JP3839483B2 - コレステリルエステル転移タンパク質(cetp)活性の調節 - Google Patents
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Description
発明の一般的な利用分野
本発明は、一般的に、ヒトおよび他の動物の循環系におけるアテローム形成活性を制御し、治療し、またはそのリスクを軽減するための、ペプチドに基づくワクチンの分野に関するものである。特に、本発明は、心臓血管疾患を予防的にまたは治療的に処置するための、あるいはリポタンパク質の相対レベルを調節してアテローム性動脈硬化症のような心臓血管疾患のリスクの低下と相関した状態を生じさせるための、内因性コレステリルエステル転移タンパク質(cholesterylester transfer protein:CETP)活性を抑制する手段を提供する組成物および方法を提供するものである。
発明の背景
コレステロールは、主に、アポリポタンパク質(Apo)と呼ばれるタンパク質部分と、リン脂質、トリグリセリド、コレステロール、コレステリルエステルを含めた種々の脂質とから成るリポタンパク質粒子(リポタンパク質)の成分として体内を循環している。アポリポタンパク質の主要なクラスは10種類存在している。すなわち、Apo A-I, Apo A-II, Apo A-IV, Apo B-48, Apo B-100, Apo C-I, Apo C-II, Apo C-III, Apo DおよびApo Eである。リポタンパク質は密度と組成により分類されている。例えば、高密度リポタンパク質(HDL)は、その一つの働きは末梢組織から肝臓へのコレステロールの輸送を調節することであるが、通常約1.063〜1.21g/mlの範囲の密度を有する。HDLはApo A-I, Apo A-II, Apo C-I, Apo C-II, Apo C-III, Apo D, Apo Eをさまざまな量で含むだけでなく、コレステロール、コレステリルエステル、リン脂質、トリグリセリドなどの脂質をさまざまな量で含有する。
HDLと対照的に、低密度リポタンパク質(LDL)は、一般に約1.019〜1.063g/mlの密度を有するものであるが、種々の脂質と結合したApo B-100を含有する。特に、脂質とコレステロールとコレステリルエステルの量は、乾燥質量の百分率として測定したとき、HDLよりもLDLの方が相当に高い。LDLはコレステロールを末梢組織へ運ぶという点で特に重要である。
超低密度リポタンパク質(VLDL)は約0.95〜1.006g/mlの密度をもち、この場合もそのタンパク質含量と脂質含量の両方の点で他のクラスのリポタンパク質と組成が異なっている。VLDLは一般にHDLやLDLよりもかなり多量のトリグリセリドを含み、特に内因的に合成されたトリグリセリドを肝臓から脂肪組織とその他の組織に運搬するという点で重要である。各種のリポタンパク質の特徴および機能が検討されてきた(例えば、Mathews, C.K. and van Holde, K.E., Biochemistry, pp. 574-576, 626-630(The Benjamin/Cummings Publishing Co., Redwood City, California, 1990); Havel, R.J.ら,“Introduction:Structure and metabolism of plasma lipoproteins(序論:血漿リポタンパク質の構造と機能)”,In The Metabolic Basis of Inherited Disease,第6版,pp. 1129-1138(Scriver, C.R.ら編)(McGraw-Hill, Inc., New York, 1989); Zannis, V.I.ら,“Genetic mutations affecting lipoproteins, their receptors, and their enzymes(リポタンパク質、その受容体およびその酵素に影響を及ぼす遺伝子変異)”,In Advances in Human Genetics, Vol. 21, pp. 145-319(Plenum Press, New Yoyk, 1993)を参照のこと)。
一般に、アテローム性動脈硬化症のような心臓血管疾患を発生しにくいことは、循環HDLの絶対レベルの増加と、さらにVLDLやLDLのような比較的低密度のリポタンパク質の循環レベルと比べたときのHDLレベルの増加にも相関している(例えば、Gordon, D.J.ら,N. Engl. J. Med., 321: 1311-1316(1989); Castelli, W.P.ら,J. Am. Med. Assoc., 256: 2835-2838(1986); Miller, N.E.ら,Am. Heart J., 113: 589-597(1987); Tall, A.R., J. Clin. Invest., 89: 379-384(1990); Tall, A.R.ら,J. Internal Med., 237: 5-12(1995)を参照のこと)。
コレステリルエステル転移タンパク質(CETP)は、HDLからTGに富むリポタンパク質(例えば、VLDLやLDL)へのコレステリルエステルの転移を媒介し、また、VLDLからHDLへのTGの逆交換をも媒介する(Tall, A.R., J. Internal Med., 237: 5-12(1995); Tall, A.R., J. Lipid Res., 34: 1255-1274(1993); Hesler, C.B.ら,J. Biol. Chem., 262: 2275-2282(1987); Quig, D.W.ら,Ann. Rev. Nutr., 10: 169-193(1990))。CETPは種々のクラスのリポタンパク質と関連したコレステリルエステルおよびトリグリセリドのレベルを調節する上で、ある役割を果たしている可能性がある。CETPの高コレステリルエステル転移活性は、心臓血管疾患のリスクの増加と関係があるLDL関連コレステロールおよびVLDL関連コレステロールのレベルの増加と相関している(例えば、Tato, F.ら,Arterioscler. Thromb. Vascular Biol., 15: 112-120(1995)を参照のこと)。
以後、本明細書においては、コレステリルエステルおよび/または非エステル化コレステロールを含めて、低密度リポタンパク質と関連した総コレステロールを表すためにLDL−Cを用いることにする。また、コレステリルエステルおよび/または非エステル化コレステロールを含めて、超低密度リポタンパク質と関連した総コレステロールを表すためにVLDL−Cを用いることにする。HDL−Cは、コレステリルエステルおよび/または非エステル化コレステロールを含めて、高密度リポタンパク質と関連した総コレステロールを表すために用いられる。
ヒト血漿から単離されたCETPは、476個のアミノ酸から成る疎水性の糖タンパク質で、ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)−ポリアクリルアミドゲルで測定した分子量は約66,000〜74,000ダルトンである(Albers, J.J.ら,Arteriosclerosis, 4: 49-58(1984); Hesler, C.B.ら,J. Biol. Chem., 262: 2275-2282(1987); Jarnagin, S.S.ら,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84: 1854-1857(1987))。ヒトCETPをコードするcDNAはクローニングされて配列決定されている(Drayna, D.ら,Nature, 327: 632-634(1987))。ヒトCETPの多形性が最近報告され、脂質代謝の疾患と関係している可能性がある(Fumeronら,J. Clin. Invest., 96: 1664-1671(1995); Juvonenら,J. Lipid Res., 36: 804-812(1995))。CETPはCE、TG、リン脂質(Barter, P.J.ら,J.Lipid Res., 21: 238-249(1980))およびリポタンパク質(例えば、Swenson, T.L.ら,J. Biol. Chem., 264: 14318-14326(1989)を参照)と結合することがわかっている。より最近では、カルボキシ末端の26個のアミノ酸により規定されるCETPの領域、とりわけアミノ酸470〜475、は中性脂肪転移に関係する中性脂肪結合にとって特に重要である(Hesler, C.B.ら,J. Biol. Chem., 263: 5020-5023(1988))が、リン脂質結合には重要でない(Wang, S.ら,J. Biol. Chem., 267: 17487-17490(1992); Wang, S.ら,J. Biol. Chem., 270: 612-618(1995)を参照)ことが明らかにされた。
CETPのコレステリルエステルおよびトリグリセリド転移活性を完全に阻害し、そしてリン脂質転移活性をより低度に阻害するモノクローナル抗体(Mab)であるTP2(正式には文献中で5C7と称される)が作られている(Hesler, C.B.ら,J. Biol. Chem., 263: 5020-5023(1988))。TP2のエピトープは、74,000ダルトンのヒトCETP分子のカルボキシ末端の26アミノ酸、すなわちアルギニン451からセリン476までのアミノ酸に位置することが決定された(Hesles, C.B.ら,(1988)参照)。TP2はヒトとウサギのCETP活性をin vitroで阻害し、ウサギのCETPをin vivoで阻害することが報告された(Yen, F.T.ら,J. Clin. Invest., 83: 2018-2024(1989)(ヒトCETPと反応するTP2); Whitlockら,J. Clin. Invest., 84: 129-137(1989)(ウサギCETPと反応するTP2))。TP2と結合するCETP領域のさらなる解析により、フェニルアラニン463とロイシン475の間のアミノ酸がTP2結合および中性脂肪(例:コレステリルエステル)転移活性にとって必須であることが明らかにされた(Wang, Sら,1992参照)。
動物モデルやヒトを用いた多くのin vivo研究から、CETP活性化は循環しているコレステロール含有HDLのレベルに影響を及ぼし得ることが示された。CETPのコレステリルエステル転移活性の増加は、LDL−Cおよび/またはVLDL−Cのレベルと比べてHDL−Cレベルの低下をもたらし、ひいてはアテローム性動脈硬化症を発生しやすくなることと相関している。部分的に精製されたヒトCETPをラット(通常はCETP活性を欠く)に注入すると、HDLからVLDLへのコレステリルエステルの移動が生じ、このことはHDLからVLDLへのコレステリルエステルのCETP促進転移と一致する(Ha, Y.C.ら,Biochim. Biophys. Acta, 833: 203-211(1985); Ha, Y.C.ら,Comp. Biochem. Physiol., 83B: 463-466(1986); Gavish, D.ら,J. Lipid Res., 28: 257-267(1987))。ヒトCETPを発現するトランスジェニックマウスは、HDLと関連したコレステロールのレベルの有意な低下を示すことが報告された(例えば、Hayek, T.ら,J. Clin. Invest., 90: 505-510(1992); Breslow, J.L.ら,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 8314-8318(1993))。さらに、野生型のマウスは通常アテローム性動脈硬化症に対して高度に抵抗性である(Breslow, J.L.ら,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 8314-8318(1993))のに、サルCETPを発現するトランスジェニックマウスは、リポタンパク質と関連したコレステロールの分布の変化、つまり、LDL−CとVLDL−Cのレベルの上昇およびHDL−Cのレベルの低下を示すことが報告された(Marotti, K.R.ら,Nature, 364: 73-75 81993))。また、サルCETPを発現するトランスジェニックマウスは、サルCETPを発現していない対照マウスと比べて、餌により誘発される重症のアテローム性動脈硬化症にかかりやすく、対照動物で見られたものよりも面積が著しく大きく、かつヒトのアテローム硬化病変で見られるものに特有の大きな病巣の外観を呈するアテローム硬化病変を大動脈に発生していた(Marottiら,前掲)。ハムスターおよびウサギへの抗ヒトCETPモノクローナル抗体(Mab)の静脈内注入は、CETP活性をin vivoで阻害し、かつHDL−Cレベルの顕著な増加、HDLトリグリセリドレベルの低下、およびHDLサイズの増加をもたらし、この場合も循環リポタンパク質中のコレステロールの分布におけるCETPの重要な役割を示唆している(Gaynor, B.J.ら,Atherosclerosis, 110: 101-109(1994)(ハムスター); Whitlock, M.E.ら,J. Clin. Invest., 84: 129-137(1989)(ウサギ))。
CETP欠損症もヒトで研究されている。例えば、日本のある家族の研究において、CETP遺伝子の非機能的対立遺伝子に関してホモ接合性である同胞は検出可能なCETP活性をもっていなかった。事実上、これらの個体はじゅく状斑をまったく示さず、さらにその家族は長寿の傾向も示した(例えば、Brown, M.L.ら,Nature, 342: 448-451(1989); Inazu, A.ら,N. Engl. J. Med., 323: 1234-1238(1990); Bisgaier, C.L.ら,J. Lipid Res., 32: 21-23(1991))。このようなホモ接合性CETP欠損個体はまた、コレステリルエステルに富む循環HDLのレベルの上昇、並びに全体的なHDLレベルの上昇および異常に大きなHDL(すなわち、通常のHDLのサイズの4〜6倍)により証明されるように、抗アテローム形成リポタンパク質のプロフィールを有することが示された(Brown, M.L.ら,1989, p. 451)。日本におけるこの突然変異の頻度は比較的高く、このことが日本の人口のかなりの割合でHDLレベルが上昇していることの説明になるかもしれない。
