JP3670662B2 - 植物プラスチドにおけるトランスジェニック構造体の制御された発現 - Google Patents
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Description
発明の分野
本発明は、植物への遺伝子工学技法の適用に関する。より詳しくは、本発明は、特定のウィルスポリメラーゼにより認識されるプロモーターを用いて、クロロプラスト発現構造体と共に特定のウィルスRNAポリメラーゼの発現のためへの核構造体の使用に関する。
背 景
高等植物のプラスチドは、遺伝子工学のための魅力ある標的である。植物プラスチド（クロロプラスト、アミロプラスト、エライオプラスト、クロモプラスト、等）は、光合成の他に、産業的に重要な化合物、たとえばアミノ酸、複雑な炭水化物、脂肪酸及び色素の生成を担当する主要な生合成センターである。プラスチドはプロプラスチドとして知られる通常の前駆体に由来し、そして従って、一定の植物種に存在するプラスチドはすべて同じ遺伝子含有物を有する。植物細胞は小さな120〜160kbの環状ゲノムの500〜10,000コピーを含み、それらの個々の分子は、大きな（約25kb）逆方向反復体を有する。従って、ひじょうに高レベルの外来性遺伝子発現を潜在的にもたらすことができる興味ある特定の遺伝子の20,000までのコピーを含むように植物細胞を構築することが可能である。
DNA配列及び生化学データは、プラスチドオルガネラの転写及び翻訳機構並びにそれらの開始シグナルが原核生物系に見出されるものと類似していることを示す。実際、プラスチド由来のプロモーター配列は、原核細胞においてレポーター遺伝子の発現を指図していることを報告されている。さらに、プラスチド遺伝子は、原核生物において存在するように、ポリシストロニックオペロン中にしばしば構成されている。
プラスチドと原核生物との間の明白な類似性にもかかわらず、プラスチド及び原核生物において遺伝子発現を制御するために使用される方法には基本的な差異が存在する。
原核生物に典型的に観察される転写制御機構に対立するものとして、プラスチド遺伝子の発現はトランス−作用性核コードタンパク質により翻訳及びmRNA安定性のレベルで主に制御されている。
植物クロロプラストの安定した形質転換に向けられたこれまでの研究は、葉のプラスチド中に所望する遺伝子を組込むための相同組換えに依存して来た。この態様においては、組換えDNA構造体のための同種形成性又はほぼ同種形成性のトランスジェニック植物が得られる。しかしながら、プラスチド遺伝子発現のための遺伝子工学に対する主な欠点は、所望する遺伝子生成物の発現のタイミング及び／又は部位を制御するための組織特異的及び／又は組織進行性調節機構の欠乏である。トランスジェニック植物におけるプラスチドオルガネラの完全な補体が形質転換されるので、組込まれた構造体は、すべてのプラスチドを含む植物組織において発現される。
プラスチドに挿入される配列の発現を制御するための機構は、特定の組織タイプに存在するプラスチド経路、たとえばそれぞれジャガイモ塊茎又は油種子におけるスターチ及び脂肪酸生合成経路、花色経路、種々の果物プラスチドにおける果物熟成関連反応、及び若い植物組織において耐除草剤性を生成するように標的化され得る経路の最適な変性のために有用であろう。さらに、たとえばアンチセンス構造体を用いて生来のプラスチド遺伝子の発現を減じることによる、存在するプラスチド代謝の調節されていない変性及び／又は新しい生化学的経路の導入が、生存する植物を得ることの不可能さをもたらす。たとえば、初期発育段階での生長する組織における一定の経路の変更が、調節されていないＥ．コリ又はクロロプラスト遺伝子プロモーターを用いて観察され、有害な最終生成物の生成をもたらし、そして従って、トランスジェニック植物を得る能力を制限する。しかしながら、所望する生化学的反応のための遺伝子が発育の特定の段階でのみ発現するようプログラムされている場合、その反応は、所望する期間で、たとえば収穫すべき十分な植物バイオマスが存在する時点で、所望する生成物を生成するように制御され得る。この態様においては、所望する最終生成物の実質的な量が得られる。
関連文献
プラスチドの安定した形質転換は、緑藻類クラミドモナス(Chlamydomonas)(Boynton et al．（1988）Science 240：1534-1538)及び最も最近は、高等植物(Svab et al．（1990）Proc.Natl.Acad.Sci. USA 87：8526-8530；Svab and Maliga（1993）Proc.Natl.Acad.Sci. USA 90：913-917)に報告されている。それらの方法は、選択マーカーを含み、そして相同組換えによりプラスチドゲノムに標的を向けられたDNAの粒子ガン導入に頼っている。
ゼニゴケ（Ohyama et al．（1986）Nature 322：572-574）、イネ（Hiratsuka et al．（1989）Mol.Gen.Genet. 217：185-195）及びタバコ(Shinozaki et al．（1986）EMBO J.ら：2043-2049)からのプラスチドゲノムの完全なDNA配列が報告されている。
プラスチドプロモーターは、原核細胞においてレポーター遺伝子の発現を指図するものとして報告されている（Gruissem et al．（1993）Critical Reviews in Plant Sciences 12：19-55）。
Ｔ７ポリメラーゼによるＥ．コリにおけるクローン化された遺伝子の選択的発現が、Rosenberg et al．（Gene（1987）56：125-135）により報告されている。
タバコ（Lassner et al．（1991）Plant Mol.Biol．17：229-234）、マウス細胞(Lieber et al．（1989）Nucl.Acids Res．17：8485-8493)及びサッカロミセス セレビシアエ(Saccharomyces cerevisiae)(Benton et al．（1990）Mol.Cell.Biol．10：353-360）における核に対してのT7 RNAポリメラーゼの標的化が報告されている。
発明の要約
本発明によれば、植物プラスチドゲノム中に挿入された外来性DNA配列の発現のタイミング又は組織パターンを制御する方法を提供するために植物細胞の遺伝子操作のために有用な構造体が供給される。核形質転換のための構造体は、植物細胞組織におけるウィルスの単一のサブユニットRNAポリメラーゼの発現、及び植物細胞プラスチド中への発現されたポリメラーゼタンパク質の標的化を提供する。核構造体は、すべての植物細胞におけるウィルスポリメラーゼの組織的な発現を提供するもの、及び好ましくは、特定の植物組織において及び／又は特定の発育段階で、発現を提供するものを包含する。
本明細書においてポリヌクレオチドとしても言及される、プラスチド形質転換に使用するためのDNA配列は、上記の核発現構造体から発現されたRNAポリメラーゼに対して特異的であるウィルスゲノムプロモーター領域、及び形質転換されたプラスチド細胞において発現されるべき対象のDNA配列を含んで成るプラスチド発現構造体を含む。プラスチド形質転換のためのポリヌクレオチドのこの部分は、“プラスチド発現構造体”として本明細書では言及される。対象のDNA配列は、たとえば生来のプラスチド遺伝子の発現の低下が所望される場合、センス配向又はアンチセンス配向での単一のコード領域であり得る。その対象のDNA配列は、たとえば、プラスチド中への外来性生化学経路の導入が所望される場合、オペロンとして発現されるべき多くの連続したコード配列を含むことができる。プラスチド形質転換のためのポリヌクレオチドはまた、植物プラスチドオルガネラにおけるマーカーの発現を提供するDNA構造体を含み、ここで前記マーカーは前記マーカーを発現するプラスチドオルガネラを含んで成る植物細胞の選択を提供する。このプラスチド構造体はまた、本明細書において、“プラスチド選択構造体”としても言及される。プラスチド形質転換に使用するためのポリヌクレオチドはまた、プラスチドゲノム中への発現及び選択構造体のトランスファーを提供する手段を含むであろう。便利には、トランスファーされるべき構造体を両端に有する標的のプラスチドゲノムに対して相同性の領域が包含される。プラスチドゲノムへのトランスファーのための他の手段はまた、転移因子の使用を包含する方法により本明細書において考慮される。
本明細書に記載される核及び／又はプラスチド構造体を含んで成る植物細胞及び植物もまた、本発明において考慮される。そのような植物又は植物細胞は、本発明の核及びプラスチド構造体の両者を有する植物細胞を提供するために、植物育成又は形質転換法に使用され得る。本発明の核及びプラスチド発現構造体の両者を含んで成る植物細胞は、ウィルスプロモーター領域の制御下でのプラスチドゲノムにおける対象のDNA配列の発現の結果として変更された表現型を有するであろうことが理解される。
さらに、植物プラスチドにおける組織及び／又は発生する選択的な発現、及び得られる表現型の変更を提供する方法が、本発明の核ポリメラーゼ構造体及びプラスチド発現構造体の両者を含んで成る植物細胞において付与される。
図面の説明
図１。核形質転換のためのT7 RNAポリメラーゼ発現二元構造体、pCGN4026の略図が示される。LB、左側のT-DNAボーダー；RB、右側のT-DNAボーダー；35Ｓ、CaMV 35Sプロモーター；nptII、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子；tml 3′、腫瘍形態学“大きな”３′領域；d35S、増強されたCaMV 35Sプロモーター；TP、タバコ小サブユニット５′未翻訳領域、クロロプラストトランジットペプチドとイントロンＩ及び成熟タンパク質の初めの12個のアミノ酸；T7 RNAP、ファージT7 RNAポリメラーゼ遺伝子のコード領域（出発コドン欠失）；nos 3′、ノパリンシンターゼ３′領域。
図２。T7 RNAポリメラーゼ依存性GUS発現マーカーを含むトランスプラストミックタバコ系の調製のための構造体及びクロロプラストDNAのサザン分析が示される。pCGN4276構造体の略図及びタバコプラスチドゲノム中へ組込みの表示が上部に示される。入って来るDNA及び野生型DNAのための予測されたサイズのBamHＩフラグメントのが提供される。入って来るDNAの５′端上にはBamHＩ部位は存在しないので、その２種のキメラ遺伝子の組合されたサイズを表示する。また、サザン分析のために使用されるプローブＡ及びＢの位置も示されている。プローブＡは形質転換の程度を決定し、そしてプローブＢはGUS遺伝子の存在を示す。サザン分析の結果は、図２の下部に示されている。4276／4026-3クローン１及び２は、Ｎ．タバカムvar.（N. tabacum var.）“Xanthi”系4026-3における２つの独立したスペクチノマイシン耐性形質転換体を示す。4276／Xanthiは、野生型Ｎ．タバカムvar.“Xanthi”におけるスペクチノマイシン耐性形質転換体を示す。対照DNAは、形質転換されていない“Xanthi”からである。
発明の特定の記載
本発明の核形質転換構成体は、植物細胞の核のゲノム中に挿入され得、そしてプラスチドオルガネへのポリメラーゼタンパク質の輸送を付与することができるトランジットペプチド領域に融合されるウィルス性単一サブユニットRNAポリメラーゼの発現を提供できるヌクレオチドのいづれかの配列を含む。本発明のウィルスポリメラーゼコード配列は、それらの細菌宿主の感染に基づいてDNA−依存性RNAポリメラーゼの合成を提供する形態学的に類似する細菌ウィルスのグループから得られる。他の既知のDNA依存性RNAポリメラーゼに比べて、このクラスの細菌ウィルスによりコードされるポリメラーゼは、単一のタンパク質種（約100kDの分子量）から成り、そして特定のプロモーター配列からの転写を選択的に認識し、そして提供する。このタイプのポリメラーゼをコードするいくつかの十分に特徴づけられたウィルスは、Ｅ．コリＴ３及びＴ７ファージ及びサルモネラチフィムリウム（Salmonella typhimurium）のSP６ファージを包含する。そのようなポリメラーゼのためのコード配列は、McGraw et al．（Nucl.Acids Res．（1985）13：6753-6766）及びKotani et al．（Nucl.Acids Res．（1985）15：2653-6664）により報告されている。このクラスのバクテリオファージの他のメンバーは、プスードモナス(Pseudomonas)ファージgh-1、クレブシエラ（Klebsiella）ファージＫ11、シトロバクター(Citrobacter)ファージviIII、及びセラチア（Serratia）ファージIVを包含する。従って、このクラスのファージのいづれかのメンバーからの関連するポリメラーゼのためのコード配列を得ることができ、そしてたとえばＴ７ポリメラーゼコード配列を含んで成る構造体により本明細書においては例示される核発現構造体に使用され得る。
植物プラスチド中へのウィルスポリメラーゼの輸送を提供するようにトランジットペプチド領域をコードする配列は好ましくは、植物核コードプラスチドタンパク質、たとえばリブロースビスリン酸カルボキシラーゼの小サブユニット（SSU）、アシルキャリヤータンパク質（ACP）を含む植物脂肪酸生合成関連遺伝子、ステアロイル−ACPデサチュラーゼ、β−ケトアシル−ACPシンターゼ及びアシル−ACPチオスステラーゼ又はLHCPII遺伝子から得られる。プラスチドへの輸送を提供するトランジットペプチドのためのコード配列は、特定のトランジットペプチドのコード配列のすべて又は一部を含むことができ、そしてまた、特定のトランジットペプチドに関連する成熟タンパク質コード配列の一部も含むことができる。プラスチドオリガネラ中に標的のタンパク質を運ぶために使用され得るトランジットペプチドの多くの例が当業界において存在する。本発明において使用される特定のトランジットペプチドをコードする配列は、プラスチドへの輸送が得られる限り、重要ではない。本明細書に提供される例においては、タバコRuBISCO SSU遺伝子５′未翻訳領域＋クロロプラストトランジットペプチドのためのコード配列及び成熟SSUの12個のアミノ酸（イントロンＩを含む）が、タバコプラスチドへの核発現されたＴ７ポリメラーゼの輸送を提供するために構造体に含まれる。ブラシカのプラスチドへの核発現されたＴ７ポリメラーゼの輸送に関しては、タバコSSUイントロンＩ領域が欠失されている類似する構造体が使用され得る。
植物細胞核におけるトランジットペプチドウィルスポリメラーゼコード配列の発現を提供する植物プロモーターは、すべての植物組織において構成的な発現を提供し、又は好ましくは、特定の植物組織において、及び／又は植物成長の特定の段階で発現を提供できる。構成プロモーターは、特定の植物において高い又は低いレベルの発現を示すことができるが、しかし植物のすべての部分においては少なくともあるレベルの発現を一般的に提供するであろう。植物の構成プロモーターの例は、CaMVからの19Ｓ及び35Ｓプロモーター及びmas，nos及びocsアグロバクテリウムT-DNA遺伝子からのプロモーターを包含する。発育性又は組織選択性発現に関しては、有用なプロモーターは、植物種子、果物、塊茎、繊維細胞、植物花組織及び花粉において選択的に発現された遺伝子からのものを包含する。
種子プラスチドにおける選択的な発現は、脂肪酸生合成経路の変性、貯蔵タンパク質の変性又は種子における新しい経路の導入、たとえば細菌性ポリヒドロキシブチレート(PHB)経路の導入が所望される場合に、所望される。そのような適用のために有用である植物機能プロモーターの例は、植物貯蔵タンパク質遺伝子、又は油性種子における脂肪酸生合成に関与する遺伝子からのものを包含する。そのようなプロモーターの例は、ナピン（Kridle et al．（1991）Seed Sci.Res．1：209：219）、ファーセオリン(Phaseolin)、ゼイン、ダイズトリプシンインヒビター、ACP、ステアロイル−ACPデサチュラーゼ及びオレオシン(Oleosin)のような遺伝子からの５′調節領域を包含する。種子特異的遺伝子調節は、EP 0255378(２／３／88）に論じられている。
果実プラスチドにおける選択的な発現は、たとえば果物の色又は風味の発育経路の変性が所望される場合、又は植物果実における炭水化物含有率の変更が所望される場合に所望される。そのような用途のために有用である植物機能プロモーターの例は、ポリガラクツロナーゼ(Bird et al．（1988）Plant Mol.Biol．11：651-662）、トマトからのＥ−８遺伝子（Deikman et al．（1988）EMBO J．7：3315-3320；Pella Penna et al．（1989）Plant Cell 1；53-63）、トマト2A11（Dear et al．（1989）Plant Mol.Biol．13：639-651）又はWO 91／01324(２／７／91）に記載されているような子房特異的プロモーター領域のような果実関連遺伝子からのものを包含する。
主なスターチ貯蔵組織、たとえばジャガイモ塊茎又はトウモロコシ種子におけるスターチ合成経路の変性は、本明細書に記載されるプラスチド発現方法により達成され得る。そのような場合、パラチン(Paratin)(Twell et al．（1987）Plant Mol.Biol．9：365-375）、ゼイン又は植物スターチシンターゼ（Visser et al．（1989）Plant Sci．64：185-192）からのプロモーターが、ウィルス性単一サブユニットRNAポリメラーゼの核発現のために特に有用である。
本明細書に記載される構造体及び方法により選択的に変性され得る他の植物組織は、植物花組織及び綿繊維のような特殊化された組織を包含する。花組織に選択的にウィルスポリメラーゼの核発現のために使用され得るプロモーターは、カルコンシンターゼ遺伝子、たとえばペチュニアからのCHS遺伝子Ａからのプロモーターを包含する（Koes et al．（1986）Nucl.Acids Res．14：5229-5329）。花色の変性に関しては、花組織におけるアントシアニン又はフラボノイド型色素の発現又はアンチセンス制御が所望される。植物の花色遺伝子操作に関しては、van Tunen et al．（Plant Biotechnology Series，Volume 2（1990）Developmental Regulation of Plant Gene Expression，D.Grierson ed.）を参照のこと。繊維組織の変性に関しては、綿繊維組織における発現のためへのトマトp7Z遺伝子プロモーターの使用が、同時継続出願07／998,158(12／29／92出願)に記載されている。綿繊維細胞における発現のために有用な他のプロモーターはまた報告されている(Crow，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci．USA（1992）89：5769-5773)。所望する綿繊維変性は、強度又はきめの改良を包含する。そのような改良のために使用され得る遺伝子の例は、PHB生合成遺伝子、セルロースシンターゼ遺伝子(Saxena et al．（1990）Plant Mol.Biol．15：673-683)及び菌類のキチンシンターゼ遺伝子(Bowen et al．Proc.Nat.Acad.Sci．（1992）89：519-523)を包含する。
綿繊維の有用な表現型変性のもう１つの例は、たとえば青又は黒色繊維を有する着色された綿の生成である。綿繊維における色系生成のためのコード配列の核発現のための方法は、07／998,158に記載されている。たとえば、メラニン生成に関しては、ストレプトミセス（Streptomyces）からの２つのタンパク質コード配列（Bernan et al．（1985）Gene 37：101-110）が使用され得る。２種のタンパク質、すなわちORF438生成物及びチロシナーゼのためのmRNAが、単一プロモーターストレプトミセスから転写される。本発明によれば、オペロンが特定のウィルスプロモーター領域、たとえば本明細書に記載されるＴ７プロモーターからの発現のために適合され、そしてプラスチド形質転換のために使用され得る。同様に、２種以上の遺伝子生成物が、形質転換された宿主細胞におけるインジゴの生成のために必要とされる。担当酵素がモノオキシゲナーゼである場合、未審査請求の日本特許出願公開番号第２−119777(Suzuki et al.)に記載されるように、２種の遺伝子生成物が必要とされる。酵素がデオキシゲナーゼ、たとえばKurkela et al．Gene（1988）73：355-362に記載されるナフタレンジオシキゲナーゼ（ND）である場合、３種の遺伝子生成物が必要とされる。トリプトファナーゼコード配列の使用はまた、インジゴへの転換のために利用できるインドールの量を高めるためにも所望される。トリプトファナーゼ遺伝子配列の源は、Ｅ．コリを包含する（たとえば、Deeley et al．（1982）J.Bacteriol．151：942-951を参照のこと）。従って、そのようなタンパク質のためのコード配列は、単一サブユニットのウィルスポリメラーゼにより特異的に認識されるウィルスプロモーターの後ろにポペロンとして提供され、そして本明細書に記載されるようにプラスチド発現構造体に使用され得る。
