JP4280304B2 - 造影剤 - Google Patents

Description

【０００１】
【発明の分野】
本発明は、超常磁性微粒子造影剤に関するものであり、特に、血管系の磁気共鳴画像において使用されるもの及びその調製に関するものである。
【０００２】
【発明の背景】
例えば、Ｘ線、超音波及び磁気共鳴（ＭＲ）画像といった画像診断療法において、異なる組織間又は器官同士、或いは健康な組織と疾患組織のコントラストを増強するため、造影剤を使用する技術は確立されたものとなっている。様々な画像診断療法において、種々の方法で造影剤によりコントラストを増強している。例えば、プロトンＭＲ画像診断法において、一般に造影剤により、画像を作り出すために使用されるＭＲ信号を出す画像核（概して水プロトン）の特有緩和時間（Ｔ₁及びＴ₂）を調節することにより、コントラスト増強効果を得ている。
【０００３】
常磁性、超常磁性、強磁性及びフェリ磁性といった磁気特性を備えた物質を生物体に注入した場合、組織水プロトンのＴ_１及びＴ_２（又はＴ_２＊）の値をさげることができる。Ｔ_２（又はＴ_２＊）が下がらなければＴ_１は下がらないが、Ｔ_１の分別低下は、Ｔ_２（又はＴ_２＊）のそれとは異なり得る。Ｔ_１の分別低下がＴ_２（又はＴ_２＊）のそれより大きい場合、ＭＲ画像強度が増加し、前記物質は、Ｔ_１又は陽性造影剤と呼ばれる。Ｔ_１の分別低下がＴ_２（又はＴ_２＊）のそれより小さい場合、ＭＲ画像強度が低下し、前記物質は、Ｔ_２（又はＴ_２＊）又は陰性造影剤と呼ばれる。
【０００４】
ここでは、超常磁性、フェリ磁性及び強磁性の磁気特性を備えた粒子を磁気粒子と呼ぶ。
【０００５】
磁器物質のＭＲ造影剤としての使用に関する文献における最初の提案は、１９７８年のラウターバー（Lauterbur）による、マンガン塩を使用するというものであった。特許文献における最初の提案は、欧州特許第71564号明細書（及び同一ケースの米国特許第4647447号明細書）のシェリング（Schering）による、ランタニドイオンガドリニウム（III）といった常磁性金属イオンのキレート錯体を使用するというものであった。
【０００６】
シェリング（Schering）、ナイコムド（Nycomed）及びブラッコ（Bracco）からそれぞれ、マグネヴィスト（MAGNEVIST）、オムニスキャン（OMNISCAN）及びプロハンス（PROHANCE）という商標で市販されている、ＧｄＤＴＰＡ、ＧｄＤＴＰＡ−ＢＭＡ及びＧｄＨＰ−Ｄ０３ＡといったようなＭＲ画像診断用の初期市販造影剤は、全て常磁性ランタニドイオンの可溶性キレート錯体であり、使用に際しては、陽性造影剤となり、分散した部分の画像強度を増強する。
【０００７】
従って、微粒子強磁性剤、微粒子フェリ磁性剤及び微粒子超常磁性剤を、陰性ＭＲ造影剤として使用することが提案されていた。そのような微粒子剤の経口製剤は、ここでは一般に磁気粒子と呼んでいるが、消化管の画像診断用に市販されるようになってきており、例としては、ナイコムドイメージング（Nycomed Imaging）が販売しているアブドスキャン（ABDOSCAN）という製品が挙げられる。しかしながら、肝臓及び脾臓器官は、比較的迅速に血液中から異質の微粒子物質を除去する作用を有するため、肝臓及び脾臓器官の画像診断用にそういった微粒子剤の非経口投与も広く提案されている。例として、そのような薬剤を使用した肝臓及び脾臓画像診断は、ウィダー（Widder）が米国特許第4859210号明細書において提案している。
【０００８】
更に最近では、例えば、米国特許第5160725号明細書及びWO-94/21240号明細書においてピルグリム（Pilgrimm）が提案しており、細網内皮系による、血液からの非経口的に投与された磁気粒子の吸収が、安定剤物質を磁気粒子表面に化学結合させることにより阻害されるため、血液滞留時間が延長される。
【０００９】
この方法で安定剤として使用できる物質としては、オリゴ糖類及び多糖類といった炭水化物、同様にポリアミノ酸、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド及びポリアルキレンオキシド（ポロキサマー（poloxamers）及びポロキサミン（poloxamines）を含む）、並びに米国特許第5160725号明細書及びWO-94/21240号明細書においてピルグリム（Pilgrimm）が、PCT/GB94/02097号明細書においてナイコムド（Nycomed）が、米国特許第5464696号明細書においてブラッコ（Bracco）が、そして米国特許第4904479号明細書においてイルム（Illum）が提案している、その他の物質が挙げられる。
【００１０】
この様式で被覆された磁気粒子は、その後血液プール剤（つまり、血管系の画像診断用）として、又はリンパ腺画像診断用に使用できる。または、バイオターゲッティング剤に接合させ、標的組織又は器官の画像診断に使用できる。
【００１１】
血液プール剤として投与する場合、磁気粒子において血液プロトンのＴ_１の分別低下がＴ_２（又はＴ_２＊）の分別低下より大きく、それによりそのような薬剤を血管系の陽性ＭＲ剤として使用できることが分かっている。
【００１２】
非経口的使用においては、複合粒子のサイズ及び粒度分布、並びに全粒子表面の化学特性は、造影効力、血液半減期、及び造影剤の体内分布並びに生分解を測定する上で非常に重要である。磁気粒子サイズ（つまり、磁気物質の結晶サイズ）は、単一ドメインサイズ範囲内（粒子が、超常磁であるため、ヒステレシスを持たず、凝集量を減らす傾向を有するような）にあるのが理想的である。粒子が均一の体内分布、体内除去及びコントラスト効果を有するように、全粒子粒度分布は狭くなっている。磁気粒子は、例えば、血液半減期を延長させる、又は安定性を増加させることにより、粒子体内分布を調節する物質、或いは腫瘍の部位など、標的部位へ優先的に分布させる標的ベクターとして作用する物質の表面被膜物質と共に提供されるのが好ましい。
【００１３】
平均結晶サイズ、言い換えれば磁心物質の平均サイズは、一般に、１〜５０ｎｍの範囲内であるのがよく、１〜２０ｎｍであるのが好ましく、２〜１５ｎｍが特に好ましい。血液プール剤として使用する場合、あらゆるコーティング物質を含む平均全粒径は、３０ｎｍ未満であるのが好ましい。（粒径は、電子顕微鏡により測定できる。）そのような粒径の超常磁性結晶又は複合粒子の生成自体に、特に問題はない。しかしながら、所望の粒径及び許容できる粒度分布を有し、過度に結晶凝集しない粒子を生成する上では、問題が存在する。本発明の一態様はこの問題を解決するものである。
【００１４】
概して、磁気結晶は、一般的には、ポリマー性コーティング剤溶液中の液相沈降反応により生成される（例えば、米国特許第4452773号明細書においてモルデイ（Molday）が記載しているような共沈技術を用いる）。この技術は、比較的多分散系の粒子を生成し、それらの粒子は、例えば、遠心分離法又はクロマトグラフィーによる後続のサイズ分画工程を必要とする。例えば、アドバンスドマグネティクス（Advanced Magnetics）の製品ＡＭＩ２２７を製造するような技術によるものである。
【００１５】
特に有益な特性を備えた磁気粒子は、分枝状ポリマー含有水溶性媒質において沈降反応させ、その後磁気粒子及び開裂ポリマー被膜を含む複合粒子を遊離させるために、ポリマーを開裂させることにより生成できることを見出した。
【００１６】
【発明の簡単な説明】
従って、本発明は、一態様によれば、複合超常磁性酸化鉄粒子を生成するためのプロセスであり、前記プロセスが、以下の連続段階を含む：
（ｉ）加熱された水溶液中に、デンプン、第一及び第二鉄塩、並びに塩基を混合し；
（ｉｉ）ｐＨを６．０から８．５の範囲内まで下げ；
（ｉｉｉ）酸化物で処理し、前記デンプンを開裂させ、前記粒子を遊離させ；
（ｉｖ）前記の遊離した粒子を洗浄し、濾過する。
【００１７】
【図面の簡単な説明】
図１、２及び３は、本発明に係る造影剤を投与したラビットの、投与前後におけるコントラストＴ₁−重価ＭＲ画像を示している。
【００１８】
［発明の詳細な説明］
本発明の工程で使用する親水性分枝状有機ポリマーは、いかなる天然、合成又は半合成の分枝状ポリマーであってもよく、必要であれば直鎖親水性ポリマーに接合する又は直鎖親水性ポリマーを架橋することによって生成してもよい。
【００１９】
前記分枝状親水性ポリマーが、広範囲にわたって架橋されたポリマーである場合、本発明の工程において、前記ポリマーの開裂により、架橋されたポリマーマトリックスが分解される。それゆえ、前記架橋結合は、磁気粒子の著しい品質低下を引き起こすことのない条件のもとで、化学開裂又は生化学開裂しやすいものであることが好ましい。そこで、エステル架橋ヒドロゲル形成ポリマー（例えば、直鎖炭水化物（例えば、デキストラン）又はポリビニルアルコールのようなポリマーを有する架橋ヒドロキシ基により形成されたもの）は、そのような架橋ポリマーとして特に適したものである。必要であれば、前記ポリマーは、エステル開裂率を制御できるよう適切に置換してもよい。この場合、エステル開裂は、例えば、アンモニア又はアルカリ金属水酸化物を用いた塩基処理法によるものであってもよい。
【００２０】
しかしながら、本発明の工程において、特に好ましい親水性分枝状ポリマーは、天然、合成又は半合成の炭水化物であり、特に、水溶性ゲルを形成できる物質が好ましく、更に、例えば、グリコーゲンのような多糖類物質が好ましく、そして更に好ましいのは、デンプン類である。必要であれば、本発明の工程において、少なくとも一ポリマーが分枝状である親水性ポリマーの混合物を使用してもよい。前記ポリマーとしてデンプン類を使用する場合、天然のデンプン類、又は、例えば、酸で処理された、又は酵素で処理された、或いは可溶性にされたデンプンのような、加工デンプン類であってもよい。天然のデンプン類、特に、トウモロコシ、ジャガイモ、お米又は小麦のデンプンのような、植物由来デンプンが特に好ましい。
【００２１】
自然のデンプン類は、通常直鎖状のアミロースと分枝状アミロペクチン多糖類の化合物である。本発明を実施する際、アミロース成分は、許容できるものであるが、分散状態から、本質的に不溶性である微晶質状態への主として不可逆的な遷移といった、後退を引き起こすほど高くないのものが好ましい。このため、トウモロコシデンプン又は小麦デンプンよりも、アミロペクチンの豊富なジャガイモデンプンを使用することが好ましい。
【００２２】
本発明において使用されるポリマー物質は、水溶媒質での溶解及びその熱処理により変化する物質であり、例えば、粒状から、まず膨張し、部分的に溶解するデンプンのような物質である場合、反応媒質の熱履歴が、最終生成物の特性に影響を及ぼし得る。そのような場合、前記媒質の粘性及び構造をよりよくコントロールできる熱履歴が好ましい。従って、デンプン類に対しては、特に反応媒質を生成、冷却し、その後、再加熱することが好ましく、例えば、６０〜９５℃で水溶性分散液を生成し、５〜８０℃の間に（例えば５〜６０℃）冷却し、そして４５〜８５℃（例えば、４５〜８０℃）に再加熱する。この方法により、沈降媒質の有益な構造を得ることができる。
【００２３】
前記分枝状親水性有機ポリマーは、水溶媒質内に分散した沈降播種部位を提供し、均一で小さな沈降粒子が形成できると考えられる。ゼラチン又はデキストランのような、無分枝状親水性ポリマー、又はシリカゲルのような無機ゲルの使用は効果的でない。
【００２４】
前記親水性分枝状ポリマーは、沈降媒質を、大気温又は周囲温度、例えば、０〜６０℃で、ゲル状にするのに十分な濃度で存在しているのが好ましい。適用される前記濃度は、８０℃までの温度で、ゲルを生成するような濃度であると便利である。デンプンの場合、好ましい濃度は、１〜２００ｇ／Ｌ、特に２〜１５０ｇ／Ｌ、とりわけ２０〜１００ｇ／Ｌ、そして更に好ましい濃度は４０〜９０ｇ／Ｌである。
【００２５】
前記沈降媒質は水溶性であるが、水溶性のアルコール、エーテル又はケトンのような、共溶媒と水の混合剤を含有していてもよい。
【００２６】
上記のように、本発明において使用する沈降媒質は、ゲルと呼ばれるコロイド状物質であるのが特に好ましい。そのような媒質において、ポリマー性ゲル形成物質は、水溶性分散媒質が浸透するネットワークを形成する。そのようなゲルは、一般に、水溶性分散媒質単独よりも粘性が高いであろうが、本発明の目的において、前記ゲルは、硬質、又は半硬質自立状態にあるほど高い粘性を必要としない。実際、ゲル構造は、沈降媒質が単に自由流動溶液であるように思われるほど弱いものでありうる。しかしながら、その場合、前記媒質のゲル特性は、そのチキソトロピー特性、すなわち前記媒質の粘性が攪拌により低下することにより難なく確認できる。
【００２７】
前記沈降溶媒は、上述したように、分枝状ポリマーを含有していなければならないが、例えば、直鎖状であるその他のゲル形成ポリマーを含んでいてもよい。この点において、使用に適しているポリマーとしては、タンパク質、多糖類、プロテオグリカン及びゲル形成界面活性剤、例えば、Ｆ−１２７、Ｆ−１０８、及びＦ−６８のような、プルロニック及びテトロニックシリーズ（Pluronic and Tetronic series）のブロックコポリマー界面活性剤が挙げられる。これらの界面活性剤は、本発明の工程において有用である昇温状態及びｐＨレベルで水溶性媒質中にゲルを形成する。従って、例えば、ゲル状の沈降媒質は、ゲル形成直鎖ブロックコポリマー界面活性剤及びアミロペクチンのような分枝状有機ポリマーの水溶性分散液を使用して調製することができる。
