JP6096586B2 - 蛍光色素で標識された可視域着色不溶性担体粒子の調製とそれを用いたイムノアッセイ法 - Google Patents
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Description
不溶性担体粒子を用いたイムノアッセイ法では、ニトロセルロースメンブレンのような繊維構造を持つ膜の所定の位置に被検出物質に特異的に結合するリガンドを固定化した試験片に、不溶性担体粒子として、金コロイド、白金金コロイド、着色ポリスチレン粒子などを用い、これに被検出物質に特異的に結合するリガンドを固定化した粒子と被検出物質を含む検体を前述の試験片に毛細管現象を利用して展開することで、ニトロセルロースメンブレン上のリガンドと再溶解した不溶性担体粒子上のリガンドで被検出物質をサンドイッチし、目視または専用の装置を用いて検出する手法が用いられている。
[1] イムノアッセイに用いる、蛍光色素で標識された可視域着色不溶性担体粒子であって、該可視域着色不溶性担体粒子による前記蛍光色素が発する波長域の蛍光の吸収が小さい、蛍光色素で標識された可視域着色不溶性担体粒子。
[2] 標識に用いる蛍光色素が、可視域着色不溶性担体粒子の吸光波長と同じ波長の色と補色の関係にある色の波長の蛍光を発する蛍光物質である、[1]の蛍光色素で標識された可視域着色不溶性担体粒子。
[3] 可視域着色不溶性担体粒子が、青色に着色された粒子であり、蛍光色素が発する蛍光の波長が450nm〜570nmである、[1]または[2]の蛍光色素で標識された可視域着色不溶性担体粒子。
[4] 可視域着色不溶性担体粒子が、青色に着色された粒子であり、蛍光色素がフルオレセインまたはフルオレセインイソチシアネートである、[3]の蛍光色素で標識された可視域着色不溶性担体粒子。
[5] 可視域着色不溶性担体粒子が、赤色に着色された粒子であり、蛍光色素が発する蛍光の波長が590nm〜750nmである、[1]または[2]の蛍光色素で標識された可視域着色不溶性担体粒子。
[6] 可視域着色不溶性担体粒子が、赤色に着色された粒子であり、蛍光色素がATBTA-EU3+である、[5]の蛍光色素で標識された可視域着色不溶性担体粒子。
[7] 不溶性担体粒子がポリスチレンラテックス粒子である、[1]〜[6]のいずれかの蛍光色素で標識された可視域着色不溶性担体粒子。
[8] [1]〜[7]のいずれかの蛍光色素で標識された可視域着色不溶性担体粒子を用いたイムノアッセイ方法。
[9] 測定しようとする抗原または抗体を含む抗原抗体複合体に[1]〜[7]のいずれかの蛍光色素で標識された可視域着色不溶性担体粒子を結合させ、不溶性担体粒子の着色を目視で観察するか、および/または不溶性担体粒子から発せられる蛍光を測定することにより抗原抗体複合体の存在を決定することを含む、[8]のイムノアッセイ法。
[10] イムノクロマト法である、[8]または[9]のイムノアッセイ法。
[11] [1]〜[7]のいずれかの蛍光色素で標識された可視域着色不溶性担体粒子を含むイムノアッセイキット。
[12](i) 可視域着色不溶性担体粒子の吸光スペクトルを測定する工程、
(ii) 該可視域着色不溶性担体粒子の吸収が少ない波長域を決定する工程、
(iii) 該波長域の蛍光を発する蛍光色素を選択する工程、および
(iv) 選択した蛍光色素で前記可視域着色不溶性担体粒子を標識する工程、
を含む、[1]〜[7]のいずれかの蛍光色素で標識された可視域着色不溶性担体粒子を調製する方法。
用いる粒子の粒径は、10nm〜数百nm、好ましくは30nm〜500nmである。
赤色 620〜750nm
橙色 590〜620nm
黄色 570〜590nm
緑色 495〜570nm
青色 450〜495nm
紫色 380〜450nm
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希土類錯体
ATBTA-EU3+(616)等。
蛍光タンパク質