追加の態様においては、本出願は、若い組織に存在し、又は活性的に成長している植物組織、たとえば***領域に選択的に存在するプラスチド経路を選択的に変性する方法を提供する。特に、光誘発性プロモーター、たとえば若い組織におけるウィルスポリメラーゼの発現のためのSSU又はクロロフィルＡ／Ｂ結合タンパク質遺伝子からのプロモーターが考慮される。活動的に成長する植物組織に関しては、EF-1の遺伝子からのプロモーターが使用される。たとえばUSPN 5,177,011（Shewmaker et al，1／５／93発行）を参照のこと。そのような若い組織又は***性プロモーターは、耐性遺伝子を用いてのグリホセート、ブロモキシニル又はイミダゾリノン除草剤に対して除草剤耐性を付与する変性のためのプラスチド発現構造体と一緒に使用され得る。たとえば、Stakler et al．（J.Biol.Chem．（1985）260：4724-4728，Stakler et al．（J.Biol.Chem．（1985）263：6310-6314及びSathasivan et al．（Nucl.Acids Res．（1990）18：2188を参照のこと。さらに、そのような組織のプラスチドは、高められた光合成能力を付与するための又は耐病性及び／又は耐ストレス性のための機構を付与するための変性のための所望する標的である。
本発明のプラスチド形質転換に使用するためのDNA配列又はポリヌクレオチドは、上記核発現構造体から発現されるRNAポリメラーゼにより特異的に認識されるウィルス遺伝子プロモーター、及びそのウィルスプロモーターの制御下で、形質転換されたプラスチド細胞において発現されるべき対象のDNA配列を含んで成るプラスチド発現構造体を含むであろう。従って、核ポリメラーゼ発現構造体がＴ７ポリメラーゼをコードする場合、次の例において論ぜられるように、対象のDNA配列の発現のためのプラスチド構造体は、Ｔ７ポリメラーゼの存在下で、対象のDNA配列が単に発現されるよう、Ｔ７遺伝子プロモーターを含むであろう。同様に、Ｔ３，SP６又は他のウィルスポリメラーゼが核形質転換の結果として発現される場合、プラスチド発現構造体は対応する遺伝子プロモーター領域を利用するであろう。
本明細書に記載される構造体に使用される特定のウィルスプロモーター領域はまた、選択されたウィルス遺伝子の５′未翻訳DNA領域の一部を含むことができる。たとえば、ファージＴ７の遺伝子10からの５′未翻訳領域は、強められた翻訳を付与することが報告されており、そして本明細書に記載されるＴ７プラスチド発現構造体に含まれる。種々の源からの異なった又は追加の５′未翻訳領域は、対象のDNA配列の発現のためのプラスチド構造体に使用される。
プラスチドウィルスプロモーター発現構造体は一般的に、核構造体によりコードされるウィルスポリメラーゼにより認識される転写終結領域を含むであろう。典型的には、強い転写終結領域は、本発明の特定のウィルスプロモーターを用いる場合に必要とされ、そして従って、特定のプロモーター領域が得られる遺伝子と同じ遺伝子からの転写終結領域を用いることが便利である。従って、本明細書に記載される例においては、Ｔ７遺伝子10プロモーター領域及びその対応する遺伝子10転写終結領域は、プラスチドＴ７発現構造体に使用される。
ファージＴ７における種々の他の遺伝子はまた、そのＴ７単一サーブユニットポリメセーゼにより特異的に認識されるプロモーター配列を含むであろうことが注目される。特に、Ｔ７の遺伝子10は、同一の24bpプロモーター領域を有する６個のＴ７遺伝子の１つである。従って、それらの遺伝子のいづれか１つからのプロモーターは、その対応する５′未翻訳領域を伴って又は伴わないで、本発明により包含されるプラスチド発現構造体のために使用され得る。
プラスチドウィルスプロモーター発現構造体における対象のDNA配列は、構造遺伝子配列によりコードされるタンパク質が形質転換されたプラスチドにおいて生成されるように、特定の構造遺伝子の発現のために配向されるコード配列であり得る。さらに、対象のDNA配列は、単一のウィルスプロモーター領域からの多くの遺伝子の発現のためのオペロンが生成されるように、多くの個々の構造遺伝子をコードする領域を含むことができる。従って、構築された又は合成のオレペロンから又は先在する原核生物の遺伝子クラスターからの複数の遺伝子を導入し、そして発現することが可能である。そのような方法は、特定のウィルスポリメラーゼの核発現を誘導するために使用されるプロモーターに依存して、特定の所望する植物組織又は発育の特定段階において価値あるタンパク質及び精製薬品の大規模且つ安価な生成を可能にするであろう。そのようなアプローチは標準の核形質転換法によっては実施されない。なぜならば、個々の遺伝子がプラスチド摂取及び適切なプロモーター及びターミネーターシグナルのためのコードされたトランジットペプチドを含むモノシストロン中に構築されるべきであるからである。結果として、遺伝子発現レベルはシストロン間で広く変化することが予測され、そして多くのトランスジェニック植物系の発生が必要とされる。究極的には、交差が、標的の生化学経路への発現を得るために、１種の植物中にそれらのシストロンのすべてを導入するために必要とされる。
他方、プラスチド構造体における対象のDNA配列は、内因性遺伝子mRNAに相補的なRNAが形質転換されたプラスチドに生成されるように配向された内因性プラスチド遺伝子のフラグメントであり得る。そのようなアンチセンス構造体は、標的のプラスチド遺伝子の発現を低めるために使用され得る。
プラスチド形質転換に続いて所望する植物細胞を選択する手段を付与するためには、プラスチド形質転換のためのポリヌクレオチドはまた、マーカー遺伝子の発現を付与する構造体を含むであろう。そのマーカー遺伝子生成物の発現は、そのマーカータンパク質を発現するプラスチドオルガネラを含んで成る植物細胞の選択を可能にする。本明細書における例においては、細菌aadA遺伝子がクロロプラスト５′プロモーター及び３′転写終結領域の制御下で発現される。植物細胞のプラスチド形質転換のためのそのような発現構造体の使用は、Svab and Maliga（1993、前記）に記載されている。aadA遺伝子の発現は、スペクチノマイシン及びストレプトマイシン耐性を付与し、そして従って、このマーカー遺伝子を発現する植物細胞の同定を可能にする。aadAマーカー遺伝子のための選択は、ストレプトマイシンの存在、又はより好ましくは、植物成長培地におけるストレプトマイシンの存在により漂白されない植物細胞の同定に基づかれている。クロロプラスト代謝に関与する生成物をコードする他の遺伝子がまた、選択マーカーとして使用され得る。たとえば、植物除草剤、たとえばグリホサート、ブロモキシニル又はイミダゾリノンに対する耐性を付与する遺伝子が特に使用される。そのような遺伝子は、Stalker et al．（J.Biol.Chem．（1985）260：4724-4728；グリホセート耐性EPSP）、Stalker et al．（J.Biol.Chem．（1985）263：6310-6314；ブロモキシニル耐性ニトリラーゼ遺伝子）、及びSathasivan et al．（Nucl.Acids Res．（1990）18：2188；AHASイミダゾリノン耐性遺伝子）により報告されている。
本明細書に記載される例においては、aadA遺伝子は、タバコ16S rRNAプロモーター、rrn領域及びタバコrps16 3′結合領域の制御下にある。多くの追加のプロモーター領域がまた、選択可能マーカー、たとえば植物プラスチドにおいて機能することが知られている種々のプラスチドプロモーター及び細菌プロモーターの発現を誘導するためにも使用され得る。
プラスチド形質転換に使用するためのポリヌクレオチドはまた、プラスミドゲノム中へのウィルスプロモーター発現構造体及び選択マーカー構造体の安定したトランスファーを提供する手段を含むであろう。便利には、標的のプラスチドゲノムに対して相同性の領域は、トランスファーされるべき構造体を両端に有し、そしてゲノム中への二重クロスオーバーを通しての相同組換えによるプラスチドゲノムのトランスファーを提供する。相同の領域がプラスチドゲノムの逆方向反復領域(IRA及びIRB)に存在する場合、トランス遺伝子の２つのコピーがプラスチドゲノム当たりに予測される。典型的には、プラスチドゲノムを有する相同性の領域は、約１kbのサイズであろう。より小さな相同性の領域、たとえば100bpなどの小さな領域が使用され得、これはプラスチドゲノム中への相同組換えを提供することができる。しかしながら、組換えの頻度及び従って、形質転換されたプラスチドを有する植物を得る頻度は、相同領域のサイズが小さくなるにつれて低下する。タバコプラスチド形質転換のためのそのような相同性の領域を含んで成る構造体の例は、Svab et al．（1990前記）及びSvab and Maliga（1993前記）に記載されている。タバコ及びブラシカのプラスチドゲノム中への組換えのために有用な領域はまた、次の例に記載されている。類似する相同組換え及び選択構造体は、標的の植物種からのプラスチドDNAを用いて調製され得る。
プラスチドゲノムへのトランスファーの他の手段は、たとえば転位因子の使用を包含する方法により本明細書において考慮される。たとえば、プラスチドゲノム中にトランスファーされるべき構造体は、植物プラスチドにおいて機能する転位マーカーからの逆方向反復領域を両端に有する。プラスチド中への標的DNAのトランスファーのために必要とされるトランスポザーゼの過渡発現を提供するDNA構造体がまた、クロロプラスト中に導入される。この態様においては、種々の表現型が、プラスチドゲノム上の種々の位置への発現構造体の挿入に起因する位置効果に依存して同じ発現構造体により形質転換された植物において得られる。そのようなプラスチド形質転換法に使用するための適切なトランスポゾンは、細菌Tn10、バクテリオファージMu及び種々の他の既知の細菌性トランスポゾンを包含する。
本発明の構造体を構築する場合、調節領域及び読み取り枠を含んで成る種々のフラグメントが、異なったプロセッシング条件、たとえば連結、制限酵素消化、PCR、インビトロ変異誘発、リンカー及びアダプターの付加、及び同様の手段にゆだねられ得る。従って、ヌクレオチドトランジッション、トランスバージョン、挿入、欠失又は同様のことが、調節領域、ウィルスポリメラーゼコード配列及び／又はプラスチドにおける発現のための対象のDNA配列に使用されるDNAに対して行なわれ得る。制限消化、クレノウブラント末端処理、連結及び同様の方法がまた、当業界においては十分に知られており、そして、たとえばManiatis et al．（Molecular Cloning：a laboratory manual（1982）Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY）により記載されている。
構造体の調製の間、DNAの種々のフラグメントがクローニングベクターにおいてしばしばクローン化され得、そしてこれはDNAの増幅、DNAの変性又は配列、リンカー又は同様のものの連結又は除去による操作を可能にする。通常、ベクターはＥ．コリにおいて、少なくとも比較的高いコピー数で複製できるであろう。多くのベクター、たとえばpBR322、pUCシリーズ、Ｍ13シリーズ、及びpBluescript（Strategene；La Jolla，CA）は、クローニングのために容易に入手できる。
ウィルスポリメラーゼ発現構造体による植物細胞の核を形質転換するためのこの方法のうちいづれかの１つの方法が、本発明において使用され得る。植物細胞の核の形質転換のための方法は、Ti−又はRi−プラスミド、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、リポソーム融合、DNA衝撃又は同様の方法の使用を包含する。
アグロバクテリウムが植物細胞核の形質転換のために使用される場合、アグロバクテリウム宿主に存在するT-DNA又はTi−又はRi−プラスミドによる相同組換えのためにアグロバクテリウム中に導入されるベクターが使用され得る。他方、Ti−プラスミドに無関係にアグロバクテリウムに保持されるプラスミドに基づいて、植物細胞への前記構造体のトランスファーを提供する二元ベクターが使用され得る。T-DNAにより片側又は両側に隣接される、特に左及び右ボーダー、より特定には右ボーダーを有する構造体を有することが所望される。核発現構造体及びT-DNAボーダーは１又は複数のマーカーを含み、このマーカーは、形質転換されたアグロバクテリウム及び形質転換された植物細胞の選択を可能にする。多くのマーカー、たとえばカナマイシン、アミノグリコシド、G418、ハイグロマイシン又は同様のものに対する耐性が、植物細胞による使用のために開発されて来た。使用される特定のマーカーは本発明においては必須ではなく、１つの又は他のマーカーが特定の宿主及び構成の態様に依存して好まれる。
ベクターは、植物細胞中へのT-DNAをトランスファーするために機能的なvir−遺伝子を有するアグロバクテリウム中への形質転換により植物細胞中への対象のDNAを導入するために使用される。次に、広い宿主範囲のベクター構造体を含むアグロバクテリウムが、複製及び通常の発現が生じるであろう条件下で植物宿主細胞中への所望するDNAのトランスファーのための適切な条件下で植物細胞を感染せしめるために使用される。これはまた、通常、所望するDNAを含む細胞が容易に選択され得るように、マーカーのトランスファーも包含するであろう。
植物細胞に標的DNA構造体をトランスファーするために衝撃法を使用する、植物核形質転換及び選択の方法はまた、本発明にも使用され得る。そのような方法は、アグロバクテリウム介在形質転換法に対してほとんど敏感ではない植物細胞の形質転換において特に有用である。衝撃形質転換法は、Sanford et al．（1991）Technigue 3；3-16；Klein et al．（1992）Bio／Technology 10：286-291に記載されている。
一般的に、植物細胞の形質転換においては、標的移植片が、形質転換されたアグロバクテリウムと共にインキュベートされ、又はDNA被覆された粒子により衝撃を与えられる。次に、植物細胞は適切な培地において増殖せしめられ、所望する構造体を得たそれらの植物細胞が選択的に培養される。塊茎が形成された後すぐに、苗条形成が、既知の方法に従って適切な植物ホルモンを用いる事によって生ぜしめられ、そして苗条は、植物の再生のための根形成培地に移される。次に、植物は成長せしめられ、そして同じ形質転換された株又は異なった株により受粉される。ホモ接合系の生成のためには、自家受粉が用いられる。
粒子衝撃によるタバコプラスチドゲノムの安定した形質転換は、Svab et al．（1990）Proc.Natl.Acad.Sci．USA 87：8526-8530；Svab and Maliga（1993）Proc.Natl.Acad.Sci．USA 90：913-917に報告されている。上記文献に記載される方法は、本明細書に記載されるプラスチド形質転換構造体により形質転換された植物を得るために使用され得る。手短に言及すれば、そのような方法は、好ましくは代謝的に活性的なプラスチドオルガネラに富んでいる組織、たとえば葉及び子葉を包含する若い植物組織からの標的宿主移植片のDNA衝撃を包含する。次に、衝撃を与えられた組織は、細胞***促進培地上で約２日間、培養される。次に、植物組織は、特定の選択剤の阻害量、並びに特定のホルモン及び特定植物種のための再生を得るのに必要な他の物質を含む選択培地に移される。たとえば、上記出版物及び本明細書に提供される例においては、選択マーカーは細菌aadA遺伝子であり、そして選択剤はスペクチノマイシンである。前記aadA遺伝子生成物は、連続した増殖を可能にし、そしてマーカー遺伝子生成物を含んで成るクロロプラストを含む細胞の緑化を可能にする。マーカー遺伝子生成物を含まない細胞は漂白される。衝撃を与えられた外植片は、約３〜８週で若い苗条を形成するであろう。それらの苗条からの葉は同じ選択培地上で継代培養され、同種形成性苗条の生成及び選択を確保される。２ラウンド目の苗条形成の代わりとして、初期の選択された苗条が成熟植物に成長せしめられ、そして分離により、挿入された遺伝子構造体のために同種形成性である形質転換された植物が提供される。
次に、そのようにして選択された形質転換植物は、植物中の全プラスチド含有物が形質転換されたか（同種形成性形質転換体）いづれかを決定するために分析され得る。典型的には、２つのラウンドの苗条形成及びスペクチノマイシン選択に続いて、分析される約50％のトランスジェニック−苗が、プラスチドDNAのサザンブロット分析により決定される場合、同種形成性である。それらの苗はさらなる栽培、トランスジェニックプラスチド表現型（核ウィルスポリメラーゼ発現構造体がまたプラスチド形質転換体にも存在する）の分析、又はトランスプラストミック植物の核中へのウィルスポリメラーゼ構造体の形質転換法への使用のために選択される。
本明細書の例に示されるように、挿入されたプラスチド遺伝子構造体はすべての交配において母として受け継がれ、そして発現は、プラスチド標的化T7 RNAポリメラーゼをコードする活性核遺伝子の性的な伝達により達成され得る。従って、核ウィルスポリメラーゼ発現構造体及びプラスチド発現構造体の両者を有する本発明の植物細胞を得るためにはいくつかの可能な手段が存在する。１つの方法においては、ポリメラーゼ活性を発現するホモ接合性核形質転換植物が得られ、そしてプラスチドゲノム中にプラスチド発現構造体をトランスファーするために衝撃手段により再形質転換される。逆に言えば、プラスチド形質転換植物は、本明細書に記載されるような衝撃手段により得られ、そして核及びプラスチドトランスジェニック構造体の両者を有するトランスジェニック植物を再生するために、たとえばアグロバクテリウム介在形質転換により又は粒子衝撃を通して、核形質転換法に使用される。第３の方法においては、トランスプラストミック植物及び核トランスジェニック植物がそれぞれの形質転換法を用いて独立して得られ、そして核及びプラスチドトランスジェニック構造体の両者を有する植物が、植物育成技法を用いて、核トランスジェニック及びプラスチドトランスジェニック植物を交雑することによって調製される。そのような交雑においては、プラスチドトランスジェニック植物は、母親として使用され、そして核トランスジェニック植物は父親である。
そのような組織を包含する形質転換及び再生法がアグロバクテリウム−介在形質転換後衝撃又は他の方法のいづれかにより一定の植物種のために適合された場合、それらの技法はプラスチド形質転換植物を生成するために選択及び再生法への使用のために変性され得る。たとえば、タバコについて本明細書に記載される方法は、他のナス科の種、たとえばトマト、ペチュニア及びジャガイモに容易に適用できる。ブラシカに関しては、アグロバクテリウム介在形質転換及び再生法は一般的に、胚軸組織、すなわち低プラスチド含有率の若くない組織の使用を包含する。従って、ブラシカに関しては、好ましい標的組織は、小胞子由来の胚軸又は子葉組織（若く、そして従って多くのプラスチドを含む）、又は葉組織外植体を包含する。そのような組織からの再生率は低いけれども、たとえばアグロバクテリウム介在形質転換により見出される位置上の効果は予測されず、そして所望する表現型を得るために多くの都合良く形質転換された植物をスクリーンすることが必要ないであろう。
従って、本明細書に記載される構造体及び方法は、変性されるべき又は植物に付加されるべき経路のタイプに依存して、広範囲の種類の植物生命体に使用され得る。たとえば、スターチ変性のためには、ジャガイモ又はトウモロコシ植物が形質転換され得る。花色の変性のためには、ペチュニア、バラ及びカーネーションが標的植物宿主である。果実品質の変性のためには、トマトが使用され得る。種子油品質又は種子タンパク質含有率の変性のためには、油性種子収穫物、たとえばブラシカ、ダイズ、トウモロコシ、ベニバナ又はヒマワリが使用され得る。
