DE69125848T2 - Targeting von therapeutischen mitteln durch verwendung von polysacchariden - Google Patents

Targeting von therapeutischen mitteln durch verwendung von polysacchariden

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Description

  • Die Erfindung betrifft das Targeting von einem therapeutischen Mittel auf eine bestimmte Zellpopulation, insbesondere auf Hepatozyten.
  • Es werden zunächst einige Begriffe definiert und dann der Stand der Technik beschrieben. Ein "therapeutisches Mittel" wird verabreicht, will man beim Empfänger eine physiologische Funktion vorteilhaft verändern. Therapeutische Mittel können Medikamente sein, Proteine, Hormone, Enzyme, Nukleinsäuren, Peptide, Steroide, Wachstumsfaktoren, Modulatoren der Enzymaktivität, Modulatoren der Rezeptoraktivität und Vitamine.
  • Ein "Diagnostikum" wird verabreicht, will man eine physiologische Funktion untersuchen, ohne sie zu beeinträchtigen. Diagnostika umfassen Radioisotope für die Szintigraphie, elektronendichte Marker für die Röntgen- oder Computertomographie und magnetische Marker für die Magnetresonanzbildgebung.
  • Unter "Targeting" versteht man die Modifizierung eines Mittels, so dass es gegenüber dem nicht-modifizierten Mittel, wird es parenteral verabreicht, von einem bestimmten Typ Zellen oder von einer bestimmten Zellpopulation verstärkt aufgenommen wird.
  • Unter "rezeptorvermittelter Endozytose" (RME) versteht man einen Vorgang, bei dem Moleküle extrazellulär an bestimmte Rezeptoren auf der Zelloberfläche binden und internalisiert werden. Bei dem als RME bekannten Vorgang werden Moleküle, die ins vaskuläre Kompartiment injiziert wurden, aus dem Plasma entfernt. Für die Aufnahme mittels RME sind im allgemeinen bei der Wechselwirkung zwischen Rezeptor und Ligand folgende drei Eigenschaften relevant: Strukturspezifität, Sättigbarkeit und Kompetition. Strukturspezifität liegt vor, wenn der Rezeptor zwischen nahe verwandten Strukturen unterscheiden kann, und wenn nur solche Moleküle internalisiert werden, deren Struktur den Bindungskriterien der Rezeptorbindungsstelle entspricht. Oft werden die an der RME beteiligten Rezeptoren über die Eigenschaft entdeckt, dass sie bestimmte Glykoproteine internalisieren bzw. aus dem Kreislauf entfernen können. Sättigbarkeit liegt vor, wenn die Rate, mit der ein Mittel durch RME aufgenommen wird, bei höheren Konzentrationen abnimmt. Dies ist der Fall, wenn bei hohen Konzentrationen die Rezeptoren voll besetzt bzw. mit Ligand gesättigt sind.
  • "Kompetition" liegt vor, wenn die Internalisierungsrate des Mittels durch die Anwesenheit eines weiteren Mittels, das dem ersten Mittel strukturell ähnlich ist, vermindert wird. Das weitere Mittel konkurriert dann um die Rezeptorbindungsstellen und vermindert die Internalisierungsrate des ersten Mittels. Sättigung tritt ein, wenn viele Liganden um eine begrenzte Zahl von Rezeptorstellen konkurrieren. Kompetition tritt auf, wenn chemisch unterschiedliche Liganden an eine begrenzte Zahl von Rezeptorstellen binden.
