JP3766701B2 - 新規酵母、該酵母を含有するパン生地および該生地の製造方法 - Google Patents
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は新規酵母、該酵母を含有するパン生地および該生地の製造方法に関する。更に詳しくは、製パン上、とりわけリタード工程を含むデニッシュやクロワッサンなどのペーストリー、糖濃度の高い菓子パン、さらに全ての種類のパンにおける冷蔵生地あるいは冷凍生地に有用な新規酵母及びこの酵母を含有するパン生地および該パン生地の製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来から、糖濃度が２５％以上の菓子パン生地においても、高い発酵力を示し良好な菓子パンを製造できるパン酵母が望まれており、浸透圧耐性の高い酵母のスクリーニングあるいは酵母のインベルターゼ比活性等について検討が行われている。しかしながら、後者のインベルターゼ比活性と菓子パン生地での発酵力との関係について、十分な検討はなされておらず、特に菓子パン生地のような高糖生地での冷蔵、冷凍後の発酵力に対するインベルターゼ比活性の関与に関してはほとんど研究されていないのが現状である。そのため、インベルターゼ比活性に注目した発明は、特開昭６１−２３１９９３、特開平３−８００７３に開示されているインベルターゼ比活性の全くないかあるいはほとんどないパン酵母に関するもののみである。しかしながら、これらの発明はフラクトオリゴ糖入りパンに使用することを目的に育種されたフラクトオリゴ糖非資化性酵母に関するものである。そのため、これらの酵母は砂糖を多量に添加する菓子パンのような高糖生地での発酵力が十分でなく、良好な菓子パンを製造するための酵母としては、実用性が十分ではないという欠点をもっている。
【０００３】
このような状況から、現在までインベルターゼ比活性が生地中の砂糖を分解するのに十分な量以上あるが、その比活性がかなり低く高糖生地の発酵力が高い酵母は開発されていないのが現状である。
【０００４】
また、最近の製パン業界では、省力化による工程の合理化と、その反面、多様な消費者ニーズにこたえるための品種のバラエティー化との両方のニーズに応えるため、冷凍生地法が盛んに行われるようになってきた。さらには、生地を冷凍させないで冷蔵状態で保管すると同時に生地の熟成を図る所謂冷蔵生地法も盛んに検討されるようになってきた。しかしながら、従来のパン酵母の場合は生地を低温に冷却しても発酵速度は常温の場合よりも遅くはなるものの発酵が進むため、冷蔵生地での保管はせいぜい１日程度であり、このため一部実用化はされてはいるものの広く応用されるまでには至っていないのが実状である。
【０００５】
デニッシュやクロワッサンなどのペーストリーの製造では、ロールインマーガリンをきれいに層状に折り込むため生地を低温処理するいわゆる「リタード法」がとりいれられている。しかしながら、このリタード工程における若干の生地発酵のために、ロールインマーガリンがきれいに折り込まれず、できたパンの層がきれいにならなかったり、生地の冷蔵保管が事実上できないため、成形残の生地の活用ができず、製パン工程の歩留りの低下を招いている。
【０００６】
このような課題を解決すべく、特開平5-76348、特開平5-284896、および特開平5-336872には、冷蔵中には発酵せず、一定温度以上では発酵する酵母（低温感受性酵母）が開示されているが、冷蔵保存後の発酵力（本明細書の復温発酵力に相当する）が、冷蔵前に比べて60％程度である。従って、冷蔵生地を用いてパンを作製した場合、発酵力が不足するためボリュームのある良質なパンが製造できないという欠点がある。
【０００７】
さらに、低温感受性酵母の復温発酵力の低下は、生地中の糖濃度が高くなると一般により顕著になり、対粉当りの糖の添加量が２５％以上の菓子パン生地のような高糖生地で冷蔵後の発酵力が、冷蔵前と同等の発酵力を有する低温感受性酵母は、未だ開発されていないのが現状である。
【０００８】
冷凍生地法においても、生地ミキシング後、冷凍過程において若干の発酵（所謂冷凍前発酵）が起こり、エチルアルコールが生地に生成することによって酵母の冷凍耐性が低下したり、流通過程における冷凍庫の開閉など保管条件の不良による温度上昇のため、せっかく冷凍した生地でも昇温による一部解凍が起こり品質が低下する、などの問題があった。そして冷凍前発酵を抑えるため、冷凍生地の製造ではミキシング温度を極端に低く押さえるべく冷蔵庫のような低温下でミキシングを行い、かつ急速冷凍をするためスパイラル急速冷凍機を使用するなど膨大なエネルギーを必要としているのが実状である。
【０００９】
このような課題を解決すべく、特開平４−２３４９３９では、低温感受性かつ冷凍耐性の性質を有するパン酵母が提供されているが、そのパン酵母はもともと一般のパン酵母に較べると発酵力がかなり弱いものであり、実用性という面で問題がある。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
従って、通常の中種法、ストレート法菓子パン生地で十分に発酵するパン酵母が望まれていた。
【００１１】
また、生地を冷凍させないで冷蔵状態でも流通が可能な冷蔵生地法や、リタード工程における生地膨張が従来のパン酵母に比べて少なく、商品価値が高く、かつ残生地も活用でき製品歩留りの高いペーストリー商品の製造を可能とする新規酵母、該酵母を含有するパン生地、および該生地の製造方法を提供することが望まれていた。
【００１２】
さらに、冷蔵保存後でも発酵力が低下せず、また高糖生地を冷蔵保存した場合でも復温発酵力が高い酵母を提供することが望まれていた。
【００１３】
また、冷凍生地法においては、生地の冷凍過程で速やかに発酵が抑制されることにより冷凍耐性が向上し、冷凍流通過程での保管条件による昇温に対しても耐性のある冷凍生地の製造を可能とする新規酵母及びこれを含有する冷凍生地が望まれていた。
【００１４】
【課題を解決するための手段】
本発明は、上記問題点を解決すべくなされたものであり、その目的とするところは、高糖生地発酵力が非常に高く、通常の中種法、ストレート法で良好な菓子パンが得られ、さらに、冷蔵耐性および／または冷凍耐性を有し、冷蔵、冷凍保存後の発酵力の減少が少なく、高糖生地での冷蔵保存にも耐性な酵母を提供することにある。
【００１５】
本発明者らは、自然界から、あるいは保存菌株からのスクリーニング又は変異処理や交雑や細胞融合などによる育種操作によって得られた菌株を用いて幅広く酵母のスクリーニングを行った結果、低温下で発酵が非常に抑制される酵母であり、インベルターゼ比活性が生地中の砂糖を分解するには十分であるが、その比活性がかなり低く、高糖生地発酵の高い酵母を分離した。そして、さらにこれらの酵母から、スクリーニング、および育種を重ねた結果、目的とする菌株を得ることに成功し、本発明を完成させた。
【００１６】
本発明は、サッカロミセス属に属し、以下の性質：
（１）インベルターゼ比活性が１０ユニット以上、１５０ユニット以下、および、
（２）高糖生地での３０℃、１１５分の発酵力が３５０ｍｌ以上である、
を有する酵母に関する。
【００１７】
好適な実施態様においては、本発明の酵母は、さらに以下の性質：
（３）高糖生地での５℃、２４時間の発酵力が１０ｍｌ以下、および、
（４）３０℃の復温高糖生地発酵力が、３０℃、１１５分の高糖生地発酵力の９０％以上である、を有する。
【００１８】
