TR2022011905A2 - Yeni̇ bi̇r kontrol çi̇zgi̇si̇ yaklaşimina sahi̇p yanal akiş (lateral flow assay) hizli tani ki̇ti̇ - Google Patents

Abstract

Göğüs kanseri potansiyel biyobelirteci olan Haptoglobin proteininin artışını belirlemek için ilk defa hızlı bir tanı kiti tarif edilmektedir. Buna ek olarak hızlı tanı kitinde testin doğru çalışıp çalışmadığını teyit etmek amacıyla kullanılan kontrol hattında, ucuz yeni bir kontrol çizgisi (6) yaklaşımı kullanıldı. Kontrol çizgisi (6), konjuge altın nanopartikül (AuNP) ile tiyol grubuna sahip Sistein molekülü arasındaki etkileşimi temel prensip olarak kabul etmektedir. Önerilen yeni kontrol çizgisi (6) biyomolekülü tüm hızlı tanı kitlerine uygulanabilir olmasıyla seri üretimde genel maaliyeti büyük oranda düşürmektedir.

Description

TARIFNAME YENI BIR KONTROL ÇIZGISI YAKLASIMINA SAHIP YANAL AKIS (LATERAL FLOW ASSAY) HIZLI TANI KITI Teknik Alan Bulus, gögüs kanseri belirteci olan haptoglobin proteininin vücuttaki artisini tespit edebilen hassas ve yüksek dogrulukta çalisan, ucuz bir amino ait olan sistein ve altin nano partikül içerikli kontrol çizgisine sahip bir yanal akis hizli tani kiti ile ilgilidir. Önceki Teknik Yaygin olarak immünokromatografik testler veya serit testleri olarak bilinen Lateral Flow Assay (LFA), tek bir çalisma eksenine sahip immünoanalizlerdir. Ucuz ve pratik olmasi, erken teshise izin vermesi, uzun raf ömrüne sahip olmasi, seri üretime uygunlugu ve en önemlisi evde kolay bir sekilde bireylerin uygulayabilmesi gibi avantajlara sahiptir. Birçok hastaligin erken teshisi ve hastaliklarin takibinde kullanilan yanal akis test kitleri oldukça uygun fiyata sahip olmasi ve seri üretime elverisli olmasi nedeniyle büyük ilgi görmektedir. Yanal akis teknolojisi sayesinde, egitimli personel ihtiyaci ortadan kaldirilarak, kullanicinin numune bölgesine sadece birkaç damla numune ekleyerek sonucu kisa bir süre içerisinde okumasina olanak saglar. Düsük numune hacmine sahip olmasi da büyük avantajlari arasinda yer almaktadir. Tüm LFA sistemleri ayni temel prensibi kullanarak çalisir. LFA strip dizayni her biri farkli isleve sahip 4 temel bilesenden olusmaktadir. Her bilesen bir veya daha fazla amaca hizmet etmektedir. Bunlardan ilki, uygulanacak numunenin ilk temas ettigi örnek peddir. LFA sisteminin hazirlanmasi; - hedef analite karsi antikor/ antij en hazirlanmasi, - renkli etiketin seçilmesi ve hazirlanmasi, - biyo-tanima moleküllerinin etiketlenme süreci, - detektör reaktiIlerin uygun pede immobilize edilmesi, - tüm bilesenlerin bir tasiyici karta monte edilmesi, numune yollanmasi, - 10-15 dakikada sonuç alinmasi adimlarini içermektedir. Numunenin üzerine düstügü örnek pedi önceden islenmektedir. Bu ön islemin iki farkli amaci vardir. Ilk olarak, numuneye bir ön filtre uygulayarak büyük biyomolekülleri tutmasi ve bunlari sisteme uygun pH'a çekmesidir. Ikincisi, sivinin konjugat pedine homojen bir sekilde ulasmasini saglamaktir. Örnek ped, tampon sivi ile islatilmaktadir. Konjugat pedi, renkli partikül ile konjuge edilmis hedef analite özgü biyomolekülü içermektedir. Yanal akis immunoassay performansi kontrol etmede çok önemli bir rol oynamaktadir. Etiketli reaktifin homojen akisina yardimci olmak için, konjugat pedi, ön islem tamponuna daldirilir. Ön islem tamponu ayrica koloidal altin probun