、ＥＤＣ３５０ｍｇを加え１時間攪拌し、ポリペプチドであるグリシン重合体を作製した。（ｃ）上記基板を（ｂ）で調整したグリシン重合体溶液に浸漬し、２時間攪拌した後、ＤＮＡ固定化基板３を得た。 Example 1
(Preparation of DNA immobilization substrates 1 and 2)
A production scheme of the polymer molecule-immobilized PMMA substrate is shown in FIG. A polymethyl methacrylate (PMMA) plate (manufactured by Kuraray Co., Ltd .; Comograss extruded plate, thickness 1 mm, average molecular weight 30,000) was immersed in a 10N aqueous sodium hydroxide solution at 70 ° C. for 15 hours. Subsequently, it wash | cleaned in order of the pure water, 0.1N HCl aqueous solution, and a pure water. In this way, the side chain of PMMA on the substrate surface was hydrolyzed to generate a carboxyl group. Next, (A) 100 mg of N-hydroxysulfuximide (hereinafter abbreviated as Sulfo-NHS) and 350 mg of 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC) were added to 2-morpholinoethanesulfonic acid monohydrate. Dissolved in (MES) buffer (adjusted to pH 6.0 with 0.1 N sodium hydroxide). The PMMA substrate after hydrolysis was immersed in these mixed solutions and stirred with a micro stirrer. (B) After stirring for 1 hour, the substrate was immersed in an aqueous boric acid solution (adjusted to pH 8.3 with 1N sodium hydroxide) containing 80 mg of glycine, which is a kind of amino acid, and stirred with a micro stirrer. After stirring for 1 hour, a DNA-immobilized substrate 1 was prepared. Further, by repeating the operations (A) and (B) three more times, a DNA-immobilized substrate 2 in which 4 molecules of glycine were bonded to the PMMA surface was obtained.
Example 2
(Preparation of DNA-immobilized substrate 3)
A production scheme of the polymer molecule-immobilized PMMA substrate is shown in FIG.
In the same manner as in Example 1, carboxyl groups were generated on the surface of the PMMA substrate. Next, (a) Sulfo-NHS 100 mg and EDC 350 mg were dissolved in MES buffer (pH 6.0). The PMMA substrate after hydrolysis was immersed in these mixed solutions, and stirred and stirred for 1 hour with a micro stirrer. (B) 80 mg of glycine was dissolved in MES (pH 8.3), 350 mg of EDC was added and stirred for 1 hour to prepare a glycine polymer as a polypeptide. (C) The substrate was immersed in the glycine polymer solution prepared in (b) and stirred for 2 hours to obtain a DNA-immobilized substrate 3.

実施例３
（DNA固定化基板４の作製）
実施例２で作製した重合体分子固定化ＰＭＭＡ基板に再び操作（ａ）を施し、重合体末端にスクシンイミド基を修飾し、ＤＮＡ固定化基板４を得た。 Example 3
(Preparation of DNA-immobilized substrate 4)
The operation (a) was again performed on the polymer molecule-immobilized PMMA substrate prepared in Example 2, and the succinimide group was modified at the polymer end to obtain the DNA-immobilized substrate 4.

実施例４
（DNA固定化基板５の作製）
実施例１と同様の操作でＰＭＭＡ基板上にカルボキシル基を生成させた。次いで（Ａ）の操作の後、１時間撹拌後、上記基板をアミノ酸の一種であるアラニン８０ｍｇを含むホウ酸水溶液（１Ｎ水酸化ナトリウムでｐＨ８．３に調整）に浸漬し、マイクロスターラーで撹拌した。１時間攪拌後、ＤＮＡ固定化基板５を作製した。 Example 4
(Preparation of DNA-immobilized substrate 5)
Carboxyl groups were generated on the PMMA substrate by the same operation as in Example 1. Next, after the operation of (A), after stirring for 1 hour, the substrate was immersed in an aqueous boric acid solution (adjusted to pH 8.3 with 1N sodium hydroxide) containing 80 mg of alanine, which is an amino acid, and stirred with a micro stirrer. . After stirring for 1 hour, a DNA-immobilized substrate 5 was produced.