次の例においては、核コード／プラスチド標的化Ｔ７ポリメラーゼを発現するか又は発現しないいづれかの植物のプラスチドゲノム中へのファージＴ７遺伝子10プロモーターの制御下でのGUSマーカーの導入が記載されている。核コード／プラスチド標的化T7 RNAポリメラーゼの使用によるプラスチドトランス遺伝子発現を操作する能力が示される。ファージＴ７遺伝子10プロモーター及び５′未翻訳領域の制御下でのプラスチド−担持される受容体遺伝子GUSが、活性T7 RNAポリメラーゼを含むタバコ系中に導入される場合、発現される。その結果は、ウィルスポリメラーゼが植物プラスチドゲノム中に都合良く導入され、そしてＴ７遺伝子10プロモーターからのGUS遺伝子を活動的に転写することを示す。さらに、GUS活性はＴ７ポリメラーゼ活性の存在下で発現されるが、しかしその不在下では発現されず、従って、この反応の特異性、及び選択的なウィルス単一サブユニットRNAポリメラーゼをコードする核トランスジェニック構造体の発現を制御することによって、プラスチドトランスジェニック構造体の発現を選択的に制御する能力を示す。
次の例は、例示的であって、本願発明を限定するものではない。
例
例１ ポリメラーゼ発現構造体
Ａ．CaMV 35Sプロモーター構造体
構造体pAR3283(Dunn et al.(1988)Gene 63:259-266)を、BglII／EcoRＩにより消化し、Ｔ７ポリメラーゼ遺伝子のコドン11に融合されるSV40 T−抗原核位置シグナルを除去する。合成アダプター（上部鎖：５′−GATCTGGATCCAACACGATTAACATCGCTAAGAACG−３′及び下部鎖：５′−AATTCGTTCTTAGCGATGTTAATCGTGTTGGATCCA−３′）を導入し、pCGN4023を得る。前記アダプターは、T7 RNAポリメラーゼ遺伝子の野生型アミノ末端コード領域を回復するが、但し、メチオニン開始コドンがBamHＩ制限部位により置換されている。pCGN4023からのBamHＩフラグメントを、BamHＩにより消化されたpCGN566(アンピシリンよりもむしろクロラムフェニコールに対する耐性を付与する、pUC18に関連するプラスミド)中にサブクローンし、pCGN4024を得る。
二重35Ｓプロモーター（−941〜−90／−363〜＋２）及びtml 3′調節領域を含むプラスミドpCGN2113(３／２／89に寄託されたATCC寄託番号40587)をSacＩ／EcoRＩにより消化し、tml 3′領域を除去する、nos 3′を含むpBI101（Jefferson et al.(1987)EMB0 J.6：3901-3907)からのSacＩ／EcoRＩフラグメントをtml 3′の位置に導入する。次にその得られたプラスミドpCGN1575をSphＩ／XbaＩにより切断し、クレノウによりブラント末端化し、そしてプラスミドを再連結し、pCGN1577を得る。BglIIリンカーを、EcoRＩ消化及びpCGN1577のクレノウ処理に続いて、EcoRＩ部位に付加する。次に、その得られるプラスミドpCGN1579におけるNcoＩ部位を、NcoＩによる消化により除去し、クレノウ処理し、そして再連結する。新プラスミドpCGN1594は、短くされたバージョン７二重35Ｓプロモーター（転写開始部位に関して−526〜−90／−363〜＋２）及び260bpのnos 3′から成る。
タバコRuBISCO SSU遺伝子５′未翻訳領域＋クロロプラストトランジットペプチドのためのコード配列及び成熟SSU(イントロンＩを含む）の12個のアミノ酸のためのコード配列を有するDNAフラグメントを、鋳型としてクローンTSSU-3-8(O'Neal et al.(1987)Nucleic Acids Res．15：8661-8677)を用いて、上部鎖プライマー５′−CCCAAGCTTAGATCTCATCTTGGAAGTTTAAAGG−３′及び下部鎖プライマー５′−GGGGAGCTCGTCGACGGATCCGTACTTCTTCTTGTTAATTGG−３′を用いてPCR増幅する。PCR反応は、94ｃ／30秒、55ｃ／30秒及び72ｃ／30秒の25サイクルのために設定されたPerkin Elmer熱サイクラー(GeneAmp System 9600)において、Perkin Elmer／Cetusにより推薦される条件を用いて100μｌの体積において行なわれる。得られたフラグメントを、HindIII／SacＩによる消化によりpBluescriptII SK＋(Stratagene；LaJolla，CA)中にクローン化する。DNA配列の確認に続いて、その得られたプラスミドpCGN3669をBglII／SacＩにより消化し、そしてSSU配列を、BamHＩ／SacＩ消化されたpCGN1594中にクローン化する。得られたプラスミドpCGN3672をBamHＩにより切断し、そして変性されたＴ７ポリメラーゼ遺伝子を、pCGN4024からのBamHＩフラグメントとして導入する。Ｔ７ポリメラーゼ遺伝子が、成熟SSUとの翻訳融合として読み取るように配向されているクローンpCGN4025を選択する。pCGN4025をHindIII／BglIIにより消化し、そしてd35S／クロロプラストトランジットペプチド：Ｔ７ポリメラーゼ／nos 3′発現構造体を、HindIII／BamHＩ消化された二元ベクターpCGN1559（McBride et al.(1990)Plant Mol.Biol.14：269-276)中に導入し、pCGN4026（図１）を得る。
Ｂ．ナピン発現構造体
タバコSSU 5′未翻訳領域、リーダーペプチドコード領域及び成熟SSU（1stイントロンを含む）の初めの12個のアミノ酸のためのコード領域を含むHindIII／BamHＩフラグメントを、pCGN3609（上記）の消化により得る。そのフラグメントを、CaMV 35Sプロモーター領域を置換してpCGN986(下記)のHindIII／BamHＩ部位中のクローン化し、そしてpCGN4095をもたらす。
pCGN986は、カリフラワーモザイクウィルス35S（CaMV 35）プロモーター及びそれらの間に複数の制限部位を有するT-DNA tml 3′−領域を含む。T-DNA tml 3′−配列を、BamHＩ−EcoRＩフラグメント（ヌクレオチド9062〜12,823，Barker et al．Plant Mol.Biol.(1982)2：335-350におけるようにして番号をつける）として、pTiA6，Bam19 T-DNAフラグメント(Thomashow et al.，Cell（1980）19：729-739)からサブクローン化した。Bam19フラグメントのヌクレオチド11,209でのユニークSmaＩ部位をSacＩ部位に変え、そしてBamHＩ部位を、リンカーを用いてEcoRＩ部位に変えた。発現カセットpCGN986は、HindIII部位、続いてCaMV 35Sプロモーター、２つのSalI部位、XbaＩ，BamHＩ，SmaＩ、及びKpnＩ部位、並びにSacＩ／EcoRＩフラグメントとしてのtml 3′領域(T-DNAのヌクレオチド11207-9023)を含む。
pCGN4095のSSU部分におけるイントロン領域を、SphＩ及びBamHＩ部位により隣接されるSSUリーダーペプチド／成熟タンパク質領域に対応する合成オリゴヌクレオチドを用いて除去する。イントロンを有さないSphＩ／BamHＩフラグメントを、pCGN4095中に連結し、SphＩ／BamHＩフラグメントを含むイントロンを置換し、そしてpCGN4096を得る。
pCGN4024（上記）からのＴ７ポリメラーゼコード領域を約2.2kbフラグメントとして得、そしてpCGN4096中にクローン化し、SSUリーダーペプチド＋成熟SSUの12個のアミノ酸のためのコード領域、及び同じ翻訳読み取り枠におけるＴ７ポリメラーゼコード領域を含むpCGN4205をもたらす。
約1.7kbのナピンプロモーター領域を、pCGN3223からのBglII／HindIIIフラグメントとして、クロラムフェニコール耐性を付与するクローニングベクター中にクローン化し、pCGN4212を得る。pCGN3223は、アンピシリン耐性バックグラウンドに1.725ナピン５′及び1.265ナピン３′調節配列を含むナピン発現カセットである。そのナピン５′及び３′調節領域は、pCGN1808(Kridl et al．Seed Science Research（1991）1：209-219)に存在するものと同じであるが、しかし異なった制限部位を端に有する。pCGN3223における調節領域は、HindIII，NotＩ及びKpnＩ制限部位を端に有し、そしてユニークSalＩ，BglII，PstＩ及びXhoＩクローニング部位は、５′及び３′非コード領域間に位置する。
ナピン５′調節領域を、pCGN4212からのBglII／HindIIIフラグメントとして、BglII／HindIII消化されたpCGN4205中に挿入し、ナピン５′及びtml 3′調節領域間にセンス発現配向で位置するSSU：T7ポリメラーゼコード構造体を含むpCGN4217を得る。ナピン／SSU：T7ポリメラーゼ／tmlキメラ遺伝子を、二元ベクタープラスミドpCGN1559及びpCGN1548（McBride et al.，前記）中にHindIII／PstＩ部分消化フラグメントとしてクローン化し、それぞれpCGN4225及びpCGN4226を得る。
Ｃ．ファセオリン発現構造体
β−ファセオリン５′非コード領域の850bp BglIIフラグメントを、p8.8 pro(Hoffman et al.(1987)EMBO J．6：3213−3221)から得、そしてBamHＩ部位でpUC(Vieira and Messing（1982）Gene 19：259-268)中にクローン化し、pTV796を得る。pTV796におけるファセオリンフラグメントは、pUC9のSmaＩ部位がファセオリンプロモーターの３′側に位置するように配向される。ファセオリンを、クロラムフェニコール耐性を付与するクローニングベクター中にHindIII／SmaＩフラグメントとしてpTV796からサブクローン化する。得られるクローンpCGN4230を、HindIII及びBglIIにより消化し、そしてファセオリンプロモーターを含む約800bpのフラグメントを、HindIII／BglII消化のpCGN4205（上記）中にクローン化し、pCGN4231を得る。pCGN4231は、ファセオリン５′及びtml 3′調節領域間にセンス発現配向下で位置するSSU：T7ポリメラーゼコード構造体を含む。そのファセオリン／SSU：T7ポリメラーゼ／tmlキメラ遺伝子を、二元ベクタープラスミドpCGN1559及びpCGN1548（McBride et al.，前記）中にHindIII／PstＩ部分消化フラグメントとしてクローン化し、それぞれpCGN4232及びpCGN4233を得る。
例２ プラスチドにおける形質転換及び発現のための構造体
Ａ．GUSプラスチド発現構造体
ファージＴ７ポリメラーゼ遺伝子10プロモーター及び全５′未翻訳領域を、上部鎖プライマー５′−GGGAAGCTTGCGAAATTAATACGACTCAC−３′及び下部鎖プライマー５′−CCCCCATGGGTATATCTCCTTCTTAAAG−３′を用いてpET3a(Rosenberg et al.(1987)Gene 56：125-135)からPCR増幅する（上記のようなPCR条件下）。得られるPCR反応生成物は、24bpのＴ７プロモーター領域及び66bpのT7 5′未翻訳領域から成る。５′未翻訳領域は、最端５′でステム−ループ構造、続いて、翻訳エンハンサー（Olins et al.(1988)Gene(Amst.)73：227-235）、強い原核リボソーム結合部位、及び遺伝子10の開始コドンを含む。T7 PCRフラグメントをHindIII／NcoＩにより消化し、そしてHindIII／NcoＩにより消化されたpUC120中にクローン化し、pCGN4028を創造する。pUC120は、反対の配向に挿入されるlac領域及びlacペプチド(Vieira，J.PhD.Thesis．University of Minnesota，1988)のATCでNcoＩ部位を有するpUC118（Vieria and Messing，Methods in Enzymology（1987）153：3-11）に基づくＥ．コリ発現ベクターである。
３′調節領域を創造するために、psbA′未翻訳領域（Shinozaki et al.(1986)EMBO J．5:2043-2049により報告されるタバコクロロプラストゲノム配列の塩基対533-435）とpET3aからのＴ７遺伝子10ターミネーター領域との間に、PCRにより融合を創造した。最初の反応においては、psbA 3′未翻訳領域は、鋳型としてニコチアナタバカムvar．“Xanthi”の全DNAを用いて、上部鎖プライマー５′−GGGGAATTCGATCCTGGCCTAGTCTATAAG−３′及び下部鎖プライマー５′−GGTTATGCTAGTTATTGCTCAAAAGAAAAAAAGAAAGGAGC−３′を用いて増幅される。また、Ｔ７遺伝子10ターミネーターは、鋳型としてpET3a DNAを用いて、上部鎖プライマー５′−GCTCCTTTCTTTTTTTCTTTTGAGCAATAACTAGCATAACC−３′及び下部鎖プライマー５′−CCCCTGCAGCCGGATATAGTTCCTCC−３′を用いて増幅される。追加のPCR反応においては、上記psbA 3′及びＴ７ターミネーター反応からの反応生成物それぞれ５μｌを、最終反応混合物100μｌ中に組合し、ここで融合生成物が、psbA 3′反応に使用される上部鎖プライマー及びＴ７遺伝子10ターミネーター反応に使用される低部鎖プライマーを用いて増幅される。その融合生成物を、EcoRＩ及びPstＩにより消化し、そしてEcoRＩ／PstＩにより消化されたpBluescriptII KS(−)(Stratagene)中にクローン化し、pCGN4027を得る。
追加の操作を通して、Ｔ７プロモーター領域（HindIII／NcoＩ）及びpsbA３′／T7ターミネーター（EcoRＩ／PstＩ）を、pBluescriptII KS(−)主鎖（Stratagene）において、pkiwi101（Janssen et al.(1989)Plant Mol.Biol．14：61-72)からのNcoＩ／EcoRＩ GUS遺伝子フラグメントと組合し、pCGN4055を得る。
従って、pCGN4055においては、GUS遺伝子は、遺伝子10のための開始コドンがGUSの開始コドンであるように、Ｅ．コリファージＴ７遺伝子10プロモーター領域（転写開始部位に対して配列−24〜＋66）から下流に位置する。Ｔ７遺伝子10の５′未翻訳領域は、それはＥ．コリにおける翻訳エンハンサーのために重要であると報告されていることから保持される。GUS遺伝子構造体の３′領域は、若い組織におけるmRNAの安定化において重要であることが示されているpsbA 3′調節要素（Gruissem et al.(1993)Critical Reviews in Plant Sciences 12：19-55）、及び強いrho独立ファージＴ７遺伝子10ターミネーターを含む。
Ｂ．PHBオペロンのためのプラスチド発現構造体
ブラシカにおけるポリヒドロキシブチレート(PHB)経路に関与する遺伝子を含むオペロンのプラスチド発現のための構造体を次のようにして調製する。アルセリゲネスユートロファス（Alcalgenes eutrophus）からのPHBオペロンを、SfuＩ及びEcoRＩによるpAeT41(Peoples et al.(1989)J.Biol.Chem．264：15298-15303)の消化により得、そしてその適切な約4.2kbのフラグメントのClaＩ／EcoRＩ−消化BluescriptII KS(−)(Stratagene)中へのクローニングにより、pCGN4077を得る。pCGN4077を変異誘発し、phbBにおけるNcoＩ部位を除去し、そして得られる構造体をpCGN4082と命名する。pCGN4077をまた変異誘発し、phbCコード領域におけるNcoＩ部位を除去し、そしてATG翻訳開始コドンでNcoＩ部位を付加する。得られる構造体をpCGN4081と命名する。pCGN4081及びpCGN4082をXhoＩ及びBglIIにより消化し、そして変異誘発されたphbCコード領域を含むpCGN4081のXhoＩ／BglIIフラグメントを、変異誘発されたphbB領域及びクローニングベクター配列を含むpCGN4082のXhoＩ／BglIIフラグメントに連結する。その得られる構造体pCGN4086は、除去された内部NcoＩ部位と共に完全なPHBオペロンを含み、そしてATG翻訳開始コドンで付加されたNcoＩ部位を有する。PHBオペロンは、pCGN4086のEcoRＩ及びXhoＩによる消化により得られ、そしてEcoRＩ／XhoＩ消化されたpBluescriptII S（＋）中にクローン化され、pCGN4089が得られる。pCGN4089をEcoRＩ／NdeＩにより消化し、PHBオペロン３′未翻訳領域を除去し、そしてEcoRＩ／NdeＩリンカーアダプターにより連結し、pCGN4098を生成する。PHBオペロンを、EcoRＩ及びNcoＩによるpCGN4098の消化により得、そしてEcoRＩ／NcoＩ消化されたpCGN4211中にクローン化し、pCGN4216を得る。pCGN4211は、アンピシリン耐性クローンを提供するためにHindIII／PstＩ消化されたpBluescriptII（−）にHindIII／pstＩフラグメントとしてトランスファーされたpCGN4055（上記）のT7／GUS／pshA 3′：T7 3′フラグメントを含む。EcoRＩ及びNcoＩによるpCGN4211の消化は、GUS領域を除去する。従って、pCGN4216は、Ｔ７遺伝子プロモーター領域及びpsbA 3′：T7 3′領域の制御下でPHBオペロンを含む。
Ｃ．タバコ形質転換構造体
pCGN4055をHindIII／PstＩにより消化し、そして５′／GUS／psbA 3′：T7 3′発現構造体を、相同組換えによりタバコプラスチドゲノム中へのキメラ遺伝子の組込みを企画されている、HindIII／PstＩ消化されたベクター中にクローン化する。その得られた構造体をpCGN4276（図２）と称する。pCGN4276構造体を含んで成る細菌細胞は、American Type Culture Collection (ATCC)，Rockville，MD（ATCC＃＿＿＿＿）に寄託された。相同組換えベクター、すなわちプラスミドOVZ445は、タバコ16S rRNAプロモーター、rrnから発現されたストレプトマイシン／スペクチノマイシン選択マーカー遺伝子、aadA（前記rrnプロモーター及びaadA領域はSvab and Maliga（1993；前記）に記載されている）を含み、そして約150bpのrps16 3′終結領域(rps16遺伝子の配列はShinozaki，K．et al.，前記により報告されている）を有する。同様に、T7／PHB／psbA 3′：T7 3′領域を含むpCGN4216からのHindIII／BamHＩフラグメントを、HindIII／XbaＩにより消化されたOVZ445中にHindIII／SpeＩフラグメントとしてトランスファーし、pCGN4295を得る。
プラスチド形質転換のためのaadA選択マーカー構造体は、それがtrnVとrps12との間の遺伝子間領域におけるtrnV遺伝子座のすぐ上流に位置するように、そしてクロロプラストゲノムDNAの少なくとも１kbがaadA発現構造体に隣接するように、タバコクロロプラストゲノムフラグメント上のOVZ44Bに存在する。プラスチドDNA隣接フラグメントは、前記ベクターと標的のプラスチドDNA配列との間に相同組換えが生じるような領域を提供する。相同組換え部位はクロロプラスト逆方向反復体領域(IRA及びIRB)(Shinozaki et al.，前記)に存在するので、トランス遺伝子の２つのコピーがプラスチドゲノム当たりに予測される（Svab，et al.(1990)前記）。
Ｄ．ブラシカ形質転換構造体
ブラシカプラスチドのゲノム中への組換えのための相同性の領域を得るために、リブロースボスホスフェートカルボキシラーゼの大きなサブユニットをコードするrbcL遺伝子を含んで成るフラグメントを、ブラシカプラスチドDNAからクローン化する。プラスチドDNAは、Doyle et al.(Phytochem.Bull.(1987)19：11-15)により記載されているように単離され得る。ブラシカナパスのプラスチドゲノムの地図（Warwick et al.(1991)Theor.Appl.Genet．82：81-92；Palmer et al.(1983)Theor.Appl.Genet．65：181-189）は、rbcL遺伝子座が4.3又は4.8kbのKpnＩフラグメントのいづれか上に存在することを示す。このフラグメントをクローン化するために、プラスチドDNAをAsp718により消化し(KpnＩと同じ認識配列)、そしてAsp718により消化されたBluescriptII KS(−)中にクローン化する。得られるクローンからのDNAを、タバコからのrbcLコード領域を含む放射性ラベルされたプローブを用いてサザンハイブリダイゼーションにより分析する。ラベルされたクローンにハイブリダイズする約4.3kbのバンドを含むクローンpCGN5034を、rbcL遺伝子のさらなる位置決定のために選択する。DNA配列分析によるrbcL遺伝子の位置決定に続いて、プラスチド発現構造体、たとえばPHBオペロン構造体の挿入のための適切な領域を同定する。所望する領域は、所望する遺伝子構造体の挿入が生来のプラスチド遺伝子の発現を中断せず、そして挿入されたプラスド構造体がブラシカプラスチドゲノム中への二重クロスオーバーによる相同組換えを提供するために相同の領域を端に有する領域である。
