JP4109245B2 - 分析装置及び分析方法 - Google Patents
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- Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
Description
試薬A;試料液中の分析対象物と特異的に結合する第1特異結合物質が可視標識aによって標識された標識a化第1特異結合物質
試薬B;第1特異結合物質に特異的に結合する分析対象物もしくはその変性体が可視標識aとは可視的信号が異なる可視標識bによって標識された標識b化分析対象物もしくはその変性体
試薬C;標識a化第1特異結合物質の特異性を損なうことなく第1特異結合物質に特異的に結合可能な第2特異結合物質
試薬B;第1特異結合物質に特異的に結合する分析対象物もしくはその変性体が可視標識aとは可視的信号が異なる可視標識bによって標識された標識b化分析対象物もしくはその変性体
試薬D;試料液中の分析対象物と特異的に結合する第1特異結合物質と、第1特異結合物質及び分析対象物と結合しない第3特異結合物質とが標識aによって標識された標識a化第1特異結合物質/第3特異結合物質
試薬E;試料液中の分析対象物と特異的に結合する第1特異結合物質の特異性を損なうことなく第3特異結合物質に特異的に結合可能な第4特異結合物質
試薬A;試料液中の分析対象物と特異的に結合する第1特異結合物質が可視標識aによって標識された標識a化第1特異結合物質
試薬B;第1特異結合物質に特異的に結合する分析対象物もしくはその変性体が可視標識aとは可視的信号が異なる可視標識bによって標識された標識b化分析対象物もしくはその変性体
試薬B;第1特異結合物質に特異的に結合する分析対象物もしくはその変性体が可視標識aとは可視的信号が異なる可視標識bによって標識された標識b化分析対象物もしくはその変性体
試薬D;試料液中の分析対象物と特異的に結合する第1特異結合物質と、第1特異結合物質及び分析対象物と結合しない第3特異結合物質とが標識aによって標識された標識a化第1特異結合物質/第3特異結合物質
試薬E;試料液中の分析対象物と特異的に結合する第1特異結合物質の特異性を損なうことなく第3特異結合物質に特異的に結合可能な第4特異結合物質
試薬A;試料液中の分析対象物と特異的に結合する第1特異結合物質が可視標識aによって標識された標識a化第1特異結合物質
試薬F;第5特異結合物質が可視標識cによって標識された標識c化第5特異結合物質
試薬G;第5結合物質と相互に結合可能な第6結合物質
この実施例1では、エストロゲンの半定量測定を行うものであり、以下の工程を有している。
刊行物「生体の科学 38(5)376−378(田中健志著)」記載の方法に従って合成した。
刊行物「生体の科学 38(5)376−378(田中健志著)」記載の方法に従って合成した。
約0.1μmの粒径を有する赤色ラテックス懸濁液(固形分重量10%)0.1mlをマイクロチューブにとり、25mM MES(pH6.1)緩衝液0.9mlを加えて希釈する。マイクロ遠心分離機により6000rpmで30分間遠心分離を行い、沈下した粒子をチューブに残して上澄み液をデカントにより廃棄する。再び25mM MES(pH6.1)緩衝液1.0mlを加えて粒子を分散させる。この洗浄操作をさらに3回繰り返す。最終的に得られた沈下粒子は、25mM MES(pH6.1)緩衝液1.0mlを加えて分散させ約1%重量固形分を有するラテックス粒子懸濁液を得る。