上記の研究は、CETPがコレステリルエステルをHDLからVLDLとLDLに転移し、それにより循環リポタンパク質の相対的なプロフィールを心臓血管疾患のリスクの増加と関連したプロフィール(例えば、HDL−Cレベルの低下とVLDL−CおよびLDL−Cレベルの増加)に変えるという点で、主要な役割を担っていることを示している。Marottiら(前掲)は彼らのデータを次のことを示すものであると解釈した。すなわち、コレステロール分布のCETP誘導変化が、両グループにアテローム形成食餌を与えたとき、動脈障害が非トランスジェニック対照マウスよりもCETP発現トランスジェニックマウスにおいて速やかに発生したことの主な理由となる、というものである。これらを合わせて考えると、既存の証拠から、CETP活性レベルの上昇は心臓血管疾患のリスクの増加を予告しうることが示唆される。かくして、内因性CETP活性の調節または抑制は、リポタンパク質の相対レベルを調節してアテローム性動脈硬化症などの心臓血管疾患を減らし、その進行をくい止め、またはその症状の軽減を引き出すための魅力的な治療法となる。
したがって、心臓血管疾患の予防または治療に役立つと思われるCETP活性を制御する組成物および方法を見つけ出すことが有利であるだろう。有効な薬理学的治療薬であるためには、化合物は、大多数のレシピエントに投与したとき、理想的には、その治療用化合物の有利な活性または効果を中和する免疫応答を引き出さず、その治療用化合物を受け取る個体において過敏状態を進行させず、かつ望ましくない副作用を生じさせないものである。また、こうした化合物および方法が連続的な治療または頻繁な反復治療の必要性を回避するならば、さらに有利であるだろう。
発明の概要
本発明は、コレステリルエステル転移タンパク質(CETP)活性の調節または抑制に有用な化合物および方法を提供する。特に、哺乳動物に投与したとき、その哺乳動物自身の内因性CETPに対する抗体応答を引き出し、その結果アテローム性動脈硬化症などの心臓血管疾患に対する予防的または治療的効果を促進するワクチンペプチドを記載する。このようなワクチンペプチドは、CETP由来の1以上のB細胞エピトープ(例えば、中性脂肪の結合またはCETPの転移活性に関与するヒトCETPタンパク質のカルボキシル末端部分に存在するもの)を含有するB細胞エピトープ部分に結合された、好ましくは共有結合された、「普遍」(universal)または「広域」(broad range)免疫原性ヘルパーT細胞エピトープを含有するヘルパーT細胞エピトープ部分を含んでなる。CETP由来の他のB細胞エピトープを使用してもよい。本発明のワクチンペプチドのB細胞エピトープ部分に用いるCETP由来のB細胞エピトープは、CETP機能をブロックするか、または血中の循環CETPのクリアランスをもたらす内因性CETPに対する抗体(自己反応性抗体)を誘導することが好ましい。加えて、本発明のワクチンペプチドで用いるB細胞エピトープは、T細胞により媒介される自己免疫肝障害を回避するように、CETPのT細胞エピトープを含まないことが好ましい。
本発明のワクチンペプチドはさまざまな「多価」の実施態様を含む。例えば、多価ペプチドは1より多い普遍または広域ヘルパーT細胞またはB細胞エピトープを免疫系に提示する。このような多価ワクチンペプチドとしては、多コピー数(2以上)の同一または異なる普遍または広域免疫原性ヘルパーT細胞エピトープおよび/または多コピー数のCETPタンパク質由来の同一または異なるB細胞エピトープをもつものがある。異なる抗体と結合可能な1より多いユニークなB細胞エピトープをもつペプチドは免疫複合体の形成を促進して、循環系からCETPを効果的にクリアランスする可能性がある。
好適な実施態様において、本発明のワクチンペプチドのヘルパーT細胞エピトープ部分は、普遍(広域)免疫原性ヘルパーT細胞エピトープ、例えば、破傷風およびジフテリア毒素に存在するもの、または百日咳菌ワクチン、カルメット-ゲラン桿菌(BCG)、ポリオワクチン、麻疹ワクチン、おたふくかぜワクチン、風疹ワクチン、ツベルクリンの精製タンパク質誘導体(purified protein derivative:PPD)、ヒト型結核菌hsp−70、およびキーホールリンペットヘモシアニンからの既知の抗原性ペプチドに存在するもの、のアミノ酸配列から誘導される。さらに、種々の普遍(つまり広域)抗原性ヘルパーT細胞エピトープは、本発明のワクチンペプチドの多重(すなわち、多価)普遍抗原性のヘルパーT細胞エピトープ部分を形成させるために、互いと結合させることができる。
本発明のワクチンペプチドのより好適な実施態様では、アミノ末端システイン残基を破傷風毒素の広域または普遍抗原性ヘルパーT細胞エピトープのアミノ酸配列に共有結合させて配列CQYIKANSKFIGITE(配列番号2のアミノ酸1〜15)を形成し、この配列をカルボキシル末端CETPアミノ酸配列FGFPEHLLVDFLQSLS(配列番号2のアミノ酸16〜31)をもつワクチンペプチドのB細胞エピトープ部分に共有結合させる。
もう一つの好適な実施態様では、多価ワクチンペプチドが、CETPの2つのB細胞エピトープからなるB細胞エピトープ部分に共有結合された、破傷風毒素の広域または普遍抗原性ヘルパーT細胞エピトープのアミノ酸配列を含んでなる。本発明のこのような好適な実施態様において、多価ワクチンペプチドは配列番号8、すなわちCQYIKANSKFIGITELFPRPDQQHSVAYTFEEDIFGFPEHLLVDFLQSLSのアミノ酸配列を有し、この配列では、アミノ末端システインが、ヒトCETPの2つのB細胞エピトープ、すなわち成熟ヒトCETP(配列番号4)のアミノ酸配列のアミノ酸349〜367およびアミノ酸461〜476、を含むアミノ酸配列に結合された、破傷風毒素由来のT細胞エピトープ(配列番号8のアミノ酸2〜15)に結合されている。本発明のさらに別の好適な実施態様において、本発明の多価ワクチンペプチドはウサギCETPの相同領域からのB細胞エピトープ(すなわち、配列番号6のアミノ酸350〜368およびアミノ酸481〜496)を含み、かつ配列番号9、すなわちMQYIKANSKFIGITERFPRPDGREAVAYRFEEDIFGFPKHLLVDFLQSLSのアミノ酸配列を有する。配列番号9のアミノ酸配列では、アミノ末端メチオニンが、ウサギCETP由来の2つのB細胞エピトープを含むアミノ酸配列に結合された、破傷風毒素由来のT細胞エピトープ(配列番号8のアミノ酸2〜15)に結合されている。
また、本発明のペプチドは、2官能性リンカー分子または免疫原性が最小であるかもしくは免疫原性がないペプチドリンカー分子を介して互いと結合させることができる。さらに、複数のペプチドを1つの共通の分子に結合させて、多コピー数のペプチドが互いに接近して配置されているペプチドアセンブリーを形成させることもできる。このような多コピー(多価)ペプチドアセンブリーはより高い免疫原性を有し、未結合の個々のペプチドを含むワクチンよりも内因性CETPに対してより効果的な免疫応答を生じる可能性がある。
本発明のワクチン化合物は薬学的に許容されるアジュバントと共に使用することもできる。
本発明の免疫原性ワクチンペプチドは、内因性CETPと反応するかまたは内因性CETPを認識する抗体の産生を引き出す。試験動物にワクチンペプチドを投与すると、総コレステロールとHDL−Cの相対レベルが低下し、アテローム性動脈硬化症病変の発生が減少した。かくして、誘導された内因性抗CETP抗体は、心臓血管疾患のリスクの低下と関連した生理的状態を促進し、アテローム性動脈硬化症プラークの形成を防止または減少させるのに直接的な作用を及ぼすようである。
【図面の簡単な説明】
図1:ウサギ(のワクチン接種)に対してワクチンペプチドを投与し、ワクチン効力を分析するために血液サンプルを回収するためのプロトコールの流れ図。対照のウサギにはワクチンペプチドを投与しなかった。
図2:70日後にウサギ(rb#1〜#4)から採取した希釈血漿サンプル中の組換えCETPに結合する抗CETP抗体に対するELISAに基づく450nmでの光学密度(O.D.)対血漿希釈度。白の四角(ウサギrb#4)は、ワクチンペプチドを投与しなかったウサギの血漿を表す(対照)。黒の四角、丸および菱形は各々、配列番号2のアミノ酸配列を有するワクチンペプチドを投与したウサギrb#1、#2および#3を表す。
図3:70日後に採取したウサギ希釈血漿サンプル中の組換えヒトCETPに結合するモノクローナル抗体(Mab)TP2の抗CETP抗体による阻害に対する競合ELISAに基づく、ウサギ(rb#1〜#4、上記図2の説明を参照)の血漿サンプルに対する450nmでの光学密度(O.D.)対血漿希釈度。
図4:ワクチン接種プロトコールにおけるウサギ(rb#1〜#4、上記図2の説明を参照)の血漿サンプルの総コレステロールの濃度(mg/dl)対時間(日数)。
図5:ワクチン接種プロトコールにおけるウサギ(rb#1〜#4、上記図2の説明を参照)の血漿サンプルのHDL−Cの濃度(mg/dl)対時間(日数)。
図6:70日後のNew Zealand白ウサギにおける非HDL/HDLの比。対照のワクチン接種していないウサギ(N=1)rb#4(白)とワクチン接種したウサギrb#1、2および3の平均(N=3)(斜線)である。
図7:ワクチン接種プロトコールにおける70日後にヒトCETP−トランスジェニックマウスから採取した希釈血漿サンプル中の組換えCETPに結合する抗CETP抗体に対するELISAに基づく450nmでの光学密度(O.D.)対血漿希釈度(半対数グラフ)。配列番号2のアミノ酸配列を有するワクチンペプチドを投与した各マウスのデータは、「+」と実線で示す。各対照のマウスのデータは、「x」と破線で示す。血漿希釈度は、1:10〜1:1,000,000(1E+1〜1E+6)の範囲であった。
図8Aおよび8B:成熟ヒトCETPの親水性、表面確率、抗原指数および両親媒性螺旋(図8A)ならびに両親媒性シートおよび二次構造(図8B)。
図9:ELISAに基づく、アテローム性動脈硬化症モデルの第I群および第II群由来の組換えヒトCETPに対する抗体力価。405nmでのOD対ウサギ血漿希釈度。
図10Aおよび10B:ELISAに基づく、アテローム性動脈硬化症モデルでのウサギCETPに対するウサギ血漿抗体力価。ワクチン接種前の血漿(図10A)およびワクチン接種後の血漿(図10B)であり、405nmでのOD対ウサギ血漿希釈度を示す。
図11:アテローム性動脈硬化症モデルでのワクチン接種前および後の動物における総コレステロール。総コレステロール(mg/dl)対日付および群を示す。
図12:アテローム性動脈硬化症モデルでのワクチン接種前および後の動物におけるHDL−Cを示す。HDL−C(mg/dl)対日付および群を示す。
図13:コレステロールを補充した食餌に対するワクチン接種したウサギおよび対照のウサギのアテローム性動脈硬化症病変のある大動脈の全面積に対する平均割合(%)の棒グラフ。個々のデータ点(菱形)、病変のある大動脈面積の平均%(斜線の棒)、データ点の標準偏差(白の棒)、p<0.01は棒グラフ間の統計的有意差を示す。
発明の詳細な説明
上記したように、アテローム性動脈硬化症の危険性の減少は、LDLおよびVLDLの循環レベルが比較的低く、HDLレベルが比較的高いことと関連している。そのような循環リポタンパク質のレベルは、少なくとも一部は、内因性レベルのCETP活性によって直接影響を受ける。特に、高CETP活性は、コレステリルエステルなどの中性脂肪のHDLからVLDLおよびLDLへの転移を促進する。従って、CETPは、循環系においてLDL、VLDLおよびHDLの相対レベルを変えるための、ヒトおよび他の動物における比較的正確な標的である(例えば、Tato, F.ら、Arteriosclero. Thromb. Vascular Biol., 15: 112-120(1995); Tall, A. R., J. Internal Med., 237: 5-12(1995)参照)。本発明は、個々の内因性CETPに対する免疫応答を促進するために有用なCETPワクチンペプチドを提供することによる、内因性CETP活性の制御に関し、それによって、アテローム性動脈硬化症の危険性の減少に関する生理学的条件、例えば高められたレベルのHDLまたは低められたレベルのLDLを促進する。さらに、本発明のワクチンペプチドを使用することによる、内因性CETPに対する免疫応答の促進により、アテローム性動脈硬化症の疑いのある組織における病変の進行に備え、予防し、または阻害することができる。
1.CETP活性を調節するためのペプチドおよび組成物
本明細書で使用するCETPワクチンペプチドとは、広域の(すなわち、範囲が広い)抗原ヘルパーT細胞エピトープのアミノ酸配列を含むヘルパーT細胞エピトープ部分、および中性脂肪結合および/または中性脂肪転移活性に関するCETPのカルボキシル末端領域などのCETPのB細胞エピトープのアミノ酸配列を含むB細胞エピトープ部分を含むペプチドである。該CETPワクチンペプチドは、抗原性である、すなわち内因性CETPに結合するペプチドに対して特異的な抗体の産生を引き出す。すなわち、本発明のCETPワクチンペプチドは、内因性CETPに特異的に結合し、および/または内因性CETP活性を阻害する抗体の生成を刺激する能力を有する、免疫原性成分である。
A.ワクチンペプチドのヘルパーT細胞エピトープ部分
本発明の組成物および方法に有用なペプチドは、ヘルパーT細胞エピトープ部分およびB細胞エピトープ部分を含む。ヘルパーT細胞エピトープ部分(簡単には「T細胞エピトープ部分」)は、少なくとも一つの広域抗原性(あるいは、広域免疫原性または範囲の広い)ヘルパーT細胞エピトープ(免疫原性担体ペプチドとも言う)から誘導されるアミノ酸配列を有し、それは、多主要組織適合遺伝子複合体(MHC)ハプロタイプによって与えることができ、それにより、ヘルパーT細胞を活性化し、次いでB細胞の増殖および分化を刺激することができるペプチドまたはその誘導体として定義される。下記でさらに説明するように、本明細書に記載するワクチンペプチドのB細胞エピトープ部分(また、CETP関連ペプチド部分とも言う)は、中性脂肪結合および/または中性脂肪転移に関与する酵素CETPのカルボキシル末端領域の一部など、CETPタンパク質のB細胞エピトープを含むアミノ酸配列を有する。
