CN105473722A - 用于改善植物中化学信号扩散的方法及组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了采用化学基因开关的组合物及方法。本文所公开的所述化学基因开关包含至少三种组分。所述第一组分是编码化学调节转录阻遏物的多核苷酸；所述第二组分是有效连接至所关注多核苷酸的阻抑型启动子；所述第三组分是有效连接至第二阻抑型启动子的基因沉默构建体，其中所述基因沉默构建体编码沉默元件，所述沉默元件可降低编码所述化学调节转录阻遏物的mRNA的水平。通过提供所述适当化学配体来控制所述所关注的多核苷酸和所述沉默构建体的表达。所述化学配体的瞬时诱导导致所述沉默元件生成，并破坏掉编码所述化学调节转录阻遏物的所述mRNA。所述沉默元件的存在使去阻遏状态得以维持。在具体的实施例中，由于所述沉默元件是非细胞自发的，所以所述去阻遏状态分布于所述植物中较广泛的区域，甚至是化学配体未到达的位置。

Description

用于改善植物中化学信号扩散的方法及组合物
对序列表的引用
序列表是名称为36446_0068P1_Seq_List.txt的文本文件，创建于2014年3月5日，提交于2014年3月11日，大小为2,258,550字节，特此依据美国专利法施行细则(C.F.R.)第37篇第1.52条(e)项(5)款以引用方式并入本文。
技术领域
本发明涉及分子生物学领域，更具体地讲，涉及对基因表达的调节。
背景技术
四环素操纵子***包含阻遏物和操纵基因元件，最初从细菌中分离得到。该操纵子***受到存在的四环素的严格控制，并且自身调节tetA和tetR基因的表达水平。tetA的产物从细胞中移除四环素。tetR的产物是结合至操纵基因元件的阻遏蛋白，该阻遏蛋白在不存在四环素的情况下Kd为约10pM，从而阻断tetA和tetR的表达。
已经修改了该***，以便控制其他所关注的多核苷酸的表达，并且/或者用于其他生物体中(主要用于动物***中)。基于Tet操纵子的***在植物中用途有限，这至少部分是由于诱导物造成的，诱导物通常是抗生素化合物，而且对光敏感。此外，植物中采用的其他化学基因开关需要化学配体接触并渗透细胞，以便激活开关。这限制了化学基因开关在不能轻易与化学配体接触的组织或生物体中可被激活的程度。
需要调节生物体中所关注的序列的表达。本发明提供了响应于化合物(诸如磺酰脲类化合物)从而调节表达的化学基因开关组合物及方法。
发明内容
本发明提供了采用化学基因开关的组合物及方法。本文所公开的化学基因开关包含至少三种组分。第一组分是编码化学调节转录阻遏物的多核苷酸；第二组分是有效连接至所关注的多核苷酸的阻抑型启动子；第三组分是有效连接至第二阻抑型启动子的基因沉默构建体，其中该基因沉默构建体编码降低化学调节转录阻遏物的水平的沉默元件。通过提供适当化学配体来控制所关注的多核苷酸和沉默构建体的表达。该化学配体的瞬态诱导导致沉默元件生成，并破坏掉编码化学调节转录阻遏物的mRNA。沉默元件的存在使去阻遏状态得以维持。在一些实施例中，由于沉默元件是非细胞自发的，所以去阻遏状态分布于植物中更广泛的区域，甚至是化学配体未到达的位置。
附图说明
图1提供了磺酰脲类化学基因开关的非限制性实例。
图2提供了用siRNA修饰磺酰脲类化学基因开关的非限制性实例。
图3提供了通过阻遏物自动调节优化阻遏物转录物剂量从而改善siRNA功效的非限制性示意图。
图4提供了靶向阻遏物EsR(L13-23)转录物的非限制性实例。
图5展示了试验和对照转基因烟草植株中的诱导结果。
图6示出了烟草幼苗中持久并更彻底的胺苯磺隆诱导结果。
图7展示了在烟草植株发芽期间用胺苯磺隆诱导导致的长期去阻遏状态。
图8提供了若干代磺酰脲类阻遏物改组文库的来源多样性、文库设计、命中多样性和群体偏倚的汇总。破折号(“-”)指示在文库的该位置没有引入氨基酸多样性。X指示文库寡核苷酸被设计成在文库的该位置引入了完全的氨基酸多样性(20种氨基酸中的任一种)。粗体残基指示选择过程中的偏倚，更大的字号指示在选定的群体中有更大的偏倚程度。括号中的残基指示选择的随机突变。***发育多样性库源自34种四环素阻遏物序列的广大家族。
图9提供了若干代磺酰脲类阻遏物改组文库的来源多样化、文库设计、命中多样化和群体偏倚的汇总，其中描述了文库L10、L11、L12、L13、L15和所得的序列合并偏倚。破折号(“-”)指示在文库的该位置没有引入氨基酸多样性。X指示文库寡核苷酸被设计成在文库的该位置引入了完全的氨基酸多样性(20种氨基酸中的任一种)。粗体残基指示选择过程中的偏倚，更大的字号指示在选定的群体中有更大的偏倚程度。括号中的残基指示选择的突变。
图10提供了在位置D178处进行饱和诱变得到的命中的β-半乳糖苷酶分析结果。
图11示出了残基L131和T134与氯磺隆结合CsR(CsL4.2-20)的磺酰脲类区分侧基是邻近的。
具体实施方式
下文将结合附图更详细地描述本发明，附图中只显示了本发明的一些实施例，而非全部实施例。这些发明内容实际上可采用许多不同的形式体现，不应被认为局限于本文给出的实施例；提供这些实施例仅仅是为了使本公开内容能满足适用的法律要求。同样的编号在全文中是指同样的要素。
借助前文的描述和随附的附图中给出的教导内容，本发明所属领域的技术人员将会想到本文示出的发明内容的多种修改形式和其他实施例。因此，应当理解，本发明内容不限于所公开的特定实施例，并意欲将其修改形式和其他实施例包括在所附权利要求的范围内。虽然本文中采用特定术语，但这些术语仅在一般性和描述性意义上使用，而并非用于限制目的。
I.概述
多细胞生物体中的任何化学诱导***的主要缺陷之一是诱导物在所有组织各处渗透并均匀分布(由于诱导物的可变移动或代谢作用)。结果是所关注的组织或细胞类型中的靶基因诱导可能不均匀(甚至缺失)。为了弥补此缺陷，本发明提供了采用附加遗传因子来影响去阻遏传播的方法及组合物。
具体地讲，本文所公开的组合物及方法采用了化学基因开关。本文所公开的化学基因开关包含至少三种组分。第一组分是编码化学调节转录阻遏物的多核苷酸；第二组分是有效连接至所关注的多核苷酸的阻抑型启动子；第三组分是有效连接至第二阻抑型启动子的基因沉默构建体，其中该基因沉默构建体编码降低化学调节转录阻遏物的水平的沉默元件。通过提供适当化学配体来控制所关注的多核苷酸和沉默构建体的表达。该化学配体的瞬态诱导导致沉默元件生成，并降低化学调节转录阻遏物的水平。沉默元件的存在使去阻遏状态得以维持。在一些实施例中，由于沉默元件是非细胞自发的，所以去阻遏状态遍布于植物中各处，甚至是化学配体物理上未到达的位置。
如本文进一步详细阐释的，化学基因开关的活性可通过选择在该开关中用到的元件的组合来控制。这些元件包括但不限于以下类型：有效连接至化学调节转录阻遏物的启动子，化学调节转录阻遏物，有效连接至所关注的多核苷酸的阻抑型启动子，所关注的多核苷酸，有效连接至基因沉默构建体的阻抑型启动子，以及基因沉默构建体。通过选择施用化学配体的方法、剂量、条件和/或时序进一步控制化学基因开关的活性。
II.化学基因开关的组分
本文所公开的组合物及方法采用化学基因开关，此化学基因开关包括所关注构建体的多核苷酸、化学调节转录阻遏物构建体以及编码降低化学调节转录阻遏物水平的沉默元件的基因沉默构建体。下文更详细地论述了这些组分中的每一种。
1.编码化学调节转录阻遏物的多核苷酸
a.化学调节转录阻遏物
如本文所用，“化学调节转录阻遏物”是指含有DNA结合结构域和配体结合结构域的多肽。在不存在化学配体的情况下，化学调节转录阻遏物结合到启动子的操纵基因并抑制启动子活性，从而抑制有效连接至所述启动子的多核苷酸的表达。在存在有效浓度化学配体的情况下，化学调节转录阻遏物会与该化学配体结合。与配体结合的化学调节转录阻遏物不再能够抑制从含有操纵基因的启动子开始的转录。化学调节转录阻遏物的变体和片段会保留这种活性。
所谓“抑制转录”，意味着给定多核苷酸的转录的减少甚至消除。因此，抑制转录可以指完全消除从给定启动子开始的转录，也可以指与不存在化学配体时适当对照物发生的转录水平相比，从给定启动子开始的转录量降低。转录量降低可以指任何统计上显著的降低，包括至少降低1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、150％、200％或更多，或者至少降低1/2、2/3、3/4、4/5、5/6、6/7、7/8、8/9或9/10。
多种化学调节转录阻遏物可用于本文所公开的方法及组合物中。在一个实施例中，化学调节转录阻遏物是四环素转录阻遏物(TetR)，这种转录阻遏物与操纵基因的结合受四环素或其衍生物影响。在一个实施例中，化学调节转录阻遏物是A、B、C、D、E、G、H、J和Z类四环素阻遏物。(A)类TetR的一个实例在Tn1721转座子上发现，以GenBank登记号X61307保藏，以gi48198交叉引用，编码蛋白质登记号CAA43639，以gi48195和UniProt登记号Q56321交叉引用。(B)类TetR的一个实例在Tn10转座子上发现，以GenBank登记号X00694保藏，以gi43052交叉引用，编码蛋白质登记号CAA25291，以gi43052和UniProt登记号P04483交叉引用。(C)类TetR的一个实例在pSC101质粒上发现，以GenBank登记号M36272保藏，以gi150945交叉引用，编码蛋白质登记号AAA25677，以gi150946交叉引用。(D)类TetR的一个实例在奥道奈兹沙门菌(Salmonellaordonez)中发现，以GenBank登记号X65876保藏，以gi49073交叉引用，编码蛋白质登记号CAA46707，以gi49075和UniProt登记号P0ACT5及P09164交叉引用。(E)类TetR的一个实例从大肠杆菌(E.coli)转座子Tn10分离获得，以GenBank登记号M34933保藏，以gi155019交叉引用，编码蛋白质登记号AAA98409，以gi155020交叉引用。(G)类TetR的一个实例从鳗弧菌(Vibrioanguillarium)分离获得，以GenBank登记号S52438保藏，以gi262928交叉引用，编码蛋白质登记号AAB24797，以gi262929交叉引用。(H)类TetR的一个实例在从多杀巴斯德菌(Pasteurellamultocida)分离获得的质粒pMV111上发现，以GenBank登记号U00792保藏，以gi392871交叉引用，编码蛋白质登记号AAC43249，以gi392872交叉引用。(J)类TetR的一个实例从奇异变形杆菌(Proteusmirabilis)分离获得，以GenBank登记号AF038993保藏，以gi4104704交叉引用，编码蛋白质登记号AAD12754，以gi4104706交叉引用。(Z)类TetR的一个实例在从谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)分离获得的质粒pAGI上发现，以GenBank登记号AF121000保藏，以gi4583389交叉引用，编码蛋白质登记号AAD25064，以gi4583390交叉引用。在其他实例中，野生型四环素阻遏物为B类四环素阻遏蛋白，或者野生型四环素阻遏物为D类四环素阻遏蛋白。四环素转录阻遏物的特性、结构域、基序和功能是众所周知的，用于评估包含一个或多个氨基酸置换的任何衍生阻遏物的标准技术和分析法也是众所周知的。
技术人员已识别并/或衍生出TetR的多种变体，并广泛地研究过这些变体。在四环素转录阻遏物***的背景下，已广泛使用多种突变、修饰和/或突变与修饰的组合的效应来表征并/或改变四环素阻遏物的特性，例如辅因子结合、配体结合常数、动力学和解离常数、操纵基因结合序列限制、协同性、结合常数、动力学和解离常数，以及融合蛋白活性和特性。变体包括在四环素或其类似物的存在下具有结合操纵基因序列的反式表型的TetR变体、具有改变的操纵基因结合特性的变体、具有改变的操纵基因序列特异性的变体，和具有改变的配体特异性及融合蛋白的变体。参见例如Isackson&Bertrand(1985)PNAS82：6226-6230(Isackson和Bertrand，1985年，《美国国家科学院院刊》第82卷第6226-6230页)；Smith&Bertrand(1988)JMolBiol203：949-959(Smith和Bertrand，1988年，《分子生物学杂志》第203卷第949-959页)；Altschmiedetal.(1988)EMBOJ7：4011-4017(Altschmied等人，1988年，《欧洲分子生物学组织杂志》第7卷第4011-4017页)；Wissmannetal.(1991)EMBOJ10：4145-4152(Wissmann等人，1991年，《欧洲分子生物学组织杂志》第10卷第4145-4152页)；Baumeisteretal.(1992)JMolBiol226：1257-1270(Baumeister等人，1992年，《分子生物学杂志》第226卷第1257-1270页)；Baumeisteretal.(1992)Proteins14：168-177(Baumeister等人，《蛋白质》第14卷第168-177页)；Gossen&Bujard(1992)PNAS89：5547-5551(Gossen和Bujard，1992年，《美国国家科学院院刊》第89卷第5547-5551页)；Wasylewskietal.(1996)JProteinChem15：45-58(Wasylewski等人，1996年，《蛋白质化学杂志》第15卷第45-58页)；Berensetal.(1997)JBiolChem272：6936-6942(Berens等人，1997年，《生物化学杂志》第272卷第6936-6942页)；Baronetal.(1997)NuclAcidsRes25：2723-2729(Baron等人，1997年，《核酸研究》第25卷第2723-2729页)；Helbl&Hillen(1998)JMolBiol276：313-318(Helbl和Hillen，1998年，《分子生物学杂志》第276卷第313-318页)；Urlingeretal.(2000)PNAS97：7963-7968(Urlinger等人，2000年，《美国国家科学院院刊》第97卷第7963-7968页)；Kamionkaetal.(2004)NuclAcidsRes32：842-847(Kamionka等人，2004年，《核酸研究》第32卷第842-847页)；Bertrametal.(2004)JMolMicrobialBiotechnol8：104-110(Bertram等人，2004年，《分子微生物学与生物技术杂志》第8卷第104-110页)；Scholzetal.(2003)JMolBiol329：217-227(Scholz等人，2003年，《分子生物学杂志》第329卷第217-227页)；以及US2003/0186281，这些文献各自全文以引用方式并入本文。
化学调节转录阻遏蛋白的模块结构以及螺旋-转角-螺旋DNA结合结构域的共同性允许产生磺酰脲类响应性阻遏多肽。因此在一些实施例中，化学调节转录阻遏物包含磺酰脲类响应性转录阻遏物(SuR)多肽。如本文所用，“磺酰脲类响应性转录阻遏物”或“SuR”包括任何化学调节转录阻遏物多肽，此化学调节转录阻遏物多肽与操纵基因序列的结合受包括磺酰脲类化合物或其衍生物在内的配体控制。在不存在磺酰脲类化学配体的情况下，SuR与启动子的给定操纵基因结合并抑制该启动子的活性，从而抑制有效连接至所述启动子的多核苷酸的表达。一旦SuR与其化学配体相互作用，SuR便不再能够抑制含有操纵基因的启动子的转录。
可将SuR设计为包含多种不同DNA结合结构域，从而结合多种不同操纵基因并影响转录。在一个实施例中，SuR多肽包含特异性结合至四环素操纵基因的DNA结合结构域。因此，在具体的实施例中，SuR多肽或编码它的多核苷酸可包含DNA结合结构域，包括但不限于来自下述阻遏物的操纵基因DNA结合结构域：tet、lac、trp、phd、arg、LexA、phiChl阻遏物，lambdaC1和Cro阻遏物，phageX阻遏物，MetJ、phirltrro、phi434C1和Cro阻遏物，RafR、gal、ebg、uxuR、exuR、ROS、SinR、PurR、FruR、P22C2、TetC、AcrR、Betl、Bm3R1、EnvR、QacR、MtrR、TcmR、Ttk、YbiH、YhgD和muNer；Interpro家族中的DNA结合结构域(包括但不限于IPR001647、IPR010982和IPR01199)；或者上述DNA结合结构域的活性变体或片段。因此，可通过将SuR配体结合结构域融合至替代DNA结合结构域，来改变DNA的结合特异性。例如，可将来自D类TetR的DNA结合结构域融合至SuR配体结合结构域，生成特异性结合至包含D类四环素操纵基因的多核苷酸的SuR多肽。在一些例子中，可使用DNA结合结构域的变体或衍生物。例如，可使用来自TetR变体的特异性识别tetO-4C操纵基因或tetO-6C操纵基因的DNA结合结构域(Helbl&Hillen(1998)JMolBiol276：313-318(Helbl和Hillen，1998年，《分子生物学杂志》第276卷第313-318页)；Helbletal.(1998)JMolBiol276：319-324(Helbl等人，1998年，《分子生物学杂志》第276卷第319-324页))。
在一些例子中，化学调节转录阻遏物或编码它的多核苷酸包括含有配体结合结构域的SuR多肽，所述配体结合结构域与融合至异源操纵基因DNA结合结构域的野生型四环素阻遏蛋白配体结合结构域相比包含至少一个氨基酸置换，所述异源操纵基因DNA结合结构域特异性结合到包含操纵基因序列或其衍生物的多核苷酸，其中阻遏物-操纵基因结合受磺酰脲类化合物的存在与否调节。在具体的实施例中，异源操纵基因DNA结合结构域包含四环素操纵基因序列或其活性变体或片段，因此阻遏物-操纵基因结合受磺酰脲类化合物的存在与否调节。SuR多肽的非限制性例子在提交于2011年4月14日的美国实用新型申请No.13/086,765和美国申请公布2010-0105141中示出，两者均以引用的方式全文并入本文。
在一些例子中，SuR多肽或编码它的多核苷酸在野生型四环素阻遏蛋白的配体结合结构域中包含一个氨基酸置换。在B类和D类野生型TetR蛋白质中，氨基酸残基6-52代表DNA结合结构域。所述蛋白质的其余部分参与二聚反应、配体结合及后续别构修饰。对于B类TetR，残基53-207代表配体结合结构域，而对于D类TetR，残基53-218代表配体结合结构域。在一些实施例中，SuR多肽在野生型TetR(B)蛋白质的配体结合结构域中包含至少一个氨基酸置换。
在一些例子中，SuR多肽或编码它的多核苷酸包含对应于选自图6所示的氨基酸多样性的等效氨基酸位置的氨基酸或氨基酸的任意组合，其中图6所示的氨基酸残基位置对应于野生型TetR(B)的氨基酸编号。在一些例子中，SuR多肽(或编码它的多核苷酸)包含与图6所示氨基酸残基至少具有10％、20％、30％、40％、50％、55％、60％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性的配体结合结构域，其中所述氨基酸残基位置对应于使用野生型TetR(B)的氨基酸编号的等效位置。在一些例子中，野生型TetR(B)为SEQIDNO：1。
在其他例子中，SuR多肽或编码它的多核苷酸包含的配体结合结构域在选自以下的残基位置处具有至少一个氨基酸置换：位置55、60、64、67、82、86、100、104、105、108、113、116、134、135、138、139、147、151、170、173、174、177，以及这些位置的任意组合，其中所述氨基酸残基位置和氨基酸置换对应于使用野生型TetR(B)的氨基酸编号的等效位置。在一些例子中，SuR多肽还在选自以下的氨基酸残基位置处具有至少一个氨基酸置换：位置109、112、117、131、137、140、164，以及这些位置的任意组合。在一些例子中，野生型TetR(B)为SEQIDNO：1。
在其他实施例中，SuR多肽或编码它的多核苷酸与野生型TetR(B)的由SEQIDNO：1的氨基酸残基53-207例示的配体结合结构域至少具有约50％、60％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性，其中所述序列同一性是使用全局比对方法针对配体结合结构域的全长确定的。在一些例子中，所述全局比对方法使用GAP算法，该GAP算法使用氨基酸序列同一性百分比和相似性百分比的默认参数，选用GAP权重8，长度权重2，和BLOSUM62评分矩阵。
在其他例子中，SuR多肽或编码它的多核苷酸与由SEQIDNO：1例示的野生型TetR(B)至少具有约50％、60％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性，其中所述序列同一性是使用全局比对方法针对多肽的全长确定的。在一些例子中，所述全局比对方法使用GAP算法，该GAP算法使用氨基酸序列同一性百分比和相似性百分比的默认参数，选用GAP权重8，长度权重2，和BLOSUM62评分矩阵。
另外的SuR多肽或编码它的多核苷酸与SuR多肽的选自SEQIDNO：3-419、863-870、884-889、1381-1568和/或2030-2110的配体结合结构域至少具有约50％、60％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性，其中所述序列同一性是使用全局比对方法针对配体结合结构域的全长确定的。SEQIDNO：3-419、863-870、884-889、1381-1568和/或2030-2110的配体结合结构域包含氨基酸53-207。在一些例子中，所述全局比对方法使用GAP算法，该GAP算法使用氨基酸序列同一性百分比和相似性百分比的默认参数，选用GAP权重8，长度权重2，和BLOSUM62评分矩阵。
在其他例子中，SuR多肽或编码它的多核苷酸与选自SEQIDNO：3-419、863-870、884-889、1381-1568和/或2030-2110的SuR多肽至少具有约50％、60％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性，其中所述序列同一性是使用全局比对方法针对多肽的全长确定的。在一些例子中，所述全局比对方法使用GAP算法，该GAP算法使用氨基酸序列同一性百分比和相似性百分比的默认参数，选用GAP权重8，长度权重2，和BLOSUM62评分矩阵。
SuR多肽或编码它的多核苷酸的非限制性例子包含的氨基酸序列可与多肽序列L7-1A04(SEQIDNO：220)、L1-22(SEQIDNO：7)、L1-29(SEQIDNO：10)、L1-02(SEQIDNO：3)、L1-07(SEQIDNO：4)、L1-20(SEQIDNO：6)、L1-44(SEQIDNO：13)、L6-3A09(SEQIDNO：402)、L6-3H02(SEQIDNO：94)、L7-4E03(SEQIDNO：403)、L10-84(B12)(SEQIDNO：404)或L13-46(SEQIDNO：405)具有最佳比对结果，从而得到至少50％、60％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性百分比，其中所述序列同一性是采用BLAST比对确定的，所述BLAST比对使用BLOSUM62矩阵，选用空位存在罚分11、空位延伸罚分1。在一些例子中，SuR多肽或编码它的多核苷酸包含的氨基酸序列可与多肽序列LL7-1A04(SEQIDNO：220)具有最佳比对结果，从而得到至少88％的序列同一性百分比；可与多肽序列L1-22(SEQIDNO：7)具有最佳比对结果，从而得到至少92％的序列同一性百分比；可与多肽序列L1-07(SEQIDNO：4)具有最佳比对结果，从而得到至少93％的序列同一性百分比；可与多肽序列L1-20(SEQIDNO：6)具有最佳比对结果，从而得到至少93％的序列同一性百分比；可与多肽序列L1-44(SEQIDNO：13)具有最佳比对结果，从而得到至少93％的序列同一性百分比；可与多肽序列L6-3H02(SEQIDNO：94)具有最佳比对结果，从而得到至少90％的序列同一性百分比；可与多肽序列L10-84(B12)(SEQIDNO：404)具有最佳比对结果，从而得到至少86％的序列同一性百分比；或可与多肽序列L13-46(SEQIDNO：405)具有最佳比对结果，从而得到至少86％的序列同一性百分比，其中所述序列同一性是采用BLAST比对确定的，所述BLAST比对使用BLOSUM62矩阵，选用空位存在罚分11、空位延伸罚分1。在一些例子中，同一性百分比是使用全局比对方法确定的，所述全局比对方法使用GAP算法，该GAP算法使用氨基酸序列同一性百分比和相似性百分比的默认参数，选用GAP权重8，长度权重2，和BLOSUM62评分矩阵。
在另外的实施例中，SuR多肽或编码它的多核苷酸包含的氨基酸序列可与多肽序列L7-1A04(SEQIDNO：220)、L1-22(SEQIDNO：7)、L1-29(SEQIDNO：10)、L1-02(SEQIDNO：3)、L1-07(SEQIDNO：4)、L1-20(SEQIDNO：6)、L1-44(SEQIDNO：13)、L6-3A09(SEQIDNO：402)、L6-3H02(SEQIDNO：94)、L7-4E03(SEQIDNO：403)、L10-84(B12)(SEQIDNO：404)或L13-46(SEQIDNO：405)具有最佳比对结果，从而得到至少400、425、450、475、500、525、550、575、600、625、650、675、700、750、800、850、900、910、920、930、940、950、960、970、980、990、1000、1010、1020、1030、1040、1050、1060、1070、1080、1090、1100、1110、1120、1130、1140、1150、1160、1170、1180、1190或1200的BLAST相似性得分，其中所述BLAST比对使用BLOSUM62矩阵，选用空位存在罚分11、空位延伸罚分1。
在一些例子中，SuR多肽或编码它的多核苷酸包含的氨基酸序列可与多肽序列L1-29(SEQIDNO：10)具有最佳比对结果，从而得到至少1006的BLAST相似性得分；可与多肽序列L1-07(SEQIDNO：4)具有最佳比对结果，从而得到至少996的BLAST相似性得分；可与多肽序列L6-3A09(SEQIDNO：402)具有最佳比对结果，从而得到至少978的BLAST相似性得分；可与多肽序列L7-4E03(SEQIDNO：403)具有最佳比对结果，从而得到至少945的BLAST相似性得分；或可与多肽序列L13-46(SEQIDNO：405)具有最佳比对结果，从而得到至少819的BLAST相似性得分，其中所述BLAST比对使用BLOSUM62矩阵，选用空位存在罚分11、空位延伸罚分1。
在一些例子中，SuR多肽或编码它的多核苷酸包含的配体结合结构域来自选自SEQIDNO：3-419、863-870、884-889、1381-1568和/或2030-2110的多肽。在一些例子中，SuR多肽或编码它的多核苷酸包含选自SEQIDNO：3-419的氨基酸序列。在一些例子中，所分离的SuR多肽选自SEQIDNO：3-419、863-870、884-889、1381-1568和/或2030-2110，磺酰脲类化合物选自氯磺隆、胺苯磺隆、甲磺隆、甲嘧磺隆、苯磺隆、氯嘧磺隆、烟嘧磺隆、砜嘧磺隆和噻吩磺隆。
在非限制性实施例中，SuR多肽与磺酰脲类化合物的平衡结合常数可能大于0.1nM但小于10μM。在一些例子中，SuR多肽与磺酰脲类化合物的平衡结合常数为至少0.1nM、0.5nM、1nM、10nM、50nM、100nM、250nM、500nM、750nM、1μM、5μM、7μM，但小于10μM。在其他例子中，SuR多肽与磺酰脲类化合物的平衡结合常数为至少0.1nM、0.5nM、1nM、10nM、50nM、100nM、250nM、500nM、750nM，但小于1μM。在一些实施例中，SuR多肽与磺酰脲类化合物的平衡结合常数大于0nM但小于0.1nM、0.5nM、1nM、10nM、50nM、100nM、250nM、500nM、750nM、1μM、5μM、7μM或10μM。在一些例子中，磺酰脲类化合物是氯磺隆、胺苯磺隆、甲磺隆、甲嘧磺隆、苯磺隆、氯嘧磺隆、烟嘧磺隆、砜嘧磺隆和/或噻吩磺隆。
在一些例子中，SuR多肽与操纵基因序列的平衡结合常数大于0.1nM但小于10μM。在一些例子中，SuR多肽与操纵基因序列的平衡结合常数为至少0.1nM、0.5nM、1nM、10nM、50nM、100nM、250nM、500nM、750nM、1μM、5μM、7μM，但小于10μM。在一些例子中，SuR多肽与操纵基因序列的平衡结合常数为至少0.1nM、0.5nM、1nM、10nM、50nM、100nM、250nM、500nM、750nM，但小于1μM。在一些例子中，SuR多肽与操纵基因序列的平衡结合常数大于0nM但小于0.1nM、0.5nM、1nM、10nM、50nM、100nM、250nM、500nM、750nM、1μM、5μM、7μM或10μM。在一些例子中，操纵基因序列为Tet操纵基因序列。在一些例子中，Tet操纵基因序列为TetR(A)操纵基因序列、TetR(B)操纵基因序列、TetR(D)操纵基因序列、TetR(E)操纵基因序列、TetR(H)操纵基因序列或它们的功能衍生物。
各种化学配体(包括示例性磺酰脲类化学配体)及其应用水平和方式在本文别处进行了详细讨论。
b.化学调节转录阻遏物的表达启动子
编码化学调节转录阻遏物的多核苷酸有效连接至植物中的活性启动子。可采用各种启动子，其非限制性例子在本文别处示出。简而言之，编码化学调节转录阻遏物的多核苷酸可以有效连接至组成型启动子、诱导型启动子或组织偏好的启动子。在具体的实施例中，所述化学调节转录阻遏物有效连接至非组成型启动子，其中非组成型启动子包括但不限于组织偏好的启动子、诱导型启动子、阻抑型启动子、发育阶段偏好的启动子，或具有这些特性中的不止一种的启动子。在一些例子中，主要调节所关注的多核苷酸在根、叶、茎、花、穗丝、花药、花粉、分生组织、种系、种子、胚乳、胚芽或子代中的表达。
在其他实施例中，化学调节转录阻遏物可以有效连接至阻抑型启动子，从而允许化学调节转录阻遏物自动调节自身的表达。已采用数学方式预测出负性自动调节不仅会抑制基因表达波动，还会缩短涉及阻遏物分子的调节回路中的信号响应时间(Savageau(1974)Nature252：542-549(Savageau，1974年，《自然》第252卷第542-549页))。这一理论在大肠杆菌中使用合成基因回路得到证实(Rosenfeldetal.(2002)JMolBiol323：785-793(Rosenfeld等人，2002年，《分子生物学杂志》第323卷第785-793页))，在酵母中也得到证实(Nevozhay(2009)ProcNatlAcadSciUSA106：5123-5128(Nevozhay，2009年，《美国国家科学院院刊》第106卷第5123-5128页))。因此，在具体的实施例中，编码化学调节转录阻遏物的多核苷酸可以有效连接至这样的阻抑型启动子：其包含调节所述阻遏物的表达的至少一个、两个、三个或更多个操纵基因(包括tet操纵基因，例如以SEQIDNO：848示出的操纵基因，或其活性变体或片段)。用于表达化学调节转录阻遏物的非限制性阻抑型启动子包括以SEQIDNO：885、856、857、858、859或860示出的阻抑型启动子，或者它们的活性变体及片段。
2.基因沉默构建体
本文公开的化学基因开关的另一种组分包含含有基因沉默构建体的多核苷酸。所述基因沉默构建体编码的沉默元件降低化学调节转录阻遏物的水平。因此，沉默元件的存在使去阻遏状态得以维持。在具体的实施例中，由于沉默元件是非细胞自发的，所以去阻遏状态分布于植物细胞、组织、器官中，或遍布于植物中各处，甚至是化学配体物理上未到达的位置。
如本文所用，术语“非细胞自发的”是指在细胞之间传递的可扩散信号由沉默元件引发。非细胞自发的信号不仅包括以“局部细胞到细胞”运动的形式进入相邻植物细胞后RNA沉默的扩展，还可以在表现“延伸性沉默”的较长距离上出现。局部细胞到细胞运动允许可扩散信号传播到沉默元件的表达起始位置的大约10至15个细胞之外。这种类型的信号传播可经由，但不限于胞间连丝进行。在其他实施例中，进入相邻植物细胞后沉默的扩展导致“延伸性沉默”。在这种情况下，从引发可扩散信号的起始细胞向外数超过10至15个细胞的一段距离会发生沉默。在某些情况下，可扩散信号延伸超过引发信号位置，而且从该引发位置传播到15个细胞之外。此信号传遍整个组织、传遍整个器官，或传遍整株植物。如本文所用，当给定细胞、组织、器官或整株植物中存在足量沉默元件时，出现术语“完全渗透”代表的现象。完全渗透能够降低化学调节转录阻遏物的水平，继而抑制化学基因开关。在另有其他实施例中，沉默元件通过植物的维管***转运。