約0.4μmの粒径を有する青色ラテックス懸濁液(固形分重量10%)0.1mlをマイクロチューブにとり、25mM MES(pH6.1)緩衝液0.9mlを加えて希釈する。マイクロ遠心分離機により6000rpmで30分間遠心分離を行い、沈下した粒子をチューブに残して上澄み液をデカントにより廃棄する。再び25mM MES(pH6.1)緩衝液1.0mlを加えて粒子を分散させる。この洗浄操作をさらに3回繰り返す。最終的に得られた沈下粒子は、25mM MES(pH6.1)緩衝液1.0mlを加えて分散させ約1%重量固形分を有するラテックス粒子懸濁液を得る。この懸濁液を抗エストラジオール抗体300μgと混合し、混合した懸濁液を室温で4時間ロータリーミキサーにより攪拌する。この懸濁液をマイクロ遠心分離機にて6000rpmで30分間遠心分離にかけ、上澄み液をデカントにより廃棄する。
上記(1−c)及び(1−d)で得られた赤色ラテックス標識化エストロン−BSA及び青色ラテックス標識化抗エストラジオール抗体をそれぞれ1重量%のBSAと2重量%のショ糖とを含む100mM トリス緩衝液を用いて希釈する。このとき、赤色ラテックス標識化エストロン−BSA及び青色ラテックス標識化抗エストラジオール抗体がともに10容量%となるように希釈する。得られた溶液1mlを10×200mmの試薬紙用シート(Whatman社製、F075−17)に塗布し、80℃の熱風乾燥器中で5分間乾燥させ、使用するまで室温で乾燥剤入りのバッグに保存する。
25×200mmのWhatman社製ニトロセルロースメンブラン(PuraBind、A−RP、孔径8μm)を机上に固定し、その一端から10mmの位置に抗マウスIgG抗体(1mg/ml)溶液をディスペンサーを用いて塗布幅が約1.0mmのライン状となるように塗布する。塗布後、80℃の熱風乾燥器中で5分間乾燥させ、室温で乾燥剤入りのバッグに使用するまで保存する。これにより図1における判定ライン部4が形成された判定紙3が得られる。
片面が粘着加工された台紙1(厚み250μm、縦125mm、横180mm、リンテック社製)を粘着面を上にして机上に固定し、その一端から30mmの位置に、その一端と平行に判定紙3を貼り合わせる。続いて、その一端から22mmの位置に、その一端と平行に試薬紙5を貼り合わせる。この貼り合わせにより、判定紙3と試薬紙5とが約2mmの重なりを有して連設する。次に、その一端から14mmの位置に、その一端と平行に試薬紙6を貼り合わせる。この貼り合わせにより、試薬紙5と試薬紙6とが約2mmの重なりを有して連設する。
試料液として生理食塩水溶液にて所定の濃度(0〜5000ng/ml)に希釈したエストラジオール−17−グルクロナイド(シグマ社製、以下E217Gとする)溶液を準備した。上述によって作製した分析装置を水平な机上に置き、試料液添加部材7の一端から各濃度のE217G溶液をマイクロピペットで100μlずつ添加後、判定ライン部4での発色の色調を観察した。結果を表1に示す。
この実施例では、エストロゲンの半定量測定を行うものである。
実施例1で製造したものを使用した。
実施例1で製造したものを使用した。
イムノアッセイに用いる金コロイド粒子は様々な粒子径のものが市販されており、また当業者においても容易に製造することができる。
約0.3μmの粒径を有する青色ラテックス懸濁液(固形分重量10%)0.1mlをマイクロチューブにとり、25mM MES(pH6.1)緩衝液0.9mlを加えて希釈する。マイクロ遠心分離機により6000rpmで30分間遠心分離を行い、沈下した粒子をチューブに残して上澄み液をデカントにより廃棄する。再び25mM MES(pH6.1)緩衝液1.0mlを加えて粒子を分散させる。この洗浄操作をさらに3回繰り返す。最終的に得られた沈下粒子は、25mM MES(pH6.1)緩衝液1.0mlを加えて分散させ約1%重量固形分を有するラテックス粒子懸濁液を得る。この懸濁液を抗β−hCGマウスモノクローナル抗体700μgと混合し、混合した懸濁液を室温で4時間ロータリーミキサーにより攪拌する。この懸濁液をマイクロ遠心分離機にて6000rpmで30分間遠心分離にかけ、上澄み液をデカントにより捨てる。