例３ アグロバクテリウム介在の核植物形質転換
核発現のための二元構造体を、トランスジェニック植物の調製のために、Holsters et al.(Mol.Gen.Genet.(1978)163:181-187)の方法によって、適切なアグロバクテリウム株の細胞、たとえばLBA4404(Ooms et al.(1982)Plasmid 7:15-29)又はEHA101(Hood et al.(1986)J.Bacteriol．168：1291-1301)中に形質転換する。
トランスジェニックタバコ植物を、Horsch et al.(Science（1985）227：1229-1232)により記載されるようにしてアグロバクテリウム介在形質転換により得る。トランスジェニックブラシカ植物を、Radke et al.(Theor.Appl.Genet.(1988)75：685-694；Plant Cell Reports（1922）11：499-505)により記載されるようにしてアグロバクテリウム介在形質転換により得る。アグロバクテリウムツメファシエンスとの同時培養によるゴシピアムヒルスタムＬ(Gossypium hirsutum L.)子葉の形質転換は、Firoozababy et al.，Plant Mol.Bio.(1987)10：105-116及びUmbeck et al.，Bio/Technology（1987）5：263-266により記載されている。
他の植物種は、関連する技法を用いて同様にして形質転換され得る。他方、Klein et al.(Bio／Technology 10：286-291)により記載されるようなマイクロプロジェクチル衝撃法をまた用いて、本明細書に記載されるウィルス性単一サブユニットRNAポリメラーゼ発現構造体を含んで成る核形質転換された植物を得ることができる。粒子衝撃法による綿の形質転換は、1992年９月17日に公開されたWO 92／15675に報告されている。
たとえば、クロロプラスト標的化シグナル配列と共にT7 DNAポリメラーゼ遺伝子を有する二元ベクターpCGN4026を、Ａ．ツメファシエンスLBA4404中に導入し、そして得られるアグロバクテリウム株を用いて、プラスチド局在化T7 RNAポリメラーゼ活性を発現するトランスジェニックタバコ系を生成する。そのATG開始コドンを欠くキメラT7 RNAポリメラーゼ遺伝子を、タバコ小サブユニット(SSU)トランジットペプチド（TP）及び成熟SSUの初めの12個のアミノ酸への翻訳融合体としてd35Sプロモーターから発現する。多かれ少かれ、35Ｓプロモーターの構成的な性質により、Ｔ７ポリメラーゼ活性がほとんどすべての組織におけるプラスミドに発現されることが予測される。
同様に、二元プラスミドベクターpCGN4225，pCGN4226，pCGN4232及びpCGN4233をＡ．ツメファシエンスEHA101中に導入し、そしてその得られるアグロバクテリウム株を用いて、T7 RNAポリメラーゼ活性を局在化するプラスミドを発現するトランスジェニックブラシカ植物、たとえばＢ．ナパスvar．A112を生成する。それらの構造体においてT7 RNAポリメラーゼの発現を提供するナピン及びファセロリンプロモーターが植物種子組織に選択的な発現を提供するので、Ｔ７ポリメラーゼ活性は、種子組織のプラスミドに主に発現することが予測される。
例４ ポリメラーゼ発現するトランスジェニック植物の分析及び選択
pCGN4026による形質転換に起因する約20種の耐カナマイシン性タバコ系を生成し、そしてT7 RNAポリメラーゼ活性についてスクリーンする。T7 RNAポリメラーゼアッセイを、40mMのトリス−HCl、pH7.9、８mMのMgCl2、５mMのジチオトレイトール、４mMのスペルミジン−HCl、0.4mMの個々のATP，GTP，CTP及びUTP、及び２μCiの32P−UTPを含む反応においてpBluescriptII KS(−)転写体中への32P-UTPの組込みを測定することによって実施する。
一次形質転換体（Ｔ１世代）の葉組織における検出できるT7 RNAポリメラーゼ活性は、合計タンパク質μｇ当たり0.01〜2.25単位である。
カナマイシン分離アッセイを、分離比を決定するためにすべての陽性系の種子に対して行なう。３種の系、4026-3，4026-9及び4026-11は、耐性遺伝子に対して３：１に分離し、これはＴ７ポリメラーゼ構造体が単一の染色***置で挿入されたことを示す。4026-3，4026-9及び4026-11を自家受粉し、ホモ接合系を創造する。ホモ接合系からの葉に対するT7 RNAポリメラーゼアッセイは、4026-3が最とも低いレベルのT7 RNAポリメラーゼ活性を有するが、4026-9及び4026-11はより高いレベルのポリメラーゼ活性を有することを示した。下記表１を参照のこと。
高レベルのプラスチド−標的化されたT7 RNAポリメラーゼを発現するタバコ系は、しわのある葉の形態学を有することが観察された。過剰のポリメラーゼは、いくらかのレベルの非特異的転写を付与し、又はプラスチド転写複合体との負の相互作用によりプラスチドに対して有害であると思われる。そのような場合、Ｔ７転写単位の添加が、プラスチドオルガネラの生存性をさらに危うくする。低T7 RNAポリメラーゼ生成系4026-3は、そのプラスチドがT7-GUS転写単位（上記）により形質転換されるまで、しわのある葉の表現型を決して示さなかったことが注目される。
例５ 植物プラスミド形質転換法
タバコプラスチドを、マイクロプロジェクチルの粒子ガン供給（Svab and Maliga（1993），前記）により形質転換する。プラスチドゲノム中への組込みは相同組換えにより生じ、そして標的部位は逆方向反復体においてリボソームRNAオペロン近くに存在するので、トランス遺伝子の２つのコピーが、プラスチドゲノム当り予測される（Svab et al.(1990)前記)。
野生型及びpCGN4026 T-DNAに対してホモ接合性のタバコ種子(Ｎ．タバカムv．Xanthi N／C)を、50％クロロックス溶液(2.5％次亜塩素酸ナトリウム)において20分間、表面殺菌し、そして滅菌されたH2Oにより４度すすぐ。次に、種子を0.2×MS塩培地上に無菌プレートし、そして発芽せしめる。苗を、30ｇ／ｌのスクロースを有する寒天固化MS培地上で成長せしめる(Murashige and Skoog（1962）Physiol.Plant 15：493-497)。Bio-Rad PDS 1000／He衝撃システム(Sanford et al.(1991)Technique 3：3-16；Klein et al.(1992)Bio／Technology 10：286-291)を用いて、タングステンマイクロプロジェクチル(1.0μｍ)をDNA、たとえばT7／GUS発現構造体、pCGN4276により被覆し、そしてその被覆されたマイクロプロジェクチルを用いて、RMOP培地(MS塩、１mg／ｌのBAP、0.1mg／ｌのNAA、30ｇ／ｌのスクロース及び0.7％のphytager)(Svab et al.(1990)前記)上に背軸側を上に配置され成熟葉に衝撃を与える。500mg／ｌのスペクチノマイシン二塩酸塩により補充されたRMOP培地上での形質転換された植物の発育及び同じ選択培地上での続くサブクローニングを、Svab et al.(1990)；Svab and Maliga（1993），前記に従って行なう。選択された植物を、１mg／ｌのIBA、500mg／ｌのスペクチノマイシン二塩酸塩及び0.6％のphytagerを含むMS培地中で根づかせる。
いくつかの同種形成性非−T7 RNAポリメラーゼ生成“Xanthi”4276系を対照として同時に創造した。多産な形質転換体は、pCGN4276 T7/GUS発現構造体による高レベルT7 RNAポリメラーゼ生成系4026-9のプラスチドを形質転換する試みからは得られなかった。4026-9からのプラスチド形質転換体の欠失は、プラスチドトランス遺伝子の高レベル発現が、Ｔ７発現システムが使用される場合、Ｅ．コリに生じることが報告されているように、オルガネラ上での代謝性流出を提供することによりたぶん説明される。
例６ プラスチドＴ７プロモーター構造体からの発現についての植物の分析
上記のようにしてのプラスチド形質転換に続いて、4026-3のT7 RNAポリメラーゼ産生バックグラウンドにおける２種の独立して単離された同種形成系を生成し、そして4026-3クローン１及び２と命名した。同種形成性は、図２に示されるようなサザンブロット分析により示された。pCGN4276構造体の略図及びタバコプラスチドゲノム中への組込みの図が図２の上部に示されている。上部線はpCGN4276から付与される入って来るDNAを示し、そして下部線は、組込みの標的領域を示す。BamHＩフラグメントのための予測されるサイズは、野生型DNAと同様に、その入って来るDNAについても示されている。その入って来るDNAの５′端上にはBamHＩ部位が存在しないので、２種のキメラ遺伝子の組合された大きさが示されている。また、サザン分析のために使用される、２種のプローブＡ及びＢの位置も示されている。4276／4026-3クローン１及び２は、Ｎ．タバカムvar．“Xanthi”系4026-3における２種の独立した耐スペクチノマイシン性形質転換体を示す。4276／Xanthiは、野生型Ｎ．タバカムvar．“Xanthi”における１種の耐スペクチノマイシン性形質転換体を表わす。対照のDNAは未翻訳Xanthiからである。DNA分子量マーカーは、キロ塩基対で示される。
サザン分析は図２の底部に示される。全体の植物細胞DNAは、Dellaporta et al.(1983)Plant Mol.Biol.Rep．1：19-21により記載されるようにして調製される。個々のサンプルのための約２μｇのDNAをBamHＩにより消化し、１％アガロースを通して電気泳動し、Nytran＋に移し、そしてd32P-dCTPラベルされたプローブによりフィルターハイブリダイズせしめる。プローブＡは、形質転換（同種形成性）の程度をし、そしてプローブＢはGUS遺伝子の存在を示す。プローブＡとのハイブリダイゼーションは、トランス遺伝子からの新しいBamHＩ部位の導入がトランスプラスミック系において3.3kb〜0.8kbのプローブされたフラグメントのサイズに変化する。同種形成性の程度は、残留する3.3kbバンドの存在により測定される。野生型の3.3kbバンドの形跡のみが元のブロットにおいて観察され、そしてそのレベルは図２で示されるこのブロットの再生においては検出できない。トランス遺伝子の初期コピーが他の逆方向反復体上に重複されていないプラスチドを、その3.3kbバンドが示すか、又は未翻訳プラスチドの小集団が存在するかいづれかについては明らかでない。
GUS遺伝子のT7 RNAポリメラーゼ依存性転写を測定するために、4276／“Xanthi”及び4276／4026-3の個々の１つのクローンの葉組織からの全体の細胞RNAサンプルを、GUS特異的プローブによるノザン分析にゆだねる。全体の植物RNAは、Hughes et al.(1988)Plant Mol.Biol.Rep．6：253-257により記載しているようにして調製された。予測されるサイズ(2.1kb)のmRNAに富んだ単一バンドが4276／4026-3 RNAサンプルにのみ存在する。これは、GUSトランス遺伝子の転写がＴ７ポリメラーゼの存在に依存することを示す。T7 RNAポリメラーゼが２種の遺伝子バックグラウンドにおいて他の転写体のレベルに影響を与えないことを示すために、重複フィルターをaadAトランス遺伝子特異的プローブによりハイブリダイズし、そしてGUSフィルターをpsbA特異的プローブにより再ハイブリダイズする。その結果は、遺伝子バックグラウンドが、連結されたaadAトランス遺伝子又は連結されていないpsbA遺伝子のいづれの相対的な転写レベルに対しても影響を与えないことを示す。奇妙なことには、1.3kbのaadA−特異的転写体が予測される0.9kbのバンドの他に、両ラインに存在する。これは、rps16 3′の境界内でプロセスされていないaadA転写体か又はGUSコード領域内の上流に生じる転写の開始のいづれかの結果であり得る。個々のmRNAについてのハイブリダイゼーションシグナルの強度をAmbisオートラジオグラフィースキャナーを用いて定量化し、そしてその結果は、GUSシグナルが組合されたaadAシグナルよりも約５倍高く、そしてpsbAシグナルよりも５倍低いことを示す。
T7 GUS転写体がトランスジェニックプラスチドにおいて翻訳されていることを示すために、β−グルクロニダーゼ特異的活性を種々の組織において測定した。GUSアッセイは、Jefferson et al.(EMBO J.,（1987）6：3901-3907)により記載しているようにして行なわれた。4276／4026-3クローンからの種々の組織におけるそれらのアッセイの結果は下記表２に示される。
上記結果は、GUS活性がすべての組織において発現され、そして葉及び花弁において最高であることを示す。さらに、GUS活性はXanthiバックグラウンドにおいては観察されないので、発現はT7 RNAポリメラーゼの存在に依存する。葉、茎及び花弁に示される活性を比較すれば、成長する種子組織におけるGUS活性は、4276／Xanthi組織について観察されるバックグラウンドレベルに接近している。根組織に見られる活性はまた低いが、しかし十分にバックグラウンド以上である。GUS活性をまた、第２の4276／4026-3クローンの葉及び根組織においてもアッセイした。第１のクローンにおいて観察されるのと同じ、それらの２種の組織における発現のレベル間の関係が、第２クローンの葉及び根組織において見られる。
葉組織に観察されるGUS mRNA蓄積及びβ−グルクロニダーゼ活性のレベルは、psbA 5′-GUS- pshA 3′プラスチドトランス遺伝子（Staub and Maliga（1993）EMBO J．12:601-606）を有するタバコについてこれまでに記載されたレベルに匹敵する。それらの結果の比較によれば、上記タバコ植物におけるβ−グルクロニダーゼのレベルは、それらの植物における全体の可溶性タンパク質の約1.5〜２％であると見積られる。さらに、ファージmRNAリーダーによる翻訳刺激のレベルは、psbAリーダー、すなわち十分に照らされた葉組織のために最適であることが示された条件下でpsbA mRNAリーダーのレベルに類似すると思われる（Staub and Maliga，前記）。従って、4026-3トランスジェニックの植物において測定されるT7 RNAポリメラーゼ活性の比較的低いレベルに関してさえ、プラスチドＴ７−トランス遺伝子から生成されるmRNAのレベルはpsbAプロモーターから生成されるそのレベルと同じほど高く、ここで前記プロモーターは、最強の内因性プラスチドプロモーターの１つであることが報告されている（Rapp et al.(1992)J.Biol.Chem．267：21404-21411）。
根及び成長する種子組織における低い活性レベルは、それらの組織における細胞当たりの低められたプラスチドゲノムコピー数により一部説明され得る。さらに、プラスチド発現構造体におけるpsbA 3′領域は、光合成的に活性的なクロロプラストの光誘発された成長の間、mRNA蓄積において６倍の低下を付与することが報告されている（Deng et al.(1988)EMBO J．7：3301-3308)。種々の組織における核−コードされたT7 RNAポリメラーゼの異なった発現レベルはまた、観察されるβ−グルクロニダーゼレベルにおける１つの要因である。Ｔ７ポリメラーゼの発現を誘導するCaMV 35Sプロモーターは、上記種子サンプルが分析された段階であり、後期の成長する種子においてよりも葉及び根において高い活性を有することが報告されている。
若くない根及び種子組織に比較して、花冠の上方の拡張する部分におけるβ−グルクロニダーゼ蓄積（後−葯形成）は、葉に見出されるその蓄積に近い。プラスチドリボソーム又はプラスチド特異的翻訳活性のいづれも、葉組織に比較してピーマン果実及びヒマワリ花弁の十分に成熟したクロロプラストに検出され得ないことが報告されている（Kuntz et al.(1989)Mol.Gen.Genet．216：156-163）。従って、翻訳器官はクロロプラストにおいて低レベルに減じられ得るけれども、我々は、花弁におけるT7／GUS構造体からの高レベルの発現を検出できるが、但しそのレベルは葉に見られるレベルよりも４〜５倍低い。あるプラスミド遺伝子、特にpsbAのためのmRNAは、ピーマン果実及びヒマワリ花弁（33）並びにトマト果実の十分に成熟したクロロプラストにおいて少なくとも４〜５倍低下することが示されている。さらに、花弁組織におけるトランス−活性化T7 RNAポリメラーゼの低レベルは、花冠の拡張する部分における35Sプロモーターの減じられた活性により説明され得る。従って、葉における値に比較して低レベルのGUS活性は、psbA 3′により引き起こされる異なったmRNA蓄積、及び／又は転写又は翻訳活性の低下の結果でありえる。
例７ 遺伝の研究
GUSレポーター遺伝子が母親側から受け継がれた特徴として挙動することを示すために、いくつかの交雑を行なった。試験及び自家交雑に由来する種子を発芽せしめ、そして組織化学的な基質X-glucにより染色することによってβ−グルクロニダーゼ活性についてその実生を評価した。4026-3／4276についての自家交雑は、核コードされたポリメラーゼがホモ接合性であるので、予測されるように、129個の陽性をもたらし、そして陽性は存在しなかった。野生型核／4276プラスチド（雌）×4026-3核（ホモ接合性）／Xanthiプラスミド（雄）交雑は、192個の陽性をもたらし、そして陰性はもたらさず、ところが相反交雑に関しては、119個の実生において陽性は存在しなかった。ホモ接合性4026-3／4276（雌）と野生型“Xanthi”（雄）との間の交雑は、そのホモ接合性におけるＴ７ポリメラーゼ用量効果を包含する母親からの実生よりもわずかに薄い青色の表現型を有する、試験された135個の実生のうち135個の実生をもたらした。相反交雑は、試験された143個の実生に関して陽性を生成しなかった。それらのデータは、レポーター遺伝子がすべての交雑において母親から受け継がれ、そしてプラスミド標的化T7 RNAポリメラーゼをコードする活性遺伝子の性的伝達により都合良く活性化され得ることを確証する。
本明細書に言及されるすべての出版物及び特許出願は当業者の熟練のレベルの示しである。すべての出版物及び特許出願は、それぞれ個々の出版物又は特許出願が引例により特別且つ個々に組込まれているのと同じ程度に引用により本明細書に組込まれる。
前述の発明は例示的且つ例的にいくらか詳細に記載されたけれども、一定の変更及び修飾が本発明の範囲内で行なわれ得ることは明らかであろう。
本発明は、植物への遺伝子工学技法の適用に関する。より詳しくは、本発明は、特定のウィルスポリメラーゼにより認識されるプロモーターを用いて、クロロプラスト発現構造体と共に特定のウィルスRNAポリメラーゼの発現のためへの核構造体の使用に関する。
背 景
高等植物のプラスチドは、遺伝子工学のための魅力ある標的である。植物プラスチド（クロロプラスト、アミロプラスト、エライオプラスト、クロモプラスト、等）は、光合成の他に、産業的に重要な化合物、たとえばアミノ酸、複雑な炭水化物、脂肪酸及び色素の生成を担当する主要な生合成センターである。プラスチドはプロプラスチドとして知られる通常の前駆体に由来し、そして従って、一定の植物種に存在するプラスチドはすべて同じ遺伝子含有物を有する。植物細胞は小さな120〜160kbの環状ゲノムの500〜10,000コピーを含み、それらの個々の分子は、大きな（約25kb）逆方向反復体を有する。従って、ひじょうに高レベルの外来性遺伝子発現を潜在的にもたらすことができる興味ある特定の遺伝子の20,000までのコピーを含むように植物細胞を構築することが可能である。
DNA配列及び生化学データは、プラスチドオルガネラの転写及び翻訳機構並びにそれらの開始シグナルが原核生物系に見出されるものと類似していることを示す。実際、プラスチド由来のプロモーター配列は、原核細胞においてレポーター遺伝子の発現を指図していることを報告されている。さらに、プラスチド遺伝子は、原核生物において存在するように、ポリシストロニックオペロン中にしばしば構成されている。