因此，在具体的实施例中，细胞非自发的沉默元件降低了化学调节转录阻遏物的水平，因此，向植物提供有效量化学配体导致所关注多核苷酸在该植物中的表达较这种所关注多核苷酸在与有效量化学配体接触过但缺乏基因沉默构建体的植物中的表达在空间上或时间上延伸。在某些情况下，这种在空间上或时间上延伸的效应通过向植物提供一定量化学配体实现，这种化学配体量少于向缺乏基因沉默构建体的植物提供的诱导所述所关注多核苷酸表达所需的这种化学配体的量。
所谓“在时间上延伸的表达”，是指在缺乏配体的情况下，表达时间为至少1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月或更长时间，甚至永久。
在另外的实施例中，所关注多核苷酸序列的表达延伸到植物中未与有效量化学配体接触过的至少一个组织中。在其他实施例中，所关注多核苷酸的表达延伸导致所关注多核苷酸的表达完全渗透顶端分生组织，或导致所关注多核苷酸序列的表达完全渗透遍及整株植物。
a.靶序列
如本文所用，“靶序列”包括希望经由沉默元件的表达降低其表达水平的任何序列。在本文所公开的化学基因开关***的背景下，靶序列包括化学调节转录阻遏物，或该转录阻遏物的5’或3'UTR序列。
b.沉默元件
所谓“沉默元件”，是指能够降低或消除靶多核苷酸或由其编码的多肽的水平或表达的多核苷酸。在本文提供的方法及组合物中，所采用的沉默元件可通过影响所述化学调节转录阻遏物的RNA转录物的水平，或通过影响翻译从而影响所编码的化学调节转录阻遏多肽的水平，来降低或消除所述化学调节转录阻遏物序列的表达水平。测定能够降低或消除所述化学调节转录阻遏物水平的功能性沉默元件的方法在本文别处公开。在本发明方法中采用的单个多核苷酸可包含针对同一种或不同种化学调节转录阻遏物的一种或多种沉默元件。
所谓“降低”多核苷酸或由其编码的多肽的水平，是指靶序列(即，化学调节转录阻遏物)的多核苷酸或多肽水平在统计上低于未暴露于沉默元件(即，尚未暴露于化学配体)的适当对照植物或组织中的相同靶序列的多核苷酸水平或多肽水平。在特定实施例中，降低化学调节转录阻遏物的多核苷酸水平和/或多肽水平导致该化学调节转录阻遏物的多核苷酸水平或由该多核苷酸编码的多肽的水平与适当对照(即，不存在沉默元件或化学配体)相比，至少降低约95％、90％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％、10％、5％或1％。测定RNA转录物的水平、所编码多肽的水平或化学调节转录阻遏物活性的方法在本文别处论述。
如下文进一步详细论述，沉默元件可包括但不限于有义抑制元件、反义抑制元件、双链RNA、miRNA、amiRNA或发夹抑制元件。靶序列的非限制性例子包括在本文别处论述的各种化学调节转录阻遏物，包括各种SuR多肽或编码各种SuR多肽的多核苷酸，诸如以SEQIDNO：1-836、863-870、884-889、1381-1568和/或2030-2110中任一序列示出的那些或其活性变体和片段。在一些实施例中，可在沉默元件中采用完整的化学调节转录阻遏物、包含DNA结合结构域的区域、包含配体结合结构域的区域，或者5’或3'UTR或其变体和片段。
在具体的实施例中，所述沉默元件包含至少15个、20个、22个、25个或更多个编码在本文别处论述的化学调节转录阻遏物的连续核苷酸，或由15个、20个、22个、25个或更多个编码在本文别处论述的化学调节转录阻遏物的连续核苷酸组成，所述化学调节转录阻遏物包括各种SuR多肽，诸如以SEQIDNO：1-836、863-870、884-889、1381-1568和/或2030-2110中任一序列示出的那些或其活性变体和片段。在其他实施例中，所述沉默元件至少包含编码在本文别处论述的化学调节转录阻遏物的第1至7位、第7至14位、第14至21位、第14至28位、第28至35位、第35至42位、第42至49位、第49至56位、第56至63位、第63至70位、第70至77位、第77至84位、第84至91位、第91至98位、第98至105位、第105至112位、第112至119位、第119至126位、第126至133位、第133至140位、第140至147位、第147至154位、第154至161位、第161至168位、第168至175位、第175至182位、第182至189位、第189至196位、第196至203位或第203至207位氨基酸的多核苷酸或由这些多核苷酸组成，所述化学调节转录阻遏物包括各种SuR多肽，诸如以SEQIDNO：1-836、863-870、884-889、1381-1568和/或2030-2110中任一序列示出的那些或其活性变体和片段。或者，所述沉默元件包含至少编码化学调节转录阻遏物的多核苷酸盒的5’或3’非翻译区(即，5'UTR或3'UTR)或者非翻译序列及编码序列的组合中的15个、20个、22个、25个或更多个连续核苷酸，或由这些连续核苷酸组成。
i.反义沉默元件
如本文所用，“反义沉默元件”包含被设计为表达与靶信使RNA的一部分或全部互补的RNA分子的多核苷酸。反义RNA抑制元件的表达降低或消除靶多核苷酸的水平。用于反义抑制的多核苷酸可能对应于编码靶多核苷酸(即，编码化学调节转录阻遏物的序列)的序列的互补序列的一部分或全部、靶多核苷酸(即，编码化学调节转录阻遏物的序列)的5′和/或3′非翻译区的互补序列的一部分或全部、靶多核苷酸(即，编码化学调节转录阻遏物的序列)的编码序列的互补序列的一部分或全部，或者靶多核苷酸(即，编码化学调节转录阻遏物的序列)的编码序列和非翻译区这两者的互补序列的一部分或全部。此外，反义抑制元件可与靶多核苷酸完全互补(即，与靶序列的互补序列100％相同)或部分互补(即，与靶序列的互补序列的同一性低于100％)。在具体的实施例中，反义抑制元件与靶多核苷酸(即，编码化学调节转录阻遏物的序列)至少具有85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。反义抑制还可用来抑制同一植物中的多种蛋白质的表达。参见例如美国专利No.5,942,657。此外，反义抑制元件可能与靶多核苷酸的一部分互补。一般来讲，可使用至少25个、50个、100个、200个、300个、400个、450个或更多个核苷酸的序列。使用反义抑制来抑制植物中的内源性基因表达的方法在例如以下文献和专利中描述：Liuetal(2002)PlantPhysiol.129：1732-1743(Liu等人，2002年，《植物生理学》第129卷第1732-1743页)，以及美国专利No.5,759,829和No.5,942,657，这些专利和文献各自以引用方式并入本文。在具体的实施例中，反义元件包含SEQIDNO：1-836、863-870、884-889、1381-1568和/或2030-2110中任一序列的至少15个、20个、22个、25个或更多个连续核苷酸的互补序列，或由这些连续核苷酸的互补序列组成。
ii.双链RNA沉默元件
“双链RNA沉默元件”或“dsRNA”包含至少一种能够形成双链RNA(dsRNA)的转录物。因此，“双链RNA沉默元件”包括dsRNA、能够形成dsRNA的转录物或多核糖核苷酸，或者不止一种能够形成dsRNA的转录物或多核糖核苷酸。“双链RNA”或“dsRNA”是指由单个自互补的RNA分子形成的多核糖核苷酸结构，或由至少两条不同的RNA链的表达形成的多核糖核苷酸结构。本发明的方法及组合物中采用的dsRNA分子例如通过以序列特异性方式介导RNA干扰“RNAi”或基因沉默来介导靶序列(即，编码化学调节转录阻遏物的序列)表达的降低。在本发明的上下文中，dsRNA能够降低或消除编码化学调节转录阻遏物的多肽的水平或表达。
dsRNA可以通过影响靶RNA转录物的水平、通过影响翻译并从而影响所编码多肽的水平或通过影响转录前水平的表达(即，通过染色质结构调节、甲基化模式等改变基因表达)来降低或消除靶序列的表达水平。参见例如Verdeletal.(2004)Science303：672-676(Verdel等人，2004年，《科学》第303卷第672-676页)；Pal-Bhadraetal.(2004)Science303：669-672(Pal-Bhadra等人，2004年，《科学》第303卷第669-672页)；Allshire(2002)Science297：1818-1819(Allshire，2002年，《科学》第297卷第1818-1819页)；Volpeetal.(2002)Science297：1833-1837(Volpe等人，2002年，《科学》第297卷第1833-1837页)；Jenuwein(2002)Science297：2215-2218(Jenuwein，2002年，《科学》第297卷第2215-2218页)；以及Halletal.(2002)Science297：2232-2237(Hall等人，2002年，《科学》第297卷第2232-2237页)。测定能够降低或消除所关注序列水平的功能性RNAi的方法在本文别处公开。因此，如本文所用，术语“dsRNA”旨在涵盖用于描述能够介导RNA干扰或基因沉默的核酸分子的其他术语，包括(例如)短干扰RNA(siRNA)、双链RNA(dsRNA)、发夹RNA、短发夹RNA(shRNA)、反式作用siRNA(TAS)、转录后基因沉默RNA(ptgsRNA)，等等。
在具体的实施例中，dsRNA的双链体或双链区域的至少一条链与编码化学调节转录调节因子的多核苷酸具有足够大的序列同一性或序列互补性，从而允许dsRNA降低所述化学调节转录调节因子的表达水平。如本文所用，与靶多核苷酸互补的链为“反义链”，与靶多核苷酸同源的链为“有义链”。
在一个实施例中，dsRNA是发夹RNA。发夹RNA是能够折回到自身上形成双链结构的RNA分子。发夹元件可采用多种结构。在具体的实施例中，dsRNA抑制元件包含发夹元件，此发夹元件依次包含第一片段、第二片段和第三片段，其中第一片段和第三片段具有足够大的互补性，故允许转录的RNA形成双链茎环结构。
发夹的第二片段构成“环”或“环区”。这些术语在本文中是同义词，而且被广义地解释为赋予足够柔韧性故而允许多核苷酸的互补区域(即，形成发夹茎的第一片段和第二片段)发生自配对的任何核苷酸序列。例如，在一些实施例中，环区可以基本上是单链的，而且充当发夹茎环的自互补区域之间的间隔区。在一些实施例中，环区可以包含随机或无义核苷酸序列，因而不与靶多核苷酸具有序列同一性。在其他实施例中，环区包含与靶多核苷酸具有同一性的有义或反义RNA序列或其片段。参见例如国际专利公布No.WO02/00904，该专利公布以引用方式并入本文。在具体的实施例中，可以对环区进行优化，使其尽可能短，同时仍提供足够大的分子内柔韧性，以允许形成碱基配对的茎区。在其他实施例中，环区包含可剪接或不可剪接的内含子。因此，环序列含有的核苷酸通常少于1000个、900个、800个、700个、600个、500个、400个、300个、200个、100个、50个、25个、20个、15个、10个，或更少。
发夹RNA分子的“第一”片段和“第三”片段构成发夹结构的碱基配对的茎。第一片段和第三片段为彼此反向的重复序列，它们具有足够大的互补性，故而允许形成碱基配对的茎区。在具体的实施例中，第一片段和第三片段彼此完全互补。或者，第一片段和第三片段可以彼此部分互补，只要它们能够彼此杂交形成碱基配对的茎区就可以。可将第一片段和第三片段的互补量计算为占整个片段的百分比。因此，发夹RNA的第一片段和第三片段通常具有至少50％、60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％，最高至100％并包括100％在内的互补性。
第一片段和第三片段的长度为至少约1000个、500个、400个、300个、200个、100个、50个、40个、30个、25个、22个、20个或19个核苷酸。在具体的实施例中，第一片段和/或第三片段的长度为约10至约100个核苷酸、约10至约75个核苷酸、约10至约50个核苷酸、约10至约40个核苷酸、约10至约35个核苷酸、约10至约30个核苷酸、约10至约25个核苷酸、约10至约20个核苷酸。在其他实施例中，第一片段和/或第三片段的长度包含至少10至20个核苷酸、20至35个核苷酸、30至45个核苷酸、40至50个核苷酸、50至100个核苷酸，或100至300个核苷酸。参见例如国际公布No.WO0200904。在具体的实施例中，第一片段和第三片段包含与第一片段具有至少85％互补性的至少20个核苷酸。在另有其他实施例中，形成发夹的茎环结构的第一片段和第三片段包含具有未配对的核苷酸残基的3’或5’悬垂区域。
在具体的实施例中，第一片段、第二片段和/或第三片段中使用的序列包含的结构域被设计成与靶多核苷酸(即，编码化学调节转录调节因子的多核苷酸)具有足够大的序列同一性，从而能够降低靶多核苷酸的水平。因而抑制性RNA转录物的特异性通常由沉默元件的这些结构域赋予。因此，在本发明的一些实施例中，所述沉默元件的第一片段、第二片段和/或第三片段包含的结构域有至少10个、15个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、30个、40个、50个、100个、200个、300个、500个、1000个或1000个以上核苷酸，此结构域与编码化学调节转录调节因子的多核苷酸具有足够大的序列同一性，故而允许靶多核苷酸(即，SEQIDNO：1-836、863-870、884-889、1381-1568和/或2030-2110中任一序列，或编码所述任一序列的多核苷酸)在适当细胞中表达时其表达水平降低。在其他实施例中，所述结构域位于所述化学调节转录阻遏物的约第15至50位核苷酸、约第20至35位核苷酸、约第25至50位核苷酸、约第20至75位核苷酸、约第40至90位核苷酸、约第15至100位核苷酸之间。
在具体的实施例中，第一片段、第二片段和/或第三片段的结构域与编码化学调节转录调节因子、启动子、5’UTR或3’UTR的多核苷酸具有100％的序列同一性。在其他实施例中，与靶多肽具有同源性的第一片段、第二片段和/或第三片段的结构域与编码化学调节转录调节因子的多核苷酸区域具有至少50％、60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性。第一片段、第二片段和/或第三片段的结构域与靶多核苷酸的序列同一性只需达到一定值，该值足以降低所关注靶多核苷酸的表达。参见例如ChuangandMeyerowitz(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.USA97：4985-4990(Chuang和Meyerowitz，2000年，《美国国家科学院院刊》第97卷第4985-4990页)；Stoutjesdijketal.(2002)PlantPhysiol.129：1723-1731(Stoutjesdijk等人，2002年，《植物生理学》第129卷第1723-1731页)；WaterhouseandHelliwell(2003)Nat.Rev.Genet.4：29-38(Waterhouse和Helliwell，2003年，《自然综述遗传学》第4卷第29-38页)；Pandolfinietal.BMCBiotechnology3：7(Pandolfini等人，《BMC生物技术》第3卷第7页)，以及美国专利公布No.20030175965；这些文献和专利各自以引用方式并入本文。测定hpRNA构建体沉默体内基因表达的效率的瞬时测定法在Panstrugaetal.(2003)Mol.Biol.Rep.30：135-140(Panstruga等人，2003年，《分子生物学报告》第30卷第135-140页)中有描述，该文献以引用方式并入本文。
第一片段、第二片段和/或第三片段与靶多核苷酸共有的互补量或第一片段与第三片段(即，发夹结构的茎)共有的互补量可取决于要控制其中基因表达的植物不同而存在差别。一些植物或细胞类型可能需要精确配对或100％同一性，而其他植物或细胞类型可以容忍一定程度错配。举例来说，在一些细胞中，靶序列中存在单个核苷酸错配就导致细胞不再能够抑制基因表达。
可以用编码化学调节转录调节因子的多核苷酸的任何区域来设计具有足够大序列同一性的沉默元件结构域，以允许发夹转录物表达，从而降低化学调节转录调节因子的水平。例如，可将所述结构域设计成与编码化学调节转录调节因子的多核苷酸的5’非翻译区、编码化学调节转录调节因子的多核苷酸的3’非翻译区、编码化学调节转录调节因子的多核苷酸的外显子区、编码化学调节转录调节因子的多核苷酸的内含子区以及这些区域的任意组合具有序列同一性。在具体的实施例中，沉默元件的结构域与来自编码化学调节转录调控因子的多核苷酸的约第1至50位、第50至100位、第100至150位、第150至200位、第200至250位、第250至300位、第300至350位、第350至400位、第400至450位、第450至500位、第550至600位、第600至650位、第650至700位、第750至800位、第850至900位、第950至1000位、第1000至1050位、第1050至1100位、第1100至1200位、第1200至1300位、第1300至1400位、第1400至1500位、第1500至1600位、第1600至1700位、第1700至1800位、第1800至1900位、第1900至2000位核苷酸中的至少约15个连续核苷酸具有足够大的同源性。在某些情况下，为了优化发夹中采用的siRNA序列，可以用合成寡脱氧核糖核苷酸/RNAseH法确定靶mRNA上呈现易发生RNA沉默的构象的位点。参见例如Vickersetal.(2003)J.Biol.Chem278：7108-7118(Vickers等人，2003年，《生物化学杂志》第278卷第7108-7118页)和Yangetal.(2002)Proc.Natl.Acad.Sci.USA99：9442-9447(Yang等人，2002年，《美国国家科学院院刊》第99卷第9442-9447页)，这些文献以引用方式并入本文。这些研究表明，RNase-H敏感位点与能促进有效的siRNA引导的mRNA降解的位点显著相关。
也可将发夹沉默元件设计成让有义或反义序列不与靶多核苷酸对应。在该实施例中，有义和反义序列侧面与环序列相接，该环序列包含与靶多核苷酸的一部分或全部对应的核苷酸序列。因而，是环区决定了RNA干扰的特异性。参见例如WO02/00904，该专利以引用的方式并入本文。
在具体的实施例中，具有发夹结构的沉默元件包含的序列选自这样的多核苷酸：该多核苷酸包含本文别处讨论的各种化学调节转录阻遏物的至少一种序列，或由各种化学调节转录阻遏物的至少一种序列组成，所述化学调节转录阻遏物包括各种SuR多肽，诸如以SEQIDNO：1-836、863-870、884-889、1381-1568和/或2030-2110中任一序列示出的那些或其活性变体和片段。在一些实施例中，沉默元件的发夹结构采用了完整的化学调节转录阻遏物，或只采用了化学调节转录阻遏物中包含DNA结合结构域或其变体或片段、或配体结合结构域或其变体或片段的区域。
在具体的实施例中，所述沉默元件包含至少15个、20个、22个、25个或更多个编码在本文别处论述的化学调节转录阻遏物的连续核苷酸，或由15个、20个、22个、25个或更多个编码在本文别处论述的化学调节转录阻遏物的连续核苷酸组成，所述化学调节转录阻遏物包括各种SuR多肽，诸如以SEQIDNO：1-836、863-870、884-889、1381-1568和/或2030-2110中任一序列示出的那些或其活性变体和片段。在其他实施例中，所述沉默元件包含至少编码在本文别处论述的化学调节转录阻遏物的第1至7位、第7至14位、第14至21位、第14至28位、第28至35位、第35至42位、第42至49位、第49至56位、第56至63位、第63至70位、第70至77位、第77至84位、第84至91位、第91至98位、第98至105位、第105至112位、第112至119位、第119至126位、第126至133位、第133至140位、第140至147位、第147至154位、第154至161位、第161至168位、第168至175位、第175至182位、第182至189位、第189至196位、第196至203位或第203至207位氨基酸的多核苷酸或由这些多核苷酸组成，所述化学调节转录阻遏物包括各种SuR多肽，诸如以SEQIDNO：1-836、863-870、884-889、1381-1568和/或2030-2110中任一序列示出的那些或其活性变体和片段。或者，所述沉默元件包含编码化学调节转录阻遏物的多核苷酸的5’或3’翻译区或者翻译序列及编码序列的组合中的至少15个、20个、22个、25个或更多个连续核苷酸，或由这些连续核苷酸组成。
另外，可以通过使用发夹抑制元件实现转录基因沉默(TGS)，其中发夹的反向重复序列与要沉默的靶多核苷酸的启动子区域具有序列同一性。参见例如Aufsatzetal.(2002)PNAS99(Suppl.4)：16499-16506(Aufsatz等人，2002年，《美国国家科学院院刊》第99卷(第4期增刊)第16499-16506页)和Metteetal.(2000)EMBOJ19(19)：5194-5201(Mette等人，2000年，《欧洲分子生物学组织杂志》，第19卷第19期，第5194-5201页)。
据设想，可用具有靶向阻遏物转录物的序列的反式作用siRNA(tasiRNA)或微RNA(miRNA)置换上述载体中的发夹盒。同样，可置换不同的阻遏物，只要修饰过的miRNA靶向新靶标即可。在这种情况下，阻遏物可以是TetR阻遏物，或任一种SuR阻遏物。虽然上述发夹方法可能会靶向同一植物/植物细胞中的相关阻遏物序列，但仍可将miRNA制作成靶向一种特定的阻遏物类型。这便能够以独立方式自动诱导产生多个基因电路。
本发明的方法和组合物采用转录时形成dsRNA分子的沉默元件。因此，正在表达的异源多核苷酸不需要自身形成dsRNA，而是可与植物细胞中的其他序列相互作用，从而允许形成dsRNA。例如，可以通过将包含miRNA或siRNA靶序列的嵌合构建体表达到与要沉默的一个或多个基因的全部或一部分相对应的序列中，生成有选择地使靶多核苷酸沉默的嵌合多核苷酸。在该实施例中，当miRNA或siRNA的靶标与细胞中存在的miRNA相互作用时，形成dsRNA。然后所得的dsRNA可以降低要沉默的一个或多个基因的表达水平。参见例如美国申请公布2007-0130653，该申请公布以引用的方式并入本文。如本文别处所述，可以用任何方法引入包含异源miRNA的构建体。
(iii)微RNA(miRNA)沉默元件
在其他实施例中，所述沉默元件可以是微RNA(miRNA)。“微RNA”或“miRNA”是高效抑制靶多核苷酸表达的调节剂，其包含约19个至约24个核糖核苷酸。参见例如Javieretal.(2003)Nature425：257-263(Javier等人，2003年，《自然》第425卷第257-263页)，该文献以引用的方式并入本文。对于miRNA干扰，可将沉默元件设计为表达形成发夹结构的dsRNA分子，所述发夹结构包含与所关注靶多核苷酸互补的第19、20、21、22、23、24或25号核苷酸序列。miRNA可以被合成或转录为更长的RNA，这种更长的RNA随后裂解产生活性miRNA。miRNA可以是“人工miRNA”或“amiRNA”，这种miRNA包含用合成方法设计为让靶序列沉默的miRNA序列。
当表达miRNA时，最终(成熟的)miRNA以具有前体主链结构的双链体形式存在，两条链称为miRNA(最终与靶标碱基配对的链)和miRNA*(星序列)。现已证实，miRNA能以转基因方式表达并有效沉默所关注的靶基因(HighlyspecificgenesilencingbyartificialmicroRNAs，ArabidopsisSchwabetal.(2006)PlantCell.May；18(5)：1121-33(“使用人工微RNA实现高度特异性基因沉默”，ArabidopsisSchwab等人，2006年5月，《植物细胞》第18卷第5期，第1121-1133页)；Epub2006Mar10&ExpressionofartificialmicroRNAsintransgenicArabidopsisthalianaconfersvirusresistance.Niuetal.(2006)NatBiotechnol.2006Nov；24(11)：1420-8(2006年3月10日电子出版，“人工微RNA在转基因拟南芥中的表达赋予抗病毒性”，Niu等人，《自然生物技术》，2006年11月，第24卷第11期，第1420-1428页)；Epub2006Oct22.Erratumin：NatBiotechnol.2007Feb；25(2)：254(2006年10月22日电子出版，Erratum，《自然生物技术》，2007年2月，第25卷第2期，第254页)；这些文献都以引用的方式并入本文。)
用于miRNA干扰的沉默元件包含miRNA前体主链。此miRNA前体主链包含具有miRNA和星序列的DNA序列。当表达为RNA时，miRNA前体主链的结构允许形成能被加工为miRNA的发夹RNA结构。在一些实施例中，所述miRNA前体主链包含基因组miRNA前体序列，其中所述序列包含***了异源性(人工)miRNA和星序列的天然前体。
如本文所用，“星序列”是指在miRNA前体主链内与miRNA互补并与miRNA形成双链体继而形成发夹RNA的茎结构的序列。在一些实施例中，星序列与miRNA序列的互补性可能小于100％。或者，星序列可与miRNA序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％、80％或更低的序列互补性，只要星序列与miRNA序列的互补性大到足以形成双链结构即可。在另有其他实施例中，星序列是与miRNA序列具有1处、2处、3处、4处、5处或更多处错配的序列，但其仍与miRNA序列具有足够大的互补性，故能与miRNA序列形成双链结构，导致生成miRNA并抑制靶序列。
miRNA前体主链可来自任何植物。在一些实施例中，miRNA前体主链来自单子叶植物。在其他实施例中，miRNA前体主链来自双子叶植物。在另外的实施例中，miRNA前体主链来自玉蜀黍或大豆。上文已描述过微RNA前体主链。例如，US20090155910A1(WO2009/079532)公开了下述大豆miRNA前体主链：156c、159、166b、168c、396b和398b，而US20090155909A1(WO2009/079548)公开了下述玉蜀黍miRNA前体主链：159c、164h、168a、169r和396h。这些参考文献均以引用的方式全文并入本文。
因此，可改变miRNA前体主链以允许将异源miRNA和星序列有效***miRNA前体主链中。在这种情况下，采用PCR技术，用被设计成靶向任一种所关注序列的异源miRNA和异源星序列替换miRNA前体主链中的miRNA片段和星片段，再克隆到表达构建体中。已经认识到，可改变将人工miRNA和星序列***主链的位置。将miRNA和星序列***miRNA前体主链中的详细方法在例如美国专利申请20090155909A1和US20090155910A1中有描述，这两个专利全文以引用方式并入本文。
在设计miRNA序列和星序列时，可以有多种设计选择。参见例如SchwabR，etal.(2005)DevCell8：517-27(SchwabR等人，2005年，《发育细胞》第8卷第517-527页)。在非限制性实施例中，本文所公开的miRNA序列在5’-端处可能有“U”、在第19位核苷酸处可能有“C”或“G”，在第10位核苷酸处可能有“A”或“U”。在其他实施例中，将miRNA设计成具有高杂交自由能(delta-G)，该杂交自由能使用ZipFold算法计算得到(Markham，N.R.&Zuker，M.(2005)NucleicAcidsRes.33：W577-W581(Markham，N.R.和Zuker，M.，2005年，《核酸研究》第33卷第W577-W581页))。任选地，可在miRNA的5’部分内加入一个碱基对变化，让所述序列与靶序列存在一个核苷酸差异。
c.沉默元件的表达启动子
编码沉默元件的多核苷酸有效连接至植物中的活性阻抑型启动子。可用于表达沉默元件的各种阻抑型启动子在本文别处详细讨论。
3.包含所关注多核苷酸的表达构建体。
任一种所关注的多核苷酸均能在本文所公开的化学基因开关中表达。在具体的实施例中，所关注多核苷酸的表达改变了植物的表型和/或基因型。改变的基因型包括对植物基因组中的任何序列的任何可遗传修饰。改变的表型包括细胞、组织、植物和/或种子表现出与其未改变状态不同的特性或性状的任何情况。改变的表型包括但不限于不同的生长习性、改变的花色、改变的相对成熟度、改变的产量、改变的能育性、改变的花期、改变的病害耐受性、改变的昆虫耐受性、改变的除草剂耐受性、改变的胁迫耐受性、改变的耐涝性、改变的耐旱性、改变的种子特性、改变的形态、改变的农学特性、改变的代谢、改变的基因表达谱、改变的多倍性、改变的作物品质、改变的饲料品质、改变的青贮饲料品质、改变的加工特性等。
所关注多核苷酸反映出作物开发参与者的商业市场和利益。所关注的作物和市场在变化，随着发展中国家开放了世界市场，也将会出现新的作物和技术。另外，随着我们对农学性状和特性诸如产量和杂种优势的理解逐渐深入，选择进行转化的基因会相应变化。所关注基因的大体类别包括例如涉及信息的那些基因(如锌指)、涉及通信的那些基因(如激酶)和涉及管家的那些基因(如热休克蛋白)。转基因的更具体类别例如包括编码对农艺学、昆虫抗性、病害抗性、除草剂抗性、不育性、籽粒特性和商业产品重要的性状的基因。一般来讲，所关注基因包括涉及油脂、淀粉、碳水化合物或营养物质代谢的那些基因，以及影响籽粒大小、蔗糖载量的那些基因，等等。
在其他实施例中，所关注多核苷酸可以是任一种所关注的序列，包括但不限于编码多肽、mRNA、RNAi前体、活性RNAi剂、miRNA、反义多核苷酸、核糖酶、融合蛋白、复制型载体、可筛选标记等的序列。可使用所关注多核苷酸的表达来诱导所编码的RNA和/或多肽的表达，或相反地，抑制所编码的RNA、RNA靶序列和/或多肽的表达。在具体例子中，所述多核苷酸序列可以是编码植物激素、植物防御蛋白、营养转运蛋白、生物结合蛋白、期望输入性状、期望输出性状、胁迫抗性基因、病害/病原体抗性基因、雄性不育基因、发育基因、调节基因、DNA修复基因、转录调节基因或任何其他所关注的多核苷酸和/或多肽的多核苷酸。
除了使用传统的育种方法外，还可通过遗传方式改变农艺上重要的性状，比如油脂含量、淀粉含量和蛋白质含量。修饰包括增加油酸、饱和油和不饱和油的含量，提升赖氨酸和硫的水平，提供必需氨基酸，以及修饰淀粉。美国专利No.5,703,049、No.5,885,801、No.5,885,802和No.5,990,389描述了hordothionin蛋白质修饰法，这些专利以引用的方式并入本文。另一个例子是美国专利No.5,850,016中描述的由大豆2S白蛋白编码的富含赖氨酸和/或富含硫的种子蛋白，和Williamsonetal.(1987)Eur.J.Biochem.165：99-106(Williamson等人，1987年，《欧洲生物化学杂志》第165卷第99-106页)中描述的来自大麦的胰凝乳蛋白酶抑制剂，这些文献的公开内容以引用方式并入本文。
可通过定点诱变产生编码序列的衍生物，由此增加预选氨基酸在所编码的多肽中的水平。举例来说，编码大麦高赖氨酸多肽(BHL)的基因源自大麦胰凝乳蛋白酶抑制剂(1996年11月1日提交的美国申请序列号08/740,682，以及WO98/20133，这些专利的公开内容以引用方式并入本文)。其他蛋白质包括富含甲硫氨酸的植物蛋白，这种植物蛋白例如来自向日葵籽(Lilleyetal.(1989)ProceedingsoftheWorldCongressonVegetableProteinUtilizationinHumanFoodsandAnimalFeedstuffs，ed.Applewhite(AmericanOilChemistsSociety，Champaign，Illinois)，pp.497-502(Lilley等人，1989年，《人类食物和动物饲料中植物蛋白利用世界大会论文集》，Applewhite编辑(美国伊利诺伊州香槟市美国石油化学家学会)，第497-502页)；该文献以引用方式并入本文)、玉米(Pedersenetal.(1986)J.Biol.Chem.261：6279(Pedersen等人，1986年，《生物化学杂志》第261卷第6279页)；Kiriharaetal.(1988)Gene71：359(Kirihara等人，1988年，《基因》第71卷第359页)；这两篇文献均以引用方式并入本文)，和水稻(Musumuraetal.(1989)PlantMol.Biol.12：123(Musumura等人，1989年，《植物分子生物学》第12卷第123页)，这篇文献以引用方式并入本文)。其他农艺上重要的基因编码胶乳、Floury2、生长因子、种子贮藏因子和转录因子。