好適な実施態様においては、本発明の酵母は、さらに以下の性質：
（５）−２０℃、１週間冷凍保存後の３０℃での復温高糖生地発酵力が、３０℃、１１５分の高糖生地発酵力の９０％以上である、という性質を有する。
【００１９】
上記性質を有する酵母として、以下の酵母：
サッカロミセス・セレビシエＲ−９１５２（ＦＥＲＭ Ｐ−１４６７５）、
サッカロミセス・セレビシエＲ−９１５５（ＦＥＲＭ Ｐ−１４６７６）、
サッカロミセス・セレビシエＲ−９１５６（ＦＥＲＭ Ｐ−１４６７７）、
サッカロミセス・セレビシエＲ−９１６０（ＦＥＲＭ Ｐ−１４６７８）、または、
サッカロミセス・セレビシエＲ−９１９４（ＦＥＲＭ Ｐ−１４６７９）が挙げられる。
【００２０】
上記酵母は、通常の菓子パン生地、冷蔵および／または冷凍パン生地に好適に用いられ得る。
【００２１】
本発明は、さらに、上記に記載の酵母を少なくとも１種を含有するパン生地に関し、好適な実施態様においては、パン生地は、通常の菓子パン生地、冷蔵パン生地あるいは冷凍パン生地である。
【００２２】
また、本発明は、上記に記載の酵母を少なくとも１種を含有するパン生地の製造方法に関し、好適な実施態様においては、通常の菓子パン生地、冷蔵パン生地あるいは冷凍パン生地の製造方法である。
【００２３】
高糖生地発酵力が高く、冷蔵、冷凍後にも発酵力が高い本願発明の酵母を用いることにより、本願発明の目的である良好な菓子パンの製造及び長時間保存のできる冷蔵生地や、品質がよく歩留りの高いリタード法でのペーストリー、さらには冷凍耐性の高い冷凍生地の製造が可能になる。また、冷蔵生地法による高糖生地を用いる菓子パンの製造が可能になる。従って、本発明の目的が達成される。以下に、本発明を具体的に説明する。
【００２４】
本発明の酵母は、少なくとも以下の性質：
（１）インベルターゼ比活性が１０ユニット以上、１５０ユニット以下、および、
（２）高糖生地での３０℃、１１５分の発酵力が３５０ｍｌ以上である、
を有する。
【００２５】
インベルターゼ比活性が、１０ユニットより低いと、生地中の砂糖を十分に分解できないために十分な発酵力が得られず、１５０ユニットより高いと、高糖生地での砂糖の分解速度が速くなり生地の浸透圧が高くなる。その結果、発酵が阻害され、十分な高糖生地発酵力が得られない。また１５０ユニットより高いと、高糖生地の冷蔵中に砂糖がより速く分解されるため浸透圧が上昇し、復温発酵力が低下するという欠点も生じる。このような点から、インベルターゼ比活性は１５０ユニット以下であることが好ましい。
【００２６】
本発明の酵母は、さらに、高糖生地での３０℃、１１５分の発酵力が３５０ｍｌ以上であるという性質を有する。このような性質を有する酵母は、低温下での耐性が付与され、かつ、パン製造時に発酵力が十分に保持されているため、本発明の目的を達成し得る。
【００２７】
本発明の酵母は、さらに以下の性質：
（３）高糖生地での５℃、２４時間の発酵力が１０ｍｌ以下、および、
（４）３０℃の復温高糖生地発酵力が、３０℃、１１５分の高糖生地発酵力の９０％以上である、を有し得る。
【００２８】
高糖生地での５℃、２４時間の発酵力が１０ｍｌ以下であることにより、冷蔵中の生地の膨張もほとんどなく、リタード法等での生地の成型がしやすく、残生地の再利用が可能になる。また、３０℃の復温高糖生地発酵力が、３０℃、１１５分の高糖生地発酵力の９０％以上であることにより、冷蔵後も十分な発酵力が維持され、冷蔵生地法によってボリュームのある良好なパンを得ることができる。
【００２９】
本発明の酵母は、さらに以下の性質：
（５）−２０℃、１週間冷凍保存後の３０℃での復温高糖生地発酵力が、３０℃、１１５分の高糖生地発酵力の９０％以上である、という性質を有し得る。
【００３０】
前記（３）の性質にさらに（５）の性質が付与されることにより、特に冷凍耐性が高められ、冷凍生地法においてもボリュームのある良好なパンを得ることができる。
【００３１】
上記性質を有する酵母の具体例として、以下の酵母：
サッカロミセス・セレビシエＲ−９１５２（ＦＥＲＭ Ｐ−１４６７５）、
サッカロミセス・セレビシエＲ−９１５５（ＦＥＲＭ Ｐ−１４６７６）、
サッカロミセス・セレビシエＲ−９１５６（ＦＥＲＭ Ｐ−１４６７７）、
サッカロミセス・セレビシエＲ−９１６０（ＦＥＲＭ Ｐ−１４６７８）、または、
サッカロミセス・セレビシエＲ−９１９４（ＦＥＲＭ Ｐ−１４６７９）が挙げられる。
【００３２】
本発明の酵母の性質の測定は、以下のようにして行い得る。
【００３３】
インベルターゼ比活性は、乾燥重量として１ｇの菌体が１分間にスクロースより生成するグルコースの２倍量（ｍｇ）と定義する。
【００３４】
具体的には、乾物重量として約５０ｍｇの酵母菌体を５ｍｌの０．１Ｍ酢酸バッファー（ｐＨ５．０）に懸濁し、その０．２ｍｌを０．１Ｍ酢酸バッファーｐＨ５．０ ０．８ｍｌに加え、さらに１ｍｌの１５（Ｗ／Ｖ）％スクロースバッファー溶液を加えて３０℃、１０分間反応させる。１ｍｌの１N NaOHを加えて反応を停止し、１N HClを１ｍｌ加えて中和し、遠心分離（3000rpm、５分）して菌体を除き、上澄のグルコース濃度をグルコスタット法（商品名：グルコースＢ−テストワコー：和光純薬製）で測定する。測定する酵母の濃度はインベルターゼ比活性の高低により適宜希釈し、グルコスタット法による測定において吸光度に直線性のある範囲で測定を行う。
【００３５】
なお、酵母の乾燥重量は酵母菌体を１０５℃、５時間乾燥した後の重量と定義する。
【００３６】
各種高糖生地での発酵力は、イースト工業会で定められた高糖生地発酵力に準じて以下のようにして測定した。
【００３７】
（５℃高糖生地発酵力）
以下の原料配合：
小麦粉 １００ ｇ
酵母 ３ ｇ
庶糖 ３０ ｇ
食塩 ０．５ ｇ
水 ５２ ｍｌ
を有する生地を捏上温度が２０±１℃になるようにミキシングを行い、生地をシリンダーにいれてあらかじめスタート時の生地量を測定し、５℃、２４時間発酵させた後の生地量とスタート時の生地量との差を、５℃高糖生地発酵力とした。
（３０℃高糖生地発酵力）
上記原料配合により、生地を捏上温度が３０±１℃になるようにミキシングを行い、生地をシリンダーにいれてあらかじめスタート時の生地量を測定し、３０℃、１１５分発酵させた後の生地量とスタート時の生地量との差を３０℃高糖生地発酵力とする。
【００３８】
（３０℃復温高糖生地発酵力）
復温発酵力は、５℃高糖生地発酵力測定と同様に調製した高糖生地を５℃、２４時間発酵させた後、３０℃に復温させて測定する。復温後、３０℃、１１５分の発酵力をもって、３０℃復温高糖生地発酵力とする。
【００３９】
（冷凍１週間後の復温高糖生地発酵力）
冷凍後復温発酵力は、３０℃高糖生地発酵力測定と同様に調製した高糖生地を３０℃で１時間発酵しガス抜きし、−２０℃で１週間冷凍後３０℃に復温させて測定する。復温後、３０℃、１１５分の発酵力をもって冷凍１週間後の復温高糖生地発酵力とする。
【００４０】
本発明のパン生地は、上記性質を有する酵母を１種または２種以上含有する。パン生地は、好適には、菓子パン生地のような高糖生地、冷蔵生地、冷凍生地である。本発明のパン生地は、ペストリーあるいは菓子パン用の生地、例えば、デニッシュ、クロワッサンをはじめ、食パン、バターロール、中華まんじゅう、イーストドーナツ等、膨張剤としてパン酵母を使用するものすべてを含む。
【００４１】
本発明は、さらに、上記のパン生地の製造方法に関するものである。パン生地の成分の配合は、当業者に公知の各パン生地に応じた配合が適用され得る。