kurutulduktan sonra membran yüzeyine geri dönüsü olmayan bir sekilde yapismasini önlemektedir. Bu bölgede tespit edilmek istenen hedef analite afinitesi olan antikor/antijen altin nanopartikül (AuNP) ile konjuge sekilde kuru halde beklemektedir. Yanal akis tahlil sistemlerinde ana bilesen nitroselüloz (NC) membrandir. Test ve kontrol bilesenlerinin zemini olan NC membrana dagitici cihaz ile seritler çekilerek homojen ve düz çizgiler elde edilmektedir. Konjuge proteinler test çizgisinde seritlenmis sekilde bekleyen detektör antij en ile etkilesmektedir. Böylece test çizgisinde AuNP birikimi sayesinde kirmizi renkli serit meydana gelmektedir. Testin çalisip çalismadigini tespit etmek için kullanilan kontrol çizgisi hedef analitin varligi ya da yoklugu fark etmeksizin olusmalidir. Bu amaçla arastirmacilar kontrol çizgisine test çizgisi ile ilgisi olmayan bir antikor seritlemekte ve bu antikora afinitesi olan AuNP ile konjuge bir antijen/antikoru hazirlayarak konjugasyon pedinde biriktirmektedir. Böylece konjugasyon sivisinda hem test hem de kontrol çizgisine spesifik, iki farkli protein bir arada bulunmaktadir. Bir arada bulunan bu iki protein farkli izoelektrik noktalarina sahip oldugu için spesifik olmayan baglanmalara sebep olabilmektedir. Ayrica genel LFA testlerinde kontrol hattinda antikor seritlenmektedir. LFA sistemlerinde dogru kosullarin belirlenmesi kaynaklar açisindan maliyetli olmaktadir. Çünkü dogru ve spesifik bir test yapabilmek için oldukça kapsamli optimizasyon çalismasina ihtiyaç duyulmaktadir. Sadece testin dogrulugunu tespit amaciyla sistemde kullanilan kontrol hattinin hayli pahali olan antikor ve antij en çiftleriyle hazirlanmasi maliyet açisindan büyük dezavantaj olarak görülmektedir. Teknigin bilinen durumunda yer alan CN111518176A sayili Çin patent dokümaninda, kontrol hattinda l mg/mL konsantrasyona sahip "rabbit anti-NP antigen polyclonal antibody, kullanilmistir. Teknigin bilinen durumunda yer alan, Tian ve arkadaslari tarafindan yapilan bir çalismada (doi: antikorunu tespit etmeyi hedeIlemis ve çalismada kontrol çizgisine "goat anti-mouse IgG (2 mg/mL), biriktirilmistir. Böylece hedef analite afinitesi olan konjugasyon pedindeki konjuge antikor ile kontrol çizgisindeki konjuge goat anti-mouse IgG etkilesime girebilmekte ve kontrol çizgisinde renklenmeye sebep olmaktadir. Bu durum konjugasyon pedinde ekstra bir antikor kullanimi engellemis olsa da kontrol çizgisinde hala oldukça pahali olan antikorlar yogun konsantrasyonlarda kullanilmaktadir. Teknigin bilinen durumunda yer alan CN111751525A sayili Çin patent dokümaninda, kontrol hattinda "rabbit anti-mouse immunoglobulin, kullanilmistir. Teknigin bilinen durumunda yer alan CN1 1 15 37746A sayili Çin patent dokümaninda, COVID- 19 antijeni ve antikorunun kombine tespiti ve uygulamasi için gelistirilen bir testten bahsedilmektedir. Bulusta tek seferde COVID-19 antijenini ve antikorunu tespit etmek için kolloidal altin immünokromatografisi kullanilmaktadir ve konjugasyon pedinde anti-chicken Teknigin bilinen durumunda yer alan, Fei ve arkadaslari tarafindan yapilan makalede için tasarlanan testte kontrol hattinda "goat anti-mouse IgG, seritlenmis ve ideal konsantrasyon olarak 4 mg/mL uygun görülmüstür. Teknigin bilinen durumunda yer alan, Kim ve arkadaslari tarafindan