昆虫抗性基因可编码针对会导致产量大跌的害虫(诸如根虫、切根虫、欧洲玉米螟等)的抗性。这种基因包括(例如)苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis)毒蛋白基因(美国专利No.5,366,892、No.5,747,450、No.5,736,514、No.5,723,756、No.5,593,881；以及Geiseretal.(1986)Gene48：109(Geiser等人，1986年，《基因》第48卷第109页))等。
编码病害抗性性状的基因包括解毒基因，如抗伏马毒素基因(美国专利No.5,792,931)、无毒性(avr)和病害抗性(R)基因(Jonesetal.(1994)Science266：789(Jones等人，1994年，《科学》第266卷第789页)；Martinetal.(1993)Science262：1432(Martin等人，1993年，《科学》第262卷第1432页)；以及Mindrinosetal.(1994)Cell78：1089(Mindrinos等人，1994年，《细胞》第78卷第1089页))，等等。
除草剂抗性性状可包括编码对能抑制乙酰乳酸合酶(ALS)的作用的除草剂(特别是磺酰脲类除草剂)的抗性的基因(例如含有导致这种抗性的突变，特别是S4和/或Hra突变的乙酰乳酸合酶(ALS)基因)、编码对能抑制谷氨酰胺合酶的作用的除草剂(例如草胺膦或basta)的抗性的基因(例如bar基因)、编码对草甘膦的抗性的基因(例如EPSPS基因和GAT基因；参见例如美国公布No.20040082770和WO03/092360)；或者本领域已知的其他这类基因。bar基因编码针对除草剂basta的抗性，nptII基因编码针对抗生素卡那霉素和遗传霉素的抗性，ALS基因突变体编码针对除草剂氯磺隆的抗性。
不育基因也可编码在表达盒中，为物理去雄提供备选方案。以这种方式使用的基因的例子包括雄性组织偏好的基因和具有雄性不育表型的基因(如QM)，这些基因在美国专利No.5,583,210中有描述。其他基因包括激酶和编码对雄性或雌性配子体发育有毒的化合物的那些基因。
下述性状体现了谷粒的质量：饱和及不饱和油脂的含量和类型、必需氨基酸的质量和数量、纤维素含量。玉米中的经修饰hordothionin蛋白质在美国专利No.5,703,049、No.5,885,801、No.5,885,802和No.5,990,389中有描述。
也可以在一种或多种基因上编码商业性状，所述基因可增加例如用于乙醇生产的淀粉，或提供蛋白质表达。经转化植物的另一个重要商业用途是生产聚合物和生物塑料，如美国专利No.5,602,321中所述。诸如β-酮硫解酶、PHB酶(聚羟基丁酸合酶)和乙酰乙酰辅酶A还原酶的基因(参见Schubertetal.(1988)J.Bacteriol.170：5837-5847(Schubert等人，1988年，《细菌学杂志》第170卷第5837-5847页))有利于聚羟基链烷酸酯(PHA)的表达。
外源产物包括植物酶和植物产物，以及来自包括原核生物和其他真核生物在内的其他来源的那些产物。这类产物包括酶、辅因子、激素等。可增加蛋白质，特别是具有能够提高植物营养价值的改善氨基酸分布的经修饰蛋白质的水平。这可通过表达具有提高的氨基酸含量的这类蛋白质来实现。
a.所关注多核苷酸的表达启动子
所关注多核苷酸有效连接至植物中的活性阻抑型启动子。可用于表达沉默元件的各种阻抑型启动子在本文别处详细讨论。
4.启动子
如上文所详细概述，可在化学基因开关的各种构建体中使用多个启动子。可根据期望的结果来选择启动子。所关注的启动子可以是组成型启动子或非组成型启动子。非组成型启动子可包括但不限于组织偏好的启动子、诱导型启动子、阻抑型启动子、发育阶段偏好的启动子，或具有这些特性中的不止一种的启动子。在一些例子中，启动子主要在根、叶、茎、花、穗丝、花药、花粉、分生组织、种系、种子、胚乳、胚芽或子代中表达。化学基因开关的构建体内采用的多个启动子的非限制性例子在下文详细论述。
组成型启动子包括(例如)Rsyn7启动子的核心启动子，以及WO99/43838和美国专利No.6,072,050中公开的其他组成型启动子；核心CaMV35S启动子(Odelletal.(1985)Nature313：810-812(Odell等人，1985年，《自然》第313卷第810-812页))；水稻肌动蛋白基因启动子(McElroyetal.(1990)PlantCell2：163-171(McElroy等人，1990年，《植物细胞》第2卷第163-171页))；泛素启动子(Christensenetal.(1989)PlantMol.Biol.12：619-632(Christensen等人，1989年，《植物分子生物学》第12卷第619-632页)和Christensenetal.(1992)PlantMol.Biol.18：675-689(Christensen等人，1992年，《植物分子生物学》第18卷第675-689页))；pEMU(Lastetal.(1991)Theor.Appl.Genet.81：581-588(Last等人，1991年，《理论与应用遗传学》第81卷第581-588页))；MAS(Veltenetal.(1984)EMBOJ.3：2723-2730(Velten等人，1984年，《欧洲分子生物学组织杂志》第3卷第2723-2730页))；ALS启动子(美国专利No.5,659,026)，等等。其他组成型启动子包括(例如)美国专利No.5,608,149、No.5,608,144、No.5,604,121、No.5,569,597、No.5,466,785、No.5,399,680、No.5,268,463、No.5,608,142和No.6,177,611中公开的那些。
组织偏好的启动子可用来靶向特定植物组织内的增强的表达。组织偏好的启动子包括以下文献中公开的那些：Yamamotoetal.(1997)PlantJ.12(2)：255-265(Yamamoto等人，1997年，《植物杂志》第12卷第2期，第255-265页)；Kawamataetal.(1997)PlantCellPhysiol.38(7)：792-803(Kawamata等人，1997年，《植物细胞生理学》第38卷第7期，第792-803页)；Hansenetal.(1997)Mol.GenGenet.254(3)：337-343(Hansen等人，1997年，《分子遗传学与普通遗传学》第254卷第3期，第337-343页)；Russelletal.(1997)TransgenicRes.6(2)：157-168(Russell等人，1997年，《转基因研究》第6卷第2期，第157-168页)；Rinehartetal.(1996)PlantPhysiol.112(3)：1331-1341(Rinehart等人，1996年，《植物生理学》第112卷第3期，第1331-1341页)；VanCampetal.(1996)PlantPhysiol.112(2)：525-535(VanCamp等人，1996年，《植物生理学》第112卷第2期，第525-535页)；Canevascinietal.(1996)PlantPhysiol.112(2)：513-524(Canevascini等人，1996年，《植物生理学》第112卷第2期，第513-524页)；Yamamotoetal.(1994)PlantCellPhysiol.35(5)：773-778(Yamamoto等人，1994年，《植物细胞生理学》第35卷第5期，第773-778页)；Lam(1994)ResultsProbl.CellDiffer.20：181-196(Lam，1994年，《细胞分化中的结果和问题》第20卷第181-196页)；Orozcoetal.(1993)PlantMolBiol.23(6)：1129-1138(Orozco等人，1993年，《植物分子生物学》第23卷第6期，第1129-1138页)；Matsuokaetal.(1993)ProcNatl.Acad.Sci.USA90(20)：9586-9590(Matsuoka等人，1993年，《美国国家科学院院刊》第90卷第20期，第9586-9590页)；以及Guevara-Garciaetal.(1993)PlantJ.4(3)：495-505(Guevara-Garcia等人，1993年，《植物杂志》第4卷第3期，第495-505页)。如有必要，可对此类启动子进行修饰，以便弱化表达。
叶偏好的启动子是本领域已知的。参见例如Yamamotoetal.(1997)PlantJ.12(2)：255-265(Yamamoto等人，1997年，《植物杂志》第12卷第2期，第255-265页)；Kwonetal.(1994)PlantPhysiol.105：357-67(Kwon等人，1994年，《植物生理学》第105卷第357-367页)；Yamamotoetal.(1994)PlantCellPhysiol.35(5)：773-778(Yamamoto等人，1994年，《植物细胞生理学》第35卷第5期，第773-778页)；Gotoretal.(1993)PlantJ.3：509-18(Gotor等人，1993年，《植物杂志》第3卷第509-518页)；Orozcoetal.(1993)PlantMol.Biol.23(6)：1129-1138(Orozco等人，1993年，《植物分子生物学》第23卷第6期，第1129-1138页)；以及Matsuokaetal.(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90(20)：9586-9590(Matsuoka等人，1993年，《美国国家科学院院刊》第90卷第20期，第9586-9590页)。
根偏好的启动子是已知的，可选自许多可从文献得到的启动子，或者可从多种相容物种从头分离。参见例如Hireetal.(1992)PlantMol.Biol.20(2)：207-218(Hire等人，1992年，《植物分子生物学》第20卷第2期，第207-218页)(大豆根特异性谷氨酰胺合成酶基因)；KellerandBaumgartner(1991)PlantCell3(10)：1051-1061(Keller和Baumgartner，1991年，《植物细胞》第3卷第10期，第1051-1061页)(法国菜豆GRP1.8基因中的根特异性控制元件)；Sangeretal.(1990)PlantMol.Biol.14(3)：433-443(Sanger等人，1990年，《植物分子生物学》第14卷第3期，第433-443页)(根瘤农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)的甘露氨酸合酶(MAS)基因的根特异性启动子)；以及Miaoetal.(1991)PlantCell3(1)：11-22(Miao等人，1991年，《植物细胞》第3卷第1期，第11-22页)(编码细胞溶质谷氨酰胺合成酶(GS)的全长cDNA克隆，其在大豆的根和根瘤中表达)。还可参见Boguszetal.(1990)PlantCell2(7)：633-641(Bogusz等人，1990年，《植物细胞》第2卷第7期，第633-641页)，其中描述了从来自固氮非豆科植物榆科山黄麻(Parasponiaandersonii)和相关的非固氮非豆科植物鸡屎藤山麻黄(Trematomentosa)的血红蛋白基因分离的两种根特异性启动子。将这些基因的启动子连接至β-葡糖醛酸酶报告基因并引入非豆科植物烟草(Nicotianatabacum)和豆科植物百脉根(Lotuscorniculatus)二者中，在这两种情况下根特异性启动子活性得以保留。Leach和Aoyagi(1991)描述了他们对毛根农杆菌(Agrobacteriumrhizogenes)的高表达rolC和rolD根诱导基因的启动子的分析结果(参见PlantScience(Limerick)79(1)：69-76(《植物科学》(Limerick)，第79卷第1期，第69-76页))。他们得出结论认为，增强子和组织偏好的DNA决定子在那些启动子中是分离的。Teeri等人(1989)使用与lacZ的基因融合显示，编码章鱼碱合酶的农杆菌属(Agrobacterium)T-DNA基因在根尖表皮中特别活跃，且TR2′基因在完整植物中是根特异性的并通过叶组织中的创伤刺激，这是用于杀昆虫或杀幼虫基因的特别理想的特性组合(参见EMBOJ.8(2)：343-350(《欧洲分子生物学组织杂志》第8卷第2期，第343-350页))。与nptII(新霉素磷酸转移酶II)融合的TR1′基因显示出相似的特性。另外的根偏好的启动子包括VfENOD-GRP3基因启动子(Kusteretal.(1995)PlantMol.Biol.29(4)：759-772(Kuster等人，1995年，《植物分子生物学》第29卷第4期，第759-772页))；以及rolB启动子(Capanaetal.(1994)PlantMol.Biol.25(4)：681-691(Capana等人，1994年，《植物分子生物学》第25卷第4期，第681-691页))。还可参见美国专利No.5,837,876、No.5,750,386、No.5,633,363、No.5,459,252、No.5,401,836、No.5,110,732和No.5,023,179。
“种子偏好的”启动子包括“种子特异性”启动子(这种启动子在种子发育期间活跃，例如种子贮藏蛋白的启动子)和“种子萌发”启动子(这种启动子在种子萌发期间活跃)。参见Thompsonetal.(1989)BioEssays10：108(Thompson等人，1989年，《生物学论文集》第10卷第108页)，该文献以引用的方式并入本文。此类种子偏好的启动子包括但不限于Cim1(细胞***素诱导信息基因启动子)；cZ19B1(玉蜀黍19kDa玉米醇溶蛋白基因启动子)；milps(肌醇-1-磷酸合酶基因启动子)(参见WO00/11177和美国专利No.6,225,529，这两份专利以引用方式并入本文)。γ-玉米醇溶蛋白基因启动子是胚乳特异性启动子。球蛋白1(Glb-1)基因启动子是代表性的胚特异性启动子。对于双子叶植物而言，种子特异性启动子包括但不限于菜豆β-菜豆蛋白基因启动子、油菜籽蛋白(napin)基因启动子、β-伴球蛋白基因启动子、大豆凝集素基因启动子、十字花科蛋白基因启动子等。对于单子叶植物而言，种子特异性启动子包括但不限于玉蜀黍15kDa玉米醇溶蛋白基因启动子、22kDa玉米醇溶蛋白基因启动子、27kDa玉米醇溶蛋白基因启动子、γ-玉米醇溶蛋白基因启动子、糯性蛋白基因启动子、超甜蛋白1基因启动子、超甜蛋白2基因启动子、球蛋白1基因启动子等。还可参见WO00/12733，其中公开了来自end1和end2基因的种子偏好的启动子；该专利以引用方式并入本文。
另外的示例性启动子包括但不限于35SCaMV启动子(Odelletal.(1995)Nature313：810-812(Odell等人，1995年，《自然》第313卷第810-812页))、S-腺苷甲硫氨酸合酶基因启动子(SAMS)(例如，US7,217,858和US2008/0026466中公开的那些启动子)、紫茉莉花叶病毒启动子(例如，Dey&Maiti(1999)PlantMolBiol40：771-782(Dey和Maiti，1999年，《植物分子生物学》第40卷第771-782页)；Dey&Maiti(1999)Transgenics3：61-70(Dey和Maiti，1999年，《转基因学》第3卷第61-70页))、延长因子启动子(例如，US2008/0313776和US2009/0133159)、香蕉条纹病毒启动子、肌动蛋白基因启动子(例如，McElroyetal.(1990)PlantCell2：163-171(McElroy等人，1990年，《植物细胞》第2卷第163-171页))、TobRB7启动子(例如，Yamamotoetal.(1991)PlantCell3：371(Yamamoto等人，1991年，《植物细胞》第3卷第371页))、马铃薯块茎储藏蛋白基因启动子(例如，马铃薯块茎储藏蛋白基因启动子B33，Martinetal.(1997)PlantJ11：53-62(Martin等人，1997年，《植物杂志》第11卷第53-62页))、核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶基因启动子(例如rbcS-3A，参见例如Fluhretal.(1986)Science232：1106-1112(Fluhr等人，1986年，《科学》第232卷第1106-1112页)，以及Pellingrinischietal.(1995)BiochemSocTrans23：247-250(Pellingrinischi等人，1995年，《生物化学会汇刊》第23卷第247-250页))、泛素启动子(例如Christensenetal.(1992)PlantMolBiol18：675-689(Christensen等人，1992年，《植物分子生物学》第18卷，第675-689页)，以及Christensen&Quail(1996)TransgenRes5：213-218(Christensen和Quail，1996年，《转基因研究》第5卷第213-218页))、金属硫蛋白基因启动子(例如US2010/0064390)、Rab17启动子(例如Vilardelletal.(1994)PlantMolBiol24：561-569(Vilardell等人，1994年，《植物分子生物学》第24卷第561-569页))、伴大豆球蛋白基因启动子(例如Chamberlandetal.(1992)PlantMolBiol19：937-949(Chamberland等人，1992年，《植物分子生物学》第19卷第937-949页))、质膜内在蛋白(PIP)基因启动子(例如Alexanderssonetal.(2009)PlantJ61：650-660(Alexandersson等人，2009年，《植物杂志》第61卷第650-660页))、脂质转移蛋白(LTP)基因启动子(例如US2009/0158464、US2009/0070893和US2008/0295201)、γ-玉米醇溶蛋白基因启动子(例如Ueadetal.(1994)MolCellBiol14：4350-4359(Uead等人，1994年，《分子细胞生物学》第14卷第4350-4359页))、γ-kafarin启动子(例如Mishraetal.(2008)MolBiolRep35：81-88(Mishra等人，2008年，《分子生物学报告》，第35卷第81-88页))、球蛋白基因启动子(例如Liuetal.(1998)PlantCellRep17：650-655(Liu等人，1998年，《植物细胞报告》第17卷第650-655页))、豆球蛋白基因启动子(例如US7211712)、早期胚乳启动子(EEP)(例如US2007/0169226和US2009/0227013)、B22E启动子(例如Klemsdaletal.(1991)MolGenGenet228：9-16(Klemsdal等人，1991年，《分子遗传学与普通遗传学》第228卷第9-16页))、油质蛋白基因启动子(例如Plantetal.(1994)PlantMolBiol25：193-205(Plant等人，1994年，《植物分子生物学》第25卷第193-205页))、早期丰富蛋白(EAP)基因启动子(例如US7,321,031)、胚胎晚期丰富蛋白(LEA)基因启动子(例如Hva1，Straubetal.(1994)PlantMolBiol26：617-630(Hva1、Straub等人，1994年，《植物分子生物学》第26卷第617-630页)；DhnandWSI18，Xiao&Xue(2001)PlantCellRep20：667-673(Dhn和WSI18，Xiao和Xue，2001年，《植物细胞报告》第20卷第667-673页))、In2-2启动子(DeVeylderetal.(1997)PlantCellPhysiol38：568-577(DeVeylder等人，1997年，《植物细胞生理学》第38卷第568-577页))、谷胱甘肽S-转移酶(GST)基因启动子(例如WO93/01294)、PR启动子(例如Caoetal.(2006)PlantCellRep6：554-560(Cao等人，2006年，《植物细胞报告》第6卷第554-560页)，以及Onoetal.(2004)BiosciBiotechBiochem68：803-807(Ono等人，2004年，《生物科学、生物技术与生物化学》第68卷第803-807页))、ACE1启动子(例如Mettetal.(1993)ProcNatlAcadSciUSA90：4567-4571(Mett等人，1993年，《美国国家科学院院刊》第90卷第4567-4571页))、类固醇响应性启动子(例如Schenaetal.(1991)ProcNatlAcadSciUSA88：10421-10425(Schena等人，1991年，《美国国家科学院院刊》第88卷第10421-10425页)，以及McNellisetal.(1998)PlantJ14：247-257(McNellis等人，1998年，《植物杂志》第14卷第247-257页))、乙醇诱导型启动子(例如AlcA，Caddicketal.(1988)NatBiotechnol16：177-180(AlcA、Caddick等人，1988年，《自然生物技术》第16卷第177-180页))、***诱导型启动子(例如Bruceetal.(2000)PlantCell12：65-79(Bruce等人，2000年，《植物细胞》第12卷第65-79页))、XVE***诱导型启动子(例如Zaoetal.(2000)PlantJ24：265-273(Zao等人，2000年，《植物杂志》第24卷第265-273页))、VGE甲氧虫酰肼诱导型启动子(例如Padidametal.(2003)TransgenRes12：101-109(Padidam等人，2003年，《转基因研究》第12卷第101-109页))，或者TGV***诱导型启动子(例如Bohneretal.(1999)PlantJ19：87-95(Bohner等人，1994年，《植物杂志》第19卷第87-95页))。
a.阻抑型启动子
如本文所用，“阻抑型启动子”包含至少一个操纵基因序列，化学调节转录阻遏物多肽特异性地结合到该操纵基因序列上，由此控制启动子的转录活性。如果不存在阻遏物，阻抑型启动子有活性，而且将引发有效连接的多核苷酸的转录。如果存在阻遏物，该阻遏物将结合到操纵基因序列并抑制转录。在化学基因开关的背景下，阻遏物包括化学调节转录阻遏物，化学配体影响阻遏物，让阻遏物能结合到操纵基因、或不能结合到操纵基因。因此，阻遏物与操纵基因的结合会受到化学配体存在与否的影响，故而化学配体的存在将阻止转录阻遏物结合到操纵基因。具有“阻抑型启动子活性”的启动子将引导有效连接的多核苷酸表达，这种启动子引导转录的能力取决于是否存在化学配体(即，四环素化合物、磺酰脲类化合物)和相应的化学调节转录阻遏蛋白。因此，操纵基因的存在“调节”有效连接的序列的转录(增强或降低该序列的表达)。
可采用启动子和操纵基因的任意组合来形成阻抑型启动子。所关注的操纵基因包括但不限于Tet操纵基因序列，Tet操纵基因序列是TetR(A)操纵基因序列、TetR(B)操纵基因序列、TetR(D)操纵基因序列、TetR(E)操纵基因序列、TetR(H)操纵基因序列，或这些操纵基因序列的活性变体或片段。另外的所关注操纵基因包括但不限于受以下阻遏物调节的那些操纵基因：tet、lac、trp、phd、arg、LexA、phiChl阻遏物，lambdaC1和Cro阻遏物，噬菌体X阻遏物，MetJ、phirltrro、phi434C1和Cro阻遏物，RafR、gal、ebg、uxuR、exuR、ROS、SinR、PurR、FruR、P22C2、TetC、AcrR、Betl、Bm3R1、EnvR、QacR、MtrR、TcmR、Ttk、YbiH、YhgD和muNer，或者Interpro家族中的DNA结合结构域(包括但不限于IPR001647、IPR010982和IPR01199)。
在一个实施例中，阻抑型启动子包含至少一个tet操纵基因序列。阻遏物包括tet阻遏物和磺酰脲类调节的阻遏物。tet阻遏物与tet操纵基因的结合受四环素化合物及其类似物调节。磺酰脲类响应性阻遏物与tet操纵基因的结合受磺酰脲类化合物及其类似物控制。tet操纵基因序列可与阻抑型启动子TATA框5’或3’端间隔0至30个核苷酸，包括例如与TATA框间隔20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1或0个核苷酸。在其他情况下，tet操纵基因序列可与TATA框序列部分重叠。在一个非限制性例子中，tet操纵基因序列为SEQIDNO：848，或其活性变体或片段。
可用的含有tet操纵基因的启动子包括例如本领域已知的那些(参见例如Padidam(2003)CurrOpPlantBiol6：169-177(Padidam，2003年，《植物生物学当代进展》第6卷第169-177页)；Gatz&Quail(1988)PNAS85：1394-1397(Gatz和Quail，1988年，《美国国家科学院院刊》第85卷第1394-1397页)；Ulmasovetal.(1997)PlantMolBiol35：417-424(Ulmasov等人，1997年，《植物分子生物学》第35卷第417-424页)；Weinmannetal.(1994)PlantJ5：559-569(Weinmann等人，1994年，《植物杂志》第5卷第559-569页))。可将一个或多个tet操纵基因序列添加到启动子中，从而得到四环素诱导型启动子。参见例如Weinmannetal.(1994)PlantJ5：559-569(Weinmann等人，1994年，《植物杂志》第5卷第559-569页)；Loveetal.(2000)PlantJ21：579-588(Love等人，2000年，《植物杂志》第21卷第579-588页)。此外，开发并广泛测试了植物中使用的利用CaMV35S启动子的四环素调节表达***(Gatzetal.(1992)PlantJ2：397-404(Gatz等人，1992年，《植物杂志》第2卷第397-404页))，此表达***在TATA框附近引入了三个tet操纵基因(3XOpT35S)。
因此，可以使用包含调节所述阻遏物表达的至少一个、两个、三个或更多个操纵基因(包括tet操纵基因，例如以SEQIDNO：848示出的操纵基因，或其活性变体或片段)的阻抑型启动子。用于表达化学调节转录阻遏物的非限制性阻抑型启动子包括以SEQIDNO：885、856、857、858、859或860示出的阻抑型启动子，或者它们的活性变体及片段。
可将任何启动子与操纵基因组合得到阻抑型启动子。在具体的实施例中，启动子在植物细胞中是有活性的。启动子可以是组成型启动子或非组成型启动子。非组成型启动子包括组织偏好的启动子，例如主要在根、叶、茎、花、穗丝、花药、花粉、分生组织、种子、胚乳或胚芽中表达的启动子。
在特定实施例中，启动子为植物肌动蛋白基因启动子、香蕉条纹病毒启动子(BSV)、MMV启动子、增强的MMV启动子(dMMV)、植物P450启动子或延长因子1a(EF1A)启动子。所关注的启动子包括例如植物肌动蛋白基因启动子(SEQIDNO：849)、香蕉条纹病毒启动子(BSV)(SEQIDNO：850)、紫茉莉花叶病毒启动子(MMV)(SEQIDNO：851)、增强的MMV启动子(dMMV)(SEQIDNO：852)、植物P450启动子(MP1)(SEQIDNO：853)或延长因子1a(EFIA)启动子(SEQIDNO：854)，或者它们的活性变体或片段。
阻抑型启动子可包含一个或多个操纵基因序列。例如，阻抑型启动子可包含1个、2个、3个、4个、5个或更多个操纵基因序列。在一个实施例中，阻抑型启动子包含两个tet操纵基因序列，第一个tet操纵基因序列与TATA框5’端间隔0至30个核苷酸，第二个tet操纵基因序列与TATA框3’端间隔0至30个核苷酸。在一些例子中，第一个和/或第二个tet操纵基因序列与TATA框间隔20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1或0个核苷酸。在一些例子中，第一个和/或第二个tet操纵基因序列可与TATA框序列部分重叠。在一些例子中，第一个和/或第二个tet操纵基因序列为SEQIDNO：848，或其活性变体或片段。
在其他实施例中，阻抑型启动子包含三个tet操纵基因序列，第一个tet操纵基因序列与TATA框5’端间隔0至30个核苷酸，第二个tet操纵基因序列与TATA框3’端间隔0至30个核苷酸，第三个tet操纵基因序列与转录起始位点(TSS)间隔0至50个核苷酸。在一些例子中，第一个和/或第二个tet操纵基因序列与TATA框间隔20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1或0个核苷酸。在其他情况下，第三个tet操纵基因序列与TSS间隔50、45、40、35、30、25、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1或0个核苷酸。在一些例子中，第三个tet操纵基因序列位于TSS的5’端，或者可与TSS序列部分重叠。在一个非限制性实施例中，第一个、第二个和/或第三个tet操纵基因序列为SEQIDNO：848，或其活性变体或片段。
在另一个实施例中，阻抑型启动子可具有位于转录起始位点附近的单个操纵基因位点。可通过使操纵基因序列恰好位于TSS下游来抑制35S启动子(Heinsetal.(1992)MolGenGenet232：328-331(Heins等人，1992年，《分子遗传学与普通遗传学》第232卷第328-331页))。
在具体例子中，阻抑型启动子是植物肌动蛋白基因启动子(actin/Op)(SEQIDNO：855)、香蕉条纹病毒启动子(BSV/Op)(SEQIDNO：856)、紫茉莉花叶病毒启动子(MMV/Op)(SEQIDNO：857)、增强的MMV启动子(dMMV/Op)(SEQIDNO：858)、植物P450启动子(MP1/Op)(SEQIDNO：859)或延长因子1a(EFIA/Op)启动子(SEQIDNO：860)，或者它们的活性变体或片段。因此，阻抑型启动子可包含与SEQIDNO：885、856、857、858、859或860具有至少约50％、60％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的多核苷酸序列，而且保留了阻抑型启动子活性。在一个具体例子中，所述启动子包含与SEQIDNO：885、856、857、858、859或860具有至少95％的序列同一性的多核苷酸序列，而且保留了阻抑型启动子活性。
在一些实施例中，化学基因开关中采用的阻抑型启动子在各种组织或细胞中的表达受以下因素限制：选择的组织或细胞类型、特定的发育阶段、特定的环境条件和/或植物或其子代的特定代数。在一些例子中，如果有效连接至阻抑型启动子的所关注多核苷酸不受抑制，便主要在根、叶、茎、花、穗丝、花药、花粉、分生组织、种系、种子、胚乳、胚芽或子代中表达。在一些例子中，有效连接至阻抑型启动子的所关注多核苷酸的表达主要在特定时间发生，包括但不限于种子或植物的各发育阶段，即营养生长阶段、生殖周期，或响应于特定环境条件、响应于害虫或病原体侵染、响应于特定化学化合物或这些条件的任意组合发生。在其他实施例中，所关注多核苷酸在不同组织或细胞中的表达减少、受抑制或被阻断，这一现象可能受以下因素限制：选择的组织或细胞类型、特定的发育阶段、特定的环境条件和/或植物或其子代的特定代数。在一些例子中，所关注多核苷酸的表达受抑制主要在根、叶、茎、花、穗丝、花药、花粉、分生组织、种系、种子、胚乳、胚芽或子代中发生。在一些例子中，所关注多核苷酸的表达受抑制主要在特定时间发生，包括但不限于种子或植物的各发育阶段，即营养生长阶段、生殖周期，或响应于特定环境条件、响应于害虫或病原体侵染、响应于特定化学化合物或这些条件的任意组合发生。