実施例５
（DNA固定化基板６の作製）
DNA固定化基板としてガラス基板を用いた。重合体分子固定化ガラス基板の作製スキームを図４に示す。 Example 5
(Preparation of DNA-immobilized substrate 6)
A glass substrate was used as the DNA immobilization substrate. A production scheme of a polymer molecule-immobilized glass substrate is shown in FIG.

スライドガラスを１０ＮＮａＯＨ水溶液に１時間浸漬したあと、純水で十分に洗浄した。ついで、ＡＰＳ（３−アミノプロピルトリエトキシシラン；信越化学工業（株）製）を２重量％の割合で純水に溶解した後、上記のスライドガラスを１時間浸漬し、この溶液から取り出した後に１１０℃で１０分間乾燥した。このようにして、ガラスの表面にアミノ基を導入した。 The slide glass was immersed in a 10N NaOH aqueous solution for 1 hour and then thoroughly washed with pure water. Next, after APS (3-aminopropyltriethoxysilane; manufactured by Shin-Etsu Chemical Co., Ltd.) was dissolved in pure water at a ratio of 2% by weight, the slide glass was immersed for 1 hour and taken out from this solution. Dry at 110 ° C. for 10 minutes. In this way, amino groups were introduced on the surface of the glass.

ついで、５．５ｇの無水コハク酸を１−メチル−２−ピロリドン３３５ｍｌに溶解させた。１Ｍの５０ｍｌのホウ酸ナトリウム（ホウ酸３．０９ｇとｐＨ調整用の水酸化ナトリウムを加えて、純水で５０ｍｌにメスアップしたもの。ｐＨ８．０）に上記コハク酸溶液に加えた。この混合液に上記のガラス基板を２０分間浸漬した。浸漬後、純水で洗浄および乾燥した。このようにして、ガラス基板の表面のアミノ基と無水コハク酸を反応させて、ガラス表面にカルボン酸を導入した。実施例２と同様の操作でグリシン重合体と反応させＤＮＡ固定化基板６とした。この反応スキームを図３に示す。 Subsequently, 5.5 g of succinic anhydride was dissolved in 335 ml of 1-methyl-2-pyrrolidone. 1M 50 ml sodium borate (3.09 g boric acid and sodium hydroxide for pH adjustment was added to make up to 50 ml with pure water. PH 8.0) was added to the succinic acid solution. The glass substrate was immersed in this mixed solution for 20 minutes. After soaking, it was washed with pure water and dried. In this way, the amino group on the surface of the glass substrate was reacted with succinic anhydride to introduce carboxylic acid on the glass surface. The DNA-immobilized substrate 6 was prepared by reacting with the glycine polymer in the same manner as in Example 2. This reaction scheme is shown in FIG.

比較例１
（DNA固定化基板７の作製）
比較として、実施例１と同様の操作でＰＭＭＡ基板上に加水分解によりカルボキシル基を生成させ、ＤＮＡ固定化基板７とした。 Comparative Example 1
(Preparation of DNA-immobilized substrate 7)
For comparison, a carboxyl group was generated on the PMMA substrate by hydrolysis in the same manner as in Example 1 to obtain a DNA-immobilized substrate 7.

比較例２
（DNA固定化基板８の作製）
実施例４と同様の操作でアミノ基を導入したガラス表面に無水コハク酸を反応させることによりカルボキシル基を生成させＤＮＡ固定化基板８とした。

（プローブＤＮＡの固定化）
配列番号１（６０塩基、５'末端アミノ化）、のＤＮＡを合成した。5'-ACATTTTGAGGCATTTCAGTCAGTTGCTCAATGTACCTATAACCAGACCGTTCATCTGGA-3この配列番号１のＤＮＡは５'末端がアミノ化されている。 Comparative Example 2
(Preparation of DNA-immobilized substrate 8)
Carboxyl groups were generated by reacting succinic anhydride on the glass surface into which amino groups had been introduced in the same manner as in Example 4 to obtain a DNA-immobilized substrate 8.