Sirius(424)、CFP(505)、AcGFP(505)、EGFP(509)、EYFP(527)、YFP(527)、ZsYellow(539)、mOrange(562)、DsRed2(582)、AsRed2(592)、mRFP1(607)、mCherry(610)、HcRed(618)、mRasberry(625)、mPlum(649)等。
実施例1 官能基としてカルボキシル基を持つ着色ポリスチレン粒子を用いた蛍光色素で標識された可視域着色蛍光粒子の調製
10mM HEPES(pH7.0)緩衝液で官能基としてカルボキシル基をもつ複数色の着色ポリスチレン粒子(表1および図1〜3参照)を0.1%になるように希釈し、これにユウロピウムキレート蛍光標識剤であるATBTA-Eu3+(東京化成工業株式会社製)を0.1mg/mLになるように加えた。攪拌後、カルボジイミドを1%になるように加え攪拌し、室温で、1時間反応させた。7000g、30分間遠心後、上清を取り除き、50mM Tris(pH9.0)、3%BSAに再浮遊した。
10mM HEPES(pH7.0)緩衝液で官能基としてカルボキシル基をもつ数色の着色ポリスチレン粒子(表1および図1〜3参照)を0.1%になるように希釈し、これに6-アミノフルオレセイン(東京化成工業株式会社製)を0.1mg/mLになるように加えた。攪拌後、カルボジイミドを1%になるように加え攪拌し、室温で、1時間反応させた。7000g、30分間遠心後、上清を取り除き、50mM Tris(pH9.0)、3%BSAに再浮遊した。
1.で調製したユウロピウムキレート蛍光標識剤結合ポリスチレン粒子を0.01%になるように50mM Tris(pH9.0)、3%BSAで希釈し、100μLを96ウェルのフルオロヌンクプレートのウェルに加え、蛍光プレートリーダー(MTP-650FA;コロナ電気株式会社製)を用いて、340nm ex/615nm emで蛍光強度を測定した。対照として、50mM Tris(pH9.0)、3%BSAのみ、ユウロピウムキレート蛍光標識剤を結合していない可視域着色ポリスチレン粒子も同時に測定を行った。
2.で調製したフルオレセイン蛍光標識剤結合ポリスチレン粒子を0.05%になるように50mM Tris(pH9.0)、3%BSAで希釈し、100μLを96ウェルのフルオロヌンクプレートのウェルに加え、蛍光プレートリーダー(MTP-650FA;コロナ電気株式会社製)を用いて、490nm ex/530nm emで蛍光強度を測定した。対照として、50mM Tris(pH9.0)、3%BSAのみ、フルオレセイン蛍光標識剤を結合していない可視域着色ポリスチレン粒子も同時に測定を行った。
実施例2においては、可視域着色ポリスチレン粒子を見比べ、視認性の高かった赤色ポリスチレン粒子および青色ポリスチレン粒子Iを材料として検証を実施した。
A型インフルエンザウイルス抗原をBALB/cマウスに免疫し、一定期間飼育したマウスから脾臓を摘出し、ケラーらの方法(Kohler et al., Nature, vol, 256, p495-497(1975))によりマウスミエローマ細胞(P3×63)と融合した。得られた融合細胞(ハイブリドーマ)を、37℃インキュベーター中で維持し、A型インフルエンザウイルスNP抗原を固相したプレートを用いたELISAにより上清の抗体活性を確認しながら細胞の純化(単クローン化)を行った。取得した該細胞2株をそれぞれプリスタン処理したBALB/cマウスに腹腔投与し、約2週間後、抗体含有腹水を採取した。
精製した抗A型インフルエンザウイルスNP抗体を1.0mg/mLになるように精製水で希釈した液をPETフィルムで裏打ちされたニトロセルロースメンブレン(Unisart CN 95;Sartorius Stedim Biotech社製)の所定の位置に線状に塗布し、45℃、30分間乾燥させ、抗A型インフルエンザウイルスNP抗体固定化メンブレンを得た(以下、抗体固定化メンブレンとする)。