5.赋予化学配体耐受性的序列
如上文所详细论述的，可以在本文公开的方法及组合物中使用多种化学配体及其相应的化学调节转录阻遏物来组装出基因开关。已经认识到，植物或植物部分在暴露于化学配体时，应当保留对所采用的化学配体的耐受性。如本文所用，在化学配体处理的背景下，“化学配体耐受性”、“耐受性”或“作物耐受性”，“除草剂耐受性”或“磺酰脲类耐受性”是指与未暴露于化学配体的植物或植物部分相比，用采用的特定化学基因开关***中的化学配体处理过的植物在经受处理后不会表现出明显损伤。所采用的化学配体可以是不会对植物造成负面影响的化合物。或者，植物可能对特定化学配体天然耐受，也可能在人为干预下对化学配体耐受，其中人为干预例如使用重组构建体、植物育种或基因工程。
在一个实施例中，化学基因开关包含的化学调节转录阻遏物为Su(R)多肽，化学配体为磺酰脲类化合物。采用这种化学基因开关时，含有多种化学基因开关组分的植物应当对用作化学配体的磺酰脲类化合物耐受。采用这种化学基因开关***的植物可能含有赋予磺酰脲类化合物耐受性的自然或异源序列。
在一个实施例中，这种植物包含磺酰脲类耐受性多肽。如本文所用，“磺酰脲类耐受性多肽”是指在植物中表达时赋予植物对至少一种磺酰脲类化合物的耐受性的任何多肽。磺酰脲类除草剂能阻断乙酰乳酸合酶(ALS)(也称为乙酰羟酸合酶(AHAS))的作用途径，故而抑制高等植物生长。在ALS中含有特定突变(例如S4和/或HRA突变)的植物具有磺酰脲类除草剂耐受性。培育磺酰脲类耐受性植物的方法在美国专利No.5,605,011、No.5,013,659、No.5,141,870、No.5,767,361、No.5,731,180、No.5,304,732、No.4,761,373、No.5,331,107、No.5,928,937和No.5,378,824，以及国际公布WO96/33270中有更全面的描述，这些专利出于各种目的全文以引用方式并入本文。磺酰脲类耐受性多肽可例如由ALS的SuRA或SuRB基因座编码。在具体的实施例中，ALS抑制剂耐受性多肽具有C3ALS突变体、HRAALS突变体、S4突变体或S4/HRA突变体，或者这些突变体的任意组合。已知可以向ALS中引入不同突变来赋予植物对不同除草剂和除草剂群组(和/或子群组)的耐受性；参见例如TranelandWright(2002)WeedScience50：700-712(Tranel和Wright，2002年，《杂草科学》第50卷第700-712页)。还可参见美国专利No.5,605,011、No.5,378,824、No.5,141,870和No.5,013,659，这些专利都全文以引用方式并入本文。在一个实施例中，向ALS中引入HRA突变有特殊用处。HRA突变得到了乙酰乳酸合酶多肽，相较其野生型蛋白质，这种多肽能够抵抗至少一种磺酰脲类化合物。
如果化学配体对植物无效，或化学配体对植物有一些影响但植物后来能自动恢复，又或化学配体对植物有不利影响，但这种不利影响能例如被特定除草剂对杂草的杀灭作用或化学基因开关***产生的所需表型抵消掉，则认为这种化学配体不会“明显损伤”植物。因此，举例来说，如果暴露于化学配体的植物与适当对照植物(例如未经处理的作物植物)相比，指示植物健康状况和/或生产力的至少一种合适参数显示的降低百分比低于50％、40％、30％、25％、20％、15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％，则认为这种植物未被化学配体处理“明显损伤”。指示植物健康状况和/或生产力的合适参数包括(例如)植物高度、植物重量、叶片长度、发育到特定阶段耗费的时间、花期、产量、结种量等。对参数的评估可通过外观检查和/或统计分析任何合适参数进行。可通过外观检查和/或统计分析来进行参数比较。因此，倘若作物植物表现出至少一种参数降低，但这种降低在自然状态下是暂时的，并且植物在一周、两周、三周、四周或六周内完全恢复，那么认为这种作物植物未被除草剂或其他处理“明显损伤”。
III.植物
本发明提供了具有一种或多种化学基因开关组分(即，沉默元件构建体、所关注多核苷酸序列的构建体和/或化学调节转录阻遏物构建体)的植物、植物细胞、植物部分和种子，以及籽粒。在具体的实施例中，所述植物和/或植物部分具有稳定掺入的至少一种化学基因开关组分(即，沉默元件构建体、所关注多核苷酸序列的构建体和/或化学调节转录阻遏物构建体)。
如本文所用，术语“植物”包括植物细胞、植物原生质体、从中可再生出植物的植物细胞组织培养物、植物愈伤组织、在植物或植物部分中完好的植物块和植物细胞如胚、花粉、胚珠、种子、叶、花、枝、果实、仁、穗、穗轴、壳、茎、根、根尖、花粉囊等。籽粒意在表示由商业种植者出于栽培或繁殖物种之外的目的所生产的成熟种子。再生的植物的子代、变体和突变体也包括在本发明的范围内，前提是这些部分包含所引入的多核苷酸。
可使用一种或多种化学基因开关组分(即，沉默元件构建体、所关注多核苷酸序列的构建体和/或化学调节转录阻遏物构建体)来转化任何植物物种，包括但不限于单子叶植物和双子叶植物。所关注的植物物种的例子包括但不限于玉米(Zeamays)、芸苔属(Brassica)物种(例如甘蓝型油菜(B.napus)、芜菁(B.rapa)、芥菜(B.juncea)，尤其是可用作种子油来源的那些芸苔属物种，苜蓿(Medicagosativa)、水稻(Oryzasativa)、黑麦(Secalecereale)、高粱(Sorghumbicolor、Sorghumvulgare)、粟(例如珍珠粟(Pennisetumglaucum)、黄米(Panicummiliaceum)、谷子(Setariaitalica)、龙爪稷(Eleusinecoracana))、向日葵(Helianthusannuus)、红花(Carthamustinctorius)、小麦(Triticumaestivum)、大豆(Glycinemax)、烟草(Nicotianatabacum)、马铃薯(Solanumtuberosum)、落花生(Arachishypogaea)、棉花(海岛棉(Gossypiumbarbadense)、陆地棉(Gossypiumhirsutum))、甘薯(Ipomoeabatatus)、木薯(Manihotesculenta)、咖啡(咖啡属(Coffea)物种)、椰子(Cocosnucifera)、菠萝(Ananascomosus)、柑橘(柑橘属(Citrus)物种)、可可(Theobromacacao)、茶(Camelliasinensis)、香蕉(芭蕉属(Musa)物种)、鳄梨(Perseaamericana)、无花果(Ficuscasica)、番石榴(Psidiumguajava)、芒果(Mangiferaindica)、橄榄(Oleaeuropaea)、木瓜(Caricapapaya)、腰果(Anacardiumoccidentale)、澳洲坚果(Macadamiaintegrifolia)、杏树(Prunusamygdalus)、糖用甜菜(Betavulgaris)、甘蔗(甘蔗属(Saccharum)物种)、燕麦、大麦、蔬菜类、观赏植物类和针叶树类。
蔬菜包括番茄(Lycopersiconesculentum)、莴苣(例如Lactucasativa)、青豆(Phaseolusvulgaris)、利马豆(Phaseoluslimensis)、豌豆(香豌豆属(Lathyrus)物种)和黄瓜属(Cucumis)的成员比如黄瓜(C.sativus)、香瓜(C.cantalupensis)和甜瓜(C.melo)。观赏植物包括杜鹃(杜鹃花属(Rhododendron)物种)、八仙花(Macrophyllahydrangea)、朱槿(Hibiscusrosasanensis)、玫瑰(蔷薇属(Rosa)物种)、郁金香(郁金香属(Tulipa)物种)、水仙(水仙属(Narcissus)物种)、矮牵牛(Petuniahybrida)、康乃馨(Dianthuscaryophyllus)、一品红(Euphorbiapulcherrima)和菊花。
可用于实施本发明的针叶树类包括(例如)松树类，如厚皮刺果松(Pinustaeda)、沼泽松(Pinuselliotii)、美国黄松(Pinusponderosa)、黑松(Pinuscontorta)和辐射松(Pinusradiata)；黄杉(Pseudotsugamenziesii)；西铁杉(Tsugacanadensis)；北美云杉(Piceaglauca)；红杉(Sequoiasempervirens)；枞树(truefirs)如银枞(Abiesamabilis)和胶枞(Abiesbalsamea)；雪松如西部红雪松(Thujaplicata)和阿拉斯加黄雪松(Chamaecyparisnootkatensis)，以及杨树和桉树。在具体的实施例中，本发明的植物是作物植物(例如玉米、苜蓿、向日葵、芸苔、大豆、棉花、红花、花生、高粱、小麦、粟、烟草等)。在其他实施例中，玉米和大豆植物是最佳的，在另外其他实施例中，玉米植物是最佳的。
其他所关注的植物包括提供所关注的种子的谷物类植物、油料种子植物和豆科植物。所关注的种子包括谷物种子，诸如玉米、小麦、大麦、水稻、高粱、黑麦等。油料种子植物包括棉花、大豆、红花、向日葵、芸苔、玉蜀黍、苜蓿、棕榈、椰子等。豆科植物包括豆类和豌豆。豆类包括瓜尔豆、槐豆、胡芦巴、大豆、四季豆、豇豆、绿豆、利马豆、蚕豆、小扁豆、鹰嘴豆等。
“受试植物”或“植物细胞”是其中已针对所关注基因进行了遗传变更(如转化)的植物或植物细胞，或者是从经如此变更的植物或细胞遗传下来并包含该变更的植物或植物细胞。“对照”、“对照植物”或“对照植物细胞”提供测量受试植物或植物细胞的表型变化的参照点。
对照植物或对照植物细胞可包括例如：(a)野生型植物或细胞，即其基因型与用于进行得到该受试植物或细胞的遗传变更的起始材料相同的野生型植物或细胞；(b)其基因型与该起始材料相同但已用无效构建体(即用已知对所关注性状没有作用的构建体(如包含标记基因的构建体)进行了转化的植物或植物细胞；(c)为受试植物或植物细胞的子代当中的非转化分离子的植物或植物细胞；(d)在遗传上与该受试植物或植物细胞相同但不被暴露于会引发所关注基因和/或沉默元件表达的条件或刺激的植物或植物细胞；或者(e)处于所关注基因不被表达的条件下的该受试植物或植物细胞本身。
如上文所概述，具有化学基因开关的植物和植物部分还可表现出化学配体耐受性。化学配体耐受性可能是天然存在的，也可能经由人为干预、经由育种或引入赋予化学配体耐受性的重组序列而产生。因此，在某些情况下，包含化学基因开关的植物包含赋予对SU除草剂的耐受性的序列，包括例如形式改变的AHAS，包括HRA序列。
IV.多核苷酸构建体
术语“多核苷酸”的使用并不旨在将本发明的方法及组合物局限于包含DNA的多核苷酸。本领域普通技术人员会认识到，多核苷酸可以是核糖核苷酸，或核糖核苷酸与脱氧核糖核苷酸的组合。这种脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸既包括天然存在的分子，也包括合成的类似物。本发明的多核苷酸还涵盖所有形式的序列，包括但不限于单链形式、双链形式、发夹结构、茎-环结构等。
可在所关注植物中表达的表达盒中提供对化学基因开关***(即，化学调节转录阻遏物、沉默元件和所关注的多核苷酸，如有需要，还可以是赋予化学配体耐受性的多核苷酸)的各种注释。所述表达盒可包含有效连接至化学调节转录阻遏物、沉默元件和所关注多核苷酸的5’和3’调节序列。“有效连接”是指两个或更多个元件之间的功能性连接。举例来说，所关注多核苷酸与调节序列(即启动子)之间的有效连接是可使该所关注多核苷酸得以表达的功能性连接。有效连接的元件可以是连续的或非连续的。当用来指两个蛋白质编码区域的连接时，所谓有效连接，是指所述编码区域处于同一阅读框中。所述表达盒可另外含有至少一个待共转化到该生物体中的额外基因。或者，可在多个表达盒上提供一个或多个额外基因。这种表达盒设有多个限制性位点和/或重组位点，用于使多核苷酸(即，化学调节转录阻遏物、沉默元件和所关注多核苷酸)的***受到调节区的转录调节。这种表达盒可另外含有选择性标记基因。
表达盒沿5′-3′转录方向可依次包含在植物中发挥作用的转录和翻译起始区(即，启动子)、化学基因开关组分(即，化学调节转录阻遏物、沉默元件和所关注多核苷酸)，以及转录和翻译终止区(即，终止区)。多个调节区(即，启动子、转录调节区和翻译终止区)和/或化学调节转录阻遏物、沉默元件和所关注多核苷酸对于宿主细胞或彼此来说，可以是天然的/同功的。或者，所述多个调节区可以是宿主细胞或彼此的异源物。
如本文所用，与序列有关的“异源”，是指该序列源于外来物种，或者，如果源于同一物种的话，则是通过蓄意人为干预对其天然形式在组成和/或基因座方面进行实质性修饰得到的序列。例如，有效连接到异源多核苷酸的启动子来自与得到该多核苷酸的物种不同的物种，或者，如果来自相同/类似的物种，那么一方或双方大体上由它们的原来形式和/或基因组位点修饰得到，或者该启动子不是被有效连接的多核苷酸的天然启动子。
终止区对于转录起始区来说可以是天然的，对于植物宿主来说可以是天然的，也可来源于与启动子、植物宿主不同的(即，外来的或异源的)来源，或这些情况的任意组合。易得的终止区可获自根瘤农杆菌的Ti质粒，比如章鱼碱合酶和胭脂碱合酶终止区。还可参见Guerineauetal.(1991)Mol.Gen.Genet.262：141-144(Guerineau等人，1991年，《分子遗传学与普通遗传学》第262卷第141-144页)；Proudfoot(1991)Cell64：671-674(Proudfoot，1991年，《细胞》第64卷第671-674页)；Sanfaconetal.(1991)GenesDev.5：141-149(Sanfacon等人，1991年，《基因与发育》第5卷第141-149页)；Mogenetal.(1990)PlantCell2：1261-1272(Mogen等人，1990年，《植物细胞》第2卷第1261-1272页)；Munroeetal.(1990)Gene91：151-158(Munroe等人，1990年，《基因》第91卷第151-158页)；Ballasetal.(1989)NucleicAcidsRes.17：7891-7903(Ballas等人，1989年，《核酸研究》，第17卷第7891-7903页)；以及Joshietal.(1987)NucleicAcidsRes.15：9627-9639(Joshi等人，1987年，《核酸研究》第15卷第9627-9639页)。
在适当情况下，可以优化化学基因开关***(即，化学调节转录阻遏物、沉默元件和所关注多核苷酸)的多核苷酸，以便增强其在转化植物中的表达水平。也就是说，可使用植物偏好的密码子来合成多核苷酸，以便提高其表达水平。有关宿主偏好密码子的用法的讨论，参见例如CampbellandGowri(1990)PlantPhysiol.92：1-11(Campbell和Gowri，1990年，《植物生理学》第92卷第1-11页)。合成植物偏好基因的方法是本领域现成的。参见例如美国专利No.5,380,831和No.5,436,391，以及Murrayetal.(1989)NucleicAcidsRes.17：477-498(Murray等人，1989年，《核酸研究》第17卷第477-498页)，该文献以引用方式并入本文。
已知有另外的序列修饰能增强细胞宿主中的基因表达。这些序列修饰包括消除以下序列：编码假多腺苷酸化信号、外显子-内含子剪接位点信号、转座子样重复的序列，以及其他此类得到充分表征的可能对基因表达有害的序列。可将序列的G-C含量调整到给定的细胞宿主的平均水平，该平均水平通过参考在宿主细胞中表达的已知基因计算得到。当可能时，修饰序列以避免可预见的发夹二级mRNA结构。
所述表达盒可另外含有5′前导序列。此类前导序列可以起到增强翻译的作用。翻译前导序列是本领域已知的，包括：小核糖核酸病毒前导序列，例如EMCV前导序列(脑心肌炎5′非编码区)(Elroy-Steinetal.(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA86：6126-6130(ElroyStein等人，1989年，《美国国家科学院院刊》第86卷第6126-6130页))；马铃薯Y病毒前导序列，例如TEV前导序列(烟草蚀纹病毒)(Gallieetal.(1995)Gene165(2)：233-238(Gallie等人，1995年，《基因》第165卷第2期，第233-238页))、MDMV前导序列(玉蜀黍矮花叶病毒)(Virology154：9-20(《病毒学》第154卷第9-20页))和人免疫球蛋白重链结合蛋白(BiP)前导序列(Macejaketal.(1991)Nature353：90-94(Macejak等人，1991年，《自然》第353卷第90-94页))；来自苜蓿花叶病毒外壳蛋白mRNA的非翻译前导序列(AMVRNA4)(Joblingetal.(1987)Nature325：622-625(Jobling等人，1987年，《自然》第325卷第622-625页))；烟草花叶病毒前导序列(TMV)(Gallieetal.(1989)MolecularBiologyofRNA，ed.Cech(Liss，NewYork)，pp.237-256(Gallie等人，1989年，《RNA的分子生物学》，Cech编辑，纽约Liss出版社，第237-256页))；以及玉蜀黍褪绿斑驳病毒前导序列(MCMV)(Lommeletal.(1991)Virology81：382-385(Lommel等人，1991年，《病毒学》第81卷第382-385页))。还可参见Della-Cioppaetal.(1987)PlantPhysiol.84：965-968(Della-Cioppa等人，1987年，《植物生理学》第84卷第965-968页)。
在制备表达盒时，可对各种DNA片段进行操纵，以便提供处于正确取向的DNA序列，且适当时提供处于正确的阅读框的DNA序列。为此目的，可应用衔接子或接头将DNA片段连接在一起，或者可涉及其他的操纵以提供便利的限制性位点、去除多余的DNA、去除限制性位点等。出于这个目的，可能涉及体外诱变、引物修复、限制性酶切、退火、再置换(例如转换和颠换)。
如本文别处详细讨论，可使用多个启动子来表达化学基因开关***的各种组分。可根据期望的结果来选择启动子。
表达盒还可包含用于选择经转化的细胞的选择性标记基因。选择性标记基因用于选择经转化的细胞或组织。标记基因包括编码抗生素抗性的基因，如编码新霉素磷酸转移酶II(NEO)和潮霉素磷酸转移酶(HPT)的那些基因，以及赋予对除草化合物的抗性的基因，所述除草化合物例如草甘膦、草铵膦、溴苯腈、磺酰脲、麦草畏和2，4-二氯苯氧基乙酸(2，4-D)。另外的选择性标记包括表型标记，例如β-半乳糖苷酶标记和荧光蛋白如绿色荧光蛋白(GFP)标记(Suetal.(2004)BiotechnolBioeng85：610-9(Su等人，2004年，《生物技术与生物工程》第85卷第610-609页)和Fetteretal.(2004)PlantCell16：215-28(Fetter等人，2004年，《植物细胞》第16卷第215-228页))、青色荧光蛋白(CYP)标记(Bolteetal.(2004)J.CellScience117：943-54(Bolte等人，2004年，《细胞科学杂志》第117卷第943-954页)和Katoetal.(2002)PlantPhysiol129：913-42(Kato等人，2002年，《植物生理学》第129卷第913-942页))和黄色荧光蛋白标记(得自Evrogen公司的PhiYFPTM，参见Bolteetal.(2004)J.CellScience117：943-54(Bolte等人，2004年，《细胞科学杂志》第117卷第943-954页))。若想了解另外的选择性标记，一般参见Yarranton(1992)Curr.Opin.Biotech.3：506-511(Yarranton，1992年，《生物技术新观点》第3卷第506-511页)；Christophersonetal.(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA89：6314-6318(Christopherson等人，1992年，《美国国家科学院院刊》第89卷第6314-6318页)；Yaoetal.(1992)Cell71：63-72(Yao等人，1992年，《细胞》第71卷第63-72页)；Reznikoff(1992)Mol.Microbiol.6：2419-2422(Reznikoff，1992年，《分子微生物学》第6卷第2419-2422页)；Barkleyetal.(1980)TheOperon，pp.177-220(Barkley等人，1980年，《操纵子》第177-220页)；Huetal.(1987)Cell48：555-566(Hu等人，1987年，《细胞》第48卷第555-566页)；Brownetal.(1987)Cell49：603-612(Brown等人，1987年，《细胞》第49卷第603-612页)；Figgeetal.(1988)Cell52：713-722(Figge等人，1988年，《细胞》，第52卷，第713-722页)；Deuschleetal.(1989)Proc.Natl.Acad.Aci.USA86：5400-5404(Deuschle等人，1989年，《美国国家科学院院刊》第86卷第5400-5404页)；Fuerstetal.(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA86：2549-2553(Fuerst等人，1989年，《美国国家科学院院刊》第86卷第2549-2553页)；Deuschleetal.(1990)Science248：480-483(Deuschle等人，1990年，《科学》第248卷第480-483页)；Gossen(1993)Ph.D.Thesis，UniversityofHeidelberg(Gossen，1993年，德国海德尔堡大学博士论文)；Reinesetal.(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90：1917-1921(Reines等人，1993年，《美国国家科学院院刊》第90卷第1917-1921页)；Labowetal.(1990)Mol.Cell.Biol.10：3343-3356(Labow等人，1990年，《分子细胞生物学》第10卷第3343-3356页)；Zambrettietal.(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA89：3952-3956(Zambretti等人，1992年，《美国国家科学院院刊》第89卷第3952-3956页)；Baimetal.(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA88：5072-5076(Baim等人，1991年，《美国国家科学院院刊》第88卷第5072-5076页)；Wyborskietal.(1991)NucleicAcidsRes.19：4647-4653(Wyborski等人，1991年，《核酸研究》第19卷第4647-4653页)；Hillenand-Wissman(1989)TopicsMol.Struc.Biol.10：143-162(Hillenand-Wissman，1989年，《分子结构生物学专题》第10卷第143-162页)；Degenkolbetal.(1991)Antimicrob.AgentsChemother.35：1591-1595(Degenkolb等人，1991年，《抗微生物剂及化学疗法》第35卷第1591-1595页)；Kleinschnidtetal.(1988)Biochemistry27：1094-1104(Kleinschnidt等人，1988年，《生物化学》第27卷第1094-1104页)；Bonin(1993)Ph.D.Thesis，UniversityofHeidelberg(Bonin，1993年，德国海德尔堡大学博士论文)；Gossenetal.(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA89：5547-5551(Gossen等人，1992年，《美国国家科学院院刊》第89卷第5547-5551页)；Olivaetal.(1992)Antimicrob.AgentsChemother.36：913-919(Oliva等人，1992年，《抗微生物剂及化学疗法》第36卷第913-919页)；Hlavkaetal.(1985)HandbookofExperimentalPharmacology，Vol.78(Springer-Verlag，Berlin)(Hlavka等人，1985年，《实验药理学手册》第78卷，柏林施普林格出版社)；Gilletal.(1988)Nature334：721-724(Gill等人，1988年，《自然》第334卷第721-724页)。这些文献的公开内容以引用的方式并入本文。以上选择性标记基因的列表不是限制性的。
可将各种组分引入植物中的单个多核苷酸构建体或单个质粒上，或多个分离的多核苷酸构建体或分离的质粒上。还认识到，可采用任何手段将基因开关的各种组分合并到一起，包括先将一种或多种组分引入植物，再利用育种将各单独组分一并引入单株植物。
V.引入方法
可使用各种方法将化学基因开关***的各种组分引入植物或植物部分。“引入”意在指以使多核苷酸或多肽的序列能进入植物细胞内部的方式将这些序列呈递给植物、植物细胞或植物部分。本发明的方法不取决于将序列引入植物或植物部分中的具体方法，只要多核苷酸或多肽能进入植物的至少一个细胞的内部即可。将多核苷酸或多肽引入植物的方法是本领域已知的，包括但不限于稳定转化方法、瞬时转化方法和病毒介导的方法。
“稳定转化”意在指被引入植物中的核苷酸构建体整合进植物的基因组中，并能够由其后代继承。“瞬时转化”意在指多核苷酸被引入植物中但没有整合进植物的基因组中，或者多肽被引入植物中。
转化方案以及将多肽或多核苷酸序列引入植物中的方案，可视要进行转化的植物或植物细胞的类型(即，单子叶植物或双子叶植物)而异。将多肽和多核苷酸引入植物细胞的合适方法包括显微注射法(Crosswayetal.(1986)Biotechniques4：320-334(Crossway等人，1986年，《生物技术》第4卷第320-334页))、电穿孔法(Riggsetal.(1986)Proc.Natl.Acad.Sci.USA83：5602-5606(Riggs等人，1986年，《美国国家科学院院刊》第83卷第5602-5606页))、农杆菌属介导的转化法(美国专利No.5,563,055和美国专利No.5,981,840)、直接基因转移法(Paszkowskietal.(1984)EMBOJ.3：2717-2722(Paszkowski等人，1984年，《欧洲分子生物学组织杂志》第3卷第2717-2722页))、弹道粒子加速法(参见例如美国专利No.4,945,050，美国专利No.5,879,918，美国专利No.5,886,244和No.5,932,782；Tomesetal.(1995)PlantCell，Tissue，andOrganCulture：FundamentalMethods，ed.GamborgandPhillips(Springer-Verlag，Berlin)(Tomes等人，1995年，《植物细胞、组织和器官培养：基础方法》，Gamborg和Phillips编辑，柏林施普林格出版社)；McCabeetal.(1988)Biotechnology6：923-926(McCabe等人，1988年，《生物技术》第6卷第923-926页))，和Lec1转化法(WO00/28058)。还可参见Weissingeretal.(1988)Ann.Rev.Genet.22：421-477(Weissinger等人，1988年，《遗传学年鉴》第22卷第421-477页)；Sanfordetal.(1987)ParticulateScienceandTechnology5：27-37(Sanford等人，1987年，《粒子科学与技术》第5卷第27-37页)(洋葱)；Christouetal.(1988)PlantPhysiol.87：671-674(Christou等人，1988年，《植物生理学》第87卷第671-674页)(大豆)；McCabeetal.(1988)Bio/Technology6：923-926(McCabe等人，1988年，《生物技术》第6卷第923-926页)(大豆)；FinerandMcMullen(1991)VitroCellDev.Biol.27P：175-182(Finer和McMullen，1991年，《体外细胞发育生物学》第27P卷第175-182页)(大豆)；Singhetal.(1998)Theor.Appl.Genet.96：319-324(Singh等人，1998年，《理论与应用遗传学》第96卷第319-324页)(大豆)；Dattaetal.(1990)Biotechnology8：736-740(Datta等人，1990年，《生物技术》第8卷第736-740页)(水稻)；Kleinetal.(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA85：4305-4309(Klein等人，1988年，《美国国家科学院院刊》第85卷第4305-4309页)(玉蜀黍)；Kleinetal.(1988)Biotechnology6：559-563(Klein等人，1988年，《生物技术》第6卷第559-563页)(玉蜀黍)；美国专利No.5,240,855、No.5,322,783和No.5,324,646；Kleinetal.(1988)PlantPhysiol.91：440-444(Klein等人，1988年，《植物生理学》第91卷第440-444页)(玉蜀黍)；Frommetal.(1990)Biotechnology8：833-839(Fromm等人，1990年，《生物技术》第8卷第833-839页)(玉蜀黍)；Hooykaas-VanSlogterenetal.(1984)Nature(London)311：763-764(Hooykaas-VanSlogteren等人，1984年，《自然》(伦敦)第311卷第763-764页)；美国专利No.5,736,369(谷类)；Bytebieretal.(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA84：5345-5349(Bytebier等人，1987年，《美国国家科学院院刊》第84卷第5345-5349页)(百合科)；DeWetetal.(1985)TheExperimentalManipulationofOvuleTissues，ed.Chapmanetal.(Longman，NewYork)，pp.197-209(DeWet等人，1985年，《胚珠组织的实验操纵》，Chapman等人编辑，纽约朗文出版社，第197-209页)(花粉)；Kaeppleretal.(1990)PlantCellReports9：415-418(Kaeppler等人，1990年，《植物细胞报告》第9卷第415-418页)；Kaeppleretal.(1992)Theor.Appl.Genet.84：560-566(Kaeppler等人，1992年，《理论与应用遗传学》第84卷第560-566页)(晶须介导的转化)；D'Halluinetal.(1992)PlantCell4：1495-1505(D′Halluin等人，1992年，《植物细胞》第4卷第1495-1505页)(电穿孔法)；Lietal.(1993)PlantCellReports12：250-255(Li等人，1993年，《植物细胞报告》第12卷第250-255页)和ChristouandFord(1995)AnnalsofBotany75：407-413(Christou和Ford，1995年，《植物学年鉴》第75卷第407-413页)(水稻)；Osjodaetal.(1996)NatureBiotechnology14：745-750(Osjoda等人，1996年，《自然生物技术》第14卷第745-750页)(利用根瘤农杆菌转化玉蜀黍)，全部上述文献以引用方式并入本文。