プラスチドと原核生物との間の明白な類似性にもかかわらず、プラスチド及び原核生物において遺伝子発現を制御するために使用される方法には基本的な差異が存在する。
原核生物に典型的に観察される転写制御機構に対立するものとして、プラスチド遺伝子の発現はトランス−作用性核コードタンパク質により翻訳及びmRNA安定性のレベルで主に制御されている。
植物クロロプラストの安定した形質転換に向けられたこれまでの研究は、葉のプラスチド中に所望する遺伝子を組込むための相同組換えに依存して来た。この態様においては、組換えDNA構造体のための同種形成性又はほぼ同種形成性のトランスジェニック植物が得られる。しかしながら、プラスチド遺伝子発現のための遺伝子工学に対する主な欠点は、所望する遺伝子生成物の発現のタイミング及び／又は部位を制御するための組織特異的及び／又は組織進行性調節機構の欠乏である。トランスジェニック植物におけるプラスチドオルガネラの完全な補体が形質転換されるので、組込まれた構造体は、すべてのプラスチドを含む植物組織において発現される。
プラスチドに挿入される配列の発現を制御するための機構は、特定の組織タイプに存在するプラスチド経路、たとえばそれぞれジャガイモ塊茎又は油種子におけるスターチ及び脂肪酸生合成経路、花色経路、種々の果物プラスチドにおける果物熟成関連反応、及び若い植物組織において耐除草剤性を生成するように標的化され得る経路の最適な変性のために有用であろう。さらに、たとえばアンチセンス構造体を用いて生来のプラスチド遺伝子の発現を減じることによる、存在するプラスチド代謝の調節されていない変性及び／又は新しい生化学的経路の導入が、生存する植物を得ることの不可能さをもたらす。たとえば、初期発育段階での生長する組織における一定の経路の変更が、調節されていないＥ．コリ又はクロロプラスト遺伝子プロモーターを用いて観察され、有害な最終生成物の生成をもたらし、そして従って、トランスジェニック植物を得る能力を制限する。しかしながら、所望する生化学的反応のための遺伝子が発育の特定の段階でのみ発現するようプログラムされている場合、その反応は、所望する期間で、たとえば収穫すべき十分な植物バイオマスが存在する時点で、所望する生成物を生成するように制御され得る。この態様においては、所望する最終生成物の実質的な量が得られる。
関連文献
プラスチドの安定した形質転換は、緑藻類クラミドモナス(Chlamydomonas)(Boynton et al．（1988）Science 240：1534-1538)及び最も最近は、高等植物(Svab et al．（1990）Proc.Natl.Acad.Sci. USA 87：8526-8530；Svab and Maliga（1993）Proc.Natl.Acad.Sci. USA 90：913-917)に報告されている。それらの方法は、選択マーカーを含み、そして相同組換えによりプラスチドゲノムに標的を向けられたDNAの粒子ガン導入に頼っている。
ゼニゴケ（Ohyama et al．（1986）Nature 322：572-574）、イネ（Hiratsuka et al．（1989）Mol.Gen.Genet. 217：185-195）及びタバコ(Shinozaki et al．（1986）EMBO J.ら：2043-2049)からのプラスチドゲノムの完全なDNA配列が報告されている。
プラスチドプロモーターは、原核細胞においてレポーター遺伝子の発現を指図するものとして報告されている（Gruissem et al．（1993）Critical Reviews in Plant Sciences 12：19-55）。
Ｔ７ポリメラーゼによるＥ．コリにおけるクローン化された遺伝子の選択的発現が、Rosenberg et al．（Gene（1987）56：125-135）により報告されている。
タバコ（Lassner et al．（1991）Plant Mol.Biol．17：229-234）、マウス細胞(Lieber et al．（1989）Nucl.Acids Res．17：8485-8493)及びサッカロミセス セレビシアエ(Saccharomyces cerevisiae)(Benton et al．（1990）Mol.Cell.Biol．10：353-360）における核に対してのT7 RNAポリメラーゼの標的化が報告されている。
発明の要約
本発明によれば、植物プラスチドゲノム中に挿入された外来性DNA配列の発現のタイミング又は組織パターンを制御する方法を提供するために植物細胞の遺伝子操作のために有用な構造体が供給される。核形質転換のための構造体は、植物細胞組織におけるウィルスの単一のサブユニットRNAポリメラーゼの発現、及び植物細胞プラスチド中への発現されたポリメラーゼタンパク質の標的化を提供する。核構造体は、すべての植物細胞におけるウィルスポリメラーゼの組織的な発現を提供するもの、及び好ましくは、特定の植物組織において及び／又は特定の発育段階で、発現を提供するものを包含する。
本明細書においてポリヌクレオチドとしても言及される、プラスチド形質転換に使用するためのDNA配列は、上記の核発現構造体から発現されたRNAポリメラーゼに対して特異的であるウィルスゲノムプロモーター領域、及び形質転換されたプラスチド細胞において発現されるべき対象のDNA配列を含んで成るプラスチド発現構造体を含む。プラスチド形質転換のためのポリヌクレオチドのこの部分は、“プラスチド発現構造体”として本明細書では言及される。対象のDNA配列は、たとえば生来のプラスチド遺伝子の発現の低下が所望される場合、センス配向又はアンチセンス配向での単一のコード領域であり得る。その対象のDNA配列は、たとえば、プラスチド中への外来性生化学経路の導入が所望される場合、オペロンとして発現されるべき多くの連続したコード配列を含むことができる。プラスチド形質転換のためのポリヌクレオチドはまた、植物プラスチドオルガネラにおけるマーカーの発現を提供するDNA構造体を含み、ここで前記マーカーは前記マーカーを発現するプラスチドオルガネラを含んで成る植物細胞の選択を提供する。このプラスチド構造体はまた、本明細書において、“プラスチド選択構造体”としても言及される。プラスチド形質転換に使用するためのポリヌクレオチドはまた、プラスチドゲノム中への発現及び選択構造体のトランスファーを提供する手段を含むであろう。便利には、トランスファーされるべき構造体を両端に有する標的のプラスチドゲノムに対して相同性の領域が包含される。プラスチドゲノムへのトランスファーのための他の手段はまた、転移因子の使用を包含する方法により本明細書において考慮される。
本明細書に記載される核及び／又はプラスチド構造体を含んで成る植物細胞及び植物もまた、本発明において考慮される。そのような植物又は植物細胞は、本発明の核及びプラスチド構造体の両者を有する植物細胞を提供するために、植物育成又は形質転換法に使用され得る。本発明の核及びプラスチド発現構造体の両者を含んで成る植物細胞は、ウィルスプロモーター領域の制御下でのプラスチドゲノムにおける対象のDNA配列の発現の結果として変更された表現型を有するであろうことが理解される。
さらに、植物プラスチドにおける組織及び／又は発生する選択的な発現、及び得られる表現型の変更を提供する方法が、本発明の核ポリメラーゼ構造体及びプラスチド発現構造体の両者を含んで成る植物細胞において付与される。
図面の説明
図１。核形質転換のためのT7 RNAポリメラーゼ発現二元構造体、pCGN4026の略図が示される。LB、左側のT-DNAボーダー；RB、右側のT-DNAボーダー；35Ｓ、CaMV 35Sプロモーター；nptII、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子；tml 3′、腫瘍形態学“大きな”３′領域；d35S、増強されたCaMV 35Sプロモーター；TP、タバコ小サブユニット５′未翻訳領域、クロロプラストトランジットペプチドとイントロンＩ及び成熟タンパク質の初めの12個のアミノ酸；T7 RNAP、ファージT7 RNAポリメラーゼ遺伝子のコード領域（出発コドン欠失）；nos 3′、ノパリンシンターゼ３′領域。
図２。T7 RNAポリメラーゼ依存性GUS発現マーカーを含むトランスプラストミックタバコ系の調製のための構造体及びクロロプラストDNAのサザン分析が示される。pCGN4276構造体の略図及びタバコプラスチドゲノム中へ組込みの表示が上部に示される。入って来るDNA及び野生型DNAのための予測されたサイズのBamHＩフラグメントのが提供される。入って来るDNAの５′端上にはBamHＩ部位は存在しないので、その２種のキメラ遺伝子の組合されたサイズを表示する。また、サザン分析のために使用されるプローブＡ及びＢの位置も示されている。プローブＡは形質転換の程度を決定し、そしてプローブＢはGUS遺伝子の存在を示す。サザン分析の結果は、図２の下部に示されている。4276／4026-3クローン１及び２は、Ｎ．タバカムvar.（N. tabacum var.）“Xanthi”系4026-3における２つの独立したスペクチノマイシン耐性形質転換体を示す。4276／Xanthiは、野生型Ｎ．タバカムvar.“Xanthi”におけるスペクチノマイシン耐性形質転換体を示す。対照DNAは、形質転換されていない“Xanthi”からである。
発明の特定の記載
本発明の核形質転換構成体は、植物細胞の核のゲノム中に挿入され得、そしてプラスチドオルガネへのポリメラーゼタンパク質の輸送を付与することができるトランジットペプチド領域に融合されるウィルス性単一サブユニットRNAポリメラーゼの発現を提供できるヌクレオチドのいづれかの配列を含む。本発明のウィルスポリメラーゼコード配列は、それらの細菌宿主の感染に基づいてDNA−依存性RNAポリメラーゼの合成を提供する形態学的に類似する細菌ウィルスのグループから得られる。他の既知のDNA依存性RNAポリメラーゼに比べて、このクラスの細菌ウィルスによりコードされるポリメラーゼは、単一のタンパク質種（約100kDの分子量）から成り、そして特定のプロモーター配列からの転写を選択的に認識し、そして提供する。このタイプのポリメラーゼをコードするいくつかの十分に特徴づけられたウィルスは、Ｅ．コリＴ３及びＴ７ファージ及びサルモネラチフィムリウム（Salmonella typhimurium）のSP６ファージを包含する。そのようなポリメラーゼのためのコード配列は、McGraw et al．（Nucl.Acids Res．（1985）13：6753-6766）及びKotani et al．（Nucl.Acids Res．（1985）15：2653-6664）により報告されている。このクラスのバクテリオファージの他のメンバーは、プスードモナス(Pseudomonas)ファージgh-1、クレブシエラ（Klebsiella）ファージＫ11、シトロバクター(Citrobacter)ファージviIII、及びセラチア（Serratia）ファージIVを包含する。従って、このクラスのファージのいづれかのメンバーからの関連するポリメラーゼのためのコード配列を得ることができ、そしてたとえばＴ７ポリメラーゼコード配列を含んで成る構造体により本明細書においては例示される核発現構造体に使用され得る。
植物プラスチド中へのウィルスポリメラーゼの輸送を提供するようにトランジットペプチド領域をコードする配列は好ましくは、植物核コードプラスチドタンパク質、たとえばリブロースビスリン酸カルボキシラーゼの小サブユニット（SSU）、アシルキャリヤータンパク質（ACP）を含む植物脂肪酸生合成関連遺伝子、ステアロイル−ACPデサチュラーゼ、β−ケトアシル−ACPシンターゼ及びアシル−ACPチオスステラーゼ又はLHCPII遺伝子から得られる。プラスチドへの輸送を提供するトランジットペプチドのためのコード配列は、特定のトランジットペプチドのコード配列のすべて又は一部を含むことができ、そしてまた、特定のトランジットペプチドに関連する成熟タンパク質コード配列の一部も含むことができる。プラスチドオリガネラ中に標的のタンパク質を運ぶために使用され得るトランジットペプチドの多くの例が当業界において存在する。本発明において使用される特定のトランジットペプチドをコードする配列は、プラスチドへの輸送が得られる限り、重要ではない。本明細書に提供される例においては、タバコRuBISCO SSU遺伝子５′未翻訳領域＋クロロプラストトランジットペプチドのためのコード配列及び成熟SSUの12個のアミノ酸（イントロンＩを含む）が、タバコプラスチドへの核発現されたＴ７ポリメラーゼの輸送を提供するために構造体に含まれる。ブラシカのプラスチドへの核発現されたＴ７ポリメラーゼの輸送に関しては、タバコSSUイントロンＩ領域が欠失されている類似する構造体が使用され得る。
植物細胞核におけるトランジットペプチドウィルスポリメラーゼコード配列の発現を提供する植物プロモーターは、すべての植物組織において構成的な発現を提供し、又は好ましくは、特定の植物組織において、及び／又は植物成長の特定の段階で発現を提供できる。構成プロモーターは、特定の植物において高い又は低いレベルの発現を示すことができるが、しかし植物のすべての部分においては少なくともあるレベルの発現を一般的に提供するであろう。植物の構成プロモーターの例は、CaMVからの19Ｓ及び35Ｓプロモーター及びmas，nos及びocsアグロバクテリウムT-DNA遺伝子からのプロモーターを包含する。発育性又は組織選択性発現に関しては、有用なプロモーターは、植物種子、果物、塊茎、繊維細胞、植物花組織及び花粉において選択的に発現された遺伝子からのものを包含する。
種子プラスチドにおける選択的な発現は、脂肪酸生合成経路の変性、貯蔵タンパク質の変性又は種子における新しい経路の導入、たとえば細菌性ポリヒドロキシブチレート(PHB)経路の導入が所望される場合に、所望される。そのような適用のために有用である植物機能プロモーターの例は、植物貯蔵タンパク質遺伝子、又は油性種子における脂肪酸生合成に関与する遺伝子からのものを包含する。そのようなプロモーターの例は、ナピン（Kridle et al．（1991）Seed Sci.Res．1：209：219）、ファーセオリン(Phaseolin)、ゼイン、ダイズトリプシンインヒビター、ACP、ステアロイル−ACPデサチュラーゼ及びオレオシン(Oleosin)のような遺伝子からの５′調節領域を包含する。種子特異的遺伝子調節は、EP 0255378(２／３／88）に論じられている。
果実プラスチドにおける選択的な発現は、たとえば果物の色又は風味の発育経路の変性が所望される場合、又は植物果実における炭水化物含有率の変更が所望される場合に所望される。そのような用途のために有用である植物機能プロモーターの例は、ポリガラクツロナーゼ(Bird et al．（1988）Plant Mol.Biol．11：651-662）、トマトからのＥ−８遺伝子（Deikman et al．（1988）EMBO J．7：3315-3320；Pella Penna et al．（1989）Plant Cell 1；53-63）、トマト2A11（Dear et al．（1989）Plant Mol.Biol．13：639-651）又はWO 91／01324(２／７／91）に記載されているような子房特異的プロモーター領域のような果実関連遺伝子からのものを包含する。
主なスターチ貯蔵組織、たとえばジャガイモ塊茎又はトウモロコシ種子におけるスターチ合成経路の変性は、本明細書に記載されるプラスチド発現方法により達成され得る。そのような場合、パラチン(Paratin)(Twell et al．（1987）Plant Mol.Biol．9：365-375）、ゼイン又は植物スターチシンターゼ（Visser et al．（1989）Plant Sci．64：185-192）からのプロモーターが、ウィルス性単一サブユニットRNAポリメラーゼの核発現のために特に有用である。
本明細書に記載される構造体及び方法により選択的に変性され得る他の植物組織は、植物花組織及び綿繊維のような特殊化された組織を包含する。花組織に選択的にウィルスポリメラーゼの核発現のために使用され得るプロモーターは、カルコンシンターゼ遺伝子、たとえばペチュニアからのCHS遺伝子Ａからのプロモーターを包含する（Koes et al．（1986）Nucl.Acids Res．14：5229-5329）。花色の変性に関しては、花組織におけるアントシアニン又はフラボノイド型色素の発現又はアンチセンス制御が所望される。植物の花色遺伝子操作に関しては、van Tunen et al．（Plant Biotechnology Series，Volume 2（1990）Developmental Regulation of Plant Gene Expression，D.Grierson ed.）を参照のこと。繊維組織の変性に関しては、綿繊維組織における発現のためへのトマトp7Z遺伝子プロモーターの使用が、同時継続出願07／998,158(12／29／92出願)に記載されている。綿繊維細胞における発現のために有用な他のプロモーターはまた報告されている(Crow，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci．USA（1992）89：5769-5773)。所望する綿繊維変性は、強度又はきめの改良を包含する。そのような改良のために使用され得る遺伝子の例は、PHB生合成遺伝子、セルロースシンターゼ遺伝子(Saxena et al．（1990）Plant Mol.Biol．15：673-683)及び菌類のキチンシンターゼ遺伝子(Bowen et al．Proc.Nat.Acad.Sci．（1992）89：519-523)を包含する。
綿繊維の有用な表現型変性のもう１つの例は、たとえば青又は黒色繊維を有する着色された綿の生成である。綿繊維における色系生成のためのコード配列の核発現のための方法は、07／998,158に記載されている。たとえば、メラニン生成に関しては、ストレプトミセス（Streptomyces）からの２つのタンパク質コード配列（Bernan et al．（1985）Gene 37：101-110）が使用され得る。２種のタンパク質、すなわちORF438生成物及びチロシナーゼのためのmRNAが、単一プロモーターストレプトミセスから転写される。本発明によれば、オペロンが特定のウィルスプロモーター領域、たとえば本明細書に記載されるＴ７プロモーターからの発現のために適合され、そしてプラスチド形質転換のために使用され得る。同様に、２種以上の遺伝子生成物が、形質転換された宿主細胞におけるインジゴの生成のために必要とされる。担当酵素がモノオキシゲナーゼである場合、未審査請求の日本特許出願公開番号第２−119777(Suzuki et al.)に記載されるように、２種の遺伝子生成物が必要とされる。酵素がデオキシゲナーゼ、たとえばKurkela et al．Gene（1988）73：355-362に記載されるナフタレンジオシキゲナーゼ（ND）である場合、３種の遺伝子生成物が必要とされる。トリプトファナーゼコード配列の使用はまた、インジゴへの転換のために利用できるインドールの量を高めるためにも所望される。トリプトファナーゼ遺伝子配列の源は、Ｅ．コリを包含する（たとえば、Deeley et al．（1982）J.Bacteriol．151：942-951を参照のこと）。従って、そのようなタンパク質のためのコード配列は、単一サブユニットのウィルスポリメラーゼにより特異的に認識されるウィルスプロモーターの後ろにポペロンとして提供され、そして本明細書に記載されるようにプラスチド発現構造体に使用され得る。
追加の態様においては、本出願は、若い組織に存在し、又は活性的に成長している植物組織、たとえば***領域に選択的に存在するプラスチド経路を選択的に変性する方法を提供する。特に、光誘発性プロモーター、たとえば若い組織におけるウィルスポリメラーゼの発現のためのSSU又はクロロフィルＡ／Ｂ結合タンパク質遺伝子からのプロモーターが考慮される。活動的に成長する植物組織に関しては、EF-1の遺伝子からのプロモーターが使用される。たとえばUSPN 5,177,011（Shewmaker et al，1／５／93発行）を参照のこと。そのような若い組織又は***性プロモーターは、耐性遺伝子を用いてのグリホセート、ブロモキシニル又はイミダゾリノン除草剤に対して除草剤耐性を付与する変性のためのプラスチド発現構造体と一緒に使用され得る。たとえば、Stakler et al．（J.Biol.Chem．（1985）260：4724-4728，Stakler et al．（J.Biol.Chem．（1985）263：6310-6314及びSathasivan et al．（Nucl.Acids Res．（1990）18：2188を参照のこと。さらに、そのような組織のプラスチドは、高められた光合成能力を付与するための又は耐病性及び／又は耐ストレス性のための機構を付与するための変性のための所望する標的である。