500IU hCG溶液を1.5mlをマイクロチューブにとり、上記(2−d)で得られた青色ラテックス標識化β−hCGマウスモノクローナル抗体を100μl加え、懸濁する。この懸濁液を室温で30分間ロータリーミキサーにより攪拌する。この懸濁液をマイクロ遠心分離機にて12000rpmで30分間遠心分離にかけ、上澄み液をデカントにより捨てる。得られた沈下粒子を上記の洗浄方法で20mM PB(pH7.4)緩衝液1.0mlを用いて3回の洗浄操作を行う。最後に0.5%重量のBSAを含む25mM HEPES(pH7.0)緩衝液中に分散させ、使用するまで4℃で保存する。
上記(2−c)及び(2−e)で得られた金コロイド標識化抗エストラジオール抗体及び青色ラテックス標識化β−hCGマウスモノクローナル抗体−hCG複合体を1重量%のBSAと2重量%のショ糖とを含む100mM トリス緩衝液を用いて希釈する。このとき、金コロイド標識化抗エストラジオール抗体及び「青色ラテックス標識化β−hCGマウスモノクローナル抗体−hCG」複合体がともに10容量%となるように希釈する。得られた溶液1mlを10×200mmの試薬紙用シート(Whatman社製、F075−17)に塗布し、80℃の熱風乾燥器中で5分間乾燥させ、使用するまで室温で乾燥剤入りのバッグに保存する。
25×200mmのWhatman社製ニトロセルロースメンブラン(PuraBind、A−RP、孔径8μm)を机上に固定し、その一端から10mmの位置にβ−hCGマウスモノクローナル抗体溶液とエストロン−BSA溶液の混合溶液(0.5mg/ml)をディスペンサーを用いて塗布幅が約1.0mmのライン状となるように塗布する。塗布後、80℃の熱風乾燥器中で5分間乾燥させ、室温で乾燥剤入りのバッグに使用するまで保存する。これにより図12における判定ライン部16が形成された判定紙15が得られる。
片面が粘着加工された台紙13(厚み250μm、縦125mm、横180mm、リンテック社製)を粘着面を上にして机上に固定し、その一端から30mmの位置に、その一端と平行に判定紙15を貼り合わせる。続いて、その一端から22mmの位置に、その一端と平行に試薬紙17を貼り合わせる。この貼り合わせにより、判定紙15と試薬紙17とが約2mmの重なりを有して連設する。さらに一端を合わせて、ベンリーゼ(旭化成社製)からなる縦30mm、横200mmの試料液添加部材18を試薬紙17を一部覆うように貼り合わせる。また台紙13の他端から32mmの位置に、その他端と平行に、GF−F(Whatman社製)からなる縦40mm、横200mmのガラス繊維濾紙を貼り合わせて吸収体14とする。ここでも判定紙15と吸収体14とが約2mmの重なりをもって連設する。さらにその他端を合わせて、縦110mm、横200mmの透明エステルフィルム(リンテック社製)からなる保護カバー24を粘着面側を下にして貼り合わせる。この貼り合わせた積層シートを各部材を直角に横断するように、幅6mmの間隔でロータリーカッターによりストリップ状に順次切断する。このことによって約28本の分析装置が完成し、分析試験で使用するまで室温で乾燥剤入りのバッグに保存する。
試料液として生理食塩水溶液にて所定の濃度(0〜5000ng/ml)に希釈したE217G溶液を準備した。上述によって作製した分析装置を水平な机上に置き、試料液添加部材18の一端から各濃度のE217G溶液をマイクロピペットで100μlずつ添加後、判定ライン部16での発色の色調を観察した。結果を表2に示す。
2,14 吸収体
3,15 判定紙
4,16 判定ライン部
5,17 試薬紙
6 試薬紙
7,18 試料液添加部材
8 標識b化分析対象物もしくはその変性体
9,19 標識a化第1特異結合物質
10 第2特異結合物質
11,23 試験片
12,24 保護カバー
20 標識c化第5抗体−抗原複合体
21 分析対象物もしくは変性体
22 第6抗体
25 第3特異結合物質
26 第4特異結合物質
