CN111912796A - 一种基于可见吸收光谱的超分辨成像***和方法 - Google Patents

Abstract

一种基于吸收光谱的超分辨成像***和方法，该***包括第一光源、第二光源及第三光源；所述第一光源用于视野范围内的显微成像；所述第二光源及第三光源分别产生波长为λ₂和λ₃的可见单色光，其中波长λ₃是待测样品中某物质的吸收峰；波长为λ₂的单色入射光对待测样品不产生吸收；调制所述第二光源的入射光波形，使所述λ₂的单色入射光在视野范围内产生对待测样品中某种物质的吸收，探测器通过阈值公式记录下所有的所述某种物质因吸收光谱而确定的准确位置，该准确位置的确定可以突破光学分辨衍射极限，从而形成超分辨成像图像。

Description

一种基于可见吸收光谱的超分辨成像***和方法

技术领域

本发明涉及超分辨成像技术，特别是利用光谱的超分辨成像技术。

背景技术

常规光学显微术的分辨率被限制在半波长左右，无法满足对于亚百纳米尺度的样品进行探测的需求。受激发射损耗显微术(STED)通过引入一束损耗光以受激发射的方式减小有效荧光的发光面积，可以实现超衍射极限的空间分辨率。自提出以来，STED显微术经过了多方面的改进和发展，已被成功地应用于生物医学、材料学等领域，对样品进行多功能超分辨成像。

在STED显微术中，有效荧光发光面积的减小是通过受激发射效应来实现的。一个典型的STED显微***中需要两束照明光，其中一束为激发光，另外一束为损耗光。当激发光的照射使得其衍射斑范围内的荧光分子被激发，其中的电子跃迁到激发态后，损耗光使得部分处于激发光斑***的电子以受激发射的方式回到基态，其余位于激发光斑中心的被激发电子则不受损耗光的影响，继续以自发荧光的方式回到基态。由于在受激发射过程中所发出的荧光和自发荧光的波长及传播方向均不同，因此真正被探测器所接受到的光子均是由位于激发光斑中心部分的荧光样品通过自发荧光方式产生的。由此，有效荧光的发光面积得以减小，从而提高了***的分辨率。

但上述STED受激发射损耗显微技术也有自身的缺点，即需要对样品进行预处理，参入荧光物质，以保证自发荧光的强度。另外，在实际光谱成像检测中，并不需要对整个样品的所有区域都需要超分辨图像，往往仅是对某些重点对象或重点区域的图像感兴趣；例如对待测品中某种物质的分布感兴趣，对其他非研究对象的图像并不感兴趣。因此成像并不需要针对整个视场空间提供超分辨成像。

发明内容

有鉴于此，针对上述存在的技术问题，本发明提供一种基于可见吸收光谱的超分辨成像装置及方法，利用该装置进行超分辨成像时，不需要预先对样品进行预处理以满足自发荧光的需要，同时只针对预先感兴趣的区域或待测物进行超分辨成像，即的现有的普通光显微成像基础上对部分区域进行了超分辨成像。因此提高了成像速度。

本发明的一个方面是提供一种基于可见吸收光谱的超分辨成像装置，所述装置包括：依光路方向的第一光源110，第一透镜120，狭缝130，第二透镜140，第一合束分束二色镜150、上述的各光学部件同光轴依顺序排列，所述第一光源110发出光束L1，经第一合束分束二色镜150反射后入射至物镜160，该光线L1经物镜160聚焦入射至样品M；此外，该***还包括依光路方向排列的第二光源210，第三透镜220，第二合束分束二色镜230；依光路方向的第三光源240，第四透镜250，光束整形装置260；反射镜270；经所述反射镜270反射的第三光源240发出的整形后光束L3入射至所述第二合束分束二色镜230后反射，与第二光源210的出射光L2同轴入射至光线扫描部件280；该入射光L2透过所述光线扫描部件280后入射至第三合束分束二色镜170，所述第三合束分束二色镜170反射所述入射光L2和L3，然后经所述物镜160透射后入射至固定在样品台上的待测样品M或入射至被夹具夹持的待测样品M；该待测样品M在检测前可不经过预先的染色处理；该入射光L1、L2或L3与该待测样品M相互作用后，产生出射光；所述第一光源产生波长范围为Δλ₁的可见光；第二光源和第三光源分别产生波长为λ₂和λ₃的单色光；其中所述波长λ₂的所述入射光L2对待测样品M内物质不产生吸收作用；而所述波长λ₃的所述入射光L3对待测样品M内的至少一种物质产生对应的吸收峰。