在其他实施例中，可通过使植物与病毒或病毒核酸接触而将化学基因开关***的各组分引入植物中。一般来讲，这类方法涉及将本发明的核苷酸构建体掺入DNA或RNA分子内部。涉及病毒DNA或RNA分子的用于将多核苷酸引入植物中并使其表达的方法是本领域已知的。参见例如美国专利No.5,889,191、No.5,889,190、No.5,866,785、No.5,589,367、No.5,316,931，以及Portaetal.(1996)MolecularBiotechnology5：209-221(Porta等人，1996年，《分子生物技术》第5卷第209-221页)；这些专利与文献以引用方式并入本文。
用于在植物基因组中特定位置处靶向***多核苷酸的方法是本领域已知的。在一个实施例中，***化学基因开关***的一种或多种组分是使用位点特异性重组***实现的。参见例如WO99/25821、WO99/25854、WO99/25840、WO99/25855和WO99/25853，所有这些专利以引用方式并入本文。靶向多核苷酸的其他方法在WO2009/114321(以引用方式并入本文)中示出，该专利描述了被制成用于修饰植物基因组，尤其是玉蜀黍基因组的“定制型”大范围核酸酶。还可参见Gaoetal.(2010)PlantJournal1：176-187(Gao等人，2010年，《植物杂志》第1卷第176-187页)。
可根据常规方式将已转化的细胞培育成植株。参见例如McCormicketal.(1986)PlantCellReports5：81-84(McCormick等人，1986年，《植物细胞报告》第5卷第81-84页)。然后可栽培这些植株，用同一转化株系或不同株系授粉，再识别出具有所需表型特征的组成型表达的子代。可以培育两代或更多代植株，确保所需表型特征的表达得到稳定保持和遗传。然后收获种子，确保已实现所需表型特征的表达。本发明以此方式提供了例如在其基因组中稳定掺入了化学基因开关***的一种或多种组分，甚至化学基因开关***的所有组分的转化种子(也称“转基因种子”)。
在一些例子中，利用质体转化，或将SuR转录物或多肽引导到质体中，可把化学基因开关***的多种组分引入质体。取决于需要的产物和/或用途，可使用任何细胞核或质体转化法。质体转化的优点包括：可获得高转基因表达、可控制转基因表达、能表达多顺反子信息、可利用同源重组实现位点特异性整合、不存在转基因沉默和位置效应、可通过单亲质体基因遗传控制转基因传递，而且可将表达的多肽隔离在细胞器中并因此可避免多肽对胞质成分的可能不利影响(例如参见以下文献的评述：Heifetz(2000)Biochimie82：655-666(Heifetz，2000年，《生物化学》第82卷第655-666页)；Danielletal.(2002)TrendsPlantSci7：84-91(Daniell等人，2002年，《植物科学趋势》第7卷第84-91页)；Maliga(2002)CurrOpPlantBiol5：164-172(Maliga，2002年，《植物生物学当代进展》第5卷第164-172页)；Maliga(2004)AnnRevPlantBiol55-289-313(Maliga，2004年，《植物生理学和植物分子生物学年评》第55卷第289-313页)；Danielletal.(2005)TrendsBiotechnol23：238-245(Daniell等人，2005年，《生物技术趋势》第23卷第238-245页)和VermaandDaniell(2007)PlantPhysiol145：1129-1143(Verma和Daniell，2007年，《植物生理学》第145卷第1129-1143页))。
用于质体转化的方法及组合物是众所周知的，例如质体转化法，包括Boyntonetal.(1988)Science240：1534-1538(Boynton等人，1988年，《科学》第240卷第1534-1538页)；Svabetal.(1990)ProcNatlAcadSciUSA87：8526-8530(Svab等人，1990年，《美国国家科学院院刊》第87卷第8526-8530页)；Svabetal.(1990)PlantMolBiol14：197-205(Svab等人，1990年，《植物分子生物学》第14卷第197-205页)；Svabetal.(1993)ProcNatlAcadSciUSA90：913-917(Svab等人，1993年，《美国国家科学院院刊》第90卷第913-917页)；Goldsetal.(1993)Bio/Technology11：95-97(Golds等人，1993年，《生物技术》第11卷第95-97页)；O'Neilletal.(1993)PlantJ3：729-738(O'Neill等人，1993年，《植物杂志》第3卷第729-738页)；Koopetal.(1996)Planta199：193-201(Koop等人，1996年，《植物学》第199卷第193-201页)；Koferetal.(1998)InVitroPlant34：303-309(Kofer等人，1998年，《体外细胞和发育生物学：植物》第34卷第303-309页)；Knoblauchetal.(1999)NatBiotechnol17：906-909(Knoblauch等人，1999年，《自然生物技术》第17卷第906-909页)；质体转化载体、元件和选择也是众所周知的(Newmanetal.(1990)Genetics126：875-888(Newman等人，1990年，《遗传学》第126卷第875-888页)；Goldschmidt-Clermont(1991)NuclAcidsRes19：4083-4089(Goldschmidt-Clermont，1991年，《核酸研究》第19卷第4083-4089页)；Carreretal.(1993)MolGenGenet241：49-56(Carrer等人，1993年，《分子遗传学与普通遗传学》第241卷第49-56页)；Svabetal.(1993)ProcNatlAcadSciUSA90：913-917(Svab等人，1993年，《美国国家科学院院刊》第90卷第913-917页)；VermaandDaniell(2007)PlantPhysiol145：1129-1143(Verma和Daniell，2007年，《植物生理学》第145卷第1129-1143页))。
用于控制质体中基因表达的方法及组合物是众所周知的，包括McBrideetal.(1994)ProcNatlAcadSciUSA91：7301-7305(McBride等人，1994年，《美国国家科学院院刊》第91卷第7301-7305页)；etal.(2005)PlantCellPhysiol46：1462-1471(等人，2005年，《植物细胞生理学》第46卷第1462-1471页)；Heifetz(2000)Biochemie82：655-666(Heifetz，2000年，《生物化学》第82卷第655-666页)；Surzyckietal.(2007)ProcNatlAcadSciUSA104：17548-17553(Surzycki等人，2007年，《美国国家科学院院刊》第104卷第17548-17553页)；美国专利No.5,576,198和No.5,925,806，WO2005/0544478；用于将多核苷酸和/或多肽导入质体的方法及组合物也是众所周知的，包括用于转运肽的翻译融合法(例如Comaietal.(1988)JBiolChern263：15104-15109(Comai等人，1988年，《生物化学杂志》第263卷第15104-15109页))。
SuR多核苷酸和多肽提供了经由容易进入细胞的化学配体来调节质体基因表达的手段。举例来说，在使用叶绿体T7表达***(McBrideetal.(1994)ProcNatlAcadSciUSA91：7301-7305(McBride等人，1994年，《美国国家科学院院刊》第91卷第7301-7305页))的情况下，SuR可用于控制质体靶向的T7聚合酶在细胞核内的表达水平。或者，可将SuR调节的启动子整合到质体基因组中并有效连接至所关注的多核苷酸和由细胞核基因组表达及导入的SuR，也可将SuR调节的启动子整合到质体中。在所有情况下，都使用磺酰脲类化合物来有效地调节所关注的多核苷酸和沉默元件。
VI.使用化学基因开关***的方法
本发明提供了用于调节植物、植物器官或植物组织中的基因表达的多种方法。这些方法包括提供含有以下组分的植物：(i)第一多核苷酸构建体，其为编码有效连接至植物中的活性启动子的化学调节转录阻遏物的多核苷酸；(ii)第二多核苷酸构建体，其为有效连接至第一阻抑型启动子的所关注多核苷酸；以及(iii)第三多核苷酸构建体，其为有效连接至第二阻抑型启动子的基因沉默构建体，其中所述基因沉默构建体编码降低化学调节转录阻遏物水平的沉默元件。在具体的实施例中，沉默元件是非自发的沉默元件。第一阻抑型启动子和第二阻抑型启动子各自包含至少一个操纵基因，其中所述化学调节转录阻遏物可以在不存在化学配体的情况下结合至每个操纵基因，因而在不存在化学配体的情况下抑制从第一阻抑型启动子和第二阻抑型启动子开始的转录，并且所述植物对所述化学配体耐受。随后使植物与有效量的化学配体接触，借此所述有效量的化学配体会导致(i)所关注的多核苷酸和沉默构建体的表达水平提高；以及(ii)化学调节转录阻遏物的水平下降。在非限制性实施例中，所述方法采用了包含至少一个与TetR多肽结合的四环素操纵基因的阻抑型启动子，和四环素化合物或其活性衍生物配体。在其他实施例中，所述方法采用了包含至少一个与具有tet操纵基因结合结构域的SuR多肽结合的四环素操纵基因序列的阻抑型启动子，和磺酰脲类化合物化学配体。
所述方法可采用任何化学配体，只要该化学配体与植物中含有的化学基因开关相容即可。化学配体包括但不限于四环素(在使用四环素转录阻遏物时)，或磺酰脲类化合物(在采用Su(R)时)。
如果化学调节转录阻遏物包含SuR，那么化学配体包含磺酰脲类化合物。磺酰脲类分子包含磺酰脲部分(-S(O)2NHC(O)NH(R)-)。在磺酰脲类除草剂中，磺酰脲部分的磺酰基端要么直接连接到通常被取代的环状基团或非环状基团，要么通过氧原子或任选取代的氨基或亚甲基连接到通常被取代的环状基团或非环状基团。在磺酰脲桥的另一端，氨基与杂环基连接，其中氨基可以具有取代基如甲基(R为CH3)而不是氢，所述杂环基通常是对称的嘧啶或三嗪环，且具有一个或两个取代基如甲基、乙基、三氟甲基、甲氧基、乙氧基、甲氨基、二甲氨基、乙氨基和卤素。磺酰脲类除草剂可为游离酸或盐的形式。为游离酸形式时，桥基上的磺酰胺氮未被去质子化(即-S(O)2NHC(O)NH(R)-)，而为盐形式时，桥基上的磺酰胺氮原子被去质子化，且存在阳离子，通常为碱金属或碱土金属阳离子，最常见的为钠或钾阳离子。磺酰脲类化合物包括例如以下类别的化合物：嘧啶基磺酰脲类化合物、三嗪基磺酰脲类化合物、噻二唑基脲类化合物和像抗糖尿病药物之类的药物，以及它们的盐和其他衍生物。嘧啶基磺酰脲类化合物的例子包括酰嘧磺隆、四唑嘧磺隆、苄嘧磺隆、氯嘧磺隆、环丙嘧磺隆、乙氧嘧磺隆、啶嘧磺隆、氟吡磺隆、氟啶嘧磺隆、甲酰胺磺隆、氯吡嘧磺隆、唑吡嘧磺隆、甲基二磺隆、甲磺胺磺隆、烟嘧磺隆、嘧苯胺磺隆、环氧嘧磺隆、氟嘧磺隆、吡嘧磺隆、砜嘧磺隆、甲嘧磺隆、磺酰磺隆、三氟啶磺隆，以及它们的盐和衍生物。三嗪基磺酰脲类化合物的例子包括氯磺隆、醚磺隆、胺苯磺隆、碘甲磺隆、甲磺隆、氟磺隆、噻吩磺隆、噻磺隆、醚苯磺隆、苯磺隆、氟胺磺隆、三氟甲磺隆，以及它们的盐和衍生物。噻二唑基脲类化合物的例子包括丁噻隆、磺噻隆、特丁噻草隆、噻氟隆、噻苯隆、嘧啶基磺酰脲类化合物(例如酰嘧磺隆、四唑嘧磺隆、苄嘧磺隆、氯嘧磺隆、环丙嘧磺隆、乙氧磺隆、啶嘧磺隆、氟吡磺隆、氟啶嘧磺隆、甲酰氨基嘧磺隆、氯吡嘧磺隆、唑吡嘧磺隆、甲基二磺隆、烟嘧磺隆、嘧苯胺磺隆、环氧嘧磺隆、氟嘧磺隆、吡嘧磺隆、砜嘧磺隆、甲嘧磺隆、磺酰磺隆和三氟啶磺隆)；三嗪基磺酰脲类化合物(例如氯磺隆、醚磺隆、胺苯磺隆、碘甲磺隆、甲磺隆、氟磺隆、噻吩磺隆、醚苯磺隆、苯磺隆、氟胺磺隆和三氟甲磺隆)；或噻二唑基脲类化合物(例如氯酯磺草胺、双氯磺草胺、双氟磺草胺、唑嘧磺草胺、磺草唑胺和五氟磺草胺)，以及它们的盐和衍生物。抗糖尿病药物的例子包括乙酰苯磺酰环己脲、氯磺丙脲、甲糖宁、甲磺氮草脲、格列甲嗪、格列齐特、格列本脲(优降糖)、格列喹酮、格列美脲，以及它们的盐和衍生物。在一些***中，SuR多肽特异性地结合到不止一种磺酰脲类化合物，所以，技术人员可以选择施用于植物的化学配体。
在一些例子中，磺酰脲类化合物选自氯磺隆、胺苯磺隆、甲磺隆、噻磺隆、甲嘧磺隆、苯磺隆、氯嘧磺隆、烟嘧磺隆和砜嘧磺隆。
在其他实施例中，磺酰脲类化合物为嘧啶基磺酰脲类化合物、三嗪基磺酰脲类化合物、噻二唑基脲类化合物、氯磺隆、胺苯磺隆、噻吩磺隆、甲磺隆、甲嘧磺隆、苯磺隆、氯嘧磺隆、烟嘧磺隆或砜嘧磺隆化合物。
在一些实施例中，磺酰脲类化合物是胺苯磺隆。在一些例子中，提供约0.001、0.002、0.003、0.004、0.005、0.006、0.007、0.008、0.009、0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.10、0.15、0.2、0.25、0.3、0.35、0.4、0.45、0.5、0.55、0.6、0.65、0.7、0.75、0.8、0.85、0.9、0.95、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20μg/ml或更大浓度的胺苯磺隆作为组织或根灌溉液。或者，可采用登记过的1％至400％标记施用率(取决于除草剂产品的类别)，以喷雾的形式提供SU化合物。在一些例子中，采用胺苯磺隆作为化学配体的SuR多肽包含的配体结合结构域与SEQIDNO：205-419的SuR多肽具有至少50％、60％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性，其中所述序列同一性是使用全局比对方法针对多肽的全长确定的。在一些例子中，所述全局比对方法为GAP法，该方法使用氨基酸序列同一性百分比和相似性百分比的默认参数，选用GAP权重8，长度权重2，和BLOSUM62评分矩阵。在一些例子中，所述多肽具有来自选自SEQIDNO：205-419的SuR多肽的配体结合结构域。在一些例子中，所述多肽选自SEQIDNO：205-419。在一些例子中，所述多肽由SEQIDNO：622-836的多核苷酸编码。
在其他实施例中，磺酰脲类化合物为氯磺隆。在一些例子中，以约0.001、0.002、0.003、0.004、0.005、0.006、0.007、0.008、0.009、0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.10、0.15、0.2、0.25、0.3、0.35、0.4、0.45、0.5、0.55、0.6、0.65、0.7、0.75、0.8、0.85、0.9、0.95、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20μg/ml的浓度提供氯磺隆。在一些例子中，采用氯磺隆作为化学配体的SuR多肽包含的配体结合结构域与SEQIDNO：14-204的SuR多肽具有至少50％、60％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性，其中所述序列同一性是使用全局比对方法针对多肽的全长确定的。在一些例子中，所述全局比对方法为GAP法，该方法使用氨基酸序列同一性百分比和相似性百分比的默认参数，选用GAP权重8，长度权重2，和BLOSUM62评分矩阵。在一些例子中，所述多肽具有来自选自SEQIDNO：14-204的SuR多肽的配体结合结构域。在一些例子中，所述多肽选自SEQIDNO：14-204。在一些例子中，所述多肽由SEQIDNO：431-621的多核苷酸编码。
所谓“接触”或“提供至植物或植物部分”，是指借以将有效量的化学配体暴露于植物、植物部分、植物组织或植物器官的任何方法。对目前实际应用来说，化学配体可以通过(例如)以下方式，在理想的时间施用至植物或植物部分：喷雾、雾化、喷粉、撒施、喷涂或倾倒、引入土壤内或土壤上、引入灌溉水中，通过种子处理或广泛应用或喷粉。
所谓“有效量”的化学配体，是指该化学配体的量足以使所关注的多核苷酸序列在期望的植物组织或植物部分中以理想水平表达。一般来讲，所述有效量的化学配体足以诱导或增强所关注的多核苷酸在期望的植物组织中表达，而不会显著影响植物/作物。如果化学配体为磺酰脲类化合物，那么所述有效量可能足以或可能不足以防治杂草。如果需要，可将所关注多核苷酸的表达设计成能够改变植物的表型和/或基因组。
在具体的实施例中，让有效量的化学配体与植物接触导致所关注多核苷酸在该植物中的表达较这种所关注多核苷酸在与有效量所述化学配体接触过但缺乏基因沉默构建体的植物中的表达在空间上或时间上延伸。在一些实施例中，所关注多核苷酸的这种在空间上或时间上延伸的表达通过向植物提供一定量化学配体实现，这种化学配体量少于向缺乏基因沉默构建体的植物提供的诱导所述所关注多核苷酸表达所需的这种化学配体的量。
所关注多核苷酸的在空间上延伸的表达可以是该多核苷酸在所述植物的至少一个未被有效量化学配体渗透的组织中的表达。在其他实施例中，向植物提供化学配体导致所关注多核苷酸的表达完全渗透植物的顶端分生组织，或完全渗透遍及整株植物。
在一个非限制性实施例中，所述方法采用了有效连接至所关注多核苷酸的第一阻抑型启动子，其中该第一阻抑型启动子包含至少一个、两个、三个或更多个操纵基因。沉默元件有效连接至包含至少一个、两个、三个或更多个操纵基因的第二阻抑型启动子；有效连接至化学调节转录阻遏物的启动子为第三阻抑型启动子，其中所述第三阻抑型启动子包含至少一个、两个、三个或更多个用于调节化学调节转录阻遏物的表达水平的操纵基因。
可将化学配体与佐剂或任何其他提供所需农业效用的试剂结合起来与植物接触。如本文所用，“佐剂”是添加到喷雾液或喷雾制剂中以便更改农用化学品的作用或喷雾液的物理特性的任何物质。参见例如载于WeedBiologyandManagement，ed.Inderjit(KluwerAcademicPublishers，TheNetherlands)(《杂草生物学与管理》，Inderjit编辑，荷兰克鲁维尔学术出版社)中的GreenandFoy(2003)“Adjuvants：ToolsforEnhancingHerbicidePerformance”(Green和Foy，2003年，“佐剂：用于提高除草剂性能的工具”)。佐剂可被分类或细分为活化剂、酸化剂、缓冲剂、添加剂、粘附剂、防絮凝剂、消泡剂、去沫剂、防冻剂、引诱剂、基本混合物、螯合剂、清洁剂、着色剂或染料、相容剂、助溶剂、偶联剂、作物油浓缩物、沉淀剂、去垢剂、分散剂、漂移控制剂、乳化剂、蒸发减弱剂、填充剂、肥料、泡沫标记、配制剂、惰性剂、湿润剂、甲基化种子油、高载荷COC、聚合物、改良植物油、渗透剂、防护剂、矿物油浓缩物、防腐剂、防雨剂、助留剂、增溶剂、表面活性剂、散播剂、粘性剂、粘展剂、增效剂、增稠剂、易位辅佐剂、紫外线防护剂、植物油、净水剂和润湿剂。
另外，本发明的方法可包括使用一种除草剂或多种除草剂的混合物，以及一种或多种其他杀虫剂、杀真菌剂、杀线虫剂、杀细菌剂、杀螨剂、生长调节剂、化学不育剂、化学信息素、驱避剂、引诱剂、信息素、取食刺激剂或其他生物活性化合物或昆虫病原细菌、病毒或真菌来形成多组分混合物，从而给予甚至更广谱的农业保护。
所述方法还可包括使用植物生长调节剂如艾维激素、N-(苯基甲基)-1H-嘌呤-6-胺、乙烯利、丙酰芸苔素内酯、赤霉酸、赤霉素A4和A7、超敏蛋白、助壮素水剂、调环酸钙盐、茉莉酸诱导体、复硝酚钠和抗倒酯，以及植物生长改良生物(例如蜡样芽孢杆菌(Bacilluscereus)菌株BP01)。
所述方法包括严格并/或特异地控制所关注多核苷酸的表达水平。调控的严格性/或特异性可受基因开关中选用的元件组合的影响。这些元件包括但不限于：有效连接至化学调节转录阻遏物的启动子、化学调节转录阻遏物、有效连接至所关注多核苷酸的阻抑型启动子、所关注的多核苷酸、沉默元件，以及有效连接至沉默元件的阻抑型启动子。通过选择施用化学配体的方法、剂量、条件和/或时序进一步控制化学基因开关的活性。在一些例子中，可以更严格地控制所关注多核苷酸的表达水平，可以控制所关注多核苷酸在各种组织或细胞中的表达水平，可以将所关注多核苷酸的表达局限于选择的组织或细胞类型、局限于特定的发育阶段、局限于特定的环境条件并/或局限于植物或其子代的特定代数。在一些例子中，阻遏物有效连接至组成型启动子。
在一些例子中，所述方法及组合物涉及的化学基因开关可能含有附加的元件。在一些例子中，一个或多个附加的元件的作用可能是，利用这些元件可以更严格地控制所关注多核苷酸的表达水平，可以控制所关注多核苷酸在各种组织或细胞中的表达水平，可以将所关注多核苷酸的表达局限于选择的组织或细胞类型、局限于特定的发育阶段、局限于特定的环境条件并/或局限于植物或其子代的特定代数。在一些例子中，这些元件包括位点特异性重组位点、位点特异性重组酶，或它们的组合。
在一些方法中，所述化学基因开关可包含以下组分：编码化学调节转录阻遏物的多核苷酸，连接至所关注多核苷酸的具有侧面与位点特异性重组位点相接的序列的启动子，有效连接至阻抑型启动子的沉默元件，和有效连接至位点特异性重组酶的阻抑型启动子，其中所述位点特异性重组酶特异地识别位点特异性重组位点并实现重组事件。在一些例子中，所述重组事件是切除其侧面与重组位点相接的序列。在某些情况下，所述切除让启动子和所关注的多核苷酸有效连接。在一些例子中，有效连接至所关注的多核苷酸的启动子是非组成型启动子，包括但不限于组织偏好的启动子、诱导型启动子、阻抑型启动子、发育阶段偏好的启动子，或具有这些特性中的不止一种的启动子。在一些例子中，主要调节所关注的多核苷酸在根、叶、茎、花、穗丝、花药、花粉、分生组织、种系、种子、胚乳、胚芽或子代中的表达。
VI.新型Su化学调节的转录调节因子以及采用它的组合物和方法
另外还提供了采用新型SU化学调节的转录调节因子的方法和组合物。这些新型多核苷酸的非限制性例子如SEQIDNO：1193-1380和1949-2029或其活性变体和片段所示；编码的多肽如SEQIDNO：1381-1568和2030-2110或其活性变体和片段所示。
本发明还涵盖了SU化学调节的转录调节因子多核苷酸和多肽的片段和变体。所谓“片段”，意指多核苷酸的一部分或由其编码的氨基酸序列从而由其编码的蛋白质的一部分。多核苷酸的片段可编码结合至包含操纵基因序列的多核苷酸的蛋白质片段，其中所述结合由磺酰脲类化合物调节。或者，可用作杂交探针的多核苷酸片段通常不编码保持生物活性的片段蛋白质。因此，核苷酸序列的片段可在至少约20个核苷酸、约50个核苷酸、约100个核苷酸直至编码SU化学调节的转录调节因子多肽的全长多核苷酸的范围内。
SU化学调节的转录调节因子多核苷酸的片段用于编码SU化学调节的转录调节因子的生物活性部分，该片段将编码至少50、75、100、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、410、415、420、425、430、435或440个连续氨基酸或直至存在于全长SU化学调节的转录调节因子多肽中的氨基酸总数。用作杂交探针或PCR引物的SU化学调节的转录调节因子多核苷酸的片段通常不必编码SU化学调节的转录调节因子蛋白质的生物活性部分。
因此，SU化学调节的转录调节因子多核苷酸的片段可以编码SU化学调节的转录调节因子多肽的生物活性部分，或在使用下文所公开的方法时可以是用作杂交探针或PCR引物的片段。SU化学调节的转录调节因子多肽的生物活性部分可通过分离SU化学调节的转录调节因子多核苷酸中的一者的一部分、表达SU化学调节的转录调节因子多肽的编码部分(例如，通过在体外重组表达)以及评估SU化学调节的转录调节因子蛋白质部分的活性来制备。作为SU化学调节的转录调节因子核苷酸序列的片段的多核苷酸包含至少16、20、50、75、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、800、900、1,000、1,100、1,200、1,300或1,400个连续核苷酸或直至本文所公开的全长SU化学调节的转录调节因子多核苷酸中存在的核苷酸数目。
“变体”蛋白旨在意指通过在天然蛋白质中的一个或多个内部位点处缺失(即，在5′和/或3′端截短)和/或缺失或添加一个或多个氨基酸和/或在天然蛋白质的一个或多个位点处置换一个或多个氨基酸而从该蛋白质衍生的蛋白质。所涵盖的变体蛋白质具有生物活性，即它们仍然具有天然蛋白的所需生物活性，即结合至包含操纵基因序列的多核苷酸，其中所述结合由磺酰脲类化合物调节。这类变体可例如由遗传多态性或由人为操纵而得到。
“变体”旨在意指实质上相似的序列。对于多核苷酸，变体包括具有5′和/或3′端处的缺失(即，截短)和/或天然多核苷酸内的一个或多个内部位点处的一个或多个核苷酸的缺失和/或添加，和/或天然多核苷酸中的一个或多个位点处的一个或多个核苷酸的置换的多核苷酸。如本文所用，“天然”多核苷酸或多肽分别包含天然存在的核苷酸序列或氨基酸序列。对于多核苷酸，保守变体包括由于遗传密码的简并性而编码SU化学调节的转录调节因子多肽之一的氨基酸序列的那些序列。诸如这些的天然存在的变体可用公知的分子生物学技术进行识别，例如用下文所述的聚合酶链反应(PCR)和杂交技术来识别。变体多核苷酸还包括通过合成获得的多核苷酸，如那些例如通过使用定点诱变或基因合成产生但仍编码SU化学调节的转录调节因子多肽的多核苷酸。
如通过本文别处所述的序列比对程序和参数所测定，SU化学调节的转录调节因子多肽(以及编码它的多核苷酸)的生物活性变体将与SEQIDNO：1381-1568和2030-2110中任一者的多肽或相对于任何SU化学调节的转录调节因子多肽具有至少约75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性。
在另外的实施例中，SU化学调节的转录调节因子蛋白质的生物活性变体可与该蛋白质相差200、190、180、170、160、150、140、130、120、110、100、90、80、70、60、50、40、30、25、20、19、18、17、16个氨基酸残基，少至1-15个氨基酸残基，少至1-10个氨基酸残基，如6-10个，少至10、9、8、7、6、5个，少至4、3、2个或甚至1个氨基酸残基。
SU化学调节的转录调节因子多肽及其活性变体和片段可以各种方式改变，包括氨基酸置换、缺失、截短和***。这类操纵的方法是本领域公知的。例如，HPPD蛋白的氨基酸序列变体和片段可通过在DNA中作出突变来制备。诱变和多核苷酸变更的方法是本领域熟知的。参见例如Kunkel(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA82：488-492(Kunkel，1985年，《美国国家科学院院刊》第82卷第488-492页)；Kunkeletal.(1987)MethodsinEnzymol.154：367-382(Kunkel等人，1987年，《酶学方法》第154卷第367-382页)；美国专利No.4,873,192；WalkerandGaastra，eds.(1983)TechniquesinMolecularBiology(MacMillanPublishingCompany，NewYork)(Walker和Gaastra编辑，1983年，《分子生物学技术》(纽约麦克米兰出版公司))以及其中引证的参考文献。有关不会影响所关注蛋白质的生物活性的适当氨基酸置换的指导可在以下文献所述的模型中找到：Dayhoffetal.(1978)AtlasofProteinSequenceandStructure(Natl.Biomed.Res.Found.，Washington，D.C.)(Dayhoff等人，1978年，《蛋白序列和结构图表集》(美国国家生物医学研究基金会，华盛顿特区))，将该文献以引用方式并入本文。保守置换，诸如将一个氨基酸用另一个具有相似性质的氨基酸进行交换，可能是最佳的。
显然，将在编码该变体的DNA中所作的突变一定不能将序列设置在阅读框外，并且优选将不会生成可能产生二级mRNA结构的互补区。参见EP专利申请公布No.75,444。
变体多核苷酸和蛋白还涵盖由诱变和重组方法(如DNA改组)获得的序列和蛋白。使用这样一种程序，可操纵一条或多条不同的SU化学调节的转录调节因子编码序列以产生具有所需特性的新SU化学调节的转录调节因子。以此方式，从一组相关的序列多核苷酸产生重组多核苷酸的文库，该相关的序列多核苷酸包含具有实质的序列同一性且可以在体外或体内发生同源重组的序列区。例如，使用该方法，可将编码所关注结构域的序列基序在本文所公开的SU化学调节的转录调节因子序列和其他已知的SU化学调节的转录调节因子基因之间进行改组，以获得编码具有改善的目的性质的蛋白质的新基因。这种DNA改组的策略是本领域已知的。参见例如Stemmer(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA91：10747-10751(Stemmer，1994年，《美国国家科学院院刊》第91卷第10747-10751页)；Stemmer(1994)Nature370：389-391(Stemmer，1994年，《自然》第370卷第389-391页)；Cramerietal.(1997)NatureBiotech.15：436-438(Crameri等人，1997年，《自然生物技术》第15卷第436-438页)；Mooreetal.(1997)J.Mol.Biol.272：336-347(Moore等人，1997年，《分子生物学杂志》第272卷第336-347页)；Zhangetal.(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.USA94：4504-4509(Zhang等人，1997年，《美国国家科学院院刊》第94卷第4504-4509页)；Cramerietal.(1998)Nature391：288-291(Crameri等人，1998年，《自然》第391卷第288-291页)以及美国专利No.5,605,793和No.5,837,458。
可将编码SU化学调节的转录调节因子多肽的多核苷酸及其活性变体和片段引入本文讨论的任何DNA构建体中，并可进一步有效连接至任何所关注启动子序列。可将这些构建体引入宿主如细菌、酵母、昆虫、哺乳动物或植物细胞中/在其中表达。这些方法的细节公开于本文别处，以可引入该序列的植物和植物细胞的详细列表的形式。因此，提供了包含新型SU化学调节的转录激活因子的各种宿主细胞、植物和植物细胞，包括但不限于，单子叶植物和双子叶植物如玉米、苜蓿、向日葵、芸苔属植物、大豆、棉花、红花、花生、高粱、小麦、粟、烟草等。
在一个实施例中，可将新型SuR设计为包含多种不同DNA结合结构域从而结合多种不同操纵基因并影响转录。在一个实施例中，SuR多肽包含特异性结合至四环素操纵基因的DNA结合结构域。因此，在具体的实施例中，SuR多肽或编码它的多核苷酸可包含DNA结合结构域，包括但不限于来自下述阻遏物的操纵基因DNA结合结构域：tet、lac、trp、phd、arg、LexA、phiChl阻遏物，lambdaC1和Cro阻遏物，phageX阻遏物，MetJ、phirltrro、phi434C1和Cro阻遏物，RafR、gal、ebg、uxuR、exuR、ROS、SinR、PurR、FruR、P22C2、TetC、AcrR、Betl、Bm3R1、EnvR、QacR、MtrR、TcmR、Ttk、YbiH、YhgD和muNer；Interpro家族中的DNA结合结构域(包括但不限于IPR001647、IPR010982和IPR01199)；或者上述DNA结合结构域的活性变体或片段。因此，可通过将SuR配体结合结构域融合至替代DNA结合结构域，来改变DNA的结合特异性。例如，可将来自D类TetR的DNA结合结构域融合至SuR配体结合结构域，生成特异性结合至包含D类四环素操纵基因的多核苷酸的SuR多肽。在一些例子中，可使用DNA结合结构域的变体或衍生物。例如，可使用来自TetR变体的特异性识别tetO-4C操纵基因或tetO-6C操纵基因的DNA结合结构域(Helbl&Hillen(1998)JMolBiol276：313-318(Helbl和Hillen，1998年，《分子生物学杂志》第276卷第313-318页)；Helbletal.(1998)JMolBiol276：319-324(Helbl等人，1998年，《分子生物学杂志》第276卷第319-324页))。