(Immobilization of probe DNA)
The DNA of SEQ ID NO: 1 (60 bases, 5 ′ terminal amination) was synthesized. 5′-ACATTTTGAGGCATTTCAGTCAGTTGCTCAATGTACCTATAACCAGACCGTTCATCTGGA-3 The DNA of SEQ ID NO: 1 is aminated at the 5 ′ end.

これらのＤＮＡを、純水に０．２７ｎｍｏｌ／μｌの濃度で溶かして、ストックソリューションとした。基板に点着する際は、ＰＢＳ(ＮａＣｌを８ｇ、Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏを２．９ｇ、ＫＣｌを０．２ｇ、ＫＨ２ＰＯ４を０．２ｇ純水に溶かし１ｌにメスアップしたものにｐＨ調整用の塩酸を加えたもの、ｐＨ５．５)でプローブの終濃度を０．０２７ｎｍｏｌ／μｌとし、かつ、担体表面のカルボキシル基とプローブＤＮＡの末端のアミノ基とを縮合させるため、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド(ＥＤＣ)を加え、この終濃度を５０ｍｇ／ｍｌとした。そして、これらの混合溶液をおよそ２００ｎｌ取り出して、これを基板に点着した。次いで、基板を密閉したプラスチック容器入れて、３７℃、湿度１００％の条件で２０時間程度インキュベートして、純水で洗浄した。

（検体ＤＮＡの調整）
検体ＤＮＡとして、上記ＤＮＡ固定化基板とハイブリダイズ可能な塩基配列を持つ配列番号５のＤＮＡ（９６８塩基）を用いた。調整方法を以下に示す。 These DNAs were dissolved in pure water at a concentration of 0.27 nmol / μl to obtain a stock solution. When spotting on the substrate, PBS (NaCl 8g, Na2HPO4 · 12H2O 2.9g, KCl 0.2g, KH2PO4 0.2g dissolved in pure water and made up to 1 liter with hydrochloric acid for pH adjustment. In addition, the final concentration of the probe was adjusted to 0.027 nmol / μl at pH 5.5), and 1-ethyl-3- (3 -Dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC) was added to bring the final concentration to 50 mg / ml. And about 200 nl of these mixed solutions were taken out and this was spotted on the board | substrate. Next, the substrate was sealed in a plastic container, incubated at 37 ° C. and 100% humidity for about 20 hours, and washed with pure water.

(Adjustment of sample DNA)
As the sample DNA, DNA of SEQ ID NO: 5 (968 bases) having a base sequence capable of hybridizing with the DNA-immobilized substrate was used. The adjustment method is shown below.

検体DNAとして、上記DNA固定化基板とハイブリダイズ可能な塩基配列を持つDNA（９６８ｂ.ｐ.）を用いた。調整方法を以下に示す。
以下の配列の核酸を合成した。
5'-GGGCGAAGAAGTTGTCCATA-3' （配列番号２：20塩基）
5'-GCAGAGCGAGGTATGTAGGC-3' （配列番号３：20塩基）
これを純水にとかして濃度を１００μＭとした。次いで、ｐKＦ３プラスミドＤＮＡ（タカラバイオ（株）製品番号；３１００）（配列番号４：２２６４塩基）を用意して、これをテンプレートとし、配列番号２および配列番号３のＤＮＡをプライマーとして、ＰＣＲ反応（Polymerase Chain Reaction）により増幅を行った。 As the sample DNA, DNA (968 bp) having a base sequence capable of hybridizing with the DNA-immobilized substrate was used. The adjustment method is shown below.
Nucleic acids having the following sequences were synthesized.
5'-GGGCGAAGAAGTTGTCCATA-3 '(SEQ ID NO: 20 bases)
5'-GCAGAGCGAGGTATGTAGGC-3 '(SEQ ID NO: 3: 20 bases)
This was dissolved in pure water to a concentration of 100 μM. Next, pKF3 plasmid DNA (Takara Bio Inc. product number; 3100) (SEQ ID NO: 2264 bases) was prepared, which was used as a template, and the DNA reaction of SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 3 was used as a primer for PCR reaction ( Amplification was performed by Polymerase Chain Reaction.