【００４２】
本発明の酵母を用いることにより、高糖生地発酵力が上昇し、冷蔵、冷凍後の高糖生地発酵力が高くなる理由は、インベルターゼ比活性が生地中の砂糖を分解するには十分であるが、かなり低い酵母をスクリーニング、育種した効果が大であると考えられる。また、低温下で発酵力が抑制される理由については明らかではないが、酵母の発酵は細胞外の糖類（グルコースやフルクトース、シュクロースなど）を細胞膜に存在する糖の透過酵素（パーミアーゼ）により酵母の細胞内に輸送し、輸送された糖類を解糖系の酵素によりエチルアルコールと炭酸ガスとに分類することにより進行するといわれており、この細胞膜に存在する糖の透過酵素が該酵母の場合特に低温下で活性が低下する、細胞質内に存在する解糖系の酵素の一部又は全部が該酵母の場合低温下で活性が低下する、温度により特異的に誘導されるタンパク（ヒートショックプロテイン）によって該酵母の場合発酵が阻害される、その他、呼吸能が特に低温下で抑制されることによって発酵が遅れる、などが考えられる。
【００４３】
なお、一般的には低温感受性(LOW TEMPERATURE SENSITIVE:LTS)という遺伝子がサッカロミセス属に存在することは公知ではあるが、これは低温下や高温下での「増殖」が抑制されたり死滅する現象に関するものであり、低温下での「発酵」が抑制される現象とは異なっている。
【００４４】
以下、本願発明の酵母を取得する方法について述べる。
【００４５】
まず、低温感受性酵母の取得法について述べる。
【００４６】
上記酵母は、自然界からのスクリーニング、ニトロソグアニジン、エチルメタンスルホネート、紫外線照射等の変異処理、交雑や細胞融合などによる育種操作によって得ることができる。ここでは、変異処理して、目的とする酵母を取得する方法を開示するが、本発明の酵母の取得方法がこの方法に限られないことはいうまでもない。
【００４７】
また、１段階の変異処理だけでは、不十分な場合は、変異処理を繰り返す方法、胞子を取得して戻し交雑する方法、細胞融合させる方法などを併用することも可能である。詳細については、後記する。
【００４８】
（Ａ）酵母の変異方法
ここでは、エチルメタンスルフォネート（以下、ＥＭＳと記す）による変異法を説明する。使用する培地は以下の通りである。
【００４９】
まず、親株のスラントから、１白金耳、ＹＰＤ培地 ５ｍｌに植菌し、３０℃、１６時間振盪培養する。培養終了後、3000rpm、10分で遠心分離して集菌し、0.1M、pH7.0のリン酸バッファーで１回洗浄する。菌体を同じリン酸バッファー５ｍｌに懸濁し、ＥＭＳを０．１５ｍｌ添加し、３０℃、２時間、時々攪拌しながら処理し、３０００ｒｐｍ、１０分の遠心分離で集菌し、リン酸バッファーで洗浄後、20%Na2S2O3を5ml加えて３０℃、１０分静置してＥＭＳを分解する。20%Na2S2O3処理を２回行い、生理食塩水５ｍｌで３回洗浄し、生理食塩水５ｍｌに懸濁し、上記組成のＹＰＤ寒天プレートに適宜希釈して菌を塗布する。
【００５０】
（Ｂ）低温感受性酵母のスクリーニング
B-1.１次スクリーニング：マイクロプレート法
ブロムクレゾールパープル（BCP）を用い、高ｐＨでは青紫色、低ｐＨでは黄色になるBCPの性質を利用して発酵力をスクリーニングする方法である。
【００５１】
ＹＰＤ寒天プレートで生育した株を、１白金耳、ＹＰＤ培地200μlが入ったマイクロプレートに植菌し、３０℃、１６時間静置培養する。マイクロプレートの各ウエルにＢＣＰ含有ＹＰＤ培地（上記ＹＰＤ培地にブロムクレゾールパープル(BCP)30mg加えたもの）200μlを注入し、このマイクロプレート各2枚に、この培養ブロスを20μｌずつそれぞれ移植し、それぞれ１０℃、および３０℃で５時間静置培養する。３０℃培養区で生育が良く菌量が多く、よく発酵するためブロスのｐＨが下がり色が黄変し、かつ１０℃培養区で生育は良いが発酵が抑制されるためブロスのｐＨが下がらず色が黄変していない株を選択する。
【００５２】
B-2.２次スクリーニング：マイセル法：
２次スクリーニングはマイセル発酵の前後の重量差が大きい株を選択する方法である。使用する培地は以下の通りである。
【００５３】
糖蜜培地 マイセル液
糖蜜（糖として） ３０ｇ グルコース ８０ｇ
硫安 ５ｇ （ＮＨ4 ）2 ＨＰＯ4 ５ｇ
燐安 ３ｇ ＫＨ2 ＰＯ4 ５ｇ
尿素 ２ｇ 水 １０００ｍｌ
水 １０００ｍｌ
１次スクリーニングで得られた株を糖蜜培地５ｍｌに１白金耳植菌して、３０℃、２４時間振盪培養する。この培養液５ｍｌを糖蜜培地５０ｍｌに移植し、さらに３０℃、２４時間振盪培養する。培養後、2本のフラスコから、培養液を併せて８０ｍｌとり、３０００ｒｐｍ、１０分遠心分離して集菌し、滅菌水で１回洗浄する。100mlのマイセル液に懸濁し、それぞれ５０ｍｌを、１０℃で１５時間、および３０℃で５時間培養した。マイセル発酵の前後の重量差をもってマイセル発酵力とし、３０℃で良く発酵しており、かつ１０℃で発酵力が低い株を選択する。
【００５４】
なお、本願発明の目的である、低温下で発酵力が抑制される酵母を取得する観点からは、変異処理した酵母を、増殖する酵母を死滅させる薬剤を含有するＹＰＤ培地に接種し、低温下で嫌気状態で培養する工程を加えることが、より効果的である。低温で増殖する菌体が死滅するので、スクリーニングの効率はさらに向上するからである。増殖する酵母を死滅させる薬剤としては、例えば、ナイスタチン、アンホテリシンＢ、シクロヘキシミドなどが挙げられるが、比較的低濃度で増殖細胞死滅効果のある薬剤であればいずれでもよい。薬剤の培地中の濃度は、ナイスタチンの場合１０μｇ／ｍｌ〜５０μｇ／ｍｌ、アンホテリシンＢの場合、１００μｇ／ｍｌ〜５００μｇ／ｍｌ、シクロヘキシミドの場合、１０００μｇ／ｍｌ〜５０００μｇ／ｍｌが適当である。
【００５５】
次に、インベルターゼ比活性の低い株のスクリーニング、育種について述べる。
【００５６】
インベルターゼ比活性の低い株の取得方法としては、一つは低温感受性株取得のための親株を選定する前により多くの菌株についてインベルターゼ活性を測定し、所望の範囲の比活性を持つ株を用いて低温感受性株の変異スクリーニング等を行うことが挙げられる。また、インベルターゼ比活性の低い胞子株を単離し、上記方法で得られた低温感受性株の胞子株と交雑株を形成させ、その胞子株を単離し、所望のインベルターゼ比活性の範囲内にある酵母を選択する等の方法を挙げることができるが、その方法については、スクリーニング、変異、交雑、細胞融合等いずれの方法を用いてもよく特に制限はない。
【００５７】
以上の方法で得られた酵母について、各種発酵力、冷蔵耐性、冷凍耐性、製パン性等の評価を行う。評価に使用する菌体は、以下の方法で調製し得る。
【００５８】
培地１００ｍｌを５００ｍｌ容坂口フラスコに分注、殺菌し、新鮮なスラントから１白金耳移植し、３０℃、２４時間振盪培養する。
【００５９】
第２種母：
第１種母と同じ培地１Ｌを５Ｌ容三角フラスコに分注、殺菌後、第１種母を全量植菌し、３０℃、２４時間振盪培養する。
【００６０】
１０Ｌ容ミニジャーファーメンターに培地１Ｌを加えて殺菌し、第２種母全量を加えて２Ｌとする。３０〜３５℃、ｐＨ４〜５（安水でコントロール）、３００ｒｐｍで攪拌しつつ、２ＮＬ／分通気して、１２時間培養する。
【００６１】
本培養：
培地組成：糖蜜（糖として） ３５０ ｇ 流加方式で添加する。
【００６２】
