ES2271952T3 - Modulacison de la actividad de la proteina de transferencia de esteres de colesterilo (cetp). - Google Patents
Modulacison de la actividad de la proteina de transferencia de esteres de colesterilo (cetp). Download PDFInfo
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Abstract
ESTA INVENCION TRATA DE PEPTIDOS QUE INCLUYEN UNA PORCION QUE ES UN EPITOPO DE CELULAS T AUXILIARES Y UNA PORCION QUE ES UN EPITOPO DE CELULAS B PARA PROVOCAR UNA RESPUESTA INMUNE CONTRA LA ACTIVIDAD DE LA PROTEINA DE TRANSFERENCIA DEL ESTER COLESTERILICO (CETP), PARA PREVENIR O TRATAR UNA ENFERMEDAD CARDIOVASCULAR, TAL COMO LA ATEROSCLEROSIS.
Description
Modulación de la actividad de la proteína de
transferencia de ésteres de colesterilo (CETP).
La presente es una solicitud de continuación en
parte de la Solicitud de Patente de Estados Unidos nº 08/432.483,
presentada el 1 de mayo de 1995.
La presente invención se encuentra, por lo
general, en el campo de las vacunas basadas en péptidos para
controlar, tratar o reducir el riesgo de actividad aterogénica en el
sistema circulatorio de humanos y otros animales. En particular, la
presente invención proporciona composiciones y procedimientos para
proporcionar medios para inhibir la actividad de la proteína
transportadora de ésteres de colesterilo (CETP) endógena, para
tratar enfermedades cardiovasculares de forma profiláctica o
terapéutica, o para modular los niveles relativos de lipoproteínas
para producir una afección correlacionada con un riesgo reducido de
enfermedad cardiovascular, tal como aterosclerosis.
El colesterol circula por el cuerpo
predominantemente en forma de componentes de partículas de
lipoproteínas (lipoproteínas), que se componen de una parte de
proteína, denominada apolipoproteínas (Apo) y diversos lípidos,
entre los que se incluyen fosfolípidos, triglicéridos, colesterol y
ésteres de colesterol. Existen diez clases principales de
apolipoproteínas: Apo A-I, Apo A-II,
Apo-IV, Apo B-48, Apo
B-100, Apo C-I, Apo
C-II, Apo C-III, Apo D, y Apo E. Las
lipoproteínas se clasifican por densidad y composición. Por ejemplo,
las lipoproteínas de alta densidad (HDL), una de cuyas funciones es
mediar el transporte de colesterol desde los tejidos periféricos
hasta el hígado, tienen normalmente una densidad que varía entre
1,063-1,21 g/mL Las HDL contienen cantidades
diversas de Apo A-I, Apo A-n, Apo
C-I, Apo C-n, Apo
C-III, Apo D, Apo E, así como cantidades diversas de
lípidos, tales como colesterol, ésteres de colesterol, fosfolípidos
y triglicéridos.
A diferencia de las HDL, las lipoproteínas de
baja densidad (LDL), que por lo general tienen una densidad de
aproximadamente 1,019-1,063 g/nA, contienen Apo
B-100 en asociación con diversos lípidos. En
particular, las cantidades de lípidos, colesterol y ésteres de
colesterol son considerablemente superiores en LDL que en HDL,
cuando se miden como porcentaje de masa seca. Las LDL son
particularmente importantes para liberar colesterol a tejidos
periféricos.
Las lipoproteínas de muy baja densidad (VLDL)
tienen una densidad de aproximadamente 0,95-1,006
g/ml y también se diferencian de otras clases de lipoproteínas en
cuanto a composición, tanto en su contenido en proteínas como en
lípidos. Por lo general, las VLDL tienen una cantidad muy superior
de triglicéridos que las HDL o LDL y son particularmente importantes
para liberar triglicéridos sintetizados endógenamente desde el
hígado hasta los tejidos adiposos y otros tejidos. Se han revisado
las características y funciones de diversas lipoproteínas (véase,
por ejemplo, Mathews, C. K. y van Holde, K. E., Biochemistry,
páginas 574-576, 626-630 (The
Benjamin/Cummings Publishing Co., Redwood City, California, 1990);
Havel, R.J. y col. Introduction: Structure and metabolism of
plasma lipoproteins, en The Metabolic Basis of Inherited
Disease, 6ª Edición, páginas 1129-1138 (Scriver,
C. R. y col. eds.) (McGraw-Hill, Inc., Nueva York,
1989); Zannis, V. L. y col., Genetic mutations affecting human
lipoproteins, their receptors, and their enzymes, en Advances
in Human Genetics. Vol. 21, páginas 145-319
(Plenum Press, Nueva York, 1993)).
Por lo general, la propensión disminuida a
enfermedades cardiovasculares, tales como aterosclerosis, se
correlaciona con niveles absolutos aumentados de HDL circulante y
también niveles aumentados de HDL relativos a niveles circulantes de
lipoproteínas de más baja densidad, tales como VLDL y LDL (véase,
por ejemplo, Gordon, D. J. y col., N. Engl. J. Med,
321:1311-1316 (1989); Castelli, W.P. y col., J.
Am. Med. Assoc., 256: 2835-2838 (1986); Miller,
N. E., y col. Am. Heart J., 113: 589-597
(1987); Tall. A. R., J. Clin. Invest., 89:
379-384 (1990); Tall, A. R. J. Internal Med.,
237: 5-12 (1995)).
La proteína transportadora de ésteres de
colesterol (CETP) media el transporte de ésteres de colesterol de
HDL a lipoproteínas ricas en TO, tales como VLDL y LDL, y también el
intercambio recíproco de TG de VLDL a HDL (Tall, A. R., J
Internal Med., 237:5-12 (1995); Tall, A. R.,
J. Lipid Res., 34: 1255-1274 (1993); Hesler,
C. B. y col. J. Biol. Chem., 262: 2275-2282
(1987); Quig, D. W. y col. Ann Rev. Nutr., 10:
169-193 (1990)). La CETP puede desempeñar una
función de modular los niveles de ésteres de colesterol y
triglicéridos relacionados con diversas clases de lipoproteínas. Una
actividad transportadora de ésteres de colesterol de la CETP elevada
se ha correlacionado con niveles aumentados de colesterol asociado a
las LDL y colesterol asociado a las VLDL, que se correlacionan por
turno con un riesgo aumentado de enfermedad cardiovascular (Véase,
por ejemplo, Tato, F. y col. Arterioscler. Thromb. Vascular
Biol., 15: 112-120 (1995)).
En la presente memoria descriptiva, se usará
LDL-C para referirse al colesterol total, incluyendo
ésteres de colesterol y/o colesterol no esterificado, asociado a
lipoproteínas de baja densidad. Se usará VLDL-C para
referirse al colesterol total, incluyendo ésteres de colesterol y/o
colesterol no esterificado, asociado a lipoproteínas de muy baja
densidad. Se usará HDL-C para referirse al
colesterol total, incluyendo ésteres de colesterol y/o colesterol no
esterificado, asociado a lipoproteínas de alta densidad.
La CETP aislada del plasma humano es una
glicoproteína hidrófoba que tiene 476 aminoácidos y un peso
molecular de aproximadamente 66.000 a 74.000 daltons en geles de
poliacrilamida-dodecilsulfato sódico (SDS) (Albers,
J. J., y col., Arteriosclerosis, 4: 49-58
(1984); Hesler, C. B. y col., J. Biol. Chem., 262:
2275-2282 (1987); Jarnagin, S. S., y col., Proc.
Natl. Acad. Sci. EE. UU., 84: 1854-1857 (1987)).
Se ha clonado y secuenciado un ADNc que codifica CETP humana
(Drayna, D., y col., Nature, 327: 632-634
(1987)). Recientemente, se ha reseñado un polimorfismo en CETP
humana y se puede relacionar con una enfermedad en el metabolismo
lípido (Fumeron y col., J. Clin. Invest., 96:
1664-1671 (1995); Juvonen y col., J. Lipid
Res., 36: 804-812 (1995)). Se ha demostrado que
la CETP une CE, TG, fosfolípidos (Barter, P. J. y col., J. Lipid
Res. 21: 238-249 (1980)), y lipoproteínas
(véase, por ejemplo, Swenson, T. L. y col., J. Biol. Chem.,
264: 14318-14326 (1989)). Más recientemente, la
región de CEPT definida por los 26 aminoácidos carboxilos terminales
y, en particular, los aminoácidos 470 a 475, ha demostrado ser
especialmente importante para unir lípidos neutros relacionados con
el transporte de lípidos neutros (Hesler, C. B. y col., J. Biol.
Chem., 236: 5020-5023 (1988)), pero no para unir
fosfolípidos (véase, Wang, S. y col., J. Biol. Chem., 267:
17487-17490 (1992); Wang, S. y col., J. Biol.
Chem., 270: 612-618 (1995)).
Se ha producido un anticuerpo monoclonal (Mab),
TP2 (anteriormente denominado 5C7 en la bibliografía), que inhibe
por completo la actividad transportadora de éster de colesterol y
triglicéridos de la CETP, y en menor grado, la actividad
transportadora de fosfolípidos (Hesler, C. B. y col., J. Biol.
Chem., 263: 5020-5023 (1988)). El epitope de TP2
se localizó en los 26 aminoácidos carboxilos terminales, esto es,
los aminoácidos de arginina-451 a
serina-476, de la molécula de CETP humana de 74.000
daltons (véase, Hesler, C. B. y col. (1988)). Se reseñó que TP2
inhibe tanto la actividad de la CETP humana como de la de conejo
in vitro y la CETP de conejo in vivo (Yen, F. T. y
col. J. Clin. Invest., 83: 2018-2024 (1989)
(reaccionando TP2 con CETP humana); Whitlock y col., J. Clin.
Invest., 84: 129-137 (1989) (reaccionando TP2
con CETP de conejo)). Otro análisis de la región de la CETP unida
por TP2 reveló que los aminoácidos entre
fenilalanina-463 y leucina-475 son
necesarios para unir TP2 y para la actividad transportadora de
lípidos neutros (por ejemplo, éster de colesterol) (véase, Wang, S.
y col., 1992).
Una serie de estudios in vivo que usa
modelos animales o humanos han indicado que la actividad de CETP
puede afectar al nivel de HDL que contiene colesterol circulante. La
actividad transportadora aumentada de ésteres de colesterol de CETP
puede producir una reducción en los niveles de HDL-C
en relación con los niveles de LDL-C y/o
VLDL-C, que se correlaciona por turno con una
propensión aumentada a la aterosclerosis. La inyección de CETP
humana parcialmente purificada en ratas (que normalmente carecen de
actividad de la CETP) dio como resultado un desplazamiento del éster
de colesterol de HDL a VLDL, consistente en el transporte de éster
de colesterol fomentado por CETP, de HDL a VLDL (Ha, Y. C. y col.
Biochim. Biophys. Acta, 833: 203-211 (1985);
Ha, Y. C. y col. Comp. Biochem. Physiol., 83B:
463-466 (1986); Gavish, D. y col. J. Lipid
Res., 28: 257-267 (1987)). Se reseñaron ratones
transgénicos que expresan CETP humana para mostrar una disminución
significante en el nivel de colesterol relacionado con HDL (véase,
por ejemplo, Hayek, T., y col. J Clin. Invest., 90:
505-510 (1992); Breslow, J. L. y col. Proc. Natl
Acad Sci. EE. UU., 90: 8314-8318 (1993)).
Además, mientras que los ratones de tipo salvaje normalmente son muy
resistentes a la aterosclerosis (Breslow, J. L. y col. Proc. Natl
Acad Sci. EE. UU., 90: 8314-8318 (1993)), se
reseñaron ratones transgénicos que expresan CETP de simio para
obtener una distribución modificada de colesterol asociado a
lipoproteínas, a saber, niveles elevados de LDL-C y
VLDL-C y niveles reducidos de HDL-C
(Marotti, K. R. y col. Nature, 364: 73-75
(1993)). Los ratones transgénicos que expresan una CETP de simio
también eran más propensos a la aterosclerosis severa inducida por
la dieta en comparación con ratones que no expresan control y
desarrollaron lesiones ateroscleróticas en sus aortas
considerablemente superiores en área que las encontradas en los
animales de control y que tienen una apariencia amplia, focal, más
típica que las encontradas en lesiones ateroscleróticas en humanos
(Marotti y col. id). La infusión intravenosa de anticuerpos
monoclonales (Mab) de anti-CETP humana en hamsters y
conejos inhibió la actividad de la CETP in vivo y dio como
resultado niveles considerablemente aumentados de niveles de
HDL-C, niveles disminuidos de
HDL-triglicéridos, y tamaño aumentado de HDL;
implicando, una vez más, una función crítica para la CETP en la
distribución de colesterol en lipoproteínas circulantes (Gaynor, B.
J. y col., Atherosclerosis, 110: 101-109
(1994) (hamsters); Whitlock, M. E., y col. J. Clin. Invest.,
84: 129-137 (1989) (conejos)).
También se ha estudiado la carencia de CETP en
humanos. Por ejemplo, en algunos estudios familiares en Japón, los
hermanos que eran homocigóticos para alelos no funcionales del gen
de la CETP no tenían una actividad de la CETP detectable.
Prácticamente no se manifestaron placas ateroscleróticas en estos
individuos, que también mostraron una tendencia hacia la longevidad
en sus familias (véase, por ejemplo, Brown, M. L. y col.
Nature, 342: 448-451 (1989); Inazu, A. y col.
N. Engl. J. Med, 323: 1234-1238 (1990);
Bisgaier, C. L. y col. J. Lipid Res., 32:
21-23 (1991)). Tales individuos homocigóticos
carentes de CETP también mostraron tener un perfil de lipoproteína
antiaterogénica, como demostraron los niveles elevados de HDL
circulante ricos en éster de colesterol, así como los niveles
elevados totales de HDL, y HDL excepcionalmente grande, esto es,
hasta de cuatro a seis veces el tamaño de HDL normal (Brown, M. L. y
col., 1989, página 451). La frecuencia de esta mutación en Japón es
relativamente elevada, y puede suponer un nivel elevado de HDL en
una fracción significativa de la población japonesa.
Los estudios anteriores indican que la CETP
desempeña una función importante en el transporte de éster de
colesterol de HDL a VLDL y LDL, y en la modificación de ese modo del
perfil relativo de lipoproteínas circulantes a uno que está
relacionado con un riesgo elevado de enfermedad cardiovascular (por
ejemplo, niveles reducidos de HDL-C y niveles
aumentados de VLDL-C y LDL-C).
Marotti y col. (arriba) interpretaron su información indicando que
una modificación en la distribución de colesterol inducida por la
CETP era la razón principal de que las lesiones arteriales se
desarrollaran más rápidamente en ratones transgénicos, que expresan
CETP, que en ratones de control no transgénicos, cuando ambos grupos
se alimentaron de una dieta aterogénica. En conjunto, la prueba
actual sugiere que los niveles aumentados de actividad de CETP puede
predecir el riesgo aumentado de enfermedad cardiovascular. La
modulación o inhibición de actividad endógena de la CETP es, de ese
modo, un procedimiento terapéutico atractivo para modular los
niveles relativos de lipoproteínas, para reducir o prevenir la
progresión de, o inducir la regresión de, enfermedades
cardiovasculares, tales como la asterosclerosis.
Por tanto, sería ventajoso descubrir compuestos
y procedimientos para controlar la actividad de la CETP que ayudaría
a prevenir o tratar enfermedades cardiovasculares. Para que sea un
compuesto terapéutico farmacológico efectivo, cuando se administre a
una mayoría significativa de receptores, idealmente, no debería
provocar una respuesta inmune que neutralice la actividad o efecto
beneficioso del compuesto terapéutico, no debe fomentar un estado
hipersensible en el individuo que recibe el compuesto terapéutico, y
no debe producir efectos secundarios adversos. También sería
ventajoso si tales compuestos y procedimientos evitaran la necesidad
de tratamientos continuos o repetidos con frecuencia.