优选的，所述入射光L2被所述光束整形装置260，优选的为相位模板整形为入射到所述样品M产生截面为环形的入射光，所述光束L3的环形中心与所述光束L2的中心重合。

优选的，所述出射光透过光学处理部件180后射入到高分辨率探测器1902上进行成像。所述的光学处理部件180包括滤光片，用于滤除除波长λ₂和λ₃外的其他波长的光；还包括有收集聚焦光学***，用于对透射光收集聚集等处理。所述光线扫描部件(210)用于所述光束L2和L3在物镜视野范围内的扫描。

本发明还提供一种超分辨成像方法，包括上述的超分辨成像装置；还包括

步骤S1：打开所述第一光源，关闭所述第二光源和第三光源，所述第一光源产生的所述光线L1照射样品M时，样品M置于样品台上，此时光线L1的反射光经物镜160后反射，沿光路透过所述第一合束分束二色镜150、第三合束分束二色镜170后出射至探测器1901；

步骤S2：由探测器(1901)对所述物镜160视野范围内的视场成像；

步骤S3：关闭第一光源，打开所述第二光源和第三光源，入射光L2、L3照射所述待测样品M时，此时所述待测样品M被夹具夹持，保证所述入射光L2、L3透过所述待测样品M后出射，设置光学处理部件180位于样品M的另一侧；出射光透过所述光学处理部件180后射入到探测器1902上进行超分辨成像；

步骤S4:合成所述步骤2和步骤3的成像图像。

优选的，所述光线扫描部件280调整所述光束L2和L3的入射位置，重复步骤S3，所述探测器1902记录下物镜视野范围内的所有区域并成像，并且记录下所有环状中心光强小于所述阈值的位置，得到关于待测物的超分辨图像；

优选的，所述步骤S4包括：将步骤S1中得到的所述第一光源发光产生的高分辨率图像与所述步骤S4中得到的超分辨图像进行合并，从而得到关于待测物的混合高分辨率图像。

优选的，所述步骤S3中的所述阈值是吸收光谱的背景杂散光；

本发明的另一方面是提供与超分辨图像相配套的阈值的计算方法；所述方法包括单独计算只有第二光源发射波长λ₂的入射光时的噪声I_noise1；

单独计算只有第三光源发射波长λ₃的入射光时的噪声I_noise2；

总噪声为

所述阈值为计算公式为：

当探测器检测到中心光强I≤I_threshold时，即满足吸收中心的条件，可确定该位置即为样品中某物质的中心位置。

本发明的发明点和优点在于：

(1)利用STED超分辨原理，独创出基于吸收光谱的超分辨图像。该超分辨图像超出了普通成像的衍射极限，对于快速确定待分析物的准确位置有重要意见。其中使用的是普通激光器，并没有对现有激光器进行改装，增加了***的适配性。另外，该超分辨图像主要是指对待分析物准确位置的确定，有利于下一步观察等工作的开展。

(2)该超分辨成像与普通成像合成形成具备超分辨能力的图像，光路中将普通成像与超分辨成像共用一套***，简化了检测装置。

(3)本发明对于阈值的确定进行了研究。对于吸收光谱，其中心位置因存在噪声(主要来源于杂散光)，该杂散光是阈值确定的最主要因素。为了能够准确计算出总噪声水平，采取分别计算不同的相关波长引起的平均噪声，取均方根得到I_noise；取RMS均方根噪声消除了在探测器端不同的波长噪声光强值相互叠加造成的影响。另外，取