在一些例子中，化学调节转录阻遏物或编码它的多核苷酸包括含有配体结合结构域的SuR多肽，所述配体结合结构域与融合至异源操纵基因DNA结合结构域的野生型四环素阻遏蛋白配体结合结构域相比包含至少一个氨基酸置换，所述异源操纵基因DNA结合结构域特异性结合到包含操纵基因序列或其衍生物的多核苷酸，其中阻遏物-操纵基因结合受磺酰脲类化合物的存在与否调节。在具体的实施例中，异源操纵基因DNA结合结构域包含四环素操纵基因序列或其活性变体或片段，因此阻遏物-操纵基因结合受磺酰脲类化合物的存在与否调节。
在一些例子中，SuR多肽或编码它的多核苷酸在野生型四环素阻遏蛋白的配体结合结构域中包含一个氨基酸置换。在B类和D类野生型TetR蛋白质中，氨基酸残基6-52代表DNA结合结构域。蛋白质的其余部分参与配体结合及后续别构修饰。对于B类TetR，残基53-207代表配体结合结构域，而对于D类TetR，残基53-218代表配体结合结构域。在一些实施例中，SuR多肽在野生型TetR(B)蛋白质的配体结合结构域中包含至少一个氨基酸置换，而在另外的例子中，SuR多肽在SEQIDNO：1的野生型TetR(B)蛋白质的配体结合结构域中包含至少一个氨基酸置换。
在非限制性实施例中，SuR多肽与磺酰脲类化合物的平衡结合常数可能大于0.1nM但小于10μM。在一些例子中，SuR多肽与磺酰脲类化合物的平衡结合常数为至少0.1nM、0.5nM、1nM、10nM、50nM、100nM、250nM、500nM、750nM、1μM、5μM、7μM，但小于10μM。在其他例子中，SuR多肽与磺酰脲类化合物的平衡结合常数为至少0.1nM、0.5nM、1nM、10nM、50nM、100nM、250nM、500nM、750nM，但小于1μM。在一些实施例中，SuR多肽与磺酰脲类化合物的平衡结合常数大于0nM但小于0.1nM、0.5nM、1nM、10nM、50nM、100nM、250nM、500nM、750nM、1μM、5μM、7μM或10μM。在一些例子中，磺酰脲类化合物是氯磺隆、胺苯磺隆、甲磺隆、甲嘧磺隆、苯磺隆、氯嘧磺隆、烟嘧磺隆、砜嘧磺隆和/或噻吩磺隆。在另外的实施例中，如SEQIDNO：1381-1568和2030-2110所示的SuR具有对氯磺隆的平衡结合常数。在其他实施例中，如SEQIDNO：1381-1568和2030-2110所示的SuR具有对胺苯磺隆的平衡结合常数。
在一些例子中，SuR多肽与操纵基因序列的平衡结合常数大于0.1nM但小于10μM。在一些例子中，SuR多肽与操纵基因序列的平衡结合常数为至少0.1nM、0.5nM、1nM、10nM、50nM、100nM、250nM、500nM、750nM、1μM、5μM、7μM，但小于10μM。在一些例子中，SuR多肽与操纵基因序列的平衡结合常数为至少0.1nM、0.5nM、1nM、10nM、50nM、100nM、250nM、500nM、750nM，但小于1μM。在一些例子中，SuR多肽与操纵基因序列的平衡结合常数大于0nM但小于0.1nM、0.5nM、1nM、10nM、50nM、100nM、250nM、500nM、750nM、1μM、5μM、7μM或10μM。在一些例子中，操纵基因序列为Tet操纵基因序列。在一些例子中，Tet操纵基因序列为TetR(A)操纵基因序列、TetR(B)操纵基因序列、TetR(D)操纵基因序列、TetR(E)操纵基因序列、TetR(H)操纵基因序列或它们的功能衍生物。
各种化学配体(包括示例性磺酰脲类化学配体)及其应用水平和方式在本文别处进行了详细讨论。
采用SuR多肽的非限制性例子的各种方法如提交于2011年4月14日的美国实用专利No.13/086,765和美国专利申请公布2010-0105141所示，两者均以引用的方式全文并入本文。简而言之，进一步提供了调节植物中表达的方法。该方法包括(a)提供一种植物，该植物包含(i)包含编码化学调节转录阻遏物并有效连接至在所述植物中有活性的启动子的多核苷酸的第一多核苷酸构建体，和(ii)包含有效连接至第一阻抑型启动子的所关注多核苷酸的第二多核苷酸构建体；其中所述第一阻抑型启动子包含至少一个操纵基因，其中所述化学调节转录阻遏物可在不存在化学配体的情况下结合至所述操纵基因，从而在不存在所述化学配体的情况下从所述第一阻抑型启动子抑制转录，并且其中所述植物耐受所述化学配体；(b)为植物提供有效量的化学配体，进而所述所关注多核苷酸的表达增加。
VII.序列同一性
如本文所用，“序列同一性”或“同一性”在两个多核苷酸或多肽序列的情形中是指当在指定的比较窗口上进行比对以获得最大对应时两个序列中相同的残基。当序列同一性百分数针对蛋白使用时，认识到不相同的残基位置往往差别在于保守氨基酸置换，其中氨基酸残基由具有相似化学性质(例如电荷或疏水性)的其他氨基酸残基置换，因此不会改变分子的功能性质。当序列差别在于保守置换，则可以上调序列同一性百分数以校正置换的保守性质。差别在于这种保守置换的序列被称为具有“序列相似性”或“相似性”。作出这个调整的手段是本领域技术人员公知的。通常，这涉及将保守置换评定为部分错配而不是完全错配，从而增加序列同一性百分数。因此，例如，如果相同的氨基酸给予1分，非保守置换给予0分，则保守置换给予0至1之间的分数。保守置换的评分是例如在程序PC/GENE(美国加利福尼亚州山景城(MountainView，California)的Intelligenetics公司)中所执行那样进行计算。
本文所用的“序列同一性百分数”意指通过在比较窗口上比较两个最佳比对的序列所确定的数值，其中多核苷酸序列在该比较窗口中的部分与参比序列(不包含添加或缺失)相比可包含添加或缺失(即，空位)，以便两个序列的最佳比对。通过以下方式计算所述百分数：确定在两个序列中出现相同核酸碱基或氨基酸残基的位置的数目以得到匹配的位置的数目，将匹配的位置的数目除以比较窗口中位置的总数目，然后将结果乘以100以得到序列同一性百分数。
除非另有规定，否则本文提供的序列同一性/相似性值是指使用GAP版本10用以下参数获得的值：使用GAP权重50和长度权重3及nwsgapdna.cmp打分矩阵，获得核苷酸序列的同一性百分数和相似性百分数；使用GAP权重8和长度权重2及BLOSUM62打分矩阵或其任何等同程序，获得氨基酸序列的同一性百分数和相似性百分数。所谓“等同程序”意指任何这样的序列比较程序，其对于任何两条所考虑的序列，相比于GAP版本10所产生的对应的比对，能产生出具有相同的核苷酸或氨基酸残基匹配和相同的序列同一性百分数的比对。
所谓“片段”意指核苷酸序列可能在至少约10个、约15、20个核苷酸、约50个核苷酸、约75个核苷酸、约100个核苷酸、200个核苷酸、300个核苷酸、400个核苷酸、500个核苷酸、600个核苷酸、700个核苷酸和多至化学基因开关***中任何多核苷酸全长范围内的多核苷酸片段的一部分。测定所需多核苷酸或多肽的活性的方法在本文别处描述。
“变体”旨在意指实质上相似的序列。对于多核苷酸或多肽，变体包含在天然多核苷酸或多肽当中的一个或多个内部位点处的一个或多个核苷酸或氨基酸的缺失和/或添加，和/或在原多核苷酸或原多肽中的一个或多个位点处的一个或多个核苷酸或氨基酸的置换。通常，如通过本文别处所述的序列比对程序和参数所测定，本文采用的具有所需活性的特定多核苷酸或多肽的变体将具有与该特定多核苷酸或多肽至少约40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性。
“分离的”或者“纯化的”多核苷酸或多肽或者其生物活性片段或变体，当通过重组技术产生时基本上不含其他细胞物质或者培养基，或者当用化学法合成时基本上不含化学前体或者其他化学物质。优选地，“分离的”核酸不含在该核酸的来源生物体的基因组DNA中，天然处于该核酸旁侧的序列(即位于该核酸的5′和3′端的序列)(优选蛋白质编码序列)。出于本发明的目的，“分离的”在用来指核酸分子时不包括分离的染色体。例如，在多个实施例中，分离的核酸分子可含有少于约5kb、4kb、3kb、2kb、1kb、0.5kb或0.1kb的在该核酸的来源细胞的基因组DNA中天然处于该核酸分子旁侧的核苷酸序列。
非限制性实施例包括：
1.一种重组多核苷酸构建体，包括：
(a)有效连接至在植物中有活性的第一阻抑型启动子的所关注多核苷酸，其中所述第一阻抑型启动子包含至少一个操纵基因；
(b)编码化学调节转录阻遏物并有效连接至在所述植物中有活性的启动子的多核苷酸；以及
(c)有效连接至第二阻抑型启动子的基因沉默构建体，其中所述基因沉默构建体编码可减少所述化学调节转录阻遏物的沉默元件，其中所述第二阻抑型启动子包含至少一个操纵基因，并且其中所述化学调节转录阻遏物可在不存在化学配体的情况下结合至每一个所述操纵基因，从而在不存在所述化学配体的情况下抑制从所述第一阻抑型启动子和所述第二阻抑型启动子的转录。
2.实施例1所述的重组多核苷酸构建体，其中
(i)有效连接至所述所关注多核苷酸的所述第一阻抑型启动子包含三个所述操纵基因；并且/或者
(ii)有效连接至编码所述化学调节转录阻遏物的所述多核苷酸的所述启动子包含第三阻抑型启动子，其中所述第三阻抑型启动子包含至少一个操纵基因；并且/或者
(iii)有效连接至所述基因沉默构建体的所述第二阻抑型启动子包含三个所述操纵基因。
3.实施例2所述的重组多核苷酸构建体，其中有效连接至编码所述化学调节转录阻遏物的所述多核苷酸的所述第三阻抑型启动子包含两个操纵基因。
4.实施例2所述的重组多核苷酸构建体，其中有效连接至编码所述化学调节转录阻遏物的所述多核苷酸的所述第三阻抑型启动子包含三个操纵基因。
5.实施例1-4中任一项所述的重组多核苷酸构建体，其中编码所述化学调节转录阻遏物的所述多核苷酸是由磺酰脲类化合物调节的。
6.实施例5所述的重组多核苷酸构建体，其中所述磺酰脲类化合物包括嘧啶基磺酰脲类化合物、三嗪基磺酰脲类化合物、噻二唑基脲类化合物、氯磺隆、胺苯磺隆、噻吩磺隆、甲磺隆、甲嘧磺隆、苯磺隆、氯嘧磺隆、烟嘧磺隆或砜嘧磺隆化合物。
7.实施例1-4中任一项所述的重组多核苷酸构建体，其中编码所述化学调节转录阻遏物的所述多核苷酸是由四环素调节的。
8.实施例1-7中任一项所述的重组多核苷酸构建体，其中所述基因沉默构建体编码减少所述化学调节转录阻遏物的细胞非自发的沉默元件。
9.实施例1-7中任一项所述的重组多核苷酸构建体，其中所述沉默元件包括siRNA、反式作用siRNA(TAS)或amiRNA。
10.实施例1-7中任一项所述的重组多核苷酸构建体，其中所述沉默元件包含发夹RNA。
11.实施例10所述的重组多核苷酸构建体，其中包含沉默元件的所述基因沉默构建体依次包含第一片段、第二片段和第三片段，其中
(a)所述第一片段包含与编码所述化学调节转录阻遏物的多核苷酸具有至少90％的序列互补性的至少约20个核苷酸。
(b)所述第二片段包含足够长度的环，以允许沉默元件作为发夹RNA进行转录；并且，
(c)所述第三片段包含与第一片段具有至少85％的互补性的至少约20个核苷酸。
12.一种植物细胞，包括
(a)第一多核苷酸构建体，其包含有效连接至在所述植物细胞中有活性的第一阻抑型启动子的所关注多核苷酸，其中所述第一阻抑型启动子包含至少一个操纵基因；
(b)第二多核苷酸构建体，其包含编码化学调节转录阻遏物并有效连接至在所述植物细胞中有活性的启动子的多核苷酸；以及
(c)第三多核苷酸构建体，其包含有效连接至包含至少一个操纵基因的第二阻抑型启动子的基因沉默构建体，
其中(i)所述基因沉默构建体编码降低所述化学调节转录阻遏物水平的细胞非自发的沉默元件，(ii)所述第二阻抑型启动子包含至少一个调节基因沉默构建体表达的操纵基因，(iii)所述化学调节转录阻遏物可在不存在化学配体的情况下结合至所述操纵基因中的每一个，从而在不存在所述化学配体的情况下抑制所述第一阻抑型启动子和所述第二阻抑型启动子的转录，并且(iv)所述植物细胞对所述化学配体耐受。
13.实施例12所述的植物细胞，其中所述第一、第二和第三多核苷酸构建体包含于相同的重组多核苷酸上。
14.实施例12-13中任一项所述的植物细胞，其中
(i)有效连接至所述所关注多核苷酸的所述第一阻抑型启动子包含三个所述操纵基因；并且/或者
(ii)有效连接至编码所述化学调节转录阻遏物的所述多核苷酸的所述启动子包含第三阻抑型启动子，其中所述第三阻抑型启动子包含至少一个调节所述阻遏物表达的操纵基因；并且/或者
(iii)有效连接至所述基因沉默构建体的所述第二阻抑型启动子包含三个所述操纵基因。
15.实施例14所述的植物细胞，其中有效连接至编码所述化学调节转录阻遏物的所述多核苷酸的所述第三阻抑型启动子包含两个操纵基因。
16.实施例14所述的植物细胞，其中有效连接至编码所述化学调节转录阻遏物的所述多核苷酸的所述第三阻抑型启动子包含三个操纵基因。
17.实施例12-16中任一项所述的植物细胞，其中所述化学调节转录阻遏物具有包含磺酰脲类化合物的化学配体。
18.实施例17所述的植物细胞，其中所述磺酰脲类化合物包括嘧啶基磺酰脲类化合物、三嗪基磺酰脲类化合物、噻二唑基脲类化合物、氯磺隆、胺苯磺隆、噻吩磺隆、甲磺隆、甲嘧磺隆、苯磺隆、氯嘧磺隆、烟嘧磺隆或砜嘧磺隆化合物。
19.实施例12-16中任一项所述的植物细胞，其中所述化学调节转录阻遏物具有包含四环素的化学配体。
20.实施例12-19中任一项所述的植物细胞，其中所述基因沉默构建体编码减少所述化学调节转录阻遏物的细胞非自发的沉默元件。
21.实施例12-19中任一项所述的植物细胞，其中所述沉默元件包括siRNA、反式作用siRNA(TAS)或amiRNA。
22.实施例12-19中任一项所述的植物细胞，其中所述沉默元件包含发夹RNA。
23.实施例22所述的植物细胞，其中包含沉默元件的所述基因沉默构建体依次包含第一片段、第二片段和第三片段，其中
(a)所述第一片段包含与编码所述化学调节转录阻遏物的多核苷酸具有至少90％的序列互补性的至少约20个核苷酸。
(b)所述第二片段包含足够长度的环，以允许沉默元件作为发夹RNA进行转录；并且，
(c)所述第三片段包含与第一片段具有至少85％的互补性的至少约20个核苷酸。
24.一种植物，其包含实施例12-23中任一项所述的植物细胞。
25.实施例24所述的植物，其中所述植物是单子叶植物或双子叶植物。
26.实施例25所述的植物，其中所述植物是玉蜀黍、大麦、粟、小麦、水稻、高粱、黑麦、大豆、卡诺拉油菜、苜蓿、向日葵、红花、甘蔗、烟草、拟南芥(Arabidopsis)或棉花。
27.实施例24-26中任一项所述的植物，其中为所述植物提供有效量的化学配体会(i)提高所述所关注多核苷酸和所述沉默构建体的表达并且(ii)降低所述植物或其一部分中所述化学调节转录阻遏物的水平。
28.实施例27所述的植物，其中为所述植物提供有效量的所述化学配体，使得与所述所关注多核苷酸在已接触所述有效量的所述化学配体但缺少所述基因沉默构建体的植物中的表达相比，所述所关注多核苷酸在所述植物中的表达在空间上或时间上延伸。
29.实施例28所述的植物，其中所述所关注多核苷酸的所述在空间上或时间上延伸的表达通过如下方式在所述植物中实现：使提供的化学配体量少于在缺少所述基因沉默构建体的植物中诱导所述所关注多核苷酸表达所需的量。
30.实施例28所述的植物，其中所述所关注多核苷酸的所述在空间上延伸的表达包括在所述植物的未被有效量的所述化学配体渗透的至少一种组织中的表达。
31.实施例27-30中任一项所述的植物，其中提供所述化学配体导致了所关注多核苷酸在所述植物的顶端分生组织中表达的完全渗透。
32.实施例27-30中任一项所述的植物，其中提供所述化学配体导致了所述所关注多核苷酸在整个植物中表达的完全渗透。
33.实施例25-32中任一项所述的植物的转化种子，其中所述种子包含所述第一、第二和第三多核苷酸构建体。
34.实施例33所述的转化种子，其中所述第一、第二和第三多核苷酸构建体包含于相同的重组多核苷酸上。
35.一种调节植物中表达的方法，包括
(a)提供一种植物，其包含(i)第一多核苷酸构建体，包含编码化学调节转录阻遏物并有效连接至在所述植物中有活性的启动子的多核苷酸，(ii)第二多核苷酸构建体，包含有效连接至第一阻抑型启动子的所关注多核苷酸，和(iii)第三多核苷酸构建体，包含有效连接至第二阻抑型启动子的基因沉默构建体，
其中所述基因沉默构建体编码降低所述化学调节转录阻遏物水平的沉默元件，其中所述第一阻抑型启动子和所述第二阻抑型启动子各包含至少一个操纵基因，其中所述化学调节转录阻遏物可在不存在化学配体的情况下结合至所述操纵基因中的每一个，从而在不存在所述化学配体的情况下抑制从所述第一阻抑型启动子和所述第二阻抑型启动子的转录，并且其中所述植物对所述化学配体耐受；并且
(b)为植物提供有效量的化学配体由此(i)所述所关注多核苷酸和所述沉默构建体的表达升高并且(ii)所述化学调节转录阻遏物的水平降低。
36.实施例35所述的方法，其中为所述植物提供有效量的所述化学配体，使得与所述所关注多核苷酸在已接触所述有效量的所述化学配体但缺少所述基因沉默构建体的植物中的表达相比，所述所关注多核苷酸在所述植物中的表达在空间上或时间上延伸。
37.实施例36所述的方法，其中所述所关注多核苷酸的所述在空间上或时间上延伸的表达通过如下方式实现：使提供的化学配体量少于在缺少所述基因沉默构建体的植物中诱导所述所关注多核苷酸表达所需的量。
38.实施例36-37中任一项所述的方法，其中所述所关注多核苷酸的所述在空间上延伸的表达包括在所述植物的未被有效量的所述化学配体渗透的至少一种组织中的表达。
39.实施例35-38中任一项所述的方法，其中提供所述化学配体导致所关注多核苷酸在所述植物的顶端分生组织中的表达的空间完全渗透。
40.实施例35-38中任一项所述的方法，其中提供所述化学配体导致所述所关注多核苷酸在整个植物中的表达的完全渗透。
41.实施例35-40中任一项所述的方法，其中所述化学配体通过喷雾提供。
42.实施例35-40中任一项所述的方法，其中所述化学配体通过种子处理提供。
43.实施例35-42中任一项所述的方法，其中有效连接至所述所关注多核苷酸的所述第一阻抑型启动子包含三个所述操纵基因，其中有效连接至所述化学调节转录阻遏物的所述启动子包含第三阻抑型启动子，其中所述第三阻抑型启动子包含至少一个操纵基因，并且其中有效连接至所述基因沉默构建体的所述第二阻抑型启动子包含三个所述操纵基因。
44.实施例43所述的方法，其中有效连接至所述化学调节转录阻遏物的所述第三阻抑型启动子包含两个操纵基因。
45.实施例43所述的方法，其中有效连接至所述化学调节转录阻遏物的所述第三阻抑型启动子包含三个操纵基因。
46.实施例35-45中任一项所述的方法，其中所关注多核苷酸的表达改变植物的表型。
47.实施例35-45中任一项所述的方法，其中所关注多核苷酸的表达改变植物的基因型。
48.实施例35-47中任一项所述的方法，其中所述化学调节转录阻遏物具有包含磺酰脲类化合物的化学配体。
49.实施例48所述的方法，其中所述磺酰脲类化合物包括嘧啶基磺酰脲类化合物、三嗪基磺酰脲类化合物、噻二唑基脲类化合物、氯磺隆、胺苯磺隆、噻吩磺隆、甲磺隆、甲嘧磺隆、苯磺隆、氯嘧磺隆、烟嘧磺隆或砜嘧磺隆化合物。
50.实施例35-47中任一项所述的方法，其中所述化学调节转录阻遏物具有包含四环素的化学配体。
51.实施例35-47中任一项所述的方法，其中所述基因沉默构建体编码减少所述化学调节转录阻遏物的细胞非自发的沉默元件。
52.实施例35-47中任一项所述的方法，其中所述沉默元件包括siRNA、反式作用siRNA(TAS)或amiRNA。
53.实施例35-47中任一项所述的方法，其中所述沉默元件包含发夹RNA。
54.实施例53所述的方法，其中包含沉默元件的所述基因沉默构建体依次包含第一片段、第二片段和第三片段，其中
(a)所述第一片段包含与所述化学调节转录阻遏物具有至少90％的序列互补性的至少约20个核苷酸。
(b)所述第二片段包含足够长度的环，以允许沉默元件作为发夹RNA进行转录；并且
(c)所述第三片段包含与第一片段具有至少85％的互补性的至少约20个核苷酸。
55.实施例35-54中任一项所述的方法，其中所述沉默元件通过所述植物的维管***转运。
表1A.序列表中提供的化学基因开关组分的非限制性实例。
SEQ ID NO 简要说明
1 TetR(B)的氨基酸序列
2 SEQ ID NO：1的变体的氨基酸序列
3-13 一些Su(R)多肽的氨基酸序列
14-204 可使用胺苯磺隆作为化学配体的Su(R)多肽的氨基酸序列
205-419 可使用氯磺隆作为化学配体的Su(R)多肽的氨基酸序列
412-419 具有反向阻遏物活性的Su(R)多肽的氨基酸序列
420-430 编码SEQ ID NO：3-13的核酸序列
431-621 编码SEQ ID NO：431-621的核酸序列
622-836 编码SEQ ID NO：405-419的核酸序列
837-840 寡核苷酸
841-847 各种构建体
848 Tet操纵基因序列
849 植物肌动蛋白启动子
850 香蕉条纹病毒启动子(BSV)
851 紫茉莉花叶病毒启动子
852 增强的MMV启动子(dMMV)
853 植物P450启动子(MP 1)
854 延伸因子1a(EFIA)启动子
855 具有tet op的植物肌动蛋白启动子(actin/Op)
856 具有tet op的香蕉条纹病毒启动子(BSV/Op)
857 具有tet op的紫茉莉花叶病毒启动子(MMV/Op)
858 具有tet op的增强的MMV启动子(dMMV/Op)
859 具有tet op的植物P450启动子(MP 1/Op)
860 具有tet op的延伸因子1a启动子(EF1A/Op)47 -->
861 具有ADH1内含子的35S CaMV启动子
862 经tet操纵基因工程改造的35SCaMV启动子
表1B.序列表中提供的化学基因开关组分的非限制性实例。
提供以下实例以描述本发明的一些实施例，但不应理解为限定或以其他方式限制任何方面、实施例、元件或它们的任意组合。任何方面、实施例、元件或它们的任意组合的修改对本领域技术人员而言是显而易见的。
实验
实例1.使用靶向磺酰脲类阻遏物的受磺酰脲类阻遏物控制的siRNA来扩增和提高所诱 导信号的空间分布
在多细胞生物体中任何化学诱导体系的主要局限之一是(由于变化的运动或新陈代谢)诱导物在所有组织中的渗透和均匀分布。结果是所关注组织或细胞类型中的靶基因诱导可能不均匀(或缺失)。为了解决这一潜在问题，期望提供另外的遗传因子来影响去阻遏的扩散。siRNA已被广泛应用于真核***中以降低靶基因表达。具体地讲，植物具有siRNA响应可全身进行的增加的可能性(Palauquietal.(1997)EMBOJ.16：4738-4745(Palauqui等人，1997年，《欧洲分子生物学组织杂志》第16卷第4738-4745页)；Voinnetetal.(1997)Nature389：553(Voinnet等人，1997年，《自然》第389卷第553页))，取决于生成的沉默信号的类型(FelipeFenselaudeFelippesetal.(2010)NucleicAcidsResearch1-10(FelipeFenselaudeFelippes等人，2010年，《核酸研究》第1-10页))。
因此，在使用基于SuR的开关的植物中提高信号空间扩散的非常适合的方法为，通过使生成信号的移动siRNA去阻遏来控制阻遏物转录物稳定性，所述信号靶向携带阻遏物编码区的转录物的任何或所有部分。通过siRNA自动诱导调节阻遏物的表达已在哺乳动物细胞培养物中得到证实(Greberetal.(2008)NucleicAcidsResearch36：16(Greber等人，2008年，《核酸研究》第36卷第16页))。在上面的例子中，已显示针对阻遏物的siRNA诱导大大延长了去除配体后诱导状态的时间。然而，这一研究仅限于组织培养细胞，并未延伸至整个动物模型，在此模型中诱导物在施用后不太可能接触所有细胞类型。此外，与植物不同，高等动物是否***性地传送siRNA信号还是未知的，因此空间增强诱导方面可能无法适用于动物***。
如图1中举例说明，可通过将具有tetO控制的启动子的表达盒添加至SU开关来测试这一方法，所述启动子连接至靶向阻遏物转录物的siRNA(siRNArep；图2)。因为siRNArep可导致沉默信号全身扩散，去阻遏将远远超出诱导物范围扩散。因此这一方法的非细胞自发特征将其与其他可能技术明确区分开来，以延长并强化去阻遏。
为了测试这一理论，创建了携带如图4所示的构建体的可诱导烟草株系。图4所示的构建体的汇总提供于下表29中。所有载体包含右边界(RB)近端35S：：3xtetO-DsRED-UBQ3可诱导报告基因盒、35S：：1xtetO-EsR(L13-32)-UBQ14阻遏物盒及SAMS-HRA-ALS左边界(LB)近端选择性标记。***的阻遏物盒上游(pHD1194-1196)或下游(pHD1196-1199)为MMV：：3xOp-siRNArep-Pin2盒，由全长阻遏物编码区的反向重复(无ATG-pHD1194和1197)组成，或限于通过内含子间隔区连接的SU阻遏物编码区的5′(pHD1195&1198)或3′(pHD1196&1199)两半。选择MMV：：tetO启动子以便不引起控制靶转基因表达的35S：：tetO启动子的沉默。在这一具体例子中，间隔区是马铃薯ST-LS1基因内含子IV2(含有内含子的标记基因的构建：在转基因植物中剪接内含子以及其在监测农杆菌介导的植物转化的早期事件中的用途。Vancanneytetal.(1990)MolGenGenet.220(2)：245-50(Vancanneyt等人，1990年，《分子遗传学与普通遗传学》第220卷第2期，第245-250页))。将载体转移到根瘤农杆菌(A.tumefaciens)EHA105中并通过农杆菌共培养转化至野生型烟草(Nicotianatabacum)的叶外植体中，随后使用50ppb灭草烟(乙酰乳酸合酶的抑制剂，而非SuR***的诱导物)筛选HRA标记基因的存在。对来自每一转化体的切下的双份叶盘，筛选其在50ppb诱导物胺苯磺隆-甲酯存在和不存在的情况下，控制的dsRED基因表达(图5)。使来自每一诱导事件的T1种子发芽并在滤纸上接触含有1ppm胺苯磺隆的0.5xMS琼脂。然后将每一事件中九个完全去阻遏的DsRED阳性幼苗移植到土壤中，并且通过四片叶子的发育阶段监控其荧光表型。使用携带pHD1180(与载体pHD1194-1199同基因，但不具有siRNA盒)的可诱导烟草事件作为对照。结果表明，虽然pHD1180事件中DsRED表达信号适中并随时间减弱，但在含有MMV：：tetO-siRNArep盒的株系中，DsRED强度水平较高并随时间仍保持如此(图6)。
在第二个实验中，将自动诱导的株系pHD1198-2的T1种子种植在土壤中，土壤用水处理或一次性施用在水中补充至1/16倍推荐喷雾速率浓度的20mlMuster(胺苯磺隆-甲基的商品形式，杜邦公司(DuPont))。然后在植物的整个生命周期中密切关注DsRED表型。结果表明，在经Muster处理的植物中，在植物的整个生命周期及除花粉(35S启动子在花粉中沉默)外的所有被检测组织中DsRED被完全激活，但其在仅用水处理的对照植物中沉默(图7)。最明显的是，DsRED表型在种子发育过程中一直存在。
表29.
质粒 盒 元件 质粒中的Nt位置
pHD1194(SEQ ID NO：2113) 盒A
35S：：3xOp 177-623
DsRED 699-1373
UBQ3 1392-2500
盒B
MMV：：3xOp 2600-2929
siRNA rep-FL 2936-4273
PinII 4380-4690
盒C
35S：：1xOp 4697-5218
EsR(L13-23) 5219-5839
UBQ14 5883-6784
盒D
SAMS 6906-8215
HRA 8216-10186
ALS 10187-10837
pHD1195(SEQ ID NO：2114)
盒A
35S：：3xOp 177-623
DsRED 699-1373
UBQ3 1392-2500
盒B
MMV：：3xOp 2600-2929
siRNA rep-5’ 2936-3759
PinII 3766-4076
盒C
35S：：1xOp 4083-4604
EsR(L13-23) 4605-5225
UBQ14 5269-617065 -->
盒D
SAMS 6292-7601
HRA 7602-9572
ALS 9573-10223
pHD1196(SEQ ID NO：2115)
盒A 35S：：3xOp 177-623
DsRED 699-1373
UBQ3 1392-2500
盒B
MMV：：3xOp 2600-2929
siRNA rep-3’ 2936-3755
PinII 3762-4072
盒C
35S：：1xOp 4079-4600
EsR(L13-23) 4601-5221
UBQ14 5265-6166
盒D
SAMS 6288-7597
HRA 7598-9568
ALS 9569-10219
phD1197SEQ ID NO：2116)
盒A
35S：：3xOp 177-623
DsRED 699-1373
UBQ3 1392-2500
盒B
35S：：1xOp 2590-3111
EsR(L13-23) 3112-3732
UBQ14 3776-4677
盒C
MMV：：3xOp 4708-5037
siRNA rep-FL 5044-6481
PinII 6488-6798
盒D
SAMS 6922-8231
HRA 8232-10202
ALS 10203-10853
phD1198SEQ ID NO：2117) 66 -->
盒A 177-623
35S：：3xOp 699-1373
DsRED 1392-2500
UBQ3
盒B
35S：：1xOp 2590-3111
EsR(L13-23) 3112-3732
UBQ14 3776-4677
盒C
MMV：：3xOp 4708-5037
siRNA rep-5’ 5044-5867
PinH 5874-6184
盒D
SAMS 6308-7617
HRA 7618-9588
ALS 9589-10239
phD1199SEQ ID N0：2118)
盒A
35S：：3xOp 177-623
DsRED 699-1373
UBQ3 1392-2500
盒B
35S：：1xOp 2590-3111
EsR(L13-23) 3112-3732
UBQ14 3776-4677
盒C
MMV：：3xOp 4708-5037
siRNA rep-3’ 5044-5863
PinII 5870-6180
盒D
SAMS 6304-7613
HRA 7614-9584
ALS 9585-10235
实例2.使用靶向磺酰脲类阻遏物的受磺酰脲类阻遏物控制的miRNA来扩增和提高所诱 导信号的空间分布。
为了表明靶向阻遏蛋白的amiRNA的存在可在诱导后提高表达，制备了两个构建体。第一个构建体即对照构建体pPHP46916(10，904bp)(SEQIDNO：2111)包含以下盒：其中大豆S腺苷甲硫氨酸启动子有效连接至具有HrA突变的大豆乙酰乳酸合酶基因、具有HrA突变的大豆乙酰乳酸合酶基因有效连接至大豆乙酰乳酸合酶终止子的盒A(此盒用作植物转化过程中的选择性标记；位置81-4062)；接着是其中T7启动子有效连接至潮霉素磷酸转移酶基因、潮霉素磷酸转移酶基因有效连接至T7终止子的盒B(此盒用作大肠杆菌中的选择性标记，位置5448-6586)；接着是其中具有三个嵌入的TET操纵基因拷贝的花椰菜花叶病毒35S启动子有效连接至具有马铃薯LSI内含子的DS-REDExpress、DS-REDExpress有效连接至花椰菜花叶病毒35S终止子的盒C(位置6862-8455)；接着是其中大豆延伸因子1a2启动子有效连接至阻遏蛋白ESR(L10-B7)、阻遏蛋白ESR(L10-B7)有效连接至nos终止子的盒D(位置8474-10893)。第二个构建体即实验构建体pPHP46864(11，868bp)(SEQIDNO：2112)是完全相同的，不同的是在马铃薯LS1内含子内的Mfel位点嵌入有含有大豆微RNA前体159的964bp盒，所述大豆微RNA前体159含有靶向阻遏蛋白的微RNA。微RNA前体及其设计过程在美国2011-0091975中进行了阐述，其内容以引用方式全文并入本文。
表28.