  • Die Aufnahme von Stoffen durch RME ist ein Charakteristikum normaler, gesunder Zellen. RME-Transportsysteme findet man auf normalen Makrophagen, bei Hepatocyten, bei Fibroplasten und bei Retikulocyten. Durch RME können Zellen eine Vielzahl Makromoleküle aus dem Plasma aufnehmen wie z.B. die Asialoglykoproteine, die Low-density-Lipoproteine, Transferrin und Insulin. Siehe Wileman et al., Biochem. J., (1985), 232, S. 1-14 (Tabelle 1) mit einer Liste RME-fähiger Zellen. Die Tabelle gibt auch einen allgemeinen Überblick über die RME. Siehe auch Tabelle I in Menz, E.T., PCT/WO/90/01295, eingereicht am 03. August 1989. Die Transformation normaler Zellen in Tumorzellen ist oft von einer Zu- oder Abnahme der RME- Rezeptoraktivität begleitet. In einigen Fällen, z.B. bei der RME des Asialoglykoproteinrezeptors in Hepatocyten, führt die Transformation der Hepatozyten zu Hepatoma-Krebszellen zum Verlust des Rezeptors. Siehe Stockert et al., Cancer Res., (1980), 40, S. 3632-3634. In vielen Fällen, wie z.B. beim Targeting eines Medikaments auf ein Tumorantigen mittels Antikörper, liegen die Antigene auf den Tumorzellen in höherer und auf den normalen Zellen in kleinerer Zahl vor.
  • Polysaccharide wie das Arabinogalactan, das mit den an der RME beteiligten Rezeptoren wechselwirkt, bezeichnet man als Polysaccharide vom RME-Typ. Viele gewöhnliche Polysaccharide wie die Dextrane, Dextrine, Cellulosen, Hydroxyethylstärken, Heparine, Stärken, Dextransulfate, das Carboxyl-methylierte Dextran und die Carboxymethylcellulose binden nicht an den an der RME beteiligten Rezeptoren; sie werden als Nicht-RME- Polysaccharide bezeichnet.
  • Es wird nun der Stand der Technik anhand dieser Definitionen beschrieben. Die Nicht-RME-Polysaccharide werden auch zur Synthese einer Vielzahl als Diagnostikum oder Therapiemittel verwendeter Stoffe eingesetzt. Siehe EP-0 186 947 B1 (Jacobsen, T.); US-Patent 4 501 726 (Schroder); PCT/WO/90/03190 vom 29. September 1989 (Ranney, D.F.); US-Patent 4 827 945 (Groman); US-Patent 4 770 183 (Groman). Ranney offenbart die Verabreichung von Diagnostika (von Metallionen, die bei der Magnetresonanz- (MR) als Kontrastmittel dienen), wobei er einen polymerer Träger verwendet, der gegen Tumorzellen gerichtet ist. Ohne nähere Beispiele weist Ranney darauf hin, dass auch andere therapeutische Komplexe mit diesem Verfahren verabreicht werden können, für eine chemotherapeutische Behandlung, für eine Sensibilisierung oder zur Verstärkung einer Strahlenbehandlung (PCT/WO/90/03190 vom 29. September 1989, S. 51). Es ist bekannt, dass man das Arabinogalactan als ein RME-Polysaccharid verwenden kann, um bestimmte Diagnostika, insbesondere superparamagnetisches Eisenoxid, auf ein Target zu lenken (PCT/WO/90/01295, Menz, E.T., eingereicht am 3. August, 1988).
  • Andererseits werden therapeutische Mittel gewöhnlich mit Liposomen und Glykoproteinen auf ein Target gelenkt. Normalerweise werden Liposomen nach ihrer Injizierung als teilchenförmiges Material erkannt und einer Phagozytose unterworfen, so dass sie in den Geweben des Reticuloendothelsystems (RES) angereichtert werden. Die Stoffe in den Liposomen reichern sich dann in Geweben an wie z.B. der Leber, der Milz oder auch in Knochen, die ein RES besitzen. Es werden auch oberflächenmodifizierte Liposomen synthetisiert, welche der RME unterliegen, wobei aber die Oberflächenmodifizierung aus einer Protein- oder Glykoproteinschicht besteht (Ranade, V.V., J. Clin. Pharmacol., (1989), 29, 685-694; Dragsten et al., Biochem. Biophys. Acta, (1987), 926, 270-279).
  • Es werden auf Kolloide und Teilchen unterschiedlicher Größe und Zusammensetzung vom RES erkannt. Beispielsweise wird Imferon , ein mit Dextran beschichtetes kolloidales Eisen- (III)oxyhydroxid, das zur Behandlung von Anämie verwendet wird, langsam durch die Phagozytoseaktivität der Makrophagen des RES aus dem Blut entfernt (Handerson et al., Blood (1969), 34, S. 357-375). Auch radioaktive Diagnostika wie Technecium- Schwefel-Kolloide und viele andere Arten magnetischer Teilchen, die man als MR-Kontrastmittel verwendet, werden durch das RES entfernt (Josephson et al., Mag. Res. Imag., (1990), 8, 637-646).