【００２８】
しかしながら、前記沈降媒質のゲルマトリックスは、磁気粒子を遊離するように、ポリマー成分のうち少なくとも一成分、好ましくは、少なくとも前記分枝状ポリマーが、化学的に（又は生化学的に）切断されるものでなければならない。このため、強力に架橋されたポリマーの使用は望ましくない。
【００２９】
粒子沈降は、例えば、塩基を用いてゲルを浸透させることによるなど、硬質又は半硬質ゲル状の水溶性媒質を用いることにより生じ得る。しかし、最も好ましいのは、加熱、攪拌（例えば、かき混ぜ）した水溶性媒質中で沈降が生じる場合であり、前記水溶性媒質の、水に対する粘性は、顕著に増強されていてもされていなくてもよい。特に好ましいのは、温度４０〜９５℃の範囲内で、緩やかに攪拌しながら沈降が生じる場合である。
【００３０】
水溶性沈降媒質のチキソトロピー特性を操作することにより、一範囲の粒径を有する本発明に係る複合粒子を生成できる。
【００３１】
本発明の工程における磁気粒子形成は、非晶物質を形成し、そして、例えば４０〜９５℃、好ましくは５０〜９３℃の昇温状態で、磁気粒子に転換するというドメインを有する二段階工程であると考えられる。粒子の磁気特性の発達は、数分から数時間、例えば最長３時間に渡ってモニターできることが分かっている。しかしながら、実際、磁気特性の発達は実質的には二時間以内に完了し、重要な磁化は、２０分以内に起ることが分かっている。
【００３２】
水溶性媒質中に形成される磁気粒子は、混合金化合物を含むいかなる沈降し得る磁気金属酸化物又は酸化水酸化物のものであってもよく、例としては、米国特許第4827945号明細書（グロマン（Groman））、欧州特許第525189号明細書（名糖産業）、欧州特許第580878号明細書（バスフ（BASF））、及びPCT/GB94/02097明細書（ナイコムド（Nycomed））に記載の、又はピルグリム（Pilgrimm）（スプラ（supra））による化合物がある。この点において、特に、化学式
（Ｍ^ＩＩＯ）_ｎ（Ｍ^ＩＩＩ _２Ｏ_３）
（但し、上記式中、Ｍ^ＩＩ及びＭ^ＩＩＩは、ＩＩ又はＩＩＩ価数状態における遷移金属又はランタニド金属であり、そのうち少なくとも一つは、Ｆｅであり、ｎはゼロ又は正数である）、又更に詳しくは、化学式
（Ｍ^ＩＩＯ）_ｎＦｅ_２Ｏ_３（Ｍ^ＩＩＩ _２Ｏ_３）_ｍ
（但し、上記式中、Ｍ^ＩＩは、Ｆｅ、Ｍｇ、Ｂｅ、Ｍｎ、Ｚｎ、Ｃｏ、Ｂａ、Ｓｒ、及びＣｕのような二価金属であり、Ｍ^ＩＩＩは、Ａｌ、Ｙｂ、Ｙ、Ｍｎ、Ｃｒ又はランタニド系のような三価金属であり、ｎ及びｍはそれぞれゼロ又は正数である）の磁気酸化鉄化合物があげられる。
【００３３】
前記磁気粒子は、マグヘマイト（γ−Ｆｅ_２Ｏ_３）及び磁鉄鉱（Ｆｅ_３Ｏ_４）に代表される、化学式（ＦｅＯ）_ｎＦｅ_２Ｏ_３（但し、式中ｎは０〜１の範囲にある）の酸化鉄、又はそのような磁気酸化鉄の混合物であるのが好ましい。
【００３４】
Ｆｅ^ＩＩＩ及びＦｅ^ＩＩイオン源として、広範囲の鉄塩を使用することができる。例えば、ＦｅＣｌ_２、ＦｅＣｌ_３、Ｆｅ^ＩＩＩクエン酸塩、Ｆｅ^ＩＩグルコン酸塩、ＦｅＳＯ_４、Ｆｅ_２（ＳＯ_４）_３、Ｆｅ^ＩＩシュウ酸塩、Ｆｅ（ＮＯ_３）_３、Ｆｅ^ＩＩアセチルアセトネート、Ｆｅ^ＩＩエチルジアンモニウム硫酸塩、Ｆｅ^ＩＩフマル酸塩、Ｆｅ^ＩＩＩリン酸塩、Ｆｅ^ＩＩＩピロリン酸塩、アンモニウムＦｅ^ＩＩＩクエン酸塩、アンモニウムＦｅ^ＩＩ硫酸塩、アンモニウムＦｅ^ＩＩＩ硫酸塩、及びアンモニウムＦｅ^ＩＩシュウ酸塩が挙げられる。Ｆｅ^ＩＩとＦｅ^ＩＩＩイオンの割合は、１：５〜５：１の範囲内にあるのが好ましい。
【００３５】
一般に塩基、好ましくは、アルカリ金属水酸化物（例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム又は水酸化リチウム）又は水酸化アンモニウム、特に好ましくは、濃縮水酸化アンモニウムのような水溶性塩基を添加し、上記水溶性媒質のｐＨを、沈降開始閾値以上に設定することにより、沈降が始まる。添加する塩基のｐＫｂは、上記水溶性媒質のｐＨを、沈降開始閾値以上、例えば１０以上にするのに十分なものでなければならない。
【００３６】
前記塩基は、金属イオン及びポリマーを含む水溶性媒質に添加するのが好ましい。その代わりに、前記塩基とポリマーを化合し、その後前記金属イオンを添加してもよい。例えば４０〜９５℃、好ましくは５０〜６０℃の昇温状態で、攪拌しながら前記化合物の水溶液を混合することにより添加すると都合がよい。
【００３７】
沈降開始後、種磁気粒子結晶は、分枝状ポリマーにより限界設定された金属水酸化物又は金属イオンの非結晶常磁性ドメイン内に形成され、これら非結晶ドメインが完全に形成された磁気粒子に転換されると考えられる。従って、粒子形成は、数分から数日、例えば１分〜２４時間、好ましくは、２０分〜１０時間、とりわけ１〜５時間といった、選択した時間の間に起ればよい。
【００３８】
前記粒子形成が、ここで特定された温度範囲の上限近く、例えば９０℃で起る場合、前記媒質が、比較的短時間、例えば最高２時間といった期間のみ、この昇温状態に保たれていることが好ましい。
【００３９】
前記塩基、沈降し得る金属イオン及びポリマーを低い温度で化合し、そして磁気粒子が形成されるよう、前記媒質を高い温度まで加熱し、その後温度上昇率を、例えば、１０〜１００℃/hourに、注意深くコントロールしなければならない。従って、粒子形成中、前記水溶性媒質の温度は、コントロールしながら（例えば、実質的に時間と比例して温度が上昇するように）上昇させるのが好ましい。例えば、５５℃の混合温度から、二時間をかけて最終温度９０℃まで上昇させるのが好ましい。
【００４０】
前記粒子形成期間後、前記反応媒質のｐＨを、例えば、６．０〜８．５にして中和することが特に好ましい。例えば、前記媒質を冷却し、中性になるまで洗浄できる凝固ゲルを生成することによって、又は酸（許容できる酸としては、例えば、塩酸、硫酸及び硝酸が挙げられる）或いは固体炭酸で前記媒質を中和することによって、又は、蒸気圧が高い場合（例えば、それが水酸化アンモニウムの場合）、真空にし、前記塩基を除去することによって中和される。中和された媒質は、直ちに更に処理することができる。
【００４１】
この中和段階において、前記媒質が凝固ゲルを形成でき、余分な金属塩及び塩基を除去する働きをする場合、洗浄は特に効果的である。都合の良いことに、洗浄は、好ましくは、事前に３〜１５℃まで冷却した脱イオン水を用いて行ってもよく、そのｐＨがほぼ中性になるまで継続することが好ましい。
【００４２】
ポリマー被覆磁気粒子を遊離している間に、ポリマーを開裂させることなく、前記ゲルマトリックスを分解するため、前記の洗浄したゲルを単に超音波で処理することもできるが、一方、例えば、前記ポリマーの分子構造を分解することにより、前記被覆粒子を遊離するため、前記ポリマーを開裂させる場合、前記微粒子生成物が特に有益な特性を有することが分かっている。化学分解は、酸化剤又は塩基のような活性化学剤を使用して行ってもよいが、酵素のような生化学剤を使用して行ってもよい。デンプンのような炭水化物ポリマーの場合、アミラーゼ、例えばα−アミラーゼのような酵素を用いて前記ポリマーを酵素で開裂させると都合がよい。しかしながら、酸化剤を用いてポリマーを開裂させるのが特に好ましい。痕跡レベルで、それ自体、生物学的に許容できる酸化剤、又は酸化剤の還元産物が同様に生物学的に許容できる酸化剤が好ましい。例えば、ハロゲンオキシアニオン（例えば、アルカリ金属次亜塩素酸塩（次亜塩素酸ナトリウム及び次亜塩素酸カルシウム等）、過ヨウ素酸塩（過ヨウ素酸ソーダ等）、過マンガン酸塩（KMnO₄等）、過酸化水素（ペルオキシド:H₂O₂等）及び酵素酸化剤が挙げられる。使用される余分な酸化剤は全てその後不活性化するのが好ましい。例えば、酸化剤として、次亜塩素酸塩を使用する場合、尿素を添加することによって不活性化するのが好ましい。酸化剤を使用してポリマーを開裂させる場合、それにより遊離する磁気粒子は、負の表面電荷を持っており、粒子の凝集作用は更に低下する。
【００４３】
前記のポリマー開裂に使用される化学剤は、磁気粒子を侵食（腐食）したり、それらの粒子の磁気特性を失わせる薬剤でないものが好ましい。従って、酸性薬剤の使用は一般に望ましくない。
【００４４】
粒子の被膜として少量又は大量の残留ポリマーを残すために、ポリマー開裂が起る程度は、必要に応じて変えることができる。被膜は一般に望ましく、結果として、複合粒子の全粒径が前記磁気粒子核のものより大きいことにも注目するべきである。精選した開裂技術によれば、前記粒子に被膜として残された残留物は、ポリマー性、オリゴマー性、又はモノマー性であってもよい。
【００４５】
ポリマー開裂後、例えば、限外濾過又はダイアフィルトレーション等の膜ろ過技術を用いて、生成物を洗浄し、汚染物をなくすのが好ましい。
【００４６】
結果として生じる全粒径は、概して、１〜３００nmの範囲にあり、４〜３０nmであるのが好ましく、８〜２０nmが特に好ましい。この点に関して、前記ポリマーの好ましい酸化剤による開裂では、酵素による開裂処理の際に得る全粒径よりも小さい粒径になる傾向があり、また、その両方においてゲルマトリックスを単に超音波処理した場合の粒径よりも小さい粒径となることが分かる。
【００４７】
好ましい一実施例において、前記複合粒子は、全反応時間を短縮し、中間物質の生成及び処理を避け、そしてコア磁気粒子への熱応力を低下させるワンポット反応により、調製することができる。この実施例では、鉄（ＩＩＩ）塩及び鉄（ＩＩ）塩（例えば、塩化物）は、デンプンと水の溶液に溶解し、酸化鉄粒子は塩基（例えばアンモニア水）を添加することにより沈殿する。その反応は、７０〜９０℃で１〜３時間継続でき、その後、余分な塩基量を減少させる（例えば、アンモニアを使用した場合、真空にし、及び／又は前記の熱い混合物上に窒素を流す）。その後、そのｐＨを、８．２未満又は前記反応混合物が緩衝能を失う点まで下げる。そして、前記混合物が熱いうちに（例えば、７０〜９０℃）前記酸化剤（例えば、次亜塩素酸ナトリウム）を添加し、許容できる複合粒子径になるまで、７０〜９０℃で酸化させることができる。１０〜２０ｎｍの範囲内の複合粒子径を得るための反応時間は、約３０〜１２０分である。０．４７テスラ、４０℃で、磁気飽和モーメントは、５０ＥＭＵ／ｇ ＦｅＯｘ以上、ｒ_１が１５ｍＭ^−１・ｓ^−１より大きく、及びｒ_２／ｒ_１が２．３より小さいのが望ましい。前記反応混合物は、その後尿素を用いて冷却し、例えば、０．２μｍフィルターを通して濾過する。そのデンプン残留物は、例えば、２０〜２００ｋＤ分子カットオフの限外ろ過膜を使用して、ダイアフィルトレーションにより除去できる。
【００４８】
前記「コア」磁気粒子は、単一ドメイン粒子の粒径特性を備えているのが好ましく、その粒径は、例えば、１〜５０nm、特に１〜２０nm、とりわけ２〜１５nmが好ましく、４〜１２nmが最も好ましい。実際、本発明の工程によって生成された複合粒子において、一般に、核結晶は実質的に単一粒径であり、その粒径は、しばしば４〜１２nmの範囲内にある。
【００４９】
本発明の工程は、複合粒子（つまり、開裂したポリマーで被覆された磁気粒子）の生成に使用することができる。前記複合粒子は、後のサイズ分画を不必要にするため、十分狭い粒度分布を有するものである。例えば、粒径が１０nm以内、好ましくは５nm以内、特に好ましくは２nm以内であり、光子相関スペクトロスコピーにより測定されるような、強度平均粒径の少なくとも９０％のものである。しかしながら、前記粒子は、一般に比較的大きな径のフィルター、例えば、０．１から０．２μmフィルターを通して濾過され、場合によって発生するあらゆる大きなポリマーの開裂片、又は生物学上の或いは微粒子のあらゆる汚染物を除去する。（粒径は、電子顕微鏡により測定できる。）
【００５０】
本発明の工程により生成された複合粒子は、それ自体新規であり、本発明の更なる一態様をなす。この態様によれば、本発明は複合粒子、好ましくは荷電粒子を提供する。前記粒子は、４〜３０nmといった平均全粒径を持ち、開裂した親水性ポリマー被膜物質、好ましくは酸化された炭水化物物質、特に開裂されたデンプンを有する超常磁性無機コア粒子を含有する。前記複合粒子の大部分が、単一超常磁性核結晶を含有しているのが好ましい。
【００５１】
更なる一態様によれば、本発明は、コントラスト有効量の複合粒子を含有する造影剤組成物を提供する。前記複合粒子は、超常磁性金属酸化物核結晶及び有機被膜を含有しており、前記核結晶の平均径は、２〜１０nm、好ましくは４〜８nmである。前記粒子の平均径は、最高３０nm、好ましくは最高１５nmである。前記被膜は、酸化により開裂したデンプンを含み、例えば、メトキシＰＥＧホスフェイトのような、酸化リン末端ポリエチレングリコールのような官能化ポリアルキレンオキシドと共に含まれるのが好ましい。
【００５２】
本発明の工程は、二つの別個の段階で行われる。例えば、磁気デンプンミクロスフェア（MSMs）の生成に使用される従来の共沈殿技術