La presente invención proporciona compuestos y
procedimientos útiles para la modulación o inhibición de la
actividad de la proteína transportadora de ésteres de colesterol
(CETP). En particular, se describen péptidos de vacuna que, cuando
se administran a un mamífero, provocan una respuesta de anticuerpos
contra la propia CETP endógena del mamífero, fomentando de ese modo
un efecto profiláctico o terapéutico contra enfermedades
cardiovasculares, tales como aterosclerosis. Tales péptidos de
vacuna comprenden una parte de epitope de célula T auxiliar que
comprende un epitope de célula T auxiliar inmunógeno
"universal" o "de gama amplia", unido, preferiblemente por
covalencia, a una parte de epitope de célula B que comprende uno o
más epitopes de célula B a partir de la CETP, tal como se encuentra
en la parte carboxilo terminal de la proteína CETP humana que está
implicada en un enlace de lípido neutro o una actividad de
transporte de la CETP. También se pueden usar otros epitopes de
célula B de CETP. Preferiblemente, los epitopes de célula B de la
CETP usados en la parte del epitope de célula B de los péptidos de
vacuna de la presente invención inducen anticuerpos a la CETP
endógena (anticuerpos autorreactivos) que o bloquean la función de
la CETP o producen la eliminación de la CETP circulante en la
sangre. Además, los epitopes de célula B usados en los péptidos de
vacuna de la presente invención preferiblemente no comprenden un
epitope de célula T de CETP, de tal forma que se evita la
posibilidad de dañar el hígado autoinmune mediado por la célula
T.
Los péptidos de vacuna de la presente invención
incluyen varias realizaciones "multivalentes". Por ejemplo, los
péptidos multivalentes presentan el sistema inmunológico con más de
un epitope sencillo de célula B o de célula T auxiliar universal o
de gama amplia. Tales péptidos de vacuna multivalentes incluyen
aquellos que tienen copias múltiples (dos o más) del mismo o
distinto epitope de célula T auxiliar inmunógeno universal o de gama
amplia y/o copias múltiples del mismo o distinto epitope de célula B
de la proteína CETP. Esos péptidos, que tienen más de un único
epitope de célula B al que se pueden unir distintos anticuerpos,
pueden fomentar la formación de complejos inmunes para eliminar de
forma efectiva la CETP del sistema circulatorio.
En una realización preferida, la parte de
epitope de célula T auxiliar de un péptido de vacuna de la presente
invención se obtiene de una secuencia de aminoácidos de un epitope
de célula T auxiliar inmunógeno universalmente (de gama amplia), tal
como aquellos encontrados en toxoides de tétanos y de difteria, o en
péptidos antigénicos conocidos de la vacuna contra la tos ferina,
Bacilo de Calmette-Guerin (BCG), vacuna contra la
polio, vacuna contra el sarampión, vacuna contra la parotiditis
infecciosa, vacuna contra la rubéola, derivado proteico purificado
(PPD) de tuberculina, Mycobacterium tuberculosis
hsp-70, y hemocianina de lapa de bocallave. Además,
diversas partes de epitope de célula T auxiliar antigénica universal
(o de gama amplia) pueden unirse a otro para formar partes de
epitope de célula
T auxiliar antigénica universal múltiple (esto es, multivalente) de los péptidos de vacuna de la presente invención.
T auxiliar antigénica universal múltiple (esto es, multivalente) de los péptidos de vacuna de la presente invención.
En una realización más preferida de un péptido
de vacuna de la presente invención, un residuo de cisteína amino
terminal está unido por covalencia a una secuencia de aminoácidos de
un epitope de célula T auxiliar antigénica de gama amplia o
universal de toxoide de tétanos, formando la secuencia CQY
IKANSKFIGITE (aminoácidos 1 a 15 de SEQ ID. NO:2) que está unida por
covalencia a una parte de epitope de célula B de un péptido de
vacuna que tiene una secuencia de aminoácidos de la CETP carboxilo
terminal FGFPEHLLVDFLQSLS (aminoácidos 16 a 31 de SEQ ID. NO:2).
En otra realización preferida, un péptido de
vacuna multivalente comprende una secuencia de aminoácidos de un
epitope de célula T auxiliar antigénica de gama amplia o universal
de toxoide de tétanos, que se une por turno por covalencia a una
parte de epitope de célula B compuesta por dos epitopes de célula B
de la CETP. En una realización preferida como tal de la presente
invención, el péptido de vacuna multivalente tiene la secuencia de
aminoácidos de SEQ ID NO:8: CQYIKA
NSKFIGITELFPRPDQQHSVAYTFEEDIFGFPEHLLVDFLQ S L S en la que una
cisteína amino terminal se une a un epitope de célula T de toxoide
de tétanos (aminoácidos 2 a 15 de SEQ ID NO:8) unido a una secuencia
de aminoácidos que contiene dos epitopes de célula B de CETP humana,
esto es, aminoácidos 349 a 367 y aminoácidos 461 a 476 de la
secuencia de aminoácidos para CETP humana madura (SEQ ID NO:4).
Todavía en otra realización preferida de la presente invención, un
péptido de vacuna multivalente de la presente invención contiene
epitopes de célula B de las regiones homólogas de la CETP de conejo
(esto es, aminoácidos 350 a 368 y 481 a 496 de SEQ ID NO:6) y tiene
la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:9:
MQYIKANSKFIGITERFPRPDGREAVAYRFEED IFGFPKHLLVDFLQSLS, en la que una
metionina amino terminal se une un epitope de célula T de toxoide de
tétanos (aminoácidos 2 a 15 de SEQ ID NO: 8) que se une a una
secuencia de aminoácidos que contiene los dos epitopes de célula B
de la CETP de conejo.
Los péptidos de la presente invención también se
pueden unir a otro a través de una molécula de unión bifuncional o
una molécula de unión de péptidos que tenga inmunogenicidad mínima o
ninguna. Además, los péptidos se pueden unir a una molécula común
para formar ensamblajes de péptidos en los que se disponen copias
múltiples de los péptidos cerca unos de otros. Tales ensamblajes
multicopia (multivalentes) de péptidos pueden ser más inmunógenos,
esto es, pueden producir una respuesta inmune más efectiva a la CETP
endógena que las vacunas que comprenden péptidos individuales no
asociados.
Los compuestos de vacuna de la presente
invención también se pueden usar junto con un adyuvante
farmacéuticamente aceptable.
Los péptidos inmunógenos de vacuna de la
presente invención provocan la producción de anticuerpos que son
reactivos con o reconocen la CETP endógena. La administración de
péptidos de vacuna a animales experimentales dio como resultado un
descenso de los niveles relativos de colesterol total y
HDL-C y dio como resultado una disminución en el
desarrollo de lesiones ateroscleróticas. Los anticuerpos
anti-CETP endógenos provocados fomentan de ese modo
una afección sicológica correlacionada con el riesgo disminuido de
enfermedades cardiovasculares, y parece que tienen un efecto directo
sobre la prevención o disminución de la formación de placas de
aterosclerosis.
Figura 1. El diagrama de flujo del protocolo
para administrar un péptido de vacuna a (vacunación de) conejos y
para extraer muestras de sangre para analizar la eficacia de la
vacuna.
Figura 2. Densidad óptica (D.O.) a 450 nm frente
a dilución de plasma basada en ensayo ELISA para anticuerpos
anti-CETP uniéndose a CETP recombinante en muestras
de plasma diluido tomadas de conejos (rb#1-#4) el Día 70. El
cuadrado en blanco (conejo rb#4) se refiere al plasma de un conejo
al que no se le ha administrado el péptido de vacuna (control). El
cuadrado, círculo y rombo rellenos se refieren a conejos rb# 1, #2 y
#3, respectivamente, a los que se les administró un péptido de
vacuna con una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:2.
Figura 3. Densidad óptica (D.O.) a 450 nm frente
a dilución de plasma para muestras de plasma sanguíneo de conejos
(rb#1-#4, véase la descripción de la figura 2, arriba), basada en
ensayo ELISA competitivo para inhibición de anticuerpo monoclonal
(Mab) TP2 uniéndose a CETP humana recombinante por medio de
anticuerpos anti-CETP en muestras de plasma
sanguíneo diluido de conejo tomadas el Día 70.
Figura 4. Concentración de colesterol total
(mg/dl) en muestras de plasma de conejos (rb#1-#4, véase la
descripción de la Figura 2, arriba) frente a tiempo (Días) en
protocolo de vacunación.
Figura 5. Concentración de HDL-C
(mg/dl) en muestras de plasma de conejos (rb#1-#4, véase la
descripción de la Figura 2, arriba) frente a tiempo (Días) en
protocolo de vacunación.
Figura 6. Relación No-HDL/HDL en
conejos blancos de Nueva Zelanda el Día 70. Conejo de control no
vacunado (N=1) rb#4 (barra rellena); media (N=3) de conejos
vacunados rb#1, 2 y 3 (recién nacidos).
Figura 7. Densidad óptica (D.O.) a 450 nm frente
a dilución de plasma (gráfico semilogarítmico) basada en ensayo
ELISA para anticuerpos anti-CETP uniéndose a CETP
recombinante en muestras de plasma diluido tomadas de ratones
transgénicos de CETP humana el Día 70 en el protocolo de vacunación.
La información para cada ratón al que se administró un péptido de
vacuna con una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:2 se indica con
"+" y una línea continua. La información para cada ratón de
control se indica con "x" y una línea discontinua. Las
diluciones de plasma abarcan un intervalo de 1:10 a 1:1.000.000
(1E+1 a 1E+6).
Figuras 8A y 8B. Diagramas típicos de
Hidrofilicidad, Probabilidad de Superficie, Índice Antigénico y
Hélice Anfifílica (Figura 8A) y Hojas anfifílicas y Estructura
Secundaria (Figura 8B) para CETP humana madura.
Figura 9. Título de anticuerpo para CETP humana
recombinante de Grupos I y II de Modelo de Aterosclerosis basado en
ensayo ELISA. D.O. a 405 nm frente a dilución de plasma de
conejo.
Figuras 10A y 10B. Títulos de anticuerpos en
plasma de conejo para CETP de conejo en Modelo de Aterosclerosis
basado en ensayo ELISA. Plasma de prevacunación (Figura 10A). Plasma
de posvacunación (Figura 10B). D.O. a 405 nm frente a dilución de
plasma de conejo.
Figura 11. Colesterol total en animales pre y
posvacunados en Modelo de Aterosclerosis. Colesterol total (mg/dl)
frente a día y grupo.
Figura 12. HDL-C en animales pre
y posvacunados en Modelo de Aterosclerosis. HDL-C
(mg/dl) frente a día y grupo.
Figura 13. Gráfico de barras del porcentaje
medio del área total de la aorta cubierta por lesiones
ateroscleróticas en ratones vacunados y de control con dietas
suplementadas con colesterol. Puntos de información individual
(rombos), porcentaje medio de área aórtica cubierta por lesiones
(barra sombreada), desviación convencional de puntos de información
(barra en blanco), p <0,01 indica importancia estadística entre
gráfico de barras.
Como se indica anteriormente, un riesgo
disminuido de aterosclerosis se ha correlacionado con niveles de
circulación relativamente bajos de LDL y VLDL y niveles
relativamente elevados de HDL. Los niveles de tales lipoproteínas de
circulación están influidos directamente, al menos en parte, por los
niveles endógenos de actividad de la CETP. En particular, la
actividad elevada de la CETP fomenta el transporte de lípidos
neutros, tales como ésteres de colesterol de HDL a VLDL y LDL. Por
consiguiente, la CETP es una diana relativamente preciso en humanos
y otros animales para modificar los niveles relativos de LDL, VLDL y
HDL en el sistema circulatorio (véase, por ejemplo, Tato, F., y col.
Arteriosclero. Thromb. Vascular Biol., 15:
112-120 (1995); Tall, A. R., J. Internal
Med., 237: 5-12 (1995)). La presente invención
está dirigida al control de la actividad de la CETP endógena
proporcionando péptidos de vacuna de la CETP que sirvan para
provocar una respuesta inmune en individuos contra su CETP endógena,
fomentando de ese modo una afección sicológica, como por ejemplo,
nivel aumentado de HDL o nivel disminuido de LDL, correlacionado con
un riesgo disminuido de aterosclerosis. Además, la provocación de
una respuesta inmune contra la CETP endógena usando péptidos de
vacuna de la presente invención puede proporcionar, prevenir o
inhibir la progresión de lesiones en tejidos propensos a
aterosclerosis.
Como se usa en la presente memoria descriptiva,
un péptido de vacuna de CETP es un péptido que comprende una parte
de epitope de célula T auxiliar que comprende una secuencia de
aminoácidos de un epitope de célula T auxiliar antigénica universal
(esto es, de gama amplia) y una parte de epitope de célula B que
comprende una secuencia de aminoácidos de un epitope de célula B de
la CETP, tal como la región carboxilo terminal de la CETP implicada
en la actividad de unión de un lípido neutro y/o transporte de un
lípido neutro. Tales péptidos de vacuna de CETP son antigénicos,
esto es, provocan la producción de anticuerpos específicos para ese
péptido que une la CETP endógena. De ese modo, los péptidos de
vacuna de CETP de la presente invención son restos inmunógenos que
tienen la capacidad de estimular la formación de anticuerpos que
unen de forma específica la CETP endógena e inhiben la actividad de
la CETP endógena.
Los péptidos útiles en las composiciones y
procedimientos de la presente invención comprenden una parte de
epitope de célula T auxiliar y una parte de epitope de célula B. La
parte de epitope de célula T auxiliar (o simplemente "parte de
epitope de célula T") tiene una secuencia de aminoácidos derivada
de al menos un epitope de célula T auxiliar universal (o universal
inmunógena o de amplia gama) antigénica (también denominado un
péptido vehículo inmunógeno) que se define como un péptido, o
derivado del mismo, que puede presentarse por medio de haplotipos de
complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) y de ese modo activan
las células T auxiliares, que por turno, estimulan el crecimiento y
diferenciación de células B. Como se trata más abajo, la parte del
epitope de la célula B (también denominada una parte de péptido
relacionada con la CETP) de los péptidos de vacuna descritos en la
presente memoria descriptiva tiene una secuencia de aminoácidos que
comprende un epitope de célula B de la proteína CETP, tal como una
parte de la región carboxilo terminal de la enzima CETP, que está
implicada en la unión de lípidos neutros y/o transporte de lípidos
neutros.
En la técnica se conocen ejemplos de lo que se
denominan epitopes de célula T auxiliar antigénica
"universales" o de "gama amplia" que se han usado en forma
de péptidos vehículo inmunógeno para vacunaciones de humanos. Entre
estos se incluyen, por ejemplo, epitopes de toxoide de tétanos (tt)
y toxoide de difteria (td) (véase, por ejemplo,
Panina-Bordignon, P., y col. Eur. J.
Immunol., 19: 2237-2242 (1989) (caracterización
de péptidos de epitope de célula T auxiliar de toxoide de tétanos
universal); Etlinger, H., Immunol. Today, 13:
52-55 (1992); Valmori, D., y col., J.
Immunol., 149: 717-721 (1992) (uso de epitopes
tt universales en vacunas futuras contra la malaria); Talwar, G. P.,
y col. Proc. Natl. Acad. Sci. EE. UU., 91:
8532-8536 (1994) (uso de epitopes universales en
forma de tt y td en vacuna para la gonadotropina coriónica
anti-humana); Talwar, G. P., y col. Proc. Natl.
Acad. Sci. EE. UU., 91: 8532-8536 (1994). Además
de tt y td, en la presente invención, otras secuencias útiles de
epitope de célula T auxiliar incluyen aquellas que se derivan de
péptidos antigénicos conocidos de la vacuna contra la tos ferina,
Bacilo de Calmette-Guerin (BCG), vacuna contra la
polio, vacuna contra el sarampión, vacuna contra la parotiditis
infecciosa, vacuna contra la rubéola y derivado proteico purificado
(PPD) de tuberculina (véase, por ejemplo, Etlinger, H., Immunol.