yapilan makalede çesitli bilesenleri kombine ederek attirmayi hedeIlemistir. Bu amaca ulasmak için kontrol çizgisinde 1 mg/mL konsantrasyonunda "goat anti-rabbit IgG, kullanmislardir. Teknigin bilinen durumunda yer alan, Ariffin ve arkadaslari tarafindan yapilan makalede LFA testinde kontrol çizgisi olarak "rabbit IgG antibody (1 mg/mL), kullanmislardir. Teknigin bilinen durumlarinda görüldügü üzere yanal akis testlerindeki kontrol hatlarinda kullanilan antikor türü degisiklik gösterebilmesine ragmen hepsi antikor temelli testlerdir. Literatürde sunulan ve piyasada bulunan hizli tani kitlerinde üreticiler kalitatif bir test olmasindan dolayi sinyalleri güçlü tutabilmek ve hassasiyeti arttirmak için 1-4 mg/mL arasinda oldukça yogun konsantrasyonlarda antikor kullanmaktadirlar. Kullanilan antikor miktari mevcut diger teshis yöntemleri (elektrokimya, PCR vb.) ile kiyaslandiginda son derece yogun konsantrasyonlar oldugu görülür. Bu durum oldukça kapsamli optimizasyonlar gerektiren LFA sistemlerinde büyük bir dezavantaj yaratarak özellikle seri üretim için önemli bir sorun haline gelmektedir. Buna ek olarak jinekoloj ik tümörler arasinda kadin popülasyonunda en sik görülen tip olan gögüs kanserinin hizli tespiti ve takibinin düzenli araliklarla yapilmasina imkân saylayacak bir hizli tani kiti üzerine hiçbir çalisma yapilmamistir. Dolayisiyla LFA sistemlerinde dogruluk oraninin arttiran, az maliyet ile gögüs kanseri takibini de saglayabilen ve kolaylikla uzman kisi olmadan kullanilabilen bulus konusu hizli tani kitinin gelistirilmesi ihtiyaci duyulmustur. Bulusun Amaçlari ve Kisa Açiklamasi Bu bulusun amaci, kontrol çizgisindeki biyomoleküle afinitesi olan bir ligandin konjugasyon pedine eklenmesi sonucu akis sirasinda test hattinda olusabilecek spesifik olmayan baglanmalari, ek bir antikor kullanmayarak hizli tani kitlerindeki dogruluk oranini arttiran bir teknigin gerçeklestirilmesidir. Bu bulusun bir baska amaci, hastaliklara yakalanip yakalanmadiginin, virüsle enfeksiyonun olup olmadiginin ve hastaligin seyrinin anlasilabilmesi için aktif olarak kullanilan yanal akis testlerinde kontrol hattinda yüksek oranda kullanilan antikor seviyelerinin yarattigi yüksek maliyeti ortadan kaldirmayi hedefleyerek zaten ucuz olan testleri çok daha uygun hale getirecek yeni bir kontrol biyomolekülü gelistirmek. Bu amaçla kontrol çizgisi için kullanilan protein yapili IgG/anti-IgG çifti yerine, AuNP/Sistein çifti kullanilan hizli tani kitinin gerçeklestirilmesidir. Bu bulusun bir baska amaci, gögüs kanseri hastaliginin seyrinin takip edilebilmesi için, yarismali formatta tasarlanan test kiti ile Haptoglobin antijenlerin tayinini, immunokromatografik prensipler uyarinca tek bir kromatografik kaset içerisinde daha hassas gerçeklestiren hizli tani kitinin gerçeklestirilmesidir. Bu bulusun bir baska amaci, plastik tasiyici kart içerisinde bulunan konjugasyon pedinde test hattiyla etkilesecek tek tür bir protein kullanarak testin spesifikligini arttirmanin saglanmasi için hizli tani kitinin gerçeklestirilmesidir. Klinik tanida hizli testin öneminin kavranmasi yeni test tekniklerin de gelistirilmesine ivme kazandirmistir. Farkli kromatografik teknikler oldukça hassas olmakla birlikte, nispeten zaman alici, pahali enstrümantasyona ihtiyaç duyarlar. Bununla birlikte kullanimlari