によりまず複合粒子が調製され、そして本発明に係る複合粒子を生成するため、次にポリマーを開裂させる。このように処理した複合粒子は、各複合粒子内に、複数の磁気結晶を含んでいても良く、一般にポリマー開裂段階により被覆されたモノクリスタルを遊離させる。そのような工程は、本発明の更なる一態様となる。
【００５３】
一定の適用においては、前記磁気粒子から、開裂したポリマー被膜を実質的に全て除去し、おそらく異なった表面調節剤で置き換えるのが望ましい。この場合、酸化剤（過酸化水素のような、非イオン性酸化剤が好ましい）又は開裂したポリマーを消化できる酵素（例えば、アミラーゼ）を使用してもよい。イオン性酸化剤は、静電的安定化を低減し、立体的に安定した開裂ポリマー被膜が除去されるにつれて、磁気粒子の凝集を促進し得るため、その使用はあまり好ましくない。前記開裂ポリマーが除去される前に、安定化剤、例えば、２リン酸ナトリウム又は３リン酸ナトリウムのような静電安定化剤を添加するのが望ましい。前記静電安定化剤は、磁気粒子に結合し、懸濁液を静電的に安定させる。そのｐＨは、中性又は僅かにアルカリ性に維持するのが望ましい（例えば、苛性ソーダの添加によって）。酸性ｐＨは、ホスフェイト安定化剤のプロトネーションにより、凝集を引き起こす可能性があるからである。２リン酸ナトリウム及び過酸化水素を有する、デンプン由来開裂ポリマーで被覆された磁気粒子（下記実施例の方法で生成）を５０〜６０℃で３〜２４時間インキュベートすることにより、十分、残留しているデンプン由来開裂ポリマー被膜を、実質的に全て除去できることを見出した。その結果得られた粒子の平均粒径は、約９nmであり、前記粒子は、蒸気滅菌状態のもと、大気温度で、懸濁液中安定していた。
【００５４】
そのような静電的に安定した磁気粒子のそういった安定懸濁液は、新しく、そして本発明の更なる一態様となる。この態様によれば、本発明は、平均全粒径が４〜３０nmの超常磁性無機コア粒子の懸濁液を提供する。前記粒子は、実質的に有機被膜物質を含まず、表面結合無機静電安定化剤を含む。
【００５５】
例えば、補体活性効果を低下させることにより生物学的許容度を増強するため、血液プール残留時間を延長するため、組織ターゲッティング能力を提供するため、保存安定性を増強するため、又はオートクレーブ性を向上させるためなどに、ポリマーが開裂し、遊離した粒子を望ましい方法で洗浄並びに濾過した後、前記粒子が、第二の物質の被膜を備えていることが好ましい。
【００５６】
その代わりに、前記第二の被膜物質を、例えば、磁気粒子形成前又は磁気粒子形成後、並びにポリマー開裂前などの早い段階で導入してもよい。
【００５７】
特に好ましい前記第二の被膜物質は、天然又は合成構造型多糖類、合成ポリアミノ酸、又はPCT/GB94/02097号明細書に記載されているような、生理的許容合成ポリマーの被膜、或いはピルグリム（Pilgrimm）又はイルム（Illum）（スプラ（supra））が記述しているような安定化物質の被膜である。前記第二の被膜物質が、ポリアルキレンオキシド（例えば、ポロキサマー、ポロキサミン、ポリエチレングリコール等）、又はヘパリノイドであるのが特に好ましく、また、官能基、例えば、酸素酸（例えば、イオウ酸素酸、炭素酸素酸又はりん酸素酸）機能、を有するような物質であるのが特に好ましく、そのような物質は、複合粒子、特にコア磁気粒子に被膜物質を化学結合させるか、または吸着させる。この点に関して、特に、メトキシ−ＰＥＧ−ホスフェイト（ＭＰＰ）、及び米国特許第5160725号明細書及びWO-94/21240号明細書においてピルグリム（Pilgrimm）が記載している、その他ポリアルキレンオキシド物質があげられる。ＭＰＰのホスフェイト基とは別の親鉄で末端官能化された親水性ポリマーを用いて、ＭＰＰの有益な効果を実現することもできる。そのような基の一つにサリチレートがある。ＰＥＧは、４−アミノ−サリチル酸、又は５−アミノ−サリチル酸に接合することにより、サリチレートを用いて官能化できる。前記サリチル酸はどちらも、生物学上で使用されてきた長い歴史を持ち、本質的に無害である。
【００５８】
更に適切な第二の被膜剤としては、ピリジン窒素のＰＥＧのような親水性ポリマーを含む、３−ヒドロキシ−４−ピリジノンがある。１，２−ジメチル−３−ヒドロキシ−４−ピリジノンのような、単一類似体は、例えば、過剰な赤血球を輸血された人々などの人体から、余分な鉄を除去するため臨床治療で使用されている。これらの種は、FeIIIに対する、いくつかの周知となっている最も大きな結合定数を有する。即ち、約３５の対数−ベータ（３）である。ここで都合よく適用し得る合成経路がいくつかある。前記ポリマー（ＰＥＧ）は、２−メチル−３，４−ジヒドロキシピリジンの窒素のアルキル化により付着し得る。ＰＥＧはまた、２−メチル−３−ヒドロキシピリジンのアルキル化によっても付着でき、引き続き結果生成物の４番目の位置での酸化が起る。ＰＥＧは、３−ヒドロキシ−２−メチル−４−ピロンと一級アミノ基を有するＰＥＧを反応させることによっても付着でき、その際、環状酸素原子を窒素で置換し、一工程で所望の３−ヒドロキシ−４−ピリジオノン（pyridionone）を形成する。

【００５９】
酸化鉄の表面にＰＥＧポリマーを付着させるための更なるオプションは、フェレドキシン／フェリオキサミンに代表される、大きなグループの細菌ジデロホアの一つにそれらを結合させることである。フェリオキサミンは、アシル化又はアルキル化により、適切なＰＥＧ誘導体を付着させるのに使用できるアミノ末端機能を有する。
【００６０】
前記第二の被膜物質を前記酸化物の表面に結合するための更なる一オプションは、鉄結合基のオリゴマー又はポリマーを使用することである。鉄結合基の例としては、ジホスフェイト、トリホスフェイト及びＭＰＰのモノホスフェイトよりも高級のポリマーといったホスフェイトがある。そのようなオリゴ−及びポリフォスフェイトは、酸化鉄粒子に非常に強力に結合するが、恐らく多数の結合部位が存在するためであろう。抱合反応は単純且つ簡単に行われる。従って、例として、ここで言及しているメトキシ−ＰＥＧ−フォスフェイトの代わりに、例えば下記実施例において、メトキシ−ＰＥＧ−ジフォスフェイト又はメトキシ−ＰＥＧ−トリフォスフェイトを使用してもよい。オリゴ−及びポリフォスフェイト、硫酸塩及びスルフォン酸塩もまた、磁気粒子に他のベクター又はレポーター基（下記で更に記述するような）を接合させるのに使用できる。
【００６１】
前記第二の被膜物質、又は他のベクター及びレポーター基を酸化物の表面に結合させるために、上述した種々のフォスフェイト結合基を用いる代わりに、ホスホナート結合基を使用してもよい。例えば、メトキシ−ＰＥＧ−ホスホナートを使用してもよい。このことは、多数の潜在的利点をもたらす。特にＰ−Ｃ結合によってＭＰＰのＰ−Ｏ−Ｃ結合を置換することにより、加水分解安定性が向上し、酸化物の表面への結合が潜在的に強固になり、また化学安定性が向上することにより、磁気結晶−リンカー−ベクター／レポーター結合体を生成する際、リンカーとして有益なヘテロ二機能性ＰＥＧ−ホスホナートをより自由に生成できるようになるといった利点がある。
【００６２】