Today, 13: 52-55 (1992)); incorporadas en la
presente memoria descriptiva mediante referencias). Además, dos o
más copias de las mismas o diversos epitopes diferentes de célula T
auxiliar antigénica universal se pueden unir a otro para formar
partes de epitope de célula T auxiliar multivalente o múltiple de
los péptidos de vacuna de la presente invención. Por ejemplo, se
puede sintetizar un péptido de vacuna de la presente invención
compuesto por una parte de epitope de célula T auxiliar múltiple o
multivalente, que comprenda una secuencia de aminoácidos de un
epitope de célula T auxiliar tt y un epitope de célula T auxiliar
td.
Además, la inmunogenicidad de un péptido de
vacuna de la presente invención también se puede potenciar uniendo
la parte de epitope de célula T auxiliar a una secuencia de péptido
de una CETP xenogénica o a una proteína homóloga relacionada con la
CETP. Anteriormente se usó un enfoque como tal en una vacuna humana
para gonadotropina coriónica humana (véase, Talwar, G. P., y col.
Proc. Natl. Acad. Sci. EE. UU., 91: 8532-8536
(1994)); dímero de heteroespecies formado entre una secuencia de
aminoácidos de subunidad \beta de gonadotropina coriónica humana y
una secuencia de aminoácidos de una subunidad de hormona
luteinizante ovina. Entre los ejemplos de proteínas relacionadas con
la CETP que se podrían usar en este enfoque se incluyen, por
ejemplo, proteína de transporte de fosfolípidos y proteína
bactericida neutrófila (véase, Day, J. R., y col. J. Biol.
Chem., 269: 9388-91 (1994); Gray, P. W., y col.,
J. Biol. Chem., 264: 9505-9509 (1989)).
Otras moléculas vehículo inmunógenas tales como
hemocianina de lapa de bocallave (KLH) también se pueden usar solas
o combinándolas con otros epitopes de célula T auxiliar antigénica
universal. Por ejemplo, KLH contiene residuos de lisina múltiples en
su secuencia de aminoácidos. Cada una de estas lisinas es un sitio
potencial en el que un péptido de vacuna descrito en la presente
memoria descriptiva podría unirse (por ejemplo, KLH activada con
maleimida, Catálogo Nº 77106, Pierce, Rockford, IL). Una disposición
como tal es un ensamblaje de péptidos de vacuna que es multivalente
de forma extensiva para tanto para los epitopes de célula T auxiliar
(esto es, aquellos epitopes de célula T auxiliar de la secuencia de
aminoácidos de KLH junto con aquellos epitopes de célula T auxiliar
de las copias múltiples de los péptidos de vacuna unidos) como para
los epitopes de célula B de la CETP (esto es, aquellos epitopes de
célula B de la CETP en las copias múltiples de los péptidos de
vacuna unidos a la secuencia de aminoácidos de KLH).
Recientemente, otra molécula vehículo
inmunógena, hsp-70 de Mycobacterium
tuberculosis, ha demostrado ser un antígeno especialmente
potente compuesto por epitopes de célula B y T múltiples (Suzue y
Young, J. Immunol., 156: 873-879 (1996)). La
proteína hsp70 se puede unir mediante agentes de entrecruzamiento
convencionales a péptidos de vacuna de la presente invención para
potenciar la inmunogenicidad. De forma alternativa, se prueden
introducir moléculas de ácido nucleico que codifican péptidos de
vacuna de la presente invención en un vector de expresión que
permite la expresión de una proteína recombinante compuesta por el
péptido de vacuna fusionado al extremo amino de hsp70.
Preferiblemente, la parte de epitope de célula T
auxiliar de los péptidos de vacuna de la presente invención
comprende un epitope de célula T auxiliar tt o td antigénica
universal. En una realización más preferida, los péptidos de la
presente solicitud usan epitopes de célula T auxiliar tt antigénica
universal que tienen secuencias de aminoácidos QYIKANSKFIGITE
(aminoácidos 2 a 15 de SEQ ID NO: 2) y FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE (SEQ ID
NO:3). Más preferiblemente, los péptidos de la presente invención
usan el epitope de célula T auxiliar tt antigénica universal que
tiene la secuencia de aminoácidos QYIKANSKFIGITE (aminoácidos 2 a 15
de SEQ ID NO: 2).
Además de los diversos ejemplos de epitopes de
célula T auxiliar tratados anteriormente, se puede determinar si
otro péptido o proteína sirve como un epitope de célula T auxiliar
para la parte de epitope de célula T de los péptidos de vacuna de la
presente invención, usando un ensayo de proliferación convencional
para epitopes de célula T (auxiliar) de clase II (véase, por
ejemplo, páginas 3.12.9-3.12.14, en Current
Protocols in Immunology. Vol. I (Coligan y col. eds.) (John
Wiley & Sons, Inc., Nueva York, Nueva York, 1994)).
La parte de epitope de célula B de los péptidos
de vacuna descritos en la presente memoria descriptiva comprenden
uno o más epitopes de célula B de la proteína CETP endógena al
mamífero vacunado, o uno o más epitopes de célula B de una CETP
distinta a la CETP endógena, pero que es de reacción cruzada
(anticuerpo) de forma inmunológica con la CETP endógena.
La parte de epitope de célula B de los péptidos
de vacuna de la presente invención puede comprender uno o más
epitopes de célula B de la CETP endógena del individuo al que se va
a vacunar para activar anticuerpos que inhiben la actividad de la
CETP endógena. Sin embargo, también se encuentra en el alcance de la
presente invención que la parte de epitope de célula B de los
péptidos de vacuna de la presente invención comprende epitopes de
célula B de moléculas de CETP que son similares, pero no idénticos a
la CETP endógena del individuo al que se va a vacunar. Algunos
epitopes de célula B de tales proteínas de la CETP similares, pero
no idénticos, pueden contener epitopes que potencien la respuesta
inmune en el individuo vacunado. Por lo general, las moléculas de la
CETP que tienen secuencias de aminoácidos que son al menos
aproximadamente el 80% homólogas a la CETP endógena se pueden usar
como una fuente de epitopes de célula B en la parte de epitope de
célula B de los péptidos de vacuna de la presente invención. Como
ejemplo, las proteínas de la CETP humana y de conejo tienen una
homología en la secuencia de aminoácidos de aproximadamente el 80%.
La CETP de conejo madura tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID
NO:6 y la CETP humana madura de hígado tiene la secuencia de
aminoácidos de SEQ ID NO:4. Por consiguiente, en un ejemplo de una
realización como tal de los péptidos de vacuna de la presente
invención, la parte de epitope de célula B comprende uno o más
epitopes de una CETP humana y/o de conejo, y tal péptido de vacuna
puede usarse tanto en conejos como en humanos para inhibir la
actividad de la CETP endógena.
Además, la parte de epitope de célula B de los
péptidos de vacuna de la presente invención comprende una parte de
la secuencia de aminoácidos de la proteína de la CETP madura (SEQ ID
NO:4) compuesta por al menos 6 secuencias de aminoácidos de longitud
y que no estimula de manera significativa, o nada, la proliferación
de células T in vitro.
En una realización preferida, los péptidos de
vacuna de la presente invención tienen partes de epitope de célula B
multivalente de péptidos de vacuna de la presente invención, que
comprenden dos o más epitopes de célula B diferentes de la CETP. Se
prefieren especialmente tales partes de epitope de célula T auxiliar
multivalente porque presentan sitios diana múltiples en los que
anticuerpos provocados pueden unirse a la CETP endógena, fomentando
de ese modo la formación más extensa de complejos inmunes y/o la
posibilidad de inhibir la actividad de transporte de colesterol de
la CETP.
Además, se prefiere que una parte de epitope de
célula B de los péptidos de vacuna no comprenda un epitope de célula
B que también comprenda un epitope de célula T que se puede
presentar en moléculas endógenas MHC de clase I. Tales epitopes de
célula T de la CETP podrían presentarse en la superficie de
hepatocitos en el contexto de MHC de clase I y provocar una
respuesta de célula T citotóxica y de ese modo dañar el tejido del
hígado. Se puede determinar si un epitope particular de célula B de
la CETP comprende un epitope de célula T de clase I usando un ensayo
convencional de célula T citotóxica (véase, por ejemplo, páginas
3.11.4-3.11.7, en Current Protocols in
Immunology. Vol I (John Wiley & Sons, Inc. Nueva York; Nueva
York, (1994)).
En otra realización, la parte de epitope de
célula B de los péptidos de vacuna de la presente invención
comprende los 26 aminoácidos carboxilos terminales de CETP humana
(véase SEQ ID NO:1) o fragmentos de los mismos que retienen una
conformación o una actividad de la región de los 26 aminoácidos
carboxilos terminales de la CETP, como por ejemplo, fragmentos de
los extremos carboxilos de la CETP que son al menos seis aminoácidos
consecutivos en longitud y que están implicados en la unión de
lípidos neutros específicos y/o la actividad de transporte de
lípidos neutros específicos de la CETP. Más preferiblemente, la
parte de epitope de célula B (o relacionada con la CETP) de los
péptidos de vacuna de la presente invención comprende cualquier
fragmento de la región carboxilo terminal de la CETP que es al menos
once aminoácidos consecutivos en longitud, que retiene la
conformación de la región de los 26 aminoácidos carboxilos
terminales de la CETP, que está implicada en la unión de lípidos
neutros y/o la actividad de transporte de lípidos neutros de la
CETP, y que es accesible a la unión de anticuerpos (véase, por
ejemplo, Wang, S., y col. J. Biol. Chem., 267:
17487-17490 (1992); Wang, S., y col., J. Biol.
Chem., 268: 1955-1959 (1993)). Además, se han
generado diversos Mab en esta región, incluyendo el Mab TP2, que
bloquea la función de la CETP humana y también la CETP de conejo,
suponiendo que este epitope se conserve en las proteínas de la CETP
humana y de conejo (Whitlock y col., J. Clin Invest., 84:
129-137 (1989)). Esto se confirma con el hecho de
que los 22 aminoácidos carboxilos terminales de la CETP humana y de
conejo se diferencian en una sola posición, esto es, se sustituye el
residuo de ácido glutámico en la posición 465 en la secuencia de
aminoácidos de la CETP humana en SEQ ID NO:4 con una lisina en la
posición homóloga (posición 485) en la secuencia de conejo (SEQ ID
NO: 6; véase también, Nagashima y col. J. Lipid Res., 29:
1643-1649 (1988)).
De manera alternativa, la parte de epitope de
célula B comprende un derivado de la región de 26 aminoácidos
carboxilo terminales de la CETP que contiene cambios de aminoácidos
(deleciones, adiciones o sustituciones) que no modifican de forma
significativa o destruyen la unión de lípidos neutros o la actividad
de transporte de la CETP (véase, Wang y col., id, (1992);
Wang y col., id., (1993)). Tales cambios en la secuencia de
aminoácidos de una CETP endógena dirigida a diana incluyen, pero no
se limitan a, lo que se conoce generalmente como sustituciones
conservadoras de aminoácidos, tales como la sustitución de un
aminoácido de la secuencia de la CETP con otra de estructura
similar, carga o hidrofobicidad. También es útil en el diseño de un
péptido de vacuna de la presente invención, cualquier adición o
sustitución a la secuencia de la CETP que mantenga la unión de
lípidos neutros y/o actividad de transporte, pero mejore la
estabilidad in vivo o in situ, mejore la purificación
o proporcione sitios de entrecruzamiento (por ejemplo, a través de
formación de enlaces de disulfuros de
cisteína-cisteína).
Ya que el transporte de lípidos neutros mediado
por la CETP precisa necesariamente la unión de lípidos neutros (por
ejemplo, triglicéridos, éster de colesterol), también son útiles en
el diseño de péptidos de vacuna de la presente invención partes de
la secuencia de aminoácidos de la CETP que están implicadas en la
unión de lípidos neutros. Algunas partes de la secuencia de
aminoácidos de la CETP usadas para diseñar los péptidos de vacuna de
la presente invención pueden estar implicadas tanto en la unión de
lípidos neutros como en el sitio real catalítico de transporte de
lípidos neutros de la CETP. Pruebas recientes sugieren que la CETP
contiene sitios de unión distintos para éster de colesterol y
triglicéridos (Melchior, G. W., y col. J. Biol. Chem., 270:
21068-21074 (1995)). Por consiguiente, la
incorporación de la secuencia de aminoácidos para un sitio de unión
de un lípido específico en un péptido de vacuna puede proporcionar
un medio para modular interacciones de la CETP con ese lípido
específico, fomentando de ese modo un perfil
anti-aterogénico, a pesar de que los anticuerpos
provocados a la CETP no fomenten la eliminación (reducir la semivida
del suero) de la CETP circulante. Por ejemplo, para modular el
contenido de triglicéridos de HDL de manera específica, se podría
incorporar un epitope de célula B derivado de la región de unión del
triglicérido de la CETP en la parte del epitope de célula B de un
péptido de vacuna de la presente invención. De forma similar, para
modular el contenido de éster de colesterol de HDL de manera
específica, se podría incorporar un epitope de célula B derivado de
la región de unión del éster de colesterol de la CETP en en el
diseño de un péptido de vacuna de la presente invención. Tales
péptidos de vacuna se diseñan de ese modo para provocar anticuerpos
que bloqueen los sitios de unión de lípidos neutros específicos en
la CETP y de ese modo influyen al lípido específico transportado
entre HDL y la CETP.
También son útiles las secuencias de aminoácidos
de la CETP que son al menos seis aminoácidos consecutivos en
longitud, un tamaño mínimo de un epitope en una proteína (véase, por
ejemplo, Watson y col., Molecular Biology of the Gene, 4ª
edición, página 836 (The Benjamin/Cummings Publishing Co. Inc.,
Menlo Park, CA, 1987), y más preferiblemente, que son al menos once
aminoácidos consecutivos en longitud de la región de 26 aminoácidos
carboxilos terminales de la CETP codificada por cualquier
polimorfismo que aparezca, de forma natural, del gen de la
CETP.
CETP.
Las moléculas de la CETP de la secuencia de
aminoácidos conocida se puede analizar para la localización de
epitopes de célula B potenciales usando algoritmos que puedan
identificar motivos antigénicos potenciales en la secuencia de
aminoácidos. Por ejemplo, combinando análisis de diagramas de
hidrofilicidad, probabilidad de superficie, hélice anfifílica, hojas
anfifílicas y estructura secundaria (Figuras 8A y 8B), se puede
obtener un Índice Antigénico (véase Figura 8A) de la secuencia de
aminoácidos de la proteína completa, llevando a la identificación de
epitopes de célula B potencialmente útiles en los péptidos de vacuna
de la presente invención.
En la técnica se conocen bien procedimientos
para analizar moléculas de CETP para unir lípidos neutros o su
efecto en la actividad de transporte de lípidos neutros, (véase, por
ejemplo, Swenson, T. L., y col. J. Biol. Chem., 263:
5150-5157 (1988) (ensayo para unión de lípidos);
Hesler, C. B., y col. J. Biol. Chem., 262:
2275-2282 (1987) (ensayo para transporte de
lípidos); Bisgaier, C. L., y col. J. Lipid Res., 34:
1625-1634 (1993) (uso de microemulsiones
fluorescentes de éster de colesterol en ensayo de actividad de
transporte de colesterol mediado con la CETP); Gaynor, B. J. y col.
Atherosclerosis, 110: 101-109 (1994) (ensayo
para transporte de lípidos de CETP); Wang y col. (1992) (analizando
mutaciones por deleción de la CETP para actividad de transporte);
Wang y col., (1993) (analizando formas sencillas mutantes de
aminoácidos de la CETP); incorporados en la presente memoria
descriptiva mediante referencias). También están disponibles en el
mercado ensayos para la actividad de transporte de la CETP (por
ejemplo, ensayo funcional de la CETP por Diagnescent Technologies,
Yonkers, Nueva York).
