AT505574B1 - Mimotope zur behandlung von atherosklerose - Google Patents

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Description

SsttfKsciisschis patent AT505 574B1 2009-09-15
Beschreibung [0001] Die Erfindung betrifft die Prävention und Behandlung von Atherosklerose.
[0002] Periphere arterielle Verschlusskrankheit, koronare Herzkrankheit sowie apoplektischer zerebraler Insult, gehören noch immerzu den Haupttodesursachen in den Vereinigten Staaten, Europa und in großen Teilen Asiens. Die Entstehung der Atherosklerose wird als chronischprogressive Entzündung der arteriellen Gefäßwand angesehen, die durch eine komplexe Wechselwirkung von Wachstumsfaktoren, Cytokinen und Zellinteraktionen gekennzeichnet ist. Gemäß der „Reaktion-auf-Verletzung"-Hypothese stellt die „Verletzung" des Endothels das anfängliche Ereignis der Erkrankung dar, das zu einer endothelialen Dysfunktion führt, die eine Kaskade von Zellinteraktionen auslöst, welche in der Bildung der atherosklerotischen Läsionen kulminieren. Als Risikofaktoren, die eine solche „Verletzung" fördern, werden exogene und endogene Einflüsse erwähnt, die statistisch signifikant mit der Atherosklerose korrelieren. Erhöhtes und modifiziertes LDL, Lp(a), arterielle Hypertonie, Diabetes mellitus und Hyperho-mocysteinämie zählen beispielsweise zu den wichtigsten dieser das Endothel schädigenden Faktoren. Da das Endothel keine starre, sondern eher eine extrem dynamische Barriere bildet, treten im Laufe der endothelialen Dysfunktion zusätzlich zu einer erhöhten Permeabilität für Lipoproteine eine Vielzahl von molekularen Veränderungen auf, welche die Wechselwirkung von Monozyten, T-Lymphozyten und Endothel-Zellen entscheidend beeinflussen. Durch die Expression von endothelialen Adhäsions-Molekülen von der Art der E-, L- und P-Selektine, Integrine, ICMA-1, VCAM-1 und „Platelet-Endothelial-Cell Adhesion Molecule-1", kommt es zu einer Adhäsion von Monozyten und T-Lymphozyten an der Lumen-Seite. Die nachfolgende Migration der Leukozyten über das Endothel wird durch MCP-1, lnterleukin-8, PDGF, M-CSF und Osteopontin vermittelt. Über den sogenannten „Scavenger'-Rezeptor können Makrophagen und Monozyten, die in der Intima vorhanden sind, die eingedrungenen LDL-Partikel aufnehmen, um sie als Vakuolen von Cholesterinestern im Zytoplasma abzulagern. Die auf diese Weise gebildeten Schaumzellen sammeln sich hauptsächlich in Gruppen im Bereich der Gefäß-Intima an und bilden die bereits in der Kindheit auftretenden „Fettstreifen'-Läsionen („fatty streak lesions"). LDL sind Lipoproteine mit geringer Dichte und werden durch katabolische Auswirkungen lipolytischer Enzyme aus Triglycerid-reichen VLDL-Partikeln gebildet. Neben ihrer schädigenden Eigenschaften auf Endothel-Zellen und Zellen der glatten Muskulatur der Media hat LDL außerdem eine chemotaktische Wirkung auf Monozyten und kann die Expression von MCFS und MCP-1 der Endothel-Zellen über Gen-Amplifikation steigern. Im Gegensatz zu LDL kann HDL Cholesterinester aus beladenen Makrophagen, übermittelt durch Apolipopro-tein E unter Bildung sogenannter HDLc-Komplexe aufnehmen. Durch die Interaktion der SR-B1-Rezeptoren können diese mit Cholesterinester beladenen Partikel an Hepatozyten oder an Zellen der adrenalen Cortex binden und Cholesterin für die Erzeugung von Gallensäuren bzw. Steroiden liefern. Dieser Mechanismus wird reverser Cholesterintransport genannt und erklärt die Schutzfunktion von HDL. Aktivierte Makrophagen können Antigene über HLA-DR präsentieren und dadurch CD4-und CD8-Lymphozyten aktivieren welche folglich stimuliert werden, um Cytokine, wie IFN-gamma und TNF-alpha, zu sezernieren und außerdem zur Verstärkung der entzündlichen Reaktion beitragen. Im weiteren Verlauf der Krankheit beginnen die glatten Muskelzellen der Media in den Bereich der Intima zu wachsen, welcher durch die Entzündung verändert wurde. Dadurch bildet sich die intermediäre Läsion in diesem Stadium. Ausgehend von der intermediären Läsion entwickelt sich im Lauf der Zeit die progressive und komplizierte Läsion, welche morphologisch durch einen nekrotischen Kern, Zellabfall und eine Kollagen-reiche fibrinöse Kappe auf der Seite des Lumens gekennzeichnet ist. Wenn die Zellzahl und der Anteil der Lipoide kontinuierlich ansteigen, kommt es zu Rissen im Endothel, und Oberflächen mit thrombotischen Eigenschaften werden freigelegt. Infolge des Anhaftens und der Aktivierung von Thrombozyten an diesen Rissen werden Granula freigesetzt, die Cytokine, Wachstumsfaktoren und Thrombin enthalten. Proteolytische Enzyme der Makrophagen sind für das Ausdünnen der fibrinösen Kappe verantwortlich, was letztlich zu einem Aufbrechen der Plaques mit nachfolgender Thrombose und Stenose der Gefäße und einer akuten Ischämie der terminalen Gefäße führt. 1 /97 tereidisd'is patentt AT505 574 B1 2009-09-15 [0003] Verschiedene Risikofaktoren werden für die Bildung atherosklerotischer Läsionen verantwortlich gehalten. Hyperlipoproteinämie, arterielle Hypertonie und Nikotinabusus sind von besonderer Bedeutung in dieser Hinsicht. Eine Krankheit, die mit einer übermäßigen Erhöhung des gesamten und des LDL-Cholesterins verbunden ist, ist die familiäre Hypercholesterinämie. Sie gehört zu den häufigsten monogenetisch vererbten Stoffwechselerkrankungen. Die moderate heterozytoge Form tritt mit einer Häufigkeit von 1:500, die homozygote Form mit 1:1 Million deutlich viel seltener auf. Ursachen für die familiäre Hypercholesterinämie sind Mutationen im LDL-Rezeptor-Gen am kurzen Arm des Chromosoms 19. Diese Mutationen können Deletionen, Insertionen oder Punkt-Mutationen sein. Der charakteristische Befund der Lipoproteine bei familiärer Hypercholesterinämie ist die Erhöhung des gesamten und des LDL-Cholesterins bei zumeist normalen Triglycerid- und VLDL-Konzentrationen. Häufig ist das HDL erniedrigt. Phänotypisch gibt es eine Typ IIAa-Hyperlipoproteinämie. Bei der heterozygoten Form ist das Gesamtcholesterin um das Zwei- bis Dreifache erhöht, bei der homozygoten Form ist es im Vergleich zum Normalwert um das Fünf- bis Sechsfache erhöht. Klinisch manifestiert sich die familiäre Hypercholesterinämie durch eine frühe Koronarsklerose. In der Regel treten bei heterozygoten Männern die ersten Symptome einer koronaren Herzkrankheit (KHK) zwischen ihrem 30. und 40. Lebensjahr auf, bei Frauen im Durchschnitt 10 Jahre später. 50% der betroffenen Männer sterben an den Folgen ihrer Koronarsklerose bevor sie 50 Jahre alt sind. Neben den massiv erhöhten LDL-Spiegeln sind auch erniedrigte HDL-Konzentrationen für das rapide Fortschreiten der Atherosklerose verantwortlich. Atherosklerotische Veränderungen können sich auch an extrakardialen Gefäßen, wie der Aorta, den Karotiden und peripheren Arterien, manifestieren. Bei der homozygoten Form der Erkrankung entsteht die Koronarsklerose schon in der frühen Kindheit. Der erste Myokardinfarkt tritt häufig vor dem 10. Lebensjahr auf, und in den meisten Fällen sterben die betroffenen Personen, bevor sie 20 Jahre alt sind. Das Entstehen von Xanthomen ist eine Funktion der Höhe des Serum-Cholesterins und der Dauer der Erkrankung. Etwa 75% der betroffenen heterozygoten Individuen, die über 20 Jahre alt sind, weisen tendinöse Xanthome auf. Die homozygoten Individuen haben in fast 100% Haut- und Sehnen-Xanthome. Lipidablagerungen können auch am Augenlid und in der Hornhaut auftreten (Xanthelasmen; Arcus lipoides). Diese sind jedoch kein spezifisches Anzeichen einer Hypercholesterinämie, da man sie auch bei normalen Cholesterinwerten findet. Weiters treten bei der FH häufig akute Arthritiden und Tendosynovitiden auf. Die einzelnen Lipoproteine unterscheiden sich hinsichtlich Größe und Dichte, da sie verschieden große Anteile von Lipiden und Proteinen, sogenannte Apoproteine, enthalten. Die Dichte nimmt mit zunehmendem Protein- und abnehmendem Lipid-Anteil zu. Infolge ihrer unterschiedlichen Dichten können sie durch Ultrazentrifugieren in verschiedene Fraktionen aufgetrennt werden. Dies ist die Basis für die Klassifizierung der Lipoproteine in ihre Hauptgruppen: Chylomikrone, Lipoproteine sehr geringer Dichte („very-low-density lipoproteins", VLDL), Lipoproteine intermediärer Dichte („intermediate-density lipoproteins", IDL), Lipoproteine geringer Dichte („low-density lipoproteins, LDL), Lipoproteine hoher Dichte („high-density lipoproteins", HDL), Lipoprotein (a) (Lp(a)). Zu den Lipo proteinen mit hohem atherogenem Potential zählen vor allem das LDL, das Lp(a) und das VLDL. LDL hat eine Dichte von etwa d=1,006-1,063 g/ml. Der Kern ist aus veresterten Cholesterinmolekülen gebildet. Dieser stark hydrophobe Kern ist von einer Hülle aus Phospholipiden, nicht-verestertem Cholesterin und einem einzigen apo BI00-Molekül umgeben. Außerdem findet man Apoprotein E an der Oberfläche der LDL-Partikel. Die Funktion des LDL besteht im Transportieren von Cholesterin an periphere Gewebe, wo es -über Vermittlung des Apoprotein B-100 - in die Zellen über den LDL-Rezeptor aufgenommen wird. In umfassenden epidemiologischen Untersuchungen konnte eine positive Korrelation zwischen der Höhe des Serum-Cholesterins und dem Auftreten einer koronaren Herzkrankheit nachgewiesen werden. LDL-Cholesterinmengen von mehr als 160 mg/dl stellen ein hohes kardiovaskuläres Risiko dar. Neben der Höhe des LDL-Cholesterins spielt auch die Höhe des Gefäßschützenden HDL-Cholesterins eine wichtige Rolle beim Abschätzen des Risikoprofils für kardiovaskuläre Erkrankungen. Mengen von weniger als 35 mg/dl sind mit einem erhöhten Risiko verbunden. VLDL sind Lipoproteine mit sehr geringer Dichte (d=0,94-1,006 g/ml) und einem hohen Triglycerid-Anteil. Im Wesentlichen enthält VLDL Apoprotein C und geringe Anteile der Apoproteine B-100 und E. Anders als Chylomikrone bestehen VLDL nicht aus Nahrungsmittel-Lipiden, sondern sie 2/97 tefüsdistiits patentt AT505 574 B1 2009-09-15 werden in der Leber aus endogen gebildeten Triglyceriden synthetisiert und in den Blutkreislauf sezerniert. Wie die Chylomikrone werden die Triglyceride durch die Apoprotein C-ll-aktivierte Lipoprotein-Lipase hydrolysiert, und die freien Fettsäuren werden dem Muskel- und Fettgewebe zugeführt. Die verbleibenden Cholesterin-reichen VLDL-Überreste werden wegen ihrer höheren Dichte Intermediate-density-Lipoproteine genannt. Lipoprotein(a) (Lp(a)) hat eine Dichte von 1,05 bis 1,12 g/ml und ist dem LDL in seiner Zusammensetzung ähnlich. Neben Apoprotein B-100 besteht sein Protein-Anteil aus dem Apoprotein(a), welches für Lp(a) charakteristisch ist. Bisher weiß man sehr wenig über die Physiologie und Funktion des Lp(a). Da das Apopro-tein(a)-Molekül eine hohe Sequenz-Homologie mit Plasminogen aufweist, nimmt man an, dass Lp(a) sowohl die Bildung von Thromben an atherosklerotischen Plaques fördert als auch eine atherogene Wirkung hat. Lp(a) findet man zusammen mit Apoprotein B in atherosklerotischen Läsionen. Retrospektive Untersuchungen zeigten eine Korrelation zwischen erhöhtem Lp(a) und einer KHK. Ebenso zeigte die Metaanalyse zahlreicher prospektiver Untersuchungen, dass Lp(a) ein unabhängiger Risikofaktor für das Auftreten einer KHK ist. Mengen von zwischen 15 und 35 mg/dl werden als normal angesehen. Bisher kann Lp(a) weder durch die Diät, noch durch Medikamente beeinflusst werden. Daher sind Therapie-Maßnahmen auf die Reduktion weiterer Risikofaktoren beschränkt. Insbesondere scheint eine Verringerung des LDL-Cholesterins das kardiovaskuläre Risiko von Lp(a) zu senken. Bei der Pathogenese der Atherosklerose wird außerdem den Gerinnungsfaktoren eine beträchtliche pathophysiologische Bedeutung beigemessen. Epidemiologische Erkenntnisse weisen auf eine Korrelation zwischen der Fibrinogen-Konzentration im Plasma und dem Entstehen einer koronaren Herzkrankheit und vor allem eines Myokardinfarkts hin. In diesem Zusammenhang erwiesen sich erhöhte Fibrinogenmengen (>300 mg/dl) als unabhängiger Indikator und Risikofaktor für kardiovaskuläre Erkrankungen. Es stehen aber auch hohe Konzentrationen des Gewebe-Plasminogen-Aktivator-Inhibitors tPA-l in einem Zusammenhang mit dem Auftreten der KHK. Das Verhältnis zwischen Hyper-Triglyceridämie und dem koronaren Risiko ist in jedem Fall ein anderes, je nach der Ursache der Erhöhung der Blut-Lipide. Trotz der Diskussion, ob Triglyceride als unabhängiger Risikofaktor anzusehen sind oder nicht, ist unbestritten, dass sie eine wichtige Rolle bei der Pathogenese der koronaren Herzkrankheiten spielen. Das Auftreten der Krankheit ist am höchsten bei Patienten, die hohes LDL-Cholesterin und einen hohen Triglycerid-Spiegel aufweisen.
[0004] Das Cholesterin-Ester-Transfer-Protein (CETP) ist ein stabiles Plasma-Glykoprotein, das für den Transfer neutraler Lipide und Phospholipide zwischen Lipoproteinen verantwortlich ist und das die Plasma-Konzentration von HDL niederreguliert. Die Hemmung der CETP-Lipidtransfer-Aktivität wurde bereits als therapeutischer Ansatz zur Steigerung des HDL-Plasma-Spiegels vorgeschlagen. Es gibt zahlreiche Gründe, die nahelegen, dass die Verringerung der CETP-Aktivität im Plasma zu einer Steigerung der HDL-Spiegel führen sollte. So senkt CETP die HDL-Konzentration durch den Transfer von Cholesterinestern von HDL zu LDL und VLDL. In Tierversuchen mit Kaninchen und Hamstern führte die vorübergehende Inhibierung von CETP mit monoklonalen anti-CETP-Antikörpern, Antisense-Oligonukleotiden oder CETP-Inhibitoren zu einer Erhöhung der HDL-Spiegel. Eine dauerhafte CETP-Inhibierung mit Antisense-Oligonukleotiden steigerte die HDL-Mengen und führte so zu einer Verringerung der atherosklerotischen Läsionen im Kaninchen-Tiermodell für Atherosklerose.
[0005] In der Literatur sind mehrere CETP-Inhibitoren beschrieben, von welchen einige sich in klinischen Versuchen befinden (z.B. Torcetrapib) (Sikorski, JA, J. Med. Chem. 49 (1) (2006): 1-22).