のようなヘテロ二機能性リンカーは、前記磁気粒子をタンパク質、タンパク質開裂片、オリゴペプチド及び他のペプチドベクターに結合するのに容易に使用できる。このように、化学式Ａ〜Ｅのリンカーは、反応チオール又はアミン基を持つペプチド化合物に結合し、その後ホスホナート基により前記磁気粒子に結合できる。
【００６３】
更に、前記磁気粒子にＰＥＧ又は他のベクター／レポーター基を付着させるための、適切な結合基としては、鉄イオンに対し高い結合親和性を有する他の基、例えば、ヒドロキサメート基、カテコール基、アスコルベート基及びデフェリオキサミン基があげられる。
【００６４】
前記第二被膜物質の分子量は、特に重要でないことが分かっており、０．１〜１０００ｋＤの範囲内であれば都合がよい。しかし、０．３〜２０ｋＤの分子量、特に０．５〜１０ｋＤ、とりわけ１〜５ｋＤの分子量を持つ物質が好ましい。例えば、少なくとも６０のアルキレンオキシド反復単位を持つポリアルキレンオキシド物質がある。
【００６５】
前記第二の被膜物質の無機コア粒子に対する重量比は、０．０２〜２５ｇ／ｇ、特に０．４〜１０ｇ／ｇ、とりわけ０．５〜８ｇ／ｇの範囲であることが好ましい。
【００６６】
本発明の工程により生成された二重被覆複合粒子に関して分かっている特別な一利点は、許容できない粒径又は粒度分布の劣化をもたらすことなく、高圧蒸気滅菌法（例えば、１２１℃で１５分間）により殺菌できることである。これは、特に重要なことである。というのは、早期工程段階を、無菌状態で行う必要がなく、従って生産合理性を向上させることになるからである。
【００６７】
第二被膜物質の被膜を提供する他に、本発明により生成された複合粒子を、生成後調整することができる。従って、特に、前記粒子を機能剤で処理し、残留炭水化物被膜に接合又は結合させてもよく、バイオターゲッティング成分（抗体、抗体フラグメント、ペプチド又はインシュリンなどの生体分子のような）、又はレポーター基（Ｘ線、ＭＲ、超音波、光画像等といった画像診断法において検出可能な基）は、従来の化学技術を用いて前記被膜物質のうちの一つに接合してもよい。更に、適切なターゲッティングベクター又は免疫反応性基は、例えば、WO-93/21957号明細書に記載されている。
【００６８】
一般的に、磁気粒子とそのようなバイオターゲッティング（ベクター）及びレポーター基の間の接合は、化学式
ＭＰ−Ｘ−Ｌ−Ｖ
で表される。但し、上記式中ＭＰは磁気粒子（上述したように除去された、開裂ポリマー被膜を含んでいてもよい）、Ｘは粒子（例えば、ホスフェイト、オリゴフォスフェイト又はポリフォスフェイト、ホスホナート、ヒドロキサメート又は上述したような他の親鉄）の表面に結合できる基（アンカー）であり、Ｌは、結合基又は更に好ましくは、少なくとも一Ｘ基を少なくとも一Ｖ基に結合させるリンカー基（分子量１０００〜１０^６Ｄの有機鎖が好ましく、例えば、分子量２〜５０ｋＤのＰＥＧ基）、そしてＶはベクター又はレポーター基、つまり、磁気粒子の体内分布を調節する（選択された器官、組織、又は疾患場所で、優先的に増強するため）基、又は画像診断技術（例えば、キレート化重金属イオン、重金属原子クラスター、常磁性金属イオン又は金属放射性核種、又はガスミクロ胞或いはミクロ胞ガス発生器、非金属放射性核種、非金属非ゼロ核スピン原子（例えば、Ｆ原子）、その他、水素、非金属重原子（例えば、Ｉ），発色基、フルオロホア、医薬剤等）により検知可能な基である。
【００６９】
このように、広範囲のベクター及びレポーターを磁気粒子に結合させてもよい。ターゲッティングベクターの例としては：ＰＥＧ（血液プールの残留期間を延長する）；完全なタンパク質としてか、又は結合ドメインを含む選択されたフラグメント開裂片としてのｔ−ＰＡ、ストレプトキナーゼ、及びウロキナーゼ；ＲＧＤ及び類似血小板リセプター結合モチーフを含有するペプチド；及びアテローム斑結合ペプチド（例えば、アポリポタンパク質ＢフラグメントＳＰ−４）がある。ｔ−ＰＡは、ジェネンテク（Genentech）から入手可能である。ＲＧＤペプチドは、特許公報、例えば、米国特許第4589881号明細書、米国特許第4661111号明細書、米国特許第4614517号明細書及び米国特許第5041380号明細書に記載されている。使用可能なＲＧＤペプチドの一例としては、Lys-Lys-CONH₂末端を介して接合できる、Gly-Arg-Gly-Asp-Ser-Pro-Ala-Ser-Ser-Ala-Tyr-Gly-Gly-Gly-Ser-Ala-Lys-Lys-CONH₂がある。これは、標準のオリゴペプチド合成技術、例えば、固状ペプチド合成により生成できる。（Tyr）-Arg-Ala-Leu-Val-Asp-Thr-Leu-Lys-Phe-Val-Thr-Gln-Ala-Glu-Gly-Ala-Lys-CONH₂（但し、（Tyr）はヨウ素を用いて識別できるようにするため添加される）の形状のＳＰ−４は、Lys-CONH₂末端を介した接合を用いて使用してもよい。これもまた標準技術により生成できる。
【００７０】
Ｖがキレート化金属である場合、前記リンカーは適切なキレート性成分、例えば、ＤＴＰＡ、ＥＤＴＡ、ＴＭＴ、ＤＯ３Ａ等の残留物を含むであろう。そのような基は、画像診断法コントラスト剤の分野では周知となっており、骨格鎖接合官能基性（例えば、CH₂φSCN）か、又は金属配位基（例えば、CH₂COOH）の一つにより接合される。
【００７１】
前記金属イオンそれ自体は、例えば、シンチグラフィー用の、ＴＭＴによってキレート化された⁹⁰Ｙ、又は蛍光画像診断用ＴＭＴキレートユウロピウム等の画像診断方式によって選択されるであろう。
【００７２】
Ｘ線画像診断法では、トリヨードベンゼン系有機リン酸塩（又は、ホスホナート或いは、オリゴフォスフェイト又はポリフォスフェイト）を使用すると便利である。そのような化合物は、磁気粒子を安定させ、且つ（粒子の放射線不透明度を高めることにより）Ｘ線コントラスト剤として作用するためである。適切なトリヨードベンゼン系有機リン酸塩の例としては、

がある。但し、上記式中、Ｒ^１及びＲ^２は、選択自由であるが、しかし、ヒドロキシル化Ｃ_１−６アルキル基が好ましく、Ｒ^３は、リンカー基であり、例えば、１〜６炭素原子鎖を提供する。
【００７３】
磁気粒子に付着するため、Ｘ−Ｌ−Ｖ化合物が多数のアンカー部位を提供することが特に好ましい。従って、好ましいＸ−Ｌ−Ｖ化合物は、化学式

のものであり、但し、Ｌ₁及びＬ₂は、リンカーＬの成分であり、ｐは２以上で、例えば、２、３、４又は５である。そこで、例えば、１〜４アンカー基を有するＰＥＧ系構造は、以下のようになり得る：