Preferiblemente, la parte de epitope de célula B
de los péptidos de vacuna de la CETP de la presente invención
comprende la secuencia de aminoácidos LFPRPDQQ HSVAYTFEEDI
(aminoácidos 16 a 34 de SEQ ID NO:8) y/o la secuencia de aminoácidos
FGFPEHLLVDFLQSLS (aminoácidos 35 a 50 de SEQ ID NO:8).
Las partes del epitope de célula T auxiliar y
del epitope de célula B (relacionado con la CETP) de los péptidos de
vacuna de la CETP de la presente invención se unen en conjunto para
formar restos inmunógenos. Las partes del epitope de célula T
auxiliar y del epitope de célula B se pueden unir por covalencia,
directamente (por ejemplo, a través de un enlace peptídico) o a
través de una molécula de entrecruzamiento. Cuando se usan moléculas
de entrecruzamiento, deben unir las partes del epitope de célula T
auxiliar y del epitope de célula B del péptido de vacuna sin que
haga tóxico al péptido o interfiera de forma significativa con o
reduzca la inmunogenicidad total del péptido de vacuna. Las
moléculas de entrecruzamiento apropiadas incluyen aminoácidos, por
ejemplo, usando uno o más residuos de glicina para formar un
"puente de glicina" entre las partes del epitope de célula T
auxiliar y del epitope de célula B de los péptidos de vacuna de la
presente invención. También se contempla la formación de enlaces de
disulfuros entre residuos de cisteína que se han añadido a las
partes del epitope de célula T auxiliar y del epitope de célula B, o
el uso de moléculas de entrecruzamiento tales como glutaraldehído
(Korn, A. H., y col., J. Mol. Biol., 65:
525-529 (1972)) y EDC (Pierce, Rockford, IL) u otras
moléculas de entrecruzamiento bifuncional para unir una parte de
epitope de célula T auxiliar a una parte de epitope de célula B. Las
moléculas de entrecruzamiento bifuncional poseen dos sitios
reactivos distintos; uno de los sitios reactivos se puede reaccionar
con un grupo funcional en la parte de epitope de célula T auxiliar
para formar un enlace covalente y el otro sitio reactivo se puede
reaccionar con un grupo funcional en la parte de epitope de célula B
para formar otro enlace covalente, uniendo las dos partes. Means y
Feeney (Bioconjugate Chem., 1: 2-12 (1990))
revisan procedimientos generales para moléculas de
entrecruzamiento.
Las moléculas de entrecruzamiento
homobifuncional tienen dos sitios reactivos que son los mismos
químicamente. Entre los ejemplos de moléculas de entrecruzamiento
homobifuncional se incluyen glutaraldehído,
N,N'-bis(3-maleimido-propionil}-2-hidroxi-1,3-propanediol
(un entrecruzador homobifuncional sulmidril-specmc);
algunos ésteres de N-succinimida, tales como
disuccinimidil suberato y
ditio-bis-succinimidil propionato) y
sus sales y ácidos bisulfónicos solubles (por ejemplo, como están
disponibles en Pierce Chemicals, Rockford, Illinois; Sigma Chemical
Co., St. Louis Missouri). Para la presente realización, deberían
ajustarse las concentraciones relativas de las partes de epitope de
célula T auxiliar y de epitope de célula B para maximizar el número
de partes de epitope de célula T auxiliar y de epitope de célula B
que están unidas y para minimizar la unión de partes idénticas de
epitope con otras (esto es, evitar, por ejemplo, la formación
homodímera de epitope de célula T auxiliar- epitope de célula T
auxiliar o epitope de célula B- epitope de célula B).
Preferiblemente, la molécula de entrecruzamiento
bifuncional es una molécula de unión heterobifuncional, que
significa que la molécula de unión tiene al menos dos sitios
reactivos que se pueden unir separadamente por covalencia a un
epitope de célula T y a un epitope de célula B. El uso de tales
moléculas de unión heterobifuncional permite separar químicamente y
añadir de forma escalonada (conjugación vectorial) cada uno de los
sitios reactivos de la molécula de unión a las partes del epitope de
célula T auxiliar y del epitope de célula B del péptido de vacuna.
Las moléculas de entrecruzamiento heterobifuncional que se pueden
usar para unir partes del epitope de célula T auxiliar y del epitope
de célula B con otras incluyen éster de
m-maleimidobenzoil-N-hidroxisuccinimida
(véase, Green, N., y col., Cell, 28: 477-487
(1982); Palker y col., Proc. Natl. Acad. Sci. EE. UU., 84:
2479-2483 (1987); éster de
m-maleimido-benzoilsulfosuccinimida;
éster de N-hidroxisuccinimida de ácido
\gamma-maleimidobutírico; y
N-succinimidil
3-(2-piridil-ditio)propionato
(véase, Carlsson, J., y col., Biochem J., 173:
723-737 (1978); Sigma Chemical Co., St. Louis,
Missouri).
Además, las partes del epitope de célula T
auxiliar y del epitope de célula B pueden unirse a una molécula
vehículo común, tal como albúmina de suero o una resina o perla
polimérica. La unión de partes del epitope de célula T auxiliar y
del epitope de célula B a un vehículo común se puede conseguir
usando una molécula de entrecruzamiento tal como gutaraldehído u
otra molécula de entrecruzamiento bifuncional (véase arriba). Para
la presente realización, deberían ajustarse las concentraciones
relativas de parte de epitope de célula T auxiliar, parte de epitope
de célula B y la molécula vehículo común para maximizar el número de
partes de epitope de célula T auxiliar y de epitope de célula B que
están unidas al vehículo común y para minimizar tanto la unión de
moléculas idénticas con otras (esto es, formación homodímera) como
la unión de partes del epitope de célula T auxiliar y del epitope de
célula B con otras (esto es, formación heterodímera). La unión de
las partes del epitope de célula T auxiliar y del epitope de célula
B con otra molécula o superficie (por ejemplo, la superficie de una
resina o perla de polímero) no debería alterar de forma
significativa o reducir las características inmunógenas de las
secuencias de la parte del epitope de célula T auxiliar antigénica
universal o de la parte del epitope de célula B (relacionada con la
CETP). El efecto global de usar tales moléculas de entrecruzamiento
bifuncional es que se unen copias múltiples de partes del epitope de
célula T auxiliar y del epitope de célula B de un péptido de vacuna
con un vehículo común que puede potenciar una respuesta inmune y la
producción de anticuerpos que se unan a la CETP endógena.
Las disposiciones de péptidos antigénicos
múltiples (MAP) también han demostrado ser antígenos e inmunogenes
altamente eficaces (véase, por ejemplo, Tam, J. P., Proc. Natl.
Acad. Sci. EE. UU., 85: 5409-5413 (1988); Wang,
C. Y., y col., Science, 254: 285-288 (1991);
Marguerite, M, y col., Mol. Immunol., 29:
793-800 (1992)). Dicha tecnología MAP, en la que las
partes del epitope de célula T auxiliar y del epitope de célula B de
los péptidos de vacuna descritos en la presente memoria descriptiva
están unidos a una molécula núcleo común, proporciona otra forma de
realizar ensamblajes de péptidos multivalentes a provocar
anticuerpos contra la CETP endógena.
Preferiblemente, las partes del epitope de
célula T auxiliar y del epitope de célula B de los péptidos de
vacuna de la presente invención se unen por covalencia de extremo a
extremo para formar un péptido continuo. Más preferiblemente, una
parte de epitope de célula T auxiliar antigénica universal
seleccionada forma la parte amino terminal del péptido de vacuna con
su residuo de aminoácidos carboxilos terminales, unido por
covalencia en un enlace peptídico al aminoácido amino terminal de
una secuencia de aminoácidos seleccionada relacionada con la CETP
(parte del epitope de célula B) del péptido de vacuna. Sin embargo,
también se puede usar el orden inverso, esto es, la secuencia de
aminoácidos relacionada con la CETP (parte del epitope de célula B)
de los péptidos de vacuna de la presente invención puede
posicionarse para formar la región amino terminal de un péptido de
vacuna y un epitope de célula T auxiliar antigénica universal o una
secuencia vehículo inmunógena de aminoácidos puede comprender la
parte carboxilo terminal del péptido de vacuna.
Los péptidos de vacuna de la presente invención
pueden hacerse más inmunógenos uniéndolos por covalencia a copias
múltiples de la proteína del complemento C3d (Dempsey y col.
Science, 271: 348-350 (1996)). De forma
alternativa, se pueden derivatizar los péptidos de vacuna con
estructuras de hidratos de carbono que activan el complemento y se
unen por covalencia con C3d (Fearon y col. Science, 272:
50-54 (1996)). Por ejemplo, las proteínas expresadas
en algunas células hospedadoras de ovario de hámster chino mutante
se pueden glicosilar con estructuras de hidratos de carbono
específicas (Stanley, Mol. Cell. Biol., 9:
377-383 (1989)). Pruebas recientes demuestran que
C3d fomenta el reconocimiento de antígenos por parte del sistema
inmunológico adquirido provocando una respuesta inmune enérgica
(Dempsey y col., 1996).
Los péptidos de la presente invención se pueden
producir por medio de cualquiera de los procedimientos disponibles
conocidos en la técnica para producir péptidos de secuencia de
aminoácidos definida. Por ejemplo, la síntesis automatizada de
péptidos está disponible para aquellos expertos en la técnica usando
sintetizadores automatizados de péptidos (por ejemplo, Sintetizador
de péptidos Synergy™ de Applied Biosystems; AMS 422 de Abimed,
Langenfeld, Alemania). El encargo de síntesis de tales péptidos se
realiza como un servicio comercial por parte de muchas compañías de
servicios comerciales de sintetización de péptidos, como por
ejemplo, Quality Controlled Biochemicals, Inc. Hopkinton,
Massachusetts); Chiron Mimotopes Peptide Systems (San Diego,
California); Bachem Bioscience, Inc. (Filadelfia, Pensilvania);
Severn Biotech Ltd. (Kiddeminster, Inglaterra).
De forma alternativa, los péptidos de la
presente invención se pueden producir usando tecnología de ácido
nucleico sintético y recombinante. Por ejemplo, uno de los expertos
en la técnica habituales puede diseñar a partir del código genético
conocido una secuencia de de 5' a 3' ácidos nucleicos que codifica
un péptido de la presente invención. Se conoce la secuencia de
aminoácidos para una CETP madura de hígado humano (SEQ ID NO:4),
como lo es su secuencia de ADN correspondiente (SEQ ID NO:5) (véase,
Drayna y col. Nature, 327: 632-634 (1987)).
Además, se conocen las secuencias de aminoácidos para una diversidad
de epitopes de célula T de gama amplia o "universal" (véase,
por ejemplo, Panina-Bordignon y col., Eur. J.
Immunol., 19: 2232-2242 (1989), Etlinger y col.
(1990), Pillai y col., Infect. Immun., 63:
1535-1540 (1995)).
Se puede sintentizar fácilmente una molécula de
ADN que contiene las secuencias codificadoras de un epitope de
célula T auxiliar y una o más partes de epitope de célula B
seleccionada (y cualquier péptido de unión, tal como poliglicina, u
otro(s) residuo(s) adicional(es),
tal(es) como un aminoácido y/o cisteína carboxilo terminal,
si así se desea) usando un sintetizador de ADN automatizado (por
ejemplo, Sintetizador de ADN Oligo 1000, Beckman Corp.) o
contratando un servicio comercial de sintetización de ADN (por
ejemplo, Genset Corp.; La Jolla, California). La molécula de ADN
sintetizada se puede introducir en cualquiera de una diversidad de
sistemas de expresión de genes disponible (por ejemplo, plásmidos
bacterianos, vectores de expresión bacteriófagos, vectores de
expresión retrovirales, vectores de expresión del baculovirus),
usando procedimientos convencionales disponibles en la técnica (por
ejemplo, Sambrook y col., Molecular Cloning: A Laboratory
Manual, Vol. 1-3 (Cold Spring Harbor Laboratory,
Cold Spring Harbor, Nueva York, 1989)), y/o como dirige el
fabricante de un sistema de expresión de genes particular disponible
en el mercado (por ejemplo, 1 sistema de expresión de células
bacterianas pPROEX™; sistema de expresión de células eucariotas SFV;
Sistema de expresión del baculovirus
BAC-TO-BAC™; Life Technologies, Inc.
Gaithersburg, Maryland). Luego, se aísla el péptido expresado del
sistema de expresión usando procedimientos convencionales para
purificar péptidos. Se puede acelerar la purificación de los
péptidos de la presente invención empleando cromatografía de
afinidad o inmunoprecipitación basada en el uso de anticuerpos para
la secuencia particular de aminoácidos del epitope de célula T
auxiliar o del epitope de célula B(parte relacionada con la
CETP), de un péptido de vacuna de la presente invención. Por
ejemplo, el Mab TP2 se une a los 26 aminoácidos carboxilos
terminales de la CETP humana, y podría ser útil en una o más etapas
de inmunoafinidad en un esquema de purificación (Hesler, C. B., y
col. J. Biol. Chem., 263: 5020-5023
(1988)).
Por supuesto, si las moléculas de ADN están
disponibles codificando cada uno de los epitopes de célula T y
célula B para un péptido de vacuna particular, se pueden emplear
procedimientos convencionales de ácido nucleico recombinante,
incluyendo reacción en cadena con polimerasa (RCP), para producir
moléculas de ácido nucleico recombinante que codifiquen los péptidos
de vacuna. Tales moléculas de ácido nucleico recombinante se pueden
introducir en cualquiera de una diversidad de vectores de expresión
que pueden transportarse o transformarse en células hospedadoras
adecuadas para expresar el péptido de vacuna en cultivo (véase, por
ejemplo, Sambrook y col., Molecular Cloning: A Laboratory
Manual Vol. 1-3 (Cold Spring Harbor Laboratory,
Cold Spring Harbor, Nueva York, 1989)). Por ejemplo, la secuencia de
ADN que codifica la CETP humana madura del hígado tiene la secuencia
nucleótida de SEQ ID NO:5 y la secuencia de ADN que codifica la CETP
madura de conejo tiene la secuencia nucleótida de SEQ ID NO:7. Se
pueden recombinar secuencias particulares que codifican diversos
epitopes de célula B de cada una de estas proteínas de CETP con
secuencias nucleótidas que codifican epitope(s)
seleccionado(s) de célula T, e introducir en un vector de
expresión para expresión en una célula hospedadora adecuada.
Un ejemplo de un plásmido recombinante que se
puede usar para producir un péptido de vacuna es el plásmido
pCMV-CETP/TT, en el que el promotor del CMV dirige
la trascripción de una secuencia que codifica un péptido de vacuna
que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:9:
MQYIKANSKFIGITERFPRPDGREAVAYRFEE
DIFGFPKH LLVDFLQSLS, en la que una metionina amnio terminal se une a un epitope de célula T de toxoide de tétanos (aminoácidos 2 a 15 de SEQ ID NO:2) y dos epitopes de célula B de CETP de conejo (aminoácidos 350 a 368 y 481 a 496 de SEQ ID NO: 6). El plásmido pCMV-CETP/TT se ha depositado en la Colección Americana de cultivos Tipo (ATCC, Rockville, MD) y se le ha designado el registro nº 98038.
DIFGFPKH LLVDFLQSLS, en la que una metionina amnio terminal se une a un epitope de célula T de toxoide de tétanos (aminoácidos 2 a 15 de SEQ ID NO:2) y dos epitopes de célula B de CETP de conejo (aminoácidos 350 a 368 y 481 a 496 de SEQ ID NO: 6). El plásmido pCMV-CETP/TT se ha depositado en la Colección Americana de cultivos Tipo (ATCC, Rockville, MD) y se le ha designado el registro nº 98038.
