JPH02500194A - 新規ポリペプチド及びその製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 新規ポリペプチド及びその製造法 「技術分野」 本発明は、新規ポリペプチド及びその製造法に関し、更に詳しくは、リボ多糖（ エンドトキシン）に強い親和性を示す新規ポリペプチド及びその製造法に関する ものである。

「背景技術」 エンドトキシンは、内毒素とも呼ばれ、グラム陰性細菌の菌体に存在する毒性物 質の総称で、成分はリボ多糖（以下ｒＬＰｓＪという、）である。

従来・エンドトキシンの除去法としては、熱分解法、限外ろ過法、ポリミキシン Ｂによるアフィニティークロマト法等が知られている。

しかしながら、熱分解法は、２５０℃以上の乾熱処理によりＬＰＳを熱分解し、 ガラス容器等からＬＰＳを分解・除去する方法であり、熱に不安定な物質からの ＬＰＳの分離には利用できない。

限外ろ過法は、低分子量物質からのＬＰＳの分離に有効であるが、原理的に高分 子量物質からのエンドトキシンの分離には適用できない、ポリミキシンＢによる アフィニティークロマト法は、ポリミキシンＢの有するＬＰＳに対する親和力を 利用する点から実用化が期待されるが、ポリミキシンＢの有する毒性の点から用 途が制限され、現在実用化されていない。

従って、高分子量生理活性物質中からＬＰＳを効果的かつ安全に分離する方法と して、実用的に有効な方法は未だ見出されていない。

そこで、本発明者らは、ＬＰＳに親和性を示す新規物質を見出すべく鋭意研究を 重ねた０本発明において、この物質をＬＰＳ結合ポリペプチド（時にはＬＢＰと 略する）という、その結果、カブトガニ血球から新規ポリペプチドを抽出・単離 するとともに該ポリペプチドの固相ペプチド合成法のような合成法による合成に 成功し、更に、該ポリペプチドが、ＬＰＳに強い親和性を示し、抗菌活性及び幼 若化反応抑制作用などの生物活性を有することを見出し、本発明を完成するに至 った。

「発明の開示」 本発明は、 次式（１）： ％式％ （式中、Ｌｙｓはリジンを、−Ｔｒｐはトリプトファンを、Ｃｙｓはシスティン を、Ｐｈｅはフェニルアラニンを、Ａｒｇはアルギニンを、Ｖａｌはバリンを、 Ｔｙｒはチロシンを、Ｇｌｙはグリシンを、１１ｅはインロイシンを表し：Ｘは 水酸基又はアミノ基を表す、） で示されるポリペプチド及びその類縁体並びに該ポリペプチドの製造法に関する ものである。

本発明の化合物は、アミノ酸１７個からなるポリペプチドであり、抽出・単離さ れた状態ではＣ末端アミノ酸であるアルギニンのカルボキシル基はアミド化され ているが、加水分解により酸となっても、ＬＰＳとの親和性には何ら影響は生じ ない。

本発明のポリペプチドは、以下のようにして、＄　ｔｒｉｄｅｎｔａｔｕｓ又は ＄　Ｂｊ工耗のカブトガニ血球から抽出・単離することができる。

即ち、＄　ｔｒｉｄｅｎｔａｔｕｓの血球を低張抽出後の残渣を酸性条件下９例 えば塩酸、硝酸、硫酸等の鉱酸の希酸中：又は有機酸、例えば酢酸等の低級脂肪 酸中で抽出して、得られた抽出液を。

例えばゲルろ過、クロマトグラフィー等の精製手段により精製することにより、 該ポリペプチドを単離することができる。

本発明のポリペプチドは、ペプチド合成法、例えば固相ペプチド合成法、液相ペ プチド合成法などのような合成法によっても製造することができる。

即ち、例えば、固相合成法では、Ｎ−保護アルギニンのカルボキシル基を、場合 によりカルボキシル基と結合しつる官能基とカルボキシル基とを有するスペーサ ーを介して、アミノ基を有する不溶性樹脂に結合させた後。

（式中の記号は前記と同義である。） で示されるペプチド配列の１６位から１位までに対応する保護アミノ酸な固相ペ プチド合成法に従って順次、不溶性樹脂に結合したアルギニンに結合させ、保護 ポリペプチドを得、次いで、該不溶性樹脂及びアミノ酸の保護基を脱離させて、 次式（旧　： （式中の記号は前記と同義である。） で示されるポリペプチドを得、その３位と１６位、及び７位と１２位のシスティ ンをそれぞれのメルカプト基を介して結合させ、ジスルフィド結合を形成させる ことにより本発明のポリペプチドを製造することができる。

前述のアミノ基を有する不溶性樹脂としては、そのアミノ基を介してＮ−保護ア ルギニンのカルボキシル基又は場合によりこれに結合しているスペーサーのカル ボキシル基と結合可能であり、かつ、その後脱離可能なものであれば如何なるも のでもよい。

かかる不溶性樹脂としては、例えば、アミノメチル樹脂（アミノメチル化スチレ ン−ジビニルベンゼン共重合体）、ベンズヒドリルアミン樹脂、メチルベンズヒ ドリルアミン樹脂、４−（アミノメチル）フェノキシメチル樹脂等が挙げられる 。

ベンズヒドリルアミン樹脂、メチルベンズヒドリルアミン樹脂、４−（アミノメ チル）フェノキシメチル樹脂を用いれば開裂によって直接アミドを与えるが、収 率の点からはアミノメチル樹脂が好ましい。