ＰＣＲの条件は以下の通りである。すなわち、ExTaq ２μｌ、 10×ExBuffer ４０μｌ、 dNTP Mix ３２μｌ（以上はタカラバイオ（株）製；製品番号ＲＲ００１Ａに付属）、配列番号２の溶液を２μｌ、配列番号３の溶液を２μｌ、テンプレート（配列番号４）を０．２μｌ加え、純水によりトータル４００μｌにメスアップした。これらの混合液を、４つのマイクロチューブに分け、サーマルサイクラーを用いてＰＣＲ反応を行った。これを、エタノール沈殿により精製し、４０μｌの純水に溶解した。 The conditions for PCR are as follows. That is, ExTaq 2 μl, 10 × ExBuffer 40 μl, dNTP Mix 32 μl (the above is manufactured by Takara Bio Inc .; attached to product number RR001A), SEQ ID NO: 2 solution 2 μl, SEQ ID NO 3 solution 2 μl, Template (SEQ ID NO: 4) 0.2 μl was added, and the volume was made up to 400 μl with pure water. These mixed solutions were divided into four microtubes, and PCR reaction was performed using a thermal cycler. This was purified by ethanol precipitation and dissolved in 40 μl of pure water.

次いで、９塩基のランダムプライマー（タカラバイオ（株）製；製品番号３８０２）を６ｍｇ／ｍｌの濃度に溶かし、上記のＰＣＲ反応後精製したＤＮＡ溶液に２μｌ加えた。この溶液を１００℃に加熱した後、氷上で急冷した。これらにＫｌｅｎｏｗＦｒａｇｍｅｎｔ（タカラバイオ（株）製；製品番号２１４０ＡＫ）付属のバッファーを５μｌ、ｄＮＴＰ混合物（dATP、dTTP、dGTPの濃度はそれぞれ２．５ｍＭ、dCTPの濃度は４００μＭ）を２．５μｌ加えた。さらに、Ｃｙ３−ｄＣＴＰ（アマシャムファルマシアバイオテク製；製品番号ＰＡ５３０２１）を２μｌ加えた。この溶液に１０ＵのＫｌｅｎｏｗＦｒａｇｍｅｎｔを加え、３７℃で２０時間インキュベートし、Ｃｙ３で標識された検体ＤＮＡ（配列番号５：９６８塩基）を得た。さらにこれをエタノール沈殿により精製し、乾燥した。 Next, a 9-base random primer (manufactured by Takara Bio Inc .; product number 3802) was dissolved at a concentration of 6 mg / ml, and 2 μl was added to the DNA solution purified after the PCR reaction. This solution was heated to 100 ° C. and then rapidly cooled on ice. 5 μl of buffer attached to Klenow Fragment (Takara Bio Inc .; product number 2140AK) and 2.5 μl of dNTP mixture (dATP, dTTP, and dGTP concentrations of 2.5 mM and dCTP concentration of 400 μM, respectively) were added thereto. . Furthermore, 2 μl of Cy3-dCTP (manufactured by Amersham Pharmacia Biotech; product number PA53021) was added. 10 U of Klenow Fragment was added to this solution and incubated at 37 ° C. for 20 hours to obtain a sample DNA (SEQ ID NO: 5: 968 bases) labeled with Cy3. This was further purified by ethanol precipitation and dried.