  • Ferner werden Glykoproteine, die durch RME internalisiert werden, dazu verwendet, um eine therapeutisches Mittel an ein Target zu lenken. wegen einer Übersicht zu "Targeting"- Strategien, siehe Tabelle II in Pharm. Res., Meijer et al., (1989), 6, S. 105-118.
  • Die Erfindung stellt einen Komplex bereit, der in einem therapeutischen Mittel verwendet werden kann, um ein Targeting auf eine bestimmte Population von Zellen zu erreichen. Das Targeting wird erreicht, indem ein kovalenter Komplex erzeugt wird zwischen dem therapeutischen Mittel und einem Polysaccharid, das mit Rezeptoren wechselwirkt, bei denen eine rezeptorvermittelte Endozytose (RME) erfolgt. Der so gewonnene Komplex wird dann durch rezeptorvermittelte Endocytose von der spezifischen Population von Zellen internalisiert. Die Erfindung erlaubt eine Anreicherung des therapeutischen Mittel in Geweben, wo es vorteilhaft wirkt, bzw. eine Verminderung in Geweben, wo es sie unerwünschte, toxische Wirkungen hat.
    • Eingehende Beschreibung einzelner Ausführungsformen Allgemeines
  • Die Erfindung stellt einen Komplex bereit, mit dem ein therapeutisches Mittel in eine bestimmte Population von Zellen geschleust werden kann. Durch das Targeting wird das therapeutische Mittel in Zellen angereichert, wo es eine vorteilhafte Wirkung hat, bzw. dessen Konzentration dort vermindert, wo es unerwünscht ist und toxische Wirkungen hat. Viele therapeutische Mittel haben toxische Wirkungen - nicht in den Zellen, wo das Mittel vorteilhaft wirkt, sondern in anderen Zellen, wo dies nicht der Fall ist.
  • Durch das Targeting des therapeutischen Mitteln auf bestimmte Zellen und weg von anderen Zellen eröffnet die Erfindung eine Möglichkeit, wie man die Sicherheit und Wirksamkeit der bislang entwickelten therapeutischen Mittel verbessern kann. Zum Beispiel kann ein therapeutisches Mittel, das den Metabolismus der Hepatozyten in der Leber verändert, für Knochenmarkszellen toxisch sein. Da das Knochenmark aber lebenswichtig ist, limitieren die toxischen Wirkungen auf das Knochenmark die Dosis, mit der das Mittel verabreicht werden kann. Könnte man das Mittel auf die Hepatocyten richten, z.B. indem man es an Arabinogalactan anhängt, wäre dessen Konzentration im Knochenmark kleiner. Die Wirksamkeit des Mittels wäre größer, da der Anteil des therapeutischen Mittels, der gewöhnlich ins Knochenmark ginge, jetzt zur Leber geleitet wird. Knochenmark-bezogene Nebeneffekte kämen nicht vor.
    • Wie werden die RME-Polysaccharide kenntlich gemacht?
  • Das therapeutische Mittel wird erfindungsgemäß an ein RME- Polysaccharid gebunden. Der resultierende Komplex wird von den Rezeptoren an den Zelloberflächen in bestimmte Arten von Zellen geleitet. Erfindungsgemäß können nur bestimmte Polysaccharide, sogenannte RME-Polysaccharide, verwendet werden. RME-Polysaccharide unterscheiden sich von herkömmlichen Nicht- RME-Polysacchariden wie Dextranen, Dextrinen, Cellulosen, Hydroxyethylstärken, Heparinen, Stärken, Dextransulfaten, dem carboxymethyliertem Dextran und der Carboxymethylcellulose. Nicht-RME-Polysaccharide werden für verschiedene Anwendungen, z.B. der Medikamentenverabreichung, Medikamentenformulierung, als Nahrungsmittelzusatzstoffe und zum Erhöhen des Plasmavolumens eingesetzt. RME-Polysaccharide umfassen Arabinogalactan und Mannan, und sie können erfindungsgemäß verwendet werden zum Targeting eines therapeutischen Mittels direkt auf Hepatocyten bzw. Macrophagen. Die vorstehend beschriebenen Druckschriften, z.B. von Ranney, beschreiben das Targeting bestimmter therapeutischer Mittel durch Polysaccharide. Sie offenbaren nicht bzw. sie befassen sich nicht selbst mit der Verwendung der RME-Polysacchariden.