本発明のプラスチド形質転換に使用するためのDNA配列又はポリヌクレオチドは、上記核発現構造体から発現されるRNAポリメラーゼにより特異的に認識されるウィルス遺伝子プロモーター、及びそのウィルスプロモーターの制御下で、形質転換されたプラスチド細胞において発現されるべき対象のDNA配列を含んで成るプラスチド発現構造体を含むであろう。従って、核ポリメラーゼ発現構造体がＴ７ポリメラーゼをコードする場合、次の例において論ぜられるように、対象のDNA配列の発現のためのプラスチド構造体は、Ｔ７ポリメラーゼの存在下で、対象のDNA配列が単に発現されるよう、Ｔ７遺伝子プロモーターを含むであろう。同様に、Ｔ３，SP６又は他のウィルスポリメラーゼが核形質転換の結果として発現される場合、プラスチド発現構造体は対応する遺伝子プロモーター領域を利用するであろう。
本明細書に記載される構造体に使用される特定のウィルスプロモーター領域はまた、選択されたウィルス遺伝子の５′未翻訳DNA領域の一部を含むことができる。たとえば、ファージＴ７の遺伝子10からの５′未翻訳領域は、強められた翻訳を付与することが報告されており、そして本明細書に記載されるＴ７プラスチド発現構造体に含まれる。種々の源からの異なった又は追加の５′未翻訳領域は、対象のDNA配列の発現のためのプラスチド構造体に使用される。
プラスチドウィルスプロモーター発現構造体は一般的に、核構造体によりコードされるウィルスポリメラーゼにより認識される転写終結領域を含むであろう。典型的には、強い転写終結領域は、本発明の特定のウィルスプロモーターを用いる場合に必要とされ、そして従って、特定のプロモーター領域が得られる遺伝子と同じ遺伝子からの転写終結領域を用いることが便利である。従って、本明細書に記載される例においては、Ｔ７遺伝子10プロモーター領域及びその対応する遺伝子10転写終結領域は、プラスチドＴ７発現構造体に使用される。
ファージＴ７における種々の他の遺伝子はまた、そのＴ７単一サーブユニットポリメセーゼにより特異的に認識されるプロモーター配列を含むであろうことが注目される。特に、Ｔ７の遺伝子10は、同一の24bpプロモーター領域を有する６個のＴ７遺伝子の１つである。従って、それらの遺伝子のいづれか１つからのプロモーターは、その対応する５′未翻訳領域を伴って又は伴わないで、本発明により包含されるプラスチド発現構造体のために使用され得る。
プラスチドウィルスプロモーター発現構造体における対象のDNA配列は、構造遺伝子配列によりコードされるタンパク質が形質転換されたプラスチドにおいて生成されるように、特定の構造遺伝子の発現のために配向されるコード配列であり得る。さらに、対象のDNA配列は、単一のウィルスプロモーター領域からの多くの遺伝子の発現のためのオペロンが生成されるように、多くの個々の構造遺伝子をコードする領域を含むことができる。従って、構築された又は合成のオレペロンから又は先在する原核生物の遺伝子クラスターからの複数の遺伝子を導入し、そして発現することが可能である。そのような方法は、特定のウィルスポリメラーゼの核発現を誘導するために使用されるプロモーターに依存して、特定の所望する植物組織又は発育の特定段階において価値あるタンパク質及び精製薬品の大規模且つ安価な生成を可能にするであろう。そのようなアプローチは標準の核形質転換法によっては実施されない。なぜならば、個々の遺伝子がプラスチド摂取及び適切なプロモーター及びターミネーターシグナルのためのコードされたトランジットペプチドを含むモノシストロン中に構築されるべきであるからである。結果として、遺伝子発現レベルはシストロン間で広く変化することが予測され、そして多くのトランスジェニック植物系の発生が必要とされる。究極的には、交差が、標的の生化学経路への発現を得るために、１種の植物中にそれらのシストロンのすべてを導入するために必要とされる。
他方、プラスチド構造体における対象のDNA配列は、内因性遺伝子mRNAに相補的なRNAが形質転換されたプラスチドに生成されるように配向された内因性プラスチド遺伝子のフラグメントであり得る。そのようなアンチセンス構造体は、標的のプラスチド遺伝子の発現を低めるために使用され得る。
プラスチド形質転換に続いて所望する植物細胞を選択する手段を付与するためには、プラスチド形質転換のためのポリヌクレオチドはまた、マーカー遺伝子の発現を付与する構造体を含むであろう。そのマーカー遺伝子生成物の発現は、そのマーカータンパク質を発現するプラスチドオルガネラを含んで成る植物細胞の選択を可能にする。本明細書における例においては、細菌aadA遺伝子がクロロプラスト５′プロモーター及び３′転写終結領域の制御下で発現される。植物細胞のプラスチド形質転換のためのそのような発現構造体の使用は、Svab and Maliga（1993、前記）に記載されている。aadA遺伝子の発現は、スペクチノマイシン及びストレプトマイシン耐性を付与し、そして従って、このマーカー遺伝子を発現する植物細胞の同定を可能にする。aadAマーカー遺伝子のための選択は、ストレプトマイシンの存在、又はより好ましくは、植物成長培地におけるストレプトマイシンの存在により漂白されない植物細胞の同定に基づかれている。クロロプラスト代謝に関与する生成物をコードする他の遺伝子がまた、選択マーカーとして使用され得る。たとえば、植物除草剤、たとえばグリホサート、ブロモキシニル又はイミダゾリノンに対する耐性を付与する遺伝子が特に使用される。そのような遺伝子は、Stalker et al．（J.Biol.Chem．（1985）260：4724-4728；グリホセート耐性EPSP）、Stalker et al．（J.Biol.Chem．（1985）263：6310-6314；ブロモキシニル耐性ニトリラーゼ遺伝子）、及びSathasivan et al．（Nucl.Acids Res．（1990）18：2188；AHASイミダゾリノン耐性遺伝子）により報告されている。
本明細書に記載される例においては、aadA遺伝子は、タバコ16S rRNAプロモーター、rrn領域及びタバコrps16 3′結合領域の制御下にある。多くの追加のプロモーター領域がまた、選択可能マーカー、たとえば植物プラスチドにおいて機能することが知られている種々のプラスチドプロモーター及び細菌プロモーターの発現を誘導するためにも使用され得る。
プラスチド形質転換に使用するためのポリヌクレオチドはまた、プラスミドゲノム中へのウィルスプロモーター発現構造体及び選択マーカー構造体の安定したトランスファーを提供する手段を含むであろう。便利には、標的のプラスチドゲノムに対して相同性の領域は、トランスファーされるべき構造体を両端に有し、そしてゲノム中への二重クロスオーバーを通しての相同組換えによるプラスチドゲノムのトランスファーを提供する。相同の領域がプラスチドゲノムの逆方向反復領域(IRA及びIRB)に存在する場合、トランス遺伝子の２つのコピーがプラスチドゲノム当たりに予測される。典型的には、プラスチドゲノムを有する相同性の領域は、約１kbのサイズであろう。より小さな相同性の領域、たとえば100bpなどの小さな領域が使用され得、これはプラスチドゲノム中への相同組換えを提供することができる。しかしながら、組換えの頻度及び従って、形質転換されたプラスチドを有する植物を得る頻度は、相同領域のサイズが小さくなるにつれて低下する。タバコプラスチド形質転換のためのそのような相同性の領域を含んで成る構造体の例は、Svab et al．（1990前記）及びSvab and Maliga（1993前記）に記載されている。タバコ及びブラシカのプラスチドゲノム中への組換えのために有用な領域はまた、次の例に記載されている。類似する相同組換え及び選択構造体は、標的の植物種からのプラスチドDNAを用いて調製され得る。
プラスチドゲノムへのトランスファーの他の手段は、たとえば転位因子の使用を包含する方法により本明細書において考慮される。たとえば、プラスチドゲノム中にトランスファーされるべき構造体は、植物プラスチドにおいて機能する転位マーカーからの逆方向反復領域を両端に有する。プラスチド中への標的DNAのトランスファーのために必要とされるトランスポザーゼの過渡発現を提供するDNA構造体がまた、クロロプラスト中に導入される。この態様においては、種々の表現型が、プラスチドゲノム上の種々の位置への発現構造体の挿入に起因する位置効果に依存して同じ発現構造体により形質転換された植物において得られる。そのようなプラスチド形質転換法に使用するための適切なトランスポゾンは、細菌Tn10、バクテリオファージMu及び種々の他の既知の細菌性トランスポゾンを包含する。
本発明の構造体を構築する場合、調節領域及び読み取り枠を含んで成る種々のフラグメントが、異なったプロセッシング条件、たとえば連結、制限酵素消化、PCR、インビトロ変異誘発、リンカー及びアダプターの付加、及び同様の手段にゆだねられ得る。従って、ヌクレオチドトランジッション、トランスバージョン、挿入、欠失又は同様のことが、調節領域、ウィルスポリメラーゼコード配列及び／又はプラスチドにおける発現のための対象のDNA配列に使用されるDNAに対して行なわれ得る。制限消化、クレノウブラント末端処理、連結及び同様の方法がまた、当業界においては十分に知られており、そして、たとえばManiatis et al．（Molecular Cloning：a laboratory manual（1982）Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY）により記載されている。
構造体の調製の間、DNAの種々のフラグメントがクローニングベクターにおいてしばしばクローン化され得、そしてこれはDNAの増幅、DNAの変性又は配列、リンカー又は同様のものの連結又は除去による操作を可能にする。通常、ベクターはＥ．コリにおいて、少なくとも比較的高いコピー数で複製できるであろう。多くのベクター、たとえばpBR322、pUCシリーズ、Ｍ13シリーズ、及びpBluescript（Strategene；La Jolla，CA）は、クローニングのために容易に入手できる。
ウィルスポリメラーゼ発現構造体による植物細胞の核を形質転換するためのこの方法のうちいづれかの１つの方法が、本発明において使用され得る。植物細胞の核の形質転換のための方法は、Ti−又はRi−プラスミド、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、リポソーム融合、DNA衝撃又は同様の方法の使用を包含する。
アグロバクテリウムが植物細胞核の形質転換のために使用される場合、アグロバクテリウム宿主に存在するT-DNA又はTi−又はRi−プラスミドによる相同組換えのためにアグロバクテリウム中に導入されるベクターが使用され得る。他方、Ti−プラスミドに無関係にアグロバクテリウムに保持されるプラスミドに基づいて、植物細胞への前記構造体のトランスファーを提供する二元ベクターが使用され得る。T-DNAにより片側又は両側に隣接される、特に左及び右ボーダー、より特定には右ボーダーを有する構造体を有することが所望される。核発現構造体及びT-DNAボーダーは１又は複数のマーカーを含み、このマーカーは、形質転換されたアグロバクテリウム及び形質転換された植物細胞の選択を可能にする。多くのマーカー、たとえばカナマイシン、アミノグリコシド、G418、ハイグロマイシン又は同様のものに対する耐性が、植物細胞による使用のために開発されて来た。使用される特定のマーカーは本発明においては必須ではなく、１つの又は他のマーカーが特定の宿主及び構成の態様に依存して好まれる。
ベクターは、植物細胞中へのT-DNAをトランスファーするために機能的なvir−遺伝子を有するアグロバクテリウム中への形質転換により植物細胞中への対象のDNAを導入するために使用される。次に、広い宿主範囲のベクター構造体を含むアグロバクテリウムが、複製及び通常の発現が生じるであろう条件下で植物宿主細胞中への所望するDNAのトランスファーのための適切な条件下で植物細胞を感染せしめるために使用される。これはまた、通常、所望するDNAを含む細胞が容易に選択され得るように、マーカーのトランスファーも包含するであろう。
植物細胞に標的DNA構造体をトランスファーするために衝撃法を使用する、植物核形質転換及び選択の方法はまた、本発明にも使用され得る。そのような方法は、アグロバクテリウム介在形質転換法に対してほとんど敏感ではない植物細胞の形質転換において特に有用である。衝撃形質転換法は、Sanford et al．（1991）Technigue 3；3-16；Klein et al．（1992）Bio／Technology 10：286-291に記載されている。
一般的に、植物細胞の形質転換においては、標的移植片が、形質転換されたアグロバクテリウムと共にインキュベートされ、又はDNA被覆された粒子により衝撃を与えられる。次に、植物細胞は適切な培地において増殖せしめられ、所望する構造体を得たそれらの植物細胞が選択的に培養される。塊茎が形成された後すぐに、苗条形成が、既知の方法に従って適切な植物ホルモンを用いる事によって生ぜしめられ、そして苗条は、植物の再生のための根形成培地に移される。次に、植物は成長せしめられ、そして同じ形質転換された株又は異なった株により受粉される。ホモ接合系の生成のためには、自家受粉が用いられる。
粒子衝撃によるタバコプラスチドゲノムの安定した形質転換は、Svab et al．（1990）Proc.Natl.Acad.Sci．USA 87：8526-8530；Svab and Maliga（1993）Proc.Natl.Acad.Sci．USA 90：913-917に報告されている。上記文献に記載される方法は、本明細書に記載されるプラスチド形質転換構造体により形質転換された植物を得るために使用され得る。手短に言及すれば、そのような方法は、好ましくは代謝的に活性的なプラスチドオルガネラに富んでいる組織、たとえば葉及び子葉を包含する若い植物組織からの標的宿主移植片のDNA衝撃を包含する。次に、衝撃を与えられた組織は、細胞***促進培地上で約２日間、培養される。次に、植物組織は、特定の選択剤の阻害量、並びに特定のホルモン及び特定植物種のための再生を得るのに必要な他の物質を含む選択培地に移される。たとえば、上記出版物及び本明細書に提供される例においては、選択マーカーは細菌aadA遺伝子であり、そして選択剤はスペクチノマイシンである。前記aadA遺伝子生成物は、連続した増殖を可能にし、そしてマーカー遺伝子生成物を含んで成るクロロプラストを含む細胞の緑化を可能にする。マーカー遺伝子生成物を含まない細胞は漂白される。衝撃を与えられた外植片は、約３〜８週で若い苗条を形成するであろう。それらの苗条からの葉は同じ選択培地上で継代培養され、同種形成性苗条の生成及び選択を確保される。２ラウンド目の苗条形成の代わりとして、初期の選択された苗条が成熟植物に成長せしめられ、そして分離により、挿入された遺伝子構造体のために同種形成性である形質転換された植物が提供される。
次に、そのようにして選択された形質転換植物は、植物中の全プラスチド含有物が形質転換されたか（同種形成性形質転換体）いづれかを決定するために分析され得る。典型的には、２つのラウンドの苗条形成及びスペクチノマイシン選択に続いて、分析される約50％のトランスジェニック−苗が、プラスチドDNAのサザンブロット分析により決定される場合、同種形成性である。それらの苗はさらなる栽培、トランスジェニックプラスチド表現型（核ウィルスポリメラーゼ発現構造体がまたプラスチド形質転換体にも存在する）の分析、又はトランスプラストミック植物の核中へのウィルスポリメラーゼ構造体の形質転換法への使用のために選択される。
本明細書の例に示されるように、挿入されたプラスチド遺伝子構造体はすべての交配において母として受け継がれ、そして発現は、プラスチド標的化T7 RNAポリメラーゼをコードする活性核遺伝子の性的な伝達により達成され得る。従って、核ウィルスポリメラーゼ発現構造体及びプラスチド発現構造体の両者を有する本発明の植物細胞を得るためにはいくつかの可能な手段が存在する。１つの方法においては、ポリメラーゼ活性を発現するホモ接合性核形質転換植物が得られ、そしてプラスチドゲノム中にプラスチド発現構造体をトランスファーするために衝撃手段により再形質転換される。逆に言えば、プラスチド形質転換植物は、本明細書に記載されるような衝撃手段により得られ、そして核及びプラスチドトランスジェニック構造体の両者を有するトランスジェニック植物を再生するために、たとえばアグロバクテリウム介在形質転換により又は粒子衝撃を通して、核形質転換法に使用される。第３の方法においては、トランスプラストミック植物及び核トランスジェニック植物がそれぞれの形質転換法を用いて独立して得られ、そして核及びプラスチドトランスジェニック構造体の両者を有する植物が、植物育成技法を用いて、核トランスジェニック及びプラスチドトランスジェニック植物を交雑することによって調製される。そのような交雑においては、プラスチドトランスジェニック植物は、母親として使用され、そして核トランスジェニック植物は父親である。
そのような組織を包含する形質転換及び再生法がアグロバクテリウム−介在形質転換後衝撃又は他の方法のいづれかにより一定の植物種のために適合された場合、それらの技法はプラスチド形質転換植物を生成するために選択及び再生法への使用のために変性され得る。たとえば、タバコについて本明細書に記載される方法は、他のナス科の種、たとえばトマト、ペチュニア及びジャガイモに容易に適用できる。ブラシカに関しては、アグロバクテリウム介在形質転換及び再生法は一般的に、胚軸組織、すなわち低プラスチド含有率の若くない組織の使用を包含する。従って、ブラシカに関しては、好ましい標的組織は、小胞子由来の胚軸又は子葉組織（若く、そして従って多くのプラスチドを含む）、又は葉組織外植体を包含する。そのような組織からの再生率は低いけれども、たとえばアグロバクテリウム介在形質転換により見出される位置上の効果は予測されず、そして所望する表現型を得るために多くの都合良く形質転換された植物をスクリーンすることが必要ないであろう。
従って、本明細書に記載される構造体及び方法は、変性されるべき又は植物に付加されるべき経路のタイプに依存して、広範囲の種類の植物生命体に使用され得る。たとえば、スターチ変性のためには、ジャガイモ又はトウモロコシ植物が形質転換され得る。花色の変性のためには、ペチュニア、バラ及びカーネーションが標的植物宿主である。果実品質の変性のためには、トマトが使用され得る。種子油品質又は種子タンパク質含有率の変性のためには、油性種子収穫物、たとえばブラシカ、ダイズ、トウモロコシ、ベニバナ又はヒマワリが使用され得る。
次の例においては、核コード／プラスチド標的化Ｔ７ポリメラーゼを発現するか又は発現しないいづれかの植物のプラスチドゲノム中へのファージＴ７遺伝子10プロモーターの制御下でのGUSマーカーの導入が記載されている。核コード／プラスチド標的化T7 RNAポリメラーゼの使用によるプラスチドトランス遺伝子発現を操作する能力が示される。ファージＴ７遺伝子10プロモーター及び５′未翻訳領域の制御下でのプラスチド−担持される受容体遺伝子GUSが、活性T7 RNAポリメラーゼを含むタバコ系中に導入される場合、発現される。その結果は、ウィルスポリメラーゼが植物プラスチドゲノム中に都合良く導入され、そしてＴ７遺伝子10プロモーターからのGUS遺伝子を活動的に転写することを示す。さらに、GUS活性はＴ７ポリメラーゼ活性の存在下で発現されるが、しかしその不在下では発現されず、従って、この反応の特異性、及び選択的なウィルス単一サブユニットRNAポリメラーゼをコードする核トランスジェニック構造体の発現を制御することによって、プラスチドトランスジェニック構造体の発現を選択的に制御する能力を示す。
次の例は、例示的であって、本願発明を限定するものではない。
例
例１ ポリメラーゼ発現構造体
Ａ．CaMV 35Sプロモーター構造体
構造体pAR3283(Dunn et al.(1988)Gene 63:259-266)を、BglII／EcoRＩにより消化し、Ｔ７ポリメラーゼ遺伝子のコドン11に融合されるSV40 T−抗原核位置シグナルを除去する。合成アダプター（上部鎖：５′−GATCTGGATCCAACACGATTAACATCGCTAAGAACG−３′及び下部鎖：５′−AATTCGTTCTTAGCGATGTTAATCGTGTTGGATCCA−３′）を導入し、pCGN4023を得る。前記アダプターは、T7 RNAポリメラーゼ遺伝子の野生型アミノ末端コード領域を回復するが、但し、メチオニン開始コドンがBamHＩ制限部位により置換されている。pCGN4023からのBamHＩフラグメントを、BamHＩにより消化されたpCGN566(アンピシリンよりもむしろクロラムフェニコールに対する耐性を付与する、pUC18に関連するプラスミド)中にサブクローンし、pCGN4024を得る。