前述の場合により存在するカルボキシル基と結合しうる官能基とカルボキシル基 とを有するスペーサーとしては、例えばアルギニンのカルボキシル基をｐ−カル ボキシメチルベンジルエステルに変換しつるものが挙げられるが特に制限はない 。

かかるスペーサーと保護アルギニンとが結合した４−（ｔ−ブトキシカルボニル 一旦−トシル−Ｌ−アルギニルオキシメチル）フェニル酢酸はＪ、Ｐ、　Ｔａｍ ら（５ｙｎｔｈｅｓｉｓ　（１９７９）　ｐ、９５５−９５７）の方法により調 製することができる。

保護アミノ酸とは、官能基を公知の方法により保護基で保護したアミノ酸であり 、各種の保護アミノ酸が市販されている０本発明のポリペプチドを合成する場合 には、以下に示す保護基のいずれかを選択するのが好ましい、まず、アミノ酸の α−アミノ基の保護基はＢｏｃ（ｔ−ブチルオキシカルボニル）又はＦｍｏｃ（ ９−フルオレニルメチルオキシカルボニル）である、　Ａｒｇのグアニジノ基の 保護基は、Ｔｏｓ　（トシル）、ＮＯ，にトロ）又はＭｔｒ（４−メトキシ−２ ，３，６−ドリメチルベンセンスルホニル）である、　Ｃｙｓのメルカプト基の 保護基としてはＢｚｌ　（ベンジル）、トＢｚｌ（４−メトキシベンジル）、４ −ＭｅＢｚｌ　（４−メチルベンジル）、Ａｃｍ　（アセトアミドメチル）、Ｔ ｒｔ（トリチル）　、Ｎｐｙｓ　（３−ニトロピリジンスルフェニル）、ｔ−Ｂ ｕ（ｔ−ブチル）又はｔ−ＢｕＳ（ｔ−ブチルメルカプト）が挙げられるが、４ −ＭｅＢｚｌ、　Ａｃｍ及びＮｐｙｓが好ましい、　Ｔｙｒの水酸基の保護基は 、Ｂｚ１％Ｃ１ｇ・Ｂｚｌ　（２、６−ジクロロベンジル）　、　ｔ−Ｂｕであ るか、あるいは保護しな（でもよい、　Ｌｙｓのε−アミノ基の保護基は、Ｚ（ ベンジルオキシカルボニル）　、　Ｃｌ−２（２−クロロベンジルオキシカルボ ニル）　、Ｂｏｃ又はＮｐｙｓである。各保護基は、ペプチドの合成条件に応じ 適切なものを選択する必要がある。

保護アミノ酸の結合は、通常の縮合法、例えば、　ＤＣＣ（ジシクロへキシルカ ルボジイミド）法、活性エステル法、混合あるいは対称酸無水物法、カルボニル ジイミダゾール法、ＤＣＣ−ＨＯＢｔ（１−ヒドロキシベンゾトリアゾール）法 、ジフェニルホスホリルアジド法等に従って行なうと−とができるが、ＤＣＣ法 、ＤＣＣ−ＨＯＢｔ法及び対称酸無水物法が好ましい、これらの縮合反応は１通 常。

ジクロロメタン、ジメチルホルムアミド等の有機溶媒又はそれらの混合溶媒中で 行なわれる。α−アミノ基の保護基の脱離試薬としては、トリフルオロ酢酸／ジ クロロメタン、ＨＣＩ／ジオキサン、ピペリジン／ジメチルホルムアミド等が用 いられ、該保護基の種類により適宜選択する。また、合成の各段階における縮合 反応の進行の程度はＥ、カイザーらの方法［Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、、　 ３４．５９５（１９７０１１にンヒドリン反応法）によって検査される。

以上のようにして、所望のアミノ酸配列を有する保護ペプチド樹脂を得ることが できる。

不溶性樹脂としてアミノメチル樹脂を用いた場合には、例えば適当な溶媒中にお いてアンモニアで処理することにより該樹脂を脱離させることができる０次いで 、フッ化水素で処理することにより、前記式（Ｈ）で示される、全ての保護基が 脱離したポリペプチドが得られる。不溶性樹脂としてベンズヒドリルアミン樹脂 、メチルベンズヒドリルアミン樹脂又は４−（アミノメチル）フェノキシメチル 樹脂を用いた場合には、フッ化水素で処理することにより、該樹脂及び保護基を 同時に脱離させることができる。

次いで、好ましくは、２−メルカプトエタノール等で還元することによりシステ ィンのメルカプト基が還元型となっていることを確実ならしめた後、酸化処理す ることにより目的とする前記式（Ｉ）で示される環状ポリペプチドをアミドとし て得ることができる。

この際の酸化処理は、公知の方法を用いることができ、通常、大気中の酸素やフ ェリシアン酸塩（例えば、フェリシアン化カリウム）のような酸化剤を用いる。

かくして得られたポリペプチドは、常套的手段、例えば、抽出、再結晶、各種ク ロマトグラフィー（ゲルろ過、イオン交換、分配、吸着、逆相）、電気泳動、向 流分配等により単離精製することができるが、逆相高速液体クロマトグラフィー による方法が最も効果的である。

「図面の簡単な説明」 第１図は、本発明のポリペプチドのＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動の結 果を示す図である。第２図及び第３図は、ＬＰＳによるＣ因子の活性化に対する 本発明のポリペプチドの阻害効果についての試験結果を示す図である。第４図は 。