但し、ｒは１、２又は３、ｓは１〜６、ＹはＣＯＮＨ又はＮＨＣＯ、（ＰＥＧ）は、ポリエチレングリコール鎖、そしてＸはＣＯＮＨＯＨ、−ＣＯＮＨ−ビスヒドロキシフェニル、又は−ＣＯ−Ｏ−ビスヒドロキシフェニル（隣接炭素上に二ヒドロキシル基を持つ）である。
【００７４】
レポーター又はベクターがこのように接合されている場合、効率良く粒子を目標にするのに充分な数のベクターが存在するよう、及び／又は選択した方法で粒子を検出できるよう、充分な数のレポーターが存在するように粒子毎の数、及び投薬量毎の数ははっきりと選定されるであろう。
【００７５】
そこで、本発明の工程の好ましい一実施形態は、以下の連続段階からなる：
（i）加熱された水溶液中に、デンプン、第一及び第二鉄塩、並びに塩基を化合し；
（ii）オプションとして、前記溶液を１５℃未満まで冷却し、ゲルを凝固させ；
（iii）ｐＨを６．０から８．５の範囲内まで下げ、この段階は、随意に段階（ii）の前に行ってもよい；
（iv）例えば、ハロゲンオキシアニオン酸化剤のような酸化物で処理し、前記デンプンを開裂させ、前記粒子を遊離させ；
（v）前記の遊離した粒子を洗浄し、濾過し；
（vi）オプションとして、前記の遊離した粒子を、官能化ポリアルキレンオキシド誘導体と反応させ、前記誘導体を前記粒子に結合させ；そして
（vii）オプションとして、前記の遊離した粒子をオートクレーブ殺菌する。
【００７６】
ステップ（iii）は、例えば、ステップ（ii）の前に減圧状態で、余分な水分及び塩基（例えば、水酸化アンモニウム）を除去することにより、又は、ステップ（iv）の前に、余分な塩基を調整するため、酸（例えば、HCl）を添加することにより実施できる。
【００７７】
開裂した親水性ポリマー被膜及び無機粒子表面に結合した血液寿命延長親水性ポリマーを有する無機コア粒子を含む複合粒子は、前記二つの被膜の内一つしか持たない比較可能な粒子と比べて、血液寿命が著しく増強されていることが分かっている。これは、前記開裂ポリマーが、血液寿命延長ポリマーの粒子表面の結合部位を遮蔽し、生体内で前記無機粒子から前記血液寿命延長ポリマーが開裂するのを遅延させる結果生じるものと考えられる。そのような粒子は、本発明の更なる一態様となる。
【００７８】
この態様によれば、本発明は、注射可能な複合粒子状薬剤を提供する。前記薬剤は、前記薬剤の表面に化学的又は物理的に（しかし、好ましくは化学的に）結合している無機粒子核（金属酸化物又は混合金酸化物が好ましく、特に、超常磁性酸化鉄粒子が好ましい）、親水性血液寿命延長ポリマー（好ましいのは、メトキシ−ＰＥＧ−フォスフェイトのような官能化ポリアルキレンオキシドであり、特に好ましくは、末端官能化直鎖ポリマー、及び例えば、分子量０．２〜３０kD、特に１〜１０kDといった、腎臓閾値より少ない分子量を有するポリマーが好ましい）を含有する。また、例えば、酸化デンプンのような開裂した分枝状炭水化物のような、親水性有機ポリマー被膜を遮蔽する結合部位を有する。
【００７９】
そのような粒子は、血液プール剤として使用してもよく、又は、上述したようなバイオターゲッティングベクターに共役させてもよい。更に、前記粒子は、例えば、静脈又は皮下注射による、間接リンパ造影法に使用してもよい。これら粒子の無機核は、超常磁性酸化鉄であるのが好ましいが、必要であれば、その他の金属化合物の粒子も使用できる。例えば、放射性核種、又は他の治療上及び診断上有効な金属を結合した化合物等である。
【００８０】
本発明に係る前記超常磁性結晶含有粒子の緩和度は、核及び被覆粒子のサイズ及び構成物（同様に、温度及びかけられた磁場）により変化するであろう。Ｔ_１緩和度（ｒ_１）は、５のように低くても、２００のように高くてもよい。一方、Ｔ_２緩和度（ｒ_２）は、０．５Ｔで５〜５００の間で変化してもよい（緩和度は、（ｍＭＦ ｅ）^−１（ｓｅｃ）^−１と表される）。ｒ_１／ｒ_２の割合は、１〜１００以上まで変化してもよい。例えば、１〜１０へ、特に０．４７Ｔ、４０℃で、１．２〜３へ変化してもよい。小さな単結晶粒子のｒ_１／ｒ_２の割合は、低い範囲にある。一方で、大きな粒子や多結晶粒子は、高い割合を示す。前記粒子が、超常磁性的働きを示すならば、０Ｔから約１Ｔの範囲の粒子の磁性は、結晶サイズによる。より大きな結晶は、顕著により大きな磁性を有する。１Ｔで、磁性は酸化鉄ｇ中約２０〜１００ｅｍｕ、好ましくは３０〜９０ｅｍｕである。
【００８１】
前記超常磁性三粒子がＦｅ^ＩＩ及びＦｅ^ＩＩＩの塩基沈降により生成される場合、０．４７Ｔ、４０℃でのｒ_１／ｒ_２の割合は、一般に３未満であろう。結果として、Ｔ_１−重価画像診断法において、本発明により生成された粒子は、陽性コントラスト剤として有効である。更に、そのような粒子の縣濁液に対する磁化曲線は、４Ｔという高い磁場強度でさえ、前記粒子は完全に磁化されないことを示している。ＭＲ画像診断装置で従来使用されていた磁場強度で、粒子が完全に磁化されないということは、ＭＲ画像に存在し得るあらゆる磁化率効果の程度が低減していることを意味する。さらに、本発明に係る粒子の緩和度が、従来の酸化鉄粒子のように、磁場強度の増加と共に急速に低下することはない。
【００８２】
従来のＭＲ画像診断法において、長年に渡って励磁は、一次磁場強度１〜１．５Ｔの高電界装置で使用されていた。しかしながら、低電界装置の使用が増えてきており、商業用撮像素子の低磁場強度、例えば、０．１〜０．３Ｔで利用できる陽性ＭＲコントラスト剤の必要性が高まっている。本発明による粒子は、これらの磁場強度で、マグネビスト（Magnevist）のような従来の金属キレート系陽性ＭＲコントラスト剤の少なくとも３倍は効果的であり、前記必要性を満たすものである。従って、更なる一態様によれば、本発明は、被験者に対するコントラスト増強磁気共鳴画像診断法を提供するものであり、陽性コントラスト剤を被験者に投与し、ＭＲ画像診断装置を用いて、前記被験者の少なくとも一部分の画像を作り出すものであり、前記装置が０．３Ｔ未満の磁場強度を有する一次磁石を有し、前記陽性剤が生理学的に許容可能な炭水化物被膜を有する磁気粒子を含有し、前記粒子が前記磁場強度で完全に磁化されず（例えば、最高可能磁性の９０％まで磁化）、好ましくは２Ｔ、特に４Ｔまでの磁場強度で完全には磁化されないことを特徴とする。
【００８３】
更なる一態様によれば、本発明は、例えば、注射液のように、生理学的に許容可能な少なくとも一担体又は一賦形剤と共に、本発明の粒子を含有する、又は本発明により生成される粒子を含有する診断用組成物を提供する。
【００８４】
本発明の組成物は、従来のいかなる薬剤形状であってもよく、例えば、懸濁液、乳濁液、粉末であってもよく、水溶性賦形剤（注射液のような）及び／又はオスモル濃度、ｐＨ、粘稠度及び安定性を調整するための成分を含有していてもよい。前記組成分が、懸濁状で、懸濁液が血液と等張且つ等水であるのが理想的である。例えば、等張懸濁液は、食塩のような塩、グルコース糖（デキストローズ）のような低分子量の糖質、ラクトース、マルトース、又はマンニトール或いは被膜剤の可溶性分画又はそれらの混合物を添加することにより調製できる。ｐＨの僅かな調整のみを必要とする場合、等水性は、塩化水素酸のような酸、又は苛性ソーダのような塩基を添加することにより得られる。クエン酸塩、酢酸塩、ホウ酸塩、酒石酸塩、グルコン酸塩、両性イオン及びトリス（Tris）のような緩衝剤を使用してもよい。粒子懸濁液の化学安定性は、アスコルビン酸又はピロ亜硫酸塩ナトリウムのような抗酸化剤を添加することにより調節できる。薬剤の物質的安定性を向上させるため、賦形剤を添加してもよい。非経口懸濁液に最もよく使用される賦形剤としては、ポリソルベート、レシチン又はソルビタンエステルのような界面活性剤、グリセロール、プロピレングリコール及びポリエチレングリコール（マクロゴール）のような粘稠度調節剤、或いは曇り点調節剤、好ましくは非イオン性剤がある。（曇り点調節剤は、非イオン性界面活性剤組成物が、相分離を起こし、凝集する温度を変化させる。）
【００８５】
本発明の組成物は、都合よく、診断上有効な金属濃度、一般には０．１〜２５０mg Fe/mlで、好ましくは０．５〜１００mg Fe/ml、とりわけ１〜７５mg Fe/mlで磁気金属酸化物を含有している。
【００８６】
本発明は、更に、人体又は非人体、好ましくは哺乳動物体の、コントラスト増強画像の形成方法を提供する。前記方法においては、本発明に係るコントラスト剤の懸濁液を前記体に、好ましくは非経口的に、とりわけ好ましくは血管内に投与し、例えば、ＭＲ又は磁力測定（例として、ＳＱＵＩＤ検出器又は一連のＳＱＵＩＤ検出器を使用する）によって、前記コントラスト剤が分布している前記体の最小部の画像を形成する。
【００８７】
その他の態様において、本発明は、人体又は非人体、好ましくは哺乳動物体内における、本発明に係るコントラスト剤の分布測定方法も提供する。前記方法においては、前記コントラスト剤を前記体に、好ましくは非経口的に投与し、前記コントラスト剤により放出された又は調節された前記体からのシグナルを検出する。前記シグナルには、例えば、放射性壊変放出、磁場のひずみ、又は磁気共鳴信号がある。
【００８８】
本発明の前記方法が、血管系の画像診断法、特にＴ_１−重価ＭＲ画像診断法を含むのが特に好ましい。画像は、肝臓又は脾臓器官が著しく粒子を除去する前に形成される。例えば、メトキシＰＥＧホスフェイトにおけるように、血液寿命延長ポリマー被膜を持つ粒子を用いて、画像は、都合よく血管内投与から２４時間以内、好ましくは４時間以内、更に好ましくは１時間以内に形成される。前記方法の代替実施形態において、局所注入により、リンパ系のＴ_２−重価画像を形成でき、又血管内への注入により、肝臓又は脾臓器官のＴ_２−重価研究、又はＴ_２−重価拡散性研究を行うことができる。
【００８９】
本発明の方法において、適用される投与量は、用いる画像診断方法のコントラスト有効投与量であろう。一般には、０．０５〜３０mg Fe/体重kgの範囲内であり、好ましくは、０．１〜１５mg Fe/kg、とりわけ０．２５〜８mg Fe/kgであるのが好ましい。
【００９０】
本発明は、診断用コントラスト剤組成物を生成するための新規磁気結晶物質の使用法も提供する。前記コントラスト剤組成物は、人体又は非人動物体への前記組成物の投与を含む診断方法において使用される。
【００９１】
本発明の複合粒子は、コントラスト剤として使用される他、局所熱的治療法又は加温療法にも使用できる。その場合、磁気特性を利用して、エネルギーが生体内で粒子に転移し（例えば、磁場方向又は磁場強度の変化する磁場にさらすことにより）、前記粒子から周囲の組織へのエネルギー損失を、例えば、細胞傷害効果を得るといった治療効果に利用できる。これは、前記粒子が、ターゲッティングベクターに、例えば、二官能ポリアルキレンオキシドのような、二官能リンカーを介して接合する場合、特に重要である。
【００９２】
同様に、前記粒子は、鉄を用いた治療法にも使用できる。この場合、コア結晶の磁性を向上させる必要はなく、開裂したポリマー被膜と、オプションとして、例えばＭＰＰのような第二の被膜を有する常磁性酸化鉄であってもよい。
【００９３】
先行技術により調製される様々な酸化鉄製剤は、血管内に投与した場合、顕著な有害反応をもたらすことが知られている。最もよく報告されているのは、全身血圧抑制と急性血小板減少である。これらの副作用は、粒子が誘発する補体系の活性化に対する生理学的、且つ血液学的反応であるようだ。磁気デンプンミクロスフェア（ＭＳＭ）のような、従来の酸化鉄粒子は、補体小瀑を強く活性化させるが、本発明の粒子が、循環している血小板の数に影響を及ぼすことはなく、影響するとしてもほんのわずかなものである一方で、従来の製剤は急性一過性血小板減少症を引き起こす。
【００９４】
驚いたことに、本発明の粒子は、第二の被膜物質（例えば、ＭＰＰ）のある無しにかかわらず、補体系又は血圧及び血小板数のような補体関連パラメーターに影響を及ぼさないことが実証されている。精選された被膜物質は、従来の粒子と類似の方法で、補体を活性化させない粒子表面を形成する。
【００９５】
前記粒子は、例えば、化学的又は物理学的に酸化鉄（FeOx）表面（例えば、ＭＰＰ）に結合するポリマーのような第二の被膜物質で、容易に被覆できる。前記粒子は、表面積が広く、ＭＰＰのような末端官能化親水性ポリマーが浸透し、コア磁気粒子の表面に結合又は吸着できる炭水化物被膜層が薄いため、更なる表面調節又は被覆に非常に適している。
【００９６】
前記のＦｅＯｘ粒子の磁性は、従来の酸化鉄剤よりも低く、画像化領域内において、前記磁性は完全に飽和されない。この特性により、高磁場強度での罹病性アーチファクトの発生が減少するであろう。
【００９７】
マウスの体内で、前記粒子の血液半減期は、デンプンとＦｅＯｘの共沈により生成される従来のＭＳＭ粒子よりも著しく長い（２以上の要因により）ことが分かっている。
【００９８】
前記粒子の血液運動特性は、前記第二の被膜物質を添加することにより、更に調節できる。このように、マウスの体内で、ＭＰＰ被覆粒子、つまり、二重被覆粒子の血液半減期は、ＭＰＰ被膜を持たない粒子又は、添加賦形剤としてメトキシ−ＰＥＧ（ＭｅＯ−ＰＥＧ）を有する（ＭｅＯ−ＰＥＧは賦形剤として作用し、ＦｅＯｘ表面とは相互作用しない）粒子のものよりも著しく長い（２以上の要因により）ことが立証されている。
【００９９】
前記ＭＰＰ被覆粒子の血液半減期は、マウスの体内で、ＭＰＰで被覆されてはいるが、開裂したポリマーの下地被覆を持たない、ナノサイズのＦｅＯｘ粒子よりも、著しく長い（２以上の要因により）ことが立証されている。
【０１００】
本発明に係る一重被覆粒子及び二重被覆粒子はどちらも、ねずみの体内で、血液学上何ら影響を及ぼさないことが分かっているが、従来の多糖類−ＦｅＯｘ薬剤は顕著な血小板減少症を引き起こす。
【０１０１】
更に、本発明に係る一重被覆粒子及び二重被覆粒子はどちらも、人の補体に影響を及ぼさないことが分かっているが、従来のデンプン−ＦｅＯｘ（ＭＳＭ）粒子は、強力な補体活性化剤である。
【０１０２】
本発明の単結晶核粒子は、凝集する量が減る傾向にあり、そのため本発明の組成物中必要とされる安定化剤（デキストランのような）の量が減少し、それにより、毒性問題の発生する可能性が少なくなるため、特に有益である。
【０１０３】
保管問題及び運搬問題を最小限にするため、本発明により生成される微粒子コントラスト剤は、例えば、噴霧乾燥又は凍結乾燥によって、好ましくは無菌状態で、都合よく乾燥粉末として生成することができる。前記の乾燥薬剤が、本発明の更なる一態様となる。
【０１０４】
本文中言及している様々な特許公報を参照し、ここに取り入れられる。
【０１０５】
ここで、下記の非制限的実施例を参照しながら本発明を更に詳細に説明する：
実施例１
ゲル調製は：デンプン液を調製し、５５℃まで加熱し、デンプン液に塩化鉄を添加し、鉄／デンプン液に水酸化アンモニウムを添加し、反応混合物を８７〜９０℃に加熱し、生成物を冷却し、そしてゲルを中和するというステップで行われる。
【０１０６】
Ａ．デンプン液の調製
１．８５０グラムの沸湯脱イオン水に、可溶性でジャガイモデンプン（CAS No.9005-84-9）５０グラムを懸濁させ、混合する。
２．沸騰させ、沸騰したら即座に前記デンプン液を５５℃の水槽に入れる。
【０１０７】
Ｂ．鉄及び水酸化アンモニウムをデンプンに添加
１．全体積５０mLの脱イオン水に、９．０グラムのＦｅＣｌ₃.６Ｈ₂Ｏと３．３グラムのＦｅＣｌ₂.４Ｈ₂Ｏ（ＦｅIIIとＦｅIIの分子比が２：１）を溶解する。
２．デンプン液を一定の５５℃まで冷却した後、前記デンプン液に鉄溶液を注ぎ、完全に混合し、５０mlの３０％（濃度）ＮＨ₄ＯＨを添加する。
３．その結果溶液を加熱し、２時間に渡って８９℃まで温度を上昇させ、更に５０分間８９℃で維持する。
４．前記水槽で１７０分加熱した後、ａ）４℃で夜通し冷却し、ゲルを形成するか、又はｂ）大気温まで冷却し、酸で中和する（下記参照）。
【０１０８】
Ｃ．ゲル洗浄手順（ゲルは酸中和されていない）
ｐＨが８．５より小さくなるまで、安定したゲル懸濁物中に、脱イオン冷水をポンプで送り、形成されたゲルを洗浄する。
【０１０９】
Ｄ．代替中和方法
混合物を４０℃未満に冷却し、酸を用いて中和する。
【０１１０】
Ｅ．次亜塩素酸ナトリウムを用いたゲル酸化開裂
製造を最適化するため、新しいロットで、ゲル１グラム当たりの次亜塩素酸ナトリウム（ヒポ）量の滴定を行う。磁気粒子生成物を、サイズ及び分散性に関しては光子相関スペクトルスコピー（ＰＣＳ）により査定し、そして水プロトン緩和率を測定することにより査定する。
ａ．例えばゲル５g中１２．５mg Fe毎、１．８mlの５％次亜塩素酸塩。ゲル５グラム中の有効塩素及びmg Feの濃度に対して次亜塩素酸塩量を調整する。
ｂ．ゲルを量り分け、次亜塩素酸塩を添加し、水槽の中で４５分間７０℃で加熱する。
Ｃ．加熱後、８Ｍ尿素（ゲル５g中０．８ml）を添加。尿素は、余分な次亜塩素酸塩を不活性化する。
Ｄ．全ての自由Ｆｅ及びＣＨＯが除去されるまで、膜（ＭＷカットオフ＜１００kD）を用いてダイアフィルトレーションをおこなう。
【０１１１】
Ｆ．分析
サンプルを分析する。このようにして調製した物質は、表１に概説した特徴を有する：
【０１１２】