ニトロセルロースメンブレンへの固定化に使用しなかったもう一つの精製した抗A型インフルエンザウイルスNP抗体を1.0mg/mLになるように精製水で希釈し、これに赤色ポリスチレン粒子または青色ポリスチレン粒子Iを0.1%になるように加え、攪拌後、さらに赤色ポリスチレン粒子と抗体の混合液には、ユウロピウムキレート蛍光標識剤であるATBTA-Eu3+(東京化成工業株式会社製)を0.1mg/mLになるように加えた。一方、青色ポリスチレン粒子Iと抗体の混合液には、6-アミノフルオレセイン(東京化成工業株式会社製)を0.1mg/mLになるように加え、攪拌した。それぞれにカルボジイミドを1%になるように加え、さらに攪拌した。室温で、1時間反応させた。7000g、30分間遠心後、上清を取り除き、50mM Tris(pH9.0)、3%BSAに再浮遊し、抗A型インフルエンザウイルスNP抗体+ユウロピウムキレート結合赤色ポリスチレン粒子および抗A型インフルエンザウイルス抗体+フルオレセイン結合青色ポリスチレン粒子を得た。
2.で得た抗体固定化メンブレンをバッキングシート、吸収帯、コンジュゲートパッド、サンプルパッドを貼り合せて、試験片とした。
Claims (10)
- イムノアッセイに用いる、蛍光色素を結合させた可視域着色不溶性担体粒子であって、標識に用いる蛍光色素が、可視域着色不溶性担体粒子の吸光波長と同じ波長の色と補色の関係にある色の波長の蛍光を発する蛍光物質であり、可視域着色不溶性担体粒子が、450nm〜495nmの可視光線を反射する色素で着色された粒子であり、蛍光色素が発する蛍光の波長が450nm〜570nmである、蛍光色素を結合させた可視域着色不溶性担体粒子。
- 可視域着色不溶性担体粒子が、450nm〜495nmの可視光線を反射する色素で着色された粒子であり、蛍光色素がフルオレセインまたはフルオレセインイソチシアネートである、請求項1記載の蛍光色素を結合させた可視域着色不溶性担体粒子。
- イムノアッセイに用いる、蛍光色素を結合させた可視域着色不溶性担体粒子であって、標識に用いる蛍光色素が、可視域着色不溶性担体粒子の吸光波長と同じ波長の色と補色の関係にある色の波長の蛍光を発する蛍光物質であり、可視域着色不溶性担体粒子が、620nm〜750nmの可視光線を反射する色素で着色された粒子であり、蛍光色素が発する蛍光の波長が590nm〜750nmである、蛍光色素を結合させた可視域着色不溶性担体粒子。
- 可視域着色不溶性担体粒子が、620nm〜750nmの可視光線を反射する色素で着色された粒子であり、蛍光色素がATBTA-EU3+である、請求項3記載の蛍光色素を結合させた可視域着色不溶性担体粒子。
- 不溶性担体粒子がポリスチレンラテックス粒子である、請求項1〜4のいずれか1項に記載の蛍光色素を結合させた可視域着色不溶性担体粒子。
- 請求項1〜5のいずれか1項に記載の蛍光色素を結合させた可視域着色不溶性担体粒子を用いたイムノアッセイ方法。
- 測定しようとする抗原または抗体を含む抗原抗体複合体に請求項1〜5のいずれか1項に記載の蛍光色素を結合させた可視域着色不溶性担体粒子を結合させ、不溶性担体粒子の着色を目視で観察するか、および/または不溶性担体粒子から発せられる蛍光を測定することにより抗原抗体複合体の存在を決定することを含む、請求項6記載のイムノアッセイ法。
- イムノクロマト法である、請求項6または7に記載のイムノアッセイ法。
- 請求項1〜5のいずれか1項に記載の蛍光色素を結合させた可視域着色不溶性担体粒子を含むイムノアッセイキット。
- (i) 可視域着色不溶性担体粒子の吸光スペクトルを測定する工程、
(ii) 該可視域着色不溶性担体粒子の吸収が少ない波長域を決定する工程、
(iii) 該波長域の蛍光を発する蛍光色素を選択する工程、および
(iv) 選択した蛍光色素を前記可視域着色不溶性担体粒子に結合させる工程、
を含む、請求項1〜5のいずれか1項に記載の蛍光色素を結合させた可視域着色不溶性担体粒子を調製する方法。
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