[0006] In der US 5,512,548 und in der WO 93/011782 sind Polypeptide und ihre Analoga beschrieben, die CETP, das den Transfer von Cholesterin-Estern von HDL zu VLDL und LDL katalysiert, inhibieren können, und daher bei Verabreichung an einen Patienten eine anti-atherosklerotische Aktivität aufweisen. Gemäß diesen Dokumenten stammt ein solcher CETP-Polypeptid-Inhibitor von Apolipoprotein C-l verschiedener Quellen, wobei insbesondere N-terminale Fragmente von bis zur Aminosäure 36 als CETP-Inhibitoren identifiziert wurden.
[0007] Auch in der US 5,880,095 A ist ein CETP-bindendes Peptid geoffenbart, das die Aktivi- 3/97 &t£S!iÄ»hi5 AT505 574B1 2009-09-15 tat von CETP bei einem Individuum inhibieren kann. Das CETP-inhibitorische Protein weist ein N-terminales Fragment von Schweine-Apolipoprotein C-Ill auf.
[0008] In US 2004/0087481 und US 6,410,022 B1 sind Peptide geoffenbart, die wegen der Induktion einer CETP-spezifischen Immunantwort zur Behandlung und Prävention kardiovaskulärer Erkrankungen, wie z.B. Atherosklerose, verwendet werden können. Diese Peptide weisen ein T-Helfer-Zell-Epitop auf, das nicht von CETP stammt, und mindestens ein B-Zell-Epitop, das von CETP kommt und direkt von letzterem abgeleitet werden kann. Das T-Helfer-Zell-Epitop ist vorteilhaft vom Tetanus-Toxoid abgeleitet und ist an mindestens ein B-Zell-Epitop von CETP kovalent gebunden. Durch Verwendung eines T-Helfer-Zell-Epitops, das für den Organismus fremd ist, wird es möglich, Antikörper im Körper eines Individuums zu induzieren, welche Antikörper gegen jenen Peptid-Teil gerichtet sind, der aus mindestens einem CETP-B-Zell-Epitop besteht.
[0009] In der WO 2006/029982 sind CETP-Mimotope zur Verwendung für die Herstellung eines Medikaments zur Behandlung oder Prävention von Atherosklerose beschrieben.
[0010] In der US 2006/276400 und WO 96/34888 werden Peptide, die von CETP direkt abgeleitet sind, geoffenbart, die CETP-T- und -B-Zell-Epitope aufweisen.
[0011] In jüngster Zeit gab es bereits Vorschläge für einen Vakzin-Ansatz hinsichtlich CETP. So wurden beispielsweise Kaninchen mit einem Vakzin behandelt, das jenes Peptid von CETP, das für den Cholesterin-Ester-Transfer verantwortlich ist, als Antigen enthielt. Die immunisierten Kaninchen hatten eine verringerte CETP-Aktivität und veränderte Lipoprotein-Spiegel mit gesteigerten HDL- und verringerten LDL-Werten. Außerdem wiesen die behandelten Versuchstiere des Atherosklerose-Modells im Vergleich zu Kontroll-Tieren verringerte atherosklero-tische Läsionen auf.
[0012] Die Ergebnisse einer klinischen Studie der Phase II wurden veröffentlicht, welche Studie von der amerikanischen Biotechnologie-Firma Avant mit dem Vakzin CETi-1 durchgeführt worden waren (BioCentury Extra For Wednesday, 22. Oktober 2003). In dieser Studie der Phase II wurde wie in der vorhergehenden Studie der Phase I ein sehr gutes Sicherheitsprofil ohne jegliche bedenkliche Nebenwirkungen nachgewiesen, was den Schluss zulässt, dass im Grunde keine Nebenwirkungen von einem anti-CETP-lmpfungs-Ansatz zu erwarten sind. Hinsichtlich der Wirksamkeit war jedoch das Avant-Vakzin enttäuschend, da es nicht zu erhöhten HDL-Spiegeln führte, die signifikant besser als jene waren, die mit einer Placebo-Behandlung erreichtwurden.
[0013] Das Problem mit dem CETi-1-Vakzin ist, dass es endogenes Antigen verwendet. Das humane Immunsystem ist gegenüber endogenen Strukturen tolerant, da bei den meisten der endogenen Moleküle - anders als bei CETP - es lebensnotwendig ist, dass keine Autoantikörper gebildet werden. Somit war es das Ziel des CETi-l-Vakzins, die endogene Toleranz zu brechen, was ihm offensichtlich nicht in ausreichendem Maß gelang.
[0014] Somit ist es das Ziel der vorliegenden Erfindung, Antigene für ein anti-CETP-Vakzin vorzusehen, welche so ausgewählt sind, dass sie vom Immunsystem als fremd angesehen werden und daher keine Selbst-Toleranz brechen müssen. Diese Antigene können zur Prävention und/oder Behandlung von Atherosklerose verwendet werden.
[0015] Daher betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung einer Verbindung, welche die Aminosäuresequenz FX8FPX9HX10X11X12DX2X3X4X5X6X7 [0016] umfasst, worin X8 ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus G, A, F, Y und K, X9 ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus E, Y, A, Q, K und S X10 ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Η, V, L, F und I,
X11 ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus L, W, S, I, F und Y 4/97 tarssÄiies patemt AT505 574B1 2009-09-15 X12 V, T, F oder I ist, X2 ein Aminosäurerest ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus F, W und Q, ist, X3 L oderS, ist, X4 QoderH, ist, X5 S oder Y ist, X6 L, A oder I ist, X7 S, N oder T ist und, kein Polypeptidfragment des Cholesterin-Ester-Transport-Proteins (CETP) oder ein CETP-Epitop ist oder umfasst, wobei die Verbindung eine Bindungskapazität an einen Antikörper hat, der für das natürliche CETP-Glykoprotein spezifisch ist, oder von DFGFPAHVFIDWLQSLS, zur Herstellung eines Medikaments zur Prävention und/oder Behandlung von Atherosklerose.
[0017] Die vorliegende Erfindung sieht CETP-Mimotope für diese Zwecke vor. Die CETP-Mimotope gemäß der vorliegenden Erfindung sind vorzugsweise antigene Polypeptide, die sich in ihrer Aminosäuresequenz von der Aminosäuresequenz des CETP oder von Fragmenten von CETP unterscheiden. In dieser Hinsicht können die erfindungsgemäßen Mimotope eine oder mehrere nicht-natürliche Aminosäuren (d.h. nicht von den 20 „klassischen" Aminosäuren) umfassen, oder sie können vollständig aus solchen nicht-natürlichen Aminosäuren zusammengesetzt sein. Außerdem können die erfindungsgemäßen Antigene, die anti-CETP-Antikörper induzieren, aus D- oder L-Aminosäuren oder aus Kombinationen von DL-Aminosäuren zusammengesetzt sein, und sie können gegebenenfalls durch weitere Modifikationen, Ringschlüsse oder Derivatisierungen verändert worden sein. Geeignete anti-CETP-Antikörper-induzierende Antigene können aus im Handel erhältlichen Peptid-Bibliotheken bereitgestellt werden. Vorzugsweise sind diese Peptide mindestens 4 Aminosäurereste lang, insbesondere mindestens 7 Aminosäuren, und bevorzugte Längen können bis zu 16, vorzugsweise bis zu 14 oder 20 Aminosäuren (z.B. 5 bis 16 Aminosäurereste) sein. Gemäß der Erfindung können jedoch auch sehr wohl längere Peptide als anti-CETP-Antikörper-induzierende Antigene verwendet werden. Weiters können die Mimotope der vorliegenden erfindung auch Teil eines Polypeptids sein und folglich an ihrem N- und/oder C-Terminus mindestens einen weiteren Aminosäurerest aufweisen.
[0018] Die Mimotope der vorliegenden Erfindung können an Antikörper binden, die durch Verabreichen von C-FGFPEHLLVDFLQSLS (16 C-terminale Aminosäuren des CETP-Proteins), gekoppelt an KLH, an Säuger erhalten werden. Sobald sie an einen Säuger verabreicht worden sind, können die Mimotope eine entsprechende Immunantwort induzieren, so dass gegen CETP gerichtete Antikörper in diesem Säuger erzeugt werden.
[0019] Zur Herstellung von CETP-Mimotopen (d.h. anti-CETP-Antikörper-induzierenden Antigenen) sind natürlich auch Phagen-Bibliotheken, Peptid-Bibliotheken geeignet, die z.B. mittels kombinatorischer Chemie erzeugt oder mittels Screening-Techniken mit hohem Durchsatz für die unterschiedlichsten Strukturen erhalten wurden (Display: A Laboratory Manual von Carlos F. Barbas (Hrsg.) et al.; Willats WG Phage display: practicalities and prospects. Plant Mol. Biol. 2002 Dec; 50 (6): 837-54).
[0020] Weiters können gemäß der Erfindung auch anti-CETP-Antikörper-induzierende Antigene auf Basis von Nukleinsäuren („Aptamere") verwendet werden, und auch diese sind in den unterschiedlichsten (Oligonukleotid)-Bibliotheken zu finden (z.B. mit 2-180 Nukleinsäureresten) (z.B. Burgstaller et al., Curr. Opin. Drug Discov. Dev. 5(5)(2002), 690-700; Famulok et al., Acc. Chem. Res. 33 (2000), 591-599; Mayer et al., PNAS 98 (2001), 4961-4965, usw.). Bei anti-CETP-Antikörper-induzierenden Antigenen auf Basis von Nukleinsäuren kann das Nukleinsäure-Gerüst beispielsweise durch die natürlichen Phosphor-Diester-Verbindungen oder auch durch Phosphortioate oder Kombinationen oder chemische Variationen (z.B. als PNA) vorgesehen werden, wobei erfindungsgemäß als Basen vor allem U, T, A, C, G, H und mC verwendet werden können.
[0021] Die 2'-Reste der Nukleotide, die gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, sind vorzugsweise H, OH, F, CI, NH2, O-Methyl, O-Ethyl, O-Propyl oder O-Butyl, 5/97 &t£S!iÄ»hi5 AT505 574B1 2009-09-15 wobei die Nukleinsäuren auch verschieden modifiziert sein können, d.h. z.B. mit Schutzgruppen, wie sie üblicherweise in der Oligonukleotid-Synthese verwendet werden. So sind auch anti-CETP-Antikörper-induzierende Antigene auf Aptamer-Basis bevorzugte anti-CETP-Antikörper-induzierende Antigene im Rahmen der vorliegenden Erfindung.
[0022] Gemäß der vorliegenden Erfindung bezieht sich der Ausdruck „Mimotop" auf ein Molekül, das eine Konformation hat, welche eine Topologie aufweist, die dem Epitop, welches es imitiert, äquivalent ist. Das Mimotop bindet an dieselbe Antigen-bindende Region eines Antikörpers, die immunspezifisch an ein gewünschtes Antigen bindet. Das Mimotop ruft eine immunologische Antwort bei einem Wirt hervor, der auf das Antigen, das es imitiert, reagiert. Das Mimotop kann auch als Kompetitor für das Epitop, welches es imitiert, in in vitro-lnhibitionstests (z.B. ELISA-Inhibitionstest) wirken, welche das Epitop und einen an das Epitop bindenden Antikörper umfassen. Ein Mimotop der vorliegenden Erfindung muss jedoch nicht unbedingt die Bindung des Epitops, das es imitiert, in einem in vitro-lnhibitionstest verhindern oder mit dieser konkurrieren, obwohl es bei Verabreichung an einen Säuger eine spezifische Immunantwort induzieren kann.
[0023] Wie hierin verwendet, bezieht sich der Ausdruck „Epitop" auf eine immunogene Region eines Antigens, die von einem bestimmten Antikörper-Molekül erkannt wird. Im Allgemeinen hat ein Antigen ein oder mehrere Epitope , die jedes einen Antikörper, der das bestimmte Epitop erkennt, binden können.
[0024] Die Abkürzungen für die in der vorliegenden Erfindung geoffenbarten Aminosäurereste folgen den lUPAC-Empfehlungen:
Aminosäure 3-Buchstaben-Code 1-Buchstaben-Code Alanin Ala A Arginin Arg R Asparagin Asn N Asparaginsäure Asp D Cystein Cys C Glutaminsäure Glu E Glutamin Gin Q Glycin Gly G Histidin His H Isoleucin Ile I Leucin Leu L Lysin Lys K Methionin Met M Phenylalanin Phe F Prolin Pro P Serin Ser S Threonin Thr T Tryptophan Trp w Tyrosin Tyr Y Valin Val V
[0025] Die Mimotope der vorliegenden Erfindung können synthetisch mittels chemischer Synthesemethoden, die auf dem Gebiet wohl bekannt sind, entweder als isoliertes Peptid oder als Teil eines anderen Peptids oder Polypeptids hergestellt werden. Alternativ kann das Peptid-Mimotop in einem Mikroorganismus erzeugt werden, der das Peptid-Mimotop erzeugt, welches danach isoliert und gewünschtenfalls weiter gereinigt wird. Das Peptid-Mimotop kann in Mikroorganismen, wie Bakterien, Hefe oder Pilzen, in Eukaryonten-Zellen, wie Säuger- oder Insektenzellen, oder in einem rekombinanten Virus-Vektor, wie einem Adenovirus, Poxvirus, Her- 6/97 ästesaschcs ßälemänit AT505 574B1 2009-09-15 pes-Virus, Simliki-Forest-Virus, Baculovirus, Bakteriophagen, Sindbis-Virus oder Sendai-Virus, erzeugt werden. Zu den geeigneten Bakterien für die Erzeugung des Peptid-Mimotops zählen E.coli, B.subtilis oder jedes andere Bakterium, das Peptide, wie die Peptid-Mimotope, exprimieren kann. Zu den geeigneten Hefe-Arten für die Expression des Peptid-Mimotops zählen Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Candida, Pichia pastoris oder jede andere Hefe, die Peptide exprimieren kann. Entsprechende Verfahren sind auf dem Gebiet wohl bekannt. Auch Verfahren zum Isolieren und Reinigen rekombinant erzeugter Peptide sind auf dem Gebiet wohl bekannt und umfassen z.B. Gelfiltration, Affinitäts-Chromatographie, lonenaustausch-Chromatographie usw.
[0026] Um die Isolierung des Peptid-Mimotops zu erleichtern, kann ein Fusionspolypeptid hergestellt werden, wobei das Peptid-Mimotop translationeil an ein heterologes Polypeptid fusioniert (kovalent gebunden) wird, was die Isolierung mittels Affinitäts-Chromatographie ermöglicht. Typische heterologe Polypeptide sind His-Tag (z.B. His6i 6 Histidin-Reste), GST-Tag (Glutathion-S-transferase) usw. Das Fusionspolypeptid erleichtert nicht nur die Reinigung der Mimotope, sondern kann auch verhindern, dass das Mimotop-Polypeptid während der Reinigung abgebaut wird. Wenn erwünscht ist, das heterologe Polypeptid nach der Reinigung zu entfernen, kann das Fusionspolypeptid eine Schnittstelle an der Verbindung zwischen dem Peptid-Mimotop und dem heterologen Polypeptid aufweisen. Die Schnittstelle besteht aus einer Aminosäuresequenz, die mit einem Enzym geschnitten wird, das für die Aminosäuresequenz an dieser Stelle spezifisch ist (z.B. Proteasen).
[0027] Die Mimotope der vorliegenden Erfindung können auch an oder nahe ihrer N- und/oder C-Termini modifiziert sein, so dass an diesen Positionen ein Cystein-Rest daran gebunden ist. Bei einer bevorzugten Ausführungsform werden terminal positionierte (an den N- und C-Termini des Peptids befindliche) Cystein-Reste verwendet, um die Peptide durch eine Disulfid-Bindung zu zyklisieren.