对于阈值，考虑了可见吸收光谱中吸收峰半高宽以及吸收峰衰减的特性。

附图说明

此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本申请的一部分，并不构成对本发明的限定。在附图中：

图1-a是本发明的基于吸收光谱的超分辨原理图1；

图1-b是本发明的基于吸收光谱的超分辨原理图2；

图2是红宝石可见吸收光谱示意图；

图3是本发明***光路***示意图；

图4-a是本发明的超分辨成像图1；

图4-b是本发明的超分辨成像图2；

图5是本发明基于吸收光谱的吸收中心阈值确定示意图。

具体实施例

对于基于吸收光谱的超分辨成像的原理解释可参考图1-a和图1-b进行说明。本发明所谓的“超分辨成像”是与STED超分辨成像相对而言的。本发明的超分辨成像由至少两个光源发出两束波长不同的单色光形成的。其中一束光的波长为λ₂；该波长λ₂对待测物是“透明”的，即不会产生光子与待测物的吸收；且该光束被整形，使得其在样品上形成与STED类似的“损耗光”，即具有“甜甜圈”截面形状的环形光束，该形状是通过例如相位掩膜PM进行调制而产生的，该调制方法可以采用本领域公知的，本领域技术人员熟知的方式进行调制，例如以STED损耗光方式进行调制成形；其中使用了相位掩膜板。在产生波长为λ₂的“损耗光”的同时，另一光源产生波长为λ₃的入射光，其对样品上至少一种待测物，例如待测物A的吸收光谱的最强吸收峰位置相对应；优选的，该光束不会被样品中的其他物质吸收，并且两束光的光轴重合，即波长λ₂的环形光束中心与波长λ₃的光束中心相重合。对于光束在样品中的截面宽度，并不一定要求在极限分辨率下，这一点也是很重要的，这允许该技术方案可采用普通的大功率激光器即可实现本发明。

对于样品本身，区别于STED的是该样品本身并不需要特殊的处理，特别是为了产生荧光而添加荧光染料分子，这使得样品的制备变得更加简单，方便快速检测。当两束不同波长的单色光入射至样品上时，两束同轴光束也可在物镜视野范围内的扫描，当该区域内未发现有待测物A时，此时透过待测物的透射光或反射光其波长仍然为λ₂和λ₃；当扫描某位置时有待测物A时，此时波长为λ₃的入射光被待测物A吸收，光强减弱，理想情况下光强全部被吸收为零(实际上仍存在剩余光强，其为杂散光等噪声)；而波长为λ₂的入射光在该位置处光强不变，在此情况下会产生如图1-b所示的周围光强强，中心区域在理想情况下不发光(实际上有杂散光等噪声发光微弱光)的从周围到中心减弱的光强分布。此时的不发光区域(或发微弱杂散光区域)位于该环形截面内，即可能是在艾里斑尺寸更小的区域出现黑点(或微弱光强)；利用探测器可记录下此黑点的位置，当物镜视野范围内的区域都被扫描过，所述探测器将记录下该视野的所有黑点位置，该位置代表了待测物A的具***置，该位置的记录是可以突破艾里斑衍射限制的，因此完成了超分辨成像。应当注意，该超分辨图像不是一次成像，是波长为λ₂的出射光成像与波长为λ₃的出射光成像的合成图。另外，将该超分辨成像与普通的具有衍射极限的成像***进行合成成像，即满足了对感兴趣待测物的超分辨成像，同时也提高了成像效率，节省成像时间。