【０１１３】
ＮＭＲＤとともに、縦緩和率（１／Ｔ₁）は、２．３５ガウスから１．２テスラの範囲で、磁場強度の関数として測定する。例として、ケーニッヒら（Koenig et al.）の細胞及び有機体のＮＭＲスペクトルスコピー（NMR Spectroscopy of Cells and Organisms）、第二巻、７５頁、アール．ケー．グプタ（R. K. Gupta）（編集者）、ＣＲＣ出版社、１９８７、及びケーニッヒら（Koenig et al.）のＮＭＲスペクトルスコピーの進歩（Progress in NMR Spectroscopy）２２：４８７〜５６７（１９９０）参照。
【０１１４】
実施例２
ジャガイモデンプンをトウモロコシデンプンに代えた他は実施例１に従って磁気粒子を調製した。
可溶性ジャガイモデンプン以外の物質を使用する場合、ゲルの形成及び劣化に使用する物質量の調節が必要となり得ることに注意しなければならない。
【０１１５】
実施例３
ジャガイモデンプンを米デンプンに代えた他は実施例１に従って磁気粒子を調製した。
【０１１６】
参考例４
次亜塩素酸塩で処理しなかった他は実施例１に従って磁気粒子を調製した（セクションＤ）。代わりに、ゲルのサンプル（４、８、１２グラム）をリン酸緩衝生理食塩水で希釈し、前記ゲルのデンプンを、大気温で１６時間、酵素アルファアミラーゼ（ＥＣ３．２．１．１）１００μｇ（１μｇ毎０．７〜１．４活性単位で）を用いて、酵素加水分解した。その結果遊離した粒子を、低速で遠心分離し、大きな凝集物を除去し、０．４５μｍのフィルターを通して濾過した。この工程により、全体寸法はかなり大きい（１０〜１１０ｎｍの範囲）が、酸化鉄核は６ｎｍである粒子が生成された。
【０１１７】
参考例５
次亜塩素酸塩で処理しなかった他は実施例１に従って磁気粒子を調製した（セクションＤ）。代わりに、１０gのゲルを、１/４インチサンプルを取り付けたブランソンソニファイヤー（Branson sonifier）を用いて超音波処理した。超音波処理は、連続的に１５分間行った。低速で遠心分離し、大きな凝集物を除去し、０．４５μｍのフィルターを通して濾過した後、その結果遊離した粒子もまた全体寸法は非常に大きい（３０〜８００ｎｍの範囲）が、参考例４のものと同様の大きさの酸化鉄核をもつことが分かった。
【０１１８】
実施例６
実施例１に従って生成した粒子の懸濁液に、ＭＰＰの酸化鉄（FeOx）に対する望ましい比率（一般に１〜２g ＭＰＰ/gm Fe）で、メトキシＰＥＧフォスフェイト（ＭＰＰ）（mol. wt. ５kD）を添加し、一定の回転で、１５時間３７℃でインキュベートした後、使用するまで４℃で保管した。
必要であれば、前記粒子を１２１℃で１５分間オートクレーブ殺菌することもできる。
コンドロイチン硫酸塩を用いて、同様に前記粒子を被覆してもよい。
代わりに、前記のＭＰＰ被覆粒子を７５℃で１２時間インキュベートするか、或いは１２１℃で１０〜２０分間直接圧熱滅菌してもよい。
【０１１９】
実施例７
ＭＰＰ被覆粒子を、様々な分子量のＭＰＰ（１．１、２．１、５．０及び１０．０kD）を用いて、様々なコーティング率（0.02、0.2、0.4、0.5、0.8、1.0、1.2、1.5、1.6、2、2.5、3、4及び8g MPP/g FeOx）で実施例６と同様に生成した。
【０１２０】
実施例８
実施例１、６及び７の粒子の動物テスト及びヒト血漿テスト結果
一範囲のＭＰＰコーティング密度を有する本発明に係る粒子に関して、マウス血液半減期（Ｔ_1/2）を測定した。マウスの尻尾の静脈に、実施例１、６及び７の製剤を１ｍｇ Ｆｅ/ｍＬで１００μＬの試料を注射した。所定の間隔で、動物を安楽死させ、２匹のマウスから血液サンプルを採取しプールし、１／Ｔ₁を測定した。１／Ｔ₁値から半減期（Ｔ_1/2）を求めた。その結果を表２に示す。比較するため、表２は、コーティングされていない粒子及び従来のＭＳＭ粒子に関する結果を含む。
【０１２１】

【０１２２】
表２から、ＭＰＰ被膜が、顕著に血液半減期を延長することは明らかである。しかし、本発明によるコーティングされていない粒子の血液半減期でさえ、従来の粒子よりもかなり長い。
【０１２３】
ＭＰＰの代わりに、非結合第二被膜剤を使用した場合、マウスの血液半減期において著しい延長は見られなかった。このことは、非被覆粒子とＭＰＰ被覆粒子、及びメトキシＰＥＧ（mol. wt. 5 kD）で処理した粒子と、デンプン誘導体ヘタスターチで処理した粒子に関し、検出したマウスの血液半減期を比較することにより示された。ＭＰＰとは異なり、メトキシＰＥＧは、粒子と結合又は化学結合していないため、単に賦形剤として存在している。その比較結果を表３に示す：
【０１２４】

【０１２５】
MPP被覆粒子及びMPP非被覆粒子を血液上の効果に関してラットでテストした。
【０１２６】
雄ラットに内在投与し、サンプリングカテーテルを右頚静脈に挿入した。投与の約２４時間前及び投与後3,10,60分後及び／又は２４時間後、血液サンプルを採取した。測定した血液学パラメータは、白血球及び血小板数を含んでいた。
【０１２７】
デキストラン磁鉄鉱又はＭＳＭ粒子とは異なり、本発明のＭＰＰ被覆粒子及びＭＰＰ非被覆粒子においては、一過性血小板減少症の発病は観測されなかった。
【０１２８】
前記ＭＰＰ被覆粒子とＭＰＰ非被覆粒子及びＭＳＭを、人体プラズマでテストし、末端補体錯体の活性化程度を測定した。ＭＳＭとは異なり、前記ＭＰＰ被覆粒子とＭＰＰ非被覆粒子は活性化を引き起こさなかった。
【０１２９】
実施例９
実施例６により生成したＭＰＰ被覆粒子１mg Fe/kgをラビットに投与し、１５分後に２mg Fe/kgを投与した。その前後のコントラストＴ１−重価ＭＲ画像を、１．５Ｔ、３Ｄ ＴＯＦ、ＴＲ/ＴＥが２５/５．６、回転度６０°で記録したところ、添付の図１、２及び３のように見えた。投与後の両コントラスト画像において血管のコントラスト増強は明らかで、高投与量と高電界の組み合わせにもかからわず、図３の画像は、罹病性アーチファクト（susceptibility artefacts）なく血管と組織の高コントラストを示している。
【０１３０】
比較例１０
後複合粒子形成ポリマー開裂
（ａ）ＭＳＭの合成
平均分子量７０ｋＤのデンプン（３g、レッペ グリコース（Reppe Glycose）、スエーデン）を水（１０ｍＬ）に溶解した。温度６０℃で、炭水化物溶液にＦｅＣｌ₃６Ｈ₂Ｏ（２．７g）及びＦｅＣｌ₂４Ｈ₂Ｏ（４．５ｇ）を溶解し、その後前記混合液を超音波で処理しながら６０℃でゆっくりと沈降させ、１．２Ｍ ＮａＯＨ（５０ｍＬ）を得た。前記超音波処理を、更に１０分間継続し、その後５分間５０００rpmで遠心分離した。その上澄みを採取し、０．９％ＮａＣｌに対して透析した。結果得たデンプン粒子は、超常磁性であり、平均流体力学直径４００ｎｍであることが磁性カーブより明らかとなった。
【０１３１】
（ｂ）次亜塩素酸ナトリウムを用いたＭＳＭ処理
平均粒径４００ｎｍのＭＳＭ粒子（１５．５mg Fe/mL、１．７０mL）を次亜塩素酸ナトリウム（フルカ（Fluka）＃７１６９６、１３．８％自由塩化物）に添加した。容器を密閉し、７０℃で４５分間加熱した。その反応混合液を冷却し、８Ｍの尿素（０．１７mL）を添加し、その懸濁液をろ過した（０．２μｍ）。粒子は、３０００ｒｐｍで、マクロセプ（Macrosep）遠心集中装置（カットオフ１００Ｋ）を用いて、水で精製した。添加した次亜塩素酸ナトリウム量の関数として得られる粒径の記録を下記の表４に示す。
【０１３２】

【０１３３】
実施例１１
実施例１及び７による配合生成物
表５は、実施例１（組成物Ａ）及び（１．２g ＭＰＰ（２kD）/g FeOx）（組成物Ｂ）により生成され、投与用に賦形剤（トリス（Tris）（５０mM）、マニトール（２．５％）、及び苛性ソーダ、ｐＨ６〜８）を配合した粒子の詳細な特性を示す。
【０１３４】