En una realización preferida, un péptido de la
presente invención también contiene un residuo de cisteína amino
terminal, u otro residuo, unido por covalencia al aminoácido amino
terminal de la parte del epitope de célula T auxiliar del péptido de
vacuna de la presente invención para usar en el atado o acoplamiento
del péptido a sí mismo, para formar dímeros de péptidos de vacuna o
a otras moléculas, tales como moléculas de entrecruzamiento o
vehículo. Más preferiblemente, el péptido de vacuna de la presente
invención tiene la secuencia de aminoácidos
CQYIKANSKFI
GITEFGFPE HLLVDFLQSLS (SEQ ID NO: 2). Aún más preferido es un péptido de vacuna de la presente invención que tiene al menos dos epitopes de célula B de la CETP. Un ejemplo de tal péptido de vacuna tiene la secuencia CQYIKANSKFIGITELFPRPDQQHSVAYT FEEDIFGFPEHLLVDFLQSLS (SEQ ID NO: 8).
GITEFGFPE HLLVDFLQSLS (SEQ ID NO: 2). Aún más preferido es un péptido de vacuna de la presente invención que tiene al menos dos epitopes de célula B de la CETP. Un ejemplo de tal péptido de vacuna tiene la secuencia CQYIKANSKFIGITELFPRPDQQHSVAYT FEEDIFGFPEHLLVDFLQSLS (SEQ ID NO: 8).
Los péptidos de la presente invención se usan
para preparar vacunas que provoquen la producción de anticuerpos
endógenos que se unan de forma específica a la CETP y modulen la
actividad de la CETP endógena (esto es, disminuir o inhibir). Las
vacunas anti-CETP de la presente invención pueden
contener uno o varios péptidos diferentes de la presente invención.
Por ejemplo, los péptidos que tienen partes de epitope de célula T
auxiliar diferentes (por ejemplo, epitopes de célula T auxililar
universal diferente) y/o partes de epitope de célula B (por ejemplo,
partes diferentes relacionadas con la CETP de los 26 aminoácidos
carboxilos terminales de la CETP) pueden combinarse y administrarse
como una composición de vacuna sencilla.
Se pueden mezclar adyuvantes farmacéuticamente
aceptables, tales como alumbre, con péptidos de vacuna descritos en
la presente memoria descriptiva para producir vacunas de la presente
invención. El alumbre es el adyuvante sencillo aprobado en la
actualidad para usar en la administración de vacunas para humanos
(véase, Eldrige, J. H., y col. en Immunobiology of Proteins and
Peptides V: Vaccines; Mechanisms, Design, and Applications,
Atassi, M. Z., ed. (Plenum Press, Nueva York, 1989), página 192).
Recientemente, se usó el alumbre junto con un derivado ftalil de
sodio de lipopolisacárido para administrar a una vacuna que mostraba
ser efectiva contra la gonadotropina coriónica humana en humanos
(véase, Talwar, G. P., y col., Proc. Natl. Acad Sci., EE.
UU., 91: 8532-8536 (1994)).
Se pueden usar otros adyuvantes convencionales
ya que están aprobados para un uso particular. Por ejemplo,
microesferas biodegradables compuestas por poli
(DL-lactida-co-glicolida)
se han estudiado como adyuvantes para administración de vacunas por
vía oral o parenteral (Eldridge, J. H., y col. en Immunobiology
of Proteins and Peptides V: Vaccines; Mechanisms, Design, and
Applications, Atassi, M. Z., ed. (Plenum Press, Nueva York,
1989), páginas 191-202).
Se han usado otros adyuvantes para administrar
vacunas a mamíferos no humanos. Por ejemplo, el Adyuvante Completo
de Freund (Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri), Adyuvante
Incompleto de Freund (Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri), y el
Sistema Adyuvante de RIBI™ (RAS; RIBI ImmunoChem Research, Inc.,
Hamilton, Montana) son adyuvantes bien conocidos usados de forma
rutinaria para administrar antígenos a animales distintos de
humanos. Además, las estructuras de adyuvante también se pueden
mezclar con o, preferiblemente, incorporarse por covalencia en
péptidos de la presente invención, por ejemplo en el residuo amino o
de aminoácidos carboxilos terminales de los péptidos. Tales
adyuvantes incorporados incluyen
N-palmitoil-S-[2,3-bis(palmitoiloxi)-propil]-cisteína
lipofílica ("Pam_{3}-Cys-OH")
en el extremo amino de los péptidos de la presente invención;
lipopéptidos solubles en agua, anfifílicos, tales como
Pam_{3}-Cys-Ser-Lys_{4}
y
Pam_{3}-Cys-Ser-Glu_{4};
glicopéptidos tales como
N-acetil-glucosaminil-N-acetilmuramil-alanil-D-isoglutamina
("GMDP"), dipéptidos de muramilo, y
alanil-N-adamantil-D-glutamina;
y adyuvantes basados en gel de poliamida que se pueden unir
fácilmente a los péptidos durante su síntesis química in
vitro (véase, Synthetic Vaccines, Nicholson, B. H., ed.
(Blackwell Scientific Publications, Cambridge, Massachusetts, 1994),
páginas 236-238).
Además, los péptidos de vacuna de la presente
invención se pueden unir a otras moléculas que puedan potenciar la
inmunogenicidad de los péptidos. Por ejemplo, uniendo péptidos de la
presente invención a una superficie de una molécula más grande, tal
como albúmina de suero, puede potenciar la inmunogenicidad, ya que
los epitopes de los péptidos de vacuna se presentan en el sistema
inmunológico de un individuo en forma de copias múltiples repetidas
adyacentes (véase, por ejemplo, Tam, J. P., Proc. Natl. Acad.
Sci., EE. UU. 85: 5409-5413 (1988); Wang, C. Y.,
y col., Science, 254: 285-288 (1991);
Marguerite, M. y col., Mol. Immunol., 29:
793-800 (1992)). Tales disposiciones
"múltiples" o "multivalentes" de los péptidos de vacuna de
la presente invención se pueden crear usando moléculas de
entrecruzamiento (véase arriba). Por ejemplo, como se indica
anteriormente, las moléculas de entrecruzamiento bifuncional poseen
dos sitios reactivos, uno de los sitios puede unir el enlace a un
péptido de vacuna de la presente invención y el otro sitio está
disponible para reaccionar con una molécula diferente, como por
ejemplo, una proteína más grande como albúmina de suero, o una
resina o perla polimérica. De ese modo, las moléculas de
entrecruzamiento covalentes se pueden usar para unir péptidos de
vacuna con otras proteínas o sustratos para formar disposiciones de
copias múltiples de péptidos (ensamblajes de copias múltiples de
péptidos).
La unión de péptidos de vacuna de la presente
invención a otra molécula o superficie debería realizarse de una
forma que no altere significativamente o reduzca las características
inmunógenas de las partes unidas del epitope de célula T auxiliar y
del epitope de célula B (relacionada con la CETP) de los péptidos de
vacuna. Preferiblemente, el uso de tales moléculas de unión potencia
la inmunogenicidad de los péptidos de vacuna de la presente
invención, como se ha demostrado, por ejemplo, mediante un aumento
más rápido en el título de anticuerpos anti-CETP y/o
producción de anticuerpos anti-CETP con afinidad
superior a cuando se administra péptidos de vacuna que no están
unidos a los individuos. Tales moléculas de entrecruzamiento también
se pueden usar para unir un péptido de la presente invención a una
molécula "potenciadora inmunógena" tal como el factor
estimulador de colonias de granulocitos macrófagos
(GM-CSF), que demostró servir como un potenciador
inmunógeno efectivo en la obtención de la producción de anticuerpos
anti-tumor específicos (por ejemplo, Tao, M. H., y
col., Nature, 362: 755-758 (1993)). Otro
potenciador inmunógeno como tal es la hemocianina de lapa de
bocallave (KLH) (véase, Ada, G. L. en Fundamental Immunology,
tercera edición, W. E. Paul, ed. (Raven Pres Ltd., Nueva York,
1993), páginas 1309-1352). Como se indica
anteriormente, un ejemplo de disposición multivalente usando KLH es
la unión de péptidos de vacuna con cualquiera de los varios residuos
de cisteína de molécula de KLH a través de la formación de enlaces
de disulfuros.
Aquellos expertos en la técnica conocen bien los
procedimientos generales de administración y pruebas de vacunas
(véase, por ejemplo, Talwar, G. P., y col., Proc. Natl. Acad.
Sci. EE. UU., 91: 8532-8536 (1994)). Los
péptidos de la presente invención se diseñan de forma específica
para administrarse, tanto solos como junto con uno o más vehículos o
adyuvantes farmacéuticamente aceptables, en forma de una vacuna que
provocará una respuesta de anticuerpos contra la CETP endógena del
receptor de vacuna. En algunas realizaciones de la presente
invención, los péptidos de vacuna también pueden combinarse y
administrarse con vacunas para otras enfermedades o desórdenes.
La respuesta inmune a la CETP endógena debería
inhibir significativamente la actividad de la CETP, modificar la
semivida del suero de la CETP, causar la eliminación de la CETP a
través de la formación de complejos inmunes, modificar el tráfico de
HDL-colesterol, cambiar el equilibrio del contenido
de colesterol de las lipoproteínas, modificar el catabolismo de
colesterol, y/o reducir el desarrollo de lesiones ateroscleróticas.
El control de niveles LDL, VLDL y/o HDL es un indicador o punto
final aceptado en el tratamiento de enfermedades cardiovasculares,
ya que estos niveles se correlacionan con un riesgo disminuido de
enfermedad cardiovascular u otra progresión de tal enfermedad
(Mader, S. S., en Human Biology, 4ª edición, páginas 83, 102
(Wm. C. Brown Publishers, Dubuque, Iowa, 1995)). Por consiguiente,
se demuestra el efecto profiláctico o terapéutico deseado de acuerdo
con la presente invención provocando anticuerpos en un individuo que
se unen a la CETP y/o inhiben la actividad de la CETP, o mediante
una disminución relativa de los niveles de LDL y/o VLDL, en
comparación con los niveles de HDL ya que aumenta el título de
anticuerpos dirigidos contra la CETP endógena, o mediante la
elevación de los niveles absolutos de HDL circulante con la
producción de anticuerpos anti-CETP, o mediante la
inhibición o disminución del desarrollo de lesiones ateroscleróticas
en tejido cardiovascular.
Como se demuestra en la presente memoria
descriptiva, la administración de péptidos de vacuna en un modelo de
conejo de aterosclesrosis llevó a una disminución importante en el
desarrollo de placas ateroscleróticas en animales alimentados con
una dieta suplementada con colesterol. Esta prueba indica que la
vacunación para provocar anticuerpos a la CETP endógena puede ser un
procedimiento útil para tratar o prevenir la aterosclerosis. Esta es
la primera prueba de que la provocación de una respuesta inmune a la
CETP puede inhibir el desarrollo de aterosclerosis.
Tales anticuerpos producidos de forma endógena
contra la propia CETP de un individuo es ventajoso frente a otros
enfoques terapéuticos posibles. Por ejemplo, es probable que tanto
el uso de inhibidores de polipéptidos de la CETP, tales como uno
aislado recientemente de babuinos (véase, por ejemplo, el documento
WO93/11782; Kushwaha, R. S., y col., J. Lipid Res., 34:
1285-1297 (1993); Genetic Engineering News,
14: 44 (1994); Science, 262: 1974-1975
(1993)), como la infusión de anticuerpos anti-CETP
producidos de forma exógena (foránea) que inhiben la actividad CETP,
provoquen una reacción inmune dirigida contra tales moléculas
foráneas inhibitorias de la CETP. Una respuesta inmune como tal
podría inactivar rápidamente y/o eliminar el inhibidor de la CETP
proporcionado de forma exógena del cuerpo. En teoría, la respuesta
inmune como tal contra el inhibidor de la CETP proporcionado de
forma exógena podría vencerse administrando dosis crecientes del
inhibidor. Sin embargo, las administraciones múltiples de dosis de
un inhibidor de CETP foráneo, en particular las dosis múltiples de
cantidades cada vez más crecientes de dichas moléculas foráneas,
presentan la posibilidad de una reacción de hipersensibilidad,
poniendo en peligro la salud del individuo que se está tratando.
Tales problemas relacionados con el uso de inhibidores de la CETP
producidos de forma exógena se evitan usando vacunas basadas en
péptidos de la presente invención, que reclutan los propios
anticuerpos del sistema inmunológico de un individuo para inhibir de
forma específica la CETP endógena. La dosificación repetida,
dosificación graduada, y efectos secundarios no deseados (tales como
una respuesta de anticuerpo anti-ratón humano
(HAMA)) se evitan empleando el enfoque de vacuna
anti-CETP descrito en la presente memoria
descriptiva.
Las composiciones de péptidos de vacuna de la
CETP de la presente invención se pueden administrar por cualquier
vía usada para vacunación, entre las que se incluye: por vía
parenteral, tal como intraperitoneal, interperitoneal, intradérmica
(subcutánea), intramuscular, intravenosa o por vía oral.
Preferiblemente, las vacunas de la presente invención se administran
por vía parenteral, por ejemplo, intraperitoneal, interperitoneal,
intradérmica, intramuscular o intravenosa. Si se desea la
administración de un péptido de vacuna por vía oral, se puede
mezclar cualquier excipiente oral farmacéuticamente aceptable con
los péptidos de vacuna de la presente invención, como por ejemplo,
tales como soluciones aprobadas para usar en la vacuna oral contra
la polio Sabin. Al igual que con algunas otras vacunas, tales como
para el tétanos, puede ser necesaria la administración de refuerzo
ocasional de composiciones de péptidos de vacuna de la CETP para
mantener un nivel deseado de modulación o inhibición de la CETP
endógena. Como se indica anteriormente, las microesferas
biodegradables, tales como aquellas compuestas por poli
(DL-actida-co-glicolida),
han demostrado ser útiles para la administración de vacunas
efectivas e inmunización por vía oral o parenteral. (Eldridge, J.
H., y col. en Immunobiology of Proteins and Peptides V: Vaccines;
Mechanisms, Design, and Applications, Atassi, M. Z., ed. (Plenum
Press. Nueva York, 1989), páginas 191-202).
Las dosis adecuadas de vacunas de péptidos de la
presente invención se establecen a través de metodologías de vacunas
generales usadas en la técnica, basadas en parámetros medibles para
los que se piensa que la vacuna va a afectar, incluyendo el control
de contraindicaciones potenciales, tales como reacción por
hipersensibilidad, eritema, induración, sensibilidad (véase, por
ejemplo, Physician's Desk Reference. Edición 49, (Medical
Economics Data Production Co., Mont Vale, Nueva Jersey, 1995),
páginas 1628, 2371 (referente a la vacuna contra la hepatitis B),
páginas 1501, 1573, 1575 (referente a vacunas contra el sarampión,
paroditis infecciosa y/o rubéola), páginas 904, 919, 1247, 1257,
1289, 1293, 2363 (referente a vacunas contra la difteria, tétanos
y/o tos ferina)); Talwar, G. P. y col., Proc. Natl. Acad.
Sci. EE. UU., 91: 8532-8536 (1994)). Un enfoque
común y tradicional para la vacunación de humanos es administrar una
dosis inicial de una vacuna particular para sensibilizar el sistema
inmunológico y después seguir con una o más dosis "de refuerzo"
de la vacuna para provocar una respuesta anamnésica en el sistema
inmunológico que fue sensibilizado con la administración inicial de
la vacuna (vacunación). Dicho procedimiento de administración
primaria y "de refuerzo" se ha conocido bien y usado de forma
común en la técnica, como por ejemplo, en el desarrollo y uso de
vacunas contra el sarampión, polio, tétanos, difteria y hepatitis
B.