本発明のポリペプチドの紫外部吸収スペクトルである。第５図は、マウスのリン パ球のＬＰＳ刺激による幼若化反応に及ぼす本発明のポリペプチドの影響を示す 図である。第６図は、ＬＰ３５０μｇ／ｍ１を加えたときのリンパ球幼若化反応 を示す写真である。第７図、第８区及び第９図は、それぞれ、本発明のポリペプ チド０．２．２及び２０μｇ／ｍｌ添加後、ＬＰＳ５０ｕｇ／ｍｌを加えたとき の結果を示す写真である。第１０図は、ヒト末梢血リンパ球のＬＰＳ刺激による 幼若化反応に及ぼす本発明のポリペプチドの影響を示す図である。

「発明を実施するための最良の形態」 以下、実施例により本発明を更に詳細に説明するが、これらの実施例は本発明の 範囲を何ら制限するものではない。

実施例Ｉ Ａ０本発明のポリペプチドの抽出・精製ｎ吐脛旦胚ｔｒｉｄｅｎｔａｔｕｓの血 球約５０ｇに２０ｍＭトリス塩酸／　５０　ｍ　Ｍ塩化ナトリウム／　ｐ　Ｈ８ ，０緩衝液１５Ｃ）ＩＩｌｌを加え、高速ホモゲナイザ−（ヒスコトロン■：日 本精密工業■製）で３分間ホモゲナイズした後、遠心（８０００ｒｐｍ。

３０分間、４℃）した、このようにして分離した沈殿物について、前記操作を２ 回繰り返し、血球内の可溶性成分を充分に抽出して残渣を得た。

残渣に２０ｍＭ塩酸１５０ａ＋１を加え、高速ホモゲナイザーで３分間ホモゲナ イズし、遠心後、酸性抽出液の上清を得た。この操作を計３回繰り返し、全量的 ４００ｍ１の抽出液を得た。この上清画分を凍結乾燥により濃縮乾固した。

濃縮乾固した酸性抽出物は２０ｍＭ塩酸で肩溶解した後、セファデックスＧ−５ ０（３，０Ｘ９０、Ｏｃｍ）カラム（２０ｍＭ塩酸で予め平衡化）に添加してゲ ルろ過を行った。ＬＰＳ（Ｅ、　ｃｏｌｉ　０１１１　Ｂ４株由来のものを使用 ）によるＣ因子（カブトガニ血液凝固セリンプロテアーゼ前駆体：本発明者らが 名付けたＬＰＳ感受性因子、Ｎａｋａｍｕｒａ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｅｕｒ、　 Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、。

１５４、５１１（１９８６１）の活性化を阻害する溶出画分を集め、プールした 画分のｐＨを水酸化ナトリウム水溶液で６．０に合わせた。

サンプルを予め２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６，０）で平衡化したＣＭ−セファロ ースＣＬ−６Ｂカラムにかけ、溶出な０〜０．３Ｍ塩化ナトリウムを含む２０ｍ Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ６，０）のグラジェントで行った。Ｃ因子活性化阻害画分を 集め、ＬＰＳ結合物質の最終精製標品（本発明の新規ポリペプチド）とした、収 量は、血球約５０ｇから約３０ｍｇであった。

Ｂ、純度検定 （１）ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動法ＬＰＳ結合ポリペプチドを還元 剤（β−メルカプトエタノール）の不存在下又は存在下に、８Ｍ尿素を含む１２ ％ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行い、クーマシーブリリアントブルー（Ｃ ｏｏｍａｓｓｉｅ　Ｂｒ１ｌｌｉａｎｔ　Ｂｌｕｅｌ　Ｒ−２５０で染色したと ころ、共に分子量約２０００の単一バンドを示した。結果を第１図に示す、第１ 図において、左側のバンドは、還元剤の不存在下におけるポリペプチドを、中央 のバンドは、還元剤の存在下におけるポリペプチドを、右側のバンドは、ミオグ ロビン標準蛋白質マーカー［ＳＤＳ　−ＰＡＧＥＭａｒｋｅｒＩＨ、Ｆｌｕｋａ 　ＡＧ　（スイス）］によるミオグロビン（１６，９ｋＤａ）、ミオグロビンＩ ＋ＩＩ（１４，４ｋＤａ）　、ミオグロビンＩ　（８，２ｋＤａ）、ミオグロビ ンＵ　（６，２ｋＤａ）及びミオグロビンＩＩＩ　（２，５ｋ　Ｄ　ａ）の位置 を示す。

（２）逆相高速液体クロマトグラフィ一本発明のポリペプチドを逆相高速液体ク ロマトグラフィー（カラムはＣｏｓｍｏｓｉｌ　５Ｃ＋ｓＰ　ｓペプチドの溶出 は０．１％トリフルオロ酢酸／アセトニトリルＯ〜９８％のグラジェント系を使 用）で分析したところ、単一ピークを示した。

Ｃ，アミノ酸組成値 サンプルを１１０℃で２４．４８．７２時間５．７Ｍ塩酸で加水分解した後、日 立８３５自動アミノ酸分析計で分析した。半シスチンについては、サンプルを過 ギ酸酸化後、１１０℃で２４時間５．７Ｍ塩酸で加水分解し、またトリプトファ ンについては、サンプルを３Ｍメルカプトエタンスルホン酸で１１０℃で２４時 間加水分解した後、それぞれアミノ酸分析計で分析した。ＳＤＳポリアクリルア ミドゲル電気泳動法で得た分子量から、このペプチドは１７個のアミノ酸から構 成される単純塩基性ポリペプチドであることが判明した。アミノ酸分析の結果を 表１に示す。