硫安 ４ ｇ
燐安 １ ｇ
尿素 ２．５ ｇ
１０Ｌ容ミニジャーファーメンターに培地１．３Ｌを加えて殺菌し、種培養液７００ｍｌを加えて２Ｌとする。３０〜３５℃、ｐＨ４〜５（安水でコントロール）、３００ｒｐｍで攪拌しつつ、２ＮＬ／分通気して、１０時間培養する。
【００６３】
上記培養ブロスを分離・水洗・濾過して、生菌体を得る。
【００６４】
上記に本発明の酵母のスクリーニング、育種法等について述べたが、低温感受性株の取得過程では１段階の変異処理だけでは、低温下での発酵力は抑制されても３０℃の発酵力も低下傾向にある。また、低インベルターゼ比活性株の取得では、低インベルターゼ比活性株との交雑株からの胞子株の単離という一回の操作では十分に所望の活性の株の取得ができない場合がある。このような場合には、次に挙げるような方法も実施し得る。
【００６５】
即ち、低温感受性株取得の場合には、変異処理を１回以上繰り返す方法、少なくとも１回の変異処理で得られた低温下で発酵が抑制される低温感受性変異株の胞子株と野生の２倍体である酵母の胞子株とを少なくとも１回戻し交雑させる方法、この低温感受性変異株と野生の２倍体である酵母とを少なくとも１回戻し細胞融合させる方法などである。
【００６６】
低インベルターゼ比活性株を取得する場合には、一回の交雑で得られた交雑株の胞子株と低インベルターゼ比活性株との交雑と、その胞子単離を１回以上行うなどの方法である。
【００６７】
なお、戻し交雑とは、変異株と野生株の胞子株を分離し、互いに異なる性をもった胞子株同志を交雑させて交雑株をとり、さらに交雑株から胞子株をとり、野生株の胞子株と交雑を行う操作を１回以上行うことである。これを行うことによって低温感受性（発酵に関する）の遺伝子と、野生株の優秀な発酵力の遺伝子を合わせ持つ菌株を取得することができる。
【００６８】
このように胞子株を取得できれば上述のような戻し交雑法が可能であるが、もし取得した変異株や野生株が胞子形成能が極端に低かったり、胞子出芽率が極端に低いため胞子株の取得が困難な場合は細胞融合法を用いればよい。常法に従ってマーカーをつけてもよいし、融合の頻度が高ければマーカーをつけなくとも融合は可能である。なお、マーカーについては例えば特開昭６３−２９４７７８に記載されているリジン要求株と呼吸欠損株との組み合わせが挙げられる。
【００６９】
【実施例】
次に実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明は何等実施例により制限されるものではない。
【００７０】
（実施例１）
商品名カネカレッドイースト（鐘淵化学工業株式会社製）の菌株をFowellプレート（酢酸ナトリウム 0.4%、寒天2%、pH6.7）に塗布し、28℃、2日間培養して胞子を形成させ、得られた胞子株Ｒ−６Ｒを親株として、前記（Ａ）のＥＭＳ法による変異を行い、前記（Ｂ）のスクリーニングを行った結果、低温感受性のサッカロミセス・セレビシエＲ−６１８０−１を得た。
【００７１】
次に、この株に、商品名カネカレッドイーストから分離した多数の胞子株からスクリーニングされたインベルターゼ比活性の非常に低い株サッカロミセス・セレビシエＲ−１３Ｒを交雑させ、胞子を形成させ、生命工学工業技術研究所に寄託されている、インベルターゼ比活性が低く、低温感受性の胞子株サッカロミセス・セレビシエＲ−９１５２（ＦＥＲＭ Ｐ−１４６７５）、サッカロミセス・セレビシエＲ−９１５５（ＦＥＲＭ Ｐ−１４６７６）、およびサッカロミセス・セレビシエＲ−９１５６（ＦＥＲＭ Ｐ−１４６７７）を取得した。
【００７２】
これらの株のジャー培養を行い、インベルターゼ比活性、５℃高糖生地発酵力、３０℃高糖生地発酵力、３０℃復温高糖生地発酵力を測定すると共に、下記に示す方法で通常の加糖中種法菓子パンとストレート法菓子パンを通常の方法と冷蔵工程を経る方法の２つの方法で作製し、なたね置換法による比容積、パンの外観、内相の評価を行い、上記株の評価を行った。
【００７３】
なお、冷蔵貯蔵なしの通常のストレート法の製パンは、下記工程のうち冷蔵貯蔵工程なしとし、それ以外は同様の条件で製パンを行った。
【００７４】
加糖中種法菓子パンの配合及び工程：配合の数字は重量部を表す。
【００７５】
ストレート法による菓子パンの配合および工程：配合の数字は重量部を表す。
結果を表１、２、３及び４に示す。
【００７６】
【表１】
【００７７】
【表２】
【００７８】
【表３】
【００７９】
【表４】
【００８０】
表に示したように、本発明の酵母は、通常のイーストに比較して通常の中種法、ストレート法菓子パンでも良好なパンが得られ、また、冷蔵中の生地の膨張もなく冷蔵保存にともなう比容積の低下、外観、内相の劣化が少なく、菓子パン生地においても、冷蔵生地法において長期に良好なパンが得られることがわかる。
【００８１】
（実施例２）
実施例１と同様の方法で、インベルターゼ比活性が低く、低温感受性であり、かつ冷凍耐性であるサッカロミセス・セレビシエＲ−９１５６（ＦＥＲＭ Ｐ−１４６７７）、サッカロミセス・セレビシエＲ−９１６０（ＦＥＲＭ Ｐ−１４６７８）、およびサッカロミセス・セレビシエＲ−９１９４（ＦＥＲＭ Ｐ−１４６７９）を取得した。
【００８２】
これらの株を実施例１と同様にジャー培養を行い、インベルターゼ比活性、５℃高糖生地発酵力、３０℃高糖生地発酵力、３０℃復温高糖生地発酵力、−２０℃、１週間冷凍後の復温高糖生地発酵力を測定し、さらに、以下に示す方法で冷凍生地菓子パンを作製し、上記株の冷凍耐性を評価した。
【００８３】
配合：配合の数字は重量部を表す。
【００８４】
強力粉 ９０
薄力粉 １０
砂糖 ３０
食塩 １
油脂 ８
イースト ４
脱粉 ２
全卵 １０
イーストフード ０．１
水 ５０
なお、冷凍しない場合は、上記工程のうち、冷凍、解凍工程なしとし、それ以外は同様の条件で製パンを行った。
【００８５】
結果を表５、６および７に示す。
【００８６】
【表５】
【００８７】
【表６】
【００８８】
【表７】
【００８９】
表に示したように、本発明の酵母は、通常のイーストに比較して、冷凍保存にともなう比容積の低下、外観、内相の劣化が少なく、菓子パン生地においても、冷凍生地法において長期に良好なパンが得られることがわかる。
【００９０】
【発明の効果】
本発明の酵母を用いることにより、糖濃度の高い菓子パン等のリッチなパンにおいて、中種法、ストレート法、どちらにおいても従来の酵母に比べて良好なパンが得られる。さらに、この良好な性質を低温感受性株に導入することにより、冷蔵生地法、リタード法および冷凍生地法において、発酵が抑制され、生地膨張が少なく、冷蔵、冷凍後でも発酵力が低下せずに、良好なパンを得ることができる。特に、糖濃度が高いリッチなパン製法においても、従来不可能であった長期安定的に冷蔵、冷凍生地法において良好なパンが提供される。
【産業上の利用分野】