De forma inicial, puede ser que la cantidad de
un péptidos de vacuna administrado a un individuo precisara provocar
una respuesta de anticuerpos efectiva para neutralizar el nivel
aproximado de actividad de la CETP endógena presente en el individuo
antes de la vacunación, como se puede determinar midiendo la
actividad de la CETP en muestras de suero o pasma del individuo, por
ejemplo, como se determina usando un ensayo de la CETP disponible en
el mercado (por ejemplo, Diagnescent Technologies, Inc., Yonkers,
Nueva York). También se pueden controlar las muestras de plasma o
suero de un individuo vacunado para determinar si se observa un
incremento medible de los niveles de HDL o HDL-C
total, después de la administración del péptido de vacuna usando
ensayos disponibles en el mercado (por ejemplo, disponibles de Wako
Chemicals USA, Inc., Richmond, Virginia). Se puede medir un aumento
en la concentración (título) de anticuerpos
anti-CETP circulante en muestras de plasma o suero,
por ejemplo usando un ensayo ELISA (véase, por ejemplo, Ejemplo 3).
De ese modo, es posible y se recomienda que se establezca
inicialmente si un aumento en el anticuerpo
anti-CETP se puede correlacionar con un incremento
del nivel de HDL o HDL-C, o con una disminución en
la actividad de la CETP. A partir de entonces, sólo es necesario
controlar un aumento en el título de los anticuerpos
anti-CETP para determinar si se ha administrado una
dosis suficiente de péptido de vacuna o si se indica una dosis "de
refuerzo" para provocar un nivel elevado de anticuerpos
anti-CETP. Este es el procedimiento común con
diversas vacunaciones establecidas, tales como vacunación contra el
virus de la hepatitis B.
Actualmente están disponibles procedimientos de
formación de imágenes arteriales en tres dimensiones, que se pueden
usar para identificar lesiones arteriales y controlar su desarrollo
o regresión en un individuo (véase, por ejemplo, McPherson,
Scientific American Science & Medicine, páginas
22-31), (marzo/abril, 1996)). De ese modo, se pueden
usar tales procedimientos de formación de imágenes para controlar la
efectividad de vacunación con un péptido de la presente
invención.
\newpage
Se puede obtener una apreciación más completa de
la presente invención y de las ventajas de la misma a partir de los
siguientes ejemplos que no limitan.
Para investigar la posibilidad de provocar una
respuesta de anticuerpos contra la CETP endógena, se preparó un
péptido con una parte del epitope de célula T auxiliar que comprende
una parte de epitope de célula T auxiliar de toxoide de tétanos
universal y del epitope de célula B que comprende una región
carboxilo terminal de CETP humana. Se designó un péptido de 31
aminoácidos con una secuencia de aminoácidos
CQYIKANSKFIGITEFGFPEHLLVDFLQS LS (SEQ ID NO:2), en la que
QYIKANSKFIGITE (aminoácidos 2 a 15 de SEQ ID NO:2) es la misma
secuencia de aminoácidos que los aminoácidos 830 a 843 de la
proteína de toxoide de tétanos, FGFPEHLLVDFLQSLS (aminoácidos 16 a
31 de SEQ ID NO:2) es la misma secuencia de aminoácidos que los
aminoácidos 461 a 476 de SEQ ID NO:4 que contiene el dominio de
transporte de lípidos neutros de la CETP humana y se sabe que se
reconoce con Mab TP2 de la CETP anti-humana (Wang,
S., y col., J. Biol. Chem, 267: 17487-17490
(1992); Wang, S., y col., J. Biol. Chem, 268:
1955-1959 (1993)), y el residuo de cisteína (C)
amino terminal está presente para usar en la unión del péptido
consigo mismo o con otras moléculas, si así se desea. La parte
relacionada con la CETP de este péptido sintético se diferencia de
la parte correspondiente de la secuencia de aminoácidos de la CETP
de conejo solamente en el residuo de ácido glutámico (E) (véase,
Nagashima M., y col., J. Lipid Res., 29:
1643-6149 (1988) (clonando gen de la CETP de
conejo)). Sin embargo, un estudio anterior ha indicado que Mabs de
la CETP anti-humana pueden reconocer esta región de
la CETP de conejo correspondiente (véase, Hesler, C. B., y col.,
J. Biol. Chem, 263: 5020-5023 (1988)). Se
sintentizó el péptido para usar en orden procedimientos de síntesis
de péptidos convencionales de Quality Controlled Biochemicals, Inc.
(Hopkinton, Massachusetts).
Se inyectó el péptido de vacuna sintético (SEQ
ID NO:2) del Ejemplo 1 anterior en conejos blancos de Nueva Zelanda
para analizar la capacidad del péptido de vacuna de provocar una
respuesta inmune contra la CETP de conejo endógena. El Grupo I
contenía tres conejos (rb#1-#3), cada uno de los cuales se sometió a
un protocolo para administración del péptido de vacuna. El Grupo II
contenía un conejo (rb#4) en forma de control que no se trató.
En la Figura 1 se muestra el protocolo general
para analizar el péptido de vacuna en los conejos. El Día 1, se
suspendió el péptido (100 \mug) en el sistema adyuvante RIBI™
(RIBI ImmunoChem Research, Inc., Hamilton, Montana) de acuerdo con
las instrucciones del fabricante hasta un volumen final de 1.000
\mul, y cada conejo del Grupo I fue inyectado en dos sitios
intramusculares (250 \mul por sitio), por vía subcutánea en dos
sitios (100 \mul por sitio), y seis sitios intradérmicos (50
\mul por sitio). El Día 28, se administró un refuerzo (100 \mug
de péptido en sistema adyuvante RIBI™) como en el Día 1. El Día 56,
se administró otro refuerzo (100 \mul de péptido en sistema
adyuvante RIBI™), como el Día 1.
Se extrajeron muestras de sangre
(aproximadamente 1-5 ml) del oído de cada conejo
antes de cada inyección inicial ("presangrado") y en los Días
42, 70 y 108, salvo que no hubo presangrado para el conejo de
control rb#4. Se prepararon muestras de plasma sanguíneo por medio
de procedimientos de centrifugación convencionales para separar
componentes celulares del plasma. Se almacenaron las muestras de
plasma a -70ºC. Se analizaron muestras de plasma de ambos Grupos I y
II para la presencia de y aumento en el título de anticuerpos
anti-CETP y para niveles totales de colesterol en
plasma y HDL-C en plasma.
Se usó un ensayo (ELISA) inmunosorbente unido a
encimas en sándwich para titular muestras de plasma que contienen
anticuerpos anti CETP. En este establecimiento, se absorbió CETP
humana recombinante (CETPr humana, obtenida de la línea celular CHO
recombinante CHO(AT) aprobada por The Trustees of Columbia
University, Nueva York, Nueva York) a pocillos de una placa de
microtítulos, y se añadieron diversas diluciones de plasma de conejo
de los conejos de los Grupos I y II a cada pocillo. Se revistió cada
pocillo de una placa de 96 pocillos NUNC Maxisorb por exposición de
toda la noche a 4ºC a 100 \mul de 1 solución de 1 \mug/ml de
CETPr humana en PBS. Se bloqueó la unión no específica añadiendo
una solución del 1% de BSA en PBS y el 0,05% de Tween a cada pocillo
e incubando durante dos horas a temperatura ambiente (20º-22ºC) en
un baño de agitación a 150 rpm. Después se lavaron los pocillos
cuatro veces con tampón de lavado ELISA (PBS + 0,05% Tween). Después
se diluyeron muestras de plasma 1:10 en tampón de dilución (1% HSA
en PBS), seguido de 6 diluciones en serie dos veces en el mismo
tampón. Se añadieron muestras diluidas (100 \mul) a los pocillos,
se incubaron durante 2 horas a temperatura ambiente en un baño de
agitación a 150 rpm, y después se lavaron 4 veces con tampón de
lavado ELISA (PBS + 0,05% Tween). Para detectar anticuerpos
anti-CETP unidos, se añadió 100 \mul de una
dilución de 1: 10.000 de inmunoglobina de cabra
anti-conejo etiquetada con peroxidasa de rábano
picante (HRP) (Southern Biotechnologiy Associates, Inc.; Birmingham,
Alabama) en tampón de dilución, y se incubaron las placas durante 2
horas a temperatura ambiente en un baño de agitación a 150 rpm.
Después se lavaron los pocillos 4 veces con tampón de lavado ELISA
(véase arriba), se añadió sustrato de peroxidasa TMB (sustrato de
peroxidasa TMB, Kirkegaard & Perry Laboratories, Inc.
Gaithersburg, Maryland), y se incubaron las placas durante 30
minutos a temperatura ambiente. Se controló el cambio en densidad
óptica por medio de espectrofotometría a 450 nm usando un lector
ELISA (por ejemplo, E-max, Molecular Device Corp.,
Menlo Park, California). En este ensayo, la D.O. era directamente
proporcional a la cantidad de anticuerpos anti-CETP
presentes en las muestras de plasma. Los resultados indicaron que
todos los conejos (rb#1-rb#4) del Grupo I produjeron
anticuerpos anti-CETP que eran específicos para la
CETP humana recombinante. No se produjo ningún anticuerpo
anti-CETP en el conejo de control no tratado (rb#4)
del Grupo 1 en el Ejemplo 2. Véase Figura 2.
Se diseñó este ensayo para determinar si los
conejos vacunados habían generado anticuerpos que se unieran con el
mismo epitope que el Mab TP2 anti-CETP (aprobado por
The Trustees of Columbia University, Nueva York, Nueva York). Se
adaptó un ELISA competitivo convencional para detectar la presencia
de anticuerpos anti-CETP en plasma de conejo. En
este ensayo, se conjugó peroxidasa de rábano picante (HRP) con el
Mab TP2 anti-CETP que se une específicamente al
fragmento de los 26 aminoácidos carboxilos terminales de la CETP
humana (Wang y col., J. Biol. Chem., 267:
17487-17490 (1992); Wang y col., J. Biol.
Chem., 268: 1955-1959 (1993)).
El siguiente procedimiento se usó para conjugar
HRP con el anticuerpo. Se dializó el anticuerpo contra
Na_{2}CO_{3} (50 mM, pH 9,5). El anticuerpo dializado estaba en
una concentración de 2 a 5 mg/ml. Se disolvió HRP
(Boehringer-Manaheim) en tampón de acetato sódico
(1,0 mM, pH 4,4) a una concentración de 6 mg/ml. Después se activó
la HRP añadiendo 0,2 ml de periodato sódico (21,4 mg/ml de tampón de
acetato, preparado inmediatamente antes de usar) a cada 1 ml de
solución de HRP, y la mezcla de activación se incubó a temperatura
ambiente en un agitador por balanceo durante 20 minutos. Después la
HRP activada se pasó por un una columna G25 equilibrada con tampón
de acetato para desalar la HRP activada. Una densidad óptica (D.O.)
a 403 nm corresponde a aproximadamente 1 mg de HRP/ml. Después se
añadió HRP activada, desalada, al anticuerpo dializado en una
cantidad igual a la mitad de la cantidad de anticuerpo (por peso,
por ejemplo, por cada 1 mg de lgG, añadir 0,5 mg de HRP activada), y
se incubó la mezcla durante 2 horas a temperatura ambiente en un
agitador por balanceo para permitir que la HRP conjugue con las
moléculas del anticuerpo. Se detuvo la reacción de conjugación
añadiendo 20 \mul de borohidruro sódico (10 mg/ml) por cada 1 ml
de la mezcla de conjugación HRP-anticuerpo, y
después se incubó la mezcla en hielo durante 30 minutos. La mezcla
de anticuerpo conjugado con HRP se dializó toda la noche contra
solución salina tampón fosfato (PBS) y después se centrifugó
(Airfuge) durante 15 minutos a 30 psi (206,90 kPa). Se añadió
timerosal al sobrenadante (anticuerpo conjugado con HRP) al 0,5%, y
se añadió albúmina de suero bovino al 1%. Se almacenó la preparación
de anticuerpo conjugado con BRP a 4ºC y se protegió de la luz.
Los pocillos de la placa de microtítulos de 96
pocillos se revistieron con CETP incubando en cada pocillo 100
\mul de una solución de 300 ng/ml de CETP humana recombinante
(obtenida de la línea celular CHO recombinante CHO(AT),
aprobada por The Trustees of Columbia University, Nueva York, Nueva
York) en salina tampón fosfato (PBS). Se drenaron los pocillos y se
llenaron los pocillos con una solución del 1% (p/p) de albúmina de
suero bovino (BSA) en PBS y el 0,05% (vol./vol.) de Tween (Sigma
Chemical Co., St. Louis, Missouri) y se incubaron durante 2 horas a
temperatura ambiente en un baño agitador (aproximadamente a 150 rpm)
para bloquear la unión no específica. Los pocillos se lavaron cuatro
veces con tampón de lavado ELISA (PBS + 0,05% Tween), y se añadió
100 \mul de muestras de plasma diluidas en tampón de dilución (1%
BSA en PBS). Después se incubaron las placas durante 1 hora a
temperatura ambiente en un baño agitador como anteriormente, y
después se lavaron cuatro veces con tampón de lavado ELISA. A cada
pocillo se añadió más tarde 100 \mul de una dilución 1:100.000 de
Mab TP2 conjugada (etiquetada) con peroxidasa de rábano picante en
tampón de dilución. Las placas se incubaron durante una hora a
temperatura ambiente en un baño de agitación como anteriormente,
después se lavaron cuatro veces con tampón de lavado ELISA. Se
añadió el sustrato de peroxidasa de rábano picante (por ejemplo,
sustrato de peroxidasa TMB, Kirkegaard & Perry Laboratories,
Inc. Gaithersburg, Maryland) a cada pocillo y se controló un cambio
en densidad óptica (D.O.) a 450 nm por medio de espectrofotometría,
usando un lector ELISA (por ejemplo, E-max,
Molecular Devices Corp., Menlo Park, California). En este ensayo, si
se producía un anticuerpo contra la parte relacionada con la CETP
del péptido de vacuna, tales moléculas de anticuerpos
anti-CETP no etiquetadas presentes en las muestras
de plasma compiten con el Mab TP2 etiquetado para unirse con la CETP
absorbida en las paredes de los pocillos y se observa una inhibición
en el desarrollo de color a medida que aumenta la concentración de
la muestra de plasma (esto es, D.O. es inversamente proporcional a
la cantidad de anticuerpo anti-CETP presente en cada
muestra de plasma).
Como se muestra en la Figura 3, se observó dicha
inhibición de TP2 uniéndose con la CETP en una muestra de plasma de
dos de los tres conejos a los que se administró el péptido de
vacuna, indicando de ese modo la producción de anticuerpos
específicos de la CETP (compárese gráficos de sueros de conejo rb#2
y rb#3 con plasma de conejo de control no tratado de conejo rb#4 en
la Figura 3). La inhibición más fuerte de TP2 uniéndose con la CETP
se manifestó en el plasma de conejo rb#3 (véase Figura 3).
También se analizaron las muestras de plasma
tomadas de conejos de los Grupos I y II, del Ejemplo 2, en diversos
tiempos (días), en el protocolo de vacunación para la concentración
de colesterol total (Figura 4) y HDL-C (Figura 5).
Se determinaron los niveles totales de colesterol y
HDL-C en plasma usando ensayos convencionales
comerciales (Wako Chemicals USA, Inc., Richmond, Virginia). Las
muestras de plasma de dos conejos (rb#2 y rb#3) que tenían los
títulos de anticuerpo anti-CETP más elevados
mostraron un aumento de 2 a 5 veces en las concentraciones de
HDL-C en el Día 70, en comparación con muestras de
plasma presangrado. Los conejos rb#2 y rb#3 también mostraron un
aumento en las concentraciones de HDL en plasma en el transcurso del
tiempo, en comparación con el conejo de control (rb#4) y el conejo
(rb#1) con título de anticuerpo más bajo, manifestando ambos
concentraciones de HDL decrecientes en el transcurso del tiempo
(Figura 5).
La Figura 6 muestra la relación de colesterol
No-HDL (No-HDL) a
HDL-colesterol (HDL) en el Día 70 de la
posvacunación. La información muestra una tendencia hacia un perfil
anti-aterogénico en el grupo de conejos vacunados
(recién nacidos), en comparación con el conejo no vacunado (barra
rellena). A pesar de que no se observó ninguna diferencia importante
en el colesterol total de las muestras de plasma, la relación de
No-HDL/HDL disminuyó en general con un aumento de
los niveles de anticuerpos anti-CETP en los conejos
vacunados del Grupo I.