  • Der erfindungsgemäße Komplex wird nachstehend als RME-Polysaccharid/Therapeutikum-Komplex bezeichnet. Der Komplex aus RME-Polysaccharid und therapeutischem Mittel umfasst die kovalente Bindung des therapeutischen Mittels an das RME-Polysaccharid (Beispiele 1 und 2).
  • Nicht-RME-Polysaccharide können chemisch modifiziert werden, z.B. durch Carboxymethylierung, Succinylierung, Hydroxyethylierung und Sulfatierung. Allgemein führt eine solche chemische Modifikation eines gewöhnlichen Polysaccharids nicht dazu, dass es an einen RME-Rezeptor bindet und einer RME unterliegt.
  • Nicht-RME-Polysaccharide können jedoch in einigen Fällen durch das Anbringen von Substituentengruppen modifiziert werden, welche von den RME-Rezeptoren erkannt werden. Durch eine derartige Modifikation wird aus einem Nicht-RME-Polysaccharid ein Polysaccharide vom RME-Typ. So kann z.B. ein Galaktoserest an das Nicht-RME-Polysaccharid Dextran gebunden werden; die Galaktose an dem so gewonnenen Polysaccharid wird vom Asialoglykoprotein-Rezeptor erkannt und unterliegt der RME. Durch das Anhängen der Galaktose wird somit das Dextran in ein RME- Polysaccharid überführt. Auf ähnliche Weise kann auch ein Mannose-Rest an das Dextran gebunden werden. Das so gewonnene Polysaccharid wird dann vom Mannose-Rezeptor der Phagocyten erkannt.
  • Eine zweite Modifikation der RME-Polysaccharide umfasst einen partiellen Verdau, wobei niedermolekulare Polysaccharide entstehen, den man erzielen kann durch kontrollierte saure Hydrolyse und Fraktionierung. Man erhält so RME-Polysaccharide der gewünschten Größenklasse. Die erfindungsgemäßen Polysaccharide haben vor dem Verdau oder der Modifikation ein Molekulargewicht von über 1000 Dalton.
  • Bevor man ein Polysaccharid als RME-Polysaccharid bezeichnen kann, muss aber erst nachgewiesen werden, dass es an einen RME-Rezeptor bindet. Dies kann man beispielsweise zeigen, indem es das Verschwinden eines Glykoproteins verhindert, von man weiß, dass es durch RME entfernt wird. Die Bindung von Arabinogalactan an den Asialoglykoprotein-Rezeptor wurde z.B. dadurch nachgewiesen, dass das Verschwinden einer radioaktiv gemachten Probe des Asialoglykoproteins Asialofetuin verhindert wurde. Die Injektion von 500 mg/kg Arabinogalactan genügte, um zu verhindern, dass in Ratten das ¹²&sup5;I-Asialofetuin verschwand (siehe Tabelle 1 in Mag. Res. Imag., Josephson et al., (1990), 8, S. 637-646). Dieser Versuch zeigte, dass das Arabinogalactan vom Asialoglykoprotein-Rezeptor der Hepatocyten erkannt wird. Somit ist das Arabinogalactan ein RME-Polysaccharid.
  • Ähnlich verhindert Mannan das Verschwinden von radioaktiv gemachtem Glykoprotein RNase-B. Siehe Arch. Biochem. Biophys., Brown et al., (1978), 188, 418-428). Arabinogalactan und Mannan werden nachstehend kurz beschrieben. Zusätzlich zu den genannten Polysacchariden können andere RME-Polysaccharide als Modifikations- oder Abbauprodukte der beschriebenen Polysaccharide gewonnen werden.