优选的，如果待测物为多种物质时，可以通过改变第三光源的波长λ₃，使该λ₃与每一待测物的最强吸收峰处波长相一致，从而可以满足检测多种待测物的需要。应当理解，此时第二光源的波长λ₂仍然是对样品中的待测物无吸收的。该波长λ₃的改变可以通过在第二光源发射白光并增加滤色片，滤色轮或液晶可调谐滤光器等方式实现。

对于待测物的某些待研究的一种或几种物质，其分布位置是成像需要关注的位置，而其他位置，特别是不感兴趣的区域，例如不含有该物质的区域并不需要特别的关注，这为混合型分辨率的成像提供了需求。在不含有该物质的区域不提供成像或者提供相对低分辨率的图像，而在感兴趣的区域提供超分辨率的成像，这样可以解决现有的超分辨成像数据数理量大，成像速度慢的缺陷，同时又可以克服没有超分辨图像，而对感兴趣区域无法进一步观察的技术问题。

具体的，先提供一普通显微成像***，该成像***采用现有的光路***，其分辨率受到衍射分辨率限制：该成像***的分辨率为：

一般的，第一光源例如提供550nm绿光，也可以是白光光源，而物镜N.A＝0.95(奥林巴斯：MPLAPON型高分辨率物镜)；折射率n＝1；该成像***的理论分辨率d≈290nm。探测器采用CCD或CMOS探测器，光路可采用共聚集显微成像***，当然也可以根据实际情况选择非共聚焦显微成像***。

另一方面，提供了第二光源和第三光源。对于第二光源和第三光源优选激光光源，以方便对光源进行整形等操作，所述第二光源和第三光源可以是脉冲光源，也可以是连续光源。对于波长的选择，第二光源选择对于待测物质不产生吸收峰的波长，例如可以是450nm蓝光脉冲光；第三光源的波长选择为对待测物质有吸收峰的波长位置。例如：红宝石样品的致色元素有铬、铁、锰等。其中Cr3+是使红宝石呈现出红色的主要原因，其他元素会产生非红色，影响其成色。其中Fe3+离子的存在会使红宝石呈现出黄色。针对该Fe3+进行吸收谱线研究发现，能呈现出该黄色调是因为产生了d电子跃迁⁶A₁→⁴E。具体的吸收谱可以参见附图2。设第三光源发射使Fe³⁺的d电子跃迁⁶A₁→⁴E的波长为564nm激光；则在样品中出现有Fe³⁺的位置因产生吸收光谱，该处的透射光强较弱，理想情况下将成为一个发光黑点。而在该离子的周围区域正常出现反射光或透射光；探测器检测该出现黑点光强的位置并记录下周围的光强，则会产生一吸收光谱成像图。因为只有存在d电子跃迁⁶A₁→⁴E跃迁的位置才会产生黑点，而周围位置并没有吸收峰，因此该分辨率超过了一般光学显微成像的衍射极限的限制；这与STED超分辨成像正相反：在STED超分辨成像中，被探测器所接受到的光子均是由位于激发光斑中心部分的荧光样品通过自发荧光方式产生的，而在其周围的发光被抑制(该波长无自发荧光，产生其他波长的受激发射荧光)。通过对该吸收位置的记录，从而可以找到待测物质的具***置，以利于进一步的研究。参见图2。这是红宝石样品的吸收光谱，该吸收光谱存在多个吸收峰，研究发现其中待测物Fe³⁺吸收峰最强值发生在d电子跃迁⁶A₁→⁴E跃迁的位置，即波长λ₃＝552nm；选择避开这些吸收峰的位置，例如λ₂＝470nm。