ヒトのワクチン接種に対する免疫原性担体ペプチドとして使用されている、「広域」または「範囲の広い」抗原性ヘルパーT細胞エピトープと呼ばれるものの例は、当業者には周知である。これらには、例えば、破傷風毒素(tt)およびジフテリア毒素(dt)のエピトープが含まれる(例えば、Panina-Bordignon, P.ら,Eur. J. Immunol., 19: 2237-2242(1989)(広域破傷風毒素ヘルパーT細胞エピトープペプチドの解析);Etlinger, H., Immunol. Today, 13: 52-55(1992); Valmori, D.ら、J. Immunol., 149: 717-721(1992)(候補の抗マラリアワクチンにおける広域ttエピトープの使用);Talwar, G.P.ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91: 8532-8536(1994)(抗ヒト慢性ゴナドトロピンワクチンにおける万能エピトープとしてのttおよびdtの使用);Talwar, G.P.ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91: 8532-8536(1994)を参照)。ttおよびdtの他に、本発明に有用な他のヘルパーT細胞エピトープ配列としては、百日咳菌ワクチン、カルメット−ゲラン桿菌(BCG)、ポリオワクチン、麻疹ワクチン、おたふくかぜワクチン、風疹ワクチンおよびツベルクリンの精製タンパク質誘導体(PPD)から公知の抗原ペプチドから誘導されるものが挙げられる(例えば、Etlinger, H., Immunol. Today, 13: 52-55(1992)(参考として本明細書に組み入れる。)参照)。さらに、同一または種々の異なる広域抗原性ヘルパーT細胞エピトープの2個以上のコピーを互いに連結して、本発明のワクチンペプチドの多重または多価ヘルパーT細胞エピトープを形成することもできる。例えば、本発明のワクチンペプチドは、ttヘルパーT細胞エピトープおよびdtヘルパーT細胞エピトープのアミノ酸配列を含む多重または多価ヘルパーT細胞エピトープ部分を含むように合成することができる。
さらに、本発明のワクチンペプチドの免疫原性は、ヘルパーT細胞エピトープ部分を外因性CETPのペプチド配列またはCETPに相同的な関連タンパク質に結合させることによりさらに高めることができる。そのような方法は、以前に、ヒト絨毛性ゴナドトロピンに対するヒトワクチンにおいて使用された(Talwar, G.P.ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91: 8532-8536(1994)参照;ヒト絨毛性ゴナドトロピンのβサブユニット由来のアミノ酸配列およびヒツジ黄体形成ホルモンのαサブユニットのアミノ酸配列の間に形成される異種二量体)。この方法で使用できるCETPに関連するタンパク質の例としては、例えば、リン脂質転移タンパク質および好中球殺菌性タンパク質が挙げられる(Day, J.R.ら、J. Biol. Chem., 269: 9388-91(1994); Gray, P.W.ら、J. Biol. Chem., 264: 9505-9509(1989)参照)。
キーホールリンペットヘモシアニン(KLH)などの他の免疫原性担体分子も、単独または他の広域抗原性ヘルパーT細胞エピトープと組み合わせて使用することができる。例えば、KLHは、そのアミノ酸配列に多重リシン残基を含む。これらのリシンの各々は、本明細書に記載するワクチンペプチドが結合する可能性のある部位である(例えば、マレイミド−活性化KLH、カタログNo. 77106, Pierce, Rockford, IL)。そのような配列は、ヘルパーT細胞エピトープ(すなわち、結合した多コピーのワクチンペプチドのヘルパーT細胞エピトープと結合したKLHアミノ酸配列のヘルパーT細胞エピトープ)およびCETPのB細胞エピトープ(すなわち、KLHアミノ酸配列に結合した多コピーのワクチンペプチドにおけるCETPのB細胞エピトープ)の両方に対してかなり多価であるワクチンペプチド集合体である。
最近、別の免疫原性担体分子であるMycobacterium tuberculosis由来のhsp70が、多重BおよびT細胞エピトープを含む特に効力のある抗原であることが示された(SuzueおよびYoung, J. Immunol., 156: 873-879(1996))。hsp70タンパク質は、標準的な架橋試薬によって本発明のワクチンペプチドに結合し、免疫原性を高めることができる。あるいは、本発明のワクチンペプチドをコードする核酸分子を、hsp70のアミノ末端に融合したワクチンペプチドから成る組換えタンパク質の発現を可能にする発現ベクターに挿入することができる。
好ましくは、本発明のワクチンペプチドのヘルパーT細胞エピトープ部分は、広域抗原性ttまたはdtヘルパーT細胞エピトープを含む。より好ましい態様では、本出願のペプチドは、アミノ酸配列QYIKANSKFIGITE(配列番号2のアミノ酸2〜15)およびFNNFTVSFWLRVPKVSASHLE(配列番号3)を有する広域抗原性ttヘルパーT細胞エピトープを使用する。最も好ましくは、本発明のペプチドは、アミノ酸配列QYIKANSKFIGITE(配列番号2のアミノ酸2〜15)を有する広域抗原性ttヘルパーT細胞エピトープを使用する。
上記したヘルパーT細胞エピトープの種々の例の他に、別のペプチドまたはタンパク質が本発明のワクチンペプチドのT細胞エピトープ部分に対するヘルパーT細胞エピトープとして有用であるかどうかは、クラスII(ヘルパー)T細胞エピトープに対する標準的な増殖アッセイを使用して決定できる(例えば、頁3.12.9〜3.12.14, Current Protocols in Immunology, Vol. 1(Coliganら編)(John Wiley & Sons, Inc., New York, New York, 1994)。
B.ワクチンペプチドのB細胞エピトープ(CETP−関連)部分
本明細書に記載したワクチンペプチドのB細胞エピトープ部分は、ワクチン接種した哺乳類に対して内因性のCETPタンパク質の1個以上のB細胞エピトープ、または内因性CETPとは異なるが、内因性CETPと免疫学的に(抗体)交差反応するCETPの1個以上のB細胞エピトープを含む。
本発明のワクチンペプチドのB細胞エピトープ部分は、内因性CETP活性を抑制する抗体を高めるためにワクチン接種すべき個々の内因性CETPの1個以上のB細胞エピトープを含み得る。しかし、本発明のワクチンペプチドのB細胞エピトープ部分が、ワクチン接種すべき個々の内因性CETPと類似しているが同一ではないCETP分子のB細胞エピトープを含むことも本発明の範囲内である。そのような類似した、しかし同一ではないCETPタンパク質のある種のB細胞エピトープは、ワクチン接種した個々の免疫応答を高めるエピトープを含み得る。一般に、内因性CETPと少なくとも約80%が相同であるアミノ酸配列を有するCETP分子は、本発明のワクチンペプチドのB細胞エピトープ部分におけるB細胞エピトープ源として使用できる。例として、ウサギおよびヒトのCETPタンパク質は、約80%のアミノ酸配列相同性を有する。成熟したウサギCETPは、配列番号6のアミノ酸配列を有し、肝臓由来の成熟ヒトCETPは、配列番号4のアミノ酸配列を有する。従って、本発明のワクチンペプチドのそのような態様の例では、B細胞エピトープ部分は、ウサギおよび/またはヒトCETPの1個以上のB細胞エピトープを含み、そのようなワクチンペプチドは、ウサギまたはヒトにおいて使用して内因性CETP活性を阻害することができる。
さらに、本発明のワクチンペプチドのB細胞エピトープ部分は、少なくとも6個のアミノ酸配列の長さから成り、in vitroでのT細胞増殖を刺激するとしてもあまりしない、成熟CETPタンパク質(配列番号4)のアミノ酸配列の一部を含む。
好ましい態様では、本発明のワクチンペプチドは、CETPの2個以上の異なるB細胞エピトープを含む、本発明のワクチンペプチドの多価B細胞エピトープ部分を有する。そのような多価ヘルパーT細胞エピトープ部分は、誘導された抗体が内因性CETPに結合し得る多重標的部位をもたらし、それによって、より広範な免疫複合体の生成、および/またはCETPコレステリル転移活性を阻害する可能性を促進するので、特に好ましい。
さらに、ワクチンペプチドのB細胞エピトープ部分は、内因性MHCクラスI分子によって与えられ得るT細胞エピトープも含むB細胞エピトープは含まないのが好ましい。CETPのそのようなT細胞エピトープは、MHCクラスIの関係において肝細胞の表面上にもたらされ、細胞障害性T細胞反応を引き出し、それによって肝組織に障害を起こしうると考えられる。特定のCETP B細胞エピトープがクラスIのT細胞エピトープを含むかどうかは、標準的な細胞障害性T細胞アッセイ(例えば、頁3.11.4〜3.11.7, Current Protocols in Immunology, Vol.1(John Wiley & Sons, Inc., New York, New York, 1994)を参照)を使用して決定できる。
別の態様では、本発明のワクチンペプチドのB細胞エピトープ部分は、ヒトCETPのカルボキシル末端の26アミノ酸(配列番号1)またはCETPのカルボキシル末端の26アミノ酸領域の立体配置もしくは活性を保持したその断片(例えば、長さが少なくとも6個の連続したアミノ酸であり、CETPの特異的中性脂肪結合および/または特異的中性脂肪転移活性に関与するCETPカルボキシル末端の断片)を含む。より好ましくは、本発明のワクチンペプチドのB細胞エピトープ(またはCETP関連)部分は、長さが少なくとも11個の連続したアミノ酸であり、CETPのカルボキシル末端の26アミノ酸領域の立体配置を保持し、CETPの中性脂肪結合および/または転移活性に関与し、抗体結合を受けやすい、CETPのカルボキシル末端領域の断片を含む(例えば、Wang, S.ら、J. Biol. Chem., 267: 17487-17490(1992); Wang, S.ら、J. Biol. Chem., 268: 1955-1959(1003)参照)。さらに、ヒトCETPの機能およびウサギCETPの機能も阻害する、Mab TP2などのいくつかのMabがこの領域に対して生成しており、このことは、このエピトープがヒトおよびウサギCETPタンパク質によって保存されることを意味する(Whitlockら、J. Clin. Invest., 84: 129-137(1989))。これは、ヒトおよびウサギCETPのカルボキシル末端の22アミノ酸が一つの位置でのみ異なる、すなわち配列番号4のヒトCETPのアミノ酸配列の465の位置のグルタミン酸が、ウサギの配列(配列番号6;Nagahimaら、J. Lipid Res., 29: 1643-1649(1988)も参照)の相同的位置(485の位置)ではリシンで置き換えられていることにより確認される。
あるいは、B細胞エピトープ部分は、CETPの中性脂肪結合または転移活性をあまり変えない、または破壊しないアミノ酸の変化(欠失、付加または置換)を含む、CETPのカルボキシル末端の26アミノ酸領域の誘導体を含む(Wangら、同上(1992); Wangら、同上(1993)参照)。標的とされる内因性CETPのアミノ酸配列におけるそのような変化は、それらに限定されないが、一般に保存性アミノ酸置換として知られるもの、例えば、CETP配列の1個のアミノ酸を、構造、電荷または疎水性が類似した別のアミノ酸で置換したものが挙げられる。中性脂肪結合及び/または転移活性を維持するが、in vivoまたはin situでの安定性が改善され、精製が改善され、または架橋部位(例えば、システイン−システインジスルフィド結合の生成による)を与える、CETP配列に対する付加または置換も、本発明のワクチンペプチドの設計に有用である。
中性脂肪のCETP−媒介転移は、中性脂肪の結合(例えば、トリグリセリド、コレステリルエステル)を必ず必要とするので、中性脂肪結合に関与するCETPのアミノ酸配列の部分も、本発明のワクチンペプチドの設計に有用である。本発明のワクチンペプチドの設計に使用されるCETPのアミノ酸配列のいくつかの部分は、中性脂肪結合およびCETPの実際の触媒中性脂肪転移部位に関与すると考えられる。最近の証拠は、CETPが、コレステリルエステルおよびトリグリセリドに対して個々の結合部位を含むことを示唆している(Melchior, G.W.ら、J. Biol. Chem., 270: 21068-21074(1995))。従って、特定の脂肪結合部位に対するアミノ酸配列をワクチンペプチドに挿入することにより、その特定の脂肪とのCETP相互作用を調節する手段が与えられ、それにより、たとえCETPに対して誘導された抗体が循環CETPのクリアランス(血清半減期の短縮)を促進しないとしても、抗アテローム発生性を促進すると考えられる。例えば、特にHDLのトリグリセリド含量を調節するには、CETPのトリグリセリド結合領域から誘導されるB細胞エピトープを本発明のワクチンペプチドのB細胞エピトープ部分に組み込むことができる。同様に、特にHDLのコレステリルエステル含量を調節するには、CETPのコレステリルエステル結合領域から誘導されるB細胞エピトープを本発明のワクチンペプチドの設計に組み込むことができる。すなわち、そのようなワクチンペプチドは、CETP上の特定の脂肪結合部位を阻止し、それによってHDLとCETPとの間で転移する特定の脂肪に影響を及ぼす抗体を誘導するように設計される。
また、長さが、タンパク質中の最小の大きさのエピトープである(例えば、Watsonら、Molecular Biology of the Gene,第4版、836頁(The Benjamin/Cummings Publishing Co., Inc., Menlo Park, CA, 1987)参照)少なくとも6個の連続したアミノ酸である、CETPのアミノ酸配列も有用であり、より好ましくは、長さが、CETP遺伝子の天然に存在する多形性によってコードされるCETPのカルボキシル末端の26アミノ酸領域の少なくとも11個の連続したアミノ酸である。
アミノ酸配列が既知のCETP分子は、そのアミノ酸配列の潜在的抗原モチーフを同定することができるアルゴリズムを使用して、潜在的B細胞エピトープの位置を分析することができる。例えば、親水性、表面確率、両親媒性螺旋、両親媒性シート、および二次構造のプロットの分析を組み合わせることにより(図8Aおよび8B)、タンパク質のアミノ酸配列全体の抗原指数が誘導され、潜在的に本発明のワクチンペプチドに有用なB細胞エピトープを同定することができる。
CETP分子の中性脂肪結合またはその中性脂肪転移に対する影響を試験する方法は当業者に周知である。例えば、Swenson, T.L.ら、J. Biol. Chem., 263: 5150-5157(1988)(脂肪結合に対するアッセイ);Hesler, C.B.ら、J. Biol. Chem., 262: 2275-2282(1987)(脂肪転移に対するアッセイ);Bisgaier, C.L.ら、J. Lipid Res., 34:1625-1634(1993)(CETP媒介コレステリル転移活性アッセイにおける蛍光コレステリルエステル微小エマルジョンの使用);Gaynor, B.J.ら、Atherosclerosis, 110: 101-109(1994)(CETP脂肪転移に対するアッセイ);Wangら、(1992)(CETPの欠失変異体の転移活性に対するアッセイ);Wangら、(1993)(CETPのアミノ酸1個の変異体形のアッセイ)参照(以上、参考として本明細書に組み入れる。)。CETPの転移活性に対するアッセイは、市販もされている(例えば、Diagnescent Technologies(Yonkers, New York)製のCETP機能アッセイ)。
