JP5191450B2

JP5191450B2 - コルチゾール測定方法及びコルチゾールセンサチップ

Info

Publication number: JP5191450B2
Application number: JP2009147884A
Authority: JP
Inventors: 勝義林; 勇一岡部; 純一嶋田; 恒之芳賀
Original assignee: Nippon Telegraph and Telephone Corp
Current assignee: Nippon Telegraph and Telephone Corp
Priority date: 2009-06-22
Filing date: 2009-06-22
Publication date: 2013-05-08
Anticipated expiration: 2029-06-22
Also published as: JP2011002430A

Description

本発明は、コルチゾール測定方法及びコルチゾールセンサチップに関する。

生体の生理機能の分析及び診断のため、血中や唾液中に存在する必須ホルモンであるコルチゾールの濃度を測定する方法としては、高速液体クロマトグラフィー法（ＨＰＬＣ）、液体クロマトグラフィー／質量分析法（ＬＣ／ＭＳ）、酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）、電気化学イムノアッセイ等の一般的な分析方法が適用できる。
なかでも、ＨＰＬＣ、ＬＣ／ＭＳ及びＥＬＩＳＡは、高感度な分析が行えるために分析機関や医療機関等で広く使用されている。しかし、これらの方法は装置が大型であるうえ、複雑な測定手法を必要とするという問題がある。

一方、電気化学イムノアッセイは、装置が小型で測定手法も簡便であるという特長を持つ。
電気化学イムノアッセイでは、測定対象物質に対する一次抗体、酵素を標識した抗体（以下、「二次抗体」という。）、酵素を標識した標準物質（以下、「酵素標識抗原」という。）、酵素の基質等を用いる。このとき、酵素の基質が酸化還元物質であるか、酵素反応の生成物が酸化還元物質であれば、その酸化還元反応を電気化学的に検出することにより、測定対象物質の濃度を測定できる。

電気化学イムノアッセイの具体的な方法としては、ＥＬＩＳＡによる生体成分測定法として知られている競合法、サンドイッチ法の利用が試みられている。
競合法は、電極に固定化した一次抗体に、測定対象物質と酵素標識抗原を添加して競合的に抗原抗体反応を行わせ、さらに酵素の基質である酸化還元物質を添加することで、酵素反応による生成物を電気化学的に検出する方法である。
非特許文献１においては、競合法とキャピラリー電気泳動イムノアッセイを利用したコルチゾールの測定方法が示されている。

サンドイッチ法は、電極に固定化した一次抗体に測定対象物質を添加した後、二次抗体を添加して測定対象物質を２つの抗体でサンドイッチし、さらに酵素の基質を添加することで、酵素反応による生成物を電気化学的に検出する方法である。
非特許文献２においては、サンドイッチ法を利用した４−アミノフェノールの測定方法が示されている。

M. Jia, Z. He, W. Jin, J. Chromatogr. A, 2002, 966, 187-194 O. Niwa, Y. Xu, H. B. Halsall, W. R. Heineman, Anal Chem., 1993, 65, 1559-1563

電気化学イムノアッセイは、装置が小型で測定手法も簡便である一方、一般的にＨＰＬＣ、ＬＣ／ＭＳ及びＥＬＩＳＡによる分析に比べて感度が低い。そのため、非特許文献１のように競合法を利用しても、低濃度のコルチゾールの測定においては充分な感度を得ることが困難である。特に、血中や唾液中のコルチゾールの濃度は約５ｎＭと低濃度であり、それらのコルチゾール濃度を測定するには非常に高い検出感度が求められる。

また、本発明者等は、非特許文献２のようなサンドイッチ法をコルチゾールの測定に適用することを試みた。しかし、コルチゾールに対する検出電流の変化は観測できなかった。これは、サンドイッチ法の場合、検出には測定対象物質に対して一次抗体と二次抗体の２つの抗体が結合する必要があり、コルチゾールのように分子量が小さい生体物質の場合には結合できる抗体の数が限られることが要因であると考えられる。
以上のように、小型の装置を用いた簡便な測定方法で、血中や唾液中のコルチゾール濃度を高感度に測定することは困難である。