Ｄ、アミノ酸配列の決定とＣ末端アルギニンアミドの同定 アミノ酸配列は、インタクトな標品的２３μｇを用い、アミン末端よりベックマ ン（Ｂｅｃｋｍａｎ１８９０Ｄシークエンサーを用いて、１５残基（半シスチン を除く）まで同定できた。また、還元アルキル化したサンプル（本発明のポリペ プチドをＭ、　Ａ、　Ｈｅｒｍｏｄｓｏｎ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｂｉｏｃｈｅｍ ｉｓｔｒｙ、　１２゜３１４６　ｆ１９７３）の方法によりＳ−ピリジルエチル 化したもの）約３６μｇを用い、１６残基（半シスチンな含めて）まで同定でき た。残る１７７番目アミノ酸残基（Ｃ末端残基）はアミノ酸分析値よりアルギニ ンであると推定できた。しかし、Ｃ末端アルギニンは、インタクトな標品、ピリ ジルエチル化した標品を用い、カルポキシペブチグーゼ（以下ｒｃＰａｓｅＪと いう）Ｙ及びＢで消化しても全く検出できなかった。そこで、一旦、サンプルを ３０ｍＭ塩酸で１１０℃で１０時間緩和な条件で加水分解した後、再度ＣＰａ５ ｅＢで処理した。その結果、本発明のポリペプチド１モル当りアルギニン約０． ５モルの遊離が認められ、Ｃ末端のカルボキシル基は、アミド化されている可能 性が強いものと判断した。このアミド化合物の理論分子量（計算値ＭＷ＝２２６ ４）と質量分析による実測値とが完全に一致したことにより、Ｃ末端アルギニン のカルボキシル基はアミド化されていることが確認された。

Ｅ、ジスルフィド（Ｓ−Ｓ）結合の同定本発明のポリペプチド内に４個の半シス チンが同定されたが、これらは全てジスルフィド結合していることが、還元剤（ ジチオスライトール）の存在下又は不存在下におけるＳ−ピリジルエチル化の比 較実験より明らかになった。そこで、ジスルフィド結合の位置を同定するため、 インタクトな標品なジスルフィド結合の交換反応が起こらない条件下（酸性条件 下、ｐＨ６，５）でトリプシン消化を行い、消化物を前述の逆相高速液体クロマ トグラフィー（カラムはＣｏｓｍｏｓｉｌ　５Ｃ＋ａＰ　、ペプチドの溶出は０ ．１％トリフルオロ酢酸／アセトニトリル系を使用）にて分離した。得られたペ プチドのアミノ酸組成を調べたところ、アミン末端から３番目と１６番目、７番 目と１２番目がジスルフィド結合していることが判明した。

Ｆ８本発明のポリペプチドのＬＰＳ結合活性本発明のポリペプチドは、０．１μ ｇ／ＩｏｌのＬ　Ｐ　Ｓ　（Ｅ、　ｃｏｌｉ　０１１１８４株由来のものを使用 ）によるＣ因子の活性化（「Ｃ因子」と表す）を０、０５　ｕＭ　（０，１２ｕ 　ｇ／ｍｌ）で５０％、ｌ　ＬＬＭ　（２，３ｕｇ／ｍｌ）で完全に阻害した。

また、本発明のポリペプチドは、１％アガロースゲルを用いた二重拡散テストに おいて、ＬＰＳと高分子複合体を形成し、沈降線を形成することが観察された。

ＬＰＳによるＣ因子の活性化に対する本発明のポリペプチドの阻害効果について の試験結果を第２図及び第３図に示す、第２図及び第３図は、それぞれ塩化ナト リウム不存在下又は存在下（ＩＭ）における結果を示す、対照として１本発間者 らにより始めて明らかになったＬＰＳと電気的に結合する性質を示す高分子量塩 基性物質、ポリリジンを用いた。第２図及び第３図において、（○）印及び（・ ）印は、それぞれ本発明のポリペプチド及びポリリジンの結果を表す。

これらの結果より、本発明の新規ポリペプチドは、ＬＰＳと単なる電気的な結合 ではなく、塩濃度に影響を受けない強い親和性を有することが判る。

Ｇ、吸光度の測定 本発明のポリペプチド９９．２μｇ／ｍｌ水溶液の紫外部吸収スペクトルを第４ 図に示す、２７６ｎｍに吸収ピークをもつ＄　２８０　ｎｍにおける吸光度は０ ．３８４２であるので、１％水溶液の２８０ｎｍにおける吸光度は、３８．７と 算出される。

実施例２ Ａ、アミノメチル樹脂へのアルギニンの導入（１）４−　（ブロモメチル）フェ ニル酢酸フェナシルエステルの合成 室温下、アセトニトリル７５ｍ１中にα−ブロモアセトフェノン３．９８ｇ　（ ２０ｍｍｏｌ）及びフッ化カリウム３　、４９　ｇ　（６０ｍｍｏｌ）を懸濁さ せ、撹拌下、４−（ブロモメチル）フェニル酢酸４、５８ｇ　（２０ｍｍｏｌ） を６等分し３０分間隔で添加し、２時間撹拌を継続した０反応終了後、不溶物を ろ別し、ろ液から溶媒を留去し、残渣を酢酸エチルに再溶解し、飽和炭酸水素ナ トリウム水溶液で２回、蒸留水、クエン酸、蒸留水で各１回洗浄し、硫酸ナトリ ウムで乾燥した。酢酸エチルを留去し、石油エーテルから結晶化し、５．５ｇの 目的物（融点８４〜８５℃）を得た。これを再結晶して融点８５〜８６℃の結晶 ５．２ｇ（収率７５％）を得た。