二重35Ｓプロモーター（−941〜−90／−363〜＋２）及びtml 3′調節領域を含むプラスミドpCGN2113(３／２／89に寄託されたATCC寄託番号40587)をSacＩ／EcoRＩにより消化し、tml 3′領域を除去する、nos 3′を含むpBI101（Jefferson et al.(1987)EMB0 J.6：3901-3907)からのSacＩ／EcoRＩフラグメントをtml 3′の位置に導入する。次にその得られたプラスミドpCGN1575をSphＩ／XbaＩにより切断し、クレノウによりブラント末端化し、そしてプラスミドを再連結し、pCGN1577を得る。BglIIリンカーを、EcoRＩ消化及びpCGN1577のクレノウ処理に続いて、EcoRＩ部位に付加する。次に、その得られるプラスミドpCGN1579におけるNcoＩ部位を、NcoＩによる消化により除去し、クレノウ処理し、そして再連結する。新プラスミドpCGN1594は、短くされたバージョン７二重35Ｓプロモーター（転写開始部位に関して−526〜−90／−363〜＋２）及び260bpのnos 3′から成る。
タバコRuBISCO SSU遺伝子５′未翻訳領域＋クロロプラストトランジットペプチドのためのコード配列及び成熟SSU(イントロンＩを含む）の12個のアミノ酸のためのコード配列を有するDNAフラグメントを、鋳型としてクローンTSSU-3-8(O'Neal et al.(1987)Nucleic Acids Res．15：8661-8677)を用いて、上部鎖プライマー５′−CCCAAGCTTAGATCTCATCTTGGAAGTTTAAAGG−３′及び下部鎖プライマー５′−GGGGAGCTCGTCGACGGATCCGTACTTCTTCTTGTTAATTGG−３′を用いてPCR増幅する。PCR反応は、94ｃ／30秒、55ｃ／30秒及び72ｃ／30秒の25サイクルのために設定されたPerkin Elmer熱サイクラー(GeneAmp System 9600)において、Perkin Elmer／Cetusにより推薦される条件を用いて100μｌの体積において行なわれる。得られたフラグメントを、HindIII／SacＩによる消化によりpBluescriptII SK＋(Stratagene；LaJolla，CA)中にクローン化する。DNA配列の確認に続いて、その得られたプラスミドpCGN3669をBglII／SacＩにより消化し、そしてSSU配列を、BamHＩ／SacＩ消化されたpCGN1594中にクローン化する。得られたプラスミドpCGN3672をBamHＩにより切断し、そして変性されたＴ７ポリメラーゼ遺伝子を、pCGN4024からのBamHＩフラグメントとして導入する。Ｔ７ポリメラーゼ遺伝子が、成熟SSUとの翻訳融合として読み取るように配向されているクローンpCGN4025を選択する。pCGN4025をHindIII／BglIIにより消化し、そしてd35S／クロロプラストトランジットペプチド：Ｔ７ポリメラーゼ／nos 3′発現構造体を、HindIII／BamHＩ消化された二元ベクターpCGN1559（McBride et al.(1990)Plant Mol.Biol.14：269-276)中に導入し、pCGN4026（図１）を得る。
Ｂ．ナピン発現構造体
タバコSSU 5′未翻訳領域、リーダーペプチドコード領域及び成熟SSU（1stイントロンを含む）の初めの12個のアミノ酸のためのコード領域を含むHindIII／BamHＩフラグメントを、pCGN3609（上記）の消化により得る。そのフラグメントを、CaMV 35Sプロモーター領域を置換してpCGN986(下記)のHindIII／BamHＩ部位中のクローン化し、そしてpCGN4095をもたらす。
pCGN986は、カリフラワーモザイクウィルス35S（CaMV 35）プロモーター及びそれらの間に複数の制限部位を有するT-DNA tml 3′−領域を含む。T-DNA tml 3′−配列を、BamHＩ−EcoRＩフラグメント（ヌクレオチド9062〜12,823，Barker et al．Plant Mol.Biol.(1982)2：335-350におけるようにして番号をつける）として、pTiA6，Bam19 T-DNAフラグメント(Thomashow et al.，Cell（1980）19：729-739)からサブクローン化した。Bam19フラグメントのヌクレオチド11,209でのユニークSmaＩ部位をSacＩ部位に変え、そしてBamHＩ部位を、リンカーを用いてEcoRＩ部位に変えた。発現カセットpCGN986は、HindIII部位、続いてCaMV 35Sプロモーター、２つのSalI部位、XbaＩ，BamHＩ，SmaＩ、及びKpnＩ部位、並びにSacＩ／EcoRＩフラグメントとしてのtml 3′領域(T-DNAのヌクレオチド11207-9023)を含む。
pCGN4095のSSU部分におけるイントロン領域を、SphＩ及びBamHＩ部位により隣接されるSSUリーダーペプチド／成熟タンパク質領域に対応する合成オリゴヌクレオチドを用いて除去する。イントロンを有さないSphＩ／BamHＩフラグメントを、pCGN4095中に連結し、SphＩ／BamHＩフラグメントを含むイントロンを置換し、そしてpCGN4096を得る。
pCGN4024（上記）からのＴ７ポリメラーゼコード領域を約2.2kbフラグメントとして得、そしてpCGN4096中にクローン化し、SSUリーダーペプチド＋成熟SSUの12個のアミノ酸のためのコード領域、及び同じ翻訳読み取り枠におけるＴ７ポリメラーゼコード領域を含むpCGN4205をもたらす。
約1.7kbのナピンプロモーター領域を、pCGN3223からのBglII／HindIIIフラグメントとして、クロラムフェニコール耐性を付与するクローニングベクター中にクローン化し、pCGN4212を得る。pCGN3223は、アンピシリン耐性バックグラウンドに1.725ナピン５′及び1.265ナピン３′調節配列を含むナピン発現カセットである。そのナピン５′及び３′調節領域は、pCGN1808(Kridl et al．Seed Science Research（1991）1：209-219)に存在するものと同じであるが、しかし異なった制限部位を端に有する。pCGN3223における調節領域は、HindIII，NotＩ及びKpnＩ制限部位を端に有し、そしてユニークSalＩ，BglII，PstＩ及びXhoＩクローニング部位は、５′及び３′非コード領域間に位置する。
ナピン５′調節領域を、pCGN4212からのBglII／HindIIIフラグメントとして、BglII／HindIII消化されたpCGN4205中に挿入し、ナピン５′及びtml 3′調節領域間にセンス発現配向で位置するSSU：T7ポリメラーゼコード構造体を含むpCGN4217を得る。ナピン／SSU：T7ポリメラーゼ／tmlキメラ遺伝子を、二元ベクタープラスミドpCGN1559及びpCGN1548（McBride et al.，前記）中にHindIII／PstＩ部分消化フラグメントとしてクローン化し、それぞれpCGN4225及びpCGN4226を得る。
Ｃ．ファセオリン発現構造体
β−ファセオリン５′非コード領域の850bp BglIIフラグメントを、p8.8 pro(Hoffman et al.(1987)EMBO J．6：3213−3221)から得、そしてBamHＩ部位でpUC(Vieira and Messing（1982）Gene 19：259-268)中にクローン化し、pTV796を得る。pTV796におけるファセオリンフラグメントは、pUC9のSmaＩ部位がファセオリンプロモーターの３′側に位置するように配向される。ファセオリンを、クロラムフェニコール耐性を付与するクローニングベクター中にHindIII／SmaＩフラグメントとしてpTV796からサブクローン化する。得られるクローンpCGN4230を、HindIII及びBglIIにより消化し、そしてファセオリンプロモーターを含む約800bpのフラグメントを、HindIII／BglII消化のpCGN4205（上記）中にクローン化し、pCGN4231を得る。pCGN4231は、ファセオリン５′及びtml 3′調節領域間にセンス発現配向下で位置するSSU：T7ポリメラーゼコード構造体を含む。そのファセオリン／SSU：T7ポリメラーゼ／tmlキメラ遺伝子を、二元ベクタープラスミドpCGN1559及びpCGN1548（McBride et al.，前記）中にHindIII／PstＩ部分消化フラグメントとしてクローン化し、それぞれpCGN4232及びpCGN4233を得る。
例２ プラスチドにおける形質転換及び発現のための構造体
Ａ．GUSプラスチド発現構造体
ファージＴ７ポリメラーゼ遺伝子10プロモーター及び全５′未翻訳領域を、上部鎖プライマー５′−GGGAAGCTTGCGAAATTAATACGACTCAC−３′及び下部鎖プライマー５′−CCCCCATGGGTATATCTCCTTCTTAAAG−３′を用いてpET3a(Rosenberg et al.(1987)Gene 56：125-135)からPCR増幅する（上記のようなPCR条件下）。得られるPCR反応生成物は、24bpのＴ７プロモーター領域及び66bpのT7 5′未翻訳領域から成る。５′未翻訳領域は、最端５′でステム−ループ構造、続いて、翻訳エンハンサー（Olins et al.(1988)Gene(Amst.)73：227-235）、強い原核リボソーム結合部位、及び遺伝子10の開始コドンを含む。T7 PCRフラグメントをHindIII／NcoＩにより消化し、そしてHindIII／NcoＩにより消化されたpUC120中にクローン化し、pCGN4028を創造する。pUC120は、反対の配向に挿入されるlac領域及びlacペプチド(Vieira，J.PhD.Thesis．University of Minnesota，1988)のATCでNcoＩ部位を有するpUC118（Vieria and Messing，Methods in Enzymology（1987）153：3-11）に基づくＥ．コリ発現ベクターである。
３′調節領域を創造するために、psbA′未翻訳領域（Shinozaki et al.(1986)EMBO J．5:2043-2049により報告されるタバコクロロプラストゲノム配列の塩基対533-435）とpET3aからのＴ７遺伝子10ターミネーター領域との間に、PCRにより融合を創造した。最初の反応においては、psbA 3′未翻訳領域は、鋳型としてニコチアナタバカムvar．“Xanthi”の全DNAを用いて、上部鎖プライマー５′−GGGGAATTCGATCCTGGCCTAGTCTATAAG−３′及び下部鎖プライマー５′−GGTTATGCTAGTTATTGCTCAAAAGAAAAAAAGAAAGGAGC−３′を用いて増幅される。また、Ｔ７遺伝子10ターミネーターは、鋳型としてpET3a DNAを用いて、上部鎖プライマー５′−GCTCCTTTCTTTTTTTCTTTTGAGCAATAACTAGCATAACC−３′及び下部鎖プライマー５′−CCCCTGCAGCCGGATATAGTTCCTCC−３′を用いて増幅される。追加のPCR反応においては、上記psbA 3′及びＴ７ターミネーター反応からの反応生成物それぞれ５μｌを、最終反応混合物100μｌ中に組合し、ここで融合生成物が、psbA 3′反応に使用される上部鎖プライマー及びＴ７遺伝子10ターミネーター反応に使用される低部鎖プライマーを用いて増幅される。その融合生成物を、EcoRＩ及びPstＩにより消化し、そしてEcoRＩ／PstＩにより消化されたpBluescriptII KS(−)(Stratagene)中にクローン化し、pCGN4027を得る。
追加の操作を通して、Ｔ７プロモーター領域（HindIII／NcoＩ）及びpsbA３′／T7ターミネーター（EcoRＩ／PstＩ）を、pBluescriptII KS(−)主鎖（Stratagene）において、pkiwi101（Janssen et al.(1989)Plant Mol.Biol．14：61-72)からのNcoＩ／EcoRＩ GUS遺伝子フラグメントと組合し、pCGN4055を得る。
従って、pCGN4055においては、GUS遺伝子は、遺伝子10のための開始コドンがGUSの開始コドンであるように、Ｅ．コリファージＴ７遺伝子10プロモーター領域（転写開始部位に対して配列−24〜＋66）から下流に位置する。Ｔ７遺伝子10の５′未翻訳領域は、それはＥ．コリにおける翻訳エンハンサーのために重要であると報告されていることから保持される。GUS遺伝子構造体の３′領域は、若い組織におけるmRNAの安定化において重要であることが示されているpsbA 3′調節要素（Gruissem et al.(1993)Critical Reviews in Plant Sciences 12：19-55）、及び強いrho独立ファージＴ７遺伝子10ターミネーターを含む。
Ｂ．PHBオペロンのためのプラスチド発現構造体
ブラシカにおけるポリヒドロキシブチレート(PHB)経路に関与する遺伝子を含むオペロンのプラスチド発現のための構造体を次のようにして調製する。アルセリゲネスユートロファス（Alcalgenes eutrophus）からのPHBオペロンを、SfuＩ及びEcoRＩによるpAeT41(Peoples et al.(1989)J.Biol.Chem．264：15298-15303)の消化により得、そしてその適切な約4.2kbのフラグメントのClaＩ／EcoRＩ−消化BluescriptII KS(−)(Stratagene)中へのクローニングにより、pCGN4077を得る。pCGN4077を変異誘発し、phbBにおけるNcoＩ部位を除去し、そして得られる構造体をpCGN4082と命名する。pCGN4077をまた変異誘発し、phbCコード領域におけるNcoＩ部位を除去し、そしてATG翻訳開始コドンでNcoＩ部位を付加する。得られる構造体をpCGN4081と命名する。pCGN4081及びpCGN4082をXhoＩ及びBglIIにより消化し、そして変異誘発されたphbCコード領域を含むpCGN4081のXhoＩ／BglIIフラグメントを、変異誘発されたphbB領域及びクローニングベクター配列を含むpCGN4082のXhoＩ／BglIIフラグメントに連結する。その得られる構造体pCGN4086は、除去された内部NcoＩ部位と共に完全なPHBオペロンを含み、そしてATG翻訳開始コドンで付加されたNcoＩ部位を有する。PHBオペロンは、pCGN4086のEcoRＩ及びXhoＩによる消化により得られ、そしてEcoRＩ／XhoＩ消化されたpBluescriptII S（＋）中にクローン化され、pCGN4089が得られる。pCGN4089をEcoRＩ／NdeＩにより消化し、PHBオペロン３′未翻訳領域を除去し、そしてEcoRＩ／NdeＩリンカーアダプターにより連結し、pCGN4098を生成する。PHBオペロンを、EcoRＩ及びNcoＩによるpCGN4098の消化により得、そしてEcoRＩ／NcoＩ消化されたpCGN4211中にクローン化し、pCGN4216を得る。pCGN4211は、アンピシリン耐性クローンを提供するためにHindIII／PstＩ消化されたpBluescriptII（−）にHindIII／pstＩフラグメントとしてトランスファーされたpCGN4055（上記）のT7／GUS／pshA 3′：T7 3′フラグメントを含む。EcoRＩ及びNcoＩによるpCGN4211の消化は、GUS領域を除去する。従って、pCGN4216は、Ｔ７遺伝子プロモーター領域及びpsbA 3′：T7 3′領域の制御下でPHBオペロンを含む。
Ｃ．タバコ形質転換構造体
pCGN4055をHindIII／PstＩにより消化し、そして５′／GUS／psbA 3′：T7 3′発現構造体を、相同組換えによりタバコプラスチドゲノム中へのキメラ遺伝子の組込みを企画されている、HindIII／PstＩ消化されたベクター中にクローン化する。その得られた構造体をpCGN4276（図２）と称する。pCGN4276構造体を含んで成る細菌細胞は、American Type Culture Collection (ATCC)，Rockville，MD（ATCC＃＿＿＿＿）に寄託された。相同組換えベクター、すなわちプラスミドOVZ445は、タバコ16S rRNAプロモーター、rrnから発現されたストレプトマイシン／スペクチノマイシン選択マーカー遺伝子、aadA（前記rrnプロモーター及びaadA領域はSvab and Maliga（1993；前記）に記載されている）を含み、そして約150bpのrps16 3′終結領域(rps16遺伝子の配列はShinozaki，K．et al.，前記により報告されている）を有する。同様に、T7／PHB／psbA 3′：T7 3′領域を含むpCGN4216からのHindIII／BamHＩフラグメントを、HindIII／XbaＩにより消化されたOVZ445中にHindIII／SpeＩフラグメントとしてトランスファーし、pCGN4295を得る。
プラスチド形質転換のためのaadA選択マーカー構造体は、それがtrnVとrps12との間の遺伝子間領域におけるtrnV遺伝子座のすぐ上流に位置するように、そしてクロロプラストゲノムDNAの少なくとも１kbがaadA発現構造体に隣接するように、タバコクロロプラストゲノムフラグメント上のOVZ44Bに存在する。プラスチドDNA隣接フラグメントは、前記ベクターと標的のプラスチドDNA配列との間に相同組換えが生じるような領域を提供する。相同組換え部位はクロロプラスト逆方向反復体領域(IRA及びIRB)(Shinozaki et al.，前記)に存在するので、トランス遺伝子の２つのコピーがプラスチドゲノム当たりに予測される（Svab，et al.(1990)前記）。
Ｄ．ブラシカ形質転換構造体
ブラシカプラスチドのゲノム中への組換えのための相同性の領域を得るために、リブロースボスホスフェートカルボキシラーゼの大きなサブユニットをコードするrbcL遺伝子を含んで成るフラグメントを、ブラシカプラスチドDNAからクローン化する。プラスチドDNAは、Doyle et al.(Phytochem.Bull.(1987)19：11-15)により記載されているように単離され得る。ブラシカナパスのプラスチドゲノムの地図（Warwick et al.(1991)Theor.Appl.Genet．82：81-92；Palmer et al.(1983)Theor.Appl.Genet．65：181-189）は、rbcL遺伝子座が4.3又は4.8kbのKpnＩフラグメントのいづれか上に存在することを示す。このフラグメントをクローン化するために、プラスチドDNAをAsp718により消化し(KpnＩと同じ認識配列)、そしてAsp718により消化されたBluescriptII KS(−)中にクローン化する。得られるクローンからのDNAを、タバコからのrbcLコード領域を含む放射性ラベルされたプローブを用いてサザンハイブリダイゼーションにより分析する。ラベルされたクローンにハイブリダイズする約4.3kbのバンドを含むクローンpCGN5034を、rbcL遺伝子のさらなる位置決定のために選択する。DNA配列分析によるrbcL遺伝子の位置決定に続いて、プラスチド発現構造体、たとえばPHBオペロン構造体の挿入のための適切な領域を同定する。所望する領域は、所望する遺伝子構造体の挿入が生来のプラスチド遺伝子の発現を中断せず、そして挿入されたプラスド構造体がブラシカプラスチドゲノム中への二重クロスオーバーによる相同組換えを提供するために相同の領域を端に有する領域である。
例３ アグロバクテリウム介在の核植物形質転換
核発現のための二元構造体を、トランスジェニック植物の調製のために、Holsters et al.(Mol.Gen.Genet.(1978)163:181-187)の方法によって、適切なアグロバクテリウム株の細胞、たとえばLBA4404(Ooms et al.(1982)Plasmid 7:15-29)又はEHA101(Hood et al.(1986)J.Bacteriol．168：1291-1301)中に形質転換する。
トランスジェニックタバコ植物を、Horsch et al.(Science（1985）227：1229-1232)により記載されるようにしてアグロバクテリウム介在形質転換により得る。トランスジェニックブラシカ植物を、Radke et al.(Theor.Appl.Genet.(1988)75：685-694；Plant Cell Reports（1922）11：499-505)により記載されるようにしてアグロバクテリウム介在形質転換により得る。アグロバクテリウムツメファシエンスとの同時培養によるゴシピアムヒルスタムＬ(Gossypium hirsutum L.)子葉の形質転換は、Firoozababy et al.，Plant Mol.Bio.(1987)10：105-116及びUmbeck et al.，Bio/Technology（1987）5：263-266により記載されている。