本発明は、ＨＰＬＣ、ＬＣ／ＭＳ及びＥＬＩＳＡに比べて装置が小型で測定方法が簡便な電気化学イムノアッセイにより、コルチゾール濃度を高感度に測定できるコルチゾール測定方法、及び該測定方法に用いるコルチゾールセンサチップの提供を目的とする。

本発明は、前記課題を解決するために以下の構成を採用した。
［１］一対のくし型電極を具備し、その少なくとも一方のくし型電極にコルチゾール抗体が固定化されたコルチゾールセンサチップを用いた、試料溶液中のコルチゾール濃度の測定方法であって、前記一対のくし型電極上の同じ位置に、測定対象物質であるコルチゾールを含む試料溶液と、ペルオキシダーゼをコルチゾールに標識した酵素標識抗原を含む標識抗原含有溶液を滴下し、前記コルチゾールと前記酵素標識抗原とを前記コルチゾール抗体に競合的に結合させる競合反応工程と、前記一対のくし型電極上の前記位置に、前記ペルオキシダーゼにより酸化される酸化還元物質を含む基質含有溶液をさらに滴下し、前記コルチゾール抗体が固定化されたくし型電極に前記酸化還元物質の酸化電位を印加して、該酸化電位を印加したくし型電極表面における前記酸化還元物質の酸化により生じる酸化電流を測定する電流測定工程と、を有するコルチゾール測定方法。
［２］前記一対のくし型電極の一方のくし型電極のみに前記コルチゾール抗体が固定化されており、該コルチゾール抗体が固定化されたくし型電極に前記酸化還元物質の酸化電位を印加し、他方のくし型電極に前記酸化還元物質の還元電位を印加する、前記［１］に記載のコルチゾール測定方法。
［３］滴下する前記酸化還元物質の量が、滴下する前記酵素標識抗原のペルオキシダーゼにより１分間で全て酸化される量である、前記［１］又は［２］に記載のコルチゾール測定方法。
［４］前記ペルオキシダーゼの酵素活性をＰ（ｕｎｉｔｓ／ｍｇ）、前記ペルオキシダーゼの分子量をＱ、前記酸化還元物質のモル数をＸ、前記酵素標識抗原のモル数をＹとしたとき、Ｘ＜Ｐ×（Ｑ×１０^−３）×Ｙを満たす、前記［３］に記載のコルチゾール測定方法。
［５］前記［２］に記載のコルチゾール測定方法に用いるコルチゾールセンサチップであって、一対のくし型電極を具備し、その一方のくし型電極のみにコルチゾール抗体が固定化されたコルチゾールセンサチップ。

本発明のコルチゾール測定方法は、ＨＰＬＣ、ＬＣ／ＭＳ及びＥＬＩＳＡに比べて装置が小型で測定方法が簡便な電気化学イムノアッセイにより、高い感度でコルチゾール濃度を測定することができる。
また、本発明は、前記コルチゾール測定方法に用いるコルチゾールセンサチップを提供する。

本発明のコルチゾールセンサチップの実施形態の一例を示した平面図である。図１のくし型電極にコルチゾール抗体を固定化した断面を示した概念図である。本発明のコルチゾールセンサチップを有する装置の実施形態の一例を示した概念図である。

［コルチゾールセンサチップ］
本発明のコルチゾールセンサチップは、本発明のコルチゾール濃度を測定するコルチゾール測定方法に用いるセンサチップである。以下、本発明のコルチゾールセンサチップの実施形態の一例を示して詳細に説明する。
本実施形態のコルチゾールセンサチップ１０（以下、「センサチップ１０」という。）は、図１に示すように、基板１１と、基板１１上に形成された一対のくし型電極１２、１３と、参照電極１４と、対向電極１５とを有している。