27 標識a化第1特異結合物質/第3特異結合物質
28 pHインジケーター
Claims (21)
- 試料液の湿潤展開方向に沿って試薬区域と判定区域とが配置され、異なった可視標識をそれぞれ有する試薬A及び試薬Bが前記試薬区域に分離状態で溶出流動可能に保持され、試薬区域から判定区域への試料液の湿潤展開に伴う試薬Aに対する試料液中の分析対象物と試薬Bと間での競合反応により競合反応物が生成可能となっており、この競合反応物を捕捉する試薬Cが前記判定区域に固定化されており、試薬Cに捕捉された競合反応物からの可視的信号の重なり度合いに基づいて試料液中の分析対象物の濃度の検知が可能となっていることを特徴とする分析装置。
試薬A;試料液中の分析対象物と特異的に結合する第1特異結合物質が可視標識aによって標識された標識a化第1特異結合物質
試薬B;第1特異結合物質に特異的に結合する分析対象物もしくはその変性体が可視標識aとは可視的信号が異なる可視標識bによって標識された標識b化分析対象物もしくはその変性体
試薬C;標識a化第1特異結合物質の特異性を損なうことなく第1特異結合物質に特異的に結合可能な第2特異結合物質 - 試料液の湿潤展開方向に沿って試薬区域と判定区域とが配置され、異なった可視標識をそれぞれ有する試薬B及び試薬Dが前記試薬区域に分離状態で溶出流動可能に保持され、試薬区域から判定区域への試料液の湿潤展開に伴う試薬Dに対する試料液中の分析対象物と試薬Bと間での競合反応により競合反応物が生成可能となっており、この競合反応物を捕捉する試薬Eが前記判定区域に固定化されており、試薬Eに捕捉された競合反応物からの可視的信号の重なり度合いに基づいて試料液中の分析対象物の濃度の検知が可能となっていることを特徴とする分析装置。
試薬B;第1特異結合物質に特異的に結合する分析対象物もしくはその変性体が可視標識aとは可視的信号が異なる可視標識bによって標識された標識b化分析対象物もしくはその変性体
試薬D;試料液中の分析対象物と特異的に結合する第1特異結合物質と、第1特異結合物質及び分析対象物と結合しない第3特異結合物質とが標識aによって標識された標識a化第1特異結合物質/第3特異結合物質
試薬E;試料液中の分析対象物と特異的に結合する第1特異結合物質の特異性を損なうことなく第3特異結合物質に特異的に結合可能な第4特異結合物質 - 試料液の湿潤展開方向に沿って試薬区域と判定区域とが配置され、可視標識を有する試薬Bが前記試薬区域に溶出流動可能に保持され、試薬Bと異なった可視標識を有する試薬Aが前記判定区域に直接的または間接的に固定されており、試薬区域から判定区域への試料液の湿潤展開に伴う試薬B及び試料液中の分析対象物の間での試薬Aへの競合的捕捉による可視的信号の重なり度合いに基づいて試料液中の分析対象物の濃度の検知が可能となっていることを特徴とする分析装置。
試薬A;試料液中の分析対象物と特異的に結合する第1特異結合物質が可視標識aによって標識された標識a化第1特異結合物質
試薬B;第1特異結合物質に特異的に結合する分析対象物もしくはその変性体が可視標識aとは可視的信号が異なる可視標識bによって標識された標識b化分析対象物もしくはその変性体 - 前記判定区域に試薬Cが固定されており、前記試薬Aは試薬Cに結合されることにより判定区域に固定化されていることを特徴とする請求項3記載の分析装置。
- 試料液の湿潤展開方向に沿って試薬区域と判定区域とが配置され、可視標識を有する試薬Bが前記試薬区域に溶出流動可能に保持され、前記判定区域に試薬Eが固定化されると共にこの試薬Eに試薬Dが固定化されており、試薬区域から判定区域への試料液の湿潤展開に伴う試薬B及び試料液中の分析対象物の間での試薬Dへの競合的捕捉による可視的信号の重なり度合いに基づいて試料液中の分析対象物の濃度の検知が可能となっていることを特徴とする分析装置。
