EA001336B1 - Контрастное вещество - Google Patents

Abstract

Изобретение относится к контрастному веществу для магнитного резонанса, содержащему композитные нано-частицы, предпочтительно включающие в себя ядро из суперпарамагнитного оксида железа, снабженное покрытием, состоящим из расщепленного окислением крахмала, возможно вместе с фунукционализированным полиалкиленоксидом, который служит для продления пребывания в крови.

Description

Настоящее изобретение относится к суперпарамагнитным дисперсным контрастным агентам, в частности, для использования при магнитно-резонансной визуализации, особенно сосудистой сети, и к их получению.

Предпосылки изобретения

В способах диагностической визуализации, таких как рентгеновская, ультразвуковая или магнитно-резонансная (МР) визуализация, применение контрастных агентов для повышения контрастности между различными тканями или органами или между здоровой и поврежденной тканью является широко известным техническим приемом. Для различных способов визуализации повышение контрастности с помощью контрастных агентов достигается разными путями. Так, при протонной МР визуализации контрастные агенты в общем случае достигают своего эффекта повышения контрастности за счет модифицирования характеристического времени релаксации (Т₁ и Т₂) формирующих изображение ядер (обычно протонов воды), сигнал МР от которых используют для формирования изображения.

При введении в живое существо материалы, обладающие магнитными свойствами, такими как парамагнетизм, суперпарамагнетизм, ферромагнетизм и ферримагнетизм, могут вызывать понижение значений Т_£ и Т₂ (или Т₂*) протонов воды тканей. Хотя понижение Т_£ не может происходить без понижения Т₂ (или Т₂*), частичное снижение Т может быть отличным от частичного снижения Т₂ (или Т₂*). Если частичное снижение Т_£ больше, чем частичное снижение Т₂ (или Т₂*), то интенсивность МР изображения увеличивается, а материал называют контрастным агентом Т_£ или позитивным контрастным агентом. Если частичное снижение Т_£ меньше, чем частичное снижение Т₂ (или Т₂*), то интенсивность изображения МР уменьшается, а материал называют контрастным агентом Т₂ (или Т₂*) или негативным контрастным агентом.

Частицы с магнитными свойствами суперпарамагнетизма, ферромагнетизма и ферримагнетизма называют далее магнитными частицами.

Первое предложение использовать магнитные материалы в качестве МР контрастных агентов было сделано в 1978 г. Лаутенбуром, который предложил использовать для этой цели соли марганца. Первое предложение в патентной литературе было сделано компанией 8сйегίη§ в патенте ЕР-А-71564 (и его аналоге И8-А4647447) относительно возможности применения хелатных комплексов ионов парамагнитных металлов, таких как ион лантанида Сй (III).

Все коммерческие контрастные агенты для МР визуализации, такие как СйЭТРА, СйЭТРА-ВМА и СйНР-ЭОЗА, раньше поставляемые компаниями 811епп§. Ыусотей и Вгассо под торговыми марками МАСЫЕУКТ, ΟΜΝΙ8ί.ΆΝ и РКОНАЫСЕ, представляют собой растворимые хелатные комплексы ионов парамагнитных лантанидов, и при использовании они являются позитивными контрастными агентами, которые повышают интенсивность изображения зон их распределения.

Впоследствии отдельные дисперсные ферромагнитные, ферримагнитные и суперпарамагнитные агенты были предложены для использования в качестве негативных МР контрастных агентов. Пероральные препараты таких дисперсных агентов, в общем случае называемых здесь магнитными частицами, стали поступать в продажу для визуализации желудочнокишечного тракта, например, продукт ΛΒΟΟ80ΛΝ компании Ыусотей 1шадщд. Однако предложено также для широкого применения парентеральное введение таких дисперсных агентов для визуализации печени и селезенки, поскольку эти органы относительно быстро обеспечивают удаление из крови инородной дисперсной материи. Так, например, визуализация печени и селезенки с использованием таких агентов была предложена ^1ййег в патенте И8А-4859210.

Недавно было установлено, например Р11дптш в патенте И8-А-5160725 и νΟ-94/21240, что захват парентерально введенных магнитных частиц из крови в ретикуло-эндотелиальную систему можно замедлить, и, таким образом, время пребывания в крови можно продлить за счет химического связывания субстанции стабилизатора с поверхностью магнитных частиц.

Примеры материалов, которые можно использовать по этому способу в качестве стабилизаторов, включают в себя углеводы, такие как олиго- и полисахариды, а также полиаминокислоты, олиго- и полинуклеотиды, и полиалкиленоксиды (включая полоксамеры и полоксамины), и другие материалы, предложенные Рйдпт в патенте И8-А-5160725 и νΟ-94/21240, Ыусотей в заявке РСТ/СВ 94/02097, Вгассо в патенте И8-А-5464696 и 111ит в патенте И8-А4904479.

Магнитные частицы, покрытые согласно этой модели, можно затем использовать в качестве агентов депо крови (т.е. для визуализации сосудистой сети) или для визуализации лимфатических узлов, либо альтернативно они могут быть конъюгированы с агентами биоконъюгирования, способствующими направленному доступу, и использованы для визуализации тканей-мишеней или органов-мишеней.

При введении магнитных частиц в качестве агентов депо крови было установлено, что частичное снижение Т1 протонов крови может быть больше, чем частичное снижение Т₂ (или Т₂*), поэтому такие агенты можно использовать в качестве позитивных МР агентов для сосудистой сети.

Для парентерального применения размер и распределение размеров частиц композита, а также химическая природа поверхности всей частицы имеют большое значение для определения эффективности получения контрастности, периода полураспада в крови и биораспределения и биораспада контрастного агента. В идеальном случае размер магнитной частицы (т.е. размер кристалла магнитного материала) находится в пределах размера одного домена (чтобы частицы были суперпарамагнитными и, таким образом, не имели бы гистерезиса и обладали пониженной тенденцией к образованию агрегатов), а общее распределение размера частиц имеет узкие пределы, чтобы частицы имели однородное биораспределение, биоэлиминацию и контрастные эффекты. Предпочтительно, чтобы поверхность магнитных частиц была покрыта материалом, который модифицирует биораспределение частиц, например, путем продления периода полураспада в крови или увеличения стабильности, или который действует как вектор конъюгирования, обеспечивающий предпочтительное распределение на сайте-мишени, таком как сайт опухоли.

Средние размеры кристаллов, т.е. материала магнитных ядер, в общем случае должны находиться в диапазоне от 1 до 50 нм, предпочтительно от 1 до 20 нм и особенно предпочтительно от 2 до 15 нм, а для использования в качестве агентов депо крови средний общий размер частиц, включая любой материал покрытия, должен быть предпочтительно менее 30 нм. (Размер частиц можно определять с помощью электронной микроскопии). Само по себе получение супермагнитных кристаллов или композитных частиц, имеющих такие размеры, не является особенно проблематичным. Однако получение частиц желаемого размера, с приемлемым распределением размеров и без повышенной агрегации кристаллов действительно представляет собой проблему, и решение этой проблемы является одной из задач настоящего изобретения.

Обычно магнитные кристаллы получают путем осаждения из жидкой фазы, как правило, в растворе агента полимерного покрытия (например, используя способ совместного осаждения, описанный Мо1бау в патенте И8-А4452773). Этот способ обеспечивает получение относительно полидисперсных частиц, которые требуют последующего фракционирования по размерам, например, путем центрифугирования или хроматографии. В качестве примера можно привести продукт АМ1 227 производства компании Абуапсеб Мадпебск, который получают таким способом.

Нами установлено, что магнитные частицы с особенно предпочтительными свойствами можно получать путем осаждения в разветвленном полимере, содержащем водную среду, с последующим расщеплением полимера для вы свобождения композитных частиц, содержащих магнитные частицы и расщепленное полимерное покрытие.

Сущность изобретения

Таким образом, одной из задач изобретения является способ получения композитных магнитных частиц, при котором формируют магнитные частицы, предпочтительно суперпарамагнитные частицы, внутри гидрофильного разветвленного органического полимера, содержащего водную среду; и расщепляют указанный полимер для высвобождения указанных композитных частиц, причем большинство из них содержит одну магнитную частицу.

Краткое описание фигур

На фиг. 1 , 2 и 3 показаны снимки изображения внутренних органов кролика в условиях пред- и постконтрастного МР, взвешенного по Т₁, после введения контрастного вещества по изобретению.

Подробное описание изобретения

Гидрофильный разветвленный органический полимер, используемый в способе по изобретению, может быть природным, синтетическим или полусинтетическим разветвленным полимером и может быть, при желании, получен путем прививки или поперечного связывания линейного гидрофильного полимера.

Если разветвленный гидрофильный органический полимер представляет собой экстенсивно поперечно-связанный полимер, расщепление данного полимера способом по изобретению приведет к разрушению поперечносвязанной полимерной матрицы. Поэтому предпочтительно, чтобы поперечные связи были чувствительными к химическому или биохимическому расщеплению в условиях, которые не вызывают значительного разрушения магнитных частиц. Полимеры со сложноэфирными поперечными связями, образующие гидрогели, (например образованные поперечным связыванием полимеров, несущих гидроксигруппу, такие как линейные углеводы (например, декстран) или поливиниловый спирт) являются, таким образом, особенно подходящими кандидатами для таких поперечно-связанных полимеров. При необходимости, полимеры могут быть соответствующим образом замещены, чтобы обеспечить контроль над скоростью расщепления сложного эфира. Расщепление эфира в данном случае может быть осуществлено обработкой основанием, например аммиаком или гидроксидом щелочного металла.

В способе по изобретению гидрофильный разветвленный полимер особенно предпочтительно является природным, синтетическим или полусинтетическим углеводом, в частности, материалом, способным к образованию водного геля, и более предпочтительно полисахаридным материалом, например гликогеном, и еще более предпочтительно крахмалом. При желании, в способе по изобретению можно использовать смесь гидрофильных полимеров, по меньшей мере, один из которых является разветвленным. Если в качестве полимера используют крахмал, то он может быть природным крахмалом или, альтернативно, предварительно обработанным крахмалом, например обработанным кислотой, обработанным ферментом, или солюбилизированным крахмалом. Природные крахмалы, особенно растительные крахмалы, такие как кукурузный, картофельный, рисовый или пшеничный крахмал, являются особенно предпочтительными.

Природные крахмалы в общем случае представляют собой сочетание полисахаридов линейной амилозы и разветвленного амилопектина. Для практики изобретения, хотя содержание амилозы является приемлемым, однако, предпочтительно оно не должно быть слишком высоким, чтобы не вызывать регрессию, в значительной степени необратимого перехода из дисперсного состояния в практически нерастворимое микрокристаллическое состояние. По этой причине применение картофельного крахмала, богатого амилопектином, является предпочтительным по сравнению с маисовым или пшеничным крахмалом.

В случае, когда используемый полимерный материал по изобретению является материалом, на который воздействуют растворением в водной среде и тепловой обработкой, например материал, такой как крахмал, который из гранулярного состояния вначале набухает и частично растворяется, режим термообработки реакционной среды может влиять на свойства конечного продукта. В таких случаях предпочтительным может быть режим термообработки, который позволяет более эффективно контролировать вязкость и структуру среды. Так, для крахмала особенно предпочтительным является, если получают реакционную среду, охлаждают ее, а затем снова нагревают, например путем образования водной дисперсии при 60-95°С, охлаждения до температуры между 5 и 80°С (например от 5 до 60°С) и повторного нагревания до температуры от 45 до 85°С (например от 45 до 80°С). При этом можно обеспечить предпочтительную структуру для среды осаждения.

Считается, что разветвленный гидрофильный органический полимер образует затравочные центры дисперсного осаждения в водной среде, обеспечивая образование мелких однородных частиц осадка. Применение неразветвленных гидрофильных полимеров, таких как желатин или декстран, или неорганических гелей, таких как силикагель, является неэффективным.

Гидрофильный разветвленный полимер предпочтительно присутствует в концентрации, достаточной, чтобы обеспечить гелевую форму среды осаждения при температуре окружающей среды или близкой к ней, например от 0 до

60°С. Приемлемым также будет использовать концентрацию, которая обеспечивает получение геля при температурах вплоть до 80°С. Для крахмалов предпочтительными являются концентрации от 1 до 200 г/л, особенно от 2 до 150 г/л, в особенности от 20 до 100 г/л, и более конкретно от 40 до 90 г/л.

Поскольку среда осаждения является водной, она может содержать также смеси воды и сорастворителей, таких как смешивающиеся с водой спирты, простые эфиры или кетоны.

Как указано выше, особенно предпочтительно, чтобы среда осаждения, используемая согласно изобретению, была в коллоидном состоянии, называемом гелем. В такой среде материал, формируемый полимерным гелем, образует систему, проницаемую для водной дисперсионной среды. Такой гель обычно будет более вязким, чем одна водная дисперсионная среда, однако, для целей изобретения нет необходимости, чтобы гель был настолько вязким, чтобы находиться в твердом или полужидком самоподдерживающемся состоянии. В действительности структура геля может даже быть настолько слабой, что среда осаждения может оказаться просто свободно текущим раствором. Однако в этом случае гелевую природу среды можно легко проверить по ее тиксотропным свойствам, а именно, при перемешивании вязкость среды уменьшается.

Несмотря на то, что среда осаждения должна содержать разветвленный полимер, как упомянуто выше, она может содержать другие гелеобразующие полимеры, которые могут, например, быть линейными. Примеры полимеров, подходящих для использования в этом качестве, включают в себя белки, полисахариды, протеогликаны и гелеобразующие поверхностноактивные вещества, например блок-сополимерные поверхностно-активные вещества серий Р1итошс и Те1тои1с, такие как Е-127, Е-108 и Е68. Эти поверхностно-активные вещества образуют гели в водной среде при повышенных температурах и уровнях рН, пригодных в способе по настоящему изобретению. Таким образом, среду осаждения в форме геля можно получить, например, с использованием водной дисперсии гелеобразующего поверхностно-активного вещества на основе линейного блок-сополимера и разветвленного органического полимера, такого как амилопектин.