[0028] Die Mimotope der vorliegenden Erfindung können auch in verschiedenen Tests und Kits verwendet werden, insbesondere in immunologischen Tests und Kits. Daher ist es besonders bevorzugt, dass das Mimotop ein Teil eines anderen Peptids oder Polypeptids, insbesondere eines Enzyms, sein kann, das als Reporter in immunologischen Tests verwendet wird. Zu solchen Reporter-Enzymen zählen z.B. alkalische Phosphatase oder Meerrettich-Peroxidase (horseradish peroxidase). ist die Amino- [0029] Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung säuresequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus FGFPAHVSIDWLHSLS und FGFPAHVSIDFSQSLS. FGFPYHHLVDQLHSLS, FGFPSHLIIDWLQSLS, FAFPAHVSIDWLQSLS, FGFPAHVSIDWLQSIS, FGFPAHIIIDWLQSLS, FGFPAHVWIDWLQSLS, FGFPAHVSFDWLQSLS, FGFPAHVSIDWSQSLS, FAFPEHLLVDFLQSLS, FGFPSHLIIDWSQSLS, FYFPAHVSIDWLQSLS, FGFPAHVSIDWLQSLT, FGFPAHVFIDWLQSLS, FGFPAHVFIDWLQSLN, FGFPEHVFIDWLQSLS, FGFPAHLLVDFLQSLS, FGFPAHVSIDWLQSLS, FGFPAHVSIDWLQYLS, FGFPAHISIDWLQSLS, FGFPAHVYIDWLQSLS, FGFPAHFSIDWLQSLS, FGFPQHLFTDWLQSLS, [0030] Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die Verbindung mit einem pharmazeutisch akzeptablen Träger gekoppelt, vorzugsweise mit KLH (Keyhole Limpet Hemocyanin (Schlüsselloch-Napfschnecken-Hämocyanin)), Tetanus-Toxoid, Albumin-bindendem Protein, Rinderserumalbumin, einem Dendrimer (MAP; Biol., Chem. 358: 581), Peptid-Linkern (oder flankierenden Regionen) sowie den Adjuvans-Substanzen, die in Singh et al., Nat. Biotech. 17(1999), 1075-1081 (insbesondere jenen in Tabelle 1 dieses 7/97 &t£S!iÄ»hi5 AT505 574B1 2009-09-15
Dokuments) und O'Hagan et al., Nature Reviews, Drug Discovery 2 (9) (2003), 727-735 geoffenbart sind (insbesondere die endogenen immunverstärkenden Verbindungen und Abgabesysteme, die darin beschrieben sind) oder Mischungen davon. Die Konjugations-Chemie (z.B. über heterobifunktionelle Verbindungen, wie GMBS, und natürlich auch andere, wie sie in „Bioconjugate Techniques", Greg T. Hermanson beschrieben sind) kann in diesem Zusammenhang aus dem Fachmann bekannten Reaktionen ausgewählt werden. Außerdem kann die Vakzin-Zusammensetzung mit einem Adjuvans, vorzugsweise einer wenig löslichen Aluminium-Zusammensetzung, insbesondere Aluminiumhydroxid, formuliert werden. Natürlich können auch Adjuvantien wie MF59 Aluminiumphosphat, Calciumphosphat, Cytokine (z.B. IL-2, IL-12, GM-CSF), Saponine (z.B. QS21), MDP-Derivate, CpG-Oligos, LPS, MPL, Po-lyphosphazene, Emulsionen (z.B. Freundsches Adjuvans, SAF), Liposome, Virosome, Iscome, Cochleate, PLG-Mikropartikel, Poloxamer-Partikel, Virus-artige Partikel, Hitzeinstabiles Enterotoxin (LT), Cholera-Toxin (CT), mutierte Toxine (z.B. LTK63 und LTR72), Mikropartikel und/oder polymerisierte Liposome verwendet werden.
[0031] Die Verbindung der vorliegenden Erfindung ist vorzugsweise an den Träger oder das Adjuvans über einen Linker gebunden, der ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus NHS-poly (Ethylenoxid) (PEO) (z.B. NHS-PE04-Maleimid).
[0032] Ein Vakzin, das die vorliegende Verbindung (Mimotop) und den pharmazeutisch ak zeptablen Träger aufweist, kann auf jede geeignete Anwendungsweise, beispielsweise i.d., i.V., i.p., i.m., intranasal, oral, subkutan, usw. und mit jeder geeigneten Abgabevorrichtung verabreicht werden (O'Hagan et al., Nature Reviews, Drug Discovery 2 (9), (2003), 727- 735). Die Verbindung der vorliegenden Erfindung ist vorzugsweise zur subkutanen, intradermalen oder intramuskulären Verabreichung formuliert (vgl. z.B. „Handbook of Pharmaceutical Manufacturing Formulations", Sarfaraz Niazi, CRC Press Inc, 2004).
[0033] Typischerweise enthält das Vakzin die erfindungsgemäße Verbindung in einer Menge von 0,1 ng bis 10 mg, vorzugsweise 10 ng bis 1 mg, insbesondere 100 ng bis 100 pg, oder alternativ z.B. 100 fmol bis 10 pmol, vorzugsweise 10 pmol bis 1 pmol, insbesondere 100 pmol bis 100 nmol. Typischerweise kann das Vakzin auch Hilfssubstanzen, z.B. Puffer, Stabilisatoren usw., enthalten.
[0034] Ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein Peptid, bestehend aus mindestens einer Aminosäuresequenz ausgewählt FAFPEHLLVDFLQSLS, FGFPYHHLVDQLHSLS, FGFPSHLIIDWLQSLS, FAFPAHVSIDWLQSLS, FGFPAHVSIDWLQSIS, FGFPAHIIIDWLQSLS, FGFPAHVWIDWLQSLS, FGFPAHVSFDWLQSLS, FGFPAHVSIDWSQSLS, FGFPSHLIIDWSQSLS, FYFPAHVSIDWLQSLS, FGFPAHVSIDWLQSLT, FGFPAHVFIDWLQSLS, FGFPAHVFIDWLQSLN, FGFPEHVFIDWLQSLS, aus der Gruppe bestehend aus FGFPAHLLVDFLQSLS, FGFPAHVSIDWLQSLS, FGFPAHVSIDWLQYLS, FGFPAHISIDWLQSLS, FGFPAHVYIDWLQSLS, FGFPAHFSIDWLQSLS, FGFPQHLFTDWLQSLS, FGFPAHVSIDWLHSLS und FGFPAHVSIDFSQSLS.
[0035] Die Peptide der vorliegenden Erfindung erwiesen sich als Mimotope für CETP, und folglich konnten die Mimotope an Antikörper binden, die an das CETP-Fragment C-FGFPEHLLVDFLQSLS (16 C-terminale Aminosäuren des CETP-Proteins) binden.
[0036] Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das Peptid an einen pharmazeutisch akzeptablen Träger, vorzugsweise KLH (Keyhole Limpet Hemocya-nin) gekoppelt.
[0037] Noch ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft eine pharmazeutische Formulierung, die mindestens ein Peptid gemäß der vorliegenden Erfindung aufweist.
[0038] Die Peptide der vorliegenden Erfindung können in einer pharmazeutischen Formulierung 8/97 osteireÄhis patemamt AT505 574 B1 2009-09-15 formuliert sein, die an ein Individum verabreicht werden kann. Diese Formulierungen können beispielsweise zur Prävention und/oder Behandlung von Atherosklerose verwendet werden.
[0039] Die vorliegende Erfindung ist durch die folgenden Figuren und Beispiele näher veranschaulicht, ohne jedoch auf diese eingeschränkt zu sein.
[0040] Fig. 1 zeigt das Ergebnis eines repräsentativen Kompetitions-ELISA nach Screenen der Phagen-Display-Bibliothek Ph.D.7 mit dem monoklonalen Antikörper „F5AF9G4".
[0041] Fig. 2a und 2b zeigen die Ergebnisse von 2 typischen Kompetitions-ELISAs nach dem Screenen der Phagen-Display-Bibliothek Ph.D.12 mit dem monoklonalen Antikörper „F5AF9G4".
[0042] Fig. 3a und 3b zeigen die Ergebnisse von 2 repräsentativen Kompetitions-ELISAs nach dem Screenen der Phagen-Display-Bibliothek Ph.D.7 mit mAk I2G6H5.
[0043] Fig. 4a zeigt das Ergebnis eines repräsentativen Kompetitions-ELISA nach dem Screenen der Phagen-Display-Bibliothek Ph.D.12 mit dem monoklonalen Antikörper „I2G6H5".
[0044] Fig. 4b zeigt die Bindung des monoklonalen Antikörpers „I2G6H5" an mit Mimotop-BSA beschichtete ELISA-Platten.
[0045] Fig. 5a und 5b zeigen die Ergebnisse eines repräsentativen Kompetitions-ELISA nach dem Screenen der Phagen-Display-Bibliothek Ph.D.12 mit dem monoklonalen Antikörper „I2G6H5".
[0046] Fig. 6 zeigt die Ergebnisse eines Kompetitions-ELISA von zwei Mimotopen nach dem Screenen der Phagen-Display-Bibliothek Ph.D.12 mit dem monoklonalen Antikörper „I2G6H5".
[0047] Fig. 7a bis 7d zeigen den Antikörper-Titer von in vivo-Versuchen.
[0048] Fig. 8a und 8b zeigen die Ergebnisse von zwei repräsentativen Kompetitions-ELISAs nach dem Screenen der Phagen-Display-Bibliothek Ph.D.7C7 mit dem monoklonalen Antikörper „I2G6H5".
[0049] Fig. 9 zeigt einen in vitro-ELISA-Test zur Detektion der Bindung zwischen „I2G6H5" und zyklischen Mimotopen.
[0050] Fig. 10a und 10b zeigen die Ergebnisse eines Inhibitions-ELISA-Tests mit FGFPSHLIIDWLQSLS, FGFPAHVFIDWLQSLS und FGFPAHVYIDWLQSLS.
[0051] FIG. 10A (BESCHICHTUNG 1 MM PEPTID. DETEKTION AIGG1) I2G6H5 2,5 ng mAk I2G6H5 Pept.Nr. 2pg ^ 20 μα Peptid Peptid nur Puffer - 1,05 0,96 p4073 Original-Epitop C-FGFPEHLLVDFLQSLS 0,44 0,1 p1358 irrelevantes Peptid irrelevantes Peptid 1,08 0,91 p4361 FGFPAHVFIDWLQSLS Fr12/3/84 ext2 VSI => VFI 0,82 0,16 p4362 FGFPAHVYIDWLQSLS Fr12/3/84 ext2 VSI => VYI 0,75 0,15 [0052] Fig. 10b (Beschichtung 1μΜ Peptid. Detektion algG1) I2G6H5 2,5 ng mAk I2G6H5 Pept. Nr. 2pg 20 pg Peptid Peptid nur Puffer - 0,84 0,75 p4073 Original-Epitop C-FGFPEHLLVDFLQSLS 0,64 0,15 p3358 irrelevantes Peptid irrelevantes Peptid 0,88 0,77 p4325 FGFPSHLIIDWLQSLS Fr12/3/55 ext2 RA => WL 0,42 0,1 9/97 &t£S!iÄ»hi5 AT505 574B1 2009-09-15 [0053] Fig. 11 zeigt die in vivo-lnduktion von gegen CETP gerichteten Antikörpern durch Mimo-tope der Erfindung, die an Mäuse verabreicht werden. Balb/c-Mäuse / 30 pg Peptid, 2 Injektionen in 2-wöchigen Intervallen. S3 = 2 Wochen nach der 3. Injektion. Alum als Adjuvans. Titer gegen ursprüngliches Epitop (p4073) induziert durch Injektion von Mimotopen. Beschichtung der Vertiefungen: 50 pl von 1 μΜ p4073-BSA oder 1 pg/ml aktiviertes KLH. Detektion: algG (1:2000): injiziertes Original irrelevantes-Peptid-BSA Epitop-BSA Peptid-
BSA 14.000 2 8. 12 12.570 7 2. 930 1 4.700 3. 8.380 1 10.100 2 18.100 15 10.350 5 4.620 1. 5.580 2 12.200 3. 12.000 9 2. 950 2 19.680 12 11.200 8. 16.500 12 8.540 5 17.940 9 .040 400 600 10 .900 10 .600 10 .820 10 600 10 .270 10 .740 400 .640 10 .500 10 610 10 .900 10 580 10 .160 10 .400 10 .070 10 650 10 .940 10 .340 10 .530 10
Gruppe 1 KLH KLH Gruppe 2 Original-Epitop P4073-KLH Gruppe 3 C-FGFPQHLTTDWLQSLS P4369-KLH Gruppe 4 C-FGFPSHLIIDWAQSLS P4324-KLH Gruppe 5 C-FGFPSHLIIDWLQSLS P4325-KLH Gruppe 6 C-FGFPSHLIIDWSQSLS P4366-KLH Gruppe 7 C-FATPSHLIIDWLQSLS P4345-KLH Gruppe 8 C-FAFPAHVSIDWLQALA P4328-KLH Gruppe 9 C-PGFPAHVSIDWLQSLS P4340-KLH Gruppe 10 C-WGFPAHVSIDWLQSLS P4341-KLH Gruppe 11 C-FSFPAHVSIDWLQSLS P4342-KLH Gruppe 12 C-FYFPAHVSIDWLQSLS P4343-KLH Gruppe 13 C-FDFPAHVSIDWLQSLS P4344-KLH Gruppe 14 C-FGFPAHVSIDWLQLLS P4347-KLH Gruppe 15 C-FGFPAHVSIDWLQYLS P4351-KLH Gruppe 16 C-FGFPAHVSIDWLQSIS P4352-KLH Gruppe 17 C-FGFPAHVSIDWLQSLT P4353-KLH Gruppe 18 C-FGFPAHISIDWLQSLS P4358-KLH Gruppe 19 C-FGFPAHIIIDWLQSLS P4359-KLH Gruppe 20 C-FGFPAHVFIDWLQSLS P4361-KLH
[0054] Fig. 12a und 12b zeigen die in vivo-lnduktion von CETP-spezifischen Antikörpern durch die Verabreichung der Mimotope der Erfindung. Titer zu p4073 und seine Korrelation zu Titern zu CETP von ausgewählten Gruppen (die hohe Titer gegen p4073 aufweisen): Gr. 4, Gr. 9, Gr. 10, Gr. 14, Gr. 16-20/Gr. 1 (KLH), Gr. 2 (ursprüngliches Epitop) als Kontrollen. Beschichtung der Vertiefungen: 50 μΙ von 1 μΜ Peptid-BSA oder CETP: GST-CETP 1:20/Detektion: algG (1:2000): KLH p4073 P1358 Gr.1 / KLH/Alum KLH 1,4 0,16 0, 15 Gr.2 / p4073-KLH/Alum Original-Epitop 1,33 0,69 0, 15 Gr.3 / p4369-KLH/Alum C-FGFPQHLTTDWLQSLS 1,49 0,73 0, 15 Gr.4 / p4324-KLH/Alum C-FGFPSHLIIDWAQSLS 1,34 0,19 0, 18 Gr.9 / p4340-KLH/Alum C-PGFPAHVSIDWLQSLS 1,46 0,78 0, 14 Gr. 10 / p4341-KLH/Alum C-WGFPAHVSIDWLQSLS 1,35 0,33 0, 13 Gr. 14 / p4347-KLH/Alum C-FGFPAHVSIDWLQLLS 1,45 0,2 0, 13 Gr. 16 / p4352-KLH/Alum C-FGFPAHVSIDWLQSIS 1,49 0,34 0, 17 Gr. 17 / p4353-KLH/Alum C-FGFPAHVSIDWLQSLT 1,42 1,42 0, 13 Gr. 18 / p4358-KLH/Alum C-FGFPAHISIDWLQSLS 1,44 1,04 0,25 10/97 KLH p4073 P1358