için yetismis eleman gerekmektedir. Bu tür geleneksel metodlar ile yanal akis test kitleri kiyaslandiginda özellikle, çok düsük maliyet, kolay kullanim, deneyimli elemana ihtiyaç duymama, hizli sonuçlar saglamasi gibi çok önemli avantajlari ön plana çikmaktadir. Ayrica yanal akis test kitlerinin ticarilestirilerek sanayiye uyarlanma olasiliklari çok daha fazladir. Bir yanal akis test kiti, bir reaksiyon membrani boyunca moleküllerin farkli hizlarla hareket ederek, immünoloj ik reaksiyonlarla tayin edilmesi prensibine dayanir. Standart bir yanal akis test kiti 4 parçadan olusur; üzerine biyolojik örnegin uygulandigi bir örnek pedi, spesifik antikorlari tasiyan test ve kontrol çizgilerinin uygulandigi bir reaksiyon membrani, atik numunenin absorblandigi bir absorbant pedi ve özel etiketlerle isaretlenmis antikorlari tasiyan konjugat ped. Konjugasyon bir karistirici yardimiyla molekülleri inkübasyona birakarak gerçeklestirilir buna pasif konjugasyon denir. Pasif konjugasyon sirasinda, nanopartikül yüzeyindeki antikor oryantasyonu, antikor ve partiküllerin basitçe birbirine karistirilmasiyla hazirlandigi için iyi kontrol edilemez. Bu nedenle, çözeltinin pH'i önemli bir rol oynar. Çözeltinin pH'ini antikorun izoelektrik noktasina yakin bir degere ayarlamanin tipik olarak en yüksek performansli konjugatlari ürettigi bilinmektedir. Fakat ayni konjugasyonda hem test hem de kontrol çizgisi için farkli antikorlar/antijenler kullanildigi için ve hepsinin izoelektrik noktasi farkli oldugu için her iki proteininde en yüksek performansi gösterecegi pHada konjugasyonu hazirlamak güçtür. Bu durum LFA testlerinde test hattinda spesifik olmayan baglanmalara ve yanlis sonuçlara neden olabilmektedir. Bir yanal akis test kitinin en önemli parametrelerinden biri de kontrol çizgisinin içerigi ve burada gerçeklesen reaksiyonudur. Kontrol çizgisi, üretilen yanal akis test kitlerinin dogru çalisip çalismadigini, herhangi bir fabrikasyon hatasinin olup olmadiginin son kullanici tarafindan anlasilmasi için tasarlanmaktadir. Örnegin, bir yanal akis test kitine örnek uygulandiktan sonra kontrol çizgisi belirmiyorsa, o testin dogrulugu yoktur ve muhtemelen bir fabrikasyon hatasi vardir. Kontrol çizgisi için genellikle IgG ve anti-IgG,ler kullanilmaktadir. Bulus, birçok arastirmaci tarafindan meme kanserinde Haptoglobin konsantrasyonunun artmasinin kadinlarda kanser belirtisi olabilecegi, deneyler ile desteklenmesiyle gögüs kanseri belirteci olan Haptoglobin proteininin vücuttaki artisini tespit edebilen hassas ve yüksek dogrulukta çalisan hizli tani kiti ile ilgilidir. Bu tani kiti içerisinde "kontrol çizgisi" olarak olusumu gösteren yeni bir reaksiyon kullanilmistir. Bu kapsamda konjugat pede yanal akis test kitinin diger unsurlariyla birlikte belirli çapa sahip altin nanopartiküller de uygulanmistir. Nitroselüloz membrana da kontrol çizgisi kismina belirli konsantrasyonda "Sistein" uygulanmistir. Tiyol gruplari, altin oksidin indirgenmesini ve tiyol gruplarinin indirgenmis altin yüzeyine dogrudan adsorpsiyonunu içeren yükseltgeme-indirgeme reaksiyonu yoluyla Au-S baglari olusturmak için oksidatif altin yüzeyi ile dogrudan reaksiyona girmektedirler [Hannoch Ron and Israel Rubinstein, Self-Assembled Monolayers on OXidized Metals. 