本発明は新規酵母、該酵母を含有するパン生地および該生地の製造方法に関する。更に詳しくは、製パン上、とりわけリタード工程を含むデニッシュやクロワッサンなどのペーストリー、糖濃度の高い菓子パン、さらに全ての種類のパンにおける冷蔵生地あるいは冷凍生地に有用な新規酵母及びこの酵母を含有するパン生地および該パン生地の製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来から、糖濃度が２５％以上の菓子パン生地においても、高い発酵力を示し良好な菓子パンを製造できるパン酵母が望まれており、浸透圧耐性の高い酵母のスクリーニングあるいは酵母のインベルターゼ比活性等について検討が行われている。しかしながら、後者のインベルターゼ比活性と菓子パン生地での発酵力との関係について、十分な検討はなされておらず、特に菓子パン生地のような高糖生地での冷蔵、冷凍後の発酵力に対するインベルターゼ比活性の関与に関してはほとんど研究されていないのが現状である。そのため、インベルターゼ比活性に注目した発明は、特開昭６１−２３１９９３、特開平３−８００７３に開示されているインベルターゼ比活性の全くないかあるいはほとんどないパン酵母に関するもののみである。しかしながら、これらの発明はフラクトオリゴ糖入りパンに使用することを目的に育種されたフラクトオリゴ糖非資化性酵母に関するものである。そのため、これらの酵母は砂糖を多量に添加する菓子パンのような高糖生地での発酵力が十分でなく、良好な菓子パンを製造するための酵母としては、実用性が十分ではないという欠点をもっている。
【０００３】
このような状況から、現在までインベルターゼ比活性が生地中の砂糖を分解するのに十分な量以上あるが、その比活性がかなり低く高糖生地の発酵力が高い酵母は開発されていないのが現状である。
【０００４】
また、最近の製パン業界では、省力化による工程の合理化と、その反面、多様な消費者ニーズにこたえるための品種のバラエティー化との両方のニーズに応えるため、冷凍生地法が盛んに行われるようになってきた。さらには、生地を冷凍させないで冷蔵状態で保管すると同時に生地の熟成を図る所謂冷蔵生地法も盛んに検討されるようになってきた。しかしながら、従来のパン酵母の場合は生地を低温に冷却しても発酵速度は常温の場合よりも遅くはなるものの発酵が進むため、冷蔵生地での保管はせいぜい１日程度であり、このため一部実用化はされてはいるものの広く応用されるまでには至っていないのが実状である。
【０００５】
デニッシュやクロワッサンなどのペーストリーの製造では、ロールインマーガリンをきれいに層状に折り込むため生地を低温処理するいわゆる「リタード法」がとりいれられている。しかしながら、このリタード工程における若干の生地発酵のために、ロールインマーガリンがきれいに折り込まれず、できたパンの層がきれいにならなかったり、生地の冷蔵保管が事実上できないため、成形残の生地の活用ができず、製パン工程の歩留りの低下を招いている。
【０００６】
このような課題を解決すべく、特開平5-76348、特開平5-284896、および特開平5-336872には、冷蔵中には発酵せず、一定温度以上では発酵する酵母（低温感受性酵母）が開示されているが、冷蔵保存後の発酵力（本明細書の復温発酵力に相当する）が、冷蔵前に比べて60％程度である。従って、冷蔵生地を用いてパンを作製した場合、発酵力が不足するためボリュームのある良質なパンが製造できないという欠点がある。
【０００７】
さらに、低温感受性酵母の復温発酵力の低下は、生地中の糖濃度が高くなると一般により顕著になり、対粉当りの糖の添加量が２５％以上の菓子パン生地のような高糖生地で冷蔵後の発酵力が、冷蔵前と同等の発酵力を有する低温感受性酵母は、未だ開発されていないのが現状である。
【０００８】
冷凍生地法においても、生地ミキシング後、冷凍過程において若干の発酵（所謂冷凍前発酵）が起こり、エチルアルコールが生地に生成することによって酵母の冷凍耐性が低下したり、流通過程における冷凍庫の開閉など保管条件の不良による温度上昇のため、せっかく冷凍した生地でも昇温による一部解凍が起こり品質が低下する、などの問題があった。そして冷凍前発酵を抑えるため、冷凍生地の製造ではミキシング温度を極端に低く押さえるべく冷蔵庫のような低温下でミキシングを行い、かつ急速冷凍をするためスパイラル急速冷凍機を使用するなど膨大なエネルギーを必要としているのが実状である。
【０００９】
このような課題を解決すべく、特開平４−２３４９３９では、低温感受性かつ冷凍耐性の性質を有するパン酵母が提供されているが、そのパン酵母はもともと一般のパン酵母に較べると発酵力がかなり弱いものであり、実用性という面で問題がある。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
従って、通常の中種法、ストレート法菓子パン生地で十分に発酵するパン酵母が望まれていた。
【００１１】
また、生地を冷凍させないで冷蔵状態でも流通が可能な冷蔵生地法や、リタード工程における生地膨張が従来のパン酵母に比べて少なく、商品価値が高く、かつ残生地も活用でき製品歩留りの高いペーストリー商品の製造を可能とする新規酵母、該酵母を含有するパン生地、および該生地の製造方法を提供することが望まれていた。
【００１２】
さらに、冷蔵保存後でも発酵力が低下せず、また高糖生地を冷蔵保存した場合でも復温発酵力が高い酵母を提供することが望まれていた。
【００１３】
また、冷凍生地法においては、生地の冷凍過程で速やかに発酵が抑制されることにより冷凍耐性が向上し、冷凍流通過程での保管条件による昇温に対しても耐性のある冷凍生地の製造を可能とする新規酵母及びこれを含有する冷凍生地が望まれていた。
【００１４】
【課題を解決するための手段】
本発明は、上記問題点を解決すべくなされたものであり、その目的とするところは、高糖生地発酵力が非常に高く、通常の中種法、ストレート法で良好な菓子パンが得られ、さらに、冷蔵耐性および／または冷凍耐性を有し、冷蔵、冷凍保存後の発酵力の減少が少なく、高糖生地での冷蔵保存にも耐性な酵母を提供することにある。
【００１５】
本発明者らは、自然界から、あるいは保存菌株からのスクリーニング又は変異処理や交雑や細胞融合などによる育種操作によって得られた菌株を用いて幅広く酵母のスクリーニングを行った結果、低温下で発酵が非常に抑制される酵母であり、インベルターゼ比活性が生地中の砂糖を分解するには十分であるが、その比活性がかなり低く、高糖生地発酵の高い酵母を分離した。そして、さらにこれらの酵母から、スクリーニング、および育種を重ねた結果、目的とする菌株を得ることに成功し、本発明を完成させた。
【００１６】
本発明は、サッカロミセス属に属し、以下の性質：
（１）インベルターゼ比活性が１０ユニット以上、１５０ユニット以下、および、
（２）高糖生地での３０℃、１１５分の発酵力が３５０ｍｌ以上である、
を有する酵母に関する。
【００１７】
好適な実施態様においては、本発明の酵母は、さらに以下の性質：
（３）高糖生地での５℃、２４時間の発酵力が１０ｍｌ以下、および、
（４）３０℃の復温高糖生地発酵力が、３０℃、１１５分の高糖生地発酵力の９０％以上である、を有する。
【００１８】
好適な実施態様においては、本発明の酵母は、さらに以下の性質：
（５）−２０℃、１週間冷凍保存後の３０℃での復温高糖生地発酵力が、３０℃、１１５分の高糖生地発酵力の９０％以上である、という性質を有する。
【００１９】
上記性質を有する酵母として、以下の酵母：
サッカロミセス・セレビシエＲ−９１５２（ＦＥＲＭ Ｐ−１４６７５）、
サッカロミセス・セレビシエＲ−９１５５（ＦＥＲＭ Ｐ−１４６７６）、
サッカロミセス・セレビシエＲ−９１５６（ＦＥＲＭ Ｐ−１４６７７）、
サッカロミセス・セレビシエＲ−９１６０（ＦＥＲＭ Ｐ−１４６７８）、または、
サッカロミセス・セレビシエＲ−９１９４（ＦＥＲＭ Ｐ−１４６７９）が挙げられる。
【００２０】
上記酵母は、通常の菓子パン生地、冷蔵および／または冷凍パン生地に好適に用いられ得る。
【００２１】