他の植物種は、関連する技法を用いて同様にして形質転換され得る。他方、Klein et al.(Bio／Technology 10：286-291)により記載されるようなマイクロプロジェクチル衝撃法をまた用いて、本明細書に記載されるウィルス性単一サブユニットRNAポリメラーゼ発現構造体を含んで成る核形質転換された植物を得ることができる。粒子衝撃法による綿の形質転換は、1992年９月17日に公開されたWO 92／15675に報告されている。
たとえば、クロロプラスト標的化シグナル配列と共にT7 DNAポリメラーゼ遺伝子を有する二元ベクターpCGN4026を、Ａ．ツメファシエンスLBA4404中に導入し、そして得られるアグロバクテリウム株を用いて、プラスチド局在化T7 RNAポリメラーゼ活性を発現するトランスジェニックタバコ系を生成する。そのATG開始コドンを欠くキメラT7 RNAポリメラーゼ遺伝子を、タバコ小サブユニット(SSU)トランジットペプチド（TP）及び成熟SSUの初めの12個のアミノ酸への翻訳融合体としてd35Sプロモーターから発現する。多かれ少かれ、35Ｓプロモーターの構成的な性質により、Ｔ７ポリメラーゼ活性がほとんどすべての組織におけるプラスミドに発現されることが予測される。
同様に、二元プラスミドベクターpCGN4225，pCGN4226，pCGN4232及びpCGN4233をＡ．ツメファシエンスEHA101中に導入し、そしてその得られるアグロバクテリウム株を用いて、T7 RNAポリメラーゼ活性を局在化するプラスミドを発現するトランスジェニックブラシカ植物、たとえばＢ．ナパスvar．A112を生成する。それらの構造体においてT7 RNAポリメラーゼの発現を提供するナピン及びファセロリンプロモーターが植物種子組織に選択的な発現を提供するので、Ｔ７ポリメラーゼ活性は、種子組織のプラスミドに主に発現することが予測される。
例４ ポリメラーゼ発現するトランスジェニック植物の分析及び選択
pCGN4026による形質転換に起因する約20種の耐カナマイシン性タバコ系を生成し、そしてT7 RNAポリメラーゼ活性についてスクリーンする。T7 RNAポリメラーゼアッセイを、40mMのトリス−HCl、pH7.9、８mMのMgCl2、５mMのジチオトレイトール、４mMのスペルミジン−HCl、0.4mMの個々のATP，GTP，CTP及びUTP、及び２μCiの32P−UTPを含む反応においてpBluescriptII KS(−)転写体中への32P-UTPの組込みを測定することによって実施する。
一次形質転換体（Ｔ１世代）の葉組織における検出できるT7 RNAポリメラーゼ活性は、合計タンパク質μｇ当たり0.01〜2.25単位である。
カナマイシン分離アッセイを、分離比を決定するためにすべての陽性系の種子に対して行なう。３種の系、4026-3，4026-9及び4026-11は、耐性遺伝子に対して３：１に分離し、これはＴ７ポリメラーゼ構造体が単一の染色***置で挿入されたことを示す。4026-3，4026-9及び4026-11を自家受粉し、ホモ接合系を創造する。ホモ接合系からの葉に対するT7 RNAポリメラーゼアッセイは、4026-3が最とも低いレベルのT7 RNAポリメラーゼ活性を有するが、4026-9及び4026-11はより高いレベルのポリメラーゼ活性を有することを示した。下記表１を参照のこと。
例５ 植物プラスミド形質転換法
タバコプラスチドを、マイクロプロジェクチルの粒子ガン供給（Svab and Maliga（1993），前記）により形質転換する。プラスチドゲノム中への組込みは相同組換えにより生じ、そして標的部位は逆方向反復体においてリボソームRNAオペロン近くに存在するので、トランス遺伝子の２つのコピーが、プラスチドゲノム当り予測される（Svab et al.(1990)前記)。
野生型及びpCGN4026 T-DNAに対してホモ接合性のタバコ種子(Ｎ．タバカムv．Xanthi N／C)を、50％クロロックス溶液(2.5％次亜塩素酸ナトリウム)において20分間、表面殺菌し、そして滅菌されたH2Oにより４度すすぐ。次に、種子を0.2×MS塩培地上に無菌プレートし、そして発芽せしめる。苗を、30ｇ／ｌのスクロースを有する寒天固化MS培地上で成長せしめる(Murashige and Skoog（1962）Physiol.Plant 15：493-497)。Bio-Rad PDS 1000／He衝撃システム(Sanford et al.(1991)Technique 3：3-16；Klein et al.(1992)Bio／Technology 10：286-291)を用いて、タングステンマイクロプロジェクチル(1.0μｍ)をDNA、たとえばT7／GUS発現構造体、pCGN4276により被覆し、そしてその被覆されたマイクロプロジェクチルを用いて、RMOP培地(MS塩、１mg／ｌのBAP、0.1mg／ｌのNAA、30ｇ／ｌのスクロース及び0.7％のphytager)(Svab et al.(1990)前記)上に背軸側を上に配置され成熟葉に衝撃を与える。500mg／ｌのスペクチノマイシン二塩酸塩により補充されたRMOP培地上での形質転換された植物の発育及び同じ選択培地上での続くサブクローニングを、Svab et al.(1990)；Svab and Maliga（1993），前記に従って行なう。選択された植物を、１mg／ｌのIBA、500mg／ｌのスペクチノマイシン二塩酸塩及び0.6％のphytagerを含むMS培地中で根づかせる。
いくつかの同種形成性非−T7 RNAポリメラーゼ生成“Xanthi”4276系を対照として同時に創造した。多産な形質転換体は、pCGN4276 T7/GUS発現構造体による高レベルT7 RNAポリメラーゼ生成系4026-9のプラスチドを形質転換する試みからは得られなかった。4026-9からのプラスチド形質転換体の欠失は、プラスチドトランス遺伝子の高レベル発現が、Ｔ７発現システムが使用される場合、Ｅ．コリに生じることが報告されているように、オルガネラ上での代謝性流出を提供することによりたぶん説明される。
例６ プラスチドＴ７プロモーター構造体からの発現についての植物の分析
上記のようにしてのプラスチド形質転換に続いて、4026-3のT7 RNAポリメラーゼ産生バックグラウンドにおける２種の独立して単離された同種形成系を生成し、そして4026-3クローン１及び２と命名した。同種形成性は、図２に示されるようなサザンブロット分析により示された。pCGN4276構造体の略図及びタバコプラスチドゲノム中への組込みの図が図２の上部に示されている。上部線はpCGN4276から付与される入って来るDNAを示し、そして下部線は、組込みの標的領域を示す。BamHＩフラグメントのための予測されるサイズは、野生型DNAと同様に、その入って来るDNAについても示されている。その入って来るDNAの５′端上にはBamHＩ部位が存在しないので、２種のキメラ遺伝子の組合された大きさが示されている。また、サザン分析のために使用される、２種のプローブＡ及びＢの位置も示されている。4276／4026-3クローン１及び２は、Ｎ．タバカムvar．“Xanthi”系4026-3における２種の独立した耐スペクチノマイシン性形質転換体を示す。4276／Xanthiは、野生型Ｎ．タバカムvar．“Xanthi”における１種の耐スペクチノマイシン性形質転換体を表わす。対照のDNAは未翻訳Xanthiからである。DNA分子量マーカーは、キロ塩基対で示される。
サザン分析は図２の底部に示される。全体の植物細胞DNAは、Dellaporta et al.(1983)Plant Mol.Biol.Rep．1：19-21により記載されるようにして調製される。個々のサンプルのための約２μｇのDNAをBamHＩにより消化し、１％アガロースを通して電気泳動し、Nytran＋に移し、そしてd32P-dCTPラベルされたプローブによりフィルターハイブリダイズせしめる。プローブＡは、形質転換（同種形成性）の程度をし、そしてプローブＢはGUS遺伝子の存在を示す。プローブＡとのハイブリダイゼーションは、トランス遺伝子からの新しいBamHＩ部位の導入がトランスプラスミック系において3.3kb〜0.8kbのプローブされたフラグメントのサイズに変化する。同種形成性の程度は、残留する3.3kbバンドの存在により測定される。野生型の3.3kbバンドの形跡のみが元のブロットにおいて観察され、そしてそのレベルは図２で示されるこのブロットの再生においては検出できない。トランス遺伝子の初期コピーが他の逆方向反復体上に重複されていないプラスチドを、その3.3kbバンドが示すか、又は未翻訳プラスチドの小集団が存在するかいづれかについては明らかでない。
GUS遺伝子のT7 RNAポリメラーゼ依存性転写を測定するために、4276／“Xanthi”及び4276／4026-3の個々の１つのクローンの葉組織からの全体の細胞RNAサンプルを、GUS特異的プローブによるノザン分析にゆだねる。全体の植物RNAは、Hughes et al.(1988)Plant Mol.Biol.Rep．6：253-257により記載しているようにして調製された。予測されるサイズ(2.1kb)のmRNAに富んだ単一バンドが4276／4026-3 RNAサンプルにのみ存在する。これは、GUSトランス遺伝子の転写がＴ７ポリメラーゼの存在に依存することを示す。T7 RNAポリメラーゼが２種の遺伝子バックグラウンドにおいて他の転写体のレベルに影響を与えないことを示すために、重複フィルターをaadAトランス遺伝子特異的プローブによりハイブリダイズし、そしてGUSフィルターをpsbA特異的プローブにより再ハイブリダイズする。その結果は、遺伝子バックグラウンドが、連結されたaadAトランス遺伝子又は連結されていないpsbA遺伝子のいづれの相対的な転写レベルに対しても影響を与えないことを示す。奇妙なことには、1.3kbのaadA−特異的転写体が予測される0.9kbのバンドの他に、両ラインに存在する。これは、rps16 3′の境界内でプロセスされていないaadA転写体か又はGUSコード領域内の上流に生じる転写の開始のいづれかの結果であり得る。個々のmRNAについてのハイブリダイゼーションシグナルの強度をAmbisオートラジオグラフィースキャナーを用いて定量化し、そしてその結果は、GUSシグナルが組合されたaadAシグナルよりも約５倍高く、そしてpsbAシグナルよりも５倍低いことを示す。
T7 GUS転写体がトランスジェニックプラスチドにおいて翻訳されていることを示すために、β−グルクロニダーゼ特異的活性を種々の組織において測定した。GUSアッセイは、Jefferson et al.(EMBO J.,（1987）6：3901-3907)により記載しているようにして行なわれた。4276／4026-3クローンからの種々の組織におけるそれらのアッセイの結果は下記表２に示される。
葉組織に観察されるGUS mRNA蓄積及びβ−グルクロニダーゼ活性のレベルは、psbA 5′-GUS- pshA 3′プラスチドトランス遺伝子（Staub and Maliga（1993）EMBO J．12:601-606）を有するタバコについてこれまでに記載されたレベルに匹敵する。それらの結果の比較によれば、上記タバコ植物におけるβ−グルクロニダーゼのレベルは、それらの植物における全体の可溶性タンパク質の約1.5〜２％であると見積られる。さらに、ファージmRNAリーダーによる翻訳刺激のレベルは、psbAリーダー、すなわち十分に照らされた葉組織のために最適であることが示された条件下でpsbA mRNAリーダーのレベルに類似すると思われる（Staub and Maliga，前記）。従って、4026-3トランスジェニックの植物において測定されるT7 RNAポリメラーゼ活性の比較的低いレベルに関してさえ、プラスチドＴ７−トランス遺伝子から生成されるmRNAのレベルはpsbAプロモーターから生成されるそのレベルと同じほど高く、ここで前記プロモーターは、最強の内因性プラスチドプロモーターの１つであることが報告されている（Rapp et al.(1992)J.Biol.Chem．267：21404-21411）。
根及び成長する種子組織における低い活性レベルは、それらの組織における細胞当たりの低められたプラスチドゲノムコピー数により一部説明され得る。さらに、プラスチド発現構造体におけるpsbA 3′領域は、光合成的に活性的なクロロプラストの光誘発された成長の間、mRNA蓄積において６倍の低下を付与することが報告されている（Deng et al.(1988)EMBO J．7：3301-3308)。種々の組織における核−コードされたT7 RNAポリメラーゼの異なった発現レベルはまた、観察されるβ−グルクロニダーゼレベルにおける１つの要因である。Ｔ７ポリメラーゼの発現を誘導するCaMV 35Sプロモーターは、上記種子サンプルが分析された段階であり、後期の成長する種子においてよりも葉及び根において高い活性を有することが報告されている。
若くない根及び種子組織に比較して、花冠の上方の拡張する部分におけるβ−グルクロニダーゼ蓄積（後−葯形成）は、葉に見出されるその蓄積に近い。プラスチドリボソーム又はプラスチド特異的翻訳活性のいづれも、葉組織に比較してピーマン果実及びヒマワリ花弁の十分に成熟したクロロプラストに検出され得ないことが報告されている（Kuntz et al.(1989)Mol.Gen.Genet．216：156-163）。従って、翻訳器官はクロロプラストにおいて低レベルに減じられ得るけれども、我々は、花弁におけるT7／GUS構造体からの高レベルの発現を検出できるが、但しそのレベルは葉に見られるレベルよりも４〜５倍低い。あるプラスミド遺伝子、特にpsbAのためのmRNAは、ピーマン果実及びヒマワリ花弁（33）並びにトマト果実の十分に成熟したクロロプラストにおいて少なくとも４〜５倍低下することが示されている。さらに、花弁組織におけるトランス−活性化T7 RNAポリメラーゼの低レベルは、花冠の拡張する部分における35Sプロモーターの減じられた活性により説明され得る。従って、葉における値に比較して低レベルのGUS活性は、psbA 3′により引き起こされる異なったmRNA蓄積、及び／又は転写又は翻訳活性の低下の結果でありえる。
例７ 遺伝の研究
GUSレポーター遺伝子が母親側から受け継がれた特徴として挙動することを示すために、いくつかの交雑を行なった。試験及び自家交雑に由来する種子を発芽せしめ、そして組織化学的な基質X-glucにより染色することによってβ−グルクロニダーゼ活性についてその実生を評価した。4026-3／4276についての自家交雑は、核コードされたポリメラーゼがホモ接合性であるので、予測されるように、129個の陽性をもたらし、そして陽性は存在しなかった。野生型核／4276プラスチド（雌）×4026-3核（ホモ接合性）／Xanthiプラスミド（雄）交雑は、192個の陽性をもたらし、そして陰性はもたらさず、ところが相反交雑に関しては、119個の実生において陽性は存在しなかった。ホモ接合性4026-3／4276（雌）と野生型“Xanthi”（雄）との間の交雑は、そのホモ接合性におけるＴ７ポリメラーゼ用量効果を包含する母親からの実生よりもわずかに薄い青色の表現型を有する、試験された135個の実生のうち135個の実生をもたらした。相反交雑は、試験された143個の実生に関して陽性を生成しなかった。それらのデータは、レポーター遺伝子がすべての交雑において母親から受け継がれ、そしてプラスミド標的化T7 RNAポリメラーゼをコードする活性遺伝子の性的伝達により都合良く活性化され得ることを確証する。
本明細書に言及されるすべての出版物及び特許出願は当業者の熟練のレベルの示しである。すべての出版物及び特許出願は、それぞれ個々の出版物又は特許出願が引例により特別且つ個々に組込まれているのと同じ程度に引用により本明細書に組込まれる。
前述の発明は例示的且つ例的にいくらか詳細に記載されたけれども、一定の変更及び修飾が本発明の範囲内で行なわれ得ることは明らかであろう。
Claims (16)
- 植物プラスチドオルガネラに対象のDNA配列の転写を提供するための方法であって、
次の細胞を含んで成る植物を成長せしめることを含んで成り、ここで前記植物細胞中の核が、転写の５′から３′の方向に次の操作可能的に連結された部分：
前記核において機能的なプロモーター、プラスチドトランジットペプチドのためのコード配列、T7クラスのバクテチオファージのメンバーからのウィルス性単一サブユニットRNAポリメラーゼのためのコード配列、及び前記核において機能的な転写終結領域を含んで成るDNA構造体を含んで成り、ここで前記トランジットペプチドコード配列及び前記RNAポリメラーゼコード配列が同じ翻訳読み取り枠において存在し、そして
前記プラスチドオルガネラのゲノムが、転写の５′から３′の配向に次の操作可能的に連結された成分：前記ウィルス性単一サブユニットRNAポリメラーゼに対して特異的なプロモーター、前記対象のDNA配列、及び転写終結領域を含んで成るDNA構造体を含んで成ることを特徴とする方法。 - 前記ウィルス性単一サブユニットRNAポリメラーゼが、コリファージT7 RNAポリメラーゼ、コリファージT3 RNAポリメラーゼ、サルモネラファージSP6 RNAポリメラーゼ、プソイドモナスファージgh-1 RNAポリメラーゼ、クレブシエラファージK11 RNAポリメラーゼ、シトロバクターファージViIII RNAポリメラーゼ、及びセラチアファージIV RNAポリメラーゼから成る群から選択される請求の範囲第１項記載の方法。
- 前記核において機能的なプロモーターが、組織選択性又は発生的に調節された発現を提供する請求の範囲第１項記載の方法。
- 前記核において機能的なプロモーターが、構成的な発現を提供する請求の範囲第１項記載の方法。
- ａ）転写の５’から３’方向に操作可能的に連結された成分として、細胞核において機能的なプロモーター、プラスチドトランジットペプチドのためのコード配列、T7クラスのバクテリオファージのメンバーからのウイルス性単一サブユニットRNAポリメラーゼのためのコード配列、及び前記の核において機能的な転写終結領域を含んで成る核発現構造体（ここで前記トランジットペプチドコード配列及び前記RNAポリメラーゼコード配列は、同じ翻訳読み取り枠において存在する）、ならびに
ｂ）転写の５’から３’方向に操作可能的に連結された成分として、前記ウイルス性単一サブユニットRNAポリメラーゼに対して特異的なプロモーター、前記対象のＤＮＡ配列及び転写終結領域を含んで成る前記細胞のプラスチドオルガネラのゲノム中のDNA構造体
を含んで成る植物細胞。 - 前記RNAポリメラーゼが、コリファージT7 RNAポリメラーゼ、コリファージT3 RNAポリメラーゼ、サルモネラファージSP6 RNAポリメラーゼ、プソイドモナスファージgh-1 RNAポリメラーゼ、クレブシエラファージK11 RNAポリメラーゼ、シトロバクターファージViIII RNAポリメラーゼ、及びセラチアファージIV RNAポリメラーゼから成る群から選択される請求の範囲第５項記載の植物細胞。
- 植物細胞核において機能的な前記プロモーターが、構成的な発現を提供する請求の範囲第５項記載の植物細胞。
- 植物細胞核において機能的な前記プロモーターが、組織選択性又は発生的に調節された発現を提供する請求の範囲第５項記載の植物細胞。
- 植物細胞において機能的な前記プロモーターが、植物種子組織において選択的に発現される遺伝子からである請求の範囲第８項記載の植物細胞。
- 植物細胞において機能的な前記プロモーターが、植物スターチ貯蔵器官において選択的に発現される遺伝子からである請求の範囲第８項記載の植物細胞。
- 植物細胞において機能的な前記プロモーターが、植物花組織において選択的に発現される遺伝子からである請求の範囲第８項記載の植物細胞。
- 植物細胞において機能的な前記プロモーターが、植物果実組織において選択的に発現される遺伝子からである請求の範囲第８項記載の植物細胞。
- 前記対照のDNA配列が、前記プラスチドオルガネラに生来のmRNAに対して相補的な配列の転写のために向けられている請求の範囲第５項記載の植物細胞。
- 前記対象のDNA配列が、センス配向でタンパク質コード配列の発現を提供する請求の範囲第５項記載の植物細胞。
- 前記対象のDNA配列が、２又はそれ以上の構造遺伝子の発現のためのオペロンを含んで成る請求の範囲第５項記載の植物細胞。
- 請求の範囲第５〜１５のいづれか１項記載の植物細胞を含んで成る植物。
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