与具有衍射极限的显微成像合成的成像***可参考图3，根据本实施例，该测量***包括依光路方向的第一光源110，第一透镜120，狭缝130，第二透镜140，第一合束分束二色镜150、上述的各光学部件同光轴依顺序排列，所述第一光源110发出束L1，经第一合束分束二色镜150反射后入射至物镜160，该光线L1经物镜160聚焦入射至样品M；此外，该***还包括依光路方向排列的第二光源210，第三透镜220，第二合束分束二色镜230；依光轴顺序排列的第三光源240，第四透镜250，光束整形装置260，例如相位掩模PM；反射镜270；经所述反射镜270反射的第三光源240发出的整形后光束L3入射至所述第二合束分束二色镜230后反射，与第二光源210的出射光L2同轴入射至光线扫描部件280，例如振镜；该入射光L2透过所述光线扫描部件280后入射至第三合束分束二色镜170，所述第三合束分束二色镜170反射所述入射光L2和L3，然后经物镜160后入射至固定在样品台上的待测样品M；该待测样品M在检测前可不经过预先的染色处理；该入射光L1、L2或L3与该待测样品M相互作用后，产生出射光。当第一光源产生的所述光线L1照射样品M时，样品M置于样品台上(图中未示出)，此时光线L1的反射光经物镜160后出射，沿光路透过所述第一合束分束二色镜150、第三合束分束二色镜170后出射至高像素探测器1901，例如CCD或CMOS。当仅有入射光L2、L3照射所述待测样品M时，此时所述待测样品M被夹具夹持(图中未示出)，保证所述入射光L2、L3透过所述待测样品M后出射，该出射光位于样品M的另一侧；此时出射光透过光学处理部件180后射入到高分辨率探测器1902上进行成像。所述的光学处理部件180包括滤光片，用于滤除除波长λ₂和λ₃外的其他波长的光；还包括有收集聚焦光学***，用于对透射光收集聚焦等处理。

上述是对本***涉及到的光路以及光学部件的设置的简要说明。其中还可以包括其他部分，例如在超分辨成像中用到的相位板，1/4波片等，这些设置在第二光源、第三光源与待测物之间。应该理解，本领域技术人员出于进一步提高分辨率的需要，是能够想到其设置在上述光路的具***置的。

第二光源的目的是产生一个类STED损耗光的入射光，其目的是提供足够的对比度，因为即便是产生吸收峰，但该位置并非不会检测到光强，实验表明仍然会有少量光未被吸收，这些光可能来源于噪声等其他误差，因此实际上该位置的图像仍然不清楚。为了提高清晰，在该黑洞位置提供一强入射光，该入射光针对该待测物无吸收。因此可参见图1-b在某待测物的周围形成一个环形光环，中间区域是待测物的位置，该位置因对第三光源发出的光有吸收，因此为黑点形式。从而提高了清晰度。该成像分辨率可以达到80–110nm的横向分辨率。

上述的两套分辨率的图像，优选CCD或CMOS探测器接收；其中一套是第一光源发出光产生的成像图像。其经探测器探测后存储；另一套是第二光源和第三光源发出单色光后探测得到的超分辨图像，两者合成后，形成对待测物质的高分辨成像图像。该图像中的Fe³⁺被准确标记出来，该区域图像通过超分辨图像成到。其他视场范围内的图像为普通光学成像得到，从而在保证超分辨的情况下，提高成像速度。如图4-a和图4-b所示为使用了本***的红宝石晶体超分辨成像图，其中黑色阴影即为待测的含有Fe³⁺杂物的中心位置。其中图4-a的分辨率达到了105nm；图4-b是图4-a的局部放大图。

实施例2:

本发明还提供一种基于可见吸收光谱的超分辨成像方法；该方法是在实施例1基础上的改进，实施例的技术方案包括在该实施例2中；

包括步骤S1：第一光源发出波长范围为Δλ₁的入射光，对待测物进行具有衍射分辨极限的成像；

步骤S2，关闭第一光源；并打开第二光源和第三光源，优选为激光光源。对所述待测物分别以λ₂和λ₃波长的激光入射；其中λ₂对待测物无吸收，且该第二光源入射至待测物的入射激光波形截面为环状；第三光源的波长λ₃为所述待测物的吸收光谱峰值。使用探测器对所述第二光源和第三光源照射到待测样品后的出射光进行检测，该出射光包括环状的波长为λ₂的出射光以及在环状的中心波长为λ₃的出射光；还包括环状的波长为λ₂的出射光以及位于环状中心的背景光；所述背景光为以波长λ₂入射光入射被待测样品中的待测物吸收后的剩余杂散光噪声；