好ましくは、本発明のCETPワクチンペプチドのB細胞エピトープ部分は、アミノ酸配列LFPRPDQQHSVAYTFEEDI(配列番号8のアミノ酸16〜34)および/またはアミノ酸配列FGFPEHLLVDFLQSLS(配列番号8のアミノ酸35〜50)を含む。
C.ワクチンペプチドの産生
本発明のCETPワクチンペプチドのヘルパーT細胞エピトープ及びB細胞エピトープ(CETP関連)部分を一緒に結合して免疫原成分を形成する。このヘルパーT細胞エピトープ及びB細胞エピトープ部分は、(例えば、ペプチド結合により)直接又は架橋分子によって共有結合させることができる。架橋分子が用いられる場合には、それらは、ワクチンペプチドのヘルパーT細胞エピトープ及びB細胞エピトープ部分を、そのペプチドを毒性にすることなく、又はそのワクチンペプチドの全体的な免疫原性を大きく妨害したり低減させることなく、一緒に結合しなければならない。適切な架橋分子にはアミノ酸が含まれ、例えば、1以上のグリシン残基を用いて本発明のワクチンペプチドのヘルパーT細胞エピトープとB細胞エピトープ部分との間に“グリシン橋”を形成させることができる。また、ヘルパーT細胞エピトープ及びB細胞エピトープ部分に付加されたシステイン残基間でジスルフィド結合を形成したり、あるいはグルタルアルデヒド(Korn, A.H.ら,J. Mol. Biol., 65: 525-529(1072))及びEDC(ピアース(Pierce)、ロックフォード、IL)のような架橋剤分子又は他の二官能性架橋剤分子を用いてヘルパーT細胞エピトープ部分とB細胞エピトープ部分を結合させることも含まれる。二官能性架橋剤分子は2つの異なる反応性部位を有する。これらの反応性部位の一方はヘルパーT細胞エピトープ部分の官能基と反応して共有結合を形成することが可能であり、他方の反応性部位はB細胞エピトープ部分の官能基と反応して別の共有結合を形成することが可能であって、これにより2つの部分を一体化する。分子同士を架橋する一般的な方法はMeans及びFeeneyによって論評されている(Bioconjugate Chem., 1: 2-12(1990))。
ホモ二官能性架橋剤分子は化学的に同一の2つの反応部位を有する。ホモ二官能性架橋剤分子の例には、グルタルアルデヒド;N, N’−ビス(3−マレイミド−プロピオニル)−2−ヒドロキシ−1, 3−プロパンジオール(スルフヒドリル特異的ホモ二官能性架橋剤);いくつかのN−スクシンイミドエステル、例えば、ジスクシンイミジルスベレート及びジチオ−ビス−(スクシンイミジルプロピオネート)並びにそれらの可溶性ビススルホン酸及び塩(例えば、ピアース・ケミカル社(Pierce Chemicals)、ロックフォード、イリノイ州;シグマ・ケミカル社(Sigma Chemicals Co.)、セントルイス、ミズーリ州から入手可能)が含まれる。この態様については、ヘルパーT細胞エピトープ及びB細胞エピトープ部分の相対濃度を調整して、一緒に結合されるヘルパーT細胞エピトープ及びB細胞エピトープ部分の数を最大にし、かつ同一のエピトープ部分が互いに結合するのを最小とするようにすべきである(すなわち、例えば、ヘルパーT細胞エピトープ−ヘルパーT細胞エピトープホモダイマー又はB細胞エピトープ−B細胞エピトープホモダイマーの形成を避けるようにする)。
好ましくは、二官能性架橋剤分子はヘテロ二官能性リンカー分子であり、これはそのリンカー分子がT細胞エピトープ及びB細胞エピトープに別々に共有結合することが可能な少なくとも2つの反応性部位を有することを意味する。このようなヘテロ二官能性リンカー分子の使用は、そのリンカー分子の反応性部位の各々を、ワクチンペプチドのヘルパーT細胞及びB細胞エピトープ部分へ化学的に別個に段階的に付加(ベクトル結合)することを可能にする。ヘルパーT細胞エピトープ及びB細胞エピトープ部分を一緒に結合させるために用いることができるヘテロ二官能性架橋剤分子には、m−マレイミドベンゾイル−N−ヒドロキシスクシンイミドエステル(Green, N.ら,Cell, 28: 477-487(1982);Palkerら,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84: 2479-2483(1987)を参照);m−マレイミド−ベンゾイルスルホスクシンイミドエステル;γ−マレイミド酪酸N−ヒドロキシスクシンイミドエステル;及びN−スクシンイミジル3−(2−ピリジル−ジチオ)プロピオネート(Carlsson, J.ら,Biochem. J., 173: 723-737(1978)を参照;シグマ・ケミカル社、セントルイス、ミズーリ州)などがある。
さらに、ヘルパーT細胞及びB細胞エピトープ部分は、血清アルブミン又は樹脂もしくはポリマービーズのような共通の担体分子に結合させることが可能である。ヘルパーT細胞エピトープ及びB細胞エピトープ部分の共通の担体への結合は、グルタルアルデヒド又は他の二官能性架橋剤分子(上記参照)のような架橋剤分子を用いて達成することができる。この態様については、ヘルパーT細胞エピトープ部分、B細胞エピトープ部分及び共通の担体分子の相対濃度を調整して、共通の担体に結合されるヘルパーT細胞エピトープ及びB細胞エピトープ部分の数が最大となり、かつ同一分子同士の結合(すなわち、ホモダイマーの形成)並びにヘルパーT細胞エピトープ及びB細胞エピトープ部分の互いとの結合(すなわち、ヘテロダイマーの形成)がどちらも最小となるようにすべきである。ヘルパーT細胞エピトープ及びB細胞エピトープ部分の別の分子又は表面(例えば、樹脂又はポリマービーズの表面)への結合は、普遍抗原性ヘルパーT細胞エピトープ部分又はB細胞エピトープ(CETP関連)部分配列の免疫原性を大きく壊滅させ、又は低減させるべきではない。このような二官能性架橋剤分子を用いる正味に効果は、ワクチンペプチドの多コピー数のヘルパーT細胞エピトープ及びB細胞エピトープ部分が免疫応答及び内因性CETPに結合する抗体の産生を増強し得る共通の担体に結合することにある。
多抗原性ペプチド(multiple antigenic peptide:MAP)配列も非常に有効な抗原及び免疫原であることが示されている(例えば、Tam, J. P., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 5409-5413(1988);Wang, C. Y.ら,Science, 254: 285-288(1991);Marguerite, M.ら,Mol. Immunol., 29: 793-800(1992)を参照)。ここに説明されるワクチンペプチドのヘルパーT細胞エピトープ及びB細胞エピトープ部分が共通のコア分子に結合するこのMAP技術は、内因性CETPに対する抗体を誘発する多価ペプチドアセンブリーを作製する別の方法を提供する。
好ましくは、本発明のワクチンペプチドのヘルパーT細胞エピトープ及びB細胞エピトープ部分は、末端と末端とを共有結合的に結合させて連続ペプチドを形成させる。より好ましくは、選択された普遍抗原性のヘルパーT細胞エピトープ部分がワクチンペプチドのアミノ末端部を形成し、そのカルボキシル末端アミノ酸残基がそのワクチンペプチドの選択されたCETP関連アミノ酸配列(B細胞エピトープ部分)のアミノ末端アミノ酸にペプチド結合で共有結合される。しかしながら、その逆の順序を用いることも可能であり、すなわち、本発明のワクチンペプチドのCETP関連アミノ酸配列(B細胞エピトープ部分)がワクチンペプチドのアミノ末端領域を形成するように位置し、普遍抗原性ヘルパーT細胞エピトープ又は免疫原性担体アミノ酸配列がそのワクチンペプチドのカルボキシル末端部を構成していてもよい。
本発明のワクチンペプチドは、それらを多コピー数の補体タンパク質C3dに共有結合させることによって、より免疫原性を高めることができる(Dempseyら,Science, 271: 348-350(1996))。あるいは、ワクチンペプチドを、補体を活性化してC3dと共有結合するようになる炭水化物構造により誘導体化してもよい(Fearonら,Science, 272: 50-54(1996))。例えば、ある種の変異体チャイニーズハムスター卵巣宿主細胞において発現されたタンパク質は特定の炭水化物構造によりグリコシル化され得る(Stanley, Mol.Cell. Biol., 9: 377-383(1989))。最近、C3dは、強い免疫応答を誘導する獲得免疫系による抗原の認識を高めることが実証されている(Dempseyら、1996)。
本発明のペプチドは、規定されたアミノ酸配列を有するペプチドを産生することが当該技術分野において知られているあらゆる利用可能な方法によって得ることができる。例えば、自動ペプチドシンセサイザー(例えば、アプライド・バイオシステムズ(Applied Biosystems)によるシナジーTMペプチドシンセサイザー(SynergyTM Peptide Synthesizer);アビメド(Abimed)、ランゲンフェルト、ドイツによるAMS422)に用いることにより、当業者は自動ペプチド合成を利用することが可能である。このような要望通りのペプチドの合成は、多くの商業ペプチド合成サービス企業、例えば、クォリティ・コントロールド・バイオケミカルズ社(Quality Controlled Biochemicals, Inc.)(ホプキントン、マサチューセッツ州);キロン・ミモトペス・ペプチド・システムズ(Chiron Mimotopes Peptide Systems)(サンディエゴ、カリフォルニア州);ベイケム・バイオサイエンス社(Bachem Bioscience, Inc.)(フィラデルフィア、ペンシルバニア州);セバーン・バイオテク社(Severn Biotech Ltd.)(キドミンスター、イギリス)により商業的サービスとして行われている。
これとは別に、本発明のペプチドは合成及び組換え核酸技術を用いて産生させることも可能である。例えば、当業者は、既知の遺伝子コードから本発明のペプチドをコードする5’から3’の核酸配列を設計することができる。ヒト肝臓に由来する成熟CETPのアミノ酸配列は知られており(配列番号4)、その対応DNA配列(配列番号5)も既知である(Draynaら,Nature, 327: 632-634(1987)を参照)。さらに、様々な広域の、すなわち「普遍」T細胞エピトープのアミノ酸配列も既知である(例えば、Panina-Bordignonら,Eur. J. Immunol., 19: 2232-2242(1989), Etlingerら(1990), Pillaiら,Infect. Immun., 63: 1535-1540(1995)を参照)。
ヘルパーT細胞エピトープ及び1以上の選択されたB細胞エピトープ部分のコーディング配列(及び、所望であれば、ポリグリシンのような架橋性ペプチド、又はアミノ及び/又はカルボキシル末端システインのような他の追加の残基(1個もしくは複数))を含むDNA分子は、自動DNAシンセサイザー(例えば、オリゴ1000DNAシンセサイザー、ベックマン社(Beckman Corp.))を用いて、又は商業的DDA合成サービス(例えば、ジェンセット社(Genset Corp.)、ラホラ、カリフォルニア州)と契約することにより容易に合成することができる。その後、合成されたDNA分子を、当該技術分野において利用可能な標準法(例えば、Sambrookら,Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Vols. 1-3(Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1989))を用いて、及び/又は特定の市販遺伝子発現系(例えば、pPROEXTM−1細菌細胞発現系;SFV真核細胞発現系;BAC−TO−BACTMバキュロウイルス発現系;ライフ・テクノロジース社(Life Technologies, Inc.)、ガイザースブルグ、メリーランド州)の製造業者が指示する通りに、多種多様な入手可能な遺伝子発現系のいずれか(例えば、細菌性プラスミド;バクテリオファージ発現ベクター、レトロウイルス発現ベクター、バキュロウイルス発現ベクター)に挿入することができる。次に、発現したペプチドを、ペプチド精製の標準法を用いて発現系から単離する。本発明のペプチドの精製は、本発明のワクチンペプチドの特定のヘルパーT細胞エピトープ又はB細胞エピトープ(CETP関連部分)アミノ酸配列に対する抗体の使用に基づくアフィニティクロマトグラフィー又は免疫沈澱を使用することにより促進することが可能である。例えば、Mab TP2はヒトCETPのカルボキシル末端の26アミノ酸と結合し、精製スキームにおける1以上のイムノアフィニティ工程において有用であり得る(Hesler, C. B.ら,J. Biol. Chem., 263: 5020-5023(1988))。
もちろん、特定のワクチンペプチドのT細胞及びB細胞エピトープの各々をコードするDNA分子を入手することができる場合には、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を含む標準組換え核酸法を用いてワクチンペプチドをコードする組換え核酸分子を生成することが可能である。このような組換え核酸分子は、適切な宿主細胞にトランスフェクト又は形質転換して培養物中にワクチンペプチドを発現させることが可能な様々な発現ベクターのいずれかに挿入することができる(例えば、Sambrookら,Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Vols. 1-3(Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1989)を参照)。例えば、肝臓に由来する成熟ヒトCETPをコードするDNA配列は配列番号5のヌクレオチド配列を有し、成熟ウサギCETPをコードするDNA配列は配列番号7のヌクレオチド配列を有する。これらのCETPタンパク質の各々の様々なB細胞エピトープをコードする特定の配列を、選択されたT細胞エピトープ(1つもしくは複数)をコードするヌクレオチド配列と再結合させ、適切な宿主細胞において発現させるために発現ベクターに挿入することができる。
ワクチンペプチドの産生に用いることができる組換えプラスミドの例は、CMVプロモーターが配列番号9:MQYIKANSKFIGITERFPRPDGREAVAYRFEEDIFGFPKHLLVDFLQSLSのアミノ酸配列を有するワクチンペプチドをコードする配列の転写を指示するプラスミドpCMV−CETP/TTである。ここでは、アミノ末端のメチオニンが破傷風毒素T細胞エピトープ(配列番号2のアミノ酸2〜15)及びウサギCETPに由来する2つのB細胞エピトープ(配列番号6のアミノ酸350〜368及び481〜496)に結合されている。プラスミドpCMV−CETP/TTはアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(ATCC、ロックビル、MD)に寄託され、受託番号98038を指定されている。