基板１１は、センサチップ１０によるコルチゾール濃度の測定に悪影響を及ぼさないものであれば特に限定されず、例えば、ガラス基板が挙げられる。
基板１１の形状は矩形である。ただし、基板１１の形状は、基板１１上に各電極を形成でき、それら電極上に試料溶液等を滴下してコルチゾール濃度を測定できる形状であれば特に限定されない。基板１１の大きさも特に限定されず、コルチゾール濃度の測定が可能な大きさであればよい。

くし型電極１２、１３は、相互に対応するくし型の形状を有する電極である。
くし型電極１２、１３は、公知の電極を用いることができ、例えば、銅、アルミニウム、金、銀、塩化銀、白金、クロム、ニッケル、鉄、炭素からなる電極が挙げられる。

くし型電極１２、１３は、数多くの平行電極が並列につながった電極であるため、装置を小型に保ったまま電流密度を増加させることができる。そのため、単なる平行電極を用いる場合に比べて得られる電流値が大きくなり、感度を高くすることができる。
くし型電極１２の平行する電極部分の幅ｄ_１、間隔ｄ_２は、大きな電流が得られるため小さければ小さいほど好ましいが、従来のフォトリソグラフィー技術で作製が可能という点で、０．１〜１０μｍであることが好ましい。
くし型電極１３は、くし型電極１２に対応する形状であればよく、前記幅及び間隔が同程度のものが好ましい。

くし型電極１２には、図２に示すように、単分子膜２１及び架橋分子２２を介してコルチゾール抗体２３が固定化されている。コルチゾール抗体２３は、一対のくし型電極１２、１３の両方にそれぞれ固定化されていてもよいが、本実施形態のように一方のみに固定化されていることが好ましい。
単分子膜２１は、ジスルフィド化合物を吸着させることにより電極表面上で自己組織化した単分子膜である。具体的には、１０−カルボキシジスルフィド（１０−ＣＤＤ）、７−カルボキシヘプチルジスルフィド（７−ＣＨＤ）、５−カルボキシペンチルジスルフィド（５−ＣＰＤ）、４，４’−ジチオブタン酸（ＤＤＡ）等からなる単分子膜が挙げられる。

単分子膜２１を架橋試薬で活性化し、コルチゾール抗体を反応させることにより、くし型電極１２に、単分子膜２１及び架橋分子２２を介してコルチゾール抗体２３を固定化することができる。
例えば、くし型電極１２上に１０−ＣＤＤからなる単分子膜２１を形成し、架橋分子２２である２，４−ジニトロフェニルアミンを結合させた後、コルチゾール抗体２３を反応させることで、くし型電極１２上にコルチゾール抗体２３を固定化できる。
また、くし型電極１２上に１０−ＣＤＤからなる単分子膜２１を形成し、架橋分子２２であるＮ−ヒドロキシスクシイミド及びベンゾフェノン誘導体を結合させた後、光照射によりコルチゾール抗体２３を反応させることで、くし型電極１２上にコルチゾール抗体２３を固定化できる。
ただし、くし型電極１２上へのコルチゾール抗体の固定化は、前述の方法には限定されず、公知の固定化方法を適宜使用できる。

コルチゾール抗体２３は、コルチゾールを特異的に認識するポリクローナル又はモノクローナル抗体である。コルチゾール抗体２３は、公知の方法で産生したものを用いてもよく、市販のものを用いてもよい。

くし型電極１２、１３、参照電極１４及び対向電極１５の形成方法は特に限定されず、公知の方法を用いることができる。例えば、金からなる電極を形成する場合は、以下に示す方法等が使用できる。
まず、電気ビーム（ＥＢ）描画により、基板１１上に各電極の溝になる部分を描画し、ネガレジストを行って現像により溝部分が残るようにする。そして、金を蒸着し、リフトオフにより各電極を形成する。次に、ＵＶフォトリソグラフィー（ポジレジスト）、エッチングによりそれら電極を所望の形状に整えることで所望の形状の電極を形成することができる。