从两个质粒制备了包含除细菌选择外所有上述盒的DNA片段，并将其用于转化大豆，如实例3所述。选择植物并获得T0代成株期的叶盘。使叶盘在室温下浮于含有0、0.05ppm或0.5ppm胺苯磺隆的组织培养基中3-4天，并在荧光显微镜下观察。观察了遗传上显著不同事件中的一系列表型，所述事件包括渗漏事件(即未诱导情况下叶盘表现出DS-RED表达)和无法被诱导的叶盘(即叶盘根本不会表现出DS-RED表达)。然而，在所有能够被诱导的叶盘中，来自实验植株的叶盘呈现更平滑、更均匀的表达模式。
使T0植株成熟并收集种子。该T1种子吸入1ppm氯磺隆并种植于生长室中，两周后(第一个三叶叶片刚刚显现)在荧光显微镜下检查。某些植物显示DS-red阳性。对于对照植物，未检查到存在于根、茎或子叶的DS-red信号。对于实验植物，仅可在根、茎观察到弱DS-red信号，在子叶中观察到甚至更弱的信号。这表明靶向阻遏物的amiRNA的存在增加了报告基因的强度和范围。
氯磺隆作为配方的一部分时效果最好。正因为如此，我们使用了市售产品TevlarXP(75％氯磺隆)。种植T1种子并浇水约10天，然后在第11天和第14天用0.2克/升的TevlarXP浇灌。第18天在荧光显微镜下观察植物。在源自实验质粒的植株中，除子叶外，在整个幼苗中存在强效诱导，而源自对照质粒的植株仅在根中表现出少量诱导。使植株再生长两周，仅浇水(无Tevlar)，与仅在根中表现出少量或无表达的对照植株相比，实验植株继续在整个植物中表现出强烈诱导模式。这表明靶向阻遏物的amiRNA的存在增加了报告基因的强度和范围。
实例3使用大豆表达载体进行体细胞大豆胚培养物的制备和模型***转化然后进行植 株再生
培养条件：
将大豆胚发生悬浮培养物(栽培变种Jack)在150rpm、26℃的旋转摇荡器上保持在35mL液体培养基SB196(下文)中，该旋转摇荡器具有冷白色荧光灯，光周期为16：8小时白天/黑夜，光强度为60-85μE/m2/s。每7天至两个星期，通过将大约35mg的组织接种到35ml的新鲜液体SB196中，对培养物进行分培(优选的分培间隔为每7天)。
使用大豆表达质粒通过粒子枪轰击方法(Kleinetal.，Nature327：70(1987)(Klein等人，《自然》第327卷第70页，1987年))转化大豆胚发生悬浮培养物，并使用DuPontBiolisticPDS1000/HE仪器(氦改型)进行所有转化。
大豆胚发生悬浮培养物的引发：
每月两次对大豆培养物进行引发，每次引发之间间隔5-7天。种植45-55天后从可用大豆植株中挑取具有未成熟种子的豆荚。从豆荚中除去种子并放入无菌绛红色盒子中。将大豆种子在含有1滴象牙皂的5％Clorox溶液(即，95ml的高压灭菌蒸馏水加5mlClorox和1滴皂，充分混合)中振摇15分钟，对它们进行灭菌。用2个1升瓶子的无菌蒸馏水清洗种子，将小于4mm的种子各自放在单独的显微镜载玻片上。切开种子的小的一端，将子叶挤出种皮。当制备用于生产转化的培养物时，将子叶转移到含有SB1培养基的平板上(每个平板25-30个子叶)。用纤维带包住平板并使用冷白色荧光灯于26℃下保持八周，光周期为16：8小时白天/黑夜、光强度为60-80μE/m2/s，4周更换培养基。当制备用于模型***实验的培养物时，将子叶转移到含有SB199培养基的平板上(每个平板25-30个子叶)2周，然后转移到SB1上2-4周。光照和温度条件与上述相同。在SB1培养基中温育后，切取次生胚并放入SB196液体培养基中7天。
用于轰击的DNA的制备：
将含有所关注基因和选择性标记基因的完整质粒或者DNA质粒片段用于轰击。通过消化质粒的凝胶分离获得来自大豆表达质粒的片段。在每种情况下，在0.5mL下述特定酶混合物中使用100μg的质粒DNA。使用溶于NEBuffer4(20mM三羟甲基氨基甲烷醋酸盐、10mM乙酸镁、50mM乙酸钾、1mM二硫苏糖醇，pH7.9)的AscI(100单位)、100μg/ml的BSA和5mMβ巯基乙醇在37℃下消化质粒1.5h。通过在1％SeaPlaqueGTG琼脂糖(生物惠特克分子应用(BioWhitakerMolecularApplications))上进行凝胶电泳来分离所得的DNA片段，并将含有基因盒的DNA片段从琼脂糖凝胶上切下来。用GELase消化酶按生产商的方案从琼脂糖纯化DNA。
将含有3mg金粒子(3mg金)的50μL无菌蒸馏水等分试样加到30μL10ng/μLDNA溶液(如本文所述制备的完整质粒或DNA片段)、25μL5MCaCl2和20μL0.1M亚精胺。将混合物在涡旋摇荡器的水平3上振摇3分钟，然后在台式微量离心机中离心10秒钟。移除上清液，然后使用400μL的100％乙醇洗涤并再次简单离心。移除400μL乙醇并将沉淀重悬于40μL的100％乙醇中。向BiolisticPDS1000/HE仪碟的每个飞碟(flyingdisk)分配5μL的DNA悬浮液。每个5μL等分试样含有大约0.375mg金/次轰击(例如每碟)。
对于模型***转化，除少数轻微改变外，方案相同(即，将1mg金粒子加至5μL1μg/μL的DNA溶液中，使用50μL2.5MCaCl2并且沉淀最终重悬于85μL100％乙醇中，因此每次轰击得到0.058mg金粒子)。
组织制备和用DNA轰击：
将大约150-200mg的7日龄胚发生悬浮培养物放在空的无菌60×15mm培养皿中，用塑料网盖住培养皿。将室抽至27-28英寸汞柱的真空，在设定为1100PSI的膜破裂压力下，每板组织被轰击1至2次。将组织放在离阻滞网/停止网大约3.5英寸处。除使用100-150mg胚发生组织、破裂压力设定为650PSI并将组织放在离阻滞网大约2.5英寸处外，模型***转化条件均相同。
转化胚的选择：
用潮霉素(当使用潮霉素B磷酸转移酶(HPT)基因作为选择性标记时)或者氯磺隆(当使用乙酰乳酸合酶(ALS)基因作为选择性标记时)选择转化胚。
在轰击后，将组织放入新鲜的SB196培养基中，如上所述进行培养。轰击六至八天后，根据使用的选择性标记，将SB196替换为含有30mg/L潮霉素或100ng/mL氯磺隆的新鲜SB196。该选择性培养基每周更换。在选择后四至六个星期，观察到绿色的转化组织从未转化的坏死胚发生簇中生长出来。
胚成熟：
对于制备转化，移取分离的绿色组织，接种到多孔板中，以产生新的克隆繁殖的转化胚发生悬浮培养物。将转化的胚发生簇在SB196中在冷白色荧光灯泡(菲利普冷白色EconowattF40/CW/RS/EW(PhillipscoolwhiteEconowattF40/CW/RS/EW))和Agro(菲利普F40Agro(PhillipsF40Agro))灯泡(40瓦)下于26℃在多孔板中培养四至六周，光周期为16：8小时，光强度为90-120μE/m2s。这段时间后，将胚簇移取到固体琼脂培养基SB166达一至两周，然后在SB103培养基中继代培养3-4周使胚成熟。在含SB103的平板上成熟后，将单独的胚从簇中移除、干燥并筛选所需表型。
对于模型***转化，胚在大豆组织分化和成熟液体培养基(SHaM液体培养基；Schmidtetal.，CellBiologyandMorphogenesis24：393(2005)(Schmidt等人，《细胞生物学和形态发生》第24卷第393页，2005年))中使用改进的步骤成熟。简而言之，如上所述，在SB196中选择4周后，将胚簇移取到装于250mL锥形瓶中的35mLSB228(SHaM液体培养基)中。在130rpm的旋转摇荡器上并在26℃下使用冷白色荧光灯将组织保持在SHaM液体培养基中两周直至胚成熟，其中光周期为16：8小时白天/黑夜，光强度为60-85μE/m2/s。在SHaM液体培养基中生长两周后的胚与SB166/SB103中培养5-8周的胚的尺寸和脂肪酸含量相当。
1.培养基配方：
2.SB196-FNLite液体增殖培养基(每升)
FNLite原液
7.SB1固体培养基(每升)
1包装MS盐(Gibco/BRL-目录号11117-066)
1mlB5维生素1000X原液
31.5g葡萄糖
2mL2，4-D(20mg/L终浓度)
pH5.7
8gTC琼脂
SB199固体培养基(每升)
1包装MS盐(Gibco/BRL-目录号11117-066)
1mlB5维生素1000X原液
30g蔗糖
4ml2，4-D(40mg/L终浓度)
pH7.0
2gGelrite
8.SB166固体培养基(每升)
1包装MS盐(Gibco/BRL-目录号11117-066)
1mlB5维生素1000X原液
60g麦芽糖
750mgMgCl2六水合物
5g活性炭
pH5.7
2ggelrite
SB103固体培养基(每升)
1包装MS盐(Gibco/BRL-目录号11117-066)
1mlB5维生素1000X原液
60g麦芽糖
750mgMgCl2六水合物
pH5.7
2ggelrite
SB71-4固体培养基(每升)
1瓶含蔗糖的甘博格B5盐(Gibco/BRL-目录号21153-036)
pH5.7
5gTC琼脂
2，4-D原液
从Phytotech获得的预制溶液，目录号D295-浓度1mg/mL
B5维生素原液(每100mL)
以等分试样保藏在-20℃下
10g肌醇
100mg烟酸
100mg盐酸吡哆醇
1g硫胺素
如果溶液没有足够快地溶解，通过热搅拌板施加低水平的热量。
SB228-大豆组织分化和成熟液体培养基(SHaM)(每升)
调整体积至900mL
pH5.8
高压灭菌
添加至冷却的培养基(≤30℃)：
*谷氨酰胺(终浓度30mM)4％110mL
*注意：添加谷氨酰胺后最终体积将为1010mL。
由于谷氨酰胺降解相对较快，可能优选的是使用培养基前即时添加。添加谷氨酰胺2周后失效；不包含谷氨酰胺的基础培养基可保存更久。
用于SHAM的FN-liteMacro10X-原液＃1(每升)
MSMicro1000X-原液#2(每升)
FeEDTA100X-原液#3(每升)
Na2EDTA*(钠EDTA)3.73g
FeSO4*7H2O(七水硫酸亚铁)2.78g
*加入铁之前必须将EDTA完全溶解。
定容
溶液是感光的。试剂瓶应包在金属箔中以避光。
高压灭菌
Ca100X-原液#4(每升)
CaCl2*2H2O(二水氯化钙)44g
定容
高压灭菌
B5维生素1000X-原液#5(每升)
4％谷氨酰胺-原液#6(每升)
DDI水加热至30℃900mL
L-谷氨酰胺40g
缓慢添加，同时搅拌，并施加低热量。
不要超过35℃。
定容
过滤灭菌
冷冻保存*
*注意：在31℃水浴暖解冻原液至晶体完全溶解。
大豆体细胞胚再生成植株：
为了从胚发生悬浮培养物获得整株植物，组织必须进行再生。如上所述，使胚成熟。在SB103培养基中继代培养3周后，可将单独胚从簇中移除，并筛选所需表型，如实例1或2所述。应指出的是，在这个阶段可筛选任何由所关注基因的表达所产生的可检测表型。
将各个成熟的胚放入空的小平皿(35×10mm)中大约4至7天，对它们进行干燥。将各板用纤维带密封(产生小的湿度腔室)。将经干燥的胚种植到SB71-4培养基中，让它们在与如上所述相同的培养条件下萌发。从萌发培养基移取萌发的小植株，用水彻底清洗，然后种植在24孔托盘(packtray)中的Redi-Earth中，用透明塑料罩盖住。2周后，将罩移开，使植物强壮一个星期。如果小植株看起来强壮，将它们移植到10英寸Redi-Earth盘，每盘最多3株小植株。10-16周后，收获成熟的种子，破成碎片并分析。
实例4.进一步改组以得到改善的胺苯磺隆阻遏物变体。
a.第四轮改组
根据TetR(B)同源物在13个先前未测试位置(除在23个先前改组位置的所选择置换的重新测试外)的***发育比对设计了第四轮改组。此外，与野生型TetR对齐的六个半胱氨酸残基随与***发育相关的可用多样性而变化。这使得改组残基总数目达到42。为了筛选这一多样性，构建了两个文库，L10和L11(表5)。正如对L4所做的，将多样性(diversity)连同代表母本克隆L7-A11的寡核苷酸滴定至合成的寡核苷酸混合物中，以降低每一单独克隆的复杂性(表6A-C)。
表5.文库L10至L15的多样性汇总。
表6A.用于组装和拯救文库L10和L11的寡核苷酸。
表6B
表6C
文库组装和克隆后，从约20,000个阻遏物阳性克隆中识别出大约100个L10和130个L11推定命中。通过在含有0、1.5和7ppb胺苯磺隆的M9X-gal指示剂(提交于2011年4月14日的美国实用专利申请No.13/086,765和美国专利申请公布2010-0105141，两者全文均以引用方式并入本文)平板上的相对菌落颜色，按阻遏物和配体活性将克隆重新排列和评级。对每个文库中所有推定命中和180个随机克隆进行测序并比较数据集，以创建序列活性关系(表5)。文库10结果表明，P69L、E73A和N82K置换偏倚于改善的克隆，由于包含这些残基的命中与随机选择群体相比分别为31％比11％、31％比10％、28％比4％及85％比42％，所以就多样性而言强烈选择C144。虽然I57F较少掺入文库中(随机群体中未掺入)，但仍在5％的命中群体中发现-大部分与顶部配体响应克隆相关。L11的结合数据表明残基G104、F105、Q108、A113、Q135、G138、Y140、C144、L147、L151和K177全部几乎是100％保守的。位置104、105、135、147和151的结果证实了表明这些残基对活性非常重要的体外诱变研究的结果。另外，残基68C和S116也就可选的多样性而言得以选择性地保持，而C121T和C203A的相应命中与包含这些后面变化的随机克隆相比，优选地为71％比45％和56％比35％。来自文库L10和L11的顶部命中在表7中示出。
B.第五轮改组：
任何基因开关的一个关键的并且经常被忽视的方面是在“关闭”状态下维持极低水平的表达。为了提高体内阻遏物测定的严格性，利用突变的核糖体结合位点构建了新的文库载体pVER7571，以降低我们测定菌株中产生的阻遏物的基础水平，从而提高“渗漏”检测的灵敏度。在这一新载体中构建了文库L12。文库L12侧重于来自文库L10和L11以及(表5)的阳性残基多样性的反复改组。文库L12由32个寡核苷酸构建而成(表8)。
表8.用于组装文库L12的寡核苷酸。
寡核苷酸 序列 SEQ ID NO
L12：1 TGGCACGTCAAGAACAAGCGAGCTCTGCTAGACGCTATGGCC 1107
L12：2 ATCGAGATGCTCGATCSCCACGCTATACACTWTTTACYATTG 1108
L12：3 TTCGAGATGCTCGATCSCCACGCTATACACTWTTTACYATTG 1109
L12：4 ATCGAGATGCTCGATCSCCACGCTMCCCACTWTTTACYATTG 1110
L12：5 TTCGAGATGCTCGATCSCCACGCTMCCCACTWTTTACYATTG 1111
L12：6 GAAGGGGMAAGCTGGCAAAATTTCTTGAGGAACAAMGCTAAG 1112
L12：7 TCCATGAGAAACGCTTTGCTCAGTCACCGTGATGGAGCCAAG 1113
L12：8 GTCTGTCTAGGTACGGGCTTCACGGAGCAACAATATGAAACT 1114
L12：9 GCGGAGAACCGCCTTGCCTTCCTGACACAACAAGGTTTCTCC 1115
L12：10 CTTGAGAACGCCCTCTACGCATGGCAAGCAGTGGGGATCTAC 1116
L12：11 CTTGAGCAGGCCCTCTACGCATGGCAAGCAGTGGGGATCTAC 1117
L12：12 ACTCTGGGTTGTGTCTTGCTGGATCAAGAGCTGCAAGTCGCT 1118
L12：13 AAGGAGGAGAGGGAAACACCTACTACTGATAGTATGCCGCCA 1119
L12：14 CTGGTTCGACAAGCTKTAGAACTCAAGGATCACCAAGGTGCA 1120
L12：15 CTGGTTCGACAAGCTTGGGAACTCAAGGATCACCAAGGTGCA 1121
L12：16 GAGCCAGCCTTCCTGTTCGGCCTTGAACTGATCATATCAGGA 1122
L12：17 TTGGAGAAGCAGCTGAAGGCAGAAAGTGGGTCTTAATGATAG 1123
L12：18 GTGGSGATCGAGCATCTCGAWGGCCATAGCGTCTAGCAGAGC 1124
L12：19 ATTTTGCCAGCTTKCCCCTTCCAATRGTAAAWAGTGTATAGC 1125
L12：20 ATTTTGCCAGCTTKCCCCTTCCAATRGTAAAWAGTGGGKAGC 1126
L12：21 GAGCAAAGCGTTTCTCATGGACTTAGCKTTGTTCCTCAAGAA 1127
L12：22 GAAGCCCGTACCTAGACAGACCTTGGCTCCATCACGGTGACT 1128
L12：23 GAAGGCAAGGCGGTTCTCCGCAGTTTCATATTGTTGCTCCGT 1129
L12：24 TGCGTAGAGGGCGTTCTCAAGGGAGAAACCTTGTTGTGTCAG 1130
L12：25 TGCGTAGAGGGCCTGCTCAAGGGAGAAACCTTGTTGTGTCAG 1131
L12：26 CAGCAAGACACAACCCAGAGTGTAGATCCCCACTGCTTGCCA 1132
L12：27 AGGTGTTTCCCTCTCCTCCTTAGCGACTTGCAGCTCTTGATC 1133
L12：28 TTCTAMAGCTTGTCGAACCAGTGGCGGCATACTATCAGTAGT 1134
L12：29 TTCCCAAGCTTGTCGAACCAGTGGCGGCATACTATCAGTAGT 113583 -->
L12：30 GCCGAACAGGAAGGCTGGCTCTGCACCTTGGTGATCCTTGAG 1136
L12：31 TGCCTTCAGCTGCTTCTCCAATCCTGATATGATCAGTTCAAG 1137
L12：32 GCGCCAAGGTACCTTCTGCAGCTATCATTAAGACCCACTTTC 1138
使用遗传板测定法从文库L12中筛选了约10,000个克隆，该方法在没有诱导物的情况下检测渗漏β-半乳糖苷酶表达，然后添加2ppb的胺苯磺隆加减0.002％***糖。因为***糖诱导阻遏物的产生，所以后一步处理增加了诱导的严格性。按照测定的活性及其序列，对66个推定命中进行评级。还测定了来自一组94个随机克隆的序列并将这两组数据集进行比较。数据表明野生型TetR残基I57、R62、P69、E73和N82以及置换T65I和F67Y为优选的。除了E73和N82外，优选要求是适度的。来自L12的顶部命中比对在表7中示出。
C.第六轮改组：
使用载体pVER7571的第六轮改组结合了来自Rd5改组的最佳多样性(表5)。由表9中所示的寡核苷酸构建完全合成文库。通过基于M9X-gal板的测定法进行在无任何诱导物存在下的阻遏和在2ppb胺苯磺隆+/-0.002％***糖存在下的诱导，筛选了7,500个克隆。将46个推定命中重新排列并平板复制到相同系列的M9X-gal测定板上。除92个随机选择的克隆外，根据诱导和阻遏及测定的其序列对这些命中评级。命中群体的序列分析表明，相对于替代多样性而言，强烈选择N82、W116及在较小程度上选择Y174(分别为2％比25％、0％比41％和9％比45％)。此外，在表现最佳组内选择在这些位置相对于替代多样性活性改善的命中W82、F134、A177及较小程度改善的Q108。L15命中的序列在表7中示出。
表9.用于组装文库L15的寡核苷酸。
表7.来自文库L10、L11、L12、L13和L15的顶部命中的序列汇总。
来自文库L10、L11、L12、L13和L15的顶部命中的各种核苷酸序列如SEQIDNO：1193-1380所示。来自文库L10、L11、L12、L13和L15的顶部命中的各种氨基酸如SEQIDNO：1381-1568所示。
实例5.氯磺隆阻遏物改组
A.第二轮改组
原始文库是针对噻吩磺隆而设计，但是一旦与其他具有比原始配体可能更好的土壤及植株中稳定性的SU化合物建立起诱导活性，演化过程就会重新针对这些替代配体。特别值得关注的是除草剂甲磺隆、甲嘧磺隆、胺苯磺隆和氯磺隆。针对此目标，选择母本克隆L1-9、L1-22、L1-29和L1-44用于进一步改组。克隆L1-9对胺苯磺隆和氯磺隆具有较强活性；克隆L1-22具有较强的甲嘧磺隆活性；克隆L1-29具有中等甲磺隆活性；而克隆L1-44对甲磺隆、胺苯磺隆和氯磺隆具有中等活性。(数据未示出)。初始筛选中未发现对甲磺隆有特殊反应活性的克隆。选择这四个克隆还因为其相对较强的阻遏物活性，在无诱导物情况下显示较低的β-gal背景活性。较强的阻遏物活性对于建立对诱导物的存在高度敏感且在无诱导物情况下严格关闭的体系是至关重要的。
基于来自母本克隆L1-9、L1-22、L1-29和L1-44的序列信息，设计、构建并筛选了两个第二轮文库。第一个文库L2由“家族”改组组成，由此使用寡核苷酸的合成组装改变选择的母本克隆之间的氨基酸多样性，找出对四个新的靶配体中任一者的响应得到改善的克隆。文库L2中所用的多样性及所得的命中序列的汇总在表10中示出。
表10
用于构建文库的寡核苷酸在表11中示出。按照针对文库L1所述的方案组装、克隆并筛选了L2寡核苷酸，不同的是每个配体以2ppm进行测试以提高测定的严格性(其浓度比第一轮文库筛选浓度降低了1/10)。
表11
第三轮文库设计和筛选
文库L6：用于提高氯磺隆响应的改组
由于来自文库L2的克隆L2-14和L2-18具有最好的氯磺隆活性分布，所以使用其氨基酸多样性作为下一轮改组的基础。除由这些主链序列提供的多样性外，还包括基于3D模型预测的提高氯磺隆填充的另外的残基变化思路。新的靶向氨基酸位置为67、109、112和173(参见表12)。Gln(Q)在位置108处的置换和Val(V)在位置170处的置换经显示可能为用于获得增强的SU响应的文库L4中的重要改变，因此SU响应在这里也发生改变。所选的多样性的汇总在表12中示出。设计和用于生成文库6的寡核苷酸在表13中示出。
组装、拯救了文库L6并将其连接至pVER7314、转化至大肠杆菌KM3中并涂布在LB羧苄青霉素/卡那霉素以及如前仅羧苄青霉素的对照培养基上。然后将文库平板挑取至每孔含有60μlLB羧苄青霉素(Cb)液体培养基的42个384孔微量滴定板中(约16,000个克隆)。培养物在37℃下过夜生长后，将培养物压模在不含诱导物、含0.2ppm和2.0ppm氯磺隆作为测试诱导物的M9测定平板上。在30℃下孵育约48小时后，将通过增加的蓝色菌落着色确定的响应于氯磺隆处理的推定命中重新排列于六个96孔微量滴定平板中，并用于压模新的一组M9测定平板以确认上述结果。为了获得对氯磺隆的相对诱导更为详细的分析，在30℃下孵育不同时间点后拍摄了平板的数字照片，还使用数字图像分析免费软件程序ImageJ(Rasband，美国国家卫生研究院，美国马里兰州贝塞斯达(Bethesda，MD)，rsb.info.nih.gov/ij/，1997-2007年)测定了菌落着色强度。利用这些结果按多种格式即背景活性(无诱导物)、应用低水平或高水平诱导物的激活活性(在诱导物作用下的蓝色着色)和激活倍数(激活活性除以背景活性)对克隆进行评级。使用0.2μg/ml氯磺隆作为诱导物针对顶部克隆组的激活研究表明，活性约提高了3倍，同时获得了较低的未诱导水平的表达(数据未示出)。除这一分析外，还得到了多数克隆(490个克隆)的DNA序列信息，并且将推导的多肽彼此比对，也与其相应的活性信息比对。从这一分析中得出了序列-活性的关系。(数据未示出。)偏倚于改善的活性的残基以加大粗体示出。简而言之，位置100处的C和位置108、109处的Q与激活高度关联，而具有最低背景活性的克隆高度优选位置138处的R、位置170处的L和位置173处的A或G。虽然某些位置具有较强偏倚，即可在选定群体中更频繁地观察到，但是在全部命中群体中观察到了所引入多样性的整体。这一信息将有助于设计另外的文库以提高对氯磺隆的响应性。
表12
表13
寡核苷酸 序列 SEQ ID
L6：1 TATTGGCATGTAAAAAATAAGCGAGCTCTGCTCGACGCCTTA 1671
L6：2 GCAGAGCCAGCCTTCTTATTCGGCCTTGAATTGATCATATGC 1672
L6：3 ATATAATGCATTCTCTAGTGAAAAACCTTGTTGGCATAAAAA 1673
L6：4 TTTAAGTTGTTTTTCTAATCCGCATATGATCAATTCAAGGCC 1674
L6：5 TTAGAAGGGGAAAGCTGGCAAGATTTTTTACGTAATAMTGCT 1675
L6：6 TAAAGCACATCTCATACTTTTAGCAKTATTACGTAAAAAATC 1676
L6：7 TTGCCAGCTTTCCCCTTCTAAAGGGCAMAHGTGAGTTGCGTG 1677
L6：8 TTGCCAGCTTTCCCCTTCTAAAGGGCAATAGTGAGTTGCGTG 1678
L6：9 GAATAAGAAGGCTGGCTCTGCACCTTGGTGATCCTTTAATTC 1679
L6：10 GCCATTGAGATGATGGATAGGCACGCAACTCACTATTGCCCT 1680
L6：11 RSTGCTGAAAATATGTTAGCCTTTTTATGCCAACAAGGTTTT 1681
L6：12 TTTACTTTAGGTTGCGTATTGTTTGATCAAGAGCTCCAAGTC 1682
L6：13 TGTTTCCCTTTCTTCTTTAGCGACTTGGAGCTCTTGATCAAA 1683
L6：14 GCCATTGAGATGATGGATAGGCACGCAACTCACDTKTGCCCT 168492 -->
L6：15 GCCATTGAGATGATGGATAGGCACCAAACTCACDTKTGCCCT 1685
L6：16 GCCATTGAGATGATGGATAGGCACCAAACTCACTATTGCCCT 1686
L6：17 AAAAGTATGAGATGTGCTTTACTAAGCCATCGCGATGGAGCA 1687
L6：18 AAAGTATGKTTAGGTACACGCTGGACAGAAMAACAWTATGAA 1688
L6：19 AAAGTATGKTTAGGTACACGCTGGACAGAAMAAWTGTATGAA 1689
L6：20 RSTGCTGAAAATCAATTAGCCTTTTTATGCCAACAAGGTTTT 1690
L6：21 TCACTAGAGAATGCATTATATGCARTGAGTGCGTGGRGGGTG 1691
L6：22 TCACTAGAGAATGCATTATATGCARTGAGTGCGTGGRGGAAC 1692
L6：23 TTTACTTTAGGTTGCGTATTGTTTGATCAAGAGAGCCAAGTC 1693
L6：24 GCTAAAGAAGAAAGGGAAACACCTACTACTGCTAGTATGCCG 1694
L6：25 CCATTAKTGCGACAAGBTTKGGAATTAAAGGATCACCAAGGT 1695
L6：26 CCATTAGCCCGACAAGBTTKGGAATTAAAGGATCACCAAGGT 1696
L6：27 GGATTAGAAAAACAACTTAAATGCGAAAGTGGGTCTTAA 1697
L6：28 CCTATCCATCATCTCAATGGCTAAGGCGTCGAGCAGAGCTCG 1698
L6：29 TTGCCAGCTTTCCCCTTCTAAAGGGCAMAHGTGAGTTTGGTG 1699
L6：30 TTGCCAGCTTTCCCCTTCTAAAGGGCAATAGTGAGTTTGGTG 1700
L6：31 GCGTGTACCTAAMCATACTTTTGCTCCATCGCGATGGCTTAG 1701
L6：32 GGCTAACATATTTTCAGCASYTTCATAWTGTTKTTCTGTCCA 1702
L6：33 GGCTAATTGATTTTCAGCASYTTCATAWTGTTKTTCTGTCCA 1703
L6：34 GGCTAACATATTTTCAGCASYTTCATACAWTTKTTCTGTCCA 1704
L6：35 GGCTAATTGATTTTCAGCASYTTCATACAWTTKTTCTGTCCA 1705
L6：36 CAATACGCAACCTAAAGTAAACACCCYCACAGCACTCAYTGC 1706
L6：37 CAATACGCAACCTAAAGTAAAGTTCCYCACAGCACTCAYTGC 1707
L6：38 TGTTTCCCTTTCTTCTTTAGCGACTTGGCTCTCTTGATCAAA 1708
L6：39 CMAAVCTTGTCGCAMTAATGGCGGCATACTAGCAGTAGTAGG 1709
L6：40 CMAAVCTTGTCGGGCTAATGGCGGCATACTAGCAGTAGTAGG 1710
L6：41 GGGAACTTCGGCGCGCCTTAAGACCCACTTTCGCA 1711
B.第四轮改组：
文库L8的构建和筛选。第四轮改组结合了来自Rd3改组(BB1860)的最佳多样性以及计算多样性(表14)。由表15A和表15B中所示的寡核苷酸构建完全合成文库。由于多样性非常高，将文库寡核苷酸混合物掺入母本命中变体寡核苷酸混合物中(5％、10％和25％的混合)，以滴定确定每克隆的残基改变数目。除了Cs活性改变的残基外，使用TetR家族***发育置换改变了七个残基(C68、C86、C88、C121、C144、C195和C203)，以试图减少阻遏物中半胱氨酸残基的数目。PCR组装文库为克隆到pVER7334中的Sac1/Asc1。该质粒编码植物中经优化的TetRDNA结合结构域的受PBAD启动子控制的表达，所述TetRDNA结合结构域融合至由Sac1至Asc1片段上的天然Tn10序列编码的TetR(B)野生型配体结合结构域。根据M9Xgal测定平板+/-200ppb氯磺隆(Cs)的蓝色菌落着色，筛选到大约15,000个克隆。按照在存在诱导物的情况下孵育24小时后的着色与不存在诱导物的情况下孵育48小时的菌落着色的比率，对克隆进行评级。总体更大的命中群体(第一重复阵列)中的序列趋势为保持L55、R104、W105和L170，同时C144A置换是高度优选的。然后标出了命中群体中相对于阻遏、诱导和诱导倍数(用于校正渗漏)的序列趋势。对于阻遏，C68L和C144A在高度阻遏群体中是有利的：在顶部40个阻遏克隆中分别为57％和93％，而在剩余209个克隆中分别为35％和66％。序列分析表明，更多的是在位置134处将V置换为L和在位置135处将S置换为E、D、T或Q。顶部20个克隆的序列比对在表16中示出。
表14.第四轮、第五轮和第六轮氯磺隆阻遏物改组的文库多样性汇总。
表15A.组装文库L8的寡核苷酸
表15B.编码文库L8的母本克隆的寡核苷酸混合物。
表16.顶部20个L8命中与母本克隆L6-4D10的序列比对和相对性能。
C.第五轮氯磺隆阻遏物改组
配体结合口袋的饱和诱变：为了针对又一轮改组生成新型多样性，采用如下表17中所示的引物，将L8命中L8-3F01中的残基60、64、82、86、100、104、105、113、116、134、135、138、139、147、151、174和177进行NNK置换诱变。
表17.用于推定配体结合口袋残基的饱和诱变的寡核苷酸。
将诱变反应转化至文库菌株Km3和通过DNA序列分析进行置换测试的96个菌落中。然后将表示在每一位置的每一可能残基的置换一式三份重新排列在含有0、20和200ppb氯磺隆的M9X-gal测定平板上。成像前将平板在37℃下孵育24和48小时。然后按照激活(侧重于20ppbCs)和阻遏特性(侧重于48小时时间点)对残基置换进行评级。对活性影响最大的突变是残基N82置换为苯丙氨酸或酪氨酸。在N82处置换为色氨酸也提高了活性，但远远不如苯丙氨酸或酪氨酸。置换S135D、S135E、F147Q、F147V和S151Q都显著提高了对氯磺隆诱导的敏感性，但是部分地以阻遏物功能为代价。表18中示出的所有其他优选的置换要么改善了阻遏要么在不损害阻遏物功能的情况下提高了对诱导物的敏感性。某些残基是功能必须的，例如R104、W105和W174，不允许进行置换。其他残基位置例如R138和K177也被标记为关键的，因为其功能性置换极其有限。
表18.饱和诱变结果汇总。
粗体＝高灵敏度响应但轻微渗漏；粗体和斜体＝高选择性残基；*＝仅在相应位置作用的残基
文库CsL3的构建和筛选：基于IVM结果将表现最佳残基置换掺入文库CsL3中(表14)。该文库是使用下表19所示的寡核苷酸组装的。使用每一组的第一个引物和最后一个引物作为拯救引物。为了使命中蛋白得到纯化，在组装和拯救过程中，在每个克隆的配体结合结构域的C端添加了6xHis标签。然后将文库***到pVER7334Sac1/Asc1中、转化至大肠杆菌测定菌株Km3中并在LB+40μg/ml卡那霉素和50μg/ml羧苄青霉素培养基上进行选择。然后将大约10,000个克隆重新排列为384孔格式，并平板复制到含有0或20ppbCs的M9Xgal测定培养基上。然后在37℃下孵育24和96小时后评估菌落颜色。结果表明残基置换N82F、V134T和F147Q是高度优选的，残基Q64、A113、M116、S135、R138和V139的保持也是高度优选的。有趣的是，最佳命中具有随机的F147L置换，使得活性比接下来的最优克隆另外增加约2倍。另外，虽然C86M置换在总体命中群体中频率较低，但是其发生在所有的顶部26个克隆中。
表19.编码文库CsL3的寡核苷酸。
表20.顶部20个CsL3命中及相关残基置换相对于母体克隆L8-F301的性能。
D.第六轮氯磺隆阻遏物改组。
通过随机诱变创建新型多样性。为了针对改组创建新的多样性，使用Mutazyme(Stratagene)对来自CsL3的顶部克隆进行易错PCR诱变。将编码CsR配体结合结构域的突变的PCR产物作为Sac1至Asc1片段***文库表达载体pVER7334、转化到文库菌株Km3中并涂布于LB+40μg/ml卡那霉素和50μg/ml羧苄青霉素的平板上。然后将大约10,000个克隆平板复制到M9Xgal测定培养基+/-20ppbCs上。然后将推定命中重新排列并平板复制到相同测定培养基上。在诱导物(诱导)孵育24小时和无诱导物(阻遏)孵育72小时后，通过蓝色菌落着色水平衡量其性能。然后对顶部命中进行液体β-半乳糖苷酶测定以供定量评估(表21)。结果表明位置D178的修饰非常重要，因为对V或E的突变将活性至少提高两倍。置换F78Y、R88C和S165R可能也对活性有影响。
表21.顶部CsL3-MTZ命中及相关残基置换相对于母本克隆CsL3-CI2和L8-F301的性能。
IND＝使用20ppbCs的诱导；REP＝无诱导物存在下的阻遏；
F.IND＝诱导倍数(IND/REP)
文库CsL4.2的构建和筛选。基于来自CsL3和CsL3-MTZ文库筛选的最佳多样性设计了第七轮文库CsL4.2(表14)。该文库是使用下表22所示的寡核苷酸组装的。使用第一个引物和最后一个引物作为拯救引物。CsL4.2包含C端6xHis标签延伸以有利于蛋白质纯化。将文库组装并克隆到载体pVER7334Sac1至Asc1中、转化至文库测定菌株Km3中并涂布于LB+40μg/ml卡那霉素和50μg/ml羧苄青霉素平板上。将大约8,000个克隆重新排列为384孔格式，并平板复制到M9Xgal测定培养基+/-2ppbCs上。将推定命中以96孔格式重新排列于相同培养基上以供重新测试。然后使用β-半乳糖苷酶测定在液体培养基中对确认的命中进行诱导和阻遏方面的测试。结果表明在命中群体中强烈选择F82、L147、V178及在较小程度上选择Q151。尽管在较大命中群体的位置135处没有优选要求，但是顶部六个克隆都具有S135D置换(表23)。
表22.组装文库4.2的寡核苷酸。
表23.顶部20个CsL4.2命中及相关残基置换相对于母本克隆L8-F301的性能。
E.残基D178的体外诱变。
由于发现残基位置D178[相对于TetR(B)]的随机诱变对活性至关重要，所以进行了进一步研究。为此，使用以下顶部和底部链引物在PhusionDNA聚合酶PCR反应(新英格兰生物实验室公司(NewEnglandBiolabs))中对顶部CsR命中CsL4.2-15和CsL4.2-20的这一位置进行饱和诱变：GCCTGGGAACTCAAANNKCACCAAGGTGCAGAGC和GCTCTGCACCTTGGTGMNNTTTGAGTTCCCAGGC。将诱变反应转化至大肠杆菌测定菌株Km3中并涂布于LB+50μg/ml羧苄青霉素平板上。然后将菌落重新排列为384孔格式，并平板复制到M9Xgal测定培养基+/-5ppb氯磺隆中。然后将推定命中重新排列并通过β-半乳糖苷酶测定相对于母本克隆进行分析(图10)。结果表明在CsL4.2-20中的位置178处将V置换为C、N、Q、S或T均得到改善的活性。然而，活性最高的置换V178Q使CsL4.2-15和CsL4.2-20主链活性提高了大约2倍。
F.通过结构导向的诱变提高配体选择性。
氯磺隆(Cs)阻遏物CsL4.2-20对Cs的敏感性比甲磺隆(Ms)和胺苯磺隆(Es)分别高2倍和30倍(表26)。为了开发不重叠的SU除草剂响应阻遏物，期望进一步分离其配体谱。我们从CsL4.2-20结构模型可以确定，残基A56、T103、Y110、L117、L131、T134、R138、P161、M166和A173可能会潜在影响相关磺酰脲类化合物的对接(例如参见图11中的L131和T134)。Cs和Es在苯基和三嗪环结构的修饰上有所不同(在图11中圈出)。Cs在苯环邻位位置具有一个氯(Cl)基，而在Es中是一个羧甲基。另外，两个分子的三嗪部分的间位具有不同的置换：Cs上为甲基和甲基醚，Es上为仲胺和乙基醚基团。甲磺隆基本上是介于这两种除草剂之间的杂合物，其具有来自Cs的三嗪部分和Es的苯基部分。下文示出了每一残基靶标的饱和诱变引物。使用PhusionDNA聚合酶(新英格兰生物实验室公司(NewEnglandBiolabs))和表24及表25中列出的引物进行诱变反应。将反应转化至大肠杆菌测定菌株Km3中并涂布于LB+50μg/ml羧苄青霉素平板上。将菌落重新排列为384孔格式并平板复制到不含诱导物、含10ppbEs、含200ppbEs和含25ppbMs的M9X-gal测定培养基上。将相对于母本Cs活性具有偏移选择性的突变重新排列为96孔格式，用于进一步研究。使用1、2.5、5和10ppbCs；25、50、100和200ppbMs；和200、250、300、350、400、450和500ppbEs测试了推定命中的阻遏和诱导。然后使用每个配体引起同等响应所需的剂量测定了每个克隆的相对选择性。Cs比Es和Cs比Ms的活性比以及顶部命中的相对Cs活性列于表25中。这些数据表明位置L131和T134对于改变配体选择性特别有用。突变L131K和T134W有效阻断Es激活：500ppbEs与1ppbCs具有类似的响应。后一种置换不幸地使Cs活性降低了约1/2。在这些位置的其他残基置换也在较小程度上影响选择性。有趣的是，一些突变在降低但不消除Es活性的同时，提高了对Cs的响应，例如L131C。发生在大多数L131和T134突变体中的针对Ms的选择性的变化幅度更小，因为Cs和Ms在结构上比Cs和Es更为类似。
表24.用于可能涉及不同磺酰脲类除草剂选择性的残基的饱和诱变的寡核苷酸。
寡核苷酸 序列 SEQ ID NO
A56NNKT GCTCTGCTAGACGCCTTGNNKATTGAGATGCATGATAGGC 1929
A56NNKB GCCTATCATGCATCTCAATMNNCAAGGCGTCTAGCAGAGC 1930
T103NNKT GCCAAGGTCTCCCTTGGTNNKCGGTGGACGGAGCAAC 1931
T103NNKB GTTGCTCCGTCCACCGMNNACCAAGGGAGACCTTGGC 1932
Y110NNKT GGTGGACGGAGCAACAGNNKGAAACTGCGGAGAAC 1933
Y110NNKB GTTCTCCGCAGTTTCMNNCTGTTGCTCCGTCCACC 1934
L117NNKT GAAACTGCGGAGAACATGNNKGCCTTCCTGACCCAAC 1935
L117NNKB GTTGGGTCAGGAAGGCMNNCATGTTCTCCGCAGTTTC 1936
L131NNKT GGTTTCTCCCTTGAGAATGCCNNKTACGCAACAGATGC 1937
表25.用于可能涉及不同磺酰脲类除草剂选择性的残基的饱和诱变的寡核苷酸。
寡核苷酸 序列 SEQ ID NO
L131NNKB GCATCTGTTGCGTAMNNGGCATTCTCAAGGGAGAAACC 1938
T134NNKT GAATGCCTTGTACGCANNKGATGCTGTGCGGGTTTTC 1939
T134NNKB GAAAACCCGCACAGCATCMNNTGCGTACAAGGCATTC 1940