この標識化された検体DNAを、１重量％ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）、５×ＳＳＣ（５×ＳＳＣとはＮａＣｌを４３．８ｇ、クエン酸３ナトリウム水和物を２２．１ｇの純水にとかし、２００ｍｌにメスアップしたもの。またＮａＣｌを４３．８ｇ、クエン酸３ナトリウム水和物を２２．１ｇ純水にとかし、１ｌにメスアップしたものを１×ＳＳＣと表記し、これの１０倍濃縮液を１０×ＳＳＣ、５倍希釈液を０．２×ＳＳＣと表記する。）、０．１重量％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）、０．０１重量％サケ***ＤＮＡの溶液（各濃度はいずれも終濃度）、４００μｌに溶解し、ハイブリダイゼーション用の溶液とした。
（ハイブリダイゼーション）
上記で得られたプローブＤＮＡを固定化したそれぞれの基板に上記検体ＤＮＡをハイブリダイゼーションさせた。具体的には、先に用意したプローブ核酸が固定化されている担体にハイブリダイゼーション用の溶液を１０μｌ滴下し、その上にカバーガラスをかぶせた。また、カバーガラスの周りをペーパーボンドでシールし、ハイブリダイゼーションの溶液が乾燥しないようにした。これを、プラスチック容器の中に入れ、６５℃、湿度１００％の条件で１０時間インキュベートした。インキュベート後、カバーガラスを剥離後に洗浄、乾燥した。
（測定）
ＤＮＡチップ用のスキャナー（Axon Instruments社のGenePix 4000A）に上記処理後の基板をセットし、レーザー出力３３％、フォトマルチプライヤーの電圧を５００Ｖに設定した状態で測定を行った。その結果を表１に示す。 This labeled sample DNA is dissolved in 1% by weight BSA (bovine serum albumin), 5 × SSC (5 × SSC is 43.8 g of NaCl and trisodium citrate hydrate is dissolved in 22.1 g of pure water. 200 ml of NaCl, 43.8 g of NaCl and 22.1 g of trisodium citrate hydrate dissolved in pure water, and 1 ml of the mess up to 1 l. The solution is expressed as 10 × SSC, and the 5-fold diluted solution is expressed as 0.2 × SSC.), 0.1 wt% SDS (sodium dodecyl sulfate), 0.01 wt% salmon sperm DNA solution (each concentration is (Final concentration), dissolved in 400 μl to obtain a solution for hybridization.
(Hybridization)
The sample DNA was hybridized to each substrate on which the probe DNA obtained above was immobilized. Specifically, 10 μl of a hybridization solution was dropped on a carrier on which the probe nucleic acid prepared previously was immobilized, and a cover glass was placed thereon. In addition, the periphery of the cover glass was sealed with a paper bond so that the hybridization solution was not dried. This was placed in a plastic container and incubated at 65 ° C. and 100% humidity for 10 hours. After incubation, the cover glass was peeled off, washed and dried.
(Measurement)
The substrate after the above treatment was set on a DNA chip scanner (Axon Instruments GenePix 4000A), and measurement was performed with the laser output set to 33% and the photomultiplier voltage set to 500V. The results are shown in Table 1.

表１は種々の手法により作製したＤＮＡ固定化基板を用いた核酸ハイブリダイゼーション後の蛍光シグナルを示したものである。 Table 1 shows fluorescence signals after nucleic acid hybridization using DNA-immobilized substrates prepared by various methods.

比較例１のＤＮＡ固定化基板７と比較して、グリシン１分子、グリシン４分子やポリグリシンを介してＤＮＡ固定化したＤＮＡ固定化基板１、２、３は高効率なハイブリダイゼーションが観察された。また、ＤＮＡ固定化基板４の結果から、重合体の末端がスクシンイミド基で修飾されていてもほぼ同様の効果が確認された。ＤＮＡ固定化基板５の結果からアミノ酸がアラニンの場合においてもグリシンと同様の効果あることが確認された。さらに、ＤＮＡ固定化基板６と８を比較して、ガラス基板を用いた場合でも、重合体を介してＤＮＡを固定化することによりハイブリダイゼーションの高効率化が確認された。これらのことからいずれの基板においても、固体基板上に重合体を固定化し、重合体に結合したアシル基とＤＮＡのアミノ基を縮合させて固定化することにより、ハイブリダイゼーション効率が飛躍的に向上することが示された。 Compared with the DNA-immobilized substrate 7 of Comparative Example 1, high-efficiency hybridization was observed for the DNA-immobilized substrates 1, 2 and 3 immobilized with DNA via 1 molecule of glycine, 4 molecules of glycine and polyglycine. . Further, from the result of the DNA-immobilized substrate 4, almost the same effect was confirmed even when the polymer terminal was modified with a succinimide group. From the results of the DNA-immobilized substrate 5, it was confirmed that the same effect as glycine was obtained even when the amino acid was alanine. Furthermore, comparing the DNA-immobilized substrates 6 and 8, it was confirmed that even when a glass substrate was used, the efficiency of hybridization was improved by immobilizing DNA via a polymer. Therefore, in any substrate, hybridization efficiency is dramatically improved by immobilizing a polymer on a solid substrate and condensing the acyl group bound to the polymer with the amino group of DNA. Was shown to do.