步骤S3，设定光强阈值，由探测器记录所述步骤S2中的环状中心光强小于该阈值的位置；如图5所示；

步骤S4，重复步骤S2-S3，探测器记录下物镜视野范围内的所有区域，并且记录下所有环状中心光强小于所述阈值的位置，得到关于待测物的超分辨图像；

步骤S5，将步骤S1中得到的所述第一光源发光产生的高分辨率图像与所述步骤S4中得到的超分辨图像进行合并，从而得到关于待测物的混合高分辨率图像。

上述步骤S3中的所述阈值是吸收光谱的背景杂散光。

噪声处理与阈值确定：

该阈值的计算过程包括单独计算只有第二光源发射波长λ₂的入射光时的噪声I_noise1；单独计算只有第三光源发射波长λ₃的入射光时的噪声I_noise2；该噪声设定为:

设定该阈值为

参考图5，当探测器检测到中心光强I≤I_threshold时，即满足吸收中心的条件，可确定该位置即为样品中某物质的中心位置。上述公式(1)采用了均方根求平均噪声的方法。在光谱测量中往往采用的是直接测量噪声的方式得到，但该方法并不适用于本发明的技术方案。当采用高像素探测器记录下不同光强水平时，高速扫描时每帧图像成像会在同一像素位置产生延迟，即在一像素中记录了不同波长λ₂和λ₃的叠加噪声。这与中心位置的实际噪声水平并不同。另外，对于阈值与噪声水平的关系，引入1/e因子，这也是考虑到了可见吸收光谱中吸收峰半高宽以及吸收峰衰减的特性，这与本发明的环形光束与中心波长吸收的光入射结构相关。

以上所述，以上实施例仅用以说明本申请的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本申请进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例中所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本申请各实施例技术方案的精神和范围。

应当理解，在本申请中，“至少一个(项)”是指一个或者多个，“多个”是指两个或两个以上。“和/或”，用于描述关联对象的关联关系，表示可以存在三种关系，例如，“A和/或B”可以表示：只存在A，只存在B以及同时存在A和B三种情况，其中A，B可以是单数或者复数。字符“/”一般表示前后关联对象是一种“或”的关系。“以下至少一项(个)”或其类似表达，是指这些项中的任意组合，包括单项(个)或复数项(个)的任意组合。例如，a，b或c中的至少一项(个)，可以表示：a，b，c，“a和b”，“a和c”，“b和c”，或“a和b和c”，其中a，b，c可以是单个，也可以是多个。

Claims (8)

1.一种基于可见吸收光谱的超分辨成像装置，所述装置包括：依光路方向的第一光源(110)，第一透镜(120)，狭缝(130)，第二透镜(140)，第一合束分束二色镜(150)，所述第一光源(110)发出光束L1，经第一合束分束二色镜(150)反射后入射至物镜(160)，所述光束L1经所述物镜(160)聚焦入射至样品M；该***还包括依光路方向排列的第二光源(210)，第三透镜(220)，第二合束分束二色镜(230)；依光路方向的第三光源(240)，第四透镜(250)，光束整形装置(260)；反射镜(270)；经所述反射镜(270)反射的第三光源(240)发出的整形后光束L3入射至所述第二合束分束二色镜(230)后反射，与透射所述第二合束分束二色镜(230)的所述光束L2同轴入射至一光线扫描部件(280)；透过所述光线扫描部件(280)后的光束L2和L3入射至第三合束分束二色镜(170)，所述第三合束分束二色镜(170)反射所述入射光L2和L3，然后经所述物镜(160)透射后入射至固定在样品台上的待测样品M或入射至被夹具夹持的待测样品M；该待测样品M在检测前不经过预先的染色处理；该入射光L1、L2或L3与该待测样品M相互作用后，产生出射光；