Однако матрица геля среды осаждения должна быть такой, чтобы было возможным химическое (или биохимическое) расщепление, по меньшей мере, одного из полимерных компонентов, предпочтительно, по меньшей мере, разветвленного полимера, чтобы высвободить магнитные частицы. По этой причине применение тяжелых поперечно-связанных полимеров является нежелательным.

Осаждение частиц может происходить под воздействием водной среды в форме твердого или полужидкого геля, например при проникании в гель основания, однако, наиболее предпочтительно осаждение проводят в нагреваемой, перемешиваемой (например, с помощью мешалки) водной среде, которая может проявлять или не проявлять заметного увеличения вязкости по отношению к воде. Особенно предпочтительно осаждение проводят при температуре в диапазоне от 40 до 95°С и при спокойном перемешивании.

За счет изменения тиксотропных свойств водной среды осаждения можно получить композитные частицы по изобретению, имеющие определенный диапазон размеров.

Предполагается, что образование магнитных частиц способом по изобретению может происходить в две стадии с образованием доменов аморфного материала, а затем трансформацией в магнитные частицы, например при повышенной температуре, например от 40 до 95°С, предпочтительно от 50 до 93°С. Таким образом установлено, что развитие магнитных свойств частиц можно контролировать в течение периода времени от нескольких минут до нескольких часов, например, вплоть до 3 ч. Однако, как показывает практика, развитие магнитных свойств практически завершается в течение двух часов, а значительное намагничивание происходит в течение двадцати минут.

Магнитные частицы, которые образуются в водной среде, могут представлять собой любой осаждаемый магнитный оксид или оксид гидроксид металла, включая смешанные металлические соединения, например соединения, описанные в патентах и заявках И8-А-4827945 (Оготаи), ЕР-А-525189 (Мейо 8апдуо), ЕР-А580878 (ВА8Е) и РСТ/ОВ 94/02097 (Ыуеотеб) или РПдптт (см. выше). В этой связи можно особенно отметить магнитные соединения оксида железа формулы (М^пО)_п(М^Ш2Оз) где М^п и М^ш представляют собой переходные металлы или лантаниды с валентностью II или III, по меньшей мере, один из которых является Ее, а п равно нулю или положительному числу, или более конкретно формулы (М^ПО)пРе2Оз(М^Ш2Оз)т где М^п представляет собой двухвалентный металл, такой как Ее, Мд, Ве, Мп, Ζη, Со, Ва, 8г и Си, М^ш представляет собой трехвалентный металл, такой как А1, Уй, Υ, Мп, Сг или лантанид, а п и т каждый равен нулю или положительному числу.

Магнитные частицы предпочтительно являются оксидами железа формулы (ЕеО)пЕе2О3, где п находится в интервале от 0 до 1 , типичными примерами которых являются магхемит (γЕе2О3) и магнетит (Ее3О4), или смесями таких магнитных оксидов железа.

Широкий спектр солей железа можно ист- III пользовать в качестве источника ионов Ее и Ее^п, например, ЕеС1₂, ЕеС1₃, Ее^ш цитрат, Ее^п глюконат, Ее8О₄, Ее₂(8О₄)₃, Ее^п оксалат, Ее(ЫО₃)₃, Ее^п ацетилацетонат, Ее^п этилдиаммонийсульфат, Ее^п фумарат, Ее^ш пирофосфат, амоний Ее^п цитрат, аммоний Ее^п сульфат, аммоний Ее^ш сульфат, аммоний Ее^ш оксалат. Соотношение ионов Ее и Ее предпочтительно должно быть в интервале от 1:5 до 5:1.

Осаждение инициируют установлением рН водной среды выше порогового значения инициирования осаждения, обычно посредством добавления основания, предпочтительно водного основания, такого как гидроксид щелочного металла (например гидроксид натрия, гидроксид калия или гидроксид лития), или гидрокисда аммония, особенно предпочтительно концентрированного гидроксида аммония. Добавляемое основание должно иметь рКй, достаточное для доведения рН водной среды выше порогового значения инициирования осаждения, например выше 1 0.

Основание предпочтительно добавляют в водную среду, которая содержит ионы металла и полимер. Альтернативно, можно объединить основание и полимер, а затем добавить ионы металла. Эти добавления можно приемлемым образом осуществлять путем смешивания водных растворов компонентов при повышенной температуре, например от 40 до 95°С, предпочтительно от 50 до 60°С, при перемешивании.

Предполагается, что при последующем инициировании осаждения образуются затравочные кристаллы магнитных частиц внутри аморфных парамагнитных доменов ионов металлов или гидроксидов металлов, разграниченных разветвленным полимером, и что эти аморфные домены трансформируются в окончательно сформировавшиеся частицы. Таким образом, образование частиц может происходить в течение выбранного периода времени от нескольких минут до нескольких дней, например от 1 мин до 24 ч, предпочтительно от 20 мин до 1 0 ч, особенно от 1 до 5 ч.

Если образование частиц осуществляют при температуре, близкой к верхней границе указанного диапазона, т.е. 90°С, среду предпочтительно выдерживают при этой повышенной температуре в течение только относительно короткого периода времени, например до 2 ч.

Если основание, осаждаемые ионы металла и полимер объединяют при более низкой температуре, а затем среду нагревают до более высокой температуры, чтобы обеспечить получение магнитных частиц, то скорость повышения температуры необходимо тщательно контролировать, например при 10-100°С/ч. Таким образом, во время образования частиц температуру водной среды предпочтительно повышают контролируемым образом (например подъемом температуры, который находится практически в линейной зависимости от времени), например повышая ее от температуры смешивания 55°С до окончательной температуры 90°С в течение двух часов.

По окончании периода формирования частиц особенно предпочтительно нейтрализовать реакционную среду, доводя ее рН например до 6,0-8,5. Это можно сделать, например, путем охлаждения среды с получением вязкого геля, который может быть промыт до нейтральной реакции путем нейтрализации среды кислотой (примеры приемлемых кислот включают в себя, например, соляную, серную и азотную кислоты) или твердой двуокисью углерода, или путем удаления с помощью вакуума основания, если оно имеет высокое давление пара (например, если оно является гидроксидом аммония). Нейтрализованную среду можно затем сразу обрабатывать.

На этой стадии нейтрализации промывка является особенно эффективной, если среде дать возможность образовать вязкий гель, она и служит для удаления избытка солей металлов и основания. Промывку можно приемлемым образом осуществлять деионизованной водой, предпочтительно предварительно охлажденной до температуры от 3 до 15°С, и предпочтительно продолжать до тех пор, пока рН не станет приблизительно нейтральным.

Несмотря на то, что промытый гель можно просто обработать ультразвуком, чтобы разрушить матрицу геля без расщепления полимера, в то же время высвобождая магнитные частицы, покрытые полимером, было установлено, что дисперсный продукт имеет особенно благоприятные свойства, если, чтобы высвободить покрытые частицы, полимер расщепляют, например, путем разрушения молекулярной структуры полимера. Химическое разрушение можно осуществлять с использованием активных химических агентов, таких как окислители или основания, но можно также осуществлять с использованием биохимических агентов, таких как ферменты. Для углеводных полимеров, таких как крахмал, приемлемо расщеплять полимер ферментативно с использованием фермента, такого как амилаза, например α-амилаза. Однако особенно предпочтительно осуществлять расщепление полимера с использованием окислителя. Предпочтительными являются окислители, которые на уровне следовых количеств биологически толерантны или продукты восстановления которых подобным образом биологически толерантны, такие как галогеноксианионы, например гипохлориты щелочных металлов (такие как гипохлорит натрия и гипохлорит кальция), периодаты (периодат натрия), перманганаты (такие как КМпО₄), пероксиды (такие как Н₂О₂) и ферментативные окислители. Любой избыток используемого оксиданта затем предпочтительно дезактивируют, например, путем добавления мочевины, если в качестве окислителя используют гипохлорит. Когда расщепление полимера осуществляют с использо ванием окислителя, высвобождаемые при этом магнитные частицы имеют отрицательный поверхностный заряд, и агломерация частиц в дальнейшем снижается.

Химические агенты, используемые для расщепления полимера, не должны вызывать эрозию магнитных частиц или потерю ими магнитных свойств. В этой связи применение кислотных агентов обычно является нежелательным.

Степень расщепления полимера можно варьировать по желанию, чтобы оставлять большее или меньшее количество полимера в качестве покрытия на частицах. Следует также отметить, что наличие покрытия обычно является желательным и что в результате общий размер композитных частиц оказывается большим, чем размер ядер магнитных частиц. В соответствии с выбранной технологией расщепления остаточное покрытие частиц может быть полимерным, олигомерным или даже мономерным.

После расщепления полимера продукт предпочтительно промывают от примесей, используя технологию мембранной фильтрации, например ультрафильтрацию или диафильтрацию.

Полученный общий размер частиц обычно находится в пределах от 1 до 300 нм, предпочтительно от 4 до 30 нм и особенно предпочтительно от 8 до 20 нм. В этой связи следует отметить, что предпочтительное расщепление полимера оксидантом имеет тенденцию давать частицы с меньшим общим размером частиц, чем методика ферментативного расщепления, и что оба указанных выше процесса дают меньшие размеры, чем простая ультразвуковая обработка матрицы геля.

В предпочтительном варианте реализации изобретения композитные частицы могут быть получены в одном реакторе, что снижает общее время реакции, исключает переработку и перегрузку промежуточных соединений и сокращает тепловую нагрузку на магнитные ядерные частицы. В этом варианте реализации изобретения соли трех- и двухвалентного железа (например, хлориды) растворяют в растворе крахмал-вода и осаждают частицы оксида железа путем добавления основания (например, водного аммиака). Реакцию проводят в течение от 1 до 3 ч при температуре 70-90°С, после чего снижают количество избыточного основания (например, путем создания вакуума и/или пропускания азота через горячую реакционную смесь, если использовали аммиак). Затем рН снижают до значения ниже 8,2 или до точки, в которой реакционная смесь теряет свою буферную емкость. После этого добавляют окислитель (например, гипохлорит натрия), пока смесь еще горячая (например, 70-90°С), и проводят окисление при 7090°С до тех пор, пока приемлемый размер композитной частицы не будет достигнут. Для получения размера композитной частицы в интер вале от 10 до 20 нм время реакции будет составлять примерно от 30 до 120 мин. Желательно, чтобы при 0,47 Тесла и 40°С момент магнитного насыщения превышал 50 электромагнитных единиц/г ЕеО_х, η было более чем 15 мМ^-1с^-1, а г₂/г₁ менее чем 2,3. Затем реакционную смесь гасят мочевиной и фильтруют, например, через фильтры 0,2 мкм. Остатки крахмала можно удалить диафильтрацией, например, с использованием ИЕ мембраны с отсеканием молекулярной массы от 20 до 200 кД.

Ядерные магнитные частицы предпочтительно имеют размерную характеристику частиц одного домена, например размер частиц от 1 до 50 нм, особенно от 1 до 20 нм, в особенности от 2 до 1 5 нм и наиболее предпочтительно от 4 до 12 нм. В действительности, в композитных частицах, полученных способом по изобретению, ядерные кристаллы обычно практически одноразмерны, причем часто находятся в интервале от 4 до 1 2 нм.

Способ по изобретению можно использовать для получения композитных частиц (т.е. магнитных частиц, покрытых расщепленным полимером), имеющих достаточно узкое распределение размеров, чтобы исключить необходимость последующего фракционирования, например, по меньшей мере, 90% частиц имеют размеры в пределах 1 0 нм, предпочтительно в пределах 5 нм и особенно предпочтительно в пределах 2 нм, как измерено по яркости среднего размера частиц способом фотонной корреляционной спектроскопии. Однако частицы обычно будут фильтровать через фильтр относительно большого диаметра, например через фильтр от 0,1 до 0,2 мкм, чтобы удалить возможные случайно появившиеся большие фрагменты полимера или любые биологические или дисперсные примеси. (Размер частиц можно определить с помощью электронной микроскопии).

Композитные частицы, полученные способом по изобретению, сами по себе являются новыми и представляют собой следующую задачу изобретения. С точки зрения этой задачи согласно изобретению предложены композитные частицы, предпочтительно заряженные частицы, имеющие средний общий размер от 4 до 30 нм и содержащие суперпарамагнитные неорганические ядерные частицы с материалом покрытия из расщепленного гидрофильного полимера, предпочтительно из окисленного углеводного материала, особенно из расщепленного крахмала. Основная часть композитных частиц предпочтительно содержит один суперпарамагнитный ядерный кристалл.

С точки зрения другой задачи согласно изобретению предложена композиция контрастного вещества, содержащая эффективное для обеспечения контрастности количество композитных частиц, содержащих ядерные кристаллы из суперпарамагнитного оксида металла и органическое покрытие, причем указанные кристал лические ядра имеют средний диаметр от 2 до 10 нм, предпочтительно от 4 до 8 нм, указанные частицы имеют средний диаметр до 30 нм, предпочтительно до 1 5 нм, а указанное покрытие содержит расщепленный окислением крахмал, предпочтительно вместе с функционализированным полиалкиленоксидом, например полиэтиленгликолем с концевым оксидом фосфора, таким как метокси-ПЭГ-фосфат.

Способ по изобретению может быть осуществлен в две отдельные стадии, причем сначала получают композитные частицы, например путем традиционной технологии соосаждения, которую используют для получения магнитных крахмальных микросфер (МКМ) (см., например, 8сйп6ег, ^0-89/03675), и последующего расщепления полимера с получением композитных частиц по изобретению. Композитные частицы, обработанные таким образом, могут содержать множество магнитных кристаллов в каждой композитной частице, в то время как стадия расщепления полимера обычно служит для высвобождения покрытых монокристаллов. Такой способ является еще одной задачей изобретения.