試薬B;第1特異結合物質に特異的に結合する分析対象物もしくはその変性体が可視標識aとは可視的信号が異なる可視標識bによって標識された標識b化分析対象物もしくはその変性体
試薬D;試料液中の分析対象物と特異的に結合する第1特異結合物質と、第1特異結合物質及び分析対象物と結合しない第3特異結合物質とが標識aによって標識された標識a化第1特異結合物質/第3特異結合物質
試薬E;試料液中の分析対象物と特異的に結合する第1特異結合物質の特異性を損なうことなく第3特異結合物質に特異的に結合可能な第4特異結合物質 - 試料液の湿潤展開方向に沿って試薬区域と判定区域とが配置され、試料液中の分析対象物と特異的に結合し、かつ可視標識aによって標識された標識a化第1特異結合物質が試薬区域に溶出流動可能に保持され、この標識a化第1特異結合物質と特異的に結合可能な分析対象物もしくはその変性体が判定区域に固定化されており、試薬区域から判定区域への試料液の湿潤展開に伴って試料液中の分析対象物及び判定区域中の分析対象物もしくはその変性体との間での前記標識a化第1特異結合物質に対する競合的捕捉と、この競合的捕捉と独立した可視的信号とが同時に判定区域に生成され、この独立した可視的信号と前記可視標識aとの重なり度合いに基づいて試料液中の分析対象物の濃度の検知が可能となっていることを特徴とする分析装置。
- 試料液の湿潤展開方向に沿って試薬区域と判定区域とが配置され、異なった可視標識をそれぞれ有する試薬A及び試薬Fが前記試薬区域に溶出流動可能に保持され、前記判定区域に分析対象物もしくはその変性体と、試薬Fと結合可能な試薬Gが固定化されており、試薬区域から判定区域への試料液の湿潤展開に伴う試薬Fと試薬Gとの結合によって前記独立した可視的信号が生成可能となっていることを特徴する請求項6記載の分析装置。
試薬A;試料液中の分析対象物と特異的に結合する第1特異結合物質が可視標識aによって標識された標識a化第1特異結合物質
試薬F;第5特異結合物質が可視標識cによって標識された標識c化第5特異結合物質
試薬G;第5結合物質と相互に結合可能な第6結合物質 - 前記独立した可視的信号が試料液の添加以前から判定区域に生じていることを特徴とする請求項6記載の分析装置。
- 前記独立した可視的信号が判定区域に固定化された試薬Gと試薬Gに結合した試薬Fとによって生じていることを特徴とする請求項6または8記載の分析装置。
- 前記独立した可視的信号が判定区域に固定化されたpH指示薬、色素、着色粒子または着色した小胞であることを特徴とする請求項6または8記載の分析装置。
- 前記試料液が、尿、血液、溶血血液、血漿、血清、唾液、汗及び涙液等の体液、池、河川及び工業用水等の水、その他食品、食物などからの分析対象物の抽出液であることを特徴とする請求項1〜10のいずれか1項記載の分析装置。
- 前記分析対象物が、ホルモン、生化学的メッセンジャー、ステロイド、薬物、薬物代謝産物、ポリペプチド、蛋白質、ビタミン、アルカロイド、単糖、二糖または多糖、ハプテンよりなる群から選択されるものであることを特徴とする請求項1〜10のいずれか1項記載の分析装置。
- 前記分析対象物が、甲状腺ホルモン、コルチゾール、エストロゲン、プロゲステロンまたはテストステロンからなる群から選択されるものであることを特徴とする請求項1〜10のいずれか1項記載の分析装置。
- 前記可視標識が、粒状標識、色素標識、酵素標識からなる群から選択されるものであることを特徴とする請求項1〜10のいずれか1項記載の分析装置。
- 前記粒状標識が、金コロイド、セレニウムコロイド等の金属コロイド、着色した脂質小胞(リボソーム)や小胞、着色ラテックスなどからなる群から選択されるものであることを特徴とする請求項14記載の分析装置。
- 前記第1特異結合物質及び第2特異結合物質が抗原、抗体、受容体のいずれかであることを特徴とする請求項1〜5のいずれか1項記載の分析装置。