所述第一光源产生波长范围为Δλ₁的可见光；第二光源和第三光源分别产生波长为λ₂和λ₃的可见单色光；其中所述波长λ₂的所述入射光L2对待测样品M内物质不产生吸收作用；且该入射光L2为入射到所述样品M能产生截面为环形的入射光；所述波长λ₃的所述入射光L3对待测样品M内的至少一种物质产生对应的吸收峰光谱。

2.根据权利要求1所述的装置，所述入射光L2被所述光束整形装置(260)，优选的为相位模板整形为入射到所述样品M产生截面为环形的入射光，所述光束L3的环形中心与所述光束L2的中心重合。

3.根据权利要求1-2任一项所述的装置，所述出射光透过光学处理部件(180)后射入到高分辨率探测器(1902)上进行成像。所述的光学处理部件(180)包括滤光片，用于滤除除波长λ₂和λ₃外的其他波长的光；还包括有收集聚焦光学***，用于对透射光收集聚集等处理；所述光线扫描部件(280)用于所述光束L2和L3在物镜视野范围内的扫描。

4.一种超分辨成像方法，包括权利要求1-3任一项所述的超分辨成像装置；所述方法包括如下步骤：

步骤S1：打开所述第一光源，关闭所述第二光源和第三光源，所述第一光源产生的所述光束L1照射样品M时，样品M置于样品台上，此时光线L1的反射光经物镜(160)后反射，沿光路透过所述第一合束分束二色镜(150)、第三合束分束二色镜(170)后出射至探测器(1901)；

步骤S2：由探测器(1901)对所述物镜(160)视野范围内的视场成像；

步骤S3：关闭所述第一光源，打开所述第二光源和第三光源，所述入射光束L2、L3照射所述待测样品M时，此时所述待测样品M被夹具夹持，保证所述入射光L2、L3透过所述待测样品M后出射，设置光学处理部件180位于所述样品M的另一侧；出射光透过所述光学处理部件180后射入到探测器1902上进行超分辨成像；

步骤S4：合成所述步骤2)和步骤3)的成像图像。

5.根据权利要求4所述的方法，所述光线扫描部件(210)调整所述光束L2和L3的入射位置，重复所述步骤S3，所述探测器1902记录物镜视野范围内的所有区域并成像，并且记录下所有环状中心光强小于光强阈值的位置，得到关于待测物的超分辨图像。

6.根据权利要求5所述的方法，所述步骤S4包括：将步骤S1中得到的所述第一光源发光产生的高分辨率图像与所述步骤S4中得到的超分辨图像进行合并，从而得到关于所述待测物的混合高分辨率图像。

7.根据权利要求4所述的方法，所述步骤S3中的所述阈值是吸收光谱的背景杂散光。

8.一种提供与超分辨图像相配套的阈值计算方法，所述方法包括提供一基于吸收光谱的超分辨成像装置，该装置至少包括有第二光源和第三光源；其中所述第二光源和第三光源分别出射波长为λ₂和λ₃的单色光L2和L3，并且所述单色光L2和L3同轴入射至待测样品M，其中所述波长λ₂的所述入射光L2对所述待测样品M内某物质不产生吸收作用；所述波长λ₃的所述入射光L3对待测样品M内的至少一种物质产生对应的吸收峰；所述方法还包括单独计算只有第二光源发射波长λ₂的入射光时的噪声I_noise1；单独计算只有第三光源发射波长λ₃的入射光时的噪声I_noise2；

总噪声为

阈值计算公式为：

当探测器检测到中心光强I≤I_threshold时，满足吸收中心的条件，确定该位置即为样品中所述某物质的中心位置。

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