参照電極１４は特に限定されず、例えば、銀／塩化銀電極が挙げられる。参照電極１４における回路を形成する部分１４ａは、金等の金属で形成されていてもよい。
また、対向電極１５は特に限定されず、例えば、白金電極、カーボン電極が挙げられる。
参照電極１４及び対向電極１５の形状は特に限定されず、例えば平板状の電極が挙げられる。

センサチップ１０によりコルチゾール濃度を測定する装置としては、例えば、図３に示すように、くし型電極１２、くし型電極１３及び参照電極１４と、電源３０とをそれぞれ連結させ、くし型電極１２、くし型電極１３及び対向電極１５と、電流計４０とをそれぞれ連結させた装置が使用できる。該装置では、電源３０により、参照電極１４を基準としてくし型電極１２及びくし型電極１３に所望の電位を印加することができる。また、電流計４０によりくし型電極１２、くし型電極１３で生じた電流を測定できる。
センサチップ１０を用いたコルチゾール濃度測定に利用できる装置としては、例えば、市販の電気化学アナライザー（商品名：ＡＬＳ６００Ｃ、ビーエーエス株式会社）が挙げられる。

［コルチゾール測定方法］
以下、本発明のコルチゾール測定方法の実施形態の一例として、前述のセンサチップ１０を用いたコルチゾール濃度の測定方法について説明する。
本実施形態のコルチゾール測定方法は、測定対象物質であるコルチゾールを含む試料溶液と、ペルオキシダーゼ酵素をコルチゾールに標識した酵素標識抗原を含む標識抗原含有溶液をくし型電極１２、１３上の同じ位置に滴下する競合反応工程と、くし型電極１２、１３上の前記位置に、前記ペルオキシダーゼ酵素に酸化される酸化還元物質を含む基質含有溶液をさらに滴下し、コルチゾール抗体２３が固定化されたくし型電極１２に前記酸化還元物質の酸化電位を印加して、該酸化電位を印加したくし型電極表面での前記酸化還元物質の酸化により生じた酸化電流を測定する電流測定工程と、を有する。

競合反応工程では、試料溶液と標識抗原含有溶液を同じ位置に滴下する。これにより、試料溶液中のコルチゾールと標識抗原含有溶液中の酵素標識抗原とが、くし型電極１２に固定化されたコルチゾール抗体２３に対して競合的に抗原抗体反応を起こす。従って、試料溶液中のコルチゾールの濃度が高いほど、コルチゾール抗体２３と結合する酵素標識抗原の量が減少する。
試料溶液と標識抗原含有溶液は、試料溶液中のコルチゾールと標識抗原含有溶液中の酵素標識抗原とを競合させることができれば、別々に滴下してもよく、予め混合した後に滴下してもよい。

酵素標識抗原のペルオキシダーゼ酵素は、基質含有溶液中の酸化還元物質を酸化する酵素であり、該酸化還元物質との組み合わせを考慮して適宜選択できる。例えば、西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）が挙げられる。

Ｍａを測定対象となるコルチゾールのモル量の最大値としたとき、滴下する酵素標識抗原のモル量Ｍｂは、０．５Ｍａ＜Ｍｂ＜２Ｍａであることが好ましく、Ｍａ＝Ｍｂであることがより好ましい。また、くし型電極１２上に固定化されているコルチゾール抗体２３のモル量Ｍｃは、０．５Ｍｂ＜Ｍｃ≦Ｍｂであることが好ましく、Ｍｂ＝Ｍｃであることがより好ましい。これらの条件を満たすことにより、試料溶液中のコルチゾールと酵素標識抗原とを競合させることで、小型の装置でも容易にコルチゾール濃度の高感度な測定が行える。

競合反応工程では、コルチゾールと酵素標識抗原を充分に反応させる点から、試料溶液及び標識抗原含有溶液を滴下してから、６０分間程度静置することが好ましい。

本実施形態のコルチゾール測定方法では、このように競合法を適用しているため、サンドイッチ法を採用した方法に比べて高感度である。つまり、サンドイッチ法では、一次抗体と二次抗体の両方が測定対象物質であるコルチゾールに結合しなければ測定できない。これに対し、本発明では測定対象物質に１つの抗体（コルチゾール抗体２３）が結合するだけで検出が可能であるため、コルチゾールのように分子量が小さい物質であってもその濃度の測定が可能となる。