Для некоторых применений может оказаться желательным удалить практически все покрытие из расщепленного полимера с магнитных частиц и, возможно, заменить его другим агентом, модифицирующим поверхность. В этом случае можно использовать окисляющий агент (предпочтительно неионный окисляющий агент, такой как перекись водорода) или фермент, способный переваривать расщепленный полимер (например, амилазу). Применение ионных окисляющих агентов менее предпочтительно, т. к. они снижают электростатическую стабилизацию и могут способствовать агрегации магнитных частиц, когда стерически стабилизирующее покрытие из расщепленного полимера удалено. Перед тем, как расщепленный полимер будет удален, желательно добавить стабилизирующий агент, например электростатический стабилизирующий агент, такой как дифосфат натрия или трифосфат натрия, который связывается с магнитными частицами и придает суспензии электростатическую стабильность. рН желательно поддерживать нейтральным или слабо щелочным (например, добавлением гидроксида натрия), поскольку кислотное значение рН может вызывать флоккуляцию за счет протонирования фосфатного стабилизирующего агента. Было установлено, что выдерживание в термостате магнитных частиц, покрытых расщепленным полимером, полученным из крахмала (произведенное способами, которые описаны в приведенных ниже примерах), с дифосфатом натрия и перекисью водорода при 5060°С в течение от 3 до 24 ч является достаточной, чтобы практически полностью удалить остатки покрытия из расщепленных полимеров, полученных их крахмала. Полученные частицы имели средний размер около 9 нм и были стабильными в суспензии при температуре окружающей среды и в условиях паровой стерилизации.

Такие стабильные суспензии таких электростатически стабилизированных магнитных частиц являются новыми и представляют собой еще одну задачу изобретения. С точки зрения этой задачи согласно изобретению предложена водная суспензия частиц с суперпарамагнитным неорганическим ядром, имеющих средний общий размер от 4 до 30 нм, причем указанные частицы практически свободны от материала органического покрытия и несут на себе связанный с поверхностью неорганический электростатический стабилизирующий агент.

После расщепления полимера и любой желательной промывки и фильтрации высвободившихся частиц, на частицы предпочтительно наносят покрытие из второго материала, например для улучшения биотолерантности за счет снижения эффектов активации комплемента, для увеличения времени пребывания в депо крови, для придания способности целенаправленной доставки в ткани, для повышения собственной стабильности или для улучшения обработки в автоклаве.

Альтернативно, материал второго покрытия может быть введен на более ранней стадии, например, перед формированием магнитных частиц или после формирования магнитных частиц и перед расщеплением полимера.

Особенно предпочтительным материалом для второго покрытия является покрытие из природного или синтетического полисахарида структурного типа, синтетической полиаминокислоты или физиологически приемлемого синтетического полимера, как описано в РСТ/ОВ 94/02097, или из вещества-стабилизатора, описанного Р11§г1тш или 111ит (см. выше). Особенно предпочтительным материалом второго покрытия является полиалкиленоксид (например, полоксамер, полоксамин, полиэтиленгликоль и т.п.) или гепариноид и в особенности предпочтительно такой материал, который несет функциональную группу, например функциональную группу оксикислоты (например, оксикислоту серы, углерода или фосфора), которая обеспечивает химическое связывание или абсорбцию материала покрытия с композитными частицами и особенно магнитными ядерными частицами. В этой связи следует упомянуть метокси-ПЭГфосфат (МПФ) и другие полиалкиленоксидные материалы, описанные Рйдптт в патенте И8А-5160725 и ШО-94/21240. Полезные качества МПФ можно также реализовать с использованием гидрофильных полимеров с концевыми функциональными группами, содержащими сидерофилы, отличные от фосфатных групп МПФ. Одной из таких групп является салицилат. ПЭГ может быть функционализирован этой группой конъюгацией с 4-аминосалициловой кислотой или 5-аминосалициловой кислотой, обе из которых являются практически безвредными и имеют длительную историю биологического применения.

Другим подходящим агентом второго покрытия является 3-гидрокси-4-пиридинон, несущий гидрофильный полимер, такой как ПЭГ, на пиридиновом азоте. Его простые аналоги, такие как 1 ,2-диметил-3-гидрокси-4-пиридинон, использовали в клинических условиях для выведения из организма человека избыточного железа, например у людей, получивших при переливании крови избыток красных кровяных телец. Эти разновидности имеют самые большие из известных константы связывания по отношению к Ее III, а именно: 1од-бета (3) порядка 35. Есть несколько синтетических путей, которые можно применять в данном случае. Полимер (ПЭГ) можно присоединить путем алкилирования азота 2-метил-3,4-дигидроксипиридина. ПЭГ можно присоединить также путем алкилирования 2-метил-3-гидроксипиридина с последующим окислением полученного продукта по положению 4. ПЭГ можно присоединить также в результате реакции между ПЭГ, который несет первичную аминогруппу, с 3-гидрокси-2метил-4-пироном, замещая кислородный атом в кольце азотом и образуя желаемый 3-гидрокси4-пиридионон в одну стадию.

-ПЭГ-2-метил-3-гидрокси-4-пиридинон

Другие варианты присоединения полимеров ПЭГ к поверхности оксида железа включают в себя присоединение их к одной из больших групп бактериальных сидерофоров, например ферродоксина/ферриоксамина. Ферриоксамин имеет концевую функциональную аминогруппу, которую можно использовать для присоединения подходящего производного ПЭГ путем ацилирования или алкилирования.

Еще один вариант присоединения материала второго покрытия к поверхности оксида заключается в использовании олигомеров или полимеров железосвязывающих групп, например фосфатов, таких как дифосфатные, трифосфатные и более полимеры, скорее, чем монофосфата МПФ. Такие олиго- и полифосфаты очень прочно связываются с частицам оксида железа, вероятно благодаря наличию множества сайтов связывания, при этом реакция конъюгирования проста и легка для осуществления. Так, например, вместо метокси-ПЭГ-фосфата, указанного здесь, например, в приведенных ниже примерах, можно использовать метокси-ПЭГдифосфат или метокси-ПЭГ-трифосфат. Олигои полифосфаты, сульфаты и сульфонаты также можно использовать для конъюгирования других векторных или репортерных групп (как рассмотрено ниже) с магнитными частицами.

В качестве альтернативы использованию различных фосфатных связывающих групп, описанных выше, для связывания материала второго покрытия или других векторных и репортерных групп с поверхностью оксида можно вместо фосфонатных связывающих групп использовать, например, метокси-ПЭГ-фосфонат. Это открывает множество потенциальных преимуществ, в частности, повышение гидролитической стабильности благодаря замещению связи Р-О-С в МПФ на связь Р-С, потенциально более сильное связывание с поверхностью оксида и повышение химической стабильности, что обеспечивает большую свободу для получения гетеробифункциональных ПЭГ-фосфонатов, полезных в качестве линкеров при получении магнитных конъюгатов типа кристалл-линкервектор/репортер.

Так, например, гетеробифункциональные линкеры, такие как

50Ν

Н₂О₃Р- (СН₂СН₂О) _ПСН₂СН₂

(А) (Б)

(Д) можно легко использовать для присоединения магнитных частиц к белкам, фрагментам белков, олигопептидам и другим пептидным векторам. Так, линкеры формул от А до Д могут быть присоединены к таким пептидным соединениям с реактивными тиол или аминогруппами, а затем присоединены к магнитным частицам через фосфонатные группы.

Другие пригодные связывающие группы для присоединения ПЭГ или других векторных/репортерных групп к магнитным частицам включают в себя другие группы с высоким сродством связи для ионов железа, например группы гидроксамат, катехин, аскорбат и деферриоксамин.

Как было установлено, молекулярная масса материала второго покрытия не является особенно критичной и приемлемо может находиться в интервале от 0,1 до 1000 кД, однако, материалы с молекулярной массой от 0,3 до 20 кД, особенно от 0,5 до 10 кД и наиболее оптимально от 1 до 5 кД являются предпочтительными, например полиалкиленоксидные материалы с молекулярной массой, по меньшей мере, 60 алкиленоксидных звеньев.

Массовое отношение материала второго покрытия к неорганическим ядерным частицам предпочтительно составляет от 0,02 до 25 г/г, особенно от 0,4 до 10 г/г и в частности от 0,5 до 8 г/г.

Особым достоинством композитных частиц с двойным покрытием, полученных способом по изобретению, является возможность их стерилизации в автоклаве (например при 121°С в течение 15 мин) без недопустимого нарушения размера частиц или распределения размеров. Это имеет особенное значение, поскольку позволяет проводить все предшествующие стадии не в асептических условиях, что значительно повышает экономичность производства.

Кроме нанесения покрытия вторым материалом композитные частицы, полученные по изобретению, можно модифицировать иным образом. В частности, частицы можно обработать функциональным агентом, чтобы конъюгировать или сочетать остаточное углеводное покрытие, и с использованием традиционной химической технологии присоединить к материалу одного из покрытий группировки биоконъюгирования для направленной доставки (такие как антитела, фрагменты антител, пептиды или биомолекулы, такие как инсулин), или репортерные группы (например, группы, обнаруживаемые при диагностической визуализации, такой как рентгеновская, МР, ультразвуковая, световая и т.п.). Другие подходящие векторы конъюгирования или иммунореактивные группы описаны, например, в ^0-93/21957.

В типичном случае конъюгаты между магнитными частицами и такими биоконъюгирующими (векторными) или репортерными группами можно представить формулой

МР-Х-Ь-У где МР представляет собой магнитную частицу (возможно с удаленным покрытием из расщепленного полимера, как описано выше); Х представляет собой группу (фрагмент), способную связываться с поверхностью частицы (например, фосфат, олиго- или полифосфат, фосфонат, гидроксамат или другой сидерофил, как описано выше); к представляет собой связь или более предпочтительно линкерную группу (предпочтительно органическую цепь с молекулярной массой от 1 000 до 1 0⁶ Д, например группу ПЭГ с молекулярной массой от 2 до 50 кД), связывающую, по меньшей мере, одну группу Х с, по меньшей мере, одной группой V; и V представляет собой векторную или репортерную группу, т.е. группу, которая модифицирует биораспределение магнитных частиц (например, чтобы получить предпочтительное накопление в выбранных органах, тканях или на больных участках) или которую можно обнаружить способом диагностической визуализации (например, хелатный ион тяжелого металла, кластер атомов тяжелого металла, ион парамагнитного металла или радионуклид металла, газовый микропузы рек или генератор микропузырьков, неметаллический радионуклид, атом неметалла с ненулевым спином ядра (например, атом Г), кроме водорода, атом тяжелого неметалла (например, I), хромофор, флуорофор, лекарственное средство и т. п.).

Таким путем широкий круг векторов или репортеров можно конъюгировать с магнитными частицами. Примеры векторов конъюгирования включают в себя ПЭГ (который способствует увеличению времени пребывания в крови); ΐ-РА, стрептокиназу и урокиназу либо как целые белки, либо как отдельные фрагменты, содержащих связывающие домены; пептиды, содержащие КОИ и аналогичные элементы связывания рецепторов тромбоцитов; и пептиды, связывающие атеросклеротические бляшки (например, фрагмент 8Р-4 аполипипопротеина В). ΐ-РА поставляется компанией Оепе1есЕ. Пептиды КОИ описаны в ряде патентных публикаций, например И8-А-4589881, ϋ8-Α-4661ίίί, И8-А4614517 и ϋ8-Α-5041380. Одним из примеров пептида КОИ, который можно использовать, является О1у-Аг§-О1у-Азр-8ег-Рго-А1а-8ег-8егА1а-Туг-О1у-О1у-О1у-8ег-А1а-Еу8-Еу8-СОМН2, который конъюгируется через концевую группу Ьу8-Ьу8-СОЫН₂. Его можно получить по технологии стандартного синтеза олигопептидов, например, твердофазного синтеза пептидов. 8Р-4 в форме (Туг)-Агд-А1а-Ееи-У аЕАзр-Тйг-Ееи-ЕузРЕе^а1-Тйг-О1п-А1а-О1и-О1у-А1а-Еу8-СОМН₂ (где (Туг) добавляют, чтобы была возможность для радиоактивного мечения иодом) можно использовать при конъюгации через концевую группу Еу8-СОМН₂. Его также можно получить по стандартной технологии.

Если V является хелатированным металлом, линкер будет содержать соответствующую хелатирующую группировку, например, ИТР А, ЕИТА, ТМТ, ИО3А и т.п. остатки. Такие группы хорошо известны в области контрастных агентов для диагностической визуализации и могут быть конъюгированы либо через функциональную группу, присоединенную к основной цепи (например, СН₂О8СМ), либо через одну из групп, координирующих металл (например, СН2СООН).

Ион металла выбирают в зависимости от способа визуализации, например, Υ⁹⁰, хелатированный ТМТ, для сцинтиграфии, или европий, хелатированный ТМТ, для флуоресцентной визуализации.

Для рентгеновской визуализации приемлемо использовать иодинированный органофосфат (либо фосфонат, либо олиго- или полифосфат), поскольку такие соединения будут одновременно стабилизировать магнитные частицы и действовать как рентгеноконтрастные агенты (посредством увеличения непроницаемости частиц для излучения). Примеры подходящих иодинированных органофосфатов включают в себя

где К¹ и К² представляют собой возможно, но предпочтительно гидроксилированные

С_1-6алкильные группы, а К³ представляет собой линкерную группу, например, обеспечивающую цепь из 1 -6 атомов углерода.