本発明は、さらに、上記に記載の酵母を少なくとも１種を含有するパン生地に関し、好適な実施態様においては、パン生地は、通常の菓子パン生地、冷蔵パン生地あるいは冷凍パン生地である。
【００２２】
また、本発明は、上記に記載の酵母を少なくとも１種を含有するパン生地の製造方法に関し、好適な実施態様においては、通常の菓子パン生地、冷蔵パン生地あるいは冷凍パン生地の製造方法である。
【００２３】
高糖生地発酵力が高く、冷蔵、冷凍後にも発酵力が高い本願発明の酵母を用いることにより、本願発明の目的である良好な菓子パンの製造及び長時間保存のできる冷蔵生地や、品質がよく歩留りの高いリタード法でのペーストリー、さらには冷凍耐性の高い冷凍生地の製造が可能になる。また、冷蔵生地法による高糖生地を用いる菓子パンの製造が可能になる。従って、本発明の目的が達成される。以下に、本発明を具体的に説明する。
【００２４】
本発明の酵母は、少なくとも以下の性質：
（１）インベルターゼ比活性が１０ユニット以上、１５０ユニット以下、および、
（２）高糖生地での３０℃、１１５分の発酵力が３５０ｍｌ以上である、
を有する。
【００２５】
インベルターゼ比活性が、１０ユニットより低いと、生地中の砂糖を十分に分解できないために十分な発酵力が得られず、１５０ユニットより高いと、高糖生地での砂糖の分解速度が速くなり生地の浸透圧が高くなる。その結果、発酵が阻害され、十分な高糖生地発酵力が得られない。また１５０ユニットより高いと、高糖生地の冷蔵中に砂糖がより速く分解されるため浸透圧が上昇し、復温発酵力が低下するという欠点も生じる。このような点から、インベルターゼ比活性は１５０ユニット以下であることが好ましい。
【００２６】
本発明の酵母は、さらに、高糖生地での３０℃、１１５分の発酵力が３５０ｍｌ以上であるという性質を有する。このような性質を有する酵母は、低温下での耐性が付与され、かつ、パン製造時に発酵力が十分に保持されているため、本発明の目的を達成し得る。
【００２７】
本発明の酵母は、さらに以下の性質：
（３）高糖生地での５℃、２４時間の発酵力が１０ｍｌ以下、および、
（４）３０℃の復温高糖生地発酵力が、３０℃、１１５分の高糖生地発酵力の９０％以上である、を有し得る。
【００２８】
高糖生地での５℃、２４時間の発酵力が１０ｍｌ以下であることにより、冷蔵中の生地の膨張もほとんどなく、リタード法等での生地の成型がしやすく、残生地の再利用が可能になる。また、３０℃の復温高糖生地発酵力が、３０℃、１１５分の高糖生地発酵力の９０％以上であることにより、冷蔵後も十分な発酵力が維持され、冷蔵生地法によってボリュームのある良好なパンを得ることができる。
【００２９】
本発明の酵母は、さらに以下の性質：
（５）−２０℃、１週間冷凍保存後の３０℃での復温高糖生地発酵力が、３０℃、１１５分の高糖生地発酵力の９０％以上である、という性質を有し得る。
【００３０】
前記（３）の性質にさらに（５）の性質が付与されることにより、特に冷凍耐性が高められ、冷凍生地法においてもボリュームのある良好なパンを得ることができる。
【００３１】
上記性質を有する酵母の具体例として、以下の酵母：
サッカロミセス・セレビシエＲ−９１５２（ＦＥＲＭ Ｐ−１４６７５）、
サッカロミセス・セレビシエＲ−９１５５（ＦＥＲＭ Ｐ−１４６７６）、
サッカロミセス・セレビシエＲ−９１５６（ＦＥＲＭ Ｐ−１４６７７）、
サッカロミセス・セレビシエＲ−９１６０（ＦＥＲＭ Ｐ−１４６７８）、または、
サッカロミセス・セレビシエＲ−９１９４（ＦＥＲＭ Ｐ−１４６７９）が挙げられる。
【００３２】
本発明の酵母の性質の測定は、以下のようにして行い得る。
【００３３】
インベルターゼ比活性は、乾燥重量として１ｇの菌体が１分間にスクロースより生成するグルコースの２倍量（ｍｇ）と定義する。
【００３４】
具体的には、乾物重量として約５０ｍｇの酵母菌体を５ｍｌの０．１Ｍ酢酸バッファー（ｐＨ５．０）に懸濁し、その０．２ｍｌを０．１Ｍ酢酸バッファーｐＨ５．０ ０．８ｍｌに加え、さらに１ｍｌの１５（Ｗ／Ｖ）％スクロースバッファー溶液を加えて３０℃、１０分間反応させる。１ｍｌの１N NaOHを加えて反応を停止し、１N HClを１ｍｌ加えて中和し、遠心分離（3000rpm、５分）して菌体を除き、上澄のグルコース濃度をグルコスタット法（商品名：グルコースＢ−テストワコー：和光純薬製）で測定する。測定する酵母の濃度はインベルターゼ比活性の高低により適宜希釈し、グルコスタット法による測定において吸光度に直線性のある範囲で測定を行う。
【００３５】
なお、酵母の乾燥重量は酵母菌体を１０５℃、５時間乾燥した後の重量と定義する。
【００３６】
各種高糖生地での発酵力は、イースト工業会で定められた高糖生地発酵力に準じて以下のようにして測定した。
【００３７】
（５℃高糖生地発酵力）
以下の原料配合：
小麦粉 １００ ｇ
酵母 ３ ｇ
庶糖 ３０ ｇ
食塩 ０．５ ｇ
水 ５２ ｍｌ
を有する生地を捏上温度が２０±１℃になるようにミキシングを行い、生地をシリンダーにいれてあらかじめスタート時の生地量を測定し、５℃、２４時間発酵させた後の生地量とスタート時の生地量との差を、５℃高糖生地発酵力とした。
（３０℃高糖生地発酵力）
上記原料配合により、生地を捏上温度が３０±１℃になるようにミキシングを行い、生地をシリンダーにいれてあらかじめスタート時の生地量を測定し、３０℃、１１５分発酵させた後の生地量とスタート時の生地量との差を３０℃高糖生地発酵力とする。
【００３８】
（３０℃復温高糖生地発酵力）
復温発酵力は、５℃高糖生地発酵力測定と同様に調製した高糖生地を５℃、２４時間発酵させた後、３０℃に復温させて測定する。復温後、３０℃、１１５分の発酵力をもって、３０℃復温高糖生地発酵力とする。
【００３９】
（冷凍１週間後の復温高糖生地発酵力）
冷凍後復温発酵力は、３０℃高糖生地発酵力測定と同様に調製した高糖生地を３０℃で１時間発酵しガス抜きし、−２０℃で１週間冷凍後３０℃に復温させて測定する。復温後、３０℃、１１５分の発酵力をもって冷凍１週間後の復温高糖生地発酵力とする。
【００４０】
本発明のパン生地は、上記性質を有する酵母を１種または２種以上含有する。パン生地は、好適には、菓子パン生地のような高糖生地、冷蔵生地、冷凍生地である。本発明のパン生地は、ペストリーあるいは菓子パン用の生地、例えば、デニッシュ、クロワッサンをはじめ、食パン、バターロール、中華まんじゅう、イーストドーナツ等、膨張剤としてパン酵母を使用するものすべてを含む。
【００４１】
本発明は、さらに、上記のパン生地の製造方法に関するものである。パン生地の成分の配合は、当業者に公知の各パン生地に応じた配合が適用され得る。
【００４２】
本発明の酵母を用いることにより、高糖生地発酵力が上昇し、冷蔵、冷凍後の高糖生地発酵力が高くなる理由は、インベルターゼ比活性が生地中の砂糖を分解するには十分であるが、かなり低い酵母をスクリーニング、育種した効果が大であると考えられる。また、低温下で発酵力が抑制される理由については明らかではないが、酵母の発酵は細胞外の糖類（グルコースやフルクトース、シュクロースなど）を細胞膜に存在する糖の透過酵素（パーミアーゼ）により酵母の細胞内に輸送し、輸送された糖類を解糖系の酵素によりエチルアルコールと炭酸ガスとに分類することにより進行するといわれており、この細胞膜に存在する糖の透過酵素が該酵母の場合特に低温下で活性が低下する、細胞質内に存在する解糖系の酵素の一部又は全部が該酵母の場合低温下で活性が低下する、温度により特異的に誘導されるタンパク（ヒートショックプロテイン）によって該酵母の場合発酵が阻害される、その他、呼吸能が特に低温下で抑制されることによって発酵が遅れる、などが考えられる。