Gr. 19/ p4359-KLH/Alum C-FGFPAHIIIDWLOSLS 1,48 0,46 0, 13 Gr.20 / p4361-KLH/Alum C-FGFPAHVFIDWLQSLS 1,52 1,56 0, 15 rekombi-nant. GST-CETP Kontroll 6ST allein Ka- ninch en- PCTD Kanin chen- Serum Gr.1 / KLH/Alum KLH 0,35 0,13 0Cf9TP 0,12 Gr.2 / p4073-KLH/Alum Original-Epitop 1,49 0,22 1,25 0,15 Gr.3 / p4369-KLH/Alum C-FGFPQHLTTDWLQSLS 0,45 0,12 0,21 0,11 Gr.4 / p4324-KLH/Alum C-FGFPSHLIIDWAQSLS 0,58 0,14 0,28 0,42 Gr.9 / p4340-KLH/Alum C-PGFPAHVSIDWLQSLS 0,49 0,13 0,21 0,09 Gr. 10/ p4341-KLH/Alum C-WGFPAHVSIDWLQSLS 0,39 0,12 0,18 0,1 Gr. 14/ p4347-KLH/Alum C-FG FPAHVSIDWLQLLS 0,35 0,14 0,2 0,11 Gr.16 / p4352-KLH/Alum C-FGFPAHVSIDWLQSIS 0,48 0,14 0,28 0,11 Gr.17 / p4353-KLH/Alum C-FG FPAHVSIDWLQSLT 0,57 0,14 0,39 0,14 Gr.18/ p4358-KLH/Alum C-FGFPAHISIDWLQSLS 0,68 0,2 0,58 0,1 Gr.19 / p4359-KLH/Alum C-FGFPAHIIIDWLQSLS 0,79 0,12 0,54 0,1 Gr.20 / p4361-KLH/Alum C-FGFPAHVFIDWLQSLS 1,64 0,12 1,51 0,26 [0055] Titer zu p4073 und ihre Korrelation zu Titern zu CETP. Die ausgewählten Gruppen weisen relativ hohe Titer gegen das ursprüngliche Peptid p4073 auf. Gr.1 (KLH) und Gr.2 (Original-Peptid) als Kontrollen. Beschichtung der Vertiefungen: 50 μΙ der Kontrollen oder von CETP: GST-CETP 1:100 / Kaninchen CETP 1:100 / Detektion: algG (1:2000): recombinant 6ST GST-CETP alleine
Gr.1/ KLH/Alum KLH 0,18 0,13 Gr.2 / p4073-KLH/Alum Original-Epitop 1,26 0,43 Gr.5 / p4325-KLH/Alum C-FGFPSHLIIDWLQSLS 0,59 0,14 Gr.6 / p4366-KLH/Alum C-FGFPSHLIIDWSQSLS 0,4 0,16 Gr.7 / p4345-KLH/Alum C-FATPSHLIIDWLQSLS 0,39 0,17 Gr.8 / p4328-KLH/Alum C-FAFPAHVSIDWLQALA 0,45 0,15 Gr. 11 / p4342-KLH/Alum C-FSFPAHVSIDWLQSLS 0,38 0,17 Gr. 12/ p4343-KLH/Alum C-FYFPAHVSIDWLQSLS 0,61 0,14 Gr.13 / p4344-KLH/Alum C-FDFPAHVSIDWLQSLS 0,35 0,14 Gr.15 / p4351-KLH/Alum C-FG FPAHVS IDWLQYLS 0,54 0,45
Kaninchen- Kanin-CETP chen-Serum
Gr.1/KLH/Alum KLH 0,47 0,16 Gr.2 / p4073-KLH/Alum Orginal-Epitop 1,42 0,25 Gr.5 / p4325-KLH/Alum C-FGFPSHLIIDWLQSLS 0,85 0,18 Gr.6 / p4366-KLH/Alum C-FGFPSHLIIDWSQSLS 0,65 0,14 Gr.7 / p4345-KLH/Alum C-FATPSHLIIDWLQSLS 0,46 0,16 11/97 &t£S!«SÄhe AT505 574B1 2009-09-15
Kaninchen- Kanin-CETP chen-
Serum Gr.8 / p4328-KLH/Alum C- FAFP AH VS ID WLQALA 0,43 0,14 Gr. 11 / p4342-KLH/Alum C-FSFPAHVSIDWLQSLS 0,41 0,12 Gr. 12/ p4343-KLH/Alum C-FYFPAHVSIDWLQSLS 1,05 0,15 Gr. 13/ p4344-KLH/Alum C-FDFPAHVSIDWLQSLS 0,43 0,15 Gr. 15/ p4351-KLH/Alum C-FGFPAHVSIDWLQYLS 0,59 0,21 [0056] Titer zu p4073 und ihre Korrelation zu Titern zu CETP. Beschichtung der Vertiefungen: 50 μΙ von CETP: GST-CETP 1:100 / GST 1:3000 / Kaninchen-CETP 1:20 / Kaninchen-Serum 1:20 Detektion: algG (1:2000): rekom bi- nant. GST- Kontroll GST Kanin chen Kaninchen CETP alleine CETP Serum
Gr.1/ KLH/Alum KLH 0,23 0,16 0,17 0,12 Gr.2 / p4073-KLH/Alum Original-Epitop 1,08 0,13 0,46 0,11 Gr.3 / p4335-KLH/Alum C-ZG F AAH VS ID WLQS LS 0,26 0,15 0,14 0,1 Gr.4 / p4348-KLH/Alum C-FGFPAHVSIDWLQWLS 0,33 0,15 0,16 0,11 Gr.5 / p4360-KLH/Alum C- FG F PAH LTTD WLQS LS 0,4 0,25 0,23 0,11 Gr.6 / p4362-KLH/Alum C-FGFP AH VYIDWLQS LS 0,86 0,14 0,94 0,13 Gr.7 / p4354-KLH/Alum C-FGFPAHVSIDWLQSLY 0,29 0,19 0,23 0,15 Gr.8 / p4337-KLH/Alum C-FGFPAHVSIRWLQSLS 0,24 0,12 0,14 0,12 [0057] Fig. 13 zeigt die in vivo-lnduktion von auf CETP gerichteten Antikörpern durch Mimoto-pe der Erfindung, die Mäusen verabreicht werden.
[0058] Fig. 14 zeigt einen CETP-Aktivitäts-Test, wobei 0,6 μΙ Humanserum (mit endogener CETP-Aktivität) mit Serum von Wildtyp-Mäusen (keine CETP-Aktivität enthaltend), die mit KLH/Alum (negative Kontroll-Gruppe), p4703-KLH/Alum (ursprüngliches CETP-Epitop) bzw. p4361 (oder p4362 oder p4325)-Mimotop geimpft waren. Es konnte nachgewiesen werden, dass die Zugabe von 1,2 μΙ und 0,6 μΙ Serum von mit p4361-KLH/Alum geimpften Mäusen die CETP-Aktivität vollständig inhibiert und die Zugabe von 0,2 μΙ Serum diese Aktivität signifikant reduziert im Gegensatz zur Zugabe von Serum von Mäusen, die nur mit KLH/Alum-Kontrolle oder mit dem ursprünglichen Epitop (p4073-KLH/Alum) geimpft waren.
[0059] Fig. 15 zeigt, dass die Zugabe von Serum von mit p4325-KLH/Alum geimpfter Mäuse zu Humanserum die CETP-Aktivität signifikant inhibiert.
[0060] Fig. 16 zeigt, dass die Zugabe von Serum von mit p4361-KLH/Alum geimpfter Mäuse zu Humanserum die CETP-Aktivität signifikant inhibiert.
[0061] Fig. 17 zeigt, dass die Zugabe von Serum von mit p4362-KLH/Alum geimpfter Mäuse zu Humanserum die CETP-Aktivität signifikant inhibiert.
BEISPIELE
[0062] Es besteht ein starkes umgekehrtes Verhältnis zwischen der Plasma-Konzentration von Cholesterin bei Lipoproteinen mit hoher Dichte (HDLs) und dem Entstehen der koronaren Herzkrankheit (KHK). So ist das Risiko für KHK höher, wenn die HDLs abnehmen. Obwohl 12/97 &t£S!iÄ»hi5 AT505 574B1 2009-09-15 33% der Patienten mit KHK niedrige Plasma-Spiegel von HDLs aufweisen, gibt es derzeit keine wirksame Therapie zur Steigerung der Plasma-Konzentration der HDLs. Diät und moderate Bewegung sind ineffektiv, Statine erreichen nur eine 5 bis 7% Steigerung des HDL, und Niacin hat Nebenwirkungen und Compliance-Profile, die seine Verwendung einschränken.
[0063] Die Inhibierung der CETP-Aktivität wurde als therapeutischer Ansatz zur Steigerung der Plasma-HDL-Spiegel vorgeschlagen. CETP ist ein Plasma-Glykoprotein, das den Transfer von neutralen Lipiden und von Phospholipiden zwischen Lipoproteinen erleichtert und die Konzentration des Plasma-HDL- reguliert. Es wird aus mehreren Gründen erwartet, dass die Inhibierung der CETP-Aktivität die Plasma-HDL-Konzentrationen erhöht. CETP senkt die HDL-Konzentrationen, indem es Cholesteryl-Ester von HDLs zu VLDLs und LDLs bewegt. Eine vorübergehende Inhibierung von CETP bei Kaninchen und Hamstern durch monoklonale Antikörper, kleine Moleküle (Sikorski, J.A., J. Med. Chem. 49 (1) (2006): 1-22) oder Anti-sense-Oligonukleotide bewirkt eine HDL-Steigerung. Eine Langzeit-CETP-Inhibierung mit Antisense-Nukleotiden erhöhte das Plasma-HDL und verringerte die atherosklerotischen Läsionen in einem Kaninchen-Modell der Atherosklerose. CETP-transgene Mäuse und Ratten weisen ein verringertes Plasma-HDL auf. Menschen mit verringerter CETP-Aktivität haben erhöhtes Plasma-HDL.
[0064] Kürzlich wurde ein Vakzin-Ansatz vorgeschlagen. Kaninchen wurden mit einem von humanem CETP stammenden Peptid immunisiert, das eine Region von CETP enthielt, die für die Funktion des Transfers von neutralem Lipid von wesentlicher Bedeutung ist. Geimpfte Kaninchen wiesen eine verringerte CETP-Aktivität und ein verändertes Lipoprotein-Profil mit niedrigerer LDL- und höherer HDL-Konzentration auf. Weiters zeigte es sich, dass mit CETP geimpfte Kaninchen kleinere atherosklerotische Läsionen hatten als Kontroll-Tiere.
[0065] Das Problem des oben angesprochenen anti-CETP-Vakzin-Ansatzes ist, dass die Vakzin-Formulierung ein Selbst-Peptid aufweist und daher die natürliche Toleranz gegen Selbst-Antigene brechen muss. Die Erfindung beschreibt ein CETP-Mimotop, das zur Impfung verwendet werden kann: Das Mimotop soll die Produktion von Antikörpern gegen CETP induzieren. Das CETP-Mimotop hat keine Selbst-Sequenz und muss daher keine Toleranz brechen. Somit wird die Induktion einer anti-CETP-Antikörper-Antwort stark erleichtert. Das Mimotop wird mit einem monoklonalen Antikörper (mAk) und (im Handel erhältlichen) Peptid-Bibliotheken identifiziert. Ein monoklonaler Anti-CETP-Antikörper wird verwendet, der die CETP-Aktivität neutralisiert. Dieser mAk detektiert eine Sequenz innerhalb der C-terminalen 26 Aminosäuren von CETP, die für eine neutrale Lipid-Transfer-Aktivität nötig ist.
BEISPIEL 1: ERZEUGUNG VON MONOKLONALEN ANTIKÖRPERN ZUR VERWENDUNG FÜR DAS SCREENEN VON PHAGEN-DLSPLAY-BLBLLOTHEKEN
[0066] A.) 2 Antikörper, die aus „Fusion F" stammen: [0067] Balb/c-Mäuse wurden mit dem Original-CETP-Epitop C-FGFPEHLLVDFLQSLS (16 C-terminale Aminosäuren des CETP-Proteins), gekoppelt an KLH und Alum als Adjuvans, immunisiert.
[0068] 2 Hybridom-Klone (beide lgG1) wurden gereinigt und zum Screenen verwendet: F5AF9G4 und F6F11D1.
[0069] Diese zwei monoklonalen Antikörper erkennen das injizierte Epitop sowie CETP-Protein in ELISA. Sie können auch im Western Blot verwendet werden, um CETP-Protein nachzuweisen (rekombinantes, in Bakterien exprimiertes Protein sowie aus Kaninchen-Serum isoliertes Protein). Beide Antikörper hemmen nicht die CETP-Enzym-Aktivität (getestet mit dem Roar CETP Activity Assay Kit, vgl. z.B. US 5,585,235; US 5,618,683; US 5,770,355).
[0070] B.) 2 Antikörper, die aus „Fusion I" stammen: [0071] Balb/c-Mäuse wurden mit Original-CETP-Epitop C-FG-FPEHLLVD-FLQSLS (16 C-terminale Aminosäuren des CETP-Proteins), gekoppelt an KLH und Alum als Adjuvans, 13/97 &t£ffi»dlS!5Chf5 pateuusiat AT505 574B1 2009-09-15 immunisiert.
[0072] 2 Hybridom-Klone (beide IgGI) wurden gereinigt und zum Screenen verwendet: I2G6H5 und I2G6H7 [0073] Diese zwei monoklonalen Antikörper erkennen das injizierte Epitop sowie das CETP-Protein in ELISA. Sie können auch im Western Blot verwendet werden, um CETP-Protein nachzuweisen (rekombinantes, in Bakterien exprimiertes Protein sowie aus Kaninchen-Serum isoliertes Protein). Im Gegensatz zu den aus „Fusion F" (vgl. A) stammenden Antikörpern, hemmen beide Antikörper, „I2G6H5" und „I2G6H7", die CETP-Enzym-Aktivität (getestet mit dem Roar CETP Activity Assay Kit).
BEISPIEL 2: PHAGEN-DISPLAY, IN VITRO-INHIBITIONS-ELISA UND IN VIVO-TESTEN VON MIMOTOPEN
[0074] Die in diesem Beispiel verwendeten Phagen-Display-Bibliotheken waren: [0075] Ph.D.7: New England BioLabs E8102L (lineare 7mer-Bibliothek) Ph.D. C7C: New England BioLabs E2121L (7mer-Bibliothek, zyklisierte Peptide) [0076] Ph.D. 12: New England BioLabs E2111L (lineare 12mer-Bibliothek) [0077] Phagen-Display erfolgte gemäß dem Protokoll des Herstellers (www.neb.com).
[0078] Nach 2 oder 3 nachfolgenden „Panning"-Runden wurden einzelne Phagen-Klone herausgenommen, und die Phagen-Überstände wurden ELISA auf Platten, die mit Antikörper beschichtet waren, der für das "Panning" verwendet wurde, unterzogen. Phagen-Klone, die in diesem ELISA positiv waren (starkes Signal für das Ziel, aber kein Signal für unspezifische Kontrolle) wurden sequenziert. Aus DNA-Sequenzen wurden Peptid-Sequenzen abgeleitet. Diese Peptide wurden synthetisiert und im Inhibitions-ELISA charakterisiert.
[0079] 1. In vitro-lnhibitions-Assay (ELISA) [0080] Verschiedene Mengen der Peptide (2 und 20 pg, wie in den entsprechenden Figuren angegeben), die vom Phagen-Display stammten, wurden mit dem für den Screening-Prozess verwendeten monoklonalen Antikörper inkubiert. Peptide, die die nachfolgende Bindung des Antikörpers an das Original-CETP-Epitop verringerten (C-terminale 16 Aminosäuren des CETP-Proteins), das auf ELISA-Platten beschichtet war, wurden als inhibierend angesehen.
[0081] 2. In vivo-Testen von Mimotopen [0082] Inhibierende sowie einige nicht-inhibierende Peptide wurden an KLH gekoppelt und Mäusen (Wildtyp- oder CETP-transgene Mäuse; subkutan in die Flanke oder intradermal in die Ohren) oder Kaninchen (subkutan in die Flanke) zusammen mit einem geeigneten Adjuvans (Aluminiumhydroxid und Gerbu 100 für Mäuse und Aluminiumhydroxid oder CFA/IFA für Kaninchen) injiziert.
[0083] Die Titer gegen injizierte Peptide sowie zum Original-CETP-Epitop wurden bestimmt. Außerdem wurde für ausgewählte Seren auch die Immunantwort auf das CETP-Protein gemessen.