Recientemente una cepa de ratones transgénicos
que expresan la CETP humana se ha puesto a disposición en el mercado
(ratones de CETP Biodigm™; Pharmakon USA, Waverly, Pensilvania).
Dichos ratones expresan CETP humana en el hígado y se reseña que
tienen aproximadamente niveles inferiores al 50% de colesterol
relacionado con HDL que compañeros de camada no transgénicos cuando
se les alimentó con dieta de pienso normal. Dichos animales
transgénicos sirven de modelo experimental adicional para analizar
otros péptidos de vacuna de la presente invención.
Se usaron dos grupos compuestos por seis ratones
transgénicos que expresan la CETP para analizar el mismo péptido de
vacuna usado en los Ejemplos 1 a 4 anteriores. Cada ratón del Grupo
I recibió inyecciones primarias del péptido de vacuna disuelto en
solución salina tamponada con fosfato (PBS) y emulsionado con
adyuvante de Freund completo (1:1) para producir una concentración
final de 100 \mug/100 \mul. Se administró a cada ratón la mezcla
de péptido de vacuna en una dosis de 50 \mul (50 \mug) en cada
uno de los dos sitios subcutáneos. El Día 28 y de nuevo el Día 56,
se administró a los animales de forma similar refuerzos del péptido
de vacuna (100 \mug) en PBS, salvo que el péptido de vacuna se
emulsionó con adyuvante de Freund incompleto. Se extrajeron muestras
de sangre en el Día 42 y en el Día 63. Los ratones de control del
Grupo II recibieron inyecciones primarias y de refuerzo de PBS
emulsionada con adyuvante, pero sin péptido de vacuna, de la misma
forma que los ratones del Grupo I. Se prepararon muestras de plasma,
como se describe anteriormente, para las muestras de plasma de
conejos.
Todos los ratones del Grupo I tenían títulos
significativos de anticuerpos anti-CETP como se mide
en una amplia gama de diluciones de plasma (1:10 a 1:1.000.000) por
medio de un ensayo ELISA directo, como se describe anteriormente
(véase Figura 7). Además, tres de los seis ratones del Grupo I
mostraron tener anticuerpos anti-CETP que competían
con Mab TP2 para unirse con la CETP recombinante humana (como se
descubrió en los conejos rb#2 y rb#3 en el Ejemplo 3, arriba).
Se inyectó el péptido de vacuna sintético (SEQ
ID NO:2) del Ejemplo 1 de arriba en conejos blancos de Nueva Zelanda
para analizar la capacidad del péptido de vacuna de provocar una
respuesta inmune contra la CETP de conejo endógena y de proteger o
reducir el desarrollo de aterosclerosis. El Grupo I estaba compuesto
por seis conejos (rb#1 #6), cada uno de los cuales se sometió a un
protocolo para administración del péptido de vacuna. El Grupo II de
control estaba compuesto por seis conejos (rb#7-12)
a los que se vacunó pero no se les administró una dieta alta en
colesterol. El Grupo de control III estaba compuesto por seis
conejos (rb#13-18) a los que no se vacunó ni se les
administró una dieta alta en colesterol. El Grupo de control IV
estaba compuesto por seis conejos (rb#19-24) a los
que no se vacunó, pero si se les administró una dieta alta en
colesterol. La dieta alta en colesterol se administró empezando
cuatro semanas después de un refuerzo final con la vacuna y continuó
durante un total de 17 semanas.
En la Tabla 1, a continuación, se muestra el
protocolo general para analizar el péptido de vacuna en los conejos.
En el Día 0, se suspendió el péptido (100 \mug) en el sistema
adyuvante RIBI™ (RIBI ImmunoChem Research, Inc. Hamilton, Montana),
de acuerdo con las instrucciones del fabricante hasta un volumen
final de 1.000 \mul, y cada conejo del Grupo I y II fue inyectado
en dos sitios intramusculares (250 \mul por sitio), por vía
subcutánea en dos sitios (100 \mul por sitio), y seis sitios
intradérmicos (50 \mul por sitio). El Día 28, se administró un
refuerzo (100 \mug de péptido en sistema adyuvante RIBI™) como en
el Día 0. El Día 49, se administró otro refuerzo (100 \mug de
péptido en sistema adyuvante RIBI™) como en el Día 0, El Día 77, se
alimentó a los Grupos I y IV con el 0,25% (p/p) de dietas
enriquecidas con colesterol (pienso para conejos suplementado con
colesterol (Farmer's Exchange, Framingham, MA)). Se alimentó a los
Grupos II y III con el mismo pienso de conejos, pero sin suplementar
con colesterol (Farmer's Exchange, Framingham, MA).
Se extrajeron muestras (aproximadamente
1-5 ml) del oído de cada conejo antes de cada
inyección inicial ("presangrado") y de forma rutinaria en
aproximadamente cada dos semanas a partir de entonces. Las muestras
de plasma sanguíneo se prepararon a través de procedimientos de
centrifugación convencionales para separar componentes celulares del
plasma. Las muestras de plasma se almacenaron a -70ºC. Se analizaron
muestras de plasma de todos los Grupos para la presencia de y
aumento en el título de anticuerpos anti-CETP y para
niveles totales de colesterol en plasma y HDL-C en
plasma.
\vskip1.000000\baselineskip
Se usó un ensayo (ELISA) inmunosorbente unido a
encimas en sándwich para titular muestras de plasma que contienen
anticuerpos anti CETP. En este establecimiento, se absorbió CETP
humana recombinante (CETPr humana, obtenida de la línea celular CHO
recombinante CHO(AT) aprobada por The Trustees of Columbia
University, Nueva York, Nueva York) a pocillos de una placa de
microtítulos, y se añadieron diversas diluciones de plasma de conejo
de los conejos de los Grupos I y IV a cada pocillo. Se revistió cada
pocillo de una placa de 96 pocillos NUNC Maxisorb por exposición de
toda la noche a 4ºC a 100 \mul de 1 solución de 1 \mug/ml de
CETPr humana en PBS. Se bloqueó la unión no específica añadiendo
una solución del 1% de BSA en PBS y el 0,05% de Tween a cada pocillo
e incubando durante dos horas a temperatura ambiente (20º-22ºC) en
un baño de agitación a 150 rpm. Después se lavaron los pocillos
cuatro veces con tampón de lavado ELISA (PBS + 0,05% Tween). Después
se diluyeron muestras de plasma 1:10 en tampón de dilución (1% BSA
en PBS), seguido de 6 diluciones seriadas dobles en el mismo tampón.
Se añadieron muestras diluidas (100 \mul) a los pocillos, se
incubaron durante 2 horas a temperatura ambiente en un baño de
agitación a 150 rpm, y después se lavaron 4 veces con tampón de
lavado ELISA (PBS + 0,05% Tween). Para detectar anticuerpos
anti-CETP unidos, se añadió 100 \mul de una
dilución de 1: 10.000 de inmunoglobina de cabra
anti-conejo etiquetada con peroxidasa de rábano
picante (HRP) (Southern Biotechnologiy Associates, Inc.; Birmingham,
Alabama) en tampón de dilución, y se incubaron las placas durante 2
horas a temperatura ambiente en un baño de agitación a 150 rpm.
Después se lavaron los pocillos 4 veces con tampón de lavado ELISA
(véase arriba), se añadió sustrato de peroxidasa TMB (sustrato de
peroxidasa TMB, Kirkegaard & Perry Laboratories, Inc.
Gaithersburg, Maryland), y se incubaron las placas durante 30
minutos a temperatura ambiente. Se controló el cambio en densidad
óptica a 450 nm por medio de espectrofotometría usando un lector
ELISA (por ejemplo, E-max, Molecular Device Corp.,
Menlo Park, California). En este ensayo, la D.O. era directamente
proporcional a la cantidad de anticuerpos anti-CETP
presentes en las muestras de plasma. Los resultados indicaron que
cinco de los doce conejos vacunados (Grupos I y II) produjeron
anticuerpos anti-CETP que eran específicos para la
CETP humana recombinante (véase Figura 9). No se produjo ningún
anticuerpo anti-CETP humana recombinante en los
Grupos de control III y IV no tratados.
Se sintetizó un péptido (péptido de conejo)
compuesto por una secuencia de aminoácidos de la CETP de conejo
endógena para usar en orden procedimientos de síntesis de péptidos
convencionales de Quality Controlled Biochemicals, Inc. (Hopkinton,
Massachusetts) con la secuencia de SEQ ID NO:7:
LQMDFGFPKHLLVDFLQSLS, que corresponde a los aminoácidos 457 a 476 de
la región carboxilo terminal de la secuencia de la CETP humana
mostrada en SEQ ID NO:4. Esta parte de la secuencia de aminoácidos
de la CETP de conejo se diferencia de la secuencia de la CETP humana
en que el residuo de ácido glutámico en la posición 465 de la
secuencia humana (SEQ ID NO:4) se sustituye con un residuo de lisina
(véase aminoácido 9 en SEQ ID NO:7). A efectos de este ensayo, se
compró el péptido de conejo en forma de un derivado biotinilado
(biotina unida por covalencia al residuo de leucina amino
terminal).
Se prepararon placas prebloqueadas de
microtítulos revestidas con estreptavidina de la siguiente forma. Se
preparó 100 \mul de 5 \mug/ml de estreptavidina (catálogo
#43-4302, Zymed Laboratories, Inc., S. San
Francisco, CA) en PBS en cada pocillo de las microplacas de 96
pocillos con bandas desechables (catálogo
#950-2950-00P, LabSystems, Needham,
MA), sellados e incubados a temperatura ambiente toda una noche.
Después de la aspiración del contenido de cada pocillo, se lavaron
las placas y luego se bloquearon con 300 \mul de PBS compuesto por
el 1% de BSA, el 5% de sacarosa, el 0,05% de Tween 20 y el 0,1% de
sulfato de gentamicina, toda una noche a temperatura ambiente. Al
día siguiente se vaciaron los pocillos y se dejaron secar toda una
noche antes de almacenarlos, sellarlos con desecador, a 4ºC, hasta
su uso. Después se añadió péptido de conejo a cada pocillo (100
\mul de una solución de 1 \mug/ml) en PBS (GIBCO BRL)
suplementada con el 10% (p/v) de albúmina de suero bovino (BSA)) y
se incubó durante 1 hora con agitación a 150 rpm a temperatura
ambiente (22ºC). Se lavaron las placas tres veces con tampón de
lavado (PBS suplementado con el 0,05% de Tween-20)
para eliminar el péptido no unido. Se diluyeron muestras de plasma
de conejo (inicialmente 1:40, después la mitad en serie
sucesivamente) en PBS suplementado con el 5% de BSA y el 1% de
gelatina y se incubaron 100 \mul de cada dilución durante 90
minutos a temperatura ambiente con agitación a 150 rpm. Después se
lavaron las placas tres veces con tampón de lavado. Se diluyó lgG de
cabra anti-conejo etiquetada con peroxidasa de
rábano picante (Southern Biotechnologiy Associates, Inc.;
Birmingham, Alabama, AL) 1:50.000 en tampón de lavado y se añadieron
100 \mul a cada pocillo, que se incubaron después durante 90
minutos a temperatura ambiente con agitación a 150 rpm. Las placas
se lavaron tres veces con tampón de lavado y después se incubaron
con sustrato de peroxidasa TMB (sustrato de peroxidasa TMB,
Kirkegaard & Perry Laboratories, Inc. Gaithersburg, Maryland), y
se incubaron las placas durante 30 minutos a temperatura ambiente.
Se controló el cambio en densidad óptica a 450 nm por medio de
espectrofotometría, usando un lector ELISA (por ejemplo,
E-max, Molecular Device Corp., Menlo Park,
California). En este ensayo, la D.O. era directamente proporcional a
la cantidad de anticuerpos de la CETP anti-conejo
presentes en las muestras de plasma.
Los resultados indicaron que tres semanas
después del refuerzo final (y antes de administrar la dieta
suplementada con colesterol a los Grupos I y IV) seis de los doce
animales vacunados (tres de cada uno de los Grupos I y II)
produjeron anticuerpos que reaccionaron con el péptido derivado de
la secuencia de la CETP de conejo endógena (véase Figuras 10A y
10B).
La información mostró que el péptido de vacuna
era capaz de provocar anticuerpos autorreactivos a la CETP endógena
de conejo. Esto indica que la combinación de epitope de célula T de
toxoide de tétanos y el epitope de célula B de la región carboxilo
terminal de la CETP es capaz de romper la tolerancia a una proteína
propia específica, esto es, en este caso, CETP endógena de
conejo.
También se analizaron muestras de plasma tomadas
de conejos de los Grupos del Ejemplo 6 en diversos tiempos (días) en
el protocolo de vacunación para la concentración total de colesterol
(Figura 11) y HDL-C (Figura 12). Se determinaron los
niveles totales de colesterol y HDL-C en plasma
usando ensayos convencionales comerciales (Wako Chemicals USA, Inc.,
Richmond, Virginia).
Las muestras de plasma de los Grupos I
(vacunado) y IV (no vacunado) mostraron un aumento en colesterol
total (hipercolesterolemia) debido a la administración de la dieta
suplementada con colesterol (Figura 11). Los Grupos II (vacunado) y
III (no vacunado) no manifestaron hipercolesterolemia inducida por
la dieta (Figura 11).
De forma similar, Los Grupos I y IV alimentados
con la dieta suplementada con colesterol mostraron un aumento en
HDL-C (Figura 12). Los análisis preliminares de la
información para el Grupo II indicaron que los tres animales con los
títulos de anticuerpos anti-CETP más elevados
también mostraron un aumento en sus niveles de HDL-C
en comparación con niveles de prevacunación. Los análisis
preliminares también indicaron que en los tres de los cinco animales
del Grupo III, no se observó ningún cambio en los niveles de
HDL-C en comparación con los niveles de
prevacunación.
Se extrajeron las aortas de todos los conejos
supervivientes (cuatro de los Grupos I y IV, cinco del Grupo II,
seis del Grupo III) después de 17 semanas (Día 196 desde la
vacunación primaria) de dieta suplementada con colesterol en los
Grupos I y IV) y dieta de control (no suplementada con colesterol)
en los Grupos II y III. Se mostró que la muerte de conejos no
supervivientes por necropsia se debió a bolas de pelo y no, por
tanto, a al diseño experimental. Se abrió cada aorta para una visión
frontal con el fin de examinar lesiones ateroscleróticas. Se tiñó la
toda la longitud de la aorta, esto es, desde el arco de la aorta en
el corazón hasta la bifurcación en el abdomen inferior, con Aceite
Rojo O para detectar lesiones. Se midieron las lesiones y se
cuantificó la información usando un programa informático (The
Morphometer, Woods Hole Educational Associated, Woods Hole, MA).
Los resultados en la Figura 13 de este análisis
demostraron una reducción estadísticamente importante en el tamaño
de las lesiones en los animales del Grupo I (vacunado, dieta
suplementada con colesterol) en comparación con el tamaño de las
lesiones en animales del Grupo IV (no vacunados, dieta suplementada
con colesterol). Los resultados mostraron que la vacuna del péptido
era capaz de reducir la zona de lesiones ateroscleróticas en
animales alimentados con dietas suplementadas con colesterol
(hipercolesterolemia) en más del 50%. Los animales no vacunados
(Grupo IV) tuvieron lesiones que abarcaban una media del 45% de la
zona total de la aorta, mientras que los animales vacunados (Grupo
I) tuvieron lesiones que abarcaban una media del 19% de la zona
total de la aorta.
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE: Rittershaus, Charles, W. Thomas, Lawrence J.
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: MODULACIÓN DE LA ACTIVIDAD DE LA PROTEÍNA TRANSPORTADORA DE ÉSTERES DE COLESTERILO (CETP).
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 9
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- DIRECCIÓN CORRESPONDENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- A.