（２）４−　（ｔ−ブトキシカルボニル一旦−トシル−Ｌ−アルギニルオキシメ チル）フェニル酢酸の合成 ｔ−ブトキシカルボニル一旦−トシル−Ｌ　−アルギニン４．　７１　ｇ　（１ １ｍｍｏｌ）　、　４−　（ブロモメチル）フェニル酢酸フェナシルエステル３ −４７　ｇ　（１０ｍｍｏｌ）　、フッ化カリウム１　、２８　ｇ　（２２ｍｍ ｏｌ）　、水０．８ｍｌ（４４ｍｍｏｌ）　、アセトニトリル５０ｍ１及びジメ チルホルムアミド１０ｍ１の混合物を室温下２４時間激しく撹拌した。生成する 不溶物を自然ろ過し、ろ液をエバボレートにより１５〜２０ｍ１まで濃縮した。

酢酸エチル８０ｍ１を添加した後、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で２回、蒸留 水で１回、飽和クエン酸水溶液で２回、蒸留水で１回洗浄し、硫酸ナトリウムで 乾燥した。溶媒を留去し、残渣を石油エーテルで処理して、半固形状の４−（ｔ −ブトキシカルボニル一旦−トシル−し−アルギニルオキシメチル）フェニル酢 酸フェナシルエステルを得た。

これを酢酸１０５ｍ１に溶解し、水１９ｍ１及び亜鉛１３．１ｇを加え、室温下 ５．５時間激しく撹拌した。亜鉛なハイフロス−パーセル及び酢酸エチルを用い てろ別し、ろ液に酢酸エチル４００ｍ１及び水３００ｍ１を加え、酢酸エチル層 を分離し、１０回水洗し、硫酸ナトリウムで乾燥後、溶媒を留去し、残渣を石油 エーテル中で摩細し、４−（ｔ−ブトキシカルボニル一旦−トシル−し−アルギ ニルオキシメチル）フェニル酢酸４．７７ｇを得た０本物質は薄層クロマトグラ フィーにより１スポツトのほぼ純品として得られた。

（３）４−　（ｔ−ブトキシカルボニル一旦−トシル−し−アルギニルオキシメ チル）フェニルアセトアミドメチル樹脂の合成 ４−（ｔ−ブトキシカルボニル一旦−トシル−し−アルギニルオキシメチル）フ ェニル酢酸５７７　ｍ　ｇ　（１、０ｍ＋＋＋ｏｌ）　、アミノメチル樹脂（株 式会社ペプチド研究所販売、１％架橋）２．００ｇ及びＤ　ＣＣ２０６ｍ　ｇ　 （１、０ｍｍｏｌ）をジクロロメタン中で常法によりカップリングさせ、樹脂１ ｇ当り０．２８４＋ｎ＋ｎｏｌのカップリングが確認された。

Ｂ、１６位システィンの導入 ４−（ｔ−ブトキシカルボニル−Ｇ−１−シル−し一アルギニルオキシメチル） フェニルアセトアミドメチル樹脂１　、０　ｇ　（０、２８４ｍｍｏｌＡｒｇ　 ｆＴｏｓｌ　／ｇ樹脂）をジクロロメタン２５ｍ１で４回、各１分洗浄し、ろ過 した。得られた樹脂に３０％トリフルオロ酢酸溶液（溶媒ニジクロロメタン）２ ５ｍｌを添加し、混合物を３０分撹拌し、Ｂｏｃ基を脱離させた。得られた樹脂 を下記の溶媒各２５ｍ１で順次処理し、各々の処理後にろ過した。

ジクロロメタン　（１回、１分） ジオキサン　（１回、１分） ジクロロメタン　（１回、１分） ジオキサン　（１回、１分） ジクロロメタン　（２回、各２分） １０％トリエチルアミン（ジクロロメタン溶液）　（１回、２分；１回、５分） ジクロロメタン　（４回、各１分） 次いで、前記樹脂をジクロロメタン２５ｍ１、及び総アルギニン量に対して３． ５当量の保護アミノ酸、即ち、Ｂｏｃ−Ｃｙｓ（４−ＭｅＢｚｌｌ　３１０　ｍ ｇ（０、９９４ｍｍｏｌ）とともに１分撹拌した。得られた混合物にＤ　ＣＣ２ ０５ｍｇ　（０、９９４ｍｍｏｌ）のジクロロメタン溶液２５ｍ１を加え、２時 間撹拌した。得られた樹脂を下記の溶媒各２５ｍ１で順次処理し、各々の処理後 にろ過した。

ジクロロメタン　（１回、１分） イソプロパツール　（１回、１分） ジクロロメタン　（１回、１分） インプロパツール　（１回、１分） ジクロロメタン　（３回、各１分） Ｃ，１５〜１位のアミノ酸の導入 Ｂと同様にして、先に得られた樹脂に、前記式（ｎ）で示されるポリペプチドの １５位から１位までの各構成アミノ酸に対応する保護アミノ酸を順次カップリン グした０表２に各反応段階で用いた保護アミノ酸を示す、保護アミノ酸の使用量 は全て総アルギニン量に対して３．５当量である。