[0084] 3. Ergebnisse [0085] 3.1. Screenen mit 2 aus „Fusion F" stammenden Antikörpern: „F5AF9G4" und „F6F11D1" [0086] 3.1.1. Phagen-Display-Bibliothek Ph.D.7 [0087] 3.1.11. Screenen mit dem monoklonalen Antikörper „F5AF9G4" 17 Sequenzen wurden bei diesem Screening identifiziert:
P2_8 SYHATFL 14/97 AT505 574 B1 2009-09-15 iKte-'cscsstiiö pälemaat
P2 9 TMAFPLN P2 11 HYHGAFL P2 12 EHHDIFL P2 15 SSLELFL P2 16 TGLSVFL P3 2 WMPSLFY P3 6, 14, 28 SMPWWFF P3 9 TMPLLFW P3 13 DTWPGLE P3 16 SMPPIFY P3 17 MPLWWWD P3 18 SMPNLFY P3 19 RMPPIFY P3 21 NPFEVFL P3 25 TLPNWFW P3 26 SMPLTFY
[0088] Das Ergebnis eines repräsentativen Kompetitions-ELISA ist in Fig. 1 gezeigt.
[0089] 3.1.1.2. Screening mit dem monoklonalen Antikörper „F6F11D1" [0090] 6 Sequenzen wurden identifiziert, die die Bindung des monoklonalen Antikörpers „F6F11D1" in in vitro-Kompetitionsversuchen inhibieren:
F2-9 C SFLDTLT F3-6 C NFLKTLS F3-18 C DFLRTLT F3-23 C AFLDTLV F3-34 C TFLSSLA F3-38 C GFLDSLM
[0091] Zusätzliche 12 Sequenzen wurden identifiziert, die die Bindung des monoklonalen Antikörpers „F6F11D1" in in vitro-Kompetitionsversuchen nicht inhibieren:
F2-2+5 SPHPHFL F2-6 NFMSIGL F2-6/F3-30 SQFLASL F2-29 SNFLKTL F3-1- TGFLATL F3-1- WSWPGLN F3-17- IAWPGLD F3-32- SKFMDTL F3-41- SDFLRAL F3-44- SMPMVFY F3-49- YEWVGLM F3-64- KGFLDHL
[0092] Alle Mimotope, die die Bindung des monoklonalen Antikörpers „F6F11D1" in vitro binden, wurden an KLH gekoppelt und subkutan (in die Flanke, s.c.) oder intradermal (i.d.) in Wildtyp-Mäuse (Mäuse haben kein CETP-Protein), CETP-tg-Mäuse bzw. Kaninchen injiziert und induzierten eine Immunantwort auf das injizierte Peptid mit allen Adjuvantien, die getestet wurden (Alum und CFA („complete Freund's adjuvant", komplettes Freundsches Adjuvans); 15/97
ästeifcscfistiiö patent AT505 574B1 2009-09-15
Gerbu).
[0093] Für alle oben angeführten in vitro-inhibierenden Mimotope konnten bei Mäusen und Kaninchen Antikörper entdeckt werden, die auf das Original-CETP-Epitop reagierten.
[0094] Für 5 von 6 Mimotopen (siehe unten und Tabelle 1) konnten Antikörper, die mit gereinigtem humanem CETP und mit rekombinant exprimiertem humanem CETP reagierten, in ELISAS aus Kaninchen-Seren nachgewiesen werden:
F2-9 C SFLDTLT F3-6 C NFLKTLS F3-18 C DFLRTLT F3-34 C TFLSSLA F3-38 C GFLDSLM
[0095] Subkutane Injektionen in die Flanke wurden in Woche 1, Woche 3 und Woche 7 mit 30 pg Peptid-KLH pro Maus gegeben. Intradermale Injektionen ins Ohr wurden in Woche 1, Woche 3 und Woche 6 mit 10 pg Peptid-KLH pro Maus gegeben. Seren wurden 2 Wochen nach der 3. Injektion genommen. Vakzin-Formulierung mit Alum (immer 1 mg pro Maus): bis zu 250 pl, injiziert in eine Flanke.
[0096] Die Alum-Formulierung mit 1 ml pro Maus (500 pl in jede Flanke) war in 1x PBS als Puffer.
[0097] Die Vakzin-Formulierung mit Gerbu Adjuvans 100 (Gerbu Kat. Nr. 3100; immer 50 pl Adjuvans pro Maus): 200 pl, 100 pl, injiziert in jede Flanke, umfassend 1x HEPES als Puffer.
[0098] Tabelle 1: Ergebnisse der Titer-Bestimmung
Adjuvans KLH injiziertes Mi-motop P4073 (FGFPEHLLV DFLQSLS) p irrelevant Alum s.c. (30 pg Peptid) KLH 1:20.000 n.a. 1:400 kein Titer p4073-KLH CFGFPEHLLVD- FLQSLS 1:70.000 n.a. 1:20.000 kein Titer p4223-KLH F2-9; C-SFLDTLT 1:15.000 1:15.000 1:6.400 kein Titer p4181-KLH F3-6 C-NFLKTLS 1:8.000 1:6.400 1:800 kein Titer p4184-KLH F3-18C- DFLRTLT 1:5.000 1:10.000 1:3.000 1:2.500 p4187 F3-34 C-TFLSSLA 1:3.200 1:9.000 1:4.000 kein Titer p4188-KLH F3-38 C-GFLDSLM 1:10.000 1:9.000 1.5.000 kein Titer p4227-KLH P12-19; C- 1:12.800 1:10.000 1:5.000 kein Titer 16/97 AT505 574 B1 2009-09-15 oiteüsäisd'is patenuimt
Adjuvans KLH injiziertes Mi-motop P4073 (FGFPEHLLV DFLQSLS) p irrelevant SANPRDFLETLF p4228-KLH P12-21; C-RMFPESFLDTLW 1:10.000 1:4.000 1:1.000 1:400 KLH/Gerbu s.c. (30 pg Peptid) KLH 1:70.000 n.a. 1:6.000 1:800 p4073-KLH CFGFPEHLLVD- FLQSLS 1:25.000 n.a. 1:15.000 1:200 p4223-KLH F2-9; C-SFLDTLT 1:40.000 1:25.000 1:50.000 1:1.000 p4181-KLH F3-6 C-NFLKTLS 1:20.000 1.20.000 1:8.000 1:400 p4184-KLH F3-18C- DFLRTLT 1:27.000 1.35.000 1:15.000 1:6.000 p4187-KLH F3-34 C-TFLSSLA 1.20.000 1.20.000 1:15.000 kein Titer p4188-KLH F3-38 C-GFLDSLM 1:40.000 1:35.000 1:35.000 1:400 p4227-KLH P12-19; C-SANPRDFLETLF 1.20.000 1:30.000 1.3.000 1:400 p4228-KLH P12-21; C-RMFPESFLDTLW 1:27.000 1:8.000 1:5.000 kein Titer p4073-KLH CFGFPEHLLVD- FLQSLS 1:10.000 1:10.000 kein Titer KLH/Alum i.d. (10 pg Peptid) KLH 1:12.800 n.a. kein Titer kein Titer p4073-KLH CFGFPEHLLVD- FLQSLS 1:10.000 n.a. 1:3.200 kein Titer p4223-KLH F2-9; C-SFLDTLT 1:6.400 1:3.200 p4181-KLH F3-6 C-NFLKTLS 1:10.000 1:1.500 1:600 kein Titer p4184-KLH F3-18 C-DFLRTLT 1:15.000 1:5.000 1:1.500 kein Titer p4187-KLH F3-34 C-TFLSSLA 1:50.000 1:6.400 1:3.200 1:500 p4188-KLH F3-38 C-GFLDSLM 1:12.000 1:5.000 1:2.000 kein Titer 17/97 &t£S!iÄ»hi5 AT505 574B1 2009-09-15
Adjuvans KLH injiziertes Mimotop P4073 (FGFPEHLLV DFLQSLS) p irrelevant p4227-KLH P12-19; C-SANPRDFLETLF 1:6.400 1:6.400 kein Titer kein Titer p4228-KLH P12-21; C-RMFPESFLDTLW 1:20.000 1:2.000 1:1.600 kein Titer p4298-KLH Fr12/3/84ex-t2; CFGFPAH- VSIDWLQSLS 1:25.000 1:3.200 1:1.600 kein Titer [0099] 3.1.2. Phagen-Disylay-Bibliothek Ph.D.12 [00100] 3.1.2.1. Screening mit dem monoklonalen Antikörper „F5AF9G4" [00101] Von 20 Aminosäuresequenzen, die aus diesem Screening erhalten wurden, waren 3 in in vitro-lnhibitionsversuchen inhibierend:
P12-19 SANPRDFLETLF
P12-21 RMFPESFLDTLW
P12-37 TIYDSFLDSLAS
[00102] Nicht-inhibierende Peptide waren: P12-5/44/46/49 P12-9 P12-24/43-_ P12-25 P12-28+42 P12-30 P12-35- P12-39- P12-42- P12-45- P12-50-_ P12-51- P12-52-_ P12-53- P12-56- P12-58- P12-61-
HQSDDKMPWWFF
KPYLLKDFLEAL
AMGPYDALDLFL
TWNPIESFLESL
YVWQDPSFTTFF
QYQTPLTFLEAL
RHISPATFLEAL
HTDSFLSTFYGD
YVWQDPSFTTFF
ADSTFTSFLQTL
GPVSIYADTDFL
DSNDTLTLAAFL
NGSPALSHMLFL
TDYDPMWVFFGY
IFPLDSQWQTFW
NESMPDLFYQPS
DWGDKYFSSFWN
[00103] Die Ergebnisse von 2 typischen Kompetitions-ELISAs sind in den Fig. 2a und 2b gezeigt.
[00104] Alle 3 Mimotope wurden an KLH gekoppelt und Wildtyp-Mäusen (Mäuse haben kein CETP-Protein), CETP-tg-Mäusen bzw. Kaninchen injiziert, und induzierten eine Immunantwort auf das injizierte Peptid mit allen getesteten Adjuvanzien (Alum und CFA; Gerbu).
[00105] Mimotop P12-19; C-SANPRDFLETLF und P12-21; C-RMFPESFLDTLW induzierten eine Immunantwort auf das Original-CETP-Epitop bei Wildtyp-Mäusen und bei Kaninchen. 18/97 iKte-icscfistiiö palenaiat AT505 574B1 2009-09-15 [00106] Dagegen induzierte Mimotop P12-37 C-TIYDSFLDSLAS keine Antikörper-Antwort auf das Original-Epitop.
[00107] 3.2. Screening mit 2 aus „Fusion I" stammenden Antikörpern: „I2G6H5" und „I2G6H7" [00108] 3.2.1. Phaqen-Display-Bibliothek Ph.D.7 [00109] 3.2.1.1. Screenen mit den monoklonalen Antikörpern „I2G6H5" und „I2G6H7" [00110] Zwei verschiedene Peptid-Sequenzen wurden in diesen Screens identifiziert, 11 von 12 Klonen, die sequenziert wurden, hatten identische Sequenzen. Diese Peptide sind in in vitro-Kompetitionsversuchen nicht inhibierend.
Fr7-2-2
Fr7-2B-65
Fr7-3-7
Fr7-3-13
Fr7-3-26
Fr7-3-32
Ja7-2-22
Ja7-3-28
Ja7-3-41
Ja7-3-52
VSAYNNV WPLHLWQ
Ja7-3-56
Ja7-3-89 [00111] Die Ergebnisse von 2 repräsentativen Kompetitions-ELISAs mit mAk „I2G6H5" sind in den Fig. 3a und 3b gezeigt. Dasselbe Muster war bei mAk „I2G6H7" zu sehen.
[00112] 3.2.2. Phagen-Display-Bibliothek Ph.D.12 [00113] 3.2.2.1. Screenen mit dem monoklonalen Antikörper „I2G6H5"
Fr12/2/6 TPTHYYADFSQL
Fr12/2/II LPGHLIWDSLHY
Fr12/2/27 LPQTHPLHLLED
Fr12/3/1 Fr12/3/19
Fr12/3/88 IPYHHLVDQLHH
Fr12/3/26
Fr12/3/65 YPYHVQVDVLQN
Fr12/3/68 IPSHHLQDSLQL
Fr12/3/12 EYAHHTSLDLRQ
Fr12/3/83 EPLHFRSDRIQA
Fr12/3/55 ATPSHLIIDRAQ
Fr12/3/63 APKHLYADMSQA
Fr12/3/84 FKPAHVSIDWLQ
Fr12/3/47 MPAHLSRDLRQS
Fr12/3/80 NPKHYSIDRHQA
Fr12/3/40 SPQHLTTDRAQA
Fr12/3/35 TPFHFAQDSWQW 19/97 ästerrisÄiits patemamt AT505 574 B1 2009-09-15 [00114] Keine der in diesem Screen identifizierten 15 Aminosäuresequenzen war bei in vitro-Kompetitionsversuchen inhibierend. Die Sequenzanalyse offenbarte jedoch für viele der Mimo-tope eine hohe Homologie mit der ursprünglichen Proteinsequenz. Anderseits konnte bei einigen Peptiden die Bindung des monoklonalen Antikörpers „I2G6H5" an mit Mimotop-BSA beschichtete ELISA-Platten gezeigt werden (vgl. Fig. 4a und 4b).
[00115] Dies zeigt, dass die Bindung von monoklonalem Antikörper an immobilisierte Mimoto-pe nicht unbedingt die Vorhersage einer Inhibierung in einem in vitro-Kompetitions-ELISA ermöglicht.
[00116] In vitro-lnhibitionsversuche mit Variationen der Original-Sequenz FGFPEHLLVDFLQSLS (16 C-terminale AS des CETP-Proteins) zeigten, das das Entfernen von mehr als 2 Aminosäuren vom N-Terminus oder von mehr als 1 Aminosäure vom C-Terminus die Inhibierung beseitigt (für die monoklonalen Antikörper „I2G6H5" und „I2G6H7". „F5AF9G4" und „F6F11D1" erkennen einen anderen Teil der Original-Sequenz).
[00117] Außerdem führt das gleichzeitige Entfernen von 2 Aminosäuren vom N-Terminus und 1 Aminosäure vom C-Terminus auch zu einem Peptid, das in vitro nicht mehr inhibiert.