Особенно предпочтительно, чтобы соединение Х-Ь-ν обеспечивало формирование множества якорных сайтов для присоединения магнитных частиц. Таким образом, предпочтительные соединения Х-Ь-ν имеют формулу

или где Е₁ и Е₂ являются компонентами линкера Е, а р равно 2 или больше, например 2, 3, 4 или 5. Так, например, структуры на основе ПЭГ с от 1 до 4 якорных групп могут быть следующими:

У-(РЕО)-ОС-СН₂-М(СН₂Х)СН₂(СН₂Ы(СН₂Х)СН₂)_ГСО(РЕО)-У [Х(СН₂)з]- СН₂-У-(РЕС)-У ν-ΡΕΘ-ΟΟΝΗ(ΟΗ₂)₅Ν(ΟΗ)00(ΟΗ₂)₂ΟΟΝΗ(ΟΗ₂)₅Ν(ΟΗ)00(СН₂)₂ ΟΟΝΗ(ΟΗ₂)₂Ν(ΟΗ)ΟΟΟΗ₃ где г равно 1, 2 или 3;

равно от 1 до 6;

Υ представляет собой СОМН или МНСО;

(РЕО) представляет собой цепь полиэтиленгликоля; а

Х представляет собой СОМНОН, -СОМНбисгидроксифенил или -СО-О-бисгидроксифенил (с двумя гидроксильными группами на соседних атомах углерода).

Если репортер или вектор конъюгирован по такой модели, то его число на одну частицу и число на одну дозу следует однозначно выбирать таким, чтобы достаточно вектора присутствовало для эффективной направленной доставки частиц, и/или достаточно репортера присутствовало, чтобы частицы можно было обнаружить выбранным способом.

Таким образом, один из предпочтительных вариантов реализации способа по изобретению включает в себя последовательность следующих стадий:

(1 ) объединяют в нагретом водном растворе крахмал, соли двух- и трехвалентного железа и основание;

(2) возможно охлаждают указанный раствор до температуры от ниже 15°С до образования заструктурировавшегося геля;

(3) снижают рН до значения в интервале от 6,0 до 8,5, причем эту стадию возможно осуществляют перед стадией (2);

(4) обрабатывают окислителем, например, содержащим галогеноксианион, до расщепления крахмала и высвобождения указанных частиц;

(5) промывают и фильтруют высвобожденные частицы;

(6) возможно подвергают взаимодействию высвобожденные частицы с функционализированным производным полиалкиленоксида, чтобы связать указанное производное с указанными частицами; и (7) возможно стерилизуют в автоклаве высвобожденные частицы.

Стадию (3) можно осуществлять, например, путем удаления избытка воды и основания (например, гидроксида аммония) при пониженном давлении перед стадией (2) или путем добавления кислоты (например, НС1), чтобы отрегулировать избыток основания перед стадией (4).

Установлено, что композитные частицы, содержащие неорганические ядерные частицы с покрытием из расщепленного гидрофильного полимера и с гидрофильным полимером, продлевающим срок жизни в крови, связанным с поверхностью неорганических частиц, обладают в значительной степени повышенным сроком жизни в крови по сравнению с частицами, имеющими только одно из двух покрытий. Предполагают, что такое повышение является результатом влияния расщепленного полимера, который служит для защиты сайта на поверхности частицы для связывания полимера, продлевающего срок жизни в крови, и тем самым замедляет ίη νίνο отщепление продлевающего срок жизни в крови полимера от неорганической частицы. Такие частицы являются следующей задачей изобретения.

Для решения этой задачи согласно изобретению предложен композитный дисперсный агент для инъекций, содержащий ядро неорганических частиц (предпочтительно металлических или смешанных металлоксидных, особенно суперпарамагнитых частиц оксида железа), имеющий химически или физически (но предпочтительно химически) связанный с его поверхностью гидрофильный полимер, продлевающий срок жизни в крови (предпочтительно функционализированный полиалкиленоксид, такой как метокси-ПЭГ-фосфат, в особенности предпочтительно линейный полимер с концевой функциональной группой и предпочтительно полимер, имеющий молекулярную массу ниже пороговой для почек, например молекулярную массу от 0,2 до 30 кД, особенно от 1 до 10 кД), и который снабжен гидрофильным органическим полимерным покрытием, защищающим сайты связывания, например, из расщепленного разветвленного углевода, например из окисленного крахмала.

Такие частицы можно использовать в качестве агентов депо крови или, альтернативно, можно конъюгировать с вектором биоконъюгирования, как описано выше. Более того, данные частицы можно использовать в непрямой лимфографии, например, после внутривенной или подкожной инъекции. Несмотря на то, что неорганическое ядро этих частиц представляет собой предпочтительно суперпарамагнитный оксид железа, при желании можно использовать частицы других соединений металлов, например соединений, включающих радионуклид или другой терапевтически или диагностически эффективный металл.

Релаксация содержащих суперапармагнитные кристаллы частиц по изобретению зависит от размера и состава ядра и покрытой частицы (а также от температуры и величины прилагаемого магнитного поля). Релаксация Т₁ (г₁) может быть такой низкой как 5 и такой высокой как 200, в то время как релаксация Т₂ (г₂) может варьироваться между 5 и 500 при 0,5 Тл (релаксация дана как (мМРе)^-1(е)^-1). Сотношение г₂/г₁ может варьироваться от 1 до выше 1 00, например от 1 до 10, в частности от 1,2 до 3 при 0,47 Тл и 40°С. Небольшие монокристаллические частицы будут иметь соотношение г₂/г₁ в более низких пределах, в то время как крупные и поликристаллические частицы будут показывать более высокие соотношения. Если частицы демонстрируют суперапарамагнитное поведение, то намагничивание частиц в пределах от 0 до примерно 1 Тл будет зависеть от размера кристаллов, причем более крупные кристаллы имеют значительно более высокую намагниченность. При 1 Тл намагниченность составляет примерно 20-100, предпочтительно 30-90 электромагнитных единиц/г оксида железа.

Если суперпармагнитные частицы получают путем осаждения Ге и Ге основанием, то соотношение г₂/г₁ при 0,47 Тл и 40°С в общем случае будет менее 3. В результате, при Т₁взвешенной визуализации частицы, полученные по изобретению, являются эффективными в качестве позитивных контрастных агентов. Кроме того, кривые намагничивания для суспензий таких частиц показывают, что даже при такой высокой напряженности поля, как 4 Тл, частицы не намагничиваются полностью. Неполное намагничивание частиц при напряженности поля, обычно используемой в аппаратуре для МР визуализации, означает, что величина любых эффектов восприимчивости, которые могут иметь место в МР изображениях, снижается. Более того, релаксация частиц по изобретению не снижается так быстро с увеличением напряженности поля, как это происходит в случае обычных частиц оксида железа.

При традиционной МР визуализации в течение многих лет наблюдалась тенденция к использованию аппаратуры с высокой напряженностью поля, имеющей первичную напряжен ность магнитного поля от 1 до 1,5 Тл. Однако использование устройств с более низкими полями растет, и потребность в разработке позитивных МР контрастных агентов, которые можно применять при низкой напряженности поля некоторых коммерческих визуализаторах, например, от 0,1 до 0,3 Тл, существует. Эту потребность удовлетворяют частицы по изобретению, которые при такой напряженности поля являются, по меньшей мере, в три раза более эффективными, чем традиционные позитивные МР контрастные агенты на основе хелатов металлов, такие как Мадпеу151. Таким образом, с точки зрения следующей задачи согласно изобретению предложен способ магнитнорезонансной визуализации с повышенной контрастностью субъекта, при котором в указанный субъект вводят позитивный контрастный агент и получают изображение, по меньшей мере, части указанного субъекта с использованием установки для МР визуализации, отличающийся тем, что указанная установка имеет первичный магнит с напряженностью поля менее 0,3 Тл, указанный позитивный агент содержит магнитные частицы, имеющие физиологически переносимое углеводное покрытие, и указанные частицы не полностью намагничиваются при указанной напряженности поля (например, намагничиваются до 90% их максимально возможного намагничивания) и предпочтительно не полностью намагничиваются при напряженности поля до 2 Тл, особенно до 4 Тл.

С точки зрения следующей задачи согласно изобретению предложены диагностические композиции, содержащие частицы по изобретению или частицы, полученные согласно изобретению, вместе с, по меньшей мере, одним физиологически приемлемым носителем или эксципиентом, например водой для инъекций.

Композиции по изобретению могут существовать в любой стандартной фармацевтической форме, например в форме суспензии, эмульсии, порошка и т.п., и могут содержать водные разбавители (такие как вода для инъекций) и/или ингредиенты для регулирования осмоляльности, рН, вязкости и стабильности. В идеальном случае композиция находится в форме суспензии, причем суспензии, которая является изотонической и изогидрической по отношению к крови. Например, изотоническую суспензию можно приготовить путем добавления солей типа хлорида натрия, низкомолекулярных сахаров типа глюкозы (декстрозы), лактозы, мальтозы или маннита или растворимой фракции покрывающего агента или их смеси. Изогидричность может быть достигнута путем добавления кислот типа соляной кислоты или оснований типа гидроксида натрия, если требуется только незначительная корректировка рН. Можно также использовать буферы, такие как цитратные, ацетатные, боратные, тартратные, глюконатные, цвиттер-ионы и Тпк. Химическую стабильность суспензии частиц можно модифицировать путем добавления антиоксидантов типа аскорбиновой кислоты или пиросульфита натрия. Для улучшения физической стабильности препарата можно также добавлять эксципиенты. Наиболее часто используемые для парентеральных суспензий эксципиенты представляют собой поверхностно-активные агенты, такие как полисорбаты, лецитин или сорбитановые эфиры, модификаторы вязкости, такие как глицерин, пропиленгликоль и полиэтиленгликоли (макроголи), или агенты, изменяющие точку помутнения, предпочтительно неионные агенты. (Агенты, изменяющие точку помутнения, изменяют температуру, при которой составы с неионными поверхностно-активными веществами подвергаются фазовому разделению, которое может приводить к флоккуляции).

Композиции по изобретению преимущественно будут содержать магнитный оксид металла при диагностически эффективной концентрации металла, в общем от 0,1 до 250 мг Ре/мл, предпочтительно от 0,5 до 100 мг Ре/мл и особенно предпочтительно от 1 до 75 мг Ре/мл.

Кроме того, согласно изобретению предложен способ формирования изображения повышенной контрастностью организма человека или не человека, предпочтительно млекопитающего, при котором в указанный организм вводят, предпочтительно парентерально и особенно предпочтительно внутрисосудисто, суспензию контрастного агента по изобретению и формируют изображение, по меньшей мере, части указанного организма, в которой распределен указанный агент, например с помощью МР или магнитометрии (например, с использованием 80и1Э детектора (8О1Э - сверхпроводящий квантовый интерференционный датчик) или матрицы 80и1Э детекторов).

В альтернативном аспекте согласно изобретению предложен также способ определения распределения контрастного агента по изобретению внутри организма человека или не человека, предпочтительно млекопитающего, при котором в указанный организм вводят указанный агент, предпочтительно парентерально, и детектируют сигнал из указанного организма, излученный или модифицированный указанным агентом, например излучение радиоактивного распада, искажение магнитного поля или сигнал магнитного резонанса.

В особенности предпочтительно способ по изобретению включает в себя визуализацию сосудистой сети, особенно с использованием взвешенной по Τι МР визуализации. Формирование изображения может быть осуществлено до того, как произойдет захват значительного количества частиц печенью или селезенкой. Для частиц с полимерным покрытием, продлевающим срок жизни в крови, например из метоксиПЭГ-фосфата, формирование изображения может приемлемо иметь место в течение 24 ч, предпочтительно в течение 4 ч и более предпочтительно в течение 1 ч после внутрисосудистого введения. В альтернативных вариантах реализации способа после локализованной инъекции взвешенные по Т₂ изображения лимфатической системы могут быть сформированы или после инъекции в сосудистую сеть могут быть осуществлены взвешенные по Т₂ исследования печени или селезенки или взвешенные по Т₂ диффузионные исследования.

Для способа по изобретению используемой дозировкой будет эффективная для обеспечения контрастности дозировка для применяемого способа визуализации. Обычно она будет в диапазоне от 0,05 до 30 мг Ре/кг веса тела, предпочтительно от 0,1 до 15 мг Ре/кг и особенно предпочтительно от 0,25 до 8 мг Ре/кг.

Согласно изобретению предложено также применение новых магнитных кристаллических материалов для производства композиции диагностического контрастного агента для использования в способе диагностики, включающем в себя введение указанного состава в живой организм человека или не человека.

Кроме применения в качестве контрастных агентов, композитные частицы по изобретению могут также применяться при локализованной тепловой обработке или гипертермии - за счет использования их магнитных свойств энергия может быть передана частицам ίη νίνο (например, экспозицией в магнитном поле изменяющегося направления поля или напряженности поля), и потери при передаче энергии от частиц к окружающим тканям могут быть использованы для терапевтического эффекта, например для достижения цитотоксического эффекта. Это имеет особенное значение в тех случаях, когда частицы конъюгированы с вектором направленной доставки, например через бифункциональный линкер, такой как бифункциональный полиалкиленоксид.

Аналогичным образом частицы можно применять в железотерапии - в этом случае нет необходимости развивать магнитные свойства ядерных кристаллов, и они могут представлять собой парамагнитные оксиды железа с покрытием из расщепленного полимера и возможно вторым покрытием, например из МПФ.

Известно, что различные препараты на основе оксида железа, полученные ранее известными способами, при внутрисосудистом введении дают существенные неблагоприятные эффекты. Наиболее часто сообщаются данные о супрессии системного кровяного давления и остром тромбоцитном истощении. Оказывается, что эти побочные эффекты могут быть физиологическим и гематологическим ответом на индуцируемую частицами активацию системы комплемента. В то время, как традиционные частицы оксида железа, такие как магнитные крахмальные микросферы (МКМ), могут сильно активировать каскад комплемента, частицы по данному изобретению не оказывают или оказывают только незначительное влияние на число циркулирующих тромбоцитов, тогда как традиционные препараты вызывают остро выраженную и переходную тромбоцитопению.