電流測定工程では、酵素標識抗原のペルオキシダーゼ酵素により酸化される酸化還元物質を含有する基質含有溶液を、試料溶液及び標識抗原含有溶液を滴下した位置に滴下する。
酸化還元物質は、酵素標識抗原のペルオキシダーゼ酵素の基質である。具体的には、ＨＲＰの場合は、例えば、テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）、２，２’−アジノビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸（ＡＢＴＳ）が挙げられる。

滴下する前記酸化還元物質の量は、競合反応工程で滴下する前記酵素標識抗原のペルオキシダーゼ酵素により１分間で全て酸化される量であることが好ましい。これにより、試料溶液中のコルチゾール濃度がゼロであり、酵素標識抗原が全てコルチゾール抗体２３に結合した場合に、該酵素標識抗原のペルオキシダーゼ酵素によって全ての酸化還元物質が酸化されることとなる。そのため、酸化電位を印加したくし型電極表面上では酸化還元物質の酸化が起こらず、測定される酸化電流がゼロとなる。

具体的には、添加する酸化還元物質のモル数（Ｘ）と、コルチゾール抗体と結合する酵素標識抗原のモル数（Ｙ）の関係を、Ｘ＜ａＹとすることが好ましい。ａは使用するペルオキシダーゼ酵素から得られる定数であり、該酵素の酵素活性をＰ（ｕｎｉｔｓ／ｍｇ、ｕｎｉｔｓ＝μｍｏｌ）、分子量をＱ（ｇ／ｍｏｌ）としたとき、ａ＝Ｐ×Ｑ×１０^−３である。
ＸをａＹより小さい値に設定すれば、酵素標識抗原の量は、その全てがコルチゾール抗体２３と結合したときに、該酵素標識抗原のペルオキシダーゼ酵素が全ての酸化還元物質を酸化できる量となる。試料溶液中のコルチゾール濃度がゼロの場合には、酵素標識抗原のみがコルチゾール抗体２３と結合してくし型電極１２表面がペルオキシダーゼ酵素で覆われるので、酸化還元物質は全て該酵素により酸化され、酸化電位を印加したくし型電極では酸化が起きず酸化電流は検出されない。そのため、測定できる濃度範囲が広くなり、コルチゾールが低濃度であっても高感度に濃度を測定できる。
例えば、ＨＲＰの酵素活性Ｐは５０ｕｎｉｔｓ／ｍｇ、分子量Ｑは４４，０００ｇ／ｍｏｌであるので、ａ＝２２００である。そのため、酸化還元物質は、そのモル数ＸがＸ＜２２００×Ｙを満たすように滴下すればよい。

また、電流測定工程では、電源３０により、コルチゾール抗体２３が固定化されたくし型電極１２に、酸化還元物質の酸化電位を印加する。これにより、試料溶液中のコルチゾールがコルチゾール抗体２３と結合して、コルチゾール抗体２３に対する酵素標識抗原の結合量が減少した場合に、それに応じて酸化電位を印加したくし型電極表面で酸化還元物質が酸化され、電流計４０で酸化電流が検出される。
酸化電位は、電極表面上で酸化還元物質が酸化されるのに充分な電位であって、かつ電極の劣化あるいは他の物質の反応により酸化電流の測定に悪影響を及ぼすようなことがない範囲であればよい。例えば、酸化還元物質がＴＭＢでその酸化還元電位が２００ｍＶの場合、４００〜６００ｍＶとすることが好ましい。