好ましい態様において、本発明のペプチドは、ペプチドをそれ自体に結合もしくはカップリングしてワクチンペプチドの二量体を形成すること、又は担体もしくは架橋剤分子のような他の分子に結合もしくはカップリングすることに用いるため、本発明のワクチンペプチドのヘルパーT細胞エピトープ部分のアミノ末端アミノ酸に共有結合的に結合されたアミノ末端システイン、又は他の残基も含む。より好ましくは、本発明のワクチンペプチドはアミノ酸配列CQYIKANSKFIGITEFGFPEHLLVDFLQSLS(配列番号2)を有する。CETPの少なくとも2つのB細胞エピトープを有する本発明のワクチンペプチドがさらに好ましい。そのようなワクチンペプチドの例は配列CQYIKANSKFIGITELFPRPDQQHSVAYTFEEDIFGFPEHLLVDFLQSLS(配列番号8)を有する。
D.ワクチンの調製
本発明のペプチドは、CETPに特異的に結合し、及び/又は内因性CETP活性を調節(すなわち、低減もしくは抑制)する内因性抗体の産生を誘発するワクチンの調製に用いられる。本発明の抗CETPワクチンは、1種もしくは数種の異なる本発明のペプチドを含む。例えば、異なるヘルパーT細胞エピトープ部分(例えば、異なる普遍ヘルパーT細胞エピトープ)及び/又は異なるB細胞エピトープ部分(例えば、CETPのカルボキシル末端の26アミノ酸を有する異なるCETP関連部分)を有するペプチドを組み合わせ、単一のワクチン組成物として投与することができる。
ミョウバンのような薬学的に許容し得るアジュバントをここに記載されるワクチンペプチドと混合して本発明のワクチンを調製することができる。ミョウバンは、ヒトへのワクチン投与において現在使用が認められている唯一のアジュバントである(Eldrige, J. H.ら,In Immunobiology of Proteins and Peptide V: Vaccines: Mechanisms, Design, and Applications, Atassi, M. Z.編(Plenum Press, New York, 1989),192頁を参照)。近年、ミョウバンが、リポ多糖のナトリウムフタリル誘導体と組み合わせて、ヒト絨毛性ゴナドトロピンに対して有効であることが示されたワクチンをヒトに投与するために用いられた(Talwar, G.P.,ら,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91:8532-8536(1994)を参照)。
他の貫用のアジュバントも、それらが特定の用途について承認される限り、用いることができる。例えば、ポリ(DL−ラクチド−コ−グリコリド)から構成された生分解性微小球がワクチンの経口又は非経口投与のためのアジュバントとして研究されている(Eldrige, J. H.ら,In Immunobiology of Proteins and Peptide V: Vaccines: Mechanisms, Design, and Applications, Atassi, M. Z.編(Plenum Press, New York, 1989), 191-202頁)。
他のアジュバントが非ヒトの動物へのワクチンの投与に用いられている。例えば、フロイント完全アジュバント(シグマ・ケミカル社、セントルイス、ミズーリ州)、フロイント不完全アジュバント(シグマ・ケミカル社、セントルイス、ミズーリ州)、及びRIBITMアジュバント・システム(RAS;RIBIイムノケム・リサーチ社(ImmunoChem Research, Inc.)、ハミルトン、モンタナ州)が、ヒト以外の動物に抗原を投与するのに日常的に用いられる公知のアジュバントである。加えて、アジュバント構造を、本発明のペプチドと混合したり、又は、好ましくは、本発明のペプチドに、例えばそのペプチドのアミノもしくはカルボキシル末端アミノ酸残基に、共有結合的に組み込むこともできる。そのような組込まれるアジュバントとしては、本発明のペプチドのアミノ末端での親油性N−パルミトイル−S−[2, 3−ビス(パルミトイルオキシ)−プロピル)]−システイン(“Pam3−Cys−OH”);Pam3−Cys−Ser−Lys4及びPam3−Cys−Ser−Glu4のような両親媒性水溶性リポペプチド;N−アセチル−グルコサミニル−N−アセチルムラミル−アラニル−D−イソグルタミン(“GMDP”)、ムラミルジペプチド、及びアラニル−N−アダマンチル−D−グルタミンのようなグリコペプチド;並びにin vitro化学合成の間に容易にペプチドに結合させることが可能なポリアミドゲルベースのアジュバントがある(Synthetic Vaccines, Nicholson, B. H.編(Black well Scientific Publications, Cambridge, Massachusetts, 1994), pp.236-238を参照)。
加えて、本発明のワクチンペプチドを、このペプチドの免疫原性を高め得る他の分子に結合させることができる。例えば、本発明のペプチドを血清アルブミンのような大分子の表面に結合させると、このワクチンペプチドのエピトープが隣接する複数の繰り返しコピーとして個体の免疫系に提示されることから、免疫原子が増強される(例えば、Tam, J. P., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 5409-5413(1988);Wang, C.Y.ら,Science, 254: 285-288(1991);Marguerite, M.ら,Mol. Immunol., 29: 793-800(1992)を参照)。このような本発明のワクチンペプチドの「多重」又は「多価」配置は、架橋剤分子を用いて作製することができる(上記参照)。例えば、上述のように、二官能性架橋剤分子は2つの反応性部位を有し、それらの部位の一方は該リンカーを本発明のワクチンペプチドに結合させることができ、他方の部位は異なる分子、例えば、血清アルブミンのような大タンパク質又は樹脂もしくはポリマービーズとの反応に利用することができる。このように、共有結合性架橋剤分子を用いて、ワクチンペプチドを他のタンパク質又は基質に結合させ、このペプチドの多コピー配置(多コピーペプチドアセンブリー)を形成することができる。
本発明のワクチンペプチドの別の分子又は表面への結合は、このワクチンペプチドの結合されたヘルパーT細胞エピトープ及びB細胞エピトープ(CETP関連)部分の免疫原性を大きく壊滅又は低減しないような方法で行うべきである。このようなリンカー分子の使用は、例えば、結合していないワクチンペプチドを個体に投与する場合よりもすみやかな抗CETP抗体力価の上昇及び/又は高親和性の抗CETP抗体の産生によって立証されるように、本発明のワクチンペプチドの免疫原性を高めることが好ましい。このような架橋剤分子は、特異的抗腫瘍抗体を産生させる上で有効な免疫原性増強剤として役立つことが示されている(例えば、Tao, M. H.ら,Nature, 362: 755-758(1993))、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子(GM−CSF)のような「免疫原性増強剤」分子に本発明のペプチドを結合させるのに用いることもできる。別のこのような免疫原性増強剤はキーホールリンペットヘモシアニン(KLH)である(Ada, G. L., In Fundamental Immunology, third edition, W. E. Paul編(Raven Press Ltd., New York, 1993), pp. 1309-1352を参照)。上述のように、KLHを用いる多価配置の例は、ジスルフィド結合の形成によるKLH分子の幾つかのシステイン残基のいずれかへのワクチンペプチドの結合である。
2.ワクチンペプチドの使用
ワクチンを投与及び試験する一般的な方法は当業者に公知である(例えば、Talwar, G. P.ら,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91: 8532-8536(1994)を参照)。本発明のペプチドは、とりわけ、単独で、又は1以上の薬学的に許容し得る担体もしくはアジュバンドと共に、ワクチン受容者の内因性CETPに対する抗体応答を誘発するワクチンとして投与するように設計されている。本発明の幾つかの態様においては、このワクチンペプチドは他の疾患又は障害用のワクチンと組み合わせて投与することもできる。
内因性CETPに対する免疫応答は、有意にCETPの活性を抑制し、CETPの血清半減期を変更し、免疫複合体の形成を介してCETPのクリアランスを誘起し、HDLコレステロールの輸送を変更し、リポタンパク質のコレステロール含量の平衡を移動させ、コレステロール異化作用を変更し、及び/又はアテローム性動脈硬化症病変の発生を低減するはずである。LDL、VLDL及び/又はHDLレベルの制御は、これらのレベルが心臓血管性疾患のリスクの低下又はそのような疾患のさらなる進行の抑制と相関することから、心臓血管性疾患の治療における許容された指標又は終末点である(Mader, S. S., In Human Biology, 4th ed., pp. 83, 102(Wm. C. Brown Publishers, Dubuque, Iowa, 1995))。したがって、本発明による所望の予防又は治療効果は、個体においてCETPに結合する及び/又はCETP活性を抑制する抗体を誘発することにより、又は内因性CETPに対する抗体の力価の上昇に伴うHDLレベルと比較したLDL及び/又はVLDLレベルの相対的な減少により、又は抗CETP抗体の産生に伴う循環HDLの絶対レベルの上昇により、又は心臓血管組織におけるアテローム性動脈硬化症病変の発生の抑制もしくは減少により立証される。
ここに示されるように、アテローム性動脈硬化症のウサギモデルにワクチンペプチドを投与すると、コレステロールを補給した餌を与えた動物においてアテローム性動脈硬化症プラークの発生が大いに低減した。この証拠により、内因性CETPに対する抗体を誘発するためのワクチン接種がアテローム性動脈硬化症を治療又は予防する有用な方法であり得ることがわかる。これは、CETPに対する免疫応答の誘発がアテローム性動脈硬化症の発症を抑制し得ることの最初の証拠である。
このように内因的に産生された個体自身のCETPに対する抗体は、他の可能性のある治療アプローチよりも有利である。例えば、近年ヒヒから単離されたもの(例えば、WO93/11782; Kushwaha, R. S.ら,J. Lipid Res., 34: 1285-1297(1993); Genetic Engineering News, 14: 44(1994); Science, 262: 1974-1975(1993)を参照)のようなCETPのポリペプチド阻害剤の使用、又はCETP活性を阻害する外因的に産生された(外来)抗CETP抗体の注入は、いずれも、そのような外来のCETP阻害分子に対する免疫応答を誘発するように思われる。そのような免疫応答は、その外因的に供給されたCETP阻害剤を急速に不活性化し、及び/又は体内から一掃するだろう。理論的には、そのような外因的に供給されたCETP阻害剤に対する免疫応答は、その阻害剤の用量を増加させて投与することにより克服することができるだろう。しかしながら、外来CETP阻害剤の用量の複数回投与、特に、そのような外来分子の常に増加する量の複数回投与は、治療中の個体の健康を危険にさらす過敏反応の可能性を提示する。外因的に産生されたCETP阻害剤を用いることに関連したそのような問題は、個体自身の免疫系抗体を集めて内因性CETPを特異的に阻害する本発明のペプチドベースのワクチンを用いることにより回避される。反復投与、段階的投与、及び(ヒト抗マウス抗体(HAMA)応答のような)望ましくない副作用は、ここに記載される抗CETPワクチンアプローチを用いることにより回避される。
本発明のCETPワクチンペプチド組成物は、腹腔内、腹膜間、皮内(皮下)、筋肉内、静脈内のような非経口又は経口を含む、ワクチン接種に用いられるいかなる経路によっても投与することができる。好ましくは、本発明のワクチンは非経口投与、例えば、腹腔内、腹膜間、皮内、筋肉内、又は静脈内投与する。ワクチンペプチドの経口投与が望まれる場合には、例えば、セービン経口ポリオワクチンにおいて用いることが認可されている溶液のような、薬学的に許容し得る経口賦形剤を本発明のワクチンペプチドと混合することができる。破傷風ワクチンのような特定の他のワクチンと同様に、内因性CETPの調節又は阻害の所望のレベルを維持するためにCETPワクチンペプチド組成物の予備の追加免疫投与が必要となることがある。上述のように、ポリ(DL−ラクチド−コ−グリコリド)から構成されるような生分解性微小球は、有効なワクチン送達及び経口もしくは非経口経路による免疫化に有用であることが示されている(Eldridge, J. H.ら,In Immunobiology of Proteins and Peptides V: Vaccines: Mechanisms, Design, and Application, Atassi, M. Z.編(Plenum Press, New York, 1989), pp. 191-202)。
本発明のペプチドワクチンの適切な投与量は、過敏反応、紅斑、硬化、圧痛のような潜在的な禁忌症の監視を含めて、そのワクチンが影響を及ぼすことが提案されている多くのパラメータに基づいて、当該技術分野において用いられる一般的なワクチン方法論によって確立される(例えば、Physician's Desk Reference, 49th ed.,(Medical Economics Data Production Co., Mont Vale, New Jersey, 1995), pp. 1628, 2371(B型肝炎ワクチンについて言及), pp. 1501, 1573, 1575(はしか、おたふく風邪、及び/又は風疹ワクチンに言及), pp. 904, 919, 1247, 1257, 1289, 1293, 2363(ジフテリア、破傷風及び/又は百日咳ワクチンに言及); Talwar, G. P.ら,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91: 8532-8536(1994)を参照)。ヒトのワクチン接種の通常かつ伝統的なアプローチは、特定のワクチンの初期用量を投与して免疫系を感作した後、そのワクチンの1回以上の「追加免疫(ブースター)」用量を投与してワクチンの初期投与(ワクチン接種)によって感作された免疫系による既往応答を誘発することである。このような「一次及び追加免疫」投与法は公知であり、例えば、はしか、ポリオ、破傷風、ジフテリア、及びB型肝炎ワクチンの開発及び使用におけるように、当該技術分野において通常用いられる。