【００４３】
なお、一般的には低温感受性(LOW TEMPERATURE SENSITIVE:LTS)という遺伝子がサッカロミセス属に存在することは公知ではあるが、これは低温下や高温下での「増殖」が抑制されたり死滅する現象に関するものであり、低温下での「発酵」が抑制される現象とは異なっている。
【００４４】
以下、本願発明の酵母を取得する方法について述べる。
【００４５】
まず、低温感受性酵母の取得法について述べる。
【００４６】
上記酵母は、自然界からのスクリーニング、ニトロソグアニジン、エチルメタンスルホネート、紫外線照射等の変異処理、交雑や細胞融合などによる育種操作によって得ることができる。ここでは、変異処理して、目的とする酵母を取得する方法を開示するが、本発明の酵母の取得方法がこの方法に限られないことはいうまでもない。
【００４７】
また、１段階の変異処理だけでは、不十分な場合は、変異処理を繰り返す方法、胞子を取得して戻し交雑する方法、細胞融合させる方法などを併用することも可能である。詳細については、後記する。
【００４８】
（Ａ）酵母の変異方法
ここでは、エチルメタンスルフォネート（以下、ＥＭＳと記す）による変異法を説明する。使用する培地は以下の通りである。
【００４９】
【００５０】
（Ｂ）低温感受性酵母のスクリーニング
B-1.１次スクリーニング：マイクロプレート法
ブロムクレゾールパープル（BCP）を用い、高ｐＨでは青紫色、低ｐＨでは黄色になるBCPの性質を利用して発酵力をスクリーニングする方法である。
【００５１】
ＹＰＤ寒天プレートで生育した株を、１白金耳、ＹＰＤ培地200μlが入ったマイクロプレートに植菌し、３０℃、１６時間静置培養する。マイクロプレートの各ウエルにＢＣＰ含有ＹＰＤ培地（上記ＹＰＤ培地にブロムクレゾールパープル(BCP)30mg加えたもの）200μlを注入し、このマイクロプレート各2枚に、この培養ブロスを20μｌずつそれぞれ移植し、それぞれ１０℃、および３０℃で５時間静置培養する。３０℃培養区で生育が良く菌量が多く、よく発酵するためブロスのｐＨが下がり色が黄変し、かつ１０℃培養区で生育は良いが発酵が抑制されるためブロスのｐＨが下がらず色が黄変していない株を選択する。
【００５２】
B-2.２次スクリーニング：マイセル法：
２次スクリーニングはマイセル発酵の前後の重量差が大きい株を選択する方法である。使用する培地は以下の通りである。
【００５３】
糖蜜培地 マイセル液
糖蜜（糖として） ３０ｇ グルコース ８０ｇ
硫安 ５ｇ （ＮＨ4 ）2 ＨＰＯ4 ５ｇ
燐安 ３ｇ ＫＨ2 ＰＯ4 ５ｇ
尿素 ２ｇ 水 １０００ｍｌ
水 １０００ｍｌ
１次スクリーニングで得られた株を糖蜜培地５ｍｌに１白金耳植菌して、３０℃、２４時間振盪培養する。この培養液５ｍｌを糖蜜培地５０ｍｌに移植し、さらに３０℃、２４時間振盪培養する。培養後、2本のフラスコから、培養液を併せて８０ｍｌとり、３０００ｒｐｍ、１０分遠心分離して集菌し、滅菌水で１回洗浄する。100mlのマイセル液に懸濁し、それぞれ５０ｍｌを、１０℃で１５時間、および３０℃で５時間培養した。マイセル発酵の前後の重量差をもってマイセル発酵力とし、３０℃で良く発酵しており、かつ１０℃で発酵力が低い株を選択する。
【００５４】
なお、本願発明の目的である、低温下で発酵力が抑制される酵母を取得する観点からは、変異処理した酵母を、増殖する酵母を死滅させる薬剤を含有するＹＰＤ培地に接種し、低温下で嫌気状態で培養する工程を加えることが、より効果的である。低温で増殖する菌体が死滅するので、スクリーニングの効率はさらに向上するからである。増殖する酵母を死滅させる薬剤としては、例えば、ナイスタチン、アンホテリシンＢ、シクロヘキシミドなどが挙げられるが、比較的低濃度で増殖細胞死滅効果のある薬剤であればいずれでもよい。薬剤の培地中の濃度は、ナイスタチンの場合１０μｇ／ｍｌ〜５０μｇ／ｍｌ、アンホテリシンＢの場合、１００μｇ／ｍｌ〜５００μｇ／ｍｌ、シクロヘキシミドの場合、１０００μｇ／ｍｌ〜５０００μｇ／ｍｌが適当である。
【００５５】
次に、インベルターゼ比活性の低い株のスクリーニング、育種について述べる。
【００５６】
インベルターゼ比活性の低い株の取得方法としては、一つは低温感受性株取得のための親株を選定する前により多くの菌株についてインベルターゼ活性を測定し、所望の範囲の比活性を持つ株を用いて低温感受性株の変異スクリーニング等を行うことが挙げられる。また、インベルターゼ比活性の低い胞子株を単離し、上記方法で得られた低温感受性株の胞子株と交雑株を形成させ、その胞子株を単離し、所望のインベルターゼ比活性の範囲内にある酵母を選択する等の方法を挙げることができるが、その方法については、スクリーニング、変異、交雑、細胞融合等いずれの方法を用いてもよく特に制限はない。
【００５７】
以上の方法で得られた酵母について、各種発酵力、冷蔵耐性、冷凍耐性、製パン性等の評価を行う。評価に使用する菌体は、以下の方法で調製し得る。
【００５８】
【００５９】
第２種母：
第１種母と同じ培地１Ｌを５Ｌ容三角フラスコに分注、殺菌後、第１種母を全量植菌し、３０℃、２４時間振盪培養する。
【００６０】
【００６１】
本培養：
培地組成：糖蜜（糖として） ３５０ ｇ 流加方式で添加する。
【００６２】
硫安 ４ ｇ
燐安 １ ｇ
尿素 ２．５ ｇ
１０Ｌ容ミニジャーファーメンターに培地１．３Ｌを加えて殺菌し、種培養液７００ｍｌを加えて２Ｌとする。３０〜３５℃、ｐＨ４〜５（安水でコントロール）、３００ｒｐｍで攪拌しつつ、２ＮＬ／分通気して、１０時間培養する。
【００６３】
上記培養ブロスを分離・水洗・濾過して、生菌体を得る。
【００６４】
上記に本発明の酵母のスクリーニング、育種法等について述べたが、低温感受性株の取得過程では１段階の変異処理だけでは、低温下での発酵力は抑制されても３０℃の発酵力も低下傾向にある。また、低インベルターゼ比活性株の取得では、低インベルターゼ比活性株との交雑株からの胞子株の単離という一回の操作では十分に所望の活性の株の取得ができない場合がある。このような場合には、次に挙げるような方法も実施し得る。
【００６５】
即ち、低温感受性株取得の場合には、変異処理を１回以上繰り返す方法、少なくとも１回の変異処理で得られた低温下で発酵が抑制される低温感受性変異株の胞子株と野生の２倍体である酵母の胞子株とを少なくとも１回戻し交雑させる方法、この低温感受性変異株と野生の２倍体である酵母とを少なくとも１回戻し細胞融合させる方法などである。
【００６６】
低インベルターゼ比活性株を取得する場合には、一回の交雑で得られた交雑株の胞子株と低インベルターゼ比活性株との交雑と、その胞子単離を１回以上行うなどの方法である。
【００６７】
なお、戻し交雑とは、変異株と野生株の胞子株を分離し、互いに異なる性をもった胞子株同志を交雑させて交雑株をとり、さらに交雑株から胞子株をとり、野生株の胞子株と交雑を行う操作を１回以上行うことである。これを行うことによって低温感受性（発酵に関する）の遺伝子と、野生株の優秀な発酵力の遺伝子を合わせ持つ菌株を取得することができる。
【００６８】