  • Ein einfacher Test, mit dem man feststellen kann, ob ein Polysaccharid/Therapeutikum-Komplex erfindungsgemäß ist, beruht auf der Eigenschaft der verschiedenen Stoffe, dass sie das Verschwinden des Komplexes aus dem Blut zu verzögern. Erfindungsgemäße Komplexe verschwinden mittels RME. Ihr Verschwinden wird von Stoffen verhindert, die über den gleichen Rezeptor entfernt werden.
  • Das Verschwinden der erfindungsgemäßen RME-Typ Polysaccharid/Therapeutikum-Komplexe wird nicht dadurch beeinträchtigt, dass man eine beachtliche Menge an Nicht-RME-Polysacchariden wie Dextran und Hydroxyethyl stärke injiziert. Das Verschwinden der erfindungsgemäßen RME- Polysaccharid/Therapeutikum-Komplexe wird auch nicht beeinträchtigt, wenn man eine beachtliche Menge von Teilchen, Kolloiden oder Liposomen, die von den phagocytischen Zellen des RES entfernt werden, injiziert.
    • Welche Vorteile besitzen Polysaccharide als Träger bei der Verabreichung therapeutischer Mittel?
  • Polysaccharide haben gegenüber Proteinen beim Targeting therapeutischer Mittel den Vorteil, dass sie bei hohen Temperaturen, extremen pH-Werten oder in organischen Lösungsmitteln nicht sofort denaturieren. Die Stabilität der Polysaccharide ermöglicht auch in organischen Lösungsmitteln eine kovalente Bindung zwischen dem therapeutischen Mittel und den Polysacchariden. Dies ist ein großer Vorteil, da einige therapeutische Mittel schlecht wasserlöslich sind. Polysaccharide haben in nicht-wässrigen Medien den Vorteil, dass in Wasser instabile Bindungen, z.B. Esterbindungen, zwischen dem therapeutischen Mittel und dem Polysaccharid vorhanden sein können. Ein Beispiel dieser Chemie wird in Beispiel 2 gezeigt.
  • Polysaccharide haben weiter den Vorteil, dass sie aus mikrobiologischen oder pflanzlichen Quellen erhalten werden können. Menschliche oder tierische Glykoproteine können Pathogene enthalten, und es bedarf eines großen Aufwands, um sicherzustellen, dass diese nicht zugegen sind. Es können Polysaccharide aus mikrobiologischen oder pflanzlichen Quellen zur Verwendung in der Erfindung ausgewählt werden. Sie haben eine sehr geringe Toxität und Immunogenität. Pflanzliche oder mikrobiologische Quellen können große Mengen Roh-Polysaccharid-Präparationen bereitstellen, zuverlässig und zum angemessenen Preis. Arabinogalactane und Mannane sind zwei verwendbare erfindungsgemäße Kohlenwasserstoffklassen.
    • Arabinogalactane
  • Arabinogalactane sind eine Klasse von Polysacchariden, die in den Zellwänden vieler Baumarten und Pflanzen vorkommen. Gewöhnlich wird Arabinogalactan aus der amerikanischen Westernlärche (Larix occidentalis) gewonnen. Das Arabinogalactan aus dieser Quelle wird als Bindemittel, als Emulgator oder als Stabilisator in Nahrungsmitteln verwendet. Es besteht aus einem Galaktosegerüst mit verzweigten Arabinose- und Galaktoseketten. Das Verhältnis von Galaktose zu Arabinose liegt allgemein zwischen 5:1 und 10:1. Das Molekulargewicht liegt zwischen 10 und 100 Kilodalton (siehe "Food Hydrocolloids"; Glickman, ed., CRC Press, (1982), 5, 33).
  • Die besten Ergebnisse erhält man mit einem gereinigten Arabinogalactan. Im Handel erhältliches Arabinogalactan können durch Ultrafiltration weiter gereinigt werden, wodurch Verunreinigungen von mehr als 100 000 Dalton und weniger als 10 000 Dalton entfernt werden können. So gereinigtes Arabinogalactan wurde in den patentgemäßen Beispielen verwendet.