Частицы по настоящему изобретению, со вторым ли покрытием (например, из МПФ) или без второго покрытия, к удивлению, продемонстрировали отсутствие влияния на систему комплемента или на параметры, относящиеся к системе комплемента, такие как кровяное давление или количество тромбоцитов. Выбранный материал покрытия увеличивает поверхность частицы, которая не будет вызывать активацию комплемента в отличие от традиционных частиц.

Частицы легко могут быть покрыты материалом второго покрытия, например полимером, который физически или химически ассоциируется с поверхностью оксида железа (РеО_х) (например, МПФ). Частицы очень хорошо подходят для дальнейшей модификации поверхности или нанесения покрытия, благодаря их большой площади поверхности и тонкому слою углеводного покрытия, которое позволяет гидрофильным полимерам с концевыми функциональными группами, таким как МПФ, проникать и связываться с или абсорбироваться на поверхности магнитной ядерной частицы.

Частицы из РеО_х имеют более низкое намагничивание, чем традиционные агенты из оксида железа, и их намагничивание не является полностью насыщенным в пределах поля визуализации. Этот признак будет снижать появление артефактов, обусловленных чувствительностью при высокой напряженности магнитного поля.

Установлено, что такие частицы имеют значительно более длительный период полураспада (в два и более раз) в крови у мышей, чем традиционные МКМ частицы, полученные совместным осаждением крахмала и РеО_х.

Кинетику частиц в крови можно дополнительно модифицировать путем добавления второго материала покрытия. Так, было продемонстрировано, что частицы, покрытые МПФ, т.е. частицы с двойным покрытием, имеют значительно более длительный период полураспада (в два и более раз) в крови у мышей, чем частицы без МПФ покрытия или с метокси-ПЭГ (МеОПЭГ) в качестве добавленного эксципиента (МеО-ПЭГ действует как эксципиент и не взаимодействует с поверхностью РеО_х).

Показано, что частицы с МПФ покрытием имеют значительно более длительный период полураспада (в два и более раз) в крови у мышей, чем частицы РеОх нано-размеров, покрытые МПФ, но без первичного покрытия из расщепленного полимера.

Установлено, что частицы по изобретению как с одинарным, так и с двойным покрытием не имеют гематологических эффектов у крыс, в то время как традиционные полисахарид-РеО_х препараты значительно усиливают тромбоцитопению.

Более того, установлено, что частицы по изобретению как с одинарным, так и с двойным покрытием не оказывают действия на человеческий комплемент, в то время как традиционные частицы крахмал-РеО_х (МКМ) являются сильными активаторами комплемента.

Монокристаллические ядерные частицы по изобретению являются особенно предпочтительными, поскольку они имеют пониженную тенденцию к агрегации, что уменьшает количество стабилизаторов (таких как декстран), необходимых в композициях по изобретению, и тем самым снижает возможные проблемы, связанные с токсичностью.

Для минимизации проблем хранения и транспортировки диспресный контрастный агент, полученный по изобретению, приемлемо может быть получен в форме сухого порошка, например, распылительной сушкой или сушкой замораживанием, предпочтительно в асептических условиях. Высушенный агент представляет собой следующую задачу изобретения.

Различные патентные публикации приведены здесь в качестве ссылки.

В следующих далее не ограничивающих примерах настоящее изобретение описано в деталях:

Пример 1.

Стадии получения геля включают в себя получение раствора крахмала и нагревание его до 55°С, добавление к раствору крахмала хлорида железа, добавление гидроксида аммония к раствору железо/крахмал, нагревание реакционной смеси до 87-90°С и охлаждение продукта/нейтрализацию геля.

А. Получение раствора крахмала.

. 50 г растворимого картофельного крахмала (СА8 № 9005-84-9) суспендируют в 850 г кипящей деионизированной воды и перемешивают.

2. Раствор крахмала доводят до кипения и при кипении немедленно помещают на водяную баню с температурой 55°С.

Б. Добавление железа и гидроксида аммония к раствору крахмала.

1. 9,0 г РеС1₃-6Н₂О и 3,3 г РеС1₂-4Н₂О (молярное отношение Ре¹¹¹ к Ре¹¹ 2:1) растворяют в общем объеме деионизованной воды 50 мл.

2. После охлаждения раствора крахмала до устойчивых 55°С раствор железа вливают в раствор крахмала, тщательно перемешивают и добавляют 50 мл 30% (концентрированного) ΝΗ₄ΟΗ.

3. Полученный раствор нагревают до температуры 89°С в течение 2 ч и выдерживают при 89°С в течение 50 мин.

4. После нагревания на водяной бане в течение 1 70 мин

а) охлаждают в течение ночи при температуре 4°С до структурирования геля или

б) охлаждают до температуры окружающей среды и нейтрализуют кислотой (см. ниже).

В. Процедура промывки геля (если гель не нейтрализован кислотой).

Заструктурировавшийся гель промывают накачиванием холодной деионизованной воды через осевшую суспензию геля до значения рН менее 8,5.

Г. Альтернативный способ нейтрализации.

Смесь охлаждают до температуры менее 40°С и нейтрализуют кислотой.

Д. Окислительное расщепление геля гипохлоритом натрия.

Чтобы оптимизировать производство, на новой партии можно провести дозированное титрование определенного количества гипохлорита натрия (гипо) на грамм геля. При производстве магнитных частиц их размер и дисперсность определяют с помощью фотонной корреляционной спектроскопии (ФКС), а также определением скорости релаксации протонов воды.

а) Например, 1,8 мл 5% гипохлорита на 12,5 мг Ре/5 г геля. Объем гипохлорита устанавливают по концентрации имеющегося хлора и миллиграммов железа в 5 граммах геля.

б) Берут навеску геля, добавляют гипохлорит и нагревают на водяной бане при 70°С в течение 45 мин.

в) После нагревания добавляют 8М мочевину (0,8 мл/5 г геля). Мочевина дезактивирует избыток гипохлорита.

г) Проводят диафильтрацию с использованием мембраны (отсечка молекулярной массы <100 кД) до тех пор, пока все свободное Ре и СНО не будут удалены.

Е. Анализ.

Образцы затем подвергают анализу. Материал, полученный таким образом, имеет характеристики, представленные в табл. 1 .

Таблица 1

Анализ	Результат	Повышенный масштаб ***
Состав
Железо (Ре)	6,4 мг/мл	до 95 мг/мл
Спектроскопия Моссбауэра	Преобладание нано-кристаллов гамма-Ре2О3
Углевод (СНО)	3,6 мг/мл
СНО:Ре (массовое соотношение)	0,57	0,2-0,3
Чистота	(Надосадочная жидкость от частиц, центрифугированных при градиенте плотности СхС1 1,4 г/мл)	(Гельпроникающая хроматография)

% свободного Ее	0%
% свободного СНО	0%	2% площади
Размер (ядро из оксида железа)
Прогнозируемый, исходя из г2/г1	9 нм	8 нм
ΝΜΚΌ*	8 нм	8 нм
ЬЕ1**	6,24±0,74 нм
Рассчитано по намагничиванию	5,7-5,8 нм
Размер (частица целиком)
Фотонная корреляционная спектроскопия	11,5 нм	10-12 нм
Скорость осаждения	42,6 единиц Сведберга
Релаксация (при 40°С и 0,47 Т)
Г1	16,34 (мМ-с)-1	20-23 (мМ-с)-1
Г2	28,04 (мМ-с)-1	34-38 (мМ-с)-1
Г2/Г1	1,72	1,6-1,7
Стабильность при 4°С	>6 месяцев
Насыщение намагниченности	60 э.м.е./г ЕеОх +++	80-90 э.м.е./г ЕеОх

+++ 1 г ЕеО_х содержит примерно 70 масс.% Ее * Дисперсия ядерной магнитной релаксации ** Визуализация по интерференционным полосам решетки *** Получено при повышенном масштабе ++ Менее чем 5% седиментируется при центрифугировании при 12000 х д в течение 5 мин % площади = % общей площади под кривой, записанной НРЬС (жидкостная хроматография высокого разрешения)

При ΝΜΚΌ скорость продольной релаксации (1/Т₁) измеряют как функцию напряженности магнитного поля в интервале от 2,35 Гаусс до 1,2 Тесла. См., например, Коешд е1. а1. ΝΜΚ 8рес1го§сору о£ Се1к апб Огдапйпъ. Уо1. II, раде 75, К.К. Сир!а (Еб), СКС Рге§8, 1987 и Коешд е1. а1 Ргодге§8 ίη ΝΜΚ. 8рес!го§сору 22:487567(1990).

Пример 2.

Магнитные частицы получали согласно примеру 1, за исключением того, что картофельный крахмал заменили на кукурузный крахмал.

Следует отметить, что использование материалов иных, чем растворимый картофельный крахмал, может потребовать изменения количества материалов, используемых для образования и разрушения геля.

Пример 3.

Магнитные частицы получали согласно примеру 1 , за исключением того, что картофельный крахмал заменили на рисовый крахмал.

Пример 4.

Магнитные частицы получали согласно примеру 1 , за исключением того, что их не обрабатывали гипохлоритом (раздел Г). Вместо этого образцы геля (4, 8, 12 г) разбавляли рассолом, забуференным фосфатом, и крахмал геля подвергали ферментативному гидролизу с использованием 100 мкг (при 0,7-1,4 единиц активности на мкг) фермента альфа-амилазы (ЕС 3.2.1.1) при температуре окружающей среды в течение 1 6 ч. Полученные высвожденные частицы центрифугировали при низкой скорости, чтобы удалить крупные агрегаты, и фильтрова ли через фильтр 0,45 мкм. Этот способ обеспечил получение частиц со значительно большими общими размерами (в интервале 10-110 нм), но с ядрами из оксида железа размером 6 нм.

Пример 5.

Магнитные частицы получали согласно примеру 1 , за исключением того, что их не обрабатывали гипохлоритом (раздел Г). Вместо этого 1 0 г геля подвергали ультразвуковой обработке, используя сонификатор Брэнсона, снабженный зондом в 1/4 дюйма. Обработку проводили непрерывно в течение 1 5 мин. После центрифугирования при низкой скорости для удаления крупных агрегатов и фильтрации через фильтр 0,45 мкм было установлено, что полученные высвободившиеся частицы также имели значительно больший общий размер (в интервале 30-800 нм), но с размером ядер из оксида железа, аналогичным размеру, указанному в примере 4.

Пример 6.

Метокси-ПЭГ-фосфат (МПФ) (молекулярная масса 5 кД) добавляли в водную суспензию частиц, полученных согласно примеру 1 , при желаемом отношении МПФ к оксиду железа (ЕеО_х) (обычно от 1 до 2 г МПФ/г Ее), выдерживали в термостате в течение 15 ч при 37°С при постоянном вращении, а затем хранили при 4°С до использования.

При желании частицы можно стерилизовать в автоклаве при 1 21 °С в течение 1 5 мин.

Аналогичным образом на частицы можно нанести покрытие с использованием хондроитинсульфата.

Альтернативно, частицы, покрытые МПФ, можно выдержать в термостате при 75°С в те чение 12 ч или сразу в автоклаве при 121°С в течение 10-20 мин.

Пример 7.

Частицы, покрытые МПФ, получали аналогично примеру 6, используя МПФ с различными молекулярными массами (1,1, 2,1, 5,0 и 10,0 кД) и различные соотношения покрытия (0,02, 0,2, 0,4, 0,5, 0,8, 1,0, 1,2, 1,5, 1,6, 2, 2,5, 3, 4 и 8 г МПФ/г РеО_х).

Пример 8.

Результаты испытаний частиц, полученных в примерах 1, 6 и 7, на животных и плазме человека.

Для частиц по изобретению, имеющих различные плотности покрытия МПФ, определяли период полураспада (Т_1/2) в крови мышей. Мышам через хвостовую вену вводили образцы по 100 мл, содержащие 1 мг Ре/мл препаратов из примеров 1 , 6 и 7. Через определенные интервалы времени животных безболезненно умерщвляли, брали образцы крови у двух мышей и объединяли их в пул, и измеряли 1/Т₁. Из значений 1 /Т1 определяли значение периода полураспада (Т_1/2). Результаты представлены в табл. 2, в которую для сравнения включены также результаты, полученные для частиц без покрытия и традиционных МКМ частиц.

_____________________________________Таблица 2

г МПФ*/г РеОх	Т1/2 (мин)
0	27,9
0,02	28,0±3,2#
0,2	31,9±3,3
0,4	39,1±14,1
0,8	28,5±1,3
1,6	69,3±27,7
2	48,9± 3,8
4	45,6± 3,0
8	62,0±5,6
МКМ	3,8

* Молекулярная масса 5 кД # означает ± стандартную погрешность измерения при построении кривой Т_1/2

МКМ: обычные магнитные крахмальные частицы, полученные совместным осаждением.

Из табл. 2 видно, что МПФ-покрытие значительно продлевает период полураспада в крови, и что не имеющие покрытия частицы по изобретению обладают гораздо более высоким периодом полураспада в крови, чем обычные частицы.

Если вместо МПФ использовали несвязывающийся агент вторичного покрытия, значительного повышения периода полураспада в крови мышей не наблюдалось. Это было продемонстрировано путем сравнения определяемых значений периода полураспада в крови мышей для частиц без покрытия, для частиц с покрытием из МПФ и для частиц, обработанных метокси-ПЭГ (молекулярная масса 5 кД) и производным крахмала Не1ак1атсй. В отличие от МПФ, метокси-ПЭГ не присоединяется химически к или не связывается с частицами, а присутствует только в качестве эксципиента. Результаты сравнения представлены в табл. 3.