- DESTINATARIO: Banner & Allegretti, Ltd.
\vskip0.500000\baselineskip
- B.
- CALLE: 75 State Street
\vskip0.500000\baselineskip
- C.
- CIUDAD: Boston
\vskip0.500000\baselineskip
- D.
- ESTADO: Massachusetts
\vskip0.500000\baselineskip
- E.
- PAÍS: EE. UU.
\vskip0.500000\baselineskip
- F.
- C.P.: 02109
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- FORMA DE LECTURA POR ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- A.
- TIPO DE MEDIO: Disco flexible
\vskip0.500000\baselineskip
- B.
- ORDENADOR: PC compatible con IBM
\vskip0.500000\baselineskip
- C.
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
- D.
- SOFTWARE: WordPerfect 6.1
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- INFORMACIÓN SOLICITUD ACTUAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- A.
- NÚMERO SOLICITUD: (no asignado todavía)
\vskip0.500000\baselineskip
- B.
- FECHA DE PRESENTACIÓN: 1 de mayo de 1996
\vskip0.500000\baselineskip
- C.
- CLASIFICACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- INFORMACIÓN SOLICITUD ANTERIOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- A.
- SOLICITUD: 08/432.483
\vskip0.500000\baselineskip
- B.
- FECHA DE PRESENTACIÓN: 1 de mayo de 1995
\vskip0.800000\baselineskip
- (viii)
- INFORMACIÓN ABOGADO / AGENTE:
\vskip0.500000\baselineskip
- A.
- NOMBRE: Leon R. Yankwich
\vskip0.500000\baselineskip
- B.
- NÚMERO DE REGISTRO: 30.237
\vskip0.500000\baselineskip
- C.
- NÚMERO DE REFERENCIA / EXPEDIENTE: 95.179-B (TCS-204-PCT)
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 1
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- A.
- LONGITUD: 26 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- B.
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- C.
- TOPOLOGÍA: linear
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA:
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO:
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- RASGO:
\vskip0.500000\baselineskip
- A.
- NOMBRE: 26 aminoácidos carboxilos terminales de la CETP humana
\vskip0.500000\baselineskip
- B.
- LOCALIZACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
- (x)
- INFORMACIÓN DE PUBLICACIÓN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- AUTORES: Drayna, Dennis, y col.
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TÍTULO: Clonación y secuenciación de ADNc de transporte de ésteres de colesterol humano
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- REVISTA: Nature
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- VOLUMEN: 327
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- EMISIÓN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- PÁGINAS: 632-634
\vskip0.500000\baselineskip
- (G)
- FECHA: 18-JUN-1987
\vskip0.500000\baselineskip
- (K)
- RESIDUOS RELEVANTES EN SEQ ID NO:1: DE 1 A 26
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 1:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Arg Asp Gly Phe Leu Leu Leu Gln Met Asp
Phe}
\sac{Gly Phe Pro Glu His Leu Leu Val Asp Phe
Leu}
\sac{Gln Ser Leu Ser}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 2
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 31 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: linear
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA:
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO:
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- RASGO:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 2:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Cys Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe
Ile}
\sac{Gly Ile Thr Glu Phe Gly Phe Pro Glu His
Leu}
\sac{Leu Val Asp Phe Leu Gln Ser Leu Ser}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 3
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 21 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: linear
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA:
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO:
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- RASGO:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: epitope de célula T auxiliar universal de toxoide de tétanos de 21 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
- (x)
- INFORMACIÓN DE PUBLICACIÓN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- AUTORES: Panina-Bordignon, P., y col.
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TÍTULO: Epitopes de célula T inmunógenos universalmente: unión promiscua a MHC humana de clase II y reconocimiento promiscuo por células T
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- REVISTA: European Journal of Immunology
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- VOLUMEN: 19
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- EMISIÓN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- PÁGINAS: 2237-2242
\vskip0.500000\baselineskip
- (G)
- FECHA: 1989
\vskip0.500000\baselineskip
- (K)
- RESIDUOS RELEVANTES EN SEQ ID NO:3: DE 1 A 21
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 3:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Phe Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp Leu
Arg}
\sac{Val Pro Lys Val Ser Ala Ser His Leu
Glu}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 4
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 476 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: linear
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA:
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO:
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- RASGO:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: secuencia de aminoácidos de la CETP humana madura
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
- (x)
- INFORMACIÓN DE PUBLICACIÓN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- AUTORES: Drayna, Dennis, y col.
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TÍTULO: Clonación y secuenciación de ADNc de transporte de ésteres de colesterol humano
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- REVISTA: Nature
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- VOLUMEN: 327
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- EMISIÓN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- PÁGINAS: 632-634
\vskip0.500000\baselineskip
- (G)
- FECHA: 18-JUN-1987
\vskip0.500000\baselineskip
- (K)
- RESIDUOS RELEVANTES EN SEQ ID NO:1: DE 1 A 476
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 4:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 5
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1.428 parejas básicas
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: linear
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA:
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO:
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- RASGO:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: secuencia codificadora de la CETP humana madura
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
- (x)
- INFORMACIÓN DE PUBLICACIÓN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- AUTORES: Drayna, Dennis, y col.
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TÍTULO: Clonación y secuenciación de ADNc de transporte de ésteres de colesterol humano
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- REVISTA: Nature
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- VOLUMEN: 327
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- EMISIÓN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- PÁGINAS: 632-634
\vskip0.500000\baselineskip
- (G)
- FECHA: 18-JUN-1987
\vskip0.500000\baselineskip
- (K)
- RESIDUOS RELEVANTES EN SEQ ID NO:5: DE 1 A 1.428
\newpage
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 5:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 6
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 496 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: linear
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA:
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO:
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- RASGO:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: secuencia aminoácido para proteína de la CETP madura de conejo
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
- (x)
- INFORMACIÓN DE PUBLICACIÓN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- AUTORES: Nagashima, Mariko, y col.
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TÍTULO: Clonación y distribución de tejido ARNm de proteína de transporte de ésteres de colesterol de conejo
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- REVISTA: J. Lipid Res.
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- VOLUMEN: 29
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- EMISIÓN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- PÁGINAS: 1643-1649
\vskip0.500000\baselineskip
- (G)
- FECHA: 1988
\vskip0.500000\baselineskip
- (K)
- RESIDUOS RELEVANTES EN SEQ ID NO:6: DE 1 A 496
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 6:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 7
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1.488 parejas básicas
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: linear
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA:
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO:
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- RASGO: Secuencia codificadora para la CETP madura de conejo
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
- (x)
- INFORMACIÓN DE PUBLICACIÓN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- AUTORES: Nagashima, Mariko, y col.
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TÍTULO: Clonación y distribución de tejido ARNm de proteína de transporte de ésteres de colesterol de conejo
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- REVISTA: J. Lipid Res.
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- VOLUMEN: 29
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- EMISIÓN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- PÁGINAS: 1643-1649
\vskip0.500000\baselineskip
- (G)
- FECHA: 1988
\vskip0.500000\baselineskip
- (K)
- RESIDUOS RELEVANTES EN SEQ ID NO:7: DE 1 A 1.488
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 7:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:8
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 50 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: linear
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA:
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO:
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- RASGO:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 8:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:9
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 50 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: linear
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA:
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO:
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- RASGO:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 9:
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (37)
1. Un péptido antigénico aislado que comprende
una parte de epitope de célula T auxiliar unida a una parte de
epitope de célula B, en el que dicha parte de epitope de célula T
auxiliar comprende un epitope de célula T auxiliar de gama amplia y
dicha parte de epitope de célula B comprende un epitope de célula B
de proteína transportadora de ésteres de colesterilo (CETP) y en el
que dicho péptido antigénico provoca, en un sujeto mamífero, la
producción de autoanticuerpos que se unen a la CETP endógena del
sujeto al que se administra dicho péptido, y en el que dichos
anticuerpos modulan la actividad de transporte de la CETP endógena
del sujeto al que se administra dicho péptido.
2. Un péptido de acuerdo con la reivindicación
1, en el que la CETP es CETP humana.
3. Un péptido de acuerdo con la reivindicación
2, en el que dicha parte de epitope de célula B comprende una parte
de CETP humana, compuesta por al menos 6 aminoácidos consecutivos de
SEQ ID NO:4 y que se reconocen por células B o anticuerpos.
4. Un péptido de acuerdo con la reivindicación
2, en el que dicho epitope de célula B de CETP se selecciona a
partir del grupo compuesto por la secuencia de aminoácidos definida
por los aminoácidos 349 a 367 de SEQ ID NO:4, aminoácidos 461 a 476
de SEQ ID NO:4; secuencias de aminoácidos identificadas por
algoritmos que identifican epitopes antigénicos, una región
implicada en la unión de lípidos neutros, o una región implicada en
la actividad de transporte de lípidos neutros.
5. Un péptido de acuerdo con la reivindicación
3, en el que dicha parte de epitope de célula B es un péptido
compuesto por entre seis y 26 aminoácidos consecutivos de los 26
aminoácidos carboxilos terminales de CETP humana (SEQ ID NO:1).
6. Un péptido de acuerdo con la reivindicación 1
ó reivindicación 2, en el que dicha parte de epitope de célula B es
un derivado de la región de los 26 aminoácidos carboxilos terminales
de CETP que tiene deleciones, adiciones o sustituciones de
aminoácidos que no modifican o destruyen de forma significativa la
unión de lípidos neutros o actividad de transporte de lípidos
neutros de dicha CETP.
7. Un péptido de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 6, en el que dicha parte de epitope de
célula T auxiliar comprende un epitope de célula T auxiliar derivado
de un péptido antigénico seleccionado del grupo compuesto por
toxoide de tétanos, toxoide de difteria, vacuna contra la tos
ferina, Bacilo de Calmette-Guerin (BCG), vacuna
contra la polio, vacuna contra el sarampión, vacuna contra la
parotiditis infecciosa, vacuna contra la rubéola, derivado proteico
purificado de tuberculina, hemocianina de lapa de bocallave, hsp70,
y combinaciones de los mismos.
8. Un péptido de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 6, en el que dicha parte de epitope de
célula T auxiliar comprende la secuencia de aminoácidos de los
aminoácidos 830 a 843 de proteína de toxina de tétanos (aminoácidos
2 a 15 de SEQ ID NO:2), la secuencia de los aminoácidos 947 a 967 de
proteína de toxina de tétanos (SEQ ID NO:3), y combinaciones de las
mismas.
9. Un péptido de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 8, que tiene un residuo de cisteína amino
terminal.
10. Un péptido de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 9, en el que dicha parte de epitope de
célula B se une a dicha parte de epitope de célula T auxiliar.
11. Un péptido de acuerdo con la reivindicación
10, en el que dicha parte de epitope de célula B se une por
covalencia a dicha parte de epitope de célula T auxiliar.
12. Un péptido de acuerdo con la reivindicación
11, en el que dicha parte de epitope de célula B se une por
covalencia a dicha parte de epitope de célula T auxiliar a través de
un enlace péptidico o un enlace de disulfuro.
13. Un péptido de acuerdo con la reivindicación
10, en el que dicha parte de epitope de célula B se une a dicha
parte de epitope de célula T auxiliar a través de una molécula de
entrecruzamiento.
14. Un péptido de acuerdo con la reivindicación
10, en el que dicha parte de epitope de célula B se une a dicha
parte de epitope de célula T auxiliar a través de un puente de
aminoácidos.
15. Un péptido de acuerdo con la reivindicación
1, que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:2.
16. Un péptido de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 9, en el que dicha parte de epitope de
célula B y dicha parte de epitope de célula T auxiliar están unidas
a una molécula vehículo común.
17. Un péptido de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 16, unido por covalencia a copias múltiples
de la proteína C3d del complemento.
18. Un péptido de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 16, derivatizado con estructuras de
hidratos de carbono que se vuelve unido por covalencia in
vivo con la proteína C3d del complemento.
19. Un péptido de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones precedentes, que comprende más de una parte de
epitope de célula T auxiliar y/o más de una parte de epitope de
célula B.
20. Una vacuna que comprende un vehículo o
adyuvante farmacéuticamente aceptable y uno o más péptidos
seleccionados de los péptidos de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 19.
21. Un péptido de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 19, para usar en forma de medicamento.
22. Un péptido de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 19, o una vacuna de acuerdo con la
reivindicación 20, para usar en la provocación de anticuerpos
anti-CETP en un humano o animal.
23. Un péptido de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 19, o una vacuna de acuerdo con la
reivindicación 20, para usar en la elevación de la relación de HDL
circulante a LDL circulante, VLDL, o colesterol total en un humano u
otro animal.
24. Un péptido de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 19, o una vacuna de acuerdo con la
reivindicación 20, para usar en la disminución del nivel de
actividad de CETP endógena en un humano u otro animal.
25. Un péptido de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 19, o una vacuna de acuerdo con la
reivindicación 20, para usar en la modificación del catabolismo de
HDL-colesterol para disminuir el desarrollo de
lesiones ateroscleróticas en un humano u otro animal.
26. Un péptido de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 19, o una vacuna de acuerdo con la
reivindicación 20, para usar en el tratamiento o prevención de
aterosclerosis en un humano u otro animal.
27. Un procedimiento para preparar una vacuna
anti-CETP para modular la actividad de la CETP
endógena o para tratar o prevenir la aterosclerosis,
comprendiendo:
- Selección de una parte de epitope de célula B de CETP, en la que dicho epitope de célula B no incluye un epitope de célula T de clase I del complejo mayor de histocompatibilidad;
- Selección de una parte de epitope de célula T auxiliar derivado de un péptido antigénico que no se deriva de la CETP; y uniéndose dicha parte de epitope de célula B de la CETP y dicha parte de epitope de célula T auxiliar para formar un resto antigénico, en el que dicho resto antigénico provoca, en un sujeto mamífero, la producción de autoanticuerpos que unen la CETP endógena del sujeto al que se administra dicha vacuna, y en el que dichos autoanticuerpos modulan la actividad de la CETP endógena del sujeto al que se administra dicho péptido.
28. Un procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 27, en el que dicha parte de epitope de célula B de
la CETP es como se define en una cualquiera de las reivindicaciones
3 a 6 y dicha parte de epitope de célula T auxiliar es como se
define en la reivindicación 7 ó reivindicación 8.
29. Un procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 27 ó reivindicación 28, en el que dicha parte de
epitope de célula B se une como se define en una cualquiera de las
reivindicaciones 11 a 16 a dicha parte de epitope de célula T
auxiliar.
30. Un procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 27 ó 28, en el que dicha parte de epitope de célula B
se une a dicha parte de epitope de célula T auxiliar para formar un
péptido de vacuna y comprendiendo además la etapa de unión de dicho
péptido de vacuna a una molécula vehículo común.
31. Uso de un péptido de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19, o una vacuna de acuerdo
con la reivindicación 20, para la elaboración de un medicamento para
usar en la provocación de anticuerpos anti-CETP
endógena en un humano o animal.
32. Uso de un péptido de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19, o una vacuna de acuerdo
con la reivindicación 20, para la elaboración de un medicamento para
usar en el tratamiento o prevención de aterosclerosis.
33. Un péptido de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 19, o una vacuna de acuerdo con la
reivindicación 20, para usar en forma de medicamento.
34. Un péptido o vacuna de acuerdo con la
reivindicación 33 para usar en el tratamiento o prevención de
aterosclerosis.
\newpage
35. Uso de un péptido de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19, o una vacuna de acuerdo
con la reivindicación 20, para la elaboración de un medicamento para
elevar la relación de HDL circulante a LDL circulante, VLDL, o
colesterol total en un humano u otro animal.
36. Uso de un péptido de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19, o una vacuna de acuerdo
con la reivindicación 20, para la elaboración de un medicamento para
disminuir el nivel de actividad de CETP endógena en un humano u otro
animal.
37. Uso de un péptido de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19, o una vacuna de acuerdo
con la reivindicación 20, para la elaboración de un medicamento para
aumentar el nivel de HDL circulante en un humano o animal.
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