  • Arabinogalactane binden an den Asialoglykoprotein-Rezeptor der Hepatocyten. Dieser Rezeptor führt mit vielen Stoffen eine RME durch (siehe "The Glycoconjugates", Harford et al., M.I. Horowitz, Ed., Academic Press, (1982), Bd. 4, 27-55) und therapeutische Mittel, die an Arabinogalactan gebunden sind, werden in die Hepatocyten eingeführt.
    • Mannane
  • Mannane sind eine Klasse von Polysacchariden, die man aus den Zellwänden der Hefen gewinnt. Hauptsächlich sind dies α-D-Mannopyrane mit einer Vielzahl linearer und verzweigter Kettenstrukturen (siehe "The Polysaccharides", Gorin et al., G. O. Aspinall, Ed., Academic Press, (1983) , Bd. 2, 376-380).
  • Mannane binden an den Mannose-Rezeptor, der sich auf den Makrophagen des RES befindet. An Mannan gebundene therapeutische Mittel werden in Makrophagen eingeführt.
    • Therapeutische Mittel, die erfindungsgemäß ein Target erhalten
  • Durch das erfindungsgemäße Verfahren kann eine Vielzahl therapeutischer Mittel auf eine Zellpopulation zugeführt werden. Beispiele therapeutischer Mittel sind in Tabelle 1 aufgelistet. Einige der Mittel in Tabelle 1 kann man Hepatocyten zuführen, z.B. antivirale Mittel zur Behandlung von Hepatitis. Eisen kann man Hepatocyten zugeführen, um eine unausgewogene Ernährung, d.h. Eisenmangelanämie, auszugleichen. Bei genetischen Defekten der Leber, z.B. bei Fehlen eines hepatischen Enzyms, kann man der Leber DNA zuführen, um die genetischen Defekte zu beseitigen. Die Erfindung kann dazu verwendet werden, therapeutische Mittel zielzurichten, die durch andere Verfahren zugeführt wurden. Es sind weitere Übersichten therapeutischer Mittel verfügbar, die man zugeführen wollte (Pharm. Res., (1989), Meijer et al., 6, Tabelle II, 105-118, und J. Clin. Pharmacol., (1989), Ranade, 29, 685-694). Tabelle 1 Erfindungsgemäße zielgerichtete Anwendungen und Mittel
  • Eine erfindungsgemäße Anwendung ist das Targeting antiviraler Mittel in Hepatocyten eines Patienten mit einer chronischen Hepatitis-B-Infektion. Dabei sind die antiviralen Mittel die zugeführten therapeutischen Mittel. Das Targeting eines antiviralen Mittels zur infizierten Zellpopulation (Hepatocyten) und nicht zum Knochenmark resultiert in einer wirksameren Behandlung mit dem Medikament. Die antiviralen Mittel können an Arabinogalactan gebunden sein und intravenös injiziert werden, so dass in den Hepatocyten eine hohe Konzentration erreicht wird. Das Targeting für die Ernährung wichtiger Stoffe, z.B. Eisen, kann durch die Erfindung erfolgen. Der Unterschied der Pharmakokinetik und biologischen Verteilung führt dazu, dass das erfindungsgemäße Eisen ein sichereres therapeutisches Mittel ist als Eisenoxid-Dextran.
  • Erfindungsgemäß können auch Vitamine zugeführt werden. Beispiel 1 zeigt die Herstellung eines Folsäure-Arabinogalactan-Konjugats, das das Vitamin Folsäure durch RME Hepatocyten zuführt. Folsäure ist chemische ähnlich wie das Medikament Methotrexat, das an Arabinogalactan gebunden werden kann, indem geringe Modifikationen des bei Folsäure angegebenen Verfahrens vorgenommen werden.
  • Hormone, wie Steroide, können durch die erfindungsgemäßen Verfahren direkt auf bestimmte Populationen von Zellen gebracht werden. Steroide haben eine starke biologische Aktivität, die sich entfaltet nachdem das Steroid an einen Rezeptor auf den Zellen bindet (Siehe "Textbook of Endocrine Physiology", Martin, C.R., Williams & Wilkins (1976), 21). Das Targeting von Steroiden auf Zellen ist eine vielfältig einsetzbare erfindungsgemäße Anwendung. Eine Anwendung des Hormon-Targeting ist, Glukocorticoide in Zellen zu schleusen. Beispiel 2 zeigt die Synthese eines Arabinogalactan-Prednison- Konjugats, mit dem das Steroid Prednison durch RME in Hepatocyten eingeführt werden kann. Steroide konnten zugeführt werden, indem man sie an Mannan hängte und sie durch den Mannose-Rezeptor auf den Zellen der RES in geeignete Zellen gelangen.