このように胞子株を取得できれば上述のような戻し交雑法が可能であるが、もし取得した変異株や野生株が胞子形成能が極端に低かったり、胞子出芽率が極端に低いため胞子株の取得が困難な場合は細胞融合法を用いればよい。常法に従ってマーカーをつけてもよいし、融合の頻度が高ければマーカーをつけなくとも融合は可能である。なお、マーカーについては例えば特開昭６３−２９４７７８に記載されているリジン要求株と呼吸欠損株との組み合わせが挙げられる。
【００６９】
【実施例】
次に実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明は何等実施例により制限されるものではない。
【００７０】
（実施例１）
商品名カネカレッドイースト（鐘淵化学工業株式会社製）の菌株をFowellプレート（酢酸ナトリウム 0.4%、寒天2%、pH6.7）に塗布し、28℃、2日間培養して胞子を形成させ、得られた胞子株Ｒ−６Ｒを親株として、前記（Ａ）のＥＭＳ法による変異を行い、前記（Ｂ）のスクリーニングを行った結果、低温感受性のサッカロミセス・セレビシエＲ−６１８０−１を得た。
【００７１】
次に、この株に、商品名カネカレッドイーストから分離した多数の胞子株からスクリーニングされたインベルターゼ比活性の非常に低い株サッカロミセス・セレビシエＲ−１３Ｒを交雑させ、胞子を形成させ、生命工学工業技術研究所に寄託されている、インベルターゼ比活性が低く、低温感受性の胞子株サッカロミセス・セレビシエＲ−９１５２（ＦＥＲＭ Ｐ−１４６７５）、サッカロミセス・セレビシエＲ−９１５５（ＦＥＲＭ Ｐ−１４６７６）、およびサッカロミセス・セレビシエＲ−９１５６（ＦＥＲＭ Ｐ−１４６７７）を取得した。
【００７２】
これらの株のジャー培養を行い、インベルターゼ比活性、５℃高糖生地発酵力、３０℃高糖生地発酵力、３０℃復温高糖生地発酵力を測定すると共に、下記に示す方法で通常の加糖中種法菓子パンとストレート法菓子パンを通常の方法と冷蔵工程を経る方法の２つの方法で作製し、なたね置換法による比容積、パンの外観、内相の評価を行い、上記株の評価を行った。
【００７３】
なお、冷蔵貯蔵なしの通常のストレート法の製パンは、下記工程のうち冷蔵貯蔵工程なしとし、それ以外は同様の条件で製パンを行った。
【００７４】
加糖中種法菓子パンの配合及び工程：配合の数字は重量部を表す。
【００７５】
【００７６】
【表１】
【表２】
【表３】
【表４】
表に示したように、本発明の酵母は、通常のイーストに比較して通常の中種法、ストレート法菓子パンでも良好なパンが得られ、また、冷蔵中の生地の膨張もなく冷蔵保存にともなう比容積の低下、外観、内相の劣化が少なく、菓子パン生地においても、冷蔵生地法において長期に良好なパンが得られることがわかる。
【００８１】
（実施例２）
実施例１と同様の方法で、インベルターゼ比活性が低く、低温感受性であり、かつ冷凍耐性であるサッカロミセス・セレビシエＲ−９１５６（ＦＥＲＭ Ｐ−１４６７７）、サッカロミセス・セレビシエＲ−９１６０（ＦＥＲＭ Ｐ−１４６７８）、およびサッカロミセス・セレビシエＲ−９１９４（ＦＥＲＭ Ｐ−１４６７９）を取得した。
【００８２】
これらの株を実施例１と同様にジャー培養を行い、インベルターゼ比活性、５℃高糖生地発酵力、３０℃高糖生地発酵力、３０℃復温高糖生地発酵力、−２０℃、１週間冷凍後の復温高糖生地発酵力を測定し、さらに、以下に示す方法で冷凍生地菓子パンを作製し、上記株の冷凍耐性を評価した。
【００８３】
配合：配合の数字は重量部を表す。
【００８４】
強力粉 ９０
薄力粉 １０
砂糖 ３０
食塩 １
油脂 ８
イースト ４
脱粉 ２
全卵 １０
イーストフード ０．１
水 ５０
【００８５】
結果を表５、６および７に示す。
【００８６】
【表５】
【表６】
【表７】
表に示したように、本発明の酵母は、通常のイーストに比較して、冷凍保存にともなう比容積の低下、外観、内相の劣化が少なく、菓子パン生地においても、冷凍生地法において長期に良好なパンが得られることがわかる。
【００９０】
【発明の効果】
本発明の酵母を用いることにより、糖濃度の高い菓子パン等のリッチなパンにおいて、中種法、ストレート法、どちらにおいても従来の酵母に比べて良好なパンが得られる。さらに、この良好な性質を低温感受性株に導入することにより、冷蔵生地法、リタード法および冷凍生地法において、発酵が抑制され、生地膨張が少なく、冷蔵、冷凍後でも発酵力が低下せずに、良好なパンを得ることができる。特に、糖濃度が高いリッチなパン製法においても、従来不可能であった長期安定的に冷蔵、冷凍生地法において良好なパンが提供される。
Claims (8)
- サッカロミセス・セレビシエに属し、以下の性質：（１）インベルターゼ比活性が１０ユニット以上、１５０ユニット以下、および、（２）３０℃、１１５分の高糖生地発酵力が３５０ｍｌ以上、４００ｍｌ以下である、（３）５℃、２４時間の高糖生地発酵力が１０ｍｌ以下、（４）３０℃の復温高糖生地発酵力が、３０℃、１１５分の高糖生地発酵力の９０％以上、９５％以下、および、（５）−２０℃、１週間冷凍保存後の３０℃での復温高糖生地発酵力が、３０℃、１１５分の高糖生地発酵力の９０％以上、９２．５％以下であり、を有し、
ここで、該５℃、２４時間の高糖生地発酵力が
以下の原料配合：小麦粉１００ｇ、酵母３ｇ、庶糖３０ｇ、食塩０．５ｇおよび水５２ｍｌを有する生地を捏上温度が２０±１℃になるようにミキシングを行い、生地をシリンダーにいれてあらかじめスタート時の生地量を測定し、５℃、２４時間発酵させた後の生地量とスタート時の生地量との差であり、
該３０℃、１１５分の高糖生地発酵力が
以下の原料配合：小麦粉１００ｇ、酵母３ｇ、庶糖３０ｇ、食塩０．５ｇおよび水５２ｍｌを有する生地を捏上温度が３０±１℃になるようにミキシングを行い、生地をシリンダーにいれてあらかじめスタート時の生地量を測定し、３０℃、１１５分発酵させた後の生地量とスタート時の生地量との差であり、
該３０℃の復温高糖生地発酵力が、小麦粉１００ｇ、酵母３ｇ、庶糖３０ｇ、食塩０．５ｇおよび水５２ｍｌを有する生地を５℃、２４時間発酵させた後、３０℃に復温させた後の３０℃、１１５分の発酵力で測定され、
該−２０℃、１週間冷凍保存後の３０℃での復温高糖生地発酵力が、小麦粉１００ｇ、酵母３ｇ、庶糖３０ｇ、食塩０．５ｇおよび水５２ｍｌを有する生地を３０℃で１時間発酵しガス抜きし、−２０℃で１週間冷凍後３０℃に復温させた後の、３０℃、１１５分の発酵力であり、
インベルターゼ活性は、乾燥重量として１ｇの菌体が１分間にスクロースより生成するグルコースの２倍量（ｍｇ）と定義される、
酵母。 - 前記酵母が、サッカロミセス・セレビシエＲ−９１５６（ＦＥＲＭＰ−１４６７７）、サッカロミセス・セレビシエＲ−９１６０（ＦＥＲＭ Ｐ−１４６７８）、または、サッカロミセス・セレビシエＲ−９１９４（ＦＥＲＭ Ｐ−１４６７９）である、請求項１に記載の酵母。
- 請求項１ないし２のいずれかの項に記載の酵母を少なくとも１種を含有するパン生地。
- 前記パン生地が冷蔵生地である、請求項３に記載のパン生地。
- 前記パン生地が冷凍生地である、請求項３に記載のパン生地。
- 請求項１ないし２のいずれかの項に記載の酵母を少なくとも１種含有するパン生地の製造方法。
- 前記パン生地が冷蔵生地である、請求項６に記載のパン生地の製造方法。
- 前記パン生地が冷凍生地である、請求項６に記載のパン生地の製造方法。
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