[00118] C-FGFPEHLLVDFLQSLS "ursprüngliche" Sequenz (Peptid stammt von CETP)/ inhibierend in vitro
Sequenz N-1 / Sequenz N-2 / Sequenz N-3 / Sequenz C-1 / Sequenz C-2 / Sequenz N-2 und /
C- GFPEHLLVDFLQSLS C- FPEHLLVDFLQSLS C- PEHLLVDFLQSLS C- FGFPEHLLVDFLQSL C- FGFPEHLLVDFLQS C- FPEHLLVDFLQSL
"Original" C-1 FGFPEHLLVDFLQSLS Fr12/2/6 TPTHYYADFSQL Fr12/2/11 LPGHLIWDSLHY Fr12/2/27 LPQTHPLHLLED Fr12/3/1 IPYHHLVDQLHH Fr12/3/19 IPYHHLVDQLHH Fr12/3/88 IPYHHLVDQLHH Fr12/3/26 YPYHVQVDVLQN Fr12/3/65 YPYHVQVDVLQN Fr12/3/68 IPSHHLQDSLQL Fr12/3/12 EYAHHTSLDLRQ Fr12/3/83 EPLHFRSDRIQA Fr12/3/55 ATPSHLIIDRAQ Fr12/3/63 APKHLYADMSQA Fr12/3/84 FKPAHVSIDWLQ Fr12/3/47 MPAHLSRDLRQS Fr12/3/80 NPKHYSIDRHQA Fr12/3/40 SPQHLTTDRAQA Fr12/3/35 TPFHFAQDSWQW inhibierend in vitro inhibierend in vitro letztendlich geringfügig inhibierend in vitro inhibierend in vitro nicht inhibierend in vitro nicht inhibierend in vitro! [00119] Folglich wurden bei Verwendung der Original-CETP-Sequenz als Matrize Peptid-Sequenzen, die bei dieser Phagen-Display-Vorgehensweise erhalten wurden, am N-Terminus und/oder am C-Terminus verlängert, um zu überprüfen, ob eine in vitro-lnhibierung mit längeren Peptiden möglich ist. 20/97
oiteüsäisd'is patenuimt AT505 574 B1 2009-09-15 [00120] 3.2.2.2. Mimotope I2G6H5 Ph.D. 12 und Varianten davon:
Fr12/2/6 TPTHYYADFSQL Fr12/2/6 Ext1 TPTHYYADFSQLLS Fr12/2/6 Ext2 TPTHYYADFSQSLS Fr12/2/6 Ext3 GTPTHYYADFSQLL Fr12/2/6 Ext4 GTPTHYYADFSQSL Fr12/2/6 Ext5 FGTPTHYYADFSQSLS Fr12/2/6 Ext6 FGFPTHYYADFSQSLS Fr12/2/11 LPGHLIWDSLHY Fr12/2/11 Ext1 LPGHLIWDSLHYL Fr12/2/11 Ext2 LPGHLIWDSLHYLS Fr12/2/11 Ext3 LPGHLIWDSLHSL Fr12/2/11 Ext4 LPGHLIWDSLHSLS Fr12/2/11 Ext5 GLPGHLIWDSLHSL Fr12/2/11 Ext6 FGLPGHLIWDSLHSLS Fr12/2/11 Ext7 FGFPGHLIWDSLHSLS Fr12/2/27 LPQTHPLHLLED Fr12/3/1/19/88 Ext1 IPYHHLVDQLHLS Fr12/3/1 /19/88 Ext2 IPYHHLVDQLHSLS Fr12/3/1/19/88 Ext3 FGIPYHHLVDQLHHLS Fr12/3/1/19/88 Ext4 FGFPYHHLVDQLHSLS Fr12/3/26/65 Ext1 YPYHVQVDVLQNLS Fr12/3/26/65 Ext2 YPYHVQVDVLQSLS Fr12/3/26/65 Ext3 FGYPYHVQVDVLQNLS Fr12/3/26/65 Ext4 FGFPYHVQVDVLQSLS Fr12/3/68 Ext1 IPSHHLQDSLQLLS Fr12/3/68 Ext2 IPSHHLQDSLQSLS Fr12/3/68 Ext3 GIPSHHLQDSLQLL Fr12/3/68 Ext4 FGIPSHHLQDSLQLLS Fr12/3/68 Ext5 FGFPSHHLQDSLQSLS Fr12/3/83 Ext1 EPLHFRSDRIQALS Fr12/3/83 Ext2 EPLHFRSDRIQSLS Fr12/3/83 Ext3 GEPLHFRSDRIQAL Fr12/3/83 Ext4 FGEPLHFRSDRIQALS Fr12/3/83 Ext5 FGFPLHFRSDRIQSLS Fr12/3/55 Ext1 ATPSHLIIDRAQSLS Fr12/3/55 Ext2 FGFPSHLIIDRAQSLS Fr12/3/55 Ext2 R->W FGFPSHLIIDWAQSLS Fr12/3/55 Ext2 RA->WL FGFPSHLIIDWLQSLS Fr12/3/63 Ext1 APKHLYADMSQALS Fr12/3/63 Ext2 APKHLYADMSQSLS Fr12/3/63 Ext3 GAPKHLYADMSQAL Fr12/3/63 Ext4 FGFPKHLYADMSQSLS 21/97 AT505 574 B1 2009-09-15 tarssÄiies patemt Fr12/3/84 Ext1 Fr12/3/84 Ext2 Fr12/3/47 Ext1 Fr12/3/47 Ext2 Fr12/3/47 Ext3 Fr12/3/47 Ext4 Fr12/3/40 Ext1 Fr12/3/40 Ext2 Fr12/3/40 Ext3 Fr12/3/40 Ext4 Fr12/3/35 Ext1 Fr12/3/35 Ext2 Fr12/3/35 Ext3 Fr12/3/35 Ext4
FKPAHVSIDWLQSLS
FGFPAHVSIDWLQSLS
MPAHLSRDLRQSL
MPAHLSRDLRQSLS
GMPAHLSRDLRQSL
FGFPAHLSRDLRQSLS
SPQHLTTDRAQALS
SPQHLTTDRAQSLS
GSPQHLTTDRAQAL
FGFPQHLTTDRAQSLS
TPFHFAQDSWQWLS
TPFHFAQDSWQSLS
GTPFHFAQDSWQWL
FGFPFHFAQDSWQSLS
[00121] Repräsentative Beispiele des Inhibitions-ELISA sind in den Fig. 5A und 5B gezeigt. Die verlängerten Peptide Fr12/3/84 Ext2 und Fr12/3/55 Ext3 zeigten eine signifikante Inhibierung: C-FGFPSHLIIDRAQSLS Fr12/3/55 Ext3 C-FGFPAHVSIDWLQSLS Fr12/3/84 Ext2 [00122] Drei zusätzliche Peptide waren in diesem Test ebenfalls inhibierend: C-FGFPYHVQVDVLQSLS Fr12/3/26/65Ext4 C-FKPAHVSIDWLQSLS Fr12/3/84 Ext1 C-FGFPQHLTTDRAQSLS Fr12/3/40 Ext4 [00123] Nach der Sequenzanalyse, die das Original-Epitop und alle aus den Phagen-Display-Screens stammenden Mimotope verglich, wurden zusätzliche 2 Peptide geschaffen.
[00124] Für das Mimotop FM2/3/55 Ext3 C-FGFPSHLIIDRAQSLS (inhibierend im ELISA, siehe oben) wurden die Aminosäure-Auswechslungen im Inhibitions-ELISA getestet:
Stark inhibierend: C-FGFPAHVSIDWLQSLS Fr12/3/84 Ext2 Schwach inhibierend: C-FGFPSHLIIDRAQSLS Fr12/3/55 Ext3
Peptide mit veränderten Sequenzen (inhibierend, vgl. Fig. 6):
C-FGFPSHLIIDWAQSLS Fr12/3/55 Ext2 W anstatt R C-FGFPSHLIIDWLQSLS Fr12/3/55 Ext2 WL anstatt RA
[00125] Weitere bevorzugte Mimotope wurden durch den folgenden Beispiel-Ansatz charakterisiert:
Bsp. Nr, CETP-42 C42-1 KLH/Alum - C42-2 p4073-KLH/Alum C-FGFPEHLLVOFLQSLS C42-3 p4073U.V-.LFV P4468-KLH/Alum C-FGFPEHLEVDFLQSLS 22/97 AT505 574 B1 2009-09-15 teisäiisd'is pate«>t
C42-4 Fr12/3/84ext2VSWVFI P4361-KLH/Alum C-FGFPAHVFJDWLQSLS C42-5 Fr12ß/84 ext2VSI->VHI p4469-KLH/Alum C-FGFPAHVUIDWLQSLS C42-6 Fr12/3/84ext2 VSI->VPI p4470-KLH/Alum C-FGFPAHVEIDWLQSLS C42-7 Fr12/3/84 ext2VSI->VWI p4471-KLH/Atum C-FGFPAHVYiflOWLQSLS C42-8 Fr12/3/55 ext2 R->W LII->LFI p4472-KLH/Alum C-FGFPSHLFJDWAQSLS C42-9 Fr12/3/84 ext2 VSI->VFI FGF->PGF SLS->LIT p4473-KLH/Alum C-RGFPAHVEIDWLQLJI C42-10 Fr12/3/84 ext2 VSI->VYI p4362-KLH/AJum C-FGFPAHVJ3DWLQSLS Bsp. Nr. CETP-45 C45-1 KLH/Alum - C45-2 p1358-KLH/Alum neq. Kontroll-Peptid C45-3 p4073-KLH/Alum C-FGFPEHLLVOFLQSLS C45-4 Fr12/3/84 ext2 VSI-VFI SLS-SLH p4474-KLH//Alum C-FGFPAHVHDWLQSLJä C45-5 Fr12/3/84 ext2VSI-FSI p4475-KLH/Alum C-FGFPAHFSBWLQSLS C45-6 Fr12(3/84 ext2VSI-VSF p4476-KLH/Alum C-FGFPAHVSFDWLQSLS C45-7 Fr12/3/84 ext2 VSI-VFI PAH-PEH p4477-KLH/Alum C-FGFPtHVFTOWLQSLS C45-8 Fr12/3/1 /19/88 ext4 p4284-KLH/Alum C-FGFPYHHLVDQLHSLS C45-9 Fr12/3/84 extl VSI-VFI plus G am N-Terminus p4479-KLH/Alum C-SFKPAHVFIDWLQSLS C45-10 Fr12/3/84 ext2 VSI-VFI plus D am N-Teminus; -43S1 plus D C-BFGFPAHVFR3WIQSLS C45-11 Fr12/3/40 ext4 RA_WL LTT_LTT = p4369 mit Austausch T—F p4481 KLH/Alum C-FGFPQHLFTDffILQSLS C45-12 Fr12/355 ext2 RA-WL (vgl. C-31 und C-33; serieninhibierende Aktivität P4325-KLH/Alum C-FGFPSHUIDJVLQSLS C45-13 Fr12/3/84 ext2 FGF-FYF (vgl. C-33: Erkenn.-Protein, keine inhibierende Aktivität?) p4343-KLH/Alum C-F YFPAH VS ID WLQS LS C45-14 Kaninchen-Sequenz C-FGFPKHLLVDFLQSLS
[00126] 3.2.2.3. Testen von Mimotopen in vitro [00127] Weibliche Balb/c-Mäuse, fünf Mäuse pro Gruppe, wurden subkutan mit 30 pg Peptid, an KLH gekoppelt, immunisiert. Den Kontroll-Gruppen wurde KLH oder C-FGFPEHLLVDFLQSLS verabreicht. Als Adjuvans wurde Alum verwendet. Die verabreichten Peptide konnten alle an „I2G6H5" binden und eine Immunantwort auf CETP induzieren, obwohl einige dieser Peptide die Bindung von CETP an „I2G6H5" in vitro nicht inhibierten (in einem in vitro-lnhibitions-Test). Der in vitro-ELISA-Assay zur Bestimmung des Antikörper-titers wurde mit gepoolten Seren nach zwei Impfungen in einem zweiwöchigen Intervall durchgeführt (S2; vgl. Fig. 7a bis 7d). Die Vertiefungen der ELISA-Platte wurden mit KLH (positive Kontrolle), Mimotop-BSA-Konjugat, C-FGFPEHLLVDFLQSLS und einem irrelevanten Peptid-BSA-Konjugat (negative Kontrolle) beschichtet. Die Detektion wurde mit Anti-Maus-IgG durchgeführt.
[00128] 3.2.3. Phagen-Display-Bibliothek Ph.D.7C7 [00129] 3.2.3.1. Screenen mit den monoklonalen Antikörpern „I2G6H5" und „I2G6H7"
Fr2-1 ACSFAYLYRC
Fr2-5
Fr2-6
Fr2-18 23/97
AT505 574 B1 2009-09-15 oiteüsdisd'« patenuimt
Fr2-19 Fr2-28 Ja2-5 Ja2-20 Ja2-23 Ja2-24 Ja2-30 ACFMGDKWVC Fr2-7 Fr2-9 ACVLYPKAIC Fr2-11 Ja2-19 ACYMGQQFVC Fr2-16 ACLTAYLHWC Fr2-20 ACTLFPVAYC Fr2-25 ACWLFPYAHC Fr2-26 ACKSINMWLC Fr2-27 ACQTINRWLC
[00130] Weil diese Mimotop-Peptide zyklisch sind, ist ihre Synthese komplizierter als die Synthese linearer Peptide. Sieben von 9 zyklischen Sequenzen wurden für die in vitro-Analyse im Inhibitions-ELISA gewählt (vgl. Fig. 8a und 8b). Keine dieser Sequenzen inhibierte die Bindung des monoklonalen Antikörpers, der für das Phagen-Display-Screening des ursprünglichen CETP-Epitops verwendet wurde. Außerdem wurden diese Peptide, wenn sie an BSA gekoppelt und auf die ELISA-Platte aufgetragen waren, nicht vom monoklonalen Antikörper detektiert (vgl. Fig. 9). Dies stand im Gegensatz zu Daten mit Mimotopen, die aus den Ph-D.7- oder Ph-D-12-Bibliotheken abgeleitet waren, wo die monoklonalen Antikörper an die meisten der identifizierten Mimotope banden, wenn diese Peptide an BSA gekoppelt und auf ELISA-Platten aufgetragen waren. BEISPIEL 3: CETP-AKTIVITÄTS-TEST: [00131] Der CETP-Aktivitäts-Test wurde mit Assays durchgeführt, die im Handel erhältlich sind (z.B. ROAR CETP Activity Assay) und beispielsweise in der US 5,585,235, US 5,618,683 und US 5,770,355 beschrieben sind. Der Test wird gemäß den Empfehlungen der Hersteller durchgeführt. 24/97
teresdiische pateijantt AT505 574B1 2009-09-15
<11Q> Affiris Forschungs- und Entwicklungs GmbH <120> Pharmazeutische Zusammensetzung <130> R 49225 <140> AT A 1258/2007 <141> 2007-08-10 <160> 238 <170> Patentin Version 3.5
<210> 1 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> cetp mimotope <220>
<221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> xaa is (Xaa)n and an amino acid residue other than c, wherein n is an integer between 0 and 9 <220> <221> MISC-FEATURE <222> (2)..(2)
<223> Xaa is an amino acid residue selected from the group consisting of D, A, R, E, s, N, τ and G <220> <221> MISCLFEATURE <222> (3)..(3)
<223> xaa is an amino acid residue selected from the group consisting of F, A, w, R, s, L, Q, v and M <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4)
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<223> xaa is an amino acid residue selected from the group consisting of Q, A, H, D, K, R, S and E <220>
<221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) L . <223> xaa is (xaa)m and an amino acid residue other than C, wherein m is an integer between 0 and 9 <400> 1
Xaa xaa Xaa Xaa xaa Xaa 1 5
<210> 2 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence 25/97 oiteüsäisd'is patenuimt AT505 574 B1 2009-09-15 <223> cetp mimotope <400> 2
Ser Tyr His Ala Thr Phe Leu 1 5
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<210> 5 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> CETP mimotope <400> 5
Glu His His Asp Ile Phe Leu 1 5
<210> 6 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> cetp mimotope <400> 6
Thr Gly Leu Ser val Phe Leu 1 5 <210> 7 <211> 7
<212> PRT <213> Artificial Sequence 26/97
oiteüsäisd'is patenuimt <220> <223> CETP mimotope <400> 7 Trp Met Pro ser Leu Phe Tyr 1 5 3 AT505 574 B1 2009-09-15
<210> 8 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CETP mimotope <400> 8
Ser Met Pro Trp Trp Phe Phe 1 5 <210> 9 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CETP mimotope <400> 9
Thr Met Pro Leu Leu Phe Trp 1 5 <210> 10 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> CETP mimotope <400> 10
Asp Thr Trp Pro Gly Leu Glu 1 5 <210> 11 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> CETP mimotope <400> 11
Ser Met Pro Pro Ile Phe Tyr 1 5 <210> 12 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial sequence 27/97 4 4 oiteüsäisd'is patenuimt AT505 574 B1 2009-09-15 <220> <223> cetp mimotope <400> 12
Met Pro Leu Trp Trp Trp Asp 1 5 <210> 13 .11 1. *7 /
<212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CETP mimotope <400> 13
Ser Met Pro Asn Leu Phe Tyr 1 5
<210> 14 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CETP mimotope <400> 14
Arg Met Pro Pro Ile Phe Tyr 1 5
<210> 15 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CETP mimotope <400> 15
Asn pro Phe Glu val Phe Leu 1 5
<210> 16 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CETP mimotope <400> 16
Thr Leu Pro Asn Trp Phe Trp 1 5
<210> 17 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial sequence 28/97 5 5 oiteüsäisd'is patenuimt AT505 574 B1 2009-09-15 <220> <223> CETP mimotope <400> 17
Ser Met Pro Leu Thr Phe Tyr 1 5 <210> 18 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CETP mimotope <400> 18
ser Pro His pro His Phe Leu 1 5 <210> 19 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CETP mimotope <400> 19
Asn Phe Met Ser Ile Gly Leu 1 5 <210> 20 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> CETP mimotope <400> 20
Ser Gin Phe Leu Ala Ser Leu 1 5 <210> 21 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> CETP mimotope <400> 21
Trp ser Trp Pro Gly Leu Asn 1 5 <210> 22 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence 29/97 6 6 äiic'iticsahis patenusntt AT505 574B1 2009-09-15 <220> <223> CETP mimotope <400> 22
Ile Ala Trp Pro Gly Leu Asp 1 5 <210> 23 <211> 7
<212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CETP mimotope <400> 23
Ser Lys Phe Met Asp Thr Leu 1 5 <210> 24 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> CETP mimotope <400> 24
Ser Met Pro Met Val Phe Tyr 1 5 <210> 25 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CETP mimotope <400> 25
Tyr Glu Trp Val Gly Leu Met 1 5 <210> 26 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CETP mimotope <400> 26
Lys Gly Phe Leu Asp His Leu 1 5
<210> 27 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence 30/97
oiteüsäisd'is patemantt AT505 574 B1 2009-09-15 7 <220> <223> cetp mimotope <400> 27
Hi5 Gin Ser Asp Asp Lys Met Pro Trp Trp Phe Phe 1 5 10
<210> 28 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> CETP mimotope <400> 28
Tyr val Trp Gin Asp Pro Ser Phe Thr Thr Phe Phe 1 5 10
<210> 29 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> CETP mimotope <400> 29
Tyr Val Trp Gin Asp Pro Ser Phe Thr Thr Phe Phe 1 5 10
<210> 30 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> CETP mimotope <400> 30
Leu Pro Gin Thr His Pro Leu His Leu Leu Glu Asp 1 5 10
<210> 31 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> CETP mimotope <400> 31
Gly Pro val ser Ile Tyr Ala Asp Thr Asp Phe Leu 1 5 10
<210> 32 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence 31/97
oiteüsäisd'is patenuimt AT505 574 B1 2009-09-15 8 <220> <223> CETP mimotope <400> 32 1 <210> <*L XX> <212> <213> <220> <223> <400>
Asp Ser Asn Asp Thr Leu Thr Leu Ala Ala Phe Leu 5 10 33 Λ xc
PRT
Artificial Sequence CETP mimotope 33
Asn Gly Ser Pro Ala Leu Ser His Met Leu Phe Leu 1 5 10
<210> 34 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> CETP mimotope <400> 34
Thr Asp Tyr Asp Pro Met Trp Val Phe Phe Gly Tyr 1 5 10
<210> 35 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CETP mimotope <400> 35