電流測定工程では、試料溶液中のコルチゾール濃度が高い場合、コルチゾール抗体２３に結合するコルチゾールの数が多くなり、それに応じてコルチゾール抗体２３に結合する酵素標識抗原の数が少なくなる。そのため、酵素標識抗原のペルオキシダーゼ酵素によって酸化される酸化還元物質の数が少なくなり、一方で酸化電位を印加したくし型電極で酸化される酸化還元物質の数が多くなる。したがって、試料溶液中のコルチゾールが多いほど大きな酸化電流が得られる。
一方、試料溶液中のコルチゾール濃度が低い場合、コルチゾール抗体に結合するコルチゾールの数が少なくなり、それに応じてコルチゾール抗体に結合する酵素標識抗原の数が多くなる。そのため、酵素標識抗原のペルオキシダーゼ酵素によって酸化される酸化還元物質の数は多くなり、酸化電位を印加したくし型電極で酸化される酸化還元物質の数が少なくなる。したがって、試料溶液中のコルチゾールが少ないほど得られる酸化電流は小さくなる。
このように、本実施形態のコルチゾール測定では、試料溶液中のコルチゾール濃度に依存した酸化電流を検出される。そのため、既知濃度のコルチゾールを含む溶液を用いて予め検量線を作成しておく等の方法を用いることにより、高感度なコルチゾール濃度の測定が可能である。

本実施形態のコルチゾール測定方法では、電気化学イムノアッセイの競合法にくし型電極１２、１３を適用している。くし型電極１２、１３は数多くの平行電極が並列につながった形状の電極であるため、電流密度を増加させることができる。そのため、単なる平行電極に比べて、装置を小型に保ったまま得られる電流値を大きくし、感度を向上させることができる。

また、本実施形態のコルチゾール測定方法では、くし型電極１２のみにコルチゾール抗体２３が固定されている。本発明のコルチゾール測定方法では、一方のくし型電極１２のみにコルチゾール抗体２３を固定化しておき、くし型電極１２に酸化還元物質の酸化電位、くし型電極１３に該酸化還元物質の還元電位をそれぞれ印加することが好ましい。
これにより、酸化電位を印加したくし型電極１２で酸化された酸化還元物質は、拡散により還元電位を印加したくし型電極１３に到達し、該くし型電極１３で還元される。くし型電極１３で還元された酸化還元物質は、拡散により再度くし型電極１２に到達して酸化される。そのため、前記形態で測定を行うことで繰り返し酸化還元反応を起こさせることができるようになり、さらに高感度なコルチゾール濃度測定が可能となる。

くし型電極１３に印加する還元電位は、酸化還元物質を還元するのに充分な電位であって、かつ電極の劣化あるいは他の物質の反応により酸化電流の測定に悪影響を及ぼすようなことがない範囲であればよい。例えば、酸化還元物質がＴＭＢでその酸化還元電位が２００ｍＶの場合、０〜−２００ｍＶであることが好ましい。

以上説明した本発明のコルチゾール測定方法は、一対のくし型電極を適用したセンサチップを用い、競合法を利用する。そのため、サンドイッチ法を適用するには小さい分子であるコルチゾールであっても、小型の装置で簡便に高感度な濃度測定が可能である。
尚、本発明のコルチゾール測定方法は、センサチップ１０及び装置１を用いる方法には限定されない。例えば、一対のくし型電極の両方の電極にコルチゾール抗体がそれぞれ固定化されたセンサチップを用いてもよい。この場合には、酸化電位は、両方のくし型電極に印加してもよく、いずれか一方のみに印加してもよい。

以下、実施例及び比較例を示して本発明を詳細に説明する。ただし、本発明は以下の記載によっては限定されない。
本実施例では、コルチゾールセンサチップを用い、電気化学イムノアッセイを利用してコルチゾールを検出した。
［実施例１］
図１に例示したセンサチップ１０を作成した。基板１１である縦Ｄ_１が１２ｍｍ、横Ｄ_２が２０ｍｍのガラス基板上に、電気ビーム（ＥＢ）描画により各電極の溝になる部分を描画し、ネガレジストを行って現像により溝部分を残し、金属蒸着、リフトオフにより各電極を形成し、さらにＵＶフォトリソグラフィー（ポジレジスト）、エッチングによりそれら電極を所望の形状に整えることで、くし型電極１２、１３、参照電極１４及び対向電極１５を有するセンサチップ１０を得た。くし型電極１２、１３の幅ｄ_１は１０μｍ、間隔ｄ_２は５μｍとした。また、各電極は、参照電極１４は銀／塩化銀、それ以外は金で形成した。