なお、Ｂｏｃ−Ａｒｇ　［ＴｏｓｌのカップリングはＤＣＣ−ＨＯＢｔ法により ＤＣＣに対しＨＯＢｔを２倍モル使用で行った。

表　２ １位アミノ酸の導入後、樹脂ペプチドをジクロロメタンを用いてグラスフィルタ ーに回収し、減圧乾燥して、乾燥樹脂ペプチド１．７８１ｇを得た。

Ｄ、樹脂の脱離 Ｃで得られた乾燥樹脂ペプチドをメタノール及びジメチルホルムアミド中におい てアンモニア（無水）で処理することにより樹脂を脱離させて。

次式： ％式％（） で示される保護ポリペプチド０．７６５ｇ（０、１９６ｍｍｏｌ）を得た。

分子量：　３９０４ Ｅ、保護基の脱離 りで得られた保護ポリペプチドをアニソール中においてエタンジチオールの存在 下フッ化水素で処理して保護基を除き、次いで陰イオン交換樹脂（Ｃ１−型）で 処理し、凍結乾燥して、次式： ％式％ で示されるポリペプチド塩酸塩４７０ｍｇ（０，１８６ｍｍｏｌ）を得た。

分子量：　２５２３ Ｆ、ポリペプチドの環化 Ｅで得られたポリペプチド塩酸塩３０ｍｇを、２００倍モル過剰の２−メルカプ トエタノールを含むＯ，ＬＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　（ｐＨ８，５）中において一 夜室温で放置した１次いで、１％酢酸で平衡化したセファデックスＧ−１０カラ ムで処理してポリペプチド含有画分を得た。水で１０倍に希釈しく０．１ｍｇ／ ｍｌ　）、０．５ＭＮａＯＨでｐＨを８．５に調整し、室温で３０時間放置した 後、凍結乾燥した０次いで、１％酢酸で平衡化したセファデックスＧ−１０カラ ムで処理して酸化型ポリペプチド８．５ｍｇを得た。

このようにして得られたポリペプチドを逆相高速液体クロマトグラフィー（カラ ムはＴＳＫ−ゲル　ＯＤ５−１２０７　（０，４６Ｘ２５ｃｍ）、ペプチドの溶 出は０．０１Ｍギ酸−トリエチルアミン（ｐＨ４，５）（Ａ）　−Ａ２０％含有 アセトニトリル（Ｂ）を使用）で分析したところ、実施例１で得られた天然のポ リペプチドのピークと一致し、更に両者を混合したものは該ピークが２倍になり 、両者は同一物と認められた。

試験例１　本発明のポリペプチドの生物活性Ａ、材料と方法 （１）ＬＰＳ Ｓ型はＳａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｍ１ｎｎｅｓｏｔａｌｌ１４　Ｗ、　Ｅ、　ｃｏ ｌｉｏｌｌｌ：８４　、Ｅ、ｃｏｌｉ　０１１３、Ｒｅ型はＳａ１ｍｏｎｅｌｌ ａ＋＋＋１ｎｎｅｓｏｔａ　Ｒ５９５、Ｅ、　ｃｏｌｉ　Ｊ５の精製ＬＰＳを用 いた。

（２）ＬＰＳ感作赤血球 主にヒトＯ型赤血球２．５％浮遊液１ｍｌにＬ　Ｐ　Ｓ　（１ｍｇ／ｍｌ　）　 ０　、５　ｍｌを加え、３．７℃で１時間振り混ぜ、生理食塩液で洗浄した。

（３）溶血活性 ０．５％ＬＰＳ惑作赤血球５０μｌ、本発明の０．５％ポリペプチドの２倍系列 希釈液５０μｍ及びＴｒｉｓ　−ＨＣｌ　ｂｉ衝化生理食塩液（ｐＨ７，２）１ ００μｍを３７℃で１時間保温後、生理食塩液２．３＋ｎｌを加え、遠心分離（ ２５０Ｏｒｐｍ、１０分）し、上清のヘモグロビン量を４１２ｎｍの吸収で定量 し、またマイクロプレート・リーダー［（：ｏｒｏｎａ　ＭＰＴ−１００：商品 名）を用い、０．５％ＬＰＳ感作赤血球５０μｍと０．５％ポリペプチドの２倍 系列希釈溶液５０μｍを３７℃で１時間保温後、そのマイクロプレート上の瀉血 パターンを測定した。

（４）抗菌活性 Ｐｅｎａｓｓａｙ培地又はＪａｒｖｉｓ合成培地１６０μｌに本発明の０．５％ ポリペプチドの２倍系列希釈液２０μｍ、菌液（ｌ　Ｏ’　−１０’／ｍｌ）　 ２０μｍを加え、３７℃で１８時間後の濁度をマイクロプレート・リーダーを用 いて５５０ｎｍで測定し、一部生薗数や阻止円も計測した。

（５）ゲル内沈降反応 Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ緩衝緩衝化生理液塩液Ｈ７，２）、ｐＨ８，６ベロナール緩衝 液、ｐＨ４，６酢酸塩緩衝液に溶解した１％アガロース溶液（０，１％ＮａＮ５ 加）中でＬＰＳと本発明のポリペプチド又は抗ＬＰＳ因子（ｎ吐■旦朋ｔｒｉｄ ｅｎｔａｔｕｓ血球抽出液（ライセード）から得られるアミノ酸１０２残基、分 子量１１．６００の塩基性蛋白質：以下ｒＡＬＦＪという）の間に生じた沈降線 をアミドブラック染色した０本発明のポリペプチドの希釈には５０ｍＭ　Ｔｒｉ ｓ　ＨＣ１−０，１５Ｍ　ＮａＣ１（ｐＨ７，２）を用いた。