【０１３５】
実施例１２
（ＭＰＰ被覆前の粒子調製のための最適実施形態）
（Ａ）オーバーヘッド機械式攪拌器及びコンデンサーを備えた２２Ｌの三口フラスコに、１２．８Ｌの脱イオン水を９５℃まで加熱し、その後１．６Ｌの脱イオン水中の８００ｇ可溶性ジャガイモデンプン（シグマ（Sigma）、No. S-2630）のスラリーを８０〜１００rpmの攪拌速度で添加した。その結果得られたわずかに曇った溶液を大気温で１０分間攪拌した後、３０分間かけて５５℃まで冷却した。１．２Ｌの脱イオン水中の１４４ｇ塩化鉄（III）六水和物及び５２．８ｇ塩化鉄（II）四水和物の溶液を添加し、３分後８００ｍＬの２８％アンモニウム水酸化物を一度に添加した。攪拌速度は、約６０ｒｍｐまでゆるめ、黒色反応混合液を大気温で１５分間攪拌した後、９２℃まで６０分間かけて徐々に加熱した。その温度を３時間の間９２〜９４℃に維持し、反応経過を、反応中及び反応後の磁性影響度測定により測定した。余分なアンモニウム水酸化物を真空蒸留により除去した。その濃縮物を約２０℃まで冷却し、冷蔵しゲルを形成した。
全てにおいて、ジャガイモデンプン８００ｇを用いて、最大バッチで一組のゲルを調製した。
【０１３６】

【０１３７】
（Ｂ）前記ゲルを冷水で洗浄し、残留水酸化アンモニウムを加えた酸化鉄組成物中に得られた塩化アンモニウムを除去した。除去しなければ、これらの化合物はステップＣにおいてデンプンの消化に使用される次亜塩素酸ナトリウムと反応し、次亜塩素酸塩ステップ用に更に多量の次亜塩素酸塩を必要とすることになる。
ゲル洗浄は、ゲルの溶解を最低限度に抑えるために、５℃程度に維持した攪拌反応器において、水の添加と除去を繰り返すことにより行った。前記ゲルは、約２容量の脱イオン冷水中で攪拌し（短時間ゆっくりと）、そして沈殿させた（約１時間）。非常に暗いゲル層から分離した暗い上澄み層を吸引により除去した（前記層を目視観測）。伝導度０．５mmhoを得るまで、同量の水の添加、短時間のゆっくりとした攪拌、沈殿及び分離を繰り返した。ゲルを洗浄するため、約８容量の総水量が必要であり、鉄回収率は約８０％であった。
【０１３８】

【０１３９】
（Ｃ）このステップは、デンプンマトリックスの酸化により、洗浄したゲルを粒子分散液に転換することを含む。これは次亜塩素酸ナトリウムを用いてゲルを処理することにより行った。その酸化に用いた次亜塩素酸塩の量は、少量（ゲル５０〜１００g）酸化実験をし、緩和度（r1、r2及びr2/r1）及び粒径を測定して決定した。
【０１４０】
洗浄したゲルを４５℃まで暖め、１２％次亜塩素酸ナトリウム液で処理した。その反応混合液の温度は数度下がった（冷却された次亜塩素酸塩を添加したため）。その反応混合液の温度を、約４５℃まで上昇させた。その反応液を、３０分かけて５５℃まで加熱した時点で、発熱反応が観察され、温度は１５分間かけて約１５℃上昇した。その発熱沈殿の後、前記反応混合液の温度は７０℃に調節し、４５分間維持した。ＲＣＩカロリーメーターを用いたこのステップでの危険評価により、この反応に対して適度（１５℃）ではあるが抑制可能な発熱を確認した。前記反応混合液を室温まで冷却し、ミリポア０．２ミクロン基準ろ過材を通して濾過した。１５kgのゲル（Ｆｅ３４g）を最大規模で酸化し、回収率は定量であった。
【０１４１】

【０１４２】
（Ｄ）このステップでは、次亜塩素酸塩を用いた酸化の後、残留デンプン、自由イオン及びその他の反応物質を除去することを含む。望ましい結果を達成するため、ミリポア、プリスケールＴＭ ＴＦＦ １００Ｋ再生セルロース膜カートリッジフィルタを使用した。その粒子の純度は、ＧＰＣでモニターした。限外濾過後の最終生成物の純度の範囲は、９７〜９９%であった（ＧＰＣ）。
【０１４３】

【０１４４】
全バッチの最終分析データは下記表１０にまとめてある。
（Ｅ）後続ＰＥＧコーティング
上記ステップ（Ａ）から（Ｄ）で生成された粒子は、必要であればＰＥＧコーティングしてもよい。分子量２０００ＤのメトキシＰＥＧフォスフェイト（ＭＰＰ）を、皮膜生成率１．２g ＭＰＰ／ｇ ＦｅＯｘでコーティングするのが好ましい。
そのようなＰＥＧ被膜のある無しにかかわらず、それらの粒子を、投与するため５０ｍＭトリス緩衝液と、苛性ソーダを用いて、ｐＨを６〜８に調整した２．５％マンニトールと配合してもよい。
【０１４５】

【０１４６】
実施例１３
ジエチル２-（３，５-ビス−アセチルアミノ−２，４，６−トリヨードベンゾイルオキシ）−エチルホスホン酸塩の調製
アルゴンのブランケットの下で、室温のもと、乾燥ジメチルホルムアミド（５０ml）中のジアトリゾ酸ナトリウム（７．１g、１１．２mmol）を攪拌した溶液に、ジメチルホルムアミド（１０ml）中のジエチル２−ブロモエチルホスホン酸塩（３．０２g、１２．３mmol、１．１当量）を添加した。１２時間攪拌した後、その溶媒を真空状態で蒸発させ、白色固体を得た。その固体は飽和水溶性NaHCO₃ ３００mlで洗浄した後、クロロホルムとエタノール２：１の混合液（３×２００ml）で抽出した。その有機抽出物を乾燥させ（MgSO₄）、濾過し、真空状態で蒸発させ、白色固体として生成物３．６１g（４１％）を得た。アセトニトリルからの再結晶により、mp２４９〜２５１℃、ＭＨ⁺（７７９）で分析的に純粋な物質を得た。
¹Ｈ-ＮＭＲ（３００MHz）スペクトルは所望の物質と一致した。
Ｃ₁₇Ｈ₂₂Ｉ₃ＰＮ₂Ｏ₇に対する計算値：Ｃ２６．２４；Ｈ２．８５；Ｉ４８．９３；Ｎ３．６０；実測値：Ｃ２６．２６；Ｈ２．７０；Ｉ４９．０５；Ｎ３．５０。
【０１４７】
実施例１４
２-（３，５-ビス-アセチルアミノ-２，４，６-６-トリヨードベンゾイルオキシ）−エチルホスホン酸の調製
窒素ふん囲気中室温で、乾燥ジクロロメタン（４０ml）中のジエチル２-（３，５-ビス-アセチルアミノ-２，４，６-トリヨードベンゾイルオキシ）エチルホスホン酸塩（３．１g、３．９８mmol）を攪拌した懸濁液に、１．５ml（１０．５６mmol、２．６５当量）よう化トリメチルシリルを添加した。１２〜１４時間攪拌した後、粘性スラリーを観測した。その後、更に４０mlのジクロロメタンを添加し、６時間攪拌し続けた。そして、水（４ml）を添加し、その反応溶液を１０分間攪拌した。その後、メタノール（４０ml）を添加し、その結果得られた赤色溶液を真空状態で濃縮し、黄色固体として望ましい未精製生成物３．４２gを得た。前記未精製生成物を、メタノール１０％−水９０％の溶液２０ml中に溶解し、その溶液をＣ₁₈イオン交換カラムを通し、前記のメタノール−水溶液５０mlで溶離させた。前記濾液を真空状態で濃縮し、０．４８g（１４％）の望ましいホスホン酸を白色固体として得た（mp＞２２０℃（dec.〜２５０℃）、ＭＨ⁺（723））。¹Ｈ-ＮＭＲ（３００MHz）スペクトルは所望の物質と一致した。
Ｃ₁₃Ｈ₁₄Ｉ₃ＰＮ₂Ｏ₇に対する計算値：Ｃ２１．６３；Ｈ１．９５；Ｉ５２．７３；Ｎ３．８８；Ｐ４．２９；実測値：Ｃ２１．２９；Ｈ１．９５；Ｉ５２．４４；Ｎ３．７１；Ｐ４．３１。
実施例１４の化合物を、前述した実施例によって生成された磁性粒子のコーティングに使用してもよい。
【０１４８】
実施例１５
メトキシ−ＰＥＧ（２Ｋ）−ホスホン酸塩の合成
ステップ１：メトキシ−ＰＥＧ（２Ｋ）−ＯＨ（２１．６０g）を、水中の共沸性を除去した１０８mlのトルエン中で数時間還流させた。冷却したその溶液を、塩化チオニル（７．８８mL）とＤＭＦ（０．３１３mL）の混合液を滴状処理し、その後加熱し、４時間還流させた。その反応混合液を減圧状態で濃縮し、その残留淡黄色固体を水１０８mL中に取り出し、エーテルで二度洗浄した。その水溶液をクロロホルムで二度抽出し、その混合した抽出物を無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、濃縮し１９．９０gのメトキシ−ＰＥＧ（２Ｋ）−Ｃｌを得た。
【０１４９】
ステップ２：メトキシ−ＰＥＧ（２Ｋ）−Ｃｌ（１８．５１g）と亜りん酸トリエチル（１８５mL）の混合液を４日間還流させた。室温まで冷却したところ、沈殿物が形成された。その沈殿物を濾過により採取し、エーテルで洗浄し、真空乾燥し、１８．１６gのメトキシ−ＰＥＧ（２Ｋ）−Ｐ（Ｏ）（ＯＥｔ）₂を得た。¹Ｈ-ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃；３００MHz）：４．１０ppm（ｍ，−Ｐ（Ｏ）（ＯＣＨ₂ＣＨ₃）₂）；３．６５ppm（ｓ，（−ＣＨ₂ＣＨ₂Ｏ−）_n）；３．３８ppm（ｓ，−ＯＣＨ₃）；２．１３ppm（三つの結合の二重項（doublet of triplets）、−ＣＨ₂ＣＨ₂Ｐ（Ｏ）（ＯＣＨ₂ＣＨ₃）₂）；１．３３ppm（ｔ，−Ｐ（Ｏ）（ＯＣＨ₂ＣＨ₃）₂）。
【０１５０】
ステップ３：塩化メチレン１００mL中のメトキシ−ＰＥＧ（２Ｋ）−Ｐ（Ｏ）（ＯＥｔ）₂（５．０２g）の溶液を、ブロモトリメチルシラン２４．１５gと塩化メチレン１５７mLから調製した溶液２８mLで滴状処理した。その反応混合液を室温で１６時間攪拌し、その後濃縮し、白色固体を得た。その白色固体を５０mLのメタノールで２時間処理した後、濃縮し、白色固体として４．５７gの生成物を得た。¹Ｈ-ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃；３００MHz）：８．２０ppm（ｂｒ ｓ，−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）₂）；３．６５ppm（ｓ，（−（ＣＨ₂ＣＨ₂Ｏ−）_n）；３．３８ppm（ｓ，−ＯＣＨ₃）；２．１７ppm（三つの結合の二重項（doublet of triplets）、−ＣＨ₂ＣＨ₂Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）₂）。
【０１５１】
実施例１６
メトキシ−ＰＥＧ（２Ｋ）−ホスホン酸塩／超常磁性酸化鉄結合体の調製
メトキシ−ＰＥＧ（２Ｋ）−ホスホン酸塩（０．４４８g）；実施例１２に係る酸化鉄生成物の９３．７mg Fe/mL懸濁液３．４２mLと、水の総水量２０mLの混合液を３７℃で２０時間インキュベートした。その反応混合液を、ＹＭ−３０膜を備えた５０mLアミコン（Amicon）攪拌セルに設置し、水に対しダイアフィルトレーションし、その後０．２μｍナイロンフィルターを通して濾過した。ＩＣＰ分析により、そのサンプルに、１３．３mg Fe/ml、０．３４mg/mlの非結合メトキシ−ＰＥＧ（２Ｋ）−ホスホン酸塩及び１．４２mg/mlの結合メトキシ−ＰＥＧ（２Ｋ）−ホスホン酸塩が含まれていることが分かった。
【０１５２】
実施例１７
メトキシ−ＰＥＧ（５Ｋ）−チオール／超常磁性酸化鉄結合体の調製
メトキシ−ＰＥＧ（５Ｋ）−チオール（０．４３８g）；実施例１２による酸化鉄生成物の９３．７mg Fe/mL懸濁液１．６７mLと水（１０mL）の混合液を３７℃で２２時間インキュベートした。その反応混合液を、ＹＭ−３０膜を備えた５０mLアミコン（Amicon）攪拌セルに設置し、水に対しダイアフィルトレーションし、その後０．２μｍナイロンフィルターを通して濾過した。そのサンプルに、ＩＣＰ分析により、１３．４７mg Fe/ml、０．２３mg/mlの非結合メトキシ−ＰＥＧ（５Ｋ）−チオール及び５．４６mg/mlの結合メトキシ−ＰＥＧ（５Ｋ）−チオールが含まれていることが分かった。
【０１５３】
実施例１８
ＭＰＰ被膜の有る場合と無い場合の酸化鉄粒子懸濁液の調製
ＭＰＰ無し：
始めに、注射液のバッチ量の７０％以下を、グラス又はグラスライニング製造タンクに添加する。一定して混合しながら、マンニトールを添加し溶解させる。マンニトールの終濃度は、一般に３．５％ ｗ／ｖであるが、１〜５％ ｗ／ｖの範囲であればよい。一定して混合しながら、トロメタミンを添加し溶解させる。トロメタミンの終濃度は、一般に５０mMであるが、１０〜１００mMの範囲にあればよい。一定して混合しながら、酸化鉄バルク懸濁液（実施例１２により生成）を添加する。酸化鉄の終濃度は、一般に３％であるが、０．１〜１０％ w/v鉄の範囲にあればよい。前記バルク懸濁液のｐＨを調べ、必要であれば、０．１Ｎ ＮａＯＨ又は０．１Ｎ塩酸のどちらかで８．１〜８．３（目標８．２）にｐＨを調節する。引き続き混合しながら、前記バルク懸濁液を、注射液で最終容量の１００％に調整する。調製された懸濁液を、一般には１５Ｆ。であるが１０から５０Ｆ。、１２１℃で蒸気熱により滅菌することができる。その最終懸濁液のｐＨは、７〜７．５が一般的範囲であるが、５〜８の範囲にあればよい。
【０１５４】
ＭＰＰ有り：
始めに、注射液の全バッチ量の２５％以下を、適切なタラ製造タンクに添加する。継続して混合しながら、メトキシ−ポリ（エチレングリコール）（２０００）ホスフェイトを添加し、溶解させる。その最終的ＭＰＰ／Ｆｅの割合は、一般には１．５であるが、０．１〜５の範囲にあればよい。継続して混合しながら、トロメタミンを添加し溶解させる。トロメタミンの終濃度は、一般に５０mMであるが、１０〜１００mMの範囲にあればよい。混合しながら、マンニトールを添加し溶解させる。マンニトールの終濃度は、一般には２．５％であるが、１〜５％ w/vの範囲にあればよい。適切な容器に、適量の酸化鉄懸濁液（実施例１２により生成）を量り分ける。混合しながら、前記酸化鉄懸濁液に、ＭＰＰ、マンニトール、及びトロメタミンを含む溶液をゆっくりと添加する。酸化鉄の終濃度は、一般には３％であるが、０．１〜１０％w/v鉄の範囲にあればよい。その懸濁液のｐＨを調べ、０．４Ｎ苛性ソーダで、８．９〜９．０に調節する。継続して混合しながら、前記懸濁液を注射液で、最終量の１００％に前記懸濁液を調整する。上述したように調製した懸濁液を、一般には１５Ｆ。であるが１０〜５０Ｆ。、１２１℃で蒸気熱により滅菌することができる。ＭＰＰの酸化鉄への結合は、蒸気滅菌中に起る。また、代わりに、前記懸濁液を２〜４時間６０〜９５℃でインキュベートし、ＭＰＰを酸化鉄に結合させることもできる。その最終懸濁液のｐＨは、７〜７．５が一般的範囲であるが、５〜８の範囲にあればよい。
【０１５５】
実施例１９
非被覆酸化鉄ナノ結晶の調製
（ａ）安定剤を添加することく、酸化鉄からデンプン由来ポリマーコーティングを除去する。
実施例１２により生成した酸化鉄懸濁液を用いて、ポリマー被膜無しで酸化鉄ナノ結晶の安定した懸濁液を、代替安定剤を用いること無く調製できるかどうかを判断するためのテストを行った。３０％過酸化水素０．５mlを、０．５mlアリクオットの酸化鉄懸濁液に添加した。前記サンプルを、一定して攪拌しながら５５℃でインキュベートし、そのｐＨ値をモニターするためｐＨ電極を使用した。酸化反応が進むにつれ、サンプルのｐＨ値はゆっくりと下がった。そのサンプルのｐＨ値を、１Ｎ ＮａＯＨを添加して、６．５〜７．５の範囲内に維持した。３時間のインキュベート時間内に、そのサンプルは、凝集し、酸化鉄粒子懸濁液は、一旦そのポリマー被膜が除去されると、不安定になり、大量の凝集物を形成することを示している。
【０１５６】
（ｂ）モノホスフェイトを用いた試験
非被覆酸化鉄ナノ結晶（ニオン（nions））を安定させるための表面調節剤としてのモノホスフェイトの有効性をテストするため、０．５mlアリクオットの酸化鉄懸濁液を、様々な濃度の燐酸三ナトリウムと混合するという研究を行った。０．５mlの過酸化水素を各サンプルに添加した。それらのサンプルを５５℃でインキュベートし、デンプン由来ポリマー被膜（ＳＤＰＣ）を酸化処理した。
【０１５７】