また、くし型電極１２上には、図２に例示したように、単分子膜２１と架橋分子２２をCarboxydecyl disulfide SAM試薬とし、１μｇ／ｍＬのコルチゾール抗体２３（商品名：ab1949、abcam社製）を１０μＬ固定化した。
得られたセンサチップ１０の各電極と、市販の電気化学アナライザー（商品名：ＡＬＳ６００Ｃ、ビーエーエス株式会社）とを４本の電気ケーブルにより接続して測定に用いた。
酵素標識抗原としては、西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）を標識したコルチゾールを用いた。また、酸化還元物質としては、テトラメチルベンジン（ＴＭＢ）を用いた。

（競合反応工程）
コルチゾール抗体２３を固定化したくし型電極１２とくし型電極１３上に、コルチゾール濃度が０ｎＭの試料溶液（１０μＬ）と、１００ｎｇ／ｍＬのＨＲＰ標識コルチゾールを含む標識抗原含有溶液（１０μＬ）を滴下し、１時間静置した。

（電流測定工程）
酸化還元物質であるＴＭＢの使用量は、次のように決定した。
酸化還元物質のモル数（Ｘ）と、コルチゾール抗体と結合する酵素標識抗原のモル数（Ｙ）の関係式Ｘ＜Ｐ×（Ｑ×１０^−３）×Ｙにおいて、ＨＲＰの酵素活性Ｐは５０ｕｎｉｔｓ／ｍｇ、ＨＲＰの分子量Ｑは４４，０００ｇ／ｍｏｌである。また、ＴＭＢを含む基質含有溶液の滴下体積は１０μＬとした。このとき、ａ＝２２００、Ｙ＝２．３×１０^−１４ｍｏｌであり、Ｘ＜５．０×１０^−１１となる。また、コンチゾール濃度が１０ｎＭの試料溶液の測定に少なくとも必要なＴＭＢの量は、滴下する基質含有溶液の体積を１０μＬとしたときにはＸ＞１０^−１４ｍｏｌである。
そこで、滴下する基質含有溶液中のＴＭＢの濃度は１μＭとした。

くし型電極１２とくし型電極１３上の試料溶液及び標識抗原含有溶液を滴下した位置に、さらにＴＭＢを含有する基質含有溶液（１μＭ）を１０μＬ滴下し、くし型電極１２に、参照電極１４に対して４００ｍＶの電位を印加し、くし型電極１２で得られる酸化電流を測定した。その結果、電流値は０Ａであった。
これは、試料溶液中にコルチゾールが存在しないために、くし型電極１２上に固定化されたコルチゾール抗体２３には全て酵素標識抗原が結合しており、さらに滴下した基質含有溶液中のＴＭＢの量ＸがａＹよりも小さいために、ＴＭＢが全て該酵素標識抗原のペルオキシダーゼ酵素により酸化され、くし型電極１２上で酸化が生じなかったためである。

また、試料溶液のコルチゾール濃度を０ｎＭから１００ｎＭまでの範囲で変更し、それぞれの試料溶液について前記と同様にして酸化電流を測定した。
その結果、試料溶液のコルチゾール濃度が増加するにつれて測定される酸化電流が増加し、１００ｎＭのときに測定された酸化電流は２０ｎＡであった。また、該酸化電流の測定による試料溶液中のコルチゾールの検出限界は１０ｎＭであった。
このように、実施例１では、小型の装置を用い、酸化還元物質の拡散を利用した簡便な測定により、低濃度のコルチゾールを高感度で検出できることが確認された。