個体に最初に投与されるワクチンペプチドの量は、ワクチン接種の前に個体内に存在する内因性CETP活性のおおよそのレベルを中和するのに必要な量であってよく、その個体からの血清又は血漿サンプル中のCETP活性を測定することにより決定することができ、例えば、市販のCETPアッセイ(例えば、ダイアグネッセント・テクノロジース社(Diagnescent Technologies, Inc.)、ヨンカース、ニューヨーク州)を用いて決定される。ワクチンペプチドの投与の後に総HDL又はHDL−Cのレベルの測定可能な増加が見られるかどうかを決定するために、市販のアッセイ(例えば、ワコー・ケミカルズUSA社(Wako Chemicals USA, Inc.)、リッチモンド、バージニア州から入手可能)を用いて、ワクチン接種した個体からの血漿又は血清サンプルをモニターすることもできる。循環抗CETP抗体の濃度(力価)の増加は、血漿又は血清サンプル中で、例えばELISA検定を用いて測定することが可能である(例えば、実施例3を参照)。したがって、最初に抗CETP抗体の増加がHDLもしくはHDL−Cのレベルの増加、又はCETP活性の低下と相関するかどうかを確立することが可能であり、かつ推奨される。その後は、抗CETP抗体の力価の上昇をモニターして十分な投与量のワクチンペプチドが投与されているかどうか、又は抗CETP抗体のレベルの増加を誘発するために「追加免疫」用量が指摘されているかどうかを決定することだけが必要である。これは、B型肝炎ウイルスに対するワクチン接種のような、様々な確立されたワクチン接種に関しての通常の手順である。
三次元動脈画像診断法が現在利用可能であり、これは個体における動脈の病変の同定並びにそれらの発症及び退行のモニターに用いることが可能である(例えば、McPherson, Scientific American Science ' Medicine, pages 22-31,(March/April, 1996)を参照)。したがって、そのような画像診断法を本発明のペプチドを用いるワクチン接種の有効性をモニターするのに用いることができる。
本発明のより完全な理解及びそれらの利点は以下の非限定的な実施例から得ることができる。
実施例
実施例1.抗CETPワクチンペプチドの設計及び合成
内因性CETPに対する抗体応答の誘発の可能性を調べるため、普遍的な破傷風毒素ヘルパーT細胞エピトープを含むヘルパーT細胞エピトープ部分及びヒトCETPのカルボキシル末端領域を含むB細胞エピトープ部分を有するペプチドを調製した。アミノ酸配列CQYIKANSKFIGITEFGFPEHLLVDFLQSLS(配列番号2)を有する31アミノ酸のペプチドを設計した。このうち、QYIKANSKFIGITE(配列番号2のアミノ酸2〜15)は破傷風毒素タンパク質のアミノ酸830〜843と同じアミノ酸配列であり、FGFPEHLLVDFLQSLS(配列番号2のアミノ酸16〜31)は、ヒトCETPの中性脂肪転移ドメインを含み、かつ抗ヒトCETPモノクローナル抗体TP2によって認識されることが知られている(Wang, S.ら,J. Biol. Chem., 267: 17487-17490(1992); Wang, S.ら,J. Biol. Chem., 268: 1955-1958(1993))配列番号4のアミノ酸461〜476と同じアミノ酸配列であり、そしてアミノ末端システイン(C)残基は所望によりこのペプチドをそれ自体との、又は、他の分子との結合において用いるために存在する。この合成ペプチドのCETP関連部分は、ウサギCETPのアミノ酸配列の対応部分とはグルタミン酸(E)残基のみが異なる(Nagashima, M.ら,J. Lipid Res., 29: 1643-6149(1988)(ウサギCETP遺伝子のクローン化)を参照)。しかしながら、従来の研究は、抗ヒトCETPモノクローナル抗体がこのウサギCETPの対応領域を認識できることを示している(Hesler, C. B.ら,J. Biol. Chem., 263: 5020-5023(1988)を参照)。このペプチドを、クォリティ・コントロールド・バイオケミカルズ社(ホプキントン、マサチューセッツ州)による標準ペプチド合成法を用いて要望通りに合成した。
実施例2.内因性CETPに対するウサギの免疫感作
上記実施例1の合成ワクチンペプチド(配列番号2)を、内因性ウサギCETPに対する免疫応答を誘発するこのワクチンペプチドの能力を試験するためにニュージーランドシロウサギに注射した。第I群は3匹のウサギ(rb♯1−#3)を含み、これらの各々にはワクチンペプチドの投与プロトコルを施した。第II群は1匹のウサギ(rb♯4)を未処理の対照として含んでいた。
ウサギにおけるワクチンペプチドの試験の一般的なプロトコルを図1に示す。1日目に、ペプチド(100μg)をRIBITMアジュバント系(RIBIイムノケム・リサーチ社、ハミルトン、モンタナ州)に製造者の指示に従って懸濁して最終容量1000μlとし、第I群のウサギの各々に、2ヶ所の筋肉内部位(部位当り250μl)に、2ヶ所の皮下部位(部位当り100μl)に、及び6ヶ所の皮内部位(部位当り50μl)に注射した。28日目に、1回の追加免疫(RIBITMアジュバント系にペプチド100μg)を1日目と同様に投与した。56日目に、もう1回の追加免疫(RIBITMアジュバント系にペプチド100μg)を1日目と同様に投与した。
対照ウサギrb♯4については予備採血しないことを除いて、各初期注射の前(「予備採血」)並びに42日、70日、及び108日目に各ウサギの耳から血液サンプル(約1〜約5ml)を採取した。血漿から細胞性成分を分離するための標準遠心法により血漿サンプルを調製した。血漿サンプルを−70℃で保存した。第I群及び第II群の両者の血漿サンプルを、抗CETP抗体の存在及び力価の増加について、並びに総血漿コレステロール及び血漿HDL−Cレベルについて分析した。
実施例3.ワクチン接種ウサギにおける抗CETP抗体の産生
抗CETP抗体の力価測定のための直接ELISA
サンドイッチ酵素結合イムノソルベントアッセイ(ELISA)を用いて抗CETP抗体を含有する血漿サンプルの力価を測定した。この構成では、組換えヒトCETP(コロンビア大学の受託機関(ニューヨーク、ニューヨーク州)からライセンスを受けた組換えCHO細胞系CHO(AT)から得られるヒトr CETP)をマイクロタイター皿のウェルに吸着させ、第I群及び第II群のウサギに由来するウサギ血漿の様々な希釈物を各ウェルに加えた。NUNCマキシソルブ(NUNC Maxisorb)96ウェルプレートの各ウェルは、PBS中のヒトr CETPの1μg/ml溶液100μlに4℃で一晩さらすことによりコーティングした。非特異的結合は、PBS及び0.05%ツィーン中のBSAの1%溶液を各ウェルに添加し、150rpmの回転振盪器上で室温(20°〜22℃)で2時間インキュベートすることによりブロックした。その後、ウェルをELISA洗浄バッファ(PBS+0.05%ツィーン)で4回洗浄した。次に、血漿サンプルを希釈バッファ(PBS中の1%BSA)で1:10に希釈した後、同じバッファで2倍段階希釈を6回行った。希釈サンプル(100μl)をウェルに加え、150rpmの回転振盪器上で室温で2時間インキュベートした後、ELISA洗浄バッファ(PBS+0.05%ツィーン)で4回洗浄した。結合した抗CETP抗体を検出するため、希釈バッファ中のホースラディッシュペルオキシダーゼ(HRP)標準ヤギ抗ウサギ免疫グロブリン(サザーン・バイオテクノロジー・アソシエーツ社(Southern Biotechnology Associates, Inc.); バーミンガム、アラバマ州)の1:10,000希釈液100μlを添加し、プレートを150rpmの回転振盪器上で室温で2時間インキュベートした。その後、ウェルをELISA洗浄バッファ(上記参照)で4回洗浄し、ペルオキシダーゼ基質TMB(TMBペルオキシダーゼ基質、カーグガード&ペリー・ラボラトリーズ社(Kirkegaard & Perry Laboratories, Inc.)、ガイザースバーグ、メリーランド州)を添加してプレートを室温で30分間インキュベートした。光学密度の変化を、ELISAリーダー(例えば、E−max、モレキュラー・デバイス社(Molecular Device Corp.)、メンロパーク、カリフォルニア州)を用いて、450nmで分光光度的に監視した。このアッセイにおいて、このO.D.は血漿サンプル中に存在する抗CETP抗体の量に正比例した。これらの結果は、第I群のウサギの全て(rb#1−rb#3)が組換えヒトCETPに特異的な抗CETP抗体を産生することを示した。実施例2における第I群の未処理対照ウサギ(rb#4)では抗CETP抗体は産生されなかった。(図2を参照のこと。)
抗CETP抗体を検出するための競合ELISA
このアッセイは、ワクチン接種されたウサギが(コロンビア大学の受託機関、(ニューヨーク、ニューヨーク州)からライセンスを受けた)抗CETPモノクロナール抗体TP2と同じエピトープに結合する抗体を産生しているかどうかを決定するために立案した。標準的な競合ELISAをウサギの血漿中の抗CETP抗体の存在の検出に適合させた。このアッセイでは、ホースラディッシュペルオキシダーゼ(HRP)を、ヒトCETPの26アミノ酸のカルボキシル末端断片に特異的に結合する抗CETPモノクローナル抗体TP2に結合させた(Wangら,J. Biol. Chem., 267: 17487-17490(1992); Wangら,J. Biol. Chem., 268: 1955-1959(1993))。
抗体にHRPを結合させるために以下の方法を用いた。抗体をNa2CO3(50mM、pH9.5)に対して透析した。この透析抗体は2〜5mg/mlの濃度であった。HRP(ベーリンガー−マンハイム(Boehringer-Mannheim))を酢酸ナトリウムバッファ(1.0mM、pH4.4)中に6mg/mlの濃度に溶解した。次に、HRP溶液1ml毎に0.2mlの過ヨウ素酸ナトリウム溶液(21.4mg/ml酢酸バッファ、使用直前に調製)を添加して活性化し、この活性化混合物を室温、ロッカー上で20分間インキュベートした。その後、この活性化HRPを、酢酸バッファで平衡化したG25カラムに通して活性化HRPを脱塩した。403nmの光学密度(O.D.)はおおよそ1mg HRP/mlに相当する。次に、この脱塩した活性化HRPを透析抗体に抗体量の1/2に等しい量で添加し(重量基準、例えば、IgG 1mg毎に活性化HRPを0.5mg添加)、この混合物を室温、ロッカー上で2時間インキュベートしてHRPを抗体分子に結合させた。この結合反応を、HRP−抗体結合混合物1ml毎に20μlの水素化ホウ素ナトリウム(10mg/ml)を添加することにより停止させた後、混合物を氷上で30分間インキュベートした。このHRP結合抗体混合物をリン酸緩衝生理食塩水(PBS)に対して一晩透析した後、30psiで15分間遠心した(エアフュージ(Airfuge))。その上清(HRP結合抗体)にチメロサールを0.5%まで添加し、ウシ血清アルブミンを1%まで添加した。このHRP結合抗体調製品を4℃で保存し、光から保護した。
96ウェルマイクロタイタープレートのウェルを、各ウェル内においてリン酸緩衝生理食塩水(PBS)中の(コロンビア大学の受託機関、(ニューヨーク、ニューヨーク州)からライセンスを受けた組換えCHO細胞系CHO(AT)から得られた)組換えヒトCETPの300ng/ml溶液100μlをインキュベートすることによりCETPでコーティングした。ウェルから液体を排出し、PBS及び0.05%(容量/容量)ツィーン(シグマ・ケミカル社、セントルイス、ミズーリ州)中のウシ血清アルブミン(BSA)の1%(重量/重量)溶液でウェルを満たし、室温、回転振盪器(約150rpm)上で2時間インキュベートして非特異的結合をブロックした。ウェルをELISA洗浄バッファ(PBS+0.05%ツィーン)で4回洗浄し、希釈バッファ(PBS中1%BSA)で希釈した血漿サンプル100μlを加えた。次に、プレートを室温、回転振盪器上で上述したように1時間インキュベートした後、ELISA洗浄バッファで4回洗浄した。次いで、各ウェルに、希釈バッファ中のホースラディッシュペルオキシダーゼ結合(標準)モノクローナル抗体TP2の1:100,000希釈液100μlを添加した。このプレートを室温、回転振盪器上で上述したように1時間インキュベートした後、ELISA洗浄バッファで4回洗浄した。ホースラディッシュペルオキシダーゼ基質(例えば、TMBペルオキシダーゼ基質、カークガード&ペリー・ラボラトリーズ社、ガイザースバーグ、メリーランド州)を各ウェルに添加し、450nmの光学密度(O.D.)の変化をELISAリーダー(例えば、E−max、モレキュラー・デバイス社、メンロパーク、カリフォルニア州)を用いて分光光度的に監視した。このアッセイでは、ワクチンペプチドのCETP関連部分に対して抗体が産生した場合、血漿サンプル中に存在するこのような未標識抗CETP抗体分子はウェル壁に吸着しているCETPへの結合について標識TP2モノクローナル抗体と競合し、発色の阻害が血漿サンプルの濃度が増加するにつれて観察される(すなわち、O.D.は各血漿サンプル中に存在する抗CETP抗体の量に反比例する)。
図3に示されるように、ワクチンペプチドが投与された3匹のウサギのうちの2匹からそのようなCETPへのTP2結合の阻害が観察され、それによりCETP特異的抗体の産生が示される(図3において、ウサギ血清rb#2及びRb#3のグラフを未処理対照rb#4の血漿と比較のこと)。CETPへのTP2結合の最も強い阻害はウサギrb#3の血漿によって示された(図3を参照)。
実施例4.ワクチン接種のウサギの血漿サンプル中のコレステロール及びHDLレベル
実施例2における第I群及び第II群のウサギからワクチン接種プロトコルの様々な時期(日)に採取した血漿サンプルを、総コレステロール(図4)及びHDL−C(図5)の濃度についても検定した。総血漿コレステロール及びHDL−Cレベルは、標準的な商業アッセイ(ワコー・ケミカルUSA社、リッチモンド、バージニア州)を用いて決定した。最も高い抗CETP抗体力価を有していた2匹のウサギ(rb#2及びRb#3)の血漿サンプルは、予備採血血漿サンプルと比較して、70日目で、HDL−C濃度の2〜5倍の増加を示した。また、ウサギ#2及び#3は、いずれも全期間にわたるHDL濃度の減少を示した対照ウサギ(rb#4)及び最低抗体力価ウサギ(rb#1)と比較して、全期間にわたる血漿HDL濃度の増加も示した(図5)。
図6は、ワクチン接種後70日目のHDLコレステロール(HDL)に対する非HDLコレステロール(非HDL)の比を示す。このデータは、ワクチン接種していない(中空)ウサギと比較して、ワクチン接種したウサギ群(線影付き)における抗アテローム形成プロフィールの傾向を示す。血漿サンプル中の総コレステロールに大きな相違は観察されなかったが、非HDL/HDLの比は、一般に、第I群のワクチン接種ウサギにおける抗CETP抗体レベルの上昇に伴って低下した。