【０１５８】
５５℃で５時間インキュベートした後、全サンプルが凝集し、モノホスフェイトが、非被覆フェロンに対し十分な表面調節剤及び安定剤でないことを示した。
【０１５９】
（ｃ）表面調節剤及び安定剤としての二りん酸塩
前記モノホスフェイトの場合と類似の方法で、ピロリン酸４ナトリウム（無水）を用いて、酸化鉄粒子の表面調節剤としての二りん酸塩（ピロりん酸塩としても知られている）の有効性を調べた。サンプルを５５℃でインキュベートし、デンプン由来ポリマー被膜（ＳＤＰＣ）を酸化処理した。５５℃で５時間インキュベートした後、サンプル２〜７においては、懸濁状態のままであった。それらの平均粒径を測定し、下記表に示した。
【０１６０】

【０１６１】
粒径が小さいものは、デンプン由来ポリマー被膜物質が除去されていることを意味する。このデータは、約２〜６０mMの濃度範囲のピロりん酸塩が、非被覆酸化鉄結晶の表面調節剤及び安定剤として申し分のないものであることを示している。
【０１６２】
（ｄ）表面調節剤及び安定剤としての三りん酸塩
安定剤として三りん酸塩をテストするため、研究を行った。シグマ粒子からの三りん酸５ナトリウム六水和物を使用した。酸化鉄懸濁液３．７５mlに、三りん酸ナトリウム５．２５mM、水３．７５ml及び３０％過酸化水素７．５mlを添加した。その混合液を、６０℃で３時間インキュベートした。その懸濁液において、凝集の兆候は見られず、粒径を測定したところ９nmであった。ここでも、粒径が小さいものは、デンプン由来物質が除去されていることを意味する。このデータは、三りん酸塩が、非被覆酸化鉄結晶の表面調整剤及び安定剤として申し分のないものであることを示している。
【０１６３】
（ｅ）表面調節剤及び安定剤としての四りん酸塩
四りん酸塩をテストするため同様の研究を行った。シグマ粒子からのヘキサアンモニウムテトラポリりん酸塩を使用した。その結果を下記表に要約する。

ここでも、サンプル２〜４のインキュベート後の粒径が小さいのは、デンプン由来被膜物質が除去されていることを意味する。このデータは、四りん酸塩も、非被覆酸化鉄結晶の表面調節剤及び安定剤として申し分のないものであることを示している。
【０１６４】
非被覆酸化鉄ナノ結晶の特性記述
非被覆酸化鉄ナノ結晶（ニオン（nions））の懸濁液は、ピロりん酸ナトリウムを用いて調製した。酸化処理が完了するとすぐに、前記懸濁液を水に対しダイアフィルトレーションし、分解されたデンプンと残留過酸化水素を除去した。その結果得られた懸濁液の特性を、下記に要約するように、いくつかの解析技法により記述する。
【０１６５】
（ａ）ＧＰＣ：ゲルパーミエーションクロマトグラフィー（ＧＰＣ）は、前記非被覆酸化鉄ナノ粒子（ＮＩＯＮ）が、デンプン由来ポリマーの痕跡を持たない鋭いピークを現していることを示している。
【０１６６】
（ｂ）全有機炭素：二つの別個のニオン（nion）調製物の分析は、全有機炭素のベースラインレベルのみを示しており、実質的にポリマー被膜の除去が完了していることを示している。

【０１６７】
（Ｃ）細管電気泳動：ニオン（nions）を分析したところ、電気泳動速度−３．４×１０^-4cm²v^-1s^-1を示した。これは、実施例１２の生成物の電気泳動速度（−３．０×１０^-4cm²v^-1s^-1）よりもわずかにネガティブである。これは、ポリりん酸塩により粒子に添加された負静電荷と一致する。
【０１６８】
（ｄ）緩和度及び磁気飽和：磁気緩和度を測定した。r₁及びr₂は、それぞれ２２．５と３４．４mM^-1s^-1であり、r₂/r₁の割合は１．５３であった。これらの値は、概して、実施例１２の生成物のものとかなり似通っている。
【０１６９】
（ｅ）蒸気滅菌下の安定性：ニオン（Nion）懸濁液を、１２１℃で２０分間蒸気滅菌し、粒径において検知可能な変化は見られなかった。

Claims (7)

1. 複合超常磁性酸化鉄粒子を生成するためのプロセスであり、前記プロセスが、以下の連続段階を含む：
   （ｉ）加熱された水溶液中に、デンプン、第一及び第二鉄塩、並びに塩基を混合し；
   （ｉｉ）ｐＨを６．０から８．５の範囲内まで下げ；
   （ｉｉｉ）酸化物で処理し、前記デンプンを開裂させ、前記粒子を遊離させ；
   （ｉｖ）前記の遊離した粒子を洗浄し、濾過する。
2. （ｖ）前記の遊離した粒子を、官能化ポリアルキレンオキシド誘導体と反応させ、前記誘導体を前記粒子に結合させる工程を、さらに含み、前記工程（ｖ）が工程（ｉｖ）の後で行われる請求項１に記載のプロセス。
3. 請求項２に記載のプロセスにより得られた複合超常磁性酸化鉄粒子であり、
   前記複合超常磁性酸化鉄粒子が、超常磁性酸化鉄コアを含有し、開裂したデンプン皮膜物質と共に、官能化ポリアルキレンオキシド誘導体の被覆をさらに含み、
   超常磁性酸化鉄コアと開裂したデンプン皮膜物質とを含む粒子の平均全粒径が４〜３０ｎｍである複合超常磁性酸化鉄粒子。
4. 請求項３に記載の複合超常磁性酸化鉄粒子を含む、人体又は非人体において、局所熱的治療法または加温療法において用いられる剤。
5. 請求項３に記載の複合超常磁性酸化鉄粒子を含む、鉄を用いた治療法において用いられる剤。
6. 造影剤組成物であり、請求項３に記載の複合超常磁性酸化鉄粒子をコントラスト有効量含む造影剤組成物。
7. 人体又は非人体の血管系、リンパ系、肝臓または脾臓の診断方法において、使用される診断用コントラスト剤組成物であり、請求項６に記載の造影剤組成物を含む診断用コントラスト剤組成物。

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