Ile Phe Pro Leu Asp Ser Gin Trp Gin Thr Phe Trp 1 5 10
<210> 36 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> CETP mimotope <400> 36
Asn Glu Ser Met Pro Asp Leu Phe Tyr Gin Pro Ser 1 5 10
<210> 37 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial sequence 32/97 9 9 äite'isäisd'is patenuimt AT505 574 B1 2009-09-15 <220> <223> CETP mimotope <400> 37
Asp Trp Gly Asp Lys Tyr Phe Ser Ser Phe Trp Asn 15 10 <210> 38 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> CETP mimotope <400> 38
val Ser Ala Tyr Asn Asn val 1 5 <210> 39 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CETP mimotope <400> 39
Trp Pro Leu His Leu Trp Gin 1 5
<210> 40 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CETP mimotope <400> 40 1 5 Ser
Cys Phe Gly Phe Pro Glu His Leu Leu val Asp Phe Leu Gin Ser Leu
<210> 41 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CETP mimotope <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1) .. (1)
<223> Xaa is P, Y, T or K 33/97 <220> 10 10 oiteüsäisd'is patenuimt AT505 574 B1 2009-09-15 <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> xaa is an amino acid residue other than c <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> Xaa is Y, L, Η, V, T, I or F <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> xaa is Y, I, P, L, Q, S, R, T, F or A <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> Xaa is A, W, V, Q, L, S, I, R or T <400> 41
Xaa Xaa His Xaa Xaa Xaa 1 5
<210> 42 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> CETP mimotope <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> xaa is selected from the group consisting of G, A, F, Y and K <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> F is (F)o, wherein o is 0 or 1 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> Xaa is selected from the group consisting of E, Y, A, Q, K and S <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> xaa is selected from the group consisting of Η, v, L, F and I <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> Xaa is selected from the group consisting of L, W, S, I, F and Y <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9)..(9) <223> xaa is v, t, f or i <220> <221> MISC_FEATURE <222> (11)..(11)
<223> Xaa is an amino acid residue selected from the group consisting of F, A, W, R, S, L, Q, V and M 34/97 11 11 0ite»t:®sä'6 patenuifflt AT505 574 B1 2009-09-15 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (12)..(12)
<223> xaa is an amino acid residue selected from the group consisting of L, A, S, w, E, R, I and H <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13)
<223> xaa is an amino acid residue selected from the group consisting ofQ, A, H, D, K, R, S and E <220> <221> MISC_FEATURE <222> (14)..(14) <223> xaa is s or y <220> <221> MISC_FEATURE <222> (15)..(15)
<223> xaa is L, A or I <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(16)
<223> Xaa is S, N or T <400> 42
Phe Xaa Phe Pro Xaa His Xaa Xaa xaa Asp Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 15 10 15
<210> 43 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CETP mimotope <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Xaa is selected from the group consisting of D, s, N, T and G <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> xaa is selected from the group consisting of Q, D, K, R, s and E <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> Xaa is S or τ <220>
<221> MISC_FEATURE
<223> xaa is an amino acid residue other than c, preferably selected from the group consisting of S, T, A, M, F and W <400> 43 xaa Phe Leu xaa xaa Leu xaa 1 5 <210> 44 35/97 12 12 oiteüsäisd'is patenuimt AT505 574 B1 2009-09-15 <211> 7
<212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> CETP mimotope <400> 44
Ser Ser Leu Glu Leu Phe Leu i 5
<210> 45 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CETP mimotope <400> 45
Ser Phe Leu Asp Thr Leu Thr 1 5
<210> 46 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> CETP mimotope . A ΛΛ. Aii *k>
Asn Phe Leu Lys Thr Leu Ser 1 5
<210> 47 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> CETP mimotope <400> 47
Asp Phe Leu Arg Thr Leu Thr 1 5
<210> 48 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CETP mimotope <400> 48
Ala Phe Leu Asp Thr Leu Val 1 5 <210> 49 36/97 13 13 oiteüsäisd'is patenuimt AT505 574 B1 2009-09-15
<211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CETP mimotope <400> 49
Thr Phe Leu Ser Ser Leu Ala 1 5
<210> 50 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CEiP mimotope <400> 50
Gly Phe Leu Asp Ser Leu Met 1 5 <210> 51 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CETP mimotope <4O0> 51
Ser Pro His Pro His Phe Leu 1 5 <210> 52
<211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CETP mimotope <400> 52
Ser Asn Phe Leu Lys Thr Leu 1 5 <210> 53 <211> 7
<212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Cetp mimotope <400> 53
Thr Gly Phe Leu Ala Thr Leu 1 5 <210> 54 37/97
AT505 574 B1 2009-09-15 14
<211> 7 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> CETP mimotope <400> 54
Ser Asp Phe Leu Arg Ala Leu 1 5
<210> 55 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CETP mimotope <400> 55
Ser Ala Asn Pro Arg Asp Phe Leu Glu Thr Leu Phe 1 5 10
<210> 56 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CETP mimotope <400> 56
Arg Met Phe Pro Glu ser Phe Leu Asp Thr Leu Trp 1 5 10 <210> 57
<211> 12 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> CETP mimotope <400> 57
Thr Ile Tyr Asp Ser Phe Leu Asp Ser Leu Ala Ser 1 5 10 <210> 58
<211> 12 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> CETP mimotope <400> 58
Lys pro Tyr Leu Leu Lys Asp Phe Leu Glu Ala Leu 1 5 10 <210> 59 38/97
oite'isäiiSd'is patenuittt AT505 574 B1 2009-09-15 15
<211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CETP mimotope <400> 59
Ala Met Gly pro Tyr Asp Ala Leu Asp Leu Phe Leu 1 5 10
<210> 60 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CETP mimotope <400> 60
Thr Trp Asn Pro Ile Glu Ser Phe Leu Glu Ser Leu 1 5 10
<210> 61 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CETP mimotope <400> 61
Gin Tyr Gin Thr Pro Leu Thr Phe Leu Glu Ala Leu 1 5 10
<210> 62 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> CETP mimotope <400> 62
Arg His Ile Ser Pro Ala Thr Phe Leu Glu Ala Leu 1 5 10
<210> 63 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> CETP mimotope <400> 63
His Thr Asp Ser Phe Leu Ser Thr Phe Tyr Gly Asp 1 5 10 <210> 64 39/97
AT505 574 B1 2009-09-15
<211> 12 <212> PRT <21B> Artificial sequence <220> <223> CETP mimotope <400> 64
Ala Asp ser Thr Phe Thr ser Phe Leu Gin Thr Leu 1 5 10
<210> 65 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CETP mimotope <400> 65
Gly Pro val Ser Ile Tyr Ala Asp Thr Asp Phe Leu 1 5 10
<210> 66 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> CETP mimotope <400> 66
Asp Ser Asn Asp Thr Leu Thr Leu Ala Ala Phe Leu 1 5 10
<210> 67 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial sequence <22 0> <223> CETP mimotope <400> 67
Thr Pro Thr His Tyr Tyr Ala Asp Phe Ser Gin Leu 1 5 10
<210> 68 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CETP mimotope <400> 68
Leu Pro Gly His Leu Ile Trp Asp Ser Leu His Tyr 1 5 10 <210> 69 40/97
osieüsicfehts patenuimt AT505 574 B1 2009-09-15 17
<211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CETP mimotope <400> 59
Leu Pro Gin Thr His Pro Leu His Leu Leu Glu Asp 1 5 10
<210> 70 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> CETP mimotope <400> 70
Ile Pro Tyr His His Leu Val Asp Gin Leu His His 1 5 10
<210> 71 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> CETP mimotope <400> 71
Tyr Pro Tyr His Val Gin val Asp val Leu Gin Asn 1 5 10
<210> 72 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CETP mimotope <400> 72
Ile Pro Ser His His Leu Gin Asp Ser Leu Gin Leu 1 5 10
<210> 73 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CETP mimotope <400> 73
Glu Tyr Ala His His Thr Ser Leu Asp Leu Arg Gin 1 5 10 <210> 74 41/97 18 18 oiteüsäisd'is patenuimt AT505 574 B1 2009-09-15
<211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CETP mimotope <400> 74
Glu Pro Leu His Phe Arg ser Asp Arg Ile Gin Ala 1 5 10
<210> 75 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CETP mimotope <400> 75
Ala Thr Pro ser His Leu Ile Ile Asp Arg Ala Gin 1 5 10
<210> 76 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> CETP mimotope <400> 76
Ala Pro Lys His Leu Tyr Ala Asp Met ser Gin Ala 1 5 10
<210> 77 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CETP mimotope <400> 77
Phe Lys Pro Ala His val ser ile Asp Trp Leu Gin 1 5 10
<210> 78 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> CETP mimotope <400> 78
Met Pro Ala His Leu Ser Arg Asp Leu Arg Gin Ser 1 5 10 <210> 79 42/97
AT505 574 B1 2009-09-15 19
<211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> cetp mimotope <400> 79
Asn Pro Lys His Tyr Ser Ile Asp Arg His Gin Ala 1 5 10
<210> 80 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CETP mimotope <400> 80
Ser Pro Gin His Leu Thr Thr Asp Arg Ala Gin Ala 1 5 10
<210> 81 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CETP mimotope <400> 81
Thr Pro Phe His Phe Ala Gin Asp Ser Trp Gin Trp 1 5 10
<210> 82 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> cetp mimotope <400> 82
Thr Pro Thr His Tyr Tyr Ala Asp Phe Ser Gin Leu Leu ser 1 5 10
<210> 83 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> CETP mimotope <400> 83
Thr Pro Thr His Tyr Tyr Ala Asp Phe Ser Gin Ser Leu Ser 1 5 10 <210> 84 43/97
oiteüsäisd'is patenuimt AT505 574 B1 2009-09-15 20
<211> 14 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> CETP mimotope <400> 84
Gly Thr Pro Thr His Tyr Tyr Ala Asp Phe Ser Gin Leu Leu 1 5 10
<210> 85 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> CETP mimotope <400> 85
Gly Thr Pro Thr His Tyr Tyr Ala Asp Phe Ser Gin Ser Leu 15 10
<210> 86 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CETP mimotope <400> 86
Phe Gly Thr Pro Thr His Tyr Tyr Ala Asp Phe Ser Gin Ser Leu Ser 15 10 15
<210> 87 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <22Ö> <223> CETP mimotope <400> 87
Phe Gly Phe Pro Thr His Tyr Tyr Ala Asp Phe Ser Gin Ser Leu Ser 15 10 15
<210> 88 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> CETP mimotope <400> 88
Leu Pro Gly His Leu Ile Trp Asp Ser Leu His Tyr 1 5 10 <210> 89 44/97
oiteüsäisd'is patenuimt AT505 574 B1 2009-09-15 21
<211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <22 0> <223> cetp mimotope <400> 89
Leu Pro Gly His Leu Ile Trp Asp Ser Leu His Tyr Leu 1 5 10
<210> 90 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CETP mimotope <400> 90
Leu Pro Gly His Leu Ile Trp Asp Ser Leu His Tyr Leu ser 1 5 10
<210> 91 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> cetp mimotope <400> 91
Leu pro Gly His Leu Ile Trp Asp Ser Leu His ser Leu 1 5 10
<210> 92 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> cetp mimotope <400> 92
Leu Pro Gly His Leu Ile Trp Asp ser Leu His ser Leu ser 15 10
<210> 93 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> cetp mimotope <400> 93
Gly Leu Pro Gly His Leu ile Trp Asp ser Leu His Tyr Leu 1 5 10 <210> 94 45/97
oite'!«äi;$d'is paten^t AT505 574 B1 2009-09-15 22
<211> 14 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> CETP mimotope <400> 94
Gly Leu Pro Gly His Leu Ile Trp Asp ser Leu His Ser Leu 15 10
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Phe Gly Phe Pro Gly His Leu Ile Trp Asp Ser Leu His Ser Leu Ser 15 10 15
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oiteüsäisd'is patenuimt AT505 574 B1 2009-09-15 23
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oiteüsäisd'is patenuimt AT505 574 B1 2009-09-15 25
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oiteüsäisd'is patenuimt AT505 574 B1 2009-09-15 27
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_L J XU XJ
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Ala Pro Lys His Leu Tyr Ala Asp Met Ser Gin Ser Leu ser 1 5 10 <210> 124 51/97
AT505 574 B1 2009-09-15
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Gly Ala Pro Lys His Leu Tyr Ala Asp Met Ser Gin Ala Leu 1 5 10
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AT505 574 B1 2009-09-15
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Thr Pro Phe His Phe Ala Gin Asp ser Trp Gin Trp Leu ser 1 5 10 <210> 134 53/97
AT505 574 B1 2009-09-15 30
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Gly Thr Pro Phe His Phe Ala Gin Asp Ser Trp Gin Trp Leu 1 5 10 <210> 136 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> CETP mimotope <400> 136
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AT505 574 B1 2009-09-15
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Ala cys Leu Thr Ala Tyr Leu His Trp Cys 1 5 10
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Ala Cys Thr Leu Phe Pro Val Ala Tyr Cys 1 5 10 <210> 143
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Ala Cys Trp Leu Phe Pro Tyr Ala His Cys 1 5 10 <210> 144 55/97
AT505 574 B1 2009-09-15
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Phe Pro Glu His Leu Leu val Asp Phe Leu Gin ser Leu 1 5 10 <210> 149 56/97
0jtc»s;diStht5 patenuimt AT505 574 B1 2009-09-15 33
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oite'!«äi;$d'is paifnusntt AT505 574 B1 2009-09-15 34
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0jtc»tidiStht5 patenuimt AT505 574 B1 2009-09-15 35
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oite'isäiiSd'is patemättt AT505 574 B1 2009-09-15 36
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<HUU> ±OD
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Ser Pro Gin His Leu Thr Thr Asp Arg Ala Gin Ala Leu Ser 1 5 10 <210> 169 60/97
oite'!«äi;$d'is patemantt AT505 574 B1 2009-09-15 37
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Phe Gly Phe Pro Gin His Leu Thr Thr Asp Arg Ala Gin ser Leu ser 15 10 15
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Phe Gly Phe Pro Gin His Leu Thr Thr Asp Trp Ala Gin Ser Leu Ser 15 10 15