- 相互に結合可能な第5特異結合物質及び第6特異結合物質が、抗原、抗体、もしくはそれらの結合物の組み合わせからなることを特徴とする請求項6,7のいずれか1項記載の分析装置。
- 前記第1特異結合物質がマウス由来抗体であって、相互に結合可能な第5特異結合物質及び第6特異結合物質がヤギ由来抗体及び抗ヤギウサギ由来抗体の組み合わせからなることを特徴とする請求項6,7のいずれか1項記載の分析装置。
- 試料液中の分析対象物と特異的に結合する第1特異結合物質が可視標識aによって標識された標識a化第1特異結合物質からなる試薬A、及び標識a化第1特異結合物質に特異的に結合する分析対象物もしくはその変性体が前記可視標識aとは可視的信号が異なる可視標識bによって標識された標識b化分析対象物もしくはその変性体からなる試薬Bを溶出流動可能に分離状態で保持する試薬区域と、前記標識a化第1特異結合物質の特異性を損なうことなく第1特異結合物質に特異的に結合可能な第2特異結合物質からなる試薬Cを固定化した判定区域とを試料液が湿潤展開可能なように配置し、試薬区域側より添加された試料液により試薬区域の標識a化第1特異結合物質と標識b化分析対象物もしくはその変性体が溶出されて判定区域へ浸潤展開し、その間に試料液中の分析対象物の存在によって標識a化第1特異結合物質に対し、分析対象物と標識b化分析対象物もしくはその変性体とが競合反応し、その競合反応物が判定区域の第2特異結合物質に捕捉され、捕捉された競合反応物中の可視標識a及び可視標識bの重なり度合いによって生ずる可視的信号の変化によって試料液中の分析対象物の濃度を検知することを特徴とする分析方法。
- 試料液中の分析対象物と特異的に結合する第1特異結合物質と、第1特異結合物質や分析対象物と結合しない第3特異結合物質とが可視標識aによって標識された標識a化第1特異結合物質/第3特異結合物質からなる試薬D、及び第1特異結合物質に特異的に結合する分析対象物もしくはその変性体が前記可視標識aとは可視的信号が異なる可視標識bによって標識された可動性の標識b化分析対象物もしくはその変性体からなる試薬Bを溶出流動可能に分離状態で保持する試薬区域と、前記第1特異結合物質の特異性を損なうことなく前記第3特異結合物質に特異的に結合可能な第4特異結合物質からなる試薬Eを固定化した判定区域とを試料液が湿潤展開可能なように配置し、試薬区域側より添加された試料液により、試薬区域の標識a化第1特異結合物質/第3特異結合物質と標識b化分析対象物もしくはその変性体が溶出されて判定区域へ浸潤展開し、その間に試料液中の分析対象物の存在によって標識a化第1特異結合物質/第3特異結合物質に対し、分析対象物と、標識b化分析対象物もしくはその変性体とが競合反応し、その競合反応物が第3特異結合物質を介して判定区域の第4特異結合物質に捕捉され、捕捉された競合反応物中の可視標識a及び可視標識bの重なり度合いによって生ずる可視的信号の変化によって試料液中の分析対象物の濃度を検知することを特徴とする分析方法。
- 試料液中の分析対象物と特異的に結合する第1特異結合物質が可視標識aによって標識された標識a化第1特異結合物質を溶出流動可能に保持する試薬区域と、前記標識a化第1特異結合物質と特異的に結合しうる分析対象物もしくはその変性体を固定化した判定区域とを試料液が浸潤展開可能なように配置し、試薬区域側より添加された試料液により試薬区域の標識a化第1特異結合物質が溶出されて判定区域へ浸潤展開し、試料液中の分析対象物の存在によってその分析対象物と判定区域に固定化された前記分析対象物もしくはその変性体とが標識a化第1特異結合物質に対し競合捕捉される際に、競合捕捉とは独立した可視的信号が同時に判定区域に生じ、その区域での可視標識aと前記独立した可視的信号の重なり度合いによって生ずる可視的信号の変化によって分析対象物の濃度を検知することを特徴とする分析方法。
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