［実施例２］
コルチゾール抗体２３が固定化されたくし型電極１２に、参照電極に対して４００ｍＶの電位を印加し、コルチゾール抗体が固定化されていないもう一方のくし型電極１３に、参照電極に対して０ｍＶの電位を印加した以外は、実施例１と同様にしてくし型電極１２で得られる電流を測定した。すなわち、実施例２では、酸化還元反応がつり合うレドックスサイクルを利用した測定を行った。
その結果、コルチゾール濃度が増加するにしたがってくし型電極１２で得られる酸化電流が増加し、コルチゾール濃度が０ｎＭ、１００ｎＭのとき、電流はそれぞれ０ｎＡ、１００ｎＡであり、実施例１に比べて感度が５倍に増大した。すなわち、コルチゾール濃度の検出限界は２ｎＭであった。
唾液中のコルチゾール濃度は平常時で約５ｎＭと極めて低濃度であるが、この結果から、本発明の方法であれば極めて高い感度で生体中のコルチゾール濃度が測定可能であることが確認された。

［実施例３］
酸化還元物質として、ＴＭＢの代わりに２，２’−アジノビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸（ＡＢＴＳ）を用いた以外は、実施例１と同様にして酸化電流の測定を行った。
その結果、コルチゾール濃度が増加するにしたがってくし型電極１２で得られた電流が増加し、コルチゾール濃度が０ｎＭ、１００ｎＭのとき、電流はそれぞれ０ｎＡ、２０ｎＡであった。
このように、ＴＭＢ以外の酸化還元物質を用いても、極めて高感度で生体中のコルチゾール濃度が測定可能であることが確認された。

本発明のコルチゾール濃度測定方法は、生体中のコルチゾールのような低分子の物質の濃度を、小型の装置を用いた簡便な手法により高感度で測定できるため、分析機関や医療機関はもとより、一般家庭等における生体の生理機能の分析・診断にも利用できる。

１０コルチゾールセンサチップ１１基板１２くし型電極１３くし型電極１４参照電極１５対向電極２１単分子膜２２架橋分子２３コルチゾール抗体

Claims

一対のくし型電極を具備し、その少なくとも一方のくし型電極にコルチゾール抗体が固定化されたコルチゾールセンサチップを用いた、試料溶液中のコルチゾール濃度の測定方法であって、
前記一対のくし型電極上の同じ位置に、測定対象物質であるコルチゾールを含む試料溶液と、ペルオキシダーゼをコルチゾールに標識した酵素標識抗原を含む標識抗原含有溶液を滴下し、前記コルチゾールと前記酵素標識抗原とを前記コルチゾール抗体に競合的に結合させる競合反応工程と、
前記一対のくし型電極上の前記位置に、前記ペルオキシダーゼにより酸化される酸化還元物質を含む基質含有溶液をさらに滴下し、前記コルチゾール抗体が固定化されたくし型電極に前記酸化還元物質の酸化電位を印加して、該酸化電位を印加したくし型電極表面における前記酸化還元物質の酸化により生じる酸化電流を測定する電流測定工程と、
を有するコルチゾール測定方法。
前記一対のくし型電極の一方のくし型電極のみに前記コルチゾール抗体が固定化されており、該コルチゾール抗体が固定化されたくし型電極に前記酸化還元物質の酸化電位を印加し、他方のくし型電極に前記酸化還元物質の還元電位を印加する、請求項１に記載のコルチゾール測定方法。
滴下する前記酸化還元物質の量が、滴下する前記酵素標識抗原のペルオキシダーゼにより１分間で全て酸化される量である、請求項１又は２に記載のコルチゾール測定方法。
前記ペルオキシダーゼの酵素活性をＰ（ｕｎｉｔｓ／ｍｇ）、前記ペルオキシダーゼの分子量をＱ、前記酸化還元物質のモル数をＸ、前記酵素標識抗原のモル数をＹとしたとき、Ｘ＜Ｐ×（Ｑ×１０^−３）×Ｙを満たす、請求項３に記載のコルチゾール測定方法。
請求項２に記載のコルチゾール測定方法に用いるコルチゾールセンサチップであって、
一対のくし型電極を具備し、その一方のくし型電極のみにコルチゾール抗体が固定化されたコルチゾールセンサチップ。