実施例5.ヒトCETPを発現するトランスジェニックマウスへの投与
近年、ヒトCETPを発現するトランスジェニックマウスの系統が商業的に利用可能になってきている(バイオディグムTM(BiodigmTM)−CETPマウス;ファーマコンUSA(Pharmakon USA)、ウェーバリー、ペンシルバニア州)。このようなマウスは肝臓でヒトCETPを発現し、正常な餌を与えた場合、一緒に生まれた遺伝子導入されていないマウスよりもHDL関連コレステロールのレベルが約50パーセント低いことが報告されている。このようなトランスジェニック動物は、本発明のワクチンペプチドをさらに試験するためのさらなる実験モデルとして役立つ。
6匹のトランスジェニックCETP発現マウスからなる2群を用いて、上記実施例1〜4において用いられたものと同じワクチンペプチドを試験した。第I群のマウスの各々には、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)に溶解し、完全フロイントアジュバントで乳化して(1:1)最終濃度を100μg/100μlとしたワクチンペプチドを初回注射した。各マウスには、2ヶ所の皮下部位の各々に、50μl用量(50μg)でワクチンペプチド混合液を投与した。28日目及び56日目にも、これらの動物に、PBS中のペプチドワクチン(100μg)の追加免疫を施したが、ワクチンペプチドは不完全フロイントアジュバントで乳化した。血液サンプルを42日目及び63日目に採取した。第II群の対照マウスには、アジュバントで乳化はしたもののワクチンペプチドを含まないPBSを、第I群のマウスと同じ方法で初回免疫及び追加免疫注射した。血漿サンプルは、ウサギの血漿サンプルについて上に記載した通りに調製した。
第I群の全てのマウスは、上述の直接ELISAにより広範囲の血漿希釈液(1:10〜1:1,000,000)で測定したときかなりの力価の抗CETP抗体を有していた(図7参照)。さらに、第I群の6匹のマウスのうちの3匹は、(上記実施例3においてウサギrb#2及びRb#3について見出されたものと同様の)組換えヒトCETPへの結合についてモノクローナル抗体TP2と競合する抗CETP抗体を有することが明らかにされた。
実施例6.アテローム性動脈硬化症のコレステロール給餌モデルにおける内因性CETPに対するウサギの免疫感作
上記実施例1の合成ワクチンペプチド(配列番号2)を、内因性ウサギCETPに対する免疫応答を誘発するこのワクチンペプチドの能力及びアテローム性動脈硬化の発症を防ぎ、もしくは低減させる能力を調べるため、ニュージーランドシロウサギに注射した。第I群は6匹のウサギ(rb#1〜rb#6)を含み、これらの各々にはワクチンペプチドの投与プロトコルを施した。第II対照群は、ワクチン接種はしたものの高コレステロール餌は与えない6匹のウサギ(rb#7〜12)を含んでいた。第III対照群は、ワクチン接種せず、かつ高コレステロール餌を与えない6匹のウサギ(rb#13〜18)を含んでいた。第IV対照群は、ワクチン接種はしないが高コレステロール餌を与える6匹のウサギ(rb#19〜24)を含んでいた。高コレステロール餌は、ワクチンによる最終追加免疫の4週間後から開始して合計17週間与えた。
これらのウサギにおいてワクチンペプチドを試験するための一般的なプロトコルを下記表1に示す。0日目に、製造者の指示に従ってペプチド(100μg)をRIBITMアジュバント系(RIBIイムノケム・リサーチ社、ハミルトン、モンタナ州)に懸濁して最終容量を1000μlとし、第I群及び第II群のウサギの各々に2ヶ所の筋肉内部位(部位当り250μl)に、2ヶ所の皮下部位(部位当り100μl)に、及び6ヶ所の皮内部位(部位当り50μl)に注射した。28日目に、追加免疫(RIBITMアジュバント系中ペプチド100μg)を0日目と同様に投与した。49日目に、もう一回の追加免疫(RIBITMアジュバント系中ペプチド100μg)を0日目と同様に投与した。77日目に、第I群及び第IV群に0.25%(w/w)コレステロール強化餌(コレステロールを補給したウサギ餌(ファーマーズ・エクスチェンジ(Farmer's Exchange)、フラミンガム、MA))を与えた。第II群及び第III群には、同じではあるがコレステロールを補給していないウサギ餌(ファーマーズ・エスクチェンジ、フラミンガム、MA)を与えた。
血液サンプル(約1〜5ml)を、各ウサギの耳から、各初回注射の前(「予備採血」)及び型通りにその後約2週間毎に採取した。血漿サンプルを、血漿から細胞性成分を分離する標準的な遠心法によって調製した。血漿サンプルを−70℃で保存した。全ての群の血漿サンプルを抗CETP抗体の存在及びその力価の増加について、並びに総血漿コレステロール及び血漿HDL−Cレベルについて分析した。
実施例7.アテローム性動脈硬化型(高コレステロール血症)モデルにおけるワクチン接種ウサギでの抗CETP抗体の産生
抗組換えヒトCETP抗体の力価を測定するための直接ELISA
サンドイッチ酵素結合イムノソルベントアッセイ(ELISA)を抗CETP抗体を含有する血漿サンプルの力価の測定に用いた。この構成では、組換えヒトCETP(コロンビア大学の受託機関、(ニューヨーク、ニューヨーク州)のライセンスを受けた組換えCHO細胞系CHO(AT)から得られるヒトr CETP)をマイクロタイター皿のウェルに吸着させ、第I群〜第IV群のウサギに由来するウサギ血漿の様々な希釈物を各ウェルに加えた。NUNCマキシソルブ96ウェルプレートの各ウェルは、PBS中のヒトr CETPの1μg/ml溶液100μlに4℃で一晩さらすことによりコーティングした。非特異的結合は、PBS及び0.05%ツィーン中のBSAの1%溶液を各ウェルに添加し、150rpmの回転振盪器上で室温(20°〜22℃)で2時間インキュベートすることによりブロックした。その後、ウェルをELISA洗浄バッファ(PBS+0.05%ツィーン)で4回洗浄した。次に、血漿サンプルを希釈バッファ(PBS中の1%BSA)で1:10に希釈した後、同じバッファで2倍段階希釈を6回実施した。希釈サンプル(100μl)をウェルに加え、150rpmの回転振盪器上で室温で2時間インキュベートした後、ELISA洗浄バッファ(PBS+0.05%ツィーン)で4回洗浄した。結合した抗CETP抗体を検出するため、希釈バッファ中のホースラディッシュペルオキシダーゼ(HRP)標識ヤギ抗ウサギ免疫グロブリン(サザーン・バイオテクノロジー・アソシエーツ社;バーミンガム、アラバマ州)の1:10,000希釈液100μlを添加し、プレートを150rpmの回転振盪器上で室温で2時間インキュベートした。その後、ウェルをELISA洗浄バッファ(上記参照)で4回洗浄し、ペルオキシダーゼ基質TMB(TMBペルオキシダーゼ基質、カーグガード&ペリー・ラボラトリーズ社、ガイザースバーグ、メリーランド州)を添加してプレートを室温で30分間インキュベートした。光学密度の変化を、ELISAリーダー(例えば、E−max、モレキュラー・デバイス社、メンロパーク、カリフォルニア州)を用いて、450nmで分光光度的に監視した。このアッセイにおいて、このO.D.は血漿サンプル中に存在する抗CETP抗体の量に正比例した。これらの結果は、12匹のワクチン接種ウサギ(第I群及び第II群)のうちの5匹が組換えヒトCETPに特異的な抗CETP抗体を産生することを示した。未処理第III及び第IV対照群では抗組換えヒトCETP抗体は産生されなかった。
自己反応性抗ウサギ(内因性)CETP抗体の力価を測定するための直接ELISA
配列番号4に示すヒトCETP配列のカルボキシル末端領域のアミノ酸457〜476に相当する配列番号7の配列:LQMDFGFPKHLLVDFLQSLSを有する、内因性ウサギCETPのアミノ酸配列を有するペプチド(ウサギペプチド)を、クオリティ・コントロールド・バイオケミカルズ社(ホプキントン、マサチューセッツ州)による標準ペプチド合成法を用いて要望通り合成した。このウサギCETPアミノ酸配列のこの部分は、ヒトの配列(配列番号4)の465位のグルタミン酸残基がリシン残基で置換されていることで、ヒトCETP配列とは異なる(配列番号7のアミノ酸9を参照)。このアッセイの目的のため、このウサギペプチドをビオチンル化誘導体(ビチオンがアミノ末端ロイシン残基に共有結合されている)として購入した。
予めブロックされたストレプトアビジン被覆マイクロタイタープレートを以下の通りに調製した。PBS中の5μg/mlストレプトアビジン(カタログ#43−4302、ジムド・ラボラトリーズ社(Zymed Laboratories, Inc.)、S.サンフランシスコ、CA)100μlを、着脱可能なストリップを有する96ウェルマイクロプレート(カタログ#950−2950−00P、ラブシステムズ(LabSystems)、ニードハム、MA)の各ウェルに分注し、密封して室温で一晩インキュベートした。各ウェルの内容物を吸引した後、プレートを洗浄し、1%BSA、5%ショ糖、0.05%ツィーン20及び0.1%硫酸ゲンタマイシンを含有するPBS 300μlを用いて室温で一晩ブロックした。翌日、ウェルを空にして一晩乾燥させた後、使用に供するまで乾燥剤と共に密封して4℃で保存した。その後、ウサギペプチドを各ウェルに添加し(10%(w/v)ウシ血清アルブミン(BSA)を補足した、PBS(ギブコ(GIBCO)BRL)中の1μg/ml溶液100μl)、150rpmで振盪しながら、室温(22℃)で1時間インキュベートした。プレートを洗浄バッファ(0.05%ツィーン20を補足したPBS)で3回洗浄して未結合のペプチドを除去した。ウサギ血漿サンプルを5%BSA及び1%ゼラチンを補足したPBSで希釈し(最初に1:40、その後段階的に1/2に)、各希釈液100μlを150rpmで振盪しながら室温で90分間インキュベートした。その後、プレートを洗浄バッファで3回洗浄した。ホースラディッシュペルオキシダーゼで標識したヤギ抗ウサギIgG(サザーン・バイオテクノロジー・アソシエーツ社、バーミンガム、AL)を洗浄バッファで1:5000に希釈し、その100μlを各ウェルに添加した後、150rpmで振盪しながら室温で90分間インキュベートした。プレートを洗浄バッファで3回洗浄した後、ペルオキシダーゼ基質TMB(TMBペルオキシダーゼ基質、カークガード&ペリー・ラボラトリーズ社、ガイザースバーグ、メリーランド)を添加してインキュベートし、そのプレートを室温で30分間インキュベートした。光学密度の変化を、ELISAリーダー(例えば、E−max、モレキュラー・デバイス社、メンロパーク、カリフォルニア州)を用いて、450nmで分光光度的に監視した。このアッセイにおいて、O.D.は血漿サンプル中に存在する抗ウサギCETP抗体の量に正比例した。
これらの結果は、最終追加免疫の3週間後(及び第I群及び第IV群にコレステロール補給餌を投与する前)に、12匹のワクチン接種動物のうちの6匹(第I群及び第II群の各々から3匹)が内因性ウサギCETP配列から誘導されるペプチドと反応する抗体を産生したことを示す(図10A及び10Bを参照)。
これらのデータは、ワクチンペプチドがウサギ内因性CETPに対する自己反応性抗体を誘発することが可能であることを示した。これは、破傷風毒素T細胞エピトープとCETPのカルボキシル末端領域のB細胞エピトープの組み合わせが、特定の自己タンパク質、すなわち、この場合は内因性ウサギCETP、に対する寛容を破壊することが可能であることを示す。
実施例9.アテローム性動脈硬化症モデルにおけるワクチン接種ウサギの血漿サンプル中のコレステロール及びHDLレベル
実施例6の各群のウサギからワクチン接種プロトコルの様々な時期(日)に採取した血漿サンプルを、総コレステロール(図11)及びHDL−C(図12)の濃度についてもアッセイした。総血漿コレステロール及びHDL−Cレベルは、標準的な商業アッセイ(ワコー・ケミカルUSA社、リッチモンド、バージニア州)を用いて決定した。
第I群(ワクチン接種)及び第IV群(非ワクチン接種)の血漿サンプルは、コレステロール補給餌の投与により、総コレステロールの増加(高コレステロール血症)を示した(図11)。第II群(ワクチン接種)及び第III群(非ワクチン接種)は餌誘発高コレステロール血症を示さなかった(図11)。
同様に、コレステロール補給餌を与えた第I群及び第IV群はHDL−Cの増加を示した(図12)。第II群のデータの予備分析により、最高の抗CETP抗体力価を有する3匹の動物も、ワクチン接種前のレベルと比較してHDL−Cのレベルの増加を示すことが示された。また、この予備分析により、第III群の5匹の動物のうちの3匹において、ワクチン接種前のレベルと比較してHDL−Cのレベルに有意な変化が観察されないことも示された。
実施例10.アテローム性動脈硬化症のコレステロール給餌モデルにおけるウサギの大動脈アテローム硬化性病変の測定
第I群及び第IV群にコレステロール補給餌を、及び第II群及び第III群に対照餌(コレステロールの補給なし)を17週間与えた後、全ての生存するウサギ(第I群及び第IV群において4匹、第II群において5匹、第III群において6匹)から大動脈を摘出した。非生存ウサギの死は、剖検によって、毛球(hair ball)によるものであり、したがって、実験の設計によるものではないことが示された。アテローム性動脈硬化症病変を調べる正面からの検分のため、各々の大動脈を切開した。大動脈の全長、すなわち心臓内の大動脈弓から下腹部の分岐まで、をオイルレッド0で染色して病変を検出した。病変を測定し、コンピュータプログラム(ザ・モルホメーター(The Morphometer)、ウッズ・ホール・エデュケーショナル・アソシエーテッド(Woods Hole Educational Associated)、ウッズ・ホール、MA)を用いてデータを定量化した。
この分析の図13の結果は、第IV群の動物(非ワクチン接種、コレステロール補給餌)における病変の大きさと比較した場合の第I群(ワクチン接種、コレステロール補給餌)の動物における病変の大きさの統計的に有意な減少を示した。これらの結果は、ペプチドワクチンが、コレステロール補給(高コレステロール血症)餌が与えられた動物におけるアテローム性動脈硬化症病変の面積を50%を超えて減少させることが可能であることを示した。非ワクチン接種動物(第IV群)は平均で大動脈の全面積の45%を覆う病変を有していた。これに対して、ワクチン接種動物(第I群)は平均で大動脈の全面積の19%を覆う病変を有していた。
幾つかの態様を上に説明したが、当業者であれば、記載された組成物及び方法の修正及び変更を本発明の精神又は添付の請求の範囲から逸脱することなくなし得ることを理解するであろう。ここに引用される論文及び刊行物は参考としてここに組み入れるものとする。
配列表
(1)一般的な情報
(i)出願人:リッターシャウス,チャールズ,ダブリュー.