Ｂ、結果 （１）瀉血活性 Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｍ１ｎｎｅｓｏｔａ　１１１４　Ｗ　、Ｒ５９５、Ｅ。

ｃｏｌｉ　０１１３のどのＬＰＳで感作した赤血球に対しても本発明のポリペプ チドは２〜３μｇ／＋ｏｌで溶血を起し、高濃度では室温でも速やかに溶血し、 また遊ｉｔ　Ｌ　Ｐ　Ｓで溶血が阻害される点はＡＬＦと同じであるが、３．１ ３μｇ／ｍ１以上では非感作赤血球の溶血も認められた。概して本発明のポリペ プチドの溶血活性はＡＬＦより弱かった。

（２）抗菌活性 本発明のポリペプチドはＳａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｔｙｐｈｉ−ｍｕｒｉｕｍ　Ｌ Ｔ　２ｆＳｌ、１１０２（Ｒｅ）、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｍ１ｎｎｅ−ｓｏｔ ａ　１１１４　Ｗ（Ｓ）、Ｒ５９５１Ｒｅｌのいずれに対しても抗菌活性を示し 、最小抗菌量はＬＴ２に対し３．１３ｕｇ／ｍｌ、１１０２に対し１．５６Ｌ１ ｇ／ｍｌであった。また５ｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓのような グラム陽性菌にも抗菌活性を示した。含菌寒天上では濃度に応じた阻止円を生じ た。一般に、本発明のポリペプチドはＡＬＦより抗菌活性が強かった。

（３）ゲル内沈降反応 本発明のポリペプチドはＳａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｍ１ｎｎｅｓｏｔａ１１１４　 Ｗ、Ｒ５９５、Ｅ、ｃｏｌｉ　０１１１：Ｒ４、０１１３、Ｊ５のいずれのＬＰ Ｓに対してもゲル内沈降反応でシャープな沈降線を生じ、異種のＬＰＳに対する 沈降線は互いに融合した。

前述したことから、本発明のポリペプチドは、ＬＰＳに強い親和性を示し、エン ドトキシンの除去手段として有用であり、また細菌感染症治療剤としても有用で ある。

試験例２　本発明のポリペプチドのＬＰＳによるリンパ球幼若化反応に対する抑 制作用 Ａ、材料と方法 Ｃ５７ＢＬ雄性マウス（５通針）の肺細胞をＦｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ比重 遠心法で採取し、ＲＰＭＩ−１６４０培養液（無血清又はＢＳＡ、ＦＣ３添加） に浮遊させた。

得られた培養液を３　Ｘ　１０　’　ｃｅｌｌ／　ｍｌに調整後、１００μｍず つ９６六マイクロクイタープレートに分注した１分注した培養液に、本発明のポ リペプチド（ＬＢＰ）０．４．４．４０及び４００Ｕｇ／ｍｌを１０ｕｌ添加後 、培養液８０μｍとＬＰ５４００μｇ／ｍｌを１０μｍ加え、５％Ｃ０２インキ ュベーク−内で７２時間培養した。′Ｈ−チミジン（”Ｈ−ＴｄＲ）は培養終了 １８時間前に１ＬＬｃｉ／１０μｍ添加し、セルハーベスクーを用いて細胞を剥 離して集めた後、取り込まれた”Ｈ−ＴｄＲの量を液体シンチレーションカウン ターで測定し、細胞増殖の指標とした。

また、その細胞増殖を倒立顕微鏡を用いて観察し、写真撮影した。

Ｂ、結果 ＬＰＳ存在下におけるＬＢＰのマウス牌リンパ球幼若化反応（細胞増殖反応）抑 制作用について第５図に示す０図から明らかなようにＬＢＰ２ｕｇ／ｍｌ及び２ ０μｇ／ｍｌでリンパ球幼若化反応を９０％以上抑制した。また、倒立顕微鏡を 用いた観察においては、ＬＰ３５０μｇ／ｍｌを加えて３日間培養すると明らか に細胞が大型化及びコロニー化（幼若化反応）しているのが認められた（第６図 ）、ＬＢＰを添加した後にＬＰＳを加えた場合、ＬＢＰｏ、２μｇ／ｍｌではほ とんど変化がみられなかったが（第７図）、ＬＢＰ２μｇ／ｍｌ及びＬＢＰ２０ μｇ／＋ｎｌで細胞の大型化及びコロニー化がほとんどみられず、ＬＰＳによる 幼若化反応に対して抑制作用が認められた（第８図及び第９図）。

試験例３　本発明のポリペプチドのＬＰＳによるリンパ球幼若化反応に対する抑 制作用 Ａ、材料と方法 健常人（男性、３０才）の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）をＦｉｃｏｌｌ−）１ｙ ｐａｑｕｅ比重遠心法で採取し、ＲＰＭＩ−１６４０培養液（無血清又はＢＳＡ 、ＦＣＳ添加）に浮遊させた。得られた培養液で２　Ｘ　１０　’　ｃｅｌｌ／ ｍｌに調整後、１００μｍずつ９６八マイクロタイタープレートに分注した。Ｌ ＢＰ２００μｇ／＋ｏｌを１０μｍ添加後、培養液８０ｕｌとＬＰＳ４００μｇ ／ｍｌを１０μｍ加え、５％ＣＯ！インキュベーター内で７２時間培養した　ｍ Ｈ−チミジン（”Ｈ−ＴｄＲ）は培養終了１８時間前に１ｐｃｉ／　１０μｌ添 加し、セルハーベスクーを用いて細胞を剥離して集めた後、取り込まれた”Ｈ− ＴｄＲの量を液体シンチレーションカウンターで測定し、細胞増殖の指標とした 。