固体基板上での重合体を介して選択結合星物質の固定化Immobilization of selectively bonded star materials via polymers on solid substrates ＰＭＭＡ表面への選択結合性物質（ＤＮＡ）の固定化反応スキーム１Immobilization reaction scheme of selective binding substance (DNA) to PMMA surface 1 ＰＭＭＡ表面への選択結合性物質（ＤＮＡ）の固定化反応スキーム２Immobilization reaction scheme of selective binding substance (DNA) to PMMA surface 2 ガラス表面への選択結合性物質（ＤＮＡ）の固定化反応スキーム４Immobilization reaction scheme of selective binding substance (DNA) to glass surface Scheme 4

符号の説明Explanation of symbols

１固体基板
２重合体
３選択結合性化合物
４ＰＭＭＡ基板
５スクシンイミド基
６グリシンまたはアラニン
７末端アミノ化ＤＮＡ
８グリシン重合体
９ガラス基板
１０無水コハク酸 1 solid substrate 2 polymer 3 selective binding compound 4 PMMA substrate 5 succinimide group 6 glycine or alanine 7 terminal aminated DNA
8 Glycine polymer 9 Glass substrate 10 Succinic anhydride

Claims

固体表面に選択結合性物質を固定化した選択結合性物質固定化担体であって、該固体表面に重合体が共有結合で結合しており、該重合体に結合している官能基と選択結合性物質が共有結合にて固定化されていることを特徴とする選択結合性物質固定化担体。 A selective-binding substance-immobilized carrier having a selective-binding substance immobilized on a solid surface, wherein a polymer is covalently bonded to the solid surface and is selectively bonded to a functional group bonded to the polymer. A selective binding substance-immobilized carrier, wherein the active substance is immobilized by a covalent bond.

該固体表面が樹脂からなる請求項１に記載の選択結合性物質固定化担体。 The selective binding substance-immobilized carrier according to claim 1, wherein the solid surface is made of a resin.

該固体表面が下記一般式（１）を構造単位として有する請求項１に記載の選択結合性物質固定化担体。

（式中、Ｒ^１、Ｒ^２およびＲ^３はそれぞれ炭素数１から２０のアルキル基、炭素数６から１８のアリール基、又は水素原子を表す。また、Ｘは、Ｏ、ＮＲ^３またはＣＨ₂を表す。）
The selective binding substance-immobilized carrier according to claim 1, wherein the solid surface has the following general formula (1) as a structural unit.

(Wherein R ¹ , R ² and R ³ each represents an alkyl group having 1 to 20 carbon atoms, an aryl group having 6 to 18 carbon atoms, or a hydrogen atom. X represents O, NR ³ or CH _2. Represents.)

該重合体に結合している官能基がアシル基である請求項１から３のいずれかに記載の選択結合性物質固定化担体。 4. The selective binding substance-immobilized carrier according to claim 1, wherein the functional group bonded to the polymer is an acyl group.

該重合体がペプチドまたはペプチド誘導体由来のものである請求項１から３のいずれかに記載の選択結合性物質固定化担体。 4. The selective binding substance-immobilized carrier according to claim 1, wherein the polymer is derived from a peptide or a peptide derivative.

選択結合性物質が核酸である請求項１から５のいずれかに記載の選択結合性物質固定化担体。 The selective binding substance-immobilized carrier according to any one of claims 1 to 5, wherein the selective binding substance is a nucleic acid.