3. Alkylthiol and Dialkyl Disulfide Assembly on Gold under Electrochemical Conditions, 1998]. Sistein,in tiyol grubu ile altinin reaksiyonu ile altin nanopartiküller kontrol çizgisinde tutuklanarak, kirmizi kontrol çizgisini olusturmuslardir. Bulusun Ayrintili Açiklamasi Bu bulusun belirtilen amaçlara ulasmasi için Haptoglobin miktarini konsantrasyon bagimli (artmasini/ azalmasini) tespit edebilen bir test hatti ve yeni kontrol biyomolekülünü içeren yanal akis hizli tani kiti ekli sekillerde gösterilmistir. Bu sekiller; Sekil-1: Hizli tani kitinin yandan patlatilmis sematik görünümüdür. Sekil-2: Hizli tani kitinin üstten sematik görünümüdür. Sekillerde yer alan parçalar tek tek numaralandirilmis olup, bu numaralarin karsiliklari asagida verilmistir. 1. Plastik tasiyici kart Örnek pedi Konjugat pedi Nitroselüloz membran Test çizgisi Kontrol çizgisi 9991593?) Absorbant pedi Bulus serumdaki Haptoglobinin kandaki miktarini tespit edebilmek için kontrol hattinda pahali antikorlara kiyasla çok daha ucuz Sistein aminoasidini kullanan yanal akis (lateral Ilow assay) hizli tani kiti olup; - tabani olusturan plastik tasiyici kart (l), - plastik tasiyici kart (l) içerisinde bulunan, kandaki özellikle kirmizi kan hücrelerinin ön filtrasyonunun saglandigi ve böylece tüm kanda girisim yapabilecek unsurlarin filtre edildigi örnek pedi (2), - plastik tasiyici kart (l) içerisinde bulunan, haptoglobin antijenini yakalayacak anti- haptoglobin antikorlarin altin nanopartiküllerle konjuge edilmis hallerini tasiyan konjugat pedi (3), - plastik tasiyici kart (l) içerisinde bulunan, belirli gözenek boyutuna sahip, nitroselülozdan imal edilmis ve tam kitinin immünokimyasal reaksiyonlarinin gerçeklestigi bir ortam olusturan nitroselüloz membran (4), - nitroselüloz membranda (4) yer alan, AuNP birikimi sayesinde kirmizi renkli serit meydana gelen Haptoglobin antij eni içeren test çizgisi (5), - nitroselüloz membranda (4) yer alan, altin ile Sistein sülfidril (tiyol) grubunun etkilesimi ile çalisan kontrol çizgisi (6), - plastik tasiyici kart (l) üzerinde yer alan, tani kiti boyunca yatay akis yapan kan örneginin, islem sonunda kitin disina akmasini önleyen ve gözenekli yapisi sayesinde kan örnegini tutan absorbant pedi (7) içermektedir. Bulusta, örnek pedi (2), ile tüm kandaki özellikle kirmizi kan hücrelerinin ön filtrasyonu saglanmis ve böylelikle tüm kanda girisim yapabilecek unsurlar filtre edilerek daha temiz örnek akisi saglanmistir. l7<20 mm boyutunda selüloz fiber örnek ped (2); %2,5 sükroz, %1 BSA, örnek pedinin (2) strip uzunlugu 14 mm<3 mm olacak sekilde ayarlanarak, plastik tasiyici karta (l) entegre edildi. Konjugat pedi (3), Haptoglobin antijenini yakalayacak monoklonal bir antikorun altin nanopartiküllerle konjuge edilmis hallerini tasimaktadir. Bununla birlikte, konjugat pedi (3), kontrol çizgisine (6) uygulanan Sistein ile etkileserek, kontrol çizgisinin (6) olusmasini saglayacak 40 nm boyutta altin nanopartiküllerini de içermektedir. Asagida altin nanopartiküllerin nasil hazirlandigi ve bu antij enlerin altin nanopartiküllerle nasil konjuge edildikleri anlatilmistir; mL kaynamakta olan filtrelenmis ultra saf su içerisine son konsantrasyonu 0,5 mM olacak sekilde HAuCL4 eklendi. Beklemeksizin arkasindan %1 Tri-Sodyum sitrat (HOC(COONa)(CH2COONa)2'2H2O) çözeltisinden 2 mL ilave edildi. 