Ｂ、結果 ＬＰＳ存在下におけるＰＢＭＣのリンパ球幼若化反応（細胞増殖反応）に対する ＬＢＰの抑制作用について第１０図に示す１図から明らかなようにＬＢＰＩＯｕ ｇ／＋ｏｌでＬＰＳ５０ｕｇ／＋ｍｌのリンパ球幼若化反応をほぼ１００％抑制 した。

以上の結果から、ＬＢＰはヒト及びマウスのＬＰＳ刺激によるリンパ球幼若化反 応をＬＰＳ量の１７２５〜１７５量でほぼ完全に阻害することが明らかとなった 。

なお、ＬＢＰとＬＰＳとの結合活性なＣ因子活性阻害を指標として測定するとＬ ＰＳ量の約２０倍量となる。このことから、ＬＢＰのリンパ球幼若化反応の阻害 作用はＬＰＳとの結合性とリンパ球（Ｔ細胞、Ｂ細胞）及び単球の細胞膜上に存 在するＬＰＳレセブクーへの拮抗作用ないしはＬＢＰの陽性荷電による細胞膜変 化がその作用を発現させたものと考えられる。

ＬＰＳレセブクーは上記細胞の他にマクロファージ、好中球、赤血球、血小板、 血管内皮細胞、肝細胞など多くの細胞に存在し、ＬＰＳの刺激により様々な免疫 反応（Ｂ細胞幼若化、アジュバント作用、多クローン性Ｂ細胞活性化、インター ロイキン産生、インターフェロン産生、ＴＮＦ産生、その他）、炎症反応（プロ スフグランジン産生、活性酸素産生、補体活性化、その他）などが誘発されるこ とが推定される。

ＬＢＰはＬＰＳ量の１７２５〜１１５量でＬＰＳに起因する上記免疫反応及び炎 症反応を直接的あるいは間接的にほぼ完全に阻害することが予想され、下記の疾 患に対する有効性が十分期待される物質である。

感染症（上気道感染、***、その他）皮膚疾患（床擦れ、火傷、その他） 大腸炎（潰瘍性大腸炎、クローン病、その他）肝疾患（肝硬変、肝不全、その他 ） 外科手術時における術後合併症 「産業上の利用可能性」 本発明のポリペプチドは、ＬＰＳに強い親和性を示し、エンドトキシンの除去手 段として有用であり、また細菌感染症治療剤としても有用である。

ご因子活性（Ａ４８５１５分） ご因子活性（Ａ４８５１５分） ＦＩＧ、４ 波長　（ｎｍ） ３Ｈ−ＴｄＲ（ｃｐｍ） 国際調査報告 一一一ムｍ＋１１１＋ｉ＋ユ軸、ＰＣＴ／ｊＰ８［１１００８２３

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. （１）次式： ▲数式、化学式、表等があります▼（Ｉ）（式中、Ｌｙｓはリジンを、Ｔｒｐは トリプトファンを、Ｃｙｓはシステインを、Ｐｈｅはフェニルアラニンを、Ａｒ ｇはアルギニンを、Ｖａｌはバリンを、Ｔｙｒはチロシンを、Ｇｌｙはクリシン を、Ｉｌｅはイソロイシンを表し；Ｘは水酸基又はアミノ基を表す。） で示されるポリペプチド。
2. （２）次式： 【配列があります】 （式中、Ｌｙｓはリジンを、Ｔｒｐはトリプトファンを、Ｃｙｓはシステインを 、Ｐｈｅはフェニルアラニンを、Ａｒｇはアルギニンを、Ｖａｌはバリンを、Ｔ ｙｒはチロシンを、Ｇｌｙはクリシンを、Ｉｌｅはイソロイシンを表し；Ｘは水 酸基又はアミノ基を表す。） で示されるポリペプチド。
3. （３）Ｎ−保護アルギニンのカルボキシル基を、場合によりカルボキシル基と結 合しうる官能基とカルボキシル基とを有するスペーサーを介して、アミノ基を有 する不溶性樹脂に結合させた後、次式： 【配列があります】 （式中の記号は前記と同義である。） で示されるペプチド配列の１６位から１位までに対応する保護アミノ酸を固相ペ プチド合成法に従って順次、不溶性樹脂に結合したアルギニンに結合させ、保護 ポリペプチドを得、次いで、該不溶性樹脂及びアミノ酸の保護基を脱離させて、 次式（ＩＩ）： 【配列があります】 （式中の記号は前記と同義である。） で示されるポリペプチドを得、その３位と１６位、及び７位と１２位のシステイ ンをそれぞれのメルカプト基を介して結合させ、ジスルフィド結合を形成させる ことを特徴とする 次式： ▲数式、化学式、表等があります▼（Ｉ）（式中、Ｘは水酸基又はアミノ基を表 し、他の記号は前記と同義である。） で示されるポリペプチドの製造法。
4. （４）カブトガニ血球を低張抽出し、低張抽出残渣を酸性条件下で抽出し、抽出 液中の物質を精製することを特徴とするリポ多糖親和性ポリペプチドの製造法。
5. （５）カブトガニがＴａｃｈｙｐｌｅｕｓｔｒｉｎｄｅｎｔａｔｕｓ及びＴａｃ ｈｙｐｌｅｕｓｇｉｇａｓの少なくとも１つである請求項４記載のポリペプチド の製造法。