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Phe Gly Phe Pro Gin His Leu Thr Thr Asp Arg Leu Gin Ser Leu Ser 15 10 15 <210> 174 61/97
AT505 574 B1 2009-09-15
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Phe Gly Phe Pro Gin His Leu Thr Thr Asp Trp Leu Gin Ser Leu Ser 15 10 15
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Ala Thr Pro Ser His Leu Ile Ile Asp Arg Ala Gin 1 5 10 <210> 176 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CETP mimotope <4O0> 176
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Phe Gly Phe Pro Ser His Leu Ile Ile Asp Trp Ala Gin Ser Leu Ser 15 10 15 <210> 179 62/97
äite'isäisd'is patenuimt AT505 574 B1 2009-09-15 B9
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Phe Gly Phe Pro Ser His Leu Ile Ile Asp Trp Ser Gin Ser Leu Ser 15 10 15 <210> 181 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CETP mimotope <400> 181
Phe Ala Thr Pro Ser His Leu Ile Ile Asp Trp Leu Gin Ser Leu Ser 15 10 15 <210> 182 <211> 12 <212> PRT <213> A rti fi ci al Sequence <220> <223> CETP mimotope <400> 182
Phe Lys Pro Ala His Val Ser Ile Asp Trp Leu Gin 1 5 10 <210> 183 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> CETP mimotope <400> 183
Phe Lys Pro Ala His val Ser Ile Asp Trp Leu Gin Ser Leu Ser 15 10 15 <210> 184 63/97
oite'isäiiSd'is patenuimt AT505 574 B1 2009-09-15 40 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> CETP mimotope <400> 184 Phe Gly Phe Pro Ala His val ser ile Asp Trp Leu Gin Ser Leu Ser 1 Λ. ζ j 1 f\ 1 c -L J <210> 185 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> cetp mimotope <400> 185 Ala Gly Phe Pro Ala His Val Ser Ile Asp Trp Leu Gin Ser Leu Ser 1 5 10 15 <210> 186 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> cetp mimotope <400> 186 Phe Ala Phe Pro Ala His Val Ser ile Asp Trp Leu Gin ser Leu Ser 1 5 10 15 <210> 187 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> cetp mimotope <400> 187
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<211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CETP mimotope <400> 188
Phe Gly Phe Ala Ala His Val Ser Ile Asp Trp Leu Gin Ser Leu Ser 15 10 15 <210> 189 64/97
xim-n AT505 574 B1 2009-09-15 41
<211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CETP mimotope <400> 189
Phe Gly Phe Pro Ala His Val Ser Ala Asp Trp Leu Gin Ser Leu Ser 15 10 15 <210> 190 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> CETP mimotope <400> 190
Phe Gly Phe Pro Ala His val Ser Ile Asp Trp Leu Gin Ala Leu Ser 15 10 15 <210> 191 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> CETP mimotope <400> 191
Phe Gly Phe pro Ala His val ser ile Asp Trp Leu Gin ser Leu Ala 15 10 15 <210> 192 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> CETP mimotope <400> 192
Phe Ala Phe Pro Ala His Val Ser Ile Asp Trp Leu Gin Ala Leu Ala 15 10 15 <210> 193 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CETP mimotope <400> 193
Phe Gly Phe Ala Ala His val ser ile Asp Trp Leu Gin ser Leu ser 15 10 15 <210> 194 65/97
patemäntt AT505 574 B1 2009-09-15 42 <211> 16 <212> prt <213> Artificial sequence <220> <223> CETP mimotope <400> 194
Phe Gly Phe Phe Ala His Val Ser Ile Asp Trp Leu Gin Ser Leu Ser i ς in ΐζ
<210> 195 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> cetp mimotope <400> 195
Phe Gly Phe Pro Ala His val Ser Ile Arg Trp Leu Gin Ser Leu Ser 15 10 15 <210> 196 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> CETP mimotope <400> 196
Phe Gly Phe Pro Ala His Val Ser Ile Glu Trp Leu Gin Ser Leu Ser 1 5 10 15 <210> 197 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> CETP mimotope <400> 197
Phe Gly Phe Pro Ala His val ser Ile Asp Trp Leu Asn Ser Leu Ser 15 10 15 <210> 198 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CETP mimotope <400> 198
Phe Gly Phe pro Ala His val ser Ile Asp Trp Leu His ser Leu ser 15 10 15 <210> 199 66/97
äiteütsdi Silits patfüiOTt AT505 574 B1 2009-09-15 43
<211> 16 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> CETP mimotope <400> 199
Ala Gly Phe Pro Ala His Val Ser Ile Asp Trp Leu Gin ser Leu ser 15 10 15 <210> 200 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CETP mimotope <400> 200
Pro Gly Phe Pro Ala His val Ser ile Asp Trp Leu Gin ser Leu ser 15 10 15 <210> 201 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CETP mimotope <400> 201
Trp Gly Phe Pro Ala His val ser ile Asp Trp Leu Gin ser Leu ser 15 10 15 <210> 202 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CETP mimotope <400> 202
Phe Ala Phe Pro Ala His val ser ile Asp Trp Leu Gin Ser Leu Ser 15 10 15 <210> 203 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CETP mimotope <400> 203
Phe ser Phe Pro Ala His val ser ile Asp Trp Leu Gin ser Leu ser 15 10 15 <210> 204 67/97
oite'isäiiSd'is patenuimt AT505 574 B1 2009-09-15 44
<211> 16 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> CETP mimotope <400> 204
Phe Tyr Phe Pro Ala His Val Ser Ile Asp Trp Leu Gin ser Leu Ser 15 10 15 <210> 205 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CETP mimotope <400> 205
Phe Asp Phe Pro Ala His val Ser Ile Asp Trp Leu Gin Ser Leu Ser 15 10 15 <210> 206 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CETP mimotope <40Q> 206
Phe Gly Ala Pro Ala His val Ser Ile Asp Trp Leu Gin Ser Leu Ser 15 10 15 <210> 207 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> CETP mimotope <400> 207
Phe Gly Phe Pro Ala His val Ser Ile Asp Trp Leu Gin Leu Leu Ser 15 10 15 <210> 208 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CETP mimotope <400> 208
Phe Gly Phe pro Ala His val Ser Ile Asp Trp Leu Gin Trp Leu Ser 15 10 15 <210> 209 68/97
oiteüsäisd'is patemantt AT505 574 B1 2009-09-15 45
<211> 16 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> CETP mimotope <400> 209
Phe Gly Phe Pro Ala His val ser ile Asp Trp Leu Gin Asn Leu ser 15 10 15 <210> 210 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CETP mimotope <400> 210
Phe Gly Phe Pro Ala His val ser ile Asp Trp Leu Gin Thr Leu ser 15 10 15 <210> 211 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> cetp mimotope <4Ö0> 211
Phe Gly Phe Pro Ala His Val Ser Ile Asp Trp Leu Gin Tyr Leu Ser 15 10 15 <210> 212 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CETP mimotope <400> 212
Phe Gly Phe Pro Ala His val Ser Ile Asp Trp Leu Gin Ser ile Ser 15 10 15 <210> 213 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CETP mimotope <400> 213
Phe Gly Phe Pro Ala His val ser ile Asp Trp Leu Gin ser Leu Thr 15 10 15 <210> 214 69/97
oiteüsäisd'is patenuimt AT505 574 B1 2009-09-15 46
<211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> cetp mimotope <400> 214
Phe Gly Phe Pro Ala His Val Ser Ile Asp Trp Leu Gin Ser Leu Tyr 15 10 15
<210> 215 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CETP mimotope <400> 215
Phe Ala Phe Pro Ala His val Ser Ile Asp Trp Leu Gin Ala Leu Ala 15 10 15
<210> 216 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> CETP mimotope <400> 216
Phe Gly Phe Pro Ala His val Ser ile Asp Arg Ala Gin ser Leu Ser 15 10 15 <210> 217
<211> 16 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> cetp mimotope <400> 217
Phe Gly Phe Pro Thr His Val Ser Ile Asp Trp Leu Gin Ser Leu Ser 15 10 15
<210> 218 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> cetp mimotope <400> 218
Phe Gly Phe Pro Phe His val Ser Ile Asp Trp Leu Gin Ser Leu Ser 15 10 15 <210> 219 70/97
<212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> cetp mimotope <400> 219
phe Gly Phe Pro Ala His Ile Ser Ile Asp Trp Leu Gin Ser Leu Ser 15 10 15 <210> 220 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CETP mimotope <400> 220
phe Gly Phe Pro Ala His Ile Ile Ile Asp Trp Leu Gin Ser Leu Ser 15 10 15 <210> 221 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CETP mimotope <400> 221
Phe Gly Phe Pro Ala His Leu Thr Thr Asp Trp Leu Gin Ser Leu Ser 15 10 15 <210> 222 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> cetp mimotope <400> 222
Phe Gly Phe Pro Ala His Val Phe Ile Asp Trp Leu Gin Ser Leu Ser 15 10 15 <210> 223 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CETP mimotope <400> 223
Phe Gly Phe Pro Ala His Val Tyr Ile Asp Trp Leu Gin Ser Leu Ser 15 10 15 <210> 224
<212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CETP mimotope <400> 224
Phe Gly Phe Pro Ala His Val Ser Leu Asp Trp Leu Gin Ser Leu Ser 15 10 15 <210> 225 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CETP mimotope <400> 225
Phe Gly Phe pro Ala His val Ser Ala Asp Trp Leu Gin Ser Leu Ser 15 10 15 <210> 226 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CETP mimotope <400> 226
Thr Pro Thr His Tyr Tyr Ala Asp Phe Ser Gin Ser Leu Ser 1 5 10 <210> 227 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> CETP mimotope <400> 227
Phe Gly Phe pro Ala His val Ser Ile Asp Trp Ser Gin ser Leu Ser 15 10 15 <210> 228 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CETP mimotope <400> 228
Phe Gly Phe pro Ala His val ser Ile Asp Phe ser Gin ser Leu ser 15 10 15 <210> 229
ίο»® AT505 574 B1 2009-09-15 49
<211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> cetp mimotope <400> 229
Phe Gly Phe Pro Ala His Val Trp Ile Asp Trp Leu Gin Ser Leu Ser 15 10 15 <210> 230 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CETP mimotope <400> 230
Phe Gly Phe Pro Ala His Val Phe Ile Asp Trp Leu Gin Ser Leu Asn 1 5 10 15 <210> 231 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <22 3> cetp mimotope <400> 231 Phe Gly Phe Pro Ala His Phe Ser ile Asp Trp Leu Gin ser Leu ser 1 5 10 15 <210> 232 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <22 3> CETP mimotope <400> 232 Phe Gly Phe Pro Ala His Val Ser Phe Asp Trp Leu Gin Ser Leu Ser 1 5 10 15 <210> 233 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CETP mimotope <400> 233
Phe Gly Phe Pro Glu His Val Phe Ile Asp Trp Leu Gin Ser Leu Ser 15 10 15 <210> 234 73/97 50 50 , äs&sHsdiischts 1 patenuimt AT505 574 B1 2009-09-15
<211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CETP mimotope <400> 234 1 5 ser <210> 235 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <22 3> cetp mimotope <400> 235
Asp Phe Gly Phe Pro Ala His Val Phe Ile Asp Trp Leu Gin Ser Leu 10 15 1 5 Ser <210> 236 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CETP mimotope <400> 236
Asp Phe Gly Phe Pro Ser His Leu ile ile Asp Trp Leu Gin Ser Leu 10 15 1 5 Ser <210> 237 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> CETP mimotope <400> 237
Asp Phe Gly Phe Pro Ala His val Tyr ile Asp Trp Leu Gin ser Leu 10 15
Phe Gly Phe Pro Gin His Leu Phe Thr Asp Trp Leu Gin ser Leu ser 15 10 15
<210> 238 <211> 16 <212> PRT 74/97

Claims (9)

  1. fotssKÄhe AT505 574B1 2009-09-15 <21B> Artificial sequence <220> <223> CETP mimotope <400> 238 phe Gly Phe pro Lys His Leu Leu Val Asp Phe Leu Gin ser Leu ser 1 5 10 15 Patentansprüche 1. Verwendung einer Verbindung, welche die Aminosäuresequenz FX8FPX9HXioXi 1X12DX2X3X4X5X6X7 umfasst, worin X8 ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus G, A, F, Y und K, Xg ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus E, Y, A, Q, K und S, X10 ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Η, V, L, F und I, Xu ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus L, W, S, I, F und Y, X12 V, T, F oder I ist, X2 ein Aminosäurerest ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus F, W und Q, ist, X3 L oder S, ist, X4 Q oder H, ist, X5 S oder Y ist, X6 L, A oder I ist, X7 S, N oder T ist und, kein Polypeptidfragment des Cholesterin-Ester-Transport-Proteins (CETP) oder ein CETP-Epitop ist oder umfasst, wobei die Verbindung eine Bindungskapazität an einen Antikörper hat, der für das natürliche CETP-Glykoseprotein spezifisch ist, oder von DFGFPAHVFIDWLQSLS, zur Herstellung eines Medikaments zur Prävention und/oder Behandlung von Atherosklerose. Gruppe bestehend aus FAFPEHLLVDFLQSLS, FGFPSHLIIDWSQSLS, FYFPAHVSIDWLQSLS, FGFPAHVSIDWLQSLT, FGFPAHVFIDWLQSLS, FGFPAHVFIDWLQSLN, FGFPEHVFIDWLQSLS, FGFPAHVSIDWLHSLS und
  2. 2. Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Aminosäuresequenz ausgewählt ist aus der FGFPYHHLVDQLHSLS, FGFPSHLIIDWLQSLS, FAFPAHV SIDWLQS L S, FGFPAHVSIDWLQSIS, FGFPAHIIIDWLQSLS, FGFPAHVWIDWLQSLS, FGFPAHVSFDWLQSLS, FGFPAHVSIDWSQSLS, FGFPAHLLVDFLQSLS, FGFPAHVSIDWLQSLS, FGFPAHVSIDWLQYLS, FGFPAHISIDWLQSLS, FGFPAHVYIDWLQSLS, FGFPAHFSIDWLQSLS, FGFPQHLFTDWLQSLS, FGFPAHVSIDFSQSLS.
  3. 3. Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Verbindung an einen pharmazeutisch akzeptablen Träger, vorzugsweise an KLH (Keyhole Limpet Hämo-cyanin) gekoppelt ist.
  4. 4. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Verbindung zur intradermalen, subkutanen oder intramuskulären Verabreichung formuliert ist.
  5. 5. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Verbindung mit einem Adjuvans, vorzugsweise mit Aluminiumhydroxid, formuliert ist.
  6. 6. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Verbindung in einer Menge von 0,1 ng bis 10 mg, vorzugsweise 10 ng bis 1 mg, inbeson- 75/97
    oiteüsäisd'is patenuimt AT505 574 B1 2009-09-15 dere 100 ng bis 100 pg, enthalten ist.
  7. 7. Peptid, bestehend aus mindestens einer Aminosäuresequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus FGFPYHHLVDQLHSLS, FAFPEHLLVDFLQSLS, FGFPSHLIIDWLQSLS, FGFPSHLIIDWSQSLS, FAFPAHVSIDWLQSLS, YFPAHVSIDWLQSLS, FGFPAHVSIDWLQSIS, GFGFPAHVSIDWLQSLT, FGFPAHIIIDWLQSLS, FGFPAHVFIDWLQSLS, FGFPAHVWIDWLQSLS, FGFPAHVFIDWLQSLN, FGFPAHVSFDWLQSLS, FGFPEHVFIDWLQSLS, FGFPAHVSIDWSQSLS, FGFPAHVSIDWLHSLS und FGFPAHLLVDFLQSLS, FGFPAHVSIDWLQSLS, GFFPAHVSIDWLQYLS, FGFPAHISIDWLQSLS, FGFPAHVYIDWLQSLS, FGFPAHFSIDWLQSLS, FGFPQHLFTDWLQSLS, FGFPAHVSIDFSQSLS.
  8. 8. Pharmazeutische Formulierung, welche mindestens ein Peptid nach Anspruch 7 umfasst.
  9. 9. Formulierung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass das Peptid an einen pharmazeutisch akzeptablen Träger, vorzugsweise an KLH (Keyhole Limpet Flämocyanin), gekoppelt ist. Hierzu 21 Blatt Zeichnungen 76/97
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