10 dk boyunca karistirilarak kaynatildi. Daha sonra oda sicakliginda 10 dk bekletilerek kullanim öncesi filtrelendi. Elde edilen AuNP,ler spektral taramayla karakterize edildi. 520 nm dalga boyunda pik gözlemlendi. ug anti-Haptoglobin eklendi. 1 saat oda sicakliginda karistirmali inkübasyon sonrasi eklenerek 30 dakika boyunca ayni kosullar altinda inkübe edildi. 10000 rpm de 20°C,de 20 dakika santrifüjlendi. Süpernatant uzaklastirilarak 1 mg/mL BSA (BIC pH 9,2 fosfat tamponu içerisinde) içeren tampon ile 1 mL de resüspanse edildi ve 10000 rpmade 20o Cade 20 dakika santrifüjlendi. Bu islem bir kez tekrar edildi. Daha sonra süpernatant uzaklastirilarak çökelek %2,5 sükroz, %1 BSA, %0,5 Tween 20 içeren içeren BIC tamponundan 500 ML konularak resüspanse edildi. Konjugatlar uygulandi. Kullanilan konjugat pedinin (3) strip uzunlugu 1 cm olacak sekilde kullanildi. Nitroselüloz membran (4), kontrol çizgisini (6), Haptoglobin antijeni içeren test çizgisini (5) içeren, belirli gözenek boyutuna sahip, nitroselülozdan imal edilmis ve tam kitinin immunokimyasal reaksiyonlarinin gerçeklestigi unsurdur. Absorbant pedinin (7) amaci ise, tam kiti boyunca yatay akis yapan kan örneginin, islem sonunda kitin disina akmasini önlemek ve gözenekli yapisi sayesinde kan örnegini tutuklamaktir. 17 mm X 20 mm boyutunda selüloz fiber ped stripin sonunda adsorbant ped (7) olarak ön muamele yapilmaksizin konumlandirilmistir. Bulusta, teknigin önceki hallerinden farkli olarak kontrol çizgisi (6) için altin nanopaitikül ve Sistein etkilesimi kullanilmistir. Kontrol çizgisinin (6) olusumu, altin ile Sisteindeki sülfidril (tiyol) grubunun etkilesimine dayanmaktadir. Böylelikle kontrol çizgisi (6) için kullanilan tavsana ait immünoglobulinlerin, test çizgisinde (5) kullanilan insan anti-IgG antikorlari ile non-spesifik baglanmalari tamamen ortadan kaldirilmis olacaktir. Bunun yani sira, kit basina düsen kontrol çizgisinin (6) maliyeti neredeyse ortadan kaldirilmis ve önemsiz hale gelmistir. Bulusun en önemli kismi testte fabrikasyon hatasi olup olmadigini teyit etmek amaciyla kullanilan kontrol hattidir. Çünkü burada kullanilan Sistein ve altin nanopartikül etkilesimi daha önce hiçbir LFA tani kitlerinde kullanilmamistir. Kontrol çizgisi (6) için kullanilan Sistein; son konsantrasyonu 50 mg/mL olacak sekilde, %0,25 Triton X-100 içeren TrisHCl (pH 8, 10 mM) tamponunda çözünerek hazirlandi. Ardindan Nitroselüloz membran (4) üzerine dispenser vasitasi ile 10 cm nitroselüloz membrana 25 ML hacimde olacak sekilde uygulandi. Bulusta kullanilan kontrol çizgisinin (6) maliyeti, teknigin önceki halleri ile kiyaslanamayacak kadar düsüktür. Tek bir kit basina düsen kontrol çizgisinin (6) maliyeti neredeyse ortadan kalkmistir. Bu durum seri üretim söz konusu oldugunda çok büyük önem tasimaktadir. Bulusun bir digeri önemli kismi test hattidir. Haptoglobin antij en test çizigisinde (5) Haptoglobin antikor ve antij eni arasindaki etkilesime dayanarak ortaya çikan renklenme sayesinde gögüs kanserinin hizli ve dogru teshisi için tam kiti gelistirilmistir. Haptoglobin antijenini içeren kisim, test çizgisidir (5). Bu antijenin immobilizasyonu için; %0,25 Triton X-100 içeren pH 8 TrisHCl tamponu içerisinde seyrelmeler yapildi. Kontrol çizgisi (6) ile arasinda yaklasik 2,5 mm uzaklik birakilacak sekilde dispenser