    • Beispiel 1
  • Die Folsäure ist ein Vitamin und es kann nachstehend beschrieben an das REM-Polysaccharid Arabinogalactan gebunden werden. Das Medikament Methotrexat ist ein Folsäure-Antagonist und wirkt gegen Krebs. Das Methotrexat kann an Polysaccharide gebunden werden, die einer RME unterliegen. Ferner kann es in Zuführ-Anwendungen eingesetzt werden, indem man die Folsäure-Kopplungschemie wie folgt veränderte:
  • Es wurde Folsäuredihydrat (6.0 mg, 13 µmol) in H&sub2;O (1 mL) suspendiert. Dann wurde NaOH (0,10 N, 7 Tropfen) zugegeben bis die weiße Folsäure-Festsubstanz nahezu vollständig gelöst war. Es wurde reines Arabinogalactan (23 000 Dalton, 35,3 mg, 1,53 µmol) zugegeben, gefolgt von 1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimid (51,2 mg, 286 µmol). Nach 2,5 Stunden Rühren bei Raumtemperatur wurde das Reaktionsgemisch durch HPLC auf einer Sephadex -G-25-Säule (9,5x300 mm) mit 0,05% NaN&sub3; (0,33 mL/min) als Elutionsmittel analysiert. Der Nachweis der freien bzw. gebundenen Folsäure erfolgte mit einem UV-Detektor, eingestellt auf 280 nm (für Folsäure UVmax = 283 nm, log = 4,40). Das Chromatogramm besass einen Peak mit einer Retentionszeit von 16,8 Minuten, zurückzuführen auf Arabinogalactan konjugiertes Folat. Die freie Folsäure erschien nach 35 Minuten. Diese Zuordnung erfolgte durch Chromatographie von Arabinogalactan und Folsäure erhalten. Für den Nachweis von reinem Arabinogalactan war ein Brechungsindexdetektor erforderlich, da dieses keine Adsorption bei 280 nm besitzt. Gemäß den UV-Messungen war 37% der Folsäure an Arabinogalactan gebunden. Unter der Annahme, dass kein Arabinogalactan verloren ging und 37% konjugiertes Folat vorlag, lag das Verhältnis von Folat zu Arabinogalactan somit bei 3:1.
    • Beispiel 2
  • Steroide sind eine Klasse von Medikamenten, die man Zellen zuführen kann, indem man sie an Polysaccharide hängt, die einer RME unterliegen. Es können eine Vielzahl Steroide in analoger Weise mit der nachstehend beschriebenen Chemie an derartige Polysaccharide gebunden werden. Die Grundschritte sind: (i) Herstellen eines Polysaccharid-Konjugats, auf dem durch eine Umsetzung mit DTPA Carboxylgruppen vorliegen, und (ii) Anhängen des Steroids mittels der Carboxylgruppe des DTPA-Polysaccharids.
    • Herstellung von Arabinogalactan-DTPA
  • Es wurden reines Arabinogalactan (23 000 Dalton, 0,50 g, 21,7 µmol) und Diethylentriaminpentaessigsäure-Dianhydrid (DTPA) (0,102 g, 285 µmol) bei 60ºC in DMSO (20 mL) gelöst. Nach einer Stunde wurde die klare Lösung auf Raumtemperatur gekühlt. Nach Zugabe von H&sub2;O (10 mL) ergab sich ein weißer Niederschlag. Das Gemisch wurde durch die Ultrafiltrationsmembran Amicon-YM 5 (Cutoff-Wert: 5000 Dalton) filtriert und mit H&sub2;O (4 x 30 mL) gewaschen. Das auf der Membran zurückbleibende Produkt wurde in H&sub2;O (10 mL) gelöst, eingefroren und lyophilisiert. Die Ausbeute an weißem Pulver betrug 0,44 g. Das nominale Verhältnis von DTPA zu Arabinogalactanverhältnis betrug 13:1, unter der Voraussetzung, dass alles DTPA, das zugegeben wurde, gebunden hat (nominales Formelgewicht: 28 000 Dalton).