Таблица 3

Агент вторичного покрытия/среда	Т1/2 (мин)
МПФ, м.м. 5 кД, 8 г/г РеОх	62,0
МеО-ПЭГ, м.мю 5000 кД, 8 г/г РеОх	26,3
НЕТА8ТКСН®, 6%-ный раствор	28,1
Отсутствует	27,9

Частицы с покрытием из МПФ и без покрытия из МПФ испытывали на активацию гематологических эффектов у крыс.

Самцам крыс подготавливали для постоянной дозировки и в правую яремную вену вставляли катетеры для отбора проб. Пробы крови отбирали приблизительно за 24 ч до введения дозы и приблизительно через 3, 10 и 60 мин и/или через 24 ч после введения дозы. Измеряемые гематологические параметры включали в себя определение количества лейкоцитов и тромбоцитов.

В отличие от декстранового магнетита или МКМ-частиц для частиц с покрытием из МПФ и без покрытия из МПФ по изобретению не наблюдалось случаев скоротечной тромбоцитопении.

Частицы с покрытием из МПФ и без покрытия из МПФ, а также МКМ испытывали на плазме человека, чтобы определить степень активации терминального комплементарного комплекса. В отличие от МКМ, частицы с покрытием из МПФ и без покрытия из МПФ не вызывали активации.

Пример 9.

Частицы с покрытием из МПФ, полученные согласно примеру 6, вводили кролику в дозе 1 мг Ре/кг, а через 1 5 мин в дозе 2 мг Ре/кг. Пред- и постконтрастные изображения взвешенного по Т₁ МР записывали при 1,5Т, 3Ό ТОР, ТК/ТЕ 25/5,6, угол переноса 60°, и они представлены на прилагаемых фиг. 1, 2 и 3. Усиление изображения сосудистой сети четко видно на обоих изображениях, а изображение на фиг. 3 демонстрирует высокую контрастность сосудов относительно тканей без артефактов чувствительности, несмотря на сочетание высокой дозы и высокой напряженности поля.

Пример 1 0. Расщепление полимера после образования композитных частиц.

(а) Синтез МКМ

Крахмал (3 г, Керре С1усоке. Швеция) со средней молекулярной массой 70 кД растворяли в воде (10 мл). При температуре 60°С РеС1₃-6Н₂О (2,7 г) и РеС1₂-4Н₂О (4,5 г) растворяли в растворе углевода, после чего смесь медленно осаждали в 1,2М ИаОН (50 мл) при 60°С, одновременно обрабатывая ультразвуком. Ультразвуковую обработку продолжали в течение еще 1 0 мин с последующим центрифугированием при 5000 об/мин в течение 5 мин. Надосадочную жидкость собирали и подвергали диализу 0,9% ИаС1. Кривая намагничивания пока зала, что полученные крахмальные частицы были суперпарамагнитными и имели средний гидродинамический диаметр 400 нм.

(б) Обработка МКМ гипохлоритом натрия

Частицы МКМ (15,5 мг Ре/мл, 1,70 мл) со средним размером частиц 400 нм добавляли к гипохлориту натрия (Р1ика # 71696, 13,8% свободного хлорида). Контейнер плотно закрывали и нагревали при температуре 70°С в течение 45 мин. Реакционную смесь охлаждали, добавляли 8М мочевину (0,17 мл), и суспензию фильтровали (0,2 мкм). Частицы очищали водой, используя центробежный концентратор Масгокер (отсечка 100 К) при 3000 об/мин. Размер частиц как функция добавленного количества гипохлорита натрия представлен ниже в табл. 4.

Таблица 4

Размер частиц МКМ до и после обработки гипохлоритом натрия

Количество ШОС1 (мл)	Размер частиц (средний, нм)
0	400
0,063	88
0,100	76
0,300	70
0,500	68
1,000	Агрегирование 1)

1) Весь крахмал расщеплен, агрегирование непокрытых кристаллов оксида железа

Пример 11. Продукты, полученные согласно примерам 1 и 7.

В табл. 5 представлены подробные характеристики частиц, полученных согласно примеру 1 (композиция А) и (1,2 г МПФ (2 кД)/г РеО_х) (Композиция Б), и приготовленные с эксципиентами (Тп8 (50 мМ), маннит (2,5%) и гидроксид натрия до рН 6-8) для введения.

Таблица 5

АНАЛИЗ	КОМПОЗИЦИЯ А	КОМПОЗИЦИЯ Б
СОСТАВ
Железо (Ре)	30 мг/л	30 мг/л
Соотношение углевод (СНО):Ре	0,8	1,2
МПФ (2 кДальтон)	0	60 мг/мл
ЧИСТОТА	(Гельпроникающая хроматография)	(Гельпроникающая хроматография)
% свободного СНО	10-12% площади	10-12% площади
РАЗМЕР (ядро из оксида железа)
Прогнозируемый исходя из г2/г1	7 нм	7нм
NМΚ^	7 нм	7 нм
РАЗМЕР (частица целиком)
Фотонная корреляционная спектроскопия	9-11 нм	11-13 нм
РЕЛАКСАЦИЯ (при 40°С и 0,47 Тесла)
Г1	19-20 (мМ.с)-1	19-21 (мМ.с)-1
Г2	30-32 (мМ.с)'1	30-33 (мМ.с)-1
Г2/Г1	1,5-1,6	1,5-1,6
Намагничивание при насыщении 0,45 Тесла	90-100 э.м.е./г РеОх	90-100 э.м.е./г РеОх
СТАБИЛЬНОСТЬ	>3 месяцев при 40°С	>3 месяцев при 40°С

ИМКВ = Дисперсия ядерной магнитной релаксации % площади = % общей площади под кривой НРЬС

Пример 1 2. Наилучшая модель получения частиц до нанесения покрытия из МПФ.

(А) В трехгорлом реакционном сосуде емкостью 22 л, снабженном верхней механической мешалкой и конденсатором, нагревали 12,8 л деионизованной воды до 95°С, а затем при перемешивании со скоростью 80-100 об/мин добавляли суспензию из 800 г растворимого картофельного крахмала (8гдта, Νο. 8-2630) в 1,6 л деионизованной воды. Полученный слегка мутный раствор перемешивали в течение 1 0 мин при температуре окружающей среды, а затем охлаждали до 55°С в течение 30 мин. Добавляли 144 г раствора гексагидрата хлорида железа (III) и 52,8 г тетрагидрата хлорида железа (II) в 1,2 л деионизованной воды, а через три минуты до бавляли одной порцией 800 мл 28% гидроксида аммония. Скорость перемешивания снижали до примерно 60 об/мин и перемешивали черную реакционную смесь в течение 1 5 мин при температуре окружающей среды, а затем постепенно нагревали до 92°С в течение 60 мин. Температуру 92-94°С поддерживали в течение трех часов, контролируя ход реакции путем измерения магнитной восприимчивости во время реакции и после ее окончания. Избыток гидроксида аммония удаляли вакуумной дистилляцией. Концентрат охлаждали до примерно 20°С и охлаждали до образования геля.

Всего получили четыре порции геля, в самой большой из которых использовали 800 г картофельного крахмала.

Таблица 6

Получение геля

Порция	Крахмал (г)	РеС13 6Н2О (г)	РеС12 4Н2О (г)	ΝΗ4ΟΗ (мл)	Объем реакционной смеси (л)	Масса геля (кг)	Ре, ХРР* (г/кг)	М (э.м.е./мг Ре)	М..„, (х10’4э.м.е./О е.см3)
1	600	108	39,6	600	12	9,8	3,33	0,0932	0,69
2	600	108	39,6	600	12	9,8	3,35	0,0954	0,71
3	600	108	39,6	600	12	9,8	3,36	0,0924	0,69
4	800	144	39,6	800	12	13,7	3,30	0,0955	0,70

*ХКР = рентгеновская флуоресцентная спектроскопия (Б) Гель промывали холодной водой для удаления хлорида аммония, полученного при образовании оксида железа, и остаточного гидроксида аммония. В противном случае эти вещества будут вступать в реакцию с гипохлоритом натрия, который используется для переработки крахмала на стадии В, что существенно увеличит расход гипохлорита при выполнении этой стадии.

Промывку геля завершали повторными добавлениями/удалениями воды в реактор с мешалкой, который выдерживали при 5°С для минимизации растворения геля. Гель переме шивали (кратковременно и медленно) в примерно двух объемах холодной деионизованной воды, а затем давали возможность осесть (примерно в течение 1 ч). Темный слой надосадочной жидкости, отделенный от очень темного слоя геля, удаляли всасыванием (под визуальным контролем). Добавление равного количества воды, кратковременное и медленное перемешивание, осаждение и отделение повторяли до получения электропроводности 0,5 ттЬо. В результате для промывки гелей потребовалось около 8 объемов воды с выделением железа около 80%.

Таблица 7

Промытый гель

№ загрузки	Масса загрузки (кг)	Общее количество воды (л)	Оборот в с	Конечная масса (кг)	Ре (г)	Выделение Ре (%)	Начал. эл. проводность (ттЬо)	Конечн. эл. проводность (ттЬо)
1	1,7	15	7	(центрифуг.)	6,1	78	4,8	0,3
2	9,5	80	5	14,5	26,5	81	5,2	0,5
3	9,5	80	4	11,2	24,5	77	4,7	0,5
4	13,3	106	5	16,4	36,9	83	4,8	0,3

(В) Эта стадия включает в себя конверсию промытого геля в дисперсию частиц путем окисления крахмальной матрицы. Ее заканчивали обработкой геля гипохлоритом натрия. Количество гипохлорита, используемого для окисления, определяли опытным путем, окисляя небольшие порции геля (50-100 г) и измеряя релаксацию (η, г₂ и г₂/г₁), а также размер частиц.

Промытый гель нагревали до 45°С и обрабатывали 1 2% раствором гипохлорита натрия. Температура реакционной смеси снизилась на несколько градусов (из-за добавления охлажденного гипохлорита). Реакционную смесь оставляли стоять до подъема температуры примерно до 45°С. Затем смесь нагревали в течение 30 мин до температуры 55°С, при которой на блюдалась экзотермическая реакция с подъемом температуры примерно на 15°С в течение 15 мин. После спада экзотермического процесса температуру реакции доводили до 70°С и поддерживали в течение 45 мин. Оценка опасности данной стадии с помощью калориметра К.С1 подтвердила умеренный (15°С), но контролируемый экзотермический процесс для данной реакции.

Реакционной смеси давали возможность охладиться до комнатной температуры и фильтровали через фильтр М1Шроге с номинальным картриджем фильтра 0,2 мкм. Самое большое окисление было проведено на 15 кг геля (34 г Ре), и выделение было количественным.

Таблица 8

Дисперсия частиц

№ загрузки	Масса загрузки (кг)	12% ШОС1\ (л)	Охлажд. Мочевина (г)	Конечный объем (л)	Ре (г)	Брукхавен (нм)	Г1 (мМ-с)’1	г2 (мМ-с)’1	Г2/Г!
1	3,0	0,63	20	3,5	5,5	11,1	13,37	23,1	1,68
2	6,5	1,83	42	8	11,8	11,8	14,5	24,8	1,68
3	10	2,25	112	12	22	12,4	14,9	25,0	1,68
4	15	3,00	80	18	34	12,7	21,0	36,2	1,71

(Г) Данная стадия включает в себя удаление остатков крахмала, свободного железа и других реагентов после окисления гипохлорита.

Для получения желаемых результатов использовали предварительно градуированные мембранные фильтровальные картриджи из регене рированной целлюлозы МиШроте ТМ ТЕЕ 100 К. Чистоту частиц контролировали с помощью СР8 (гельпроникающая хроматография). Чисто та конечного продукта после ультрафильтрации была в диапазоне 97-99% (СРС).

Таблица 9

Конечный продукт

№ загрузки	Объем загрузки (л)	Фильтровальная среда	Вода, общий объем (л)	Конечная масса (кг)	Ре по 1СР (г)	Выделение Ре (%)
1	2	М1Шроге 100 К, 1 фут2 (0,093 м2) регенерированной целлюлозы	25	670	2,2	67
2	6	М1Шроге 100 К, 6 фут2 (0,557 м2) регенерированной целлюлозы	45	671	8,8	70
3	12	М1Шроге 100 К, 6 фут2 (0,557 м2) регенерированной целлюлозы	60	980	13,7	73
4	18	М1Шроге 100 К, 6 фут2 (0,557 м2) регенерированной целлюлозы	100	1674	27,7	82

Окончательные результаты анализов для всех четырех загрузок приведены ниже в табл.

10.

(Д) Последующее нанесение ПЭГ покрытия

На частицы, полученные согласно описанным выше стадиям (А)-(Г), при желании можно нанести покрытие из ПЭГ, предпочтительно из метокси-ПЭГ-фосфата (МПФ) с молекулярной массой 2000 Д при соотношении 1,2 г МПФ на грамм ЕеО_х.

Частицы с таким покрытием из ПЭГ или без него могут быть приготовлены для введения в организм с 50 мМ буфером ТгЕ и 2,5% раствора маннита при рН, доведенным с помощью гидроксидом натрия до значения от 6 до 8.

Таблица 10

Результаты анализов

Загрузка	1	2	3	4
Чистота (%, СРС)	97,2	98,1	99,0	99,2
Железо (мг/мл, 1СР)	3,3	13,1	13,7	16,5
Г2/Г1	1,67	1,66	1,65	1,64
г1 (мМ-с)’1	19,6	18,9	20,0	21,3
г2 (мМ-с)’1	32,7	31,3	33,0	35,0
Намагниченность (э.м.е/мг Ре)	0,0762	0,0795	0,0801	0,0826
Размер частиц (нм, Брукхавен)	12	10	10	11
Подвижность (МВ‘1С1 х Е08)	-3,02	-3,02	-3,04	-2,92
Рн	4,1	4,0	4,0	4,0
Отношение железо/углерод	0,52	0,28	0,30	0,28
Внешний вид	Не вязкая, от темно-красной до коричневой	Не вязкая, темно-коричневая	Не вязкая, темно-коричневая	Не вязкая, темно-коричневая

Пример 13. Получение диэтил-2-(3,5-бисацетиламино-2,4,6-трииодобензоилокси)этилфосфоната.