vasitasi ile 10 cm nitroselüloz membrana (4) 25 uL hacimde uygulandi. Nitroselüloz membran (4) 37 oC,de 1,5 saat süre ile kurutuldu. Testin çalisip çalismadigi amaciyla uygulanan kontrol çizgisinin (6) belirme süresi de sadece 10 saniyedir. Detayli literatür taramasi sonucunda meme kanseri olusumu sirasinda Haptoglobin antij en seviyesinde artis tespit edildigi görüldü. Bilindigi üzere yanal akis testlerinde kontrol hattini olusturabilmek için konjugasyon pedine, kontrol hattinda sabitlenen biyomoleküle afinitesi olan etiketli bir ligand eklenmektedir. Bu durum LFA sistemlerinde nispeten zayif stabilite ve kararsiz performans gibi dezavantajlara sebep olabilmektedir. Kontrol hattinda Sisteinin kullanilmasi bu sorunu ortadan kaldirir. Sonuç olarak bu teknik testin güvenilirligini de artiran bir etkendir. Bulus konusu hizli tani kiti, yukarida özellikle haptoglobin ile açiklanmis olsa da, ilgili antijenler ve antikorlardan yararlanilarak baska beliiteç proteinlerin saptanmasi için de kullanilabilir. TR TR TR

Claims (5)

1.ISTEMLER tabani olusturan plastik tasiyici kart (l), plastik tasiyici kait (l) içerisinde bulunan, kandaki özellikle kirmizi kan hücrelerinin ön filtrasyonunun saglandigi ve böylece tüm kanda girisim yapabilecek unsurlarin filtre edildigi örnek pedi (2), plastik tasiyici kait (l) üzerinde yer alan, tani kiti boyunca yatay akis yapan kan örneginin, islem sonunda kitin disina akmasini önleyen ve gözenekli yapisi sayesinde kan örnegini tutan absorbant pedi (7) plastik tasiyici kart (l) içerisinde bulunan, antijene baglanacak antikorlarin altin nanopartiküllerle konjuge edilmis hallerini tasiyan konjugat pedi (3), plastik tasiyici kait (l) içerisinde bulunan, belirli gözenek boyutuna sahip, nitroselülozdan imal edilmis ve tam kitinin immünokimyasal reaksiyonlarinin gerçeklestigi bir ortam olusturan nitroselüloz membran (4), nitroselüloz membranda (4) yer alan, antikorlar baglanmis antij en etkilesimi sonucunda altin nanopartikül birikimi gerçeklesmesi durumunda kirmizi renkli serit meydana gelen antij en barindiran test çizgisi (5), içeren belirteç proteinlerin tespiti için test spesifikligi yüksek ve maliyeti düsük bir yanal akis (lateral Ilow assay) hizli tani kiti olup; nitroselüloz membranda (4) yer alan, altin nanopartiküller ile sülfidril (tiyol) grubunun etkilesimi ile çalisan Sistein barindiran kontrol çizgisi (6), içermesiyle karakterize edilmektedir.

2.Istem l,deki gibi bir hizli tani kiti olup; klasik yanal akis testlerinde kontrol çizgisi (6) için kullanilan protein yapili antikor/antijen çiftleri yerine, AuNP/Sistein çifti kullanilmasi ile karakterize edilmektedir.

3.Istem l,deki gibi bir hizli tani kiti olup; plastik tasiyici kart (l) içerisinde bulunan, konjugasyon pedinde test hattiyla etkilesecek tek tür bir protein kullanarak testin spesifikligini arttirmaya yardimci olacak teknik içermesiyle karakterize edilmektedir.

4. Istem l,deki gibi bir hizli tani kiti olup; 50 mg/mL sistein konsantrasyonuna sahip anilan kontrol çizgisi (6) ile karakterize edilmektedir.

5. Istem l,deki gibi bir hizli tani kiti olup; belirteç protein olarak haptoglobinin saptanmasi amaci ile anti-haptoglobin antikoru içeren anilan kojugat pedi (3) ve haptoglobin antij eni içeren anilan test çizgisi (5) ile karakterize edilmektedir. TR TR TR