    • Kopplung von 6α-Methylprednisolon an Arabinogalactan-DTPA
  • Es wurden Arabinogalactan-DTPA (107,5 mg, 3,8 µmole) und 6α- Methylprednisolon (64,5 mg, 172 µmol) bei 60ºC in DMSO (15 mL) gelöst und dann 1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimid (259 mg, 1,45 mmol) zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde eine Stunde bei 60ºC gerührt. Die HPLC-Analyse (9,5x300 mm Sephadex-G10-Säule; Elutionsmittel: 0,05% NaN&sub3;; 0,50 mL/min, 280 nm UV-Detektor) des Reaktionsgemisches ergab nur einen einzelnen Peak bei 10,5 Minuten Retentionszeit, entsprechend der Laufzeit des Arabinogalactan-DTPA-Konjugats. Es wurde aber kein Peak für 6α-Methylprednisolon bei 19,5 Minuten gefunden, was bedeutet, dass das Steroid (durch Veresterung) vollständig an das Arabinogalactan-DTPA-Konjugat gebunden hatte. Nach Zugabe von H&sub2;O (10 mL) wurde das Reaktionsgemisch durch ein Amicon-YM3 (Cutoff-Wert: 3000 Dalton) ultrafiltriert. Es wurde mit H&sub2;O gewaschen (3 x 30 mL). Das Filtrat enthielt nicht-umgesetztes Steroid, Carbodiimid, Spuren von DTPA und andere niedermolekulare Stoffe. Eine HPLC-Analyse des Filtrats bestätigte die Abwesenheit freien Steroids. H&sub2;O (10 mL) wurde in das Retentat eingebracht und das Produkt lyophilisiert. Die Ausbeute an schwach-weißem Pulver betrug 0,10 g.

Claims (10)

1. Komplex zum Targeting eines therapeutischen Mittels auf eine bestimmte Population von Zellen, umfassend einen Träger, der an einen RME-Rezeptor binden kann und ausgewählt ist aus der Gruppe mit Polysaccharid und dessen Modifikationen, wobei das therapeutische Mittel kovalent an den Träger gebunden ist, so dass das therapeutische Mittel an den RME-Rezeptor einer Zielzelle gelenkt und dort internalisiert wird.
2. Komplex nach Anspruch 1, wobei der Träger ausgewählt ist aus der Gruppe mit Arabinogalaktan, Mannan, Fukoidan und deren Abbauprodukten.
3. Komplex nach Anspruch 1 oder 2, wobei der Träger ein Polysaccharid ist, modifiziert durch einen funktionellen Rest, so dass ein Derivat vorliegt.
4. Komplex nach Anspruch 1, 2 oder 3, wobei das therapeutische Mittel eine für die Ernährung wichtige Substanz ist.
5. Komplex nach Anspruch 1, 2 oder 3, wobei das therapeutische Mittel ein antivirales Mittel ist.
6. Komplex nach Anspruch 1, 2 oder 3, wobei das therapeutische Mittel ein Hormonmittel ist.
7. Komplex nach Anspruch 1, 2 oder 3, wobei das therapeutische Mittel ein Gen, ein Enzym, ein Vitamin, Methotrexat, Folsäure, 6α-Methylprednison oder Trifluorthymidin ist.
8. Komplex nach Anspruch 5, wobei das therapeutische Mittel Ara-A-Phoshat ist.
9. Komplex nach Anspruch 7, wobei das therapeutische Mittel eine DNA ist.
10. Verwendung von einem Komplex zur Herstellung eines Medikaments, wobei der Komplex einen Polysaccharidträger umfasst, der kovalent an ein therapeutisches Mittel gebunden ist, wobei das therapeutische Mittel ausgewählt ist aus der Gruppe: Nahrungsmittel, antivirale Mittel, Hormone zur Abgabe des Mittels an den RME-Rezeptor einer bestimmten Population von Zellen und zur Internalisation mit den Zellen.
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