К перемешиваемому раствору диатризоата (7,1 г, 11,2 ммоля) в сухом диметиформамиде (50 мл) при комнатной температуре под слоем аргона добавляли раствор диэтил-2-бромоэтилфосфоната (3,02 г, 12,3 ммоля, 1,1 экв.) в диметилформамиде (10 мл). После перемешивания в течение 1 2 ч растворитель испаряли в вакууме и получали белый осадок, который промывали 300 мл насыщенного водного раствора №1НСО₃. а затем экстрагировали смесью хлороформэтанол 2:1 (3 х 200 мл). Органический экстракт сушили (Мд8О₄), фильтровали и выпаривали в вакууме с получением 3,61 г (41%) продукта в виде белого твердого вещества. В результате перекристаллизации из ацетонитрила получили аналитически чистый материал; Т_пл. 249-251°С,

МН⁺ (779). Спектр ¹Н-ЯМР (300 МГц) согласовывался с целевым материалом.

Рассчитано для С₁₇Н₂₂1₃Р^О₇: С 26,24; Н 2,85; I 48,93; N 3,60;

установлено: С 26,26; Н 2,70; I 49,05; N 3,50.

Пример 14. Получение 2-(3,5-бис-ацетиламино-2,4,6-трииодобензоилокси)этилфосфоновой кислоты.

К перемешиваемой суспензии диэтил 2(3,5-бис-ацетиламино-2,4,6-трииодобензоилокси)этилфосфоната (3,1 г, 3,98 ммоль) в сухом дихлорметане (40 мл) при комнатной температуре в атмосфере азота добавляли 1,5 мл (10,56 ммоль, 2,65 экв.) триметилсилилиодида. После перемешивания в течение 12-14 ч получили вязкую суспензию, к которой добавляли еще 40 мл дихлорметана и продолжали перемешивание в течение 6 ч. Затем добавляли воду (4 мл) и перемешивали реакционную смесь в течение 10 мин. Затем добавляли метанол (40 мл), и образовавшийся раствор красного цвета концентрировали в вакууме с получением 3,42 г неочищенного целевого продукта в виде желтого твердого вещества. Неочищенный продукт растворяли в 20 мл раствора из 10% этанола и 90% воды и пропускали раствор через С₁₈ ионообменную колонку, элюируя 50 мл раствора метанол-вода. Фильтрат концентрировали в вакууме с получением 0,48 г (14%) целевой фосфоновой кислоты в виде белого твердого вещества, Тпл. >200°С (разложение ~250°С); МН⁺ (723).

Спектр 'Н-ЯМР (300 МГц) согласовывался с целевым материалом.

Рассчитано для ^₇Η₂₂Ι₃ΡΝ₂Ο₇: С 21,63; Н 1,95; I 52,73; N 3,88; Р 4,29;

установлено: С 21,29; Н 1,95; I 52,44; N 3,71; Р 4,31.

Соединение из примера 1 4 можно применять для покрытия магнитных частиц, полученных согласно предыдущим примерам.

Пример 15. Синтез метокси-ПЭГ(2К)фосфоната.

Стадия 1: Метокси-ПЭГ(2К)-ОН (21,60 г) в течение нескольких часов нагревали с обратным холодильником в 1 08 мл толуола при азеотропном удалении воды. Охлажденный раствор обрабатывали по каплям смесью тионилхлорида (7,88 мл) и диметилформамида (0,313 мл), а затем нагревали с обратным холодильником в течение 4 ч. Реакционную смесь концентрировали при пониженном давлении, и остаточное светло-желтое твердое вещество переносили в 1 08 мл воды и дважды промывали эфиром. Водный раствор дважды экстрагировали хлороформом, объединенные экстракты сушили над безводным сульфатом магния и концентрировали с получением 19,90 г метокси-ПЭГ(2К)-С1.

Стадия 2: Смесь метокси-ПЭГ(2К)-С1 (18,51 г) и триэтилфосфита (185 мл) нагревали с обратным холодильником в течение 4 дней. Осадок, образовавшийся при охлаждении до комнатной температуры, собирали путем фильтрации, промывали эфиром и сушили под вакуумом с получением 18,16 г метоксиПЭГ(2К)-Р(О)(ОЕ1)₂. ¹Н-ЯМР (С1)С1_;; 300 МГц):

4,10 ррт (т, -Р(О)(ОСН2СН₃)2); 3,65 ррт (8, (-СН2СН2О-)п); 3,38 ррт (₈, -ОСН₃); 2,13 ррт (дуплет триплетов, -СН₂Сн₂Р(О)(ОсН₂СН₃)₂); 1,33 ррт (ΐ, -Р(О)(ОСН₂СН₃)₂).

Стадия 3: Раствор метокси-ПЭГ(2К)Р(О)(ОЕ1)₂ (5,02 г) в 100 мл метиленхлорида обрабатывали по каплям 28 мл раствора, полученного из 24,15 г бромтриметилсилана и 157 мл метиленхлорида. Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 1 6 ч, а затем концентрировали с получением белого твердого вещества. Белое твердое вещество в течение 2 ч обрабатывали метанолом, а затем концентрировали с получением 4,57 г продукта в виде белого твердого вещества. Ίΐ-ЯМР (СЭС1₃; 300 МГц): 8,20 ррт (Ьг 8,

-Р(О)(ОН)2); 3,65 ррт (8, (-(СНСНО-У; 3,38 ррт (8, -ОСН₃); 2,17 ррт (дуплет триплетов СН2СН2Р(О)(ОН)2).

Пример 1 6. Получение конъюгата метоксиПЭГ(2К)-фосфонат/суперпарамагнитный оксид железа.

Смесь метокси-ПЭГ(2К)-фосфоната (0,448 г); 3,42 мл суспензии 93,7 мг Ее/мл оксида железа - продукта согласно примеру 1 2 - и воды до общего объема 20 мл выдерживали в термостате при 37°С в течение 20 ч. Реакционную смесь помещали в 50 мл смеситель Ат1соп, снабженный мембраной ΥΜ-30 и проводили диафильтрацию через воду, а затем фильтровали через нейлоновый фильтр 0,2 мкм. Анализом 1СР установлено, что образец содержит 13,3 мг Ее/мл, 0,34 мг/мл несвязанного метокси-ПЭГ(2К)фосфоната и 1,42 мг/мл связанного метоксиПЭГ(2К)-фосфоната.

Пример 1 7. Получение конъюгата метоксиПЭГ(2К)-тиол/суперпарамагнитный оксид железа.

Смесь метокси-ПЭГ(5К)-тиола (0,438 г); 1,67 мл суспензии 93,7 мг Ее/мл оксида железа продукта согласно примеру 1 2 - и воды (1 0) мл выдерживали в термостате при 37°С в течение 22 ч. Реакционную смесь помещали в 50 мл смеситель Аткоп, снабженный мембраной ΥΜ30, и проводили диафильтрацию через воду, а затем фильтровали через нейлоновый фильтр 0,2 мкм. Анализ 1СР показал, что образец содержит 13,47 мг Ее/мл, 0,23 мг/мл несвязанного метокси-ПЭГ(2К)-тиола и 5,46 мг/мл связанного метокси-ПЭГ(2К)-тиола.

Пример 18. Получение суспензий частиц оксида железа с покрытием из МПФ и без покрытия из МПФ.

Без покрытия из МПФ:

Начинают с добавления ~70% от объема загрузки воды для инъекций в стеклянный или футерованный стеклом промышленный танк. При постоянном перемешивании добавляют и растворяют маннит. Конечная концентрация маннита может быть в пределах от 1 до 5% мас./об., обычно 3,5% мас./об. При постоянном перемешивании добавляют и растворяют трометамин. Конечная концентрация трометамина может быть в пределах от 1 0 до 1 00 мМ, обычно 50 мМ. При постоянном перемешивании добавляют объемную суспензию оксида железа (полученную согласно примеру 1 2). Конечная концентрация оксида железа может быть в пределах от 0,1 до 10% мас./об., обычно 3% мас./об. Проверяют рН объемной суспензии. При необходимости рН доводят до значения в пределах 8,1-8,3 (цель - 8,2) с использованием 0,1н. раствора №ЮН или 0,1н. раствора соляной кислоты. При непрерывном перемешивании доводят суспензию до 1 00% конечного объема водой для инъекций. Полученную суспензию можно стерилизовать паром при 121°С до 10-50 Е_о, обыч но 15 Е_о. Конечная суспензия может иметь рН в пределах от 5 до 8, обычно от 7 до 7,5.

С покрытием из МПФ:

Начинают с добавления 25% от общего объема загрузки воды для инъекций в соответствующий тарированный промышленный танк. При постоянном перемешивании добавляют и растворяют метоксиполиэтиленгликоль-(2000)фосфат. Конечное соотношение МПФ/Ее может быть в пределах от 0,1 до 5%, обычно 1,5. При постоянном перемешивании добавляют и растворяют трометамин. Конечная концентрация трометамина может быть в пределах от 1 0 до 100 мМ, обычно 50 мМ. При перемешивании добавляют и растворяют маннит. Конечная концентрация маннита может быть в пределах от 1 до 5% мас./об., обычно 2,5%. Взвешивают в подходящем контейнере соответствующее количество суспензии оксида железа (полученной согласно примеру 1 2). При перемешивании в суспензию оксида железа медленно добавляют раствор, содержащий МПФ, маннит и трометамин. Конечная концентрация оксида железа может быть в пределах от 0,1 до 10% мас./об., обычно 3%. Проверяют рН суспензии. Доводят рН до значения в пределах 8,4-9,0 0,4н. раствором гидроксида натрия. При непрерывном перемешивании доводят суспензию до 1 00% конечного объема водой для инъекций. Полученную таким образом суспензию можно стерилизовать паровым нагревом при 121°С до 10-50 Е_о, обычно 1 5 Ео. Связывание МПФ с оксидом железа завершается во время паровой стерилизации.

Альтернативно, суспензию можно выдержать в термостате при 60-95°С в течение 2-4 ч, чтобы окончательно связать МПФ с оксидом железа. Конечная суспензия может иметь рН в пределах от 5 до 8, обычно от 7 до 7,5.

Пример 1 9. Получение нано-кристаллов оксида железа без покрытия.

(а) Удаление крахмального полимерного покрытия с поверхности оксида железа без добавления стабилизатора

Проводили тест, чтобы определить, возможно ли получение стабильных суспензий из нано-кристаллов оксида железа без полимерных покрытий, исходя из суспензий оксида железа, полученных согласно примеру 1 2, без замены стабилизатора. 0,5 мл 30% перекиси водорода добавляли к 0,5 мл аликвотам суспензии оксида железа. Образец выдерживали в термостате при 55°С при непрерывном перемешивании, при этом рН образца контролировали с помощью специального рН-электрода. По мере протекания реакции окисления рН образца снижалось. Значение рН образца поддерживали в пределах 6,5-7,5 добавлением 1н. ΝαΟΗ. При выдерживании в термостате в течение трех часов происходила флоккуляция образца, указывая, что суспензия частиц оксида железа с удаленным по лимерным покрытием нестабильна и образует крупные агрегаты.

(б) Проба с монофосфатом

Для теста на эффективность монофосфата в качестве модификатора поверхности для стабилизации непокрытых нано-кристаллов оксида железа (нионов) было проведено исследование, при котором аликвоты суспензии оксида железа смешивали с тринатрийфосфатом в различных концентрациях. Затем 0,5 мл перекиси водорода добавляли к каждому образцу. Образцы выдерживали в термостате при 55°С до окисления крахмального полимерного покрытия (КПП).

№ образца	[Να2ΗΡΟ4] (мМ)
0	0
1	1,7
2	8,3
3	16,6
4	33,3
5	50
6	66,7
7	83,3
8	166
9	250
10	333

Происходила флоккуляция всех образцов после 5 ч выдерживания при 55°С, указывая, что монофосфат не является удовлетворительным поверхностным модификатором и стабилизатором для непокрытых частиц оксида железа.

(в) Дифосфат в качестве модификатора поверхности и стабилизатора

Эффективность дифосфата (также известного как пирофосфат) в качестве поверхностного модификатора частиц оксида железа исследовали с помощью тетранатрийфосфата (безводного) способом, аналогичным способу, применявшемуся с монофосфатом. Образцы выдерживали в термостате при 55°С до окисления крахмального полимерного покрытия (КПП). После выдерживания в термостате при 55°С в течение 5 ч образцы 2-7 остались суспендированными. Измеренные средние размеры частиц указаны в приведенной ниже таблице.

№ образца	[Να2ΗΡΟ4] (мМ)	Средний размер частицы (нм)
0	0	*
1	2,5	11,6
2	6,3	9,5
3	12,5	9,3
4	18,8	9,7
5	25,1	9,1
6	25,1	9,6
7	62,7	9,7
8	125,4	*
9	188,1	*
10	250,7	*

* Происходила флоккуляция образцов

Малые размеры частиц отражают удаление материала крахмального полимерного покрытия. Эти данные указывают, что пирофосфат в концентрации примерно от 2 до 60 мМ является удовлетворительным поверхностным модификатором и стабилизатором для непокрытых кристаллов оксида железа.