トーマス,ローレンス ジェイ.
(ii)発明の名称:コレステロールエステル転移タンパク質(CETP)活性のモジュレーション
(iii)配列の数:9
(iv)住所:
(A)名宛人:バーナー & アレグレッティ,Ltd.
(B)通り名:75ステートストリート
(C)都市名:ボストン
(D)州名:マサチューセッツ
(E)国名:米国
(F)郵便番号:02109
(v)コンピューター読み取り可能形式::
(A)媒体の形式:フロッピーディスク
(B)コンピューター:IBM PC互換機
(C)オペレーティングシステム:PC−DOS/MS−DOS
(D)ソフトウェア:WordPerfect 6.1
(vi)本出願のデータ:
(A)出願番号:(未だ付与されていない)
(B)出願日:1996年5月1日
(C)分類:
(vii)先の出願のデータ:
(A)出願番号:08/432,483
(B)出願日:1995年5月1日
(viii):代理人に関する情報
(A)名称:ヤンクビック,レオン アール.
(B)登録番号:30,237
(C)参照/事件番号:95,179−B(TCS−204−PCT)
(2)配列番号:1:
(i)配列の特色
(A)配列の長さ:26アミノ酸
(B)配列の型: アミノ酸
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:ペプチド
(iii)仮想配列:
(iv)アンチセンス:
(ix)配列の特徴:
(A)名称:ヒトCETPのカルボキシ末端26アミノ酸
(B)存在位置:
(x)公表に関する情報:
(A)著者:ドライナ,デニス,ら
(B)題名:ヒトコレステロールエステル転移cDNAのクローニングおよび配列決定
(C)雑誌名:Nature
(D)巻:327
(E)発行:
(F)頁:632〜634
(G)日付:1987年6月18日
(K)配列番号1における適切な残基:1〜26
(xi)配列:
(2)配列番号:2:
(i)配列の特色
(A)配列の長さ:31アミノ酸
(B)配列の型: アミノ酸
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:ペプチド
(iii)仮想配列:
(iv)アンチセンス:
(ix)配列の特徴:
(A)名称:
(B)存在位置:
(xi)配列:
(2)配列番号:3:
(i)配列の特色
(A)配列の長さ:21アミノ酸
(B)配列の型: アミノ酸
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:ペプチド
(iii)仮想配列:
(iv)アンチセンス:
(ix)配列の特徴:
(A)名称:21アミノ酸の破傷風毒素ユニバーサルヘルパーT細胞エピトープ
(B)存在位置:
(x)公表に関する情報:
(A)著者:パニア−ボーディントン,ピー,ら
(B)題名:普遍的抗原性のT細胞エピトープ:ヒトMHCクラスIIへの不規則な結合およびT細胞による不規則な認識
(C)雑誌名:European Jouranal of Immunology
(D)巻:19
(E)発行:
(F)頁:2237〜2242
(G)日付:1989年
(K)配列番号3における適切な残基:1〜21
(xi)配列:
(2)配列番号:4:
(i)配列の特色
(A)配列の長さ:476アミノ酸
(B)配列の型: アミノ酸
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:ペプチド
(iii)仮想配列:
(iv)アンチセンス:
(ix)配列の特徴:
(A)名称:成熟ヒトCETPのアミノ酸配列
(B)存在位置:
(x)公表に関する情報:
(A)著者:ドライナ,デニス,ら
(B)題名:ヒトコレステロールエステル転移cDNAのクローニングおよび配列決定
(C)雑誌名:Nature
(D)巻:327
(E)発行:
(F)頁:632〜634
(G)日付:1987年6月18日
(K)配列番号4における適切な残基:1〜476
(xi)配列:
(2)配列番号:5:
(i)配列の特色
(A)配列の長さ:1428塩基
(B)配列の型: 核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:cDNA
(iii)仮想配列:
(iv)アンチセンス:
(ix)配列の特徴:
(A)名称:成熟ヒトCETPのコード配列
(B)存在位置:
(x)公表に関する情報:
(A)著者:ドライナ,デニス,ら
(B)題名:ヒトコレステロールエステル転移cDNAのクローニングおよび配列決定
(C)雑誌名:Nature
(D)巻:327
(E)発行:
(F)頁:632〜634
(G)日付:1987年6月18日
(K)配列番号5における適切な残基:1〜1428
(xi)配列:
(2)配列番号:6:
(i)配列の特色
(A)配列の長さ:496アミノ酸
(B)配列の型: アミノ酸
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:タンパク質
(iii)仮想配列:
(iv)アンチセンス:
(ix)配列の特徴:
(A)名称:成熟ウサギCETPタンパク質のアミノ酸配列
(B)存在位置:
(x)公表に関する情報:
(A)著者:ナガシマ,マリコ,ら
(B)題名:ウサギコレステロールエステル転移タンパク質のクローニングおよびmRNAの組織分布
(C)雑誌名:J. Lipid Res.
(D)巻:29
(E)発行:
(F)頁:1643〜1649
(G)日付:1988年
(K)配列番号6における適切な残基:1〜496
(xi)配列:
(2)配列番号:7:
(i)配列の特色
(A)配列の長さ:1488塩基対
(B)配列の型: 核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:cDNA
(iii)仮想配列:
(iv)アンチセンス:
(ix)配列の特徴:
(A)名称:成熟ウサギCETPのコード配列
(B)存在位置:
(x)公表に関する情報:
(A)著者:ナガシマ,マリコ,ら
(B)題名:ウサギコレステロールエステル転移タンパク質のクローニングおよびmRNAの組織分布
(C)雑誌名:J. Lipid Res.
(D)巻:29
(E)発行:
(F)頁:1643〜1649
(G)日付:1988年
(K)配列番号7における適切な残基:1〜1488
(xi)配列:
(2)配列番号:8
(i)配列の特色
(A)配列の長さ:50アミノ酸
(B)配列の型:アミノ酸
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:ペプチド
(iii)仮想配列:
(iv)アンチセンス:
(ix)配列の特徴:
(A)名称:
(B)存在位置:
(xi)配列:
(2)配列番号:9:
(i)配列の特色
(A)配列の長さ:50アミノ酸
(B)配列の型:アミノ酸
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:ペプチド
(ix)配列の特徴:
(A)名称:
(B)存在位置:
(xi)配列:
Claims (37)
- コレステリルエステル転移タンパク質(CETP)のB細胞エピトープ部分を含有するB細胞エピトープ部分と結合された、広域ヘルパーT細胞エピトープを含有するヘルパー細胞エピトープ部分を含んでなる単離された抗原性ペプチドであって、哺乳類宿主に投与される際に、宿主の内因性CETPと結合する抗体の産生を引き起こすことが可能である、上記ペプチド。
- CETPがヒトCETPである、請求項1に記載のペプチド。
- B細胞エピトープ部分がB細胞または抗体により認識される配列番号4の少なくとも6個の連続アミノ酸からなるヒトCETPの一部を含有する、請求項2に記載のペプチド。
- B細胞エピトープ部分が、配列番号4のアミノ酸349〜367により規定されるアミノ酸配列、配列番号4のアミノ酸461〜476により規定されるアミノ酸配列、抗原エピトープ同定アルゴリズムにより同定されたCETPのアミノ酸配列、中性脂肪結合に関与するCETPの領域、または中性脂肪転移活性に関与するCETPの領域からなる群から選択される、請求項2に記載のペプチド。
- B細胞エピトープ部分がヒトCETPのカルボキシル末端の26アミノ酸(配列番号1)の6〜26個の連続アミノ酸からなるペプチドである、請求項3に記載のペプチド。
- ヘルパーT細胞エピトープ部分が破傷風毒素、ジフテリア毒素、百日咳菌ワクチン、カルメット-ゲラン桿菌(BCG)、ポリオワクチン、麻疹ワクチン、おたふくかぜワクチン、風疹ワクチン、ツベルクリンの精製タンパク質誘導体、キーホールリンペットヘモシアニン、hsp70およびこれらの組合せからなる群から選択される免疫原性ペプチドから誘導されたヘルパーT細胞エピトープを含有する、請求項1〜5のいずれか1項に記載のペプチド。
- ヘルパーT細胞エピトープ部分が破傷風毒素タンパク質のアミノ酸830〜843(配列番号2のアミノ酸2〜15)のアミノ酸配列、破傷風毒素タンパク質のアミノ酸947〜967(配列番号3)のアミノ酸配列およびこれらの組合せを含有する、請求項1〜5のいずれか1項に記載のペプチド。
- アミノ末端システイン残基を有する、請求項1〜7のいずれか1項に記載のペプチド。
- B細胞エピトープ部分がヘルパーT細胞エピトープ部分に共有結合される、請求項1に記載のペプチド。
- B細胞エピトープ部分がペプチド結合またはジスルフィド結合を介してヘルパーT細胞エピトープ部分に共有結合される、請求項9に記載のペプチド。
- B細胞エピトープ部分が架橋剤分子を介してヘルパーT細胞エピトープ部分に結合される、請求項1に記載のペプチド。
- B細胞エピトープ部分がアミノ酸橋を介してヘルパーT細胞エピトープ部分に結合される、請求項1に記載のペプチド。
- 配列番号2のアミノ酸配列を有する、請求項1に記載のペプチド。
- 1つの共通の担体分子に結合された、請求項1〜5のいずれか1項に規定されるB細胞エピトープ部分と請求項6または7に規定されるヘルパーT細胞エピトープ部分とを含んでなるワクチンペプチド。
- 多コピー数の補体タンパク質C3dに共有結合された、請求項1〜13のいずれか1項に記載のペプチドまたは請求項14に記載のワクチンペプチド。
- 補体タンパク質C3dとin vivoで共有結合するようになる炭水化物構造により誘導体化された、請求項1〜13のいずれか1項に記載のペプチドまたは請求項14に記載のワクチンペプチド。
- 2以上のヘルパーT細胞エピトープ部分および/または2以上のB細胞エピトープ部分を含んでなる、請求項1〜13、請求項15または16のいずれか1項に記載のペプチド、あるいは請求項14に記載のワクチンペプチド。
- 薬学的に許容し得る担体またはアジュバンド、ならびに請求項1〜13および15〜16のいずれか1項に記載のペプチドおよび請求項14に記載のワクチンペプチドから選択される1以上のペプチドを含んでなるワクチン組成物。
- 医薬品として使用するための、請求項1〜13および15〜16のいずれか1項に記載のペプチド。
- 前記宿主において循環LDL、VLDLまたは総コレステロールに対する循環HDLの比率を高めることに使用するための、請求項1〜13および15〜16のいずれか1項に記載のペプチド。
- 前記宿主において内因性CETP活性のレベルを低下させることに使用するための、請求項1〜13および15〜16のいずれか1項に記載のペプチド。
- 前記宿主においてHDL-コレステロールの異化作用を改変してアテローム性動脈硬化症病変の発生を低下させることに使用するための、請求項1〜13および15〜16のいずれか1項に記載のペプチド。
- 前記宿主においてアテローム性動脈硬化症を治療的または予防的に処置することに使用するための、請求項1〜13および15〜16のいずれか1項に記載のペプチド。
- 内因性CETP活性を調節するための、またはアテローム性動脈硬化症を治療的もしくは予防的に処置するための抗CETPワクチンを調製する方法であって、
主要組織適合性遺伝子複合体(MHC)クラスIのT細胞エピトープを含まない、
CETPのB細胞エピトープを含んでなるB細胞エピトープ部分を選択し、
CETPに由来しない免疫原性ペプチドから誘導された広域ヘルパーT細胞エピトープ部分を選択し、そして
B細胞エピトープ部分と広域ヘルパーT細胞エピトープ部分とを結合させて抗原性部分を形成させる、
ことを含んでなる上記方法。 - B細胞エピトープ部分が請求項1〜5のいずれか1項に規定されるものであり、かつヘルパーT細胞エピトープ部分が請求項6または7に規定されるものである、請求項24に記載の方法。
- B細胞エピトープ部分が請求項10〜15のいずれか1項に規定されるように広域ヘルパーT細胞エピトープ部分に結合される、請求項24または25に記載の方法。
- ヒトまたは動物において内因性抗CETP抗体を引き出すことに使用する医薬品の製造における、請求項1〜13および15〜16のいずれか1項に記載のペプチド、請求項14に記載のワクチンペプチド、または請求項18に記載のワクチン組成物の使用。
- 医薬品として使用するための、請求項14に記載のワクチンペプチド。
- 前記宿主において循環LDL、VLDLまたは総コレステロールに対する循環HDLの比率を高めることに使用するための、請求項14に記載のワクチンペプチド。
- 前記宿主において内因性CETP活性のレベルを低下させることに使用するための、請求項14に記載のワクチンペプチド。
- 前記宿主においてHDL-コレステロールの異化作用を改変してアテローム性動脈硬化症病変の発生を低下させることに使用するための、請求項14に記載のワクチンペプチド。
- 前記宿主においてアテローム性動脈硬化症を治療的または予防的に処置することに使用するための、請求項14に記載のワクチンペプチド。
- 医薬品として使用するための、請求項18に記載のワクチン組成物。
- 前記宿主において循環LDL、VLDLまたは総コレステロールに対する循環HDLの比率を高めることに使用するための、請求項18に記載のワクチン組成物。
- 前記宿主において内因性CETP活性のレベルを低下させることに使用するための、請求項18に記載のワクチン組成物。
- 前記宿主においてHDL-コレステロールの異化作用を改変してアテローム性動脈硬化症病変の発生を低下させることに使用するための、請求項18に記載のワクチン組成物。
- 前記宿主においてアテローム性動脈硬化症を治療的または予防的に処置することに使用するための、請求項18に記載のワクチン組成物。
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