(г) Трифосфат в качестве модификатора поверхности и стабилизатора

Для тестирования трифосфата в качестве стабилизатора провели исследование. Использовали гексагидрат пентанатрийтрифосфата производства компании 81дта. К 3,75 мл суспензии оксида железа добавляли 5,25 мМ натрийтрифосфата, 3,75 мл воды и 7,5 мл 30% перекиси водорода. Смесь выдерживали в термостате при 60°С в течение 3 ч. Суспензия не показала признаков флоккуляции, и измеренный размер частиц составил 9 нм. В этом случае малый размер частиц также отражает удаление материала крахмального полимерного покрытия. Эти данные указывают, что трифосфат является удовлетворительным поверхностным модификатором и стабилизатором для непокрытых кристаллов оксида железа.

(е) Тетрафосфат в качестве модификатора поверхности и стабилизатора

Аналогичное исследование провели для опробования тетрафосфата. Использовали соль гексаммонийтетрафосфат производства компании 81дта. Результаты приведены в следующей таблице.

№ образца	[№2НРО4] (мМ)	Средний размер частицы (нм)
0	0	*
1	2,5	27,3
2	5	9,5
3	10	10,1
4	20	9,3

* Происходила флоккуляция образцов

В этом случае малый размер частиц образцов 2-4 после выдерживания в термостате также отражает удаление материала крахмального полимерного покрытия. Эти данные указывают, что тетрафосфат также является удовлетворительным поверхностным модификатором и стабилизатором для непокрытых кристаллов оксида железа.

Исследование характеристик непокрытых монокристаллов оксида железа Используя пирофосфат натрия, получили суспензии непокрытых нано-кристаллов (нионов) оксида железа. После окончания окисления провели диафильтрацию суспензии через воду для удаления фрагментированного крахмала и остатка перекиси водорода. Полученную суспензию анализировали несколькими методами, указанными ниже.

(а) ОРС: Гельпроникающая хроматография (ОРС) показывает, что непокрытые нано частицы (ΝΊΌΝ) оксида железа дают острый пик при отсутствии хвостового сигнала полимеров из крахмала.

(б) Общий органический углерод (СОУ): Анализ двух отдельных препаратов нионов показал только базовый уровень содержания общего органического углерода, что свидетельствует о практически полном удалении полимерного покрытия.

Образец	СОУ (ррй)	Концентрация Ее
Контрольный образец
воды	159	-
Нион	156	2,6 мкг/мл
Образец	СОУ (ррй)	Концентрация Ее
Контрольный образец
воды	144	-
Нион	211	30 мкг/мл
Пример 12	4060	18 мкг/мл

(в) Капиллярный электрофорез: Анализ нионов показал отрицательную электрофоретическую подвижность -3,4х10^-4 см²В^-1с^-1, которая является немного более отрицательной, чем у продукта из примера 12 (-3,0х10^-4 см²В^-1с^-1). Это согласуется с отрицательным электростатическим зарядом, добавляемым частицам полифосфатами.

(г) Релаксация и магнитное насыщение: Определяли магнитную релаксацию. η и г₂ были равны 22,5 и 34,4 мМ^-1с^-1, соответственно, что давало отношение г₁/г₂ 1,53. Эти величины в общем почти такие же, как соответствующие значения, полученные для продукта из примера

12.

(д) Стабильность при паровой стерилизации: Суспензии нионов подвергали паровой стерилизации при 121°С в течение 20 мин, и это не показало заметного изменения размера частиц.

Claims (6)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1 . Способ получения композитных магнитных частиц, при котором (1 ) формируют магнитные частицы внутри углевода, содержащего водную среду, и (2) расщепляют указанный углевод с высвобождением указанных композитных частиц, причем указанные композитные частицы обладают моментом магнитного насыщения более 50 электромагнитных единиц/г ЕеО_х, имеют величину η, представляющую собой скорость релаксации Τι, выше 15 мМ^-1с^-1 (измеренную при 0,47 Тесла и 40°С), а средний общий размер частицы указанных композитных частиц находится в интервале от 4 до 30 нм.

   2. Способ по п. 1 , отличающийся тем, что указанная среда представляет собой гель, предпочтительно гель, содержащий анионные центры.

   3. Способ по п.1, отличающийся тем, что указанные магнитные частицы представляют собой частицы оксида железа.

   4. Способ по п.1, отличающийся тем, что указанные магнитные частицы являются суперпарамагнитными.

   5. Способ по п.1, отличающийся тем, что указанный углевод представляет собой крахмал.

   6. Способ по п.1, отличающийся тем, что указанный углевод расщепляют окислением.

   7. Способ по п.1, отличающийся тем, что расщепление указанного углевода осуществляют посредством обработки частиц, которые содержат множество указанных магнитных частиц внутри матрицы из указанного углевода.

   8. Способ по п.1, отличающийся тем, что указанные композитные частицы дополнительно обрабатывают с целью присоединения к ним покрытия из гидрофильного полимера, продлевающего пребывание в крови, причем предпочтительно указанный полимер присутствует в указанной среде до проведения стадии (2), причем более предпочтительно указанный полимер представляет собой функционализированный полиалкиленоксид.

   9. Способ по п.1. отличающийся тем, что указанная водная среда дополнительно содержит линейный полимер.

   1 0. Способ по п. 1 , отличающийся тем, что указанный углевод расщепляют после образования композитных частиц магнитная частицаполимер.

   11. Способ по п.1, при котором последовательно проводят следующие стадии:

   (1 ) объединяют в нагретом водном растворе крахмал, соли трех- и двухвалентного железа и основание;
2. (2) возможно, охлаждают указанный раствор до температуры ниже 15°С для образования заструктурировавшегося геля;
3. (3) снижают рН до 6,0-8,5, причем, возможно, выполняют эту стадию перед стадией (2);
4. (4) обрабатывают окислителем для расщепления крахмала и высвобождения указанных частиц;
5. (5) высвобожденные частицы промывают и фильтруют;
6. (6) высвобожденные частицы, возможно, подвергают взаимодействию с функционализированным производным полиалкиленоксида для связывания указанного производного с указанными частицами; и (7) высвобожденные частицы, возможно, стерилизуют в автоклаве.

   12. Способ по п.11, отличающийся тем, что стадию (3) осуществляют путем удаления избытка воды и основания при пониженном давлении перед осуществлением стадии (2).

   13. Способ по п.12, отличающийся тем, что указанное основание представляет собой гидроксид аммония.

   14. Способ по п.11, отличающийся тем, что стадию (3) осуществляют путем добавления кислоты для регулирования избытка основания перед осуществлением стадии (4).

   15. Способ по п.14, отличающийся тем, что указанная кислота представляет собой НС1.

   1 6. Способ по п. 1 , отличающийся тем, что большинство композитных частиц, высвобожденных таким образом, содержат одну магнитную частицу.

   1 7. Способ по п. 1 , отличающийся тем, что стадию расщепления (2) выполняют в две стадии, причем вторую стадию расщепления осуществляют таким образом, чтобы удалить по существу весь указанный углевод с магнитных частиц, при этом указанную вторую стадию расщепления осуществляют в присутствии или с последующим добавлением стабилизирующего агента, который связывается с магнитными частицами, до удаления полимерного покрытия с магнитных частиц и их связывания со стабили зирующим агентом.

   18. Способ по п. 1, отличающийся тем, что стадии (1) и (2) осуществляют в одном реакционном сосуде.

   19. Способ по п. 1, отличающийся тем, что в указанных композитных частицах соотношение г₂/г₁ находится в интервале от 1 до 100, при этом г₂ представляет собой скорость релаксации

   Т2.

   20. Способ по п.1, отличающийся тем, что в указанных композитных частицах соотношение γ₂/γι находится в интервале от 1 до 10.

   21. Способ по п.1, отличающийся тем, что в указанных композитных частицах соотношение γ₂/γι составляет менее 3.

   22. Способ по п.1, отличающийся тем, что в указанных композитных частицах соотношение г₂/г₁ находится в интервале от 1,2 до 3.

   23. Композитные частицы, имеющие средний общий размер частицы от 4 до 30 нм, момент магнитного насыщения более 50 электромагнитных единиц/г ГеО_х, величину г выше 15 мМ^-1с^-1 (измеренную при 0,47 Тесла и 40°С) и содержащие суперпарамагнитные неорганические ядерные частицы с материалом покрытия из расщепленного углевода, предпочтительно из расщепленного крахмала.

   24. Частицы по п.23, дополнительно содержащие покрытие из гидрофильного полимера, продлевающего время пребывания в крови.

   25. Частицы по п.23, отличающиеся тем, что в указанных композитных частицах соотношение г₂/г₁ находится в интервале от 1 до 100.

   26. Частицы по п.23, отличающиеся тем, что в указанных композитных частицах соотношение г₂/г₁ находится в интервале от 1 до 10.

   27. Частицы по п.23, отличающиеся тем, что в указанных композитных частицах соотношение г₂/г₁ составляет менее 3.

   28. Частицы по п.2З, отличающиеся тем, что в указанных композитных частицах соотношение г₂/г₁ находится в интервале от 1,2 до 3.

   29. Водная суспензия суперпарамагнитных неорганических ядерных частиц, имеющих средний общий размер частицы от 4 до 30 нм, момент магнитного насыщения более 50 электромагнитных единиц/г ЕеО_х, величину г₁ выше 15 мМ^-1с^-1 (измеренную при 0,47 Тесла и 40°С), причем указанные частицы практически свободны от органического материала покрытия и несут связанный с поверхностью неорганический электростатический стабилизирующий агент, причем указанный агент представляет собой олиго- или полифосфат.

   30. Частицы по п.23, имеющие средний общий диаметр частицы от 4 до 30 нм, содержащие суперпарамагнитные неорганические ядерные частицы со связанным с поверхностью ядерной частицы модификатором биораспределения, причем связанным через множество связывающих ионы железа групп, либо через олиго- или полифосфатную группу или фосфонатную группу, присоединенную к указанному модификатору, причем указанный модификатор предпочтительно содержит полиалкиленоксидную группировку, более предпочтительно дополнительно содержит материал покрытия из расщепленного углевода, предпочтительно из расщепленного крахмала.

   31. Частицы по любому из пп.23-28 и 30, имеющие связанную с поверхностью ядерной частицы репортерную группировку, обнаруживаемую при диагностической визуализации, причем указанная репортерная группировка представляет собой иодированный органофосфат.

   32. Дисперсный композитный агент для инъекций, содержащий композитные частицы, имеющие средний общий размер частицы от 4 до 30 нм, момент магнитного насыщения более 50 электромагнитных единиц/г ЕеО_х, величину Г1 выше 15 мМ^-1с^-1 (измеренную при 0,47 Тесла и 40°С), причем агент содержит ядра неорганических частиц, имеющие химически или физически связанный с его поверхностью гидрофильный полимер, продлевающий пребывание в крови, и снабженные покрытием из расщепленного разветвленного углевода, защищающего центры связывания, предпочтительно покрытие из разветвленного крахмала, более предпочтительно указанный гидрофильный полимер, продлевающий пребывание в крови, представляет собой функционализированный полиалкиленоксид.

   33. Агент по п.32, отличающийся тем, что в указанных композитных частицах соотношение γ₂/γι находится в интервале от 1 до 100.

   34. Агент по п.32, отличающийся тем, что в указанных композитных частицах соотношение Γ₂/η находится в интервале от 1 до 10.

   35. Агент по п.32, отличающийся тем, что в указанных композитных частицах соотношение г₂/г_£ составляет менее 3.

   36. Агент по п.32, отличающийся тем, что в указанных композитных частицах соотношение г₂/г_£ находится в интервале от 1,2 до 3.

   37. Диагностическая композиция, содержащая частицы по любому из пп.1-28, 30-36 или полученные по любому из пп.1-28, 30-36, вместе с, по меньшей мере, одним физиологически приемлемым носителем или эксципиентом.

   38. Композиция контрастного вещества, содержащая эффективное для обеспечения контрастности количество композитных частиц, содержащих ядерные кристаллы из суперпарамагнитного оксида металла и органическое покрытие, причем указанные ядерные кристаллы имеют средний диаметр от 2 до 1 0 нм, указанные частицы имеют средний диаметр до 30 нм, момент магнитного насыщения более 50 электромагнитных единиц/г ЕеО_х, величину г₁ выше 15 мМ^-1с^-1 (измеренную при 0,47 Тесла и 40°С), а указанное покрытие содержит расщепленный окислением крахмал, причем предпочтительно указанное покрытие дополнительно содержит функционализированный полиалкиленоксид, причем более предпочтительно указанные ядерные кристаллы имеют средний диаметр от 4 до 8 нм, а указанные частицы имеют средний диаметр до 1 5 нм.

   39. Композиция по п.38, отличающаяся тем, что в указанных композитных частицах соотношение г₂/г_£ находится в интервале от 1 до 100.

   40. Композиция по п.38, отличающаяся тем, что в указанных композитных частицах соотношение г₂/г_£ находится в интервале от 1 до 10.

   41. Композиция по п.38, отличающаяся тем, что в указанных композитных частицах соотношение г₂/г_£ составляет менее 3.

   42. Композиция по п.38, отличающаяся тем, что в указанных композитных частицах соотношение г₂/г_£ находится в интервале от 1,2 до 3.

   43. Способ формирования изображения повышенной контрастности человеческого или не человеческого организма, при котором в указанный организм вводят композицию по любому из пп.37-42 и формируют изображение, по меньшей мере, части указанного организма, в котором распределяется указанный агент.

   44. Способ определения распределения контрастного агента внутри человеческого или не человеческого организма, при котором в указанный организм вводят композицию по любому из пп.37-42 и детектируют сигнал из указанного организма, который излучают или модифицируют указанные частицы.

   45. Применение композитной магнитной частицы по любому из пп.1-36 или полученной по любому из пп.1-36 для производства диагно стической композиции контрастного агента для использования в методе диагностики, включающем в себя введение указанной композиции в живой человеческий или не человеческий организм.