R138NNKT GCAACAGATGCTGTGNNKGTTTTCACTCTGGGTGC 1941
R138NNKB GCACCCAGAGTGAAAACMNNCACAGCATCTGTTGC 1942
P161NNKT GAGGAGAGGGAAACANNKACTCCTGATAGTATGC 1943
P161NNKB GCATACTATCAGGAGTMNNTGTTTCCCTCTCCTC 1944
M166NNKT GAAACACCTACTCCTGATAGTNNKCCGCCACTGCTTC 1945
M166NNKB GAAGCAGTGGCGGMNNACTATCAGGAGTAGGTGTTTC 1946
A173NNKT GCCACTGCTTCGACAANNKTGGGAACTCAAAGTTC 1947
A173NNKB GAACTTTGAGTTCCCAMNNTTGTCGAAGCAGTGGC 1948
表26.不同命中基于β-半乳糖苷酶测定的相对Cs、Es和Ms选择性。
测定了不同剂量的Cs、Es和Ms的相对β-半乳
糖苷酶活性。使用达到相同活性水平所需的每
种诱导物的量来测定相对配体选择性。
本文所用的冠词“一个”和“一种”指一个(种)或不止一个(种)(即，指至少一个(种))所述冠词的语法对象。举例而言，“一个要素”意指一个或多个要素。
说明书中提到的所有公布和专利申请指示了本发明适合的本领域技术人员的水平。所有公布和专利申请以引用方式并入本文，如同每个单独的公布或专利申请被具体地和独立地指出以引用方式并入本文一样。
虽然为了理解清晰目的已经通过举例说明和实例方式较详细地描述了本发明，但显然可以在所附权利要求书范围内实施一些改变和修改。

Claims (55)

1.一种重组多核苷酸构建体，所述重组多核苷酸构建体包括：
(a)有效连接至在植物中有活性的第一阻抑型启动子的所关注多核苷酸，其中所述第一阻抑型启动子包含至少一个操纵基因；
(b)编码化学调节转录阻遏物并有效连接至在所述植物中有活性的启动子的多核苷酸；以及
(c)有效连接至第二阻抑型启动子的基因沉默构建体，其中所述基因沉默构建体编码可减少所述化学调节转录阻遏物的沉默元件，其中所述第二阻抑型启动子包含至少一个操纵基因，并且其中所述化学调节转录阻遏物可在不存在化学配体的情况下结合至每一个所述操纵基因，从而在不存在所述化学配体的情况下抑制从所述第一阻抑型启动子和所述第二阻抑型启动子的转录。
2.根据权利要求1所述的重组多核苷酸构建体，其中
(i)有效连接至所述所关注多核苷酸的所述第一阻抑型启动子包含三个所述操纵基因；并且/或者
(ii)有效连接至编码所述化学调节转录阻遏物的所述多核苷酸的所述启动子包含第三阻抑型启动子，其中所述第三阻抑型启动子包含至少一个操纵基因；并且/或者
(iii)有效连接至所述基因沉默构建体的所述第二阻抑型启动子包含三个所述操纵基因。
3.根据权利要求2所述的重组多核苷酸构建体，其中有效连接至编码所述化学调节转录阻遏物的所述多核苷酸的所述第三阻抑型启动子包含两个操纵基因。
4.根据权利要求2所述的重组多核苷酸构建体，其中有效连接至编码所述化学调节转录阻遏物的所述多核苷酸的所述第三阻抑型启动子包含三个操纵基因。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的重组多核苷酸构建体，其中编码所述化学调节转录阻遏物的所述多核苷酸是由磺酰脲类化合物调节的。
6.根据权利要求5所述的重组多核苷酸构建体，其中所述磺酰脲类化合物包括嘧啶基磺酰脲类化合物、三嗪基磺酰脲类化合物、噻二唑基脲类化合物、氯磺隆、胺苯磺隆、噻吩磺隆、甲磺隆、甲嘧磺隆、苯磺隆、氯嘧磺隆、烟嘧磺隆或砜嘧磺隆化合物。
7.根据权利要求1-4中任一项所述的重组多核苷酸构建体，其中编码所述化学调节转录阻遏物的所述多核苷酸是由四环素调节的。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的重组多核苷酸构建体，其中所述基因沉默构建体编码降低所述化学调节转录阻遏物的细胞非自发的沉默元件。
9.根据权利要求1-7中任一项所述的重组多核苷酸构建体，其中所述沉默元件包括siRNA、反式作用siRNA(TAS)或amiRNA。
10.根据权利要求1-7中任一项所述的重组多核苷酸构建体，其中所述沉默元件包含发夹RNA。
11.根据权利要求10所述的重组多核苷酸构建体，其中包含所述沉默元件的所述基因沉默构建体依次包含第一片段、第二片段和第三片段，其中
(a)所述第一片段包含与编码所述化学调节转录阻遏物的多核苷酸具有至少90％的序列互补性的至少约20个核苷酸。
(b)所述第二片段包含足够长度的环，以允许所述沉默元件作为发夹RNA进行转录；并且，
(c)所述第三片段包含与第一片段具有至少85％的互补性的至少约20个核苷酸。
12.一种植物细胞，所述植物细胞包括
(a)第一多核苷酸构建体，其包含有效连接至在所述植物细胞中有活性的第一阻抑型启动子的所关注多核苷酸，其中所述第一阻抑型启动子包含至少一个操纵基因；
(b)第二多核苷酸构建体，其包含编码化学调节转录阻遏物并有效连接至在所述植物细胞中有活性的启动子的多核苷酸；以及
(c)第三多核苷酸构建体，其包含有效连接至包含至少一个操纵基因的第二阻抑型启动子的基因沉默构建体，
其中(i)所述基因沉默构建体编码降低所述化学调节转录阻遏物水平的细胞非自发的沉默元件，(ii)所述第二阻抑型启动子包含至少一个调节基因沉默构建体表达的操纵基因，(iii)所述化学调节转录阻遏物可在不存在化学配体的情况下结合至所述操纵基因中的每一个，从而在不存在所述化学配体的情况下抑制所述第一阻抑型启动子和所述第二阻抑型启动子的转录，并且(iv)所述植物细胞对所述化学配体耐受。
13.根据权利要求12所述的植物细胞，其中所述第一、第二和第三多核苷酸构建体包含于相同的重组多核苷酸上。
14.根据权利要求12-13中任一项所述的植物细胞，其中
(i)有效连接至所述所关注多核苷酸的所述第一阻抑型启动子包含三个所述操纵基因；并且/或者
(ii)有效连接至编码所述化学调节转录阻遏物的所述多核苷酸的所述启动子包含第三阻抑型启动子，其中所述第三阻抑型启动子包含至少一个调节所述阻遏物表达的操纵基因；
并且/或者
(iii)有效连接至所述基因沉默构建体的所述第二阻抑型启动子包含三个所述操纵基因。
15.根据权利要求14所述的植物细胞，其中有效连接至编码所述化学调节转录阻遏物的所述多核苷酸的所述第三阻抑型启动子包含两个操纵基因。
16.根据权利要求14所述的植物细胞，其中有效连接至编码所述化学调节转录阻遏物的所述多核苷酸的所述第三阻抑型启动子包含三个操纵基因。
17.根据权利要求12-16中任一项所述的植物细胞，其中所述化学调节转录阻遏物具有包含磺酰脲类化合物的化学配体。
18.根据权利要求17所述的植物细胞，其中所述磺酰脲类化合物包括嘧啶基磺酰脲类化合物、三嗪基磺酰脲类化合物、噻二唑基脲类化合物、氯磺隆、胺苯磺隆、噻吩磺隆、甲磺隆、甲嘧磺隆、苯磺隆、氯嘧磺隆、烟嘧磺隆或砜嘧磺隆化合物。
19.根据权利要求12-16中任一项所述的植物细胞，其中所述化学调节转录阻遏物具有包含四环素的化学配体。
20.根据权利要求12-19中任一项所述的植物细胞，其中所述基因沉默构建体编码减少所述化学调节转录阻遏物的细胞非自发的沉默元件。
21.根据权利要求12-19中任一项所述的植物细胞，其中所述沉默元件包括siRNA、反式作用siRNA(TAS)或amiRNA。
22.根据权利要求12-19中任一项所述的植物细胞，其中所述沉默元件包含发夹RNA。
23.根据权利要求22所述的植物细胞，其中包含所述沉默元件的所述基因沉默构建体依次包含第一片段、第二片段和第三片段，其中
(a)所述第一片段包含与编码所述化学调节转录阻遏物的所述多核苷酸具有至少90％的序列互补性的至少约20个核苷酸。
(b)所述第二片段包含足够长度的环，以允许所述沉默元件作为发夹RNA进行转录；并且，
(c)所述第三片段包含与所述第一片段具有至少85％的互补性的至少约20个核苷酸。
24.一种植物，所述植物包含根据权利要求12-23中任一项所述的植物细胞。
25.根据权利要求24所述的植物，其中所述植物是单子叶植物或双子叶植物。
26.根据权利要求25所述的植物，其中所述植物是玉蜀黍、大麦、粟、小麦、水稻、高粱、黑麦、大豆、卡诺拉油菜、苜蓿、向日葵、红花、甘蔗、烟草、拟南芥或棉花。
27.根据权利要求24-26中任一项所述的植物，其中为所述植物提供有效量的所述化学配体会(i)提高所述所关注多核苷酸和所述沉默构建体的表达并且(ii)降低所述植物或其某一部分中所述化学调节转录阻遏物的水平。
28.根据权利要求27所述的植物，其中为所述植物提供有效量的所述化学配体，使得与所述所关注多核苷酸在已接触所述有效量的所述化学配体但缺少所述基因沉默构建体的植物中的表达相比，所述所关注多核苷酸在所述植物中的表达在空间上或时间上延伸。
29.根据权利要求28所述的植物，其中所述所关注多核苷酸的所述在空间上或时间上延伸的表达通过如下方式在所述植物中实现：使提供的化学配体量少于在缺少所述基因沉默构建体的植物中诱导所述所关注多核苷酸表达所需的量。
30.根据权利要求28所述的植物，其中所述所关注多核苷酸空间上的表达延伸包括在所述植物的未被有效量所述化学配体渗透的至少一种组织中的表达。
31.根据权利要求27-30中任一项所述的植物，其中提供所述化学配体导致所述所关注多核苷酸在所述植物的顶端分生组织中的表达的完全渗透。
32.根据权利要求27-30中任一项所述的植物，其中提供所述化学配体导致所述所关注多核苷酸在整个所述植物中的表达的完全渗透。
33.根据权利要求25-32中任一项所述的植物的转化种子，其中所述种子包含所述第一、第二和第三多核苷酸构建体。
34.根据权利要求33所述的转化种子，其中所述第一、第二和第三多核苷酸构建体包含于相同的重组多核苷酸上。
35.一种调节植物中表达的方法，所述调节植物中表达的方法包括
(a)提供一种植物，其包含(i)第一多核苷酸构建体，所述第一多核苷酸构建体包含编码化学调节转录阻遏物并有效连接至在所述植物中有活性的启动子的多核苷酸，(ii)第二多核苷酸构建体，所述第二多核苷酸构建体包含有效连接至第一阻抑型启动子的所关注多核苷酸，和(iii)第三多核苷酸构建体，所述第三多核苷酸构建体包含有效连接至第二阻抑型启动子的基因沉默构建体，
其中所述基因沉默构建体编码降低所述化学调节转录阻遏物水平的沉默元件，其中所述第一阻抑型启动子和所述第二阻抑型启动子各包含至少一个操纵基因，其中所述化学调节转录阻遏物可在不存在化学配体的情况下结合至所述操纵基因中的每一个，从而在不存在所述化学配体的情况下抑制从所述第一阻抑型启动子和所述第二阻抑型启动子的转录，并且其中所述植物对所述化学配体耐受；并且
(b)为所述植物提供有效量的所述化学配体由此(i)所述所关注多核苷酸和所述沉默构建体的表达升高并且(ii)所述化学调节转录阻遏物的水平降低。
36.根据权利要求35所述的方法，其中为所述植物提供有效量的所述化学配体，使得与所述所关注多核苷酸在已接触所述有效量的所述化学配体但缺少所述基因沉默构建体的植物中的表达相比，所述所关注多核苷酸在所述植物中的表达在空间上或时间上延伸。
37.根据权利要求36所述的方法，其中所述所关注多核苷酸的所述在空间上或时间上延伸的表达通过如下方式实现：使提供的化学配体量少于在缺少所述基因沉默构建体的植物中诱导所述所关注多核苷酸表达所需的量。
38.根据权利要求36-37中任一项所述的方法，其中所述所关注多核苷酸的所述在空间上延伸的表达包括在所述植物的未被有效量的所述化学配体渗透的至少一种组织中的表达。
39.根据权利要求35-38中任一项所述的方法，其中提供所述化学配体导致所述所关注多核苷酸在所述植物的顶端分生组织中的表达的空间完全渗透。
40.根据权利要求35-38中任一项所述的方法，其中提供所述化学配体导致所述所关注多核苷酸在整个所述植物中的表达的完全渗透。
41.根据权利要求35-40中任一项所述的方法，其中所述化学配体通过喷雾提供。
42.根据权利要求35-40中任一项所述的方法，其中所述化学配体通过种子处理提供。
43.根据权利要求35-42任一项所述的方法，其中有效连接至所述所关注多核苷酸的所述第一阻抑型启动子包含三个所述操纵基因，其中有效连接至所述化学调节转录阻遏物的所述启动子包含第三阻抑型启动子，其中所述第三阻抑型启动子包含至少一个操纵基因，并且其中有效连接至所述基因沉默构建体的所述第二阻抑型启动子包含三个所述操纵基因。
44.根据权利要求43所述的方法，其中有效连接至所述化学调节转录阻遏物的所述第三阻抑型启动子包含两个操纵基因。
45.根据权利要求43所述的方法，其中有效连接至所述化学调节转录阻遏物的所述第三阻抑型启动子包含三个操纵基因。
46.根据权利要求35-45中任一项所述的方法，其中所述所关注多核苷酸的表达改变所述植物的表型。
47.根据权利要求35-45中任一项所述的方法，其中所述所关注多核苷酸的表达改变所述植物的基因型。
48.根据权利要求35-47中任一项所述的方法，其中所述化学调节转录阻遏物具有包含磺酰脲类化合物的化学配体。
49.根据权利要求48所述的方法，其中所述磺酰脲类化合物包括嘧啶基磺酰脲类化合物、三嗪基磺酰脲类化合物、噻二唑基脲类化合物、氯磺隆、胺苯磺隆、噻吩磺隆、甲磺隆、甲嘧磺隆、苯磺隆、氯嘧磺隆、烟嘧磺隆或砜嘧磺隆化合物。
50.根据权利要求35-47中任一项所述的方法，其中所述化学调节转录阻遏物具有包含四环素的化学配体。
51.根据权利要求35-47中任一项所述的方法，其中所述基因沉默构建体编码降低所述化学调节转录阻遏物的细胞非自发的沉默元件。
52.根据权利要求35-47中任一项所述的方法，其中所述沉默元件包括siRNA、反式作用siRNA(TAS)或amiRNA。
53.根据权利要求35-47中任一项所述的方法，其中所述沉默元件包含发夹RNA。
54.根据权利要求53所述的方法，其中包含所述沉默元件的所述基因沉默构建体依次包含第一片段、第二片段和第三片段，其中
(a)所述第一片段包含与所述化学调节转录阻遏物具有至少90％的序列互补性的至少约20个核苷酸。
(b)所述第二片段包含足够长度的环，以允许所述沉默元件作为发夹RNA进行转录；并且
(c)所述第三片段包含与所述第一片段具有至少85％的互补性的至少约20个核苷酸。
55.根据权利要求35-54中任一项所述的方法，其中所述沉默元件通过所述植物的维管***转运。
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Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10676754B2 (en) 2014-07-11 2020-06-09 E I Du Pont De Nemours And Company Compositions and methods for producing plants resistant to glyphosate herbicide
EP3384031A1 (en) 2015-11-30 2018-10-10 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Plant regulatory elements and methods of use thereof
CN113046377B (zh) * 2021-04-28 2022-08-16 吉林农业大学 一种雄性不育基因MsGAL及其应用

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2003029453A2 (en) * 2001-09-28 2003-04-10 Novartis Forschungsstiftung, Zweigniederlassung Friedrich Miescher Institute For Biomedical Research Induction of gene expression by silencing of repressor genes
CN1564870A (zh) * 2001-07-10 2005-01-12 蒙特利尔大学 植物转录阻遏物,结合其的蛋白质核因子,及它们的应用
CN102264758A (zh) * 2008-10-28 2011-11-30 先锋国际良种公司 磺酰脲-响应性的阻遏蛋白
CN102905517A (zh) * 2010-04-23 2013-01-30 先锋国际良种公司 基因开关组合物及使用方法

Family Cites Families (93)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
NZ201918A (en) 1981-09-18 1987-04-30 Genentech Inc N-terminal methionyl analogues of bovine growth hormone
US5380831A (en) 1986-04-04 1995-01-10 Mycogen Plant Science, Inc. Synthetic insecticidal crystal protein gene
US5304732A (en) 1984-03-06 1994-04-19 Mgi Pharma, Inc. Herbicide resistance in plants
US5331107A (en) 1984-03-06 1994-07-19 Mgi Pharma, Inc. Herbicide resistance in plants
US4761373A (en) 1984-03-06 1988-08-02 Molecular Genetics, Inc. Herbicide resistance in plants
US4945050A (en) 1984-11-13 1990-07-31 Cornell Research Foundation, Inc. Method for transporting substances into living cells and tissues and apparatus therefor
US5569597A (en) 1985-05-13 1996-10-29 Ciba Geigy Corp. Methods of inserting viral DNA into plant material
US5453566A (en) 1986-03-28 1995-09-26 Calgene, Inc. Antisense regulation of gene expression in plant/cells
US5013659A (en) 1987-07-27 1991-05-07 E. I. Du Pont De Nemours And Company Nucleic acid fragment encoding herbicide resistant plant acetolactate synthase
US5605011A (en) 1986-08-26 1997-02-25 E. I. Du Pont De Nemours And Company Nucleic acid fragment encoding herbicide resistant plant acetolactate synthase
US5378824A (en) 1986-08-26 1995-01-03 E. I. Du Pont De Nemours And Company Nucleic acid fragment encoding herbicide resistant plant acetolactate synthase
US5268463A (en) 1986-11-11 1993-12-07 Jefferson Richard A Plant promoter α-glucuronidase gene construct
US5608142A (en) 1986-12-03 1997-03-04 Agracetus, Inc. Insecticidal cotton plants
US4873192A (en) 1987-02-17 1989-10-10 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Process for site specific mutagenesis without phenotypic selection
US5316931A (en) 1988-02-26 1994-05-31 Biosource Genetics Corp. Plant viral vectors having heterologous subgenomic promoters for systemic expression of foreign genes
US5990387A (en) 1988-06-10 1999-11-23 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Stable transformation of plant cells
US5023179A (en) 1988-11-14 1991-06-11 Eric Lam Promoter enhancer element for gene expression in plant roots
US5110732A (en) 1989-03-14 1992-05-05 The Rockefeller University Selective gene expression in plants
US5879918A (en) 1989-05-12 1999-03-09 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Pretreatment of microprojectiles prior to using in a particle gun
US5240855A (en) 1989-05-12 1993-08-31 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Particle gun
US5322783A (en) 1989-10-17 1994-06-21 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Soybean transformation by microparticle bombardment
DE69133128T2 (de) 1990-04-12 2003-06-18 Syngenta Participations Ag Gewebe-spezifische Promotoren
US5466597A (en) 1990-04-26 1995-11-14 Plant Genetic Systems, N.V. Bacillus thuringiensis strains and their genes encoding insecticidal toxins
US5498830A (en) 1990-06-18 1996-03-12 Monsanto Company Decreased oil content in plant seeds
US5932782A (en) 1990-11-14 1999-08-03 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Plant transformation method using agrobacterium species adhered to microprojectiles
US5277905A (en) 1991-01-16 1994-01-11 Mycogen Corporation Coleopteran-active bacillus thuringiensis isolate
US5459252A (en) 1991-01-31 1995-10-17 North Carolina State University Root specific gene promoter
US5399680A (en) 1991-05-22 1995-03-21 The Salk Institute For Biological Studies Rice chitinase promoter
GB9114259D0 (en) 1991-07-02 1991-08-21 Ici Plc Plant derived enzyme and dna sequences
US5731180A (en) 1991-07-31 1998-03-24 American Cyanamid Company Imidazolinone resistant AHAS mutants
EP0602064B1 (en) 1991-08-02 1998-12-16 Mycogen Corporation Novel microorganism and insecticide
ES2140416T3 (es) 1991-08-27 2000-03-01 Novartis Ag Proteinas con propiedades insecticidas contra insectos homopteros y su uso en la proteccion de plantas.
DE69233410D1 (de) 1991-10-04 2004-10-21 Univ North Carolina State Pathogenresistente transgene pflanzen
TW261517B (zh) 1991-11-29 1995-11-01 Mitsubishi Shozi Kk
US5324646A (en) 1992-01-06 1994-06-28 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Methods of regeneration of Medicago sativa and expressing foreign DNA in same
GB9210273D0 (en) 1992-05-13 1992-07-01 Ici Plc Dna
US5401836A (en) 1992-07-16 1995-03-28 Pioneer Hi-Bre International, Inc. Brassica regulatory sequence for root-specific or root-abundant gene expression
EP0652965A1 (en) 1992-07-27 1995-05-17 Pioneer Hi-Bred International, Inc. An improved method of agrobacterium-mediated transformation of cultured soybean cells
CA2127807A1 (en) 1992-11-20 1994-06-09 John Maliyakal Transgenic cotton plants producing heterologous bioplastic
IL108241A (en) 1992-12-30 2000-08-13 Biosource Genetics Corp Plant expression system comprising a defective tobamovirus replicon integrated into the plant chromosome and a helper virus
AU6162294A (en) 1993-01-13 1994-08-15 Pioneer Hi-Bred International, Inc. High lysine derivatives of alpha-hordothionin
US5583210A (en) 1993-03-18 1996-12-10 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Methods and compositions for controlling plant development
US5576198A (en) 1993-12-14 1996-11-19 Calgene, Inc. Controlled expression of transgenic constructs in plant plastids
US5837458A (en) 1994-02-17 1998-11-17 Maxygen, Inc. Methods and compositions for cellular and metabolic engineering
US5605793A (en) 1994-02-17 1997-02-25 Affymax Technologies N.V. Methods for in vitro recombination
US5593881A (en) 1994-05-06 1997-01-14 Mycogen Corporation Bacillus thuringiensis delta-endotoxin
US5633363A (en) 1994-06-03 1997-05-27 Iowa State University, Research Foundation In Root preferential promoter
US5736369A (en) 1994-07-29 1998-04-07 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Method for producing transgenic cereal plants
US5608144A (en) 1994-08-12 1997-03-04 Dna Plant Technology Corp. Plant group 2 promoters and uses thereof
US5792931A (en) 1994-08-12 1998-08-11 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Fumonisin detoxification compositions and methods
US5736514A (en) 1994-10-14 1998-04-07 Nissan Chemical Industries, Ltd. Bacillus strain and harmful organism controlling agents
US5659026A (en) 1995-03-24 1997-08-19 Pioneer Hi-Bred International ALS3 promoter
US5853973A (en) 1995-04-20 1998-12-29 American Cyanamid Company Structure based designed herbicide resistant products
DE69636637T2 (de) 1995-04-20 2007-08-23 Basf Ag Auf basis ihrer struktur entworfene herbizid-resistente produkte
BR9609200A (pt) 1995-06-02 1999-05-11 Pioneer Hi Bred Int Derivados de alta treonina de alpha-hordotionina
WO1996038563A1 (en) 1995-06-02 1996-12-05 Pioneer Hi-Bred International, Inc. HIGH METHIONINE DERIVATIVES OF α-HORDOTHIONIN
US5925806A (en) 1995-06-06 1999-07-20 Mcbride; Kevin E. Controlled expression of transgenic constructs in plant plastids
US5837876A (en) 1995-07-28 1998-11-17 North Carolina State University Root cortex specific gene promoter
US5703049A (en) 1996-02-29 1997-12-30 Pioneer Hi-Bred Int'l, Inc. High methionine derivatives of α-hordothionin for pathogen-control
US5850016A (en) 1996-03-20 1998-12-15 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Alteration of amino acid compositions in seeds
US6072050A (en) 1996-06-11 2000-06-06 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Synthetic promoters
EP0946729A2 (en) 1996-11-01 1999-10-06 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Proteins with enhanced levels of essential amino acids
US5981840A (en) 1997-01-24 1999-11-09 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Methods for agrobacterium-mediated transformation
GB9710475D0 (en) 1997-05-21 1997-07-16 Zeneca Ltd Gene silencing
AU745960C (en) 1997-11-18 2003-09-18 Pioneer Hi-Bred International, Inc. A novel method for the integration of foreign DNA into eukaryoticgenomes
CA2306053C (en) 1997-11-18 2003-01-21 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Mobilization of viral genomes from t-dna using site-specific recombination systems
WO1999025853A1 (en) 1997-11-18 1999-05-27 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Targeted manipulation of herbicide-resistance genes in plants
ATE401410T1 (de) 1997-11-18 2008-08-15 Pioneer Hi Bred Int Zusammensetzungen und verfahren für die genetische modifizierung von pflanzen
ATE278782T1 (de) 1998-02-26 2004-10-15 Pioneer Hi Bred Int Konstitutive maispromotoren
ES2252964T3 (es) 1998-08-20 2006-05-16 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Promotores preferidos de semillas.
WO2000012733A1 (en) 1998-08-28 2000-03-09 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Seed-preferred promoters from end genes
WO2000028058A2 (en) 1998-11-09 2000-05-18 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Transcriptional activator lec1 nucleic acids, polypeptides and their uses
US7217858B2 (en) 1998-12-21 2007-05-15 E. I. Du Pont De Nemours And Company S-adenosyl-L-methionine synthetase promoter and its use in expression of transgenic genes in plants
US7531723B2 (en) 1999-04-16 2009-05-12 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Modulation of cytokinin activity in plants
MXPA02012733A (es) 2000-06-23 2003-05-14 Du Pont Extrusturas recombinantes y su uso en la reduccion de la expresion de genes.
US7462481B2 (en) 2000-10-30 2008-12-09 Verdia, Inc. Glyphosate N-acetyltransferase (GAT) genes
US20030186281A1 (en) 2001-12-21 2003-10-02 Wolfgang Hillen Modified tetracycline repressor protein compositions and methods of use
AU2003234328A1 (en) 2002-04-30 2003-11-17 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Novel glyphosate-n-acetyltransferase (gat) genes
US7321031B2 (en) 2003-04-16 2008-01-22 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Seed preferred regulatory elements
GB0328021D0 (en) 2003-12-03 2004-01-07 Inst Of Ophthalmology Method
US7211712B2 (en) 2004-12-10 2007-05-01 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Seed-preferred regulatory elements
AU2006261633A1 (en) 2005-06-17 2006-12-28 E.I. Du Pont De Nemours And Company Methods and compositions for gene silencing
GB0606096D0 (en) * 2006-03-27 2006-05-03 Cbmm Sa Screening method
US8158858B2 (en) 2007-04-04 2012-04-17 E I Du Pont De Nemours And Company Soybean promoters and flower-preferred expression thereof in transgenic plants
WO2008134593A1 (en) * 2007-04-25 2008-11-06 President And Fellows Of Harvard College Molecular circuits
US8759612B2 (en) 2007-05-17 2014-06-24 E. I. Du Pont De Nemours And Company Soybean promoters LTP2 and flower-preferred expression thereof in transgenic plants
US8710206B2 (en) 2007-06-15 2014-04-29 E. I. Du Pont De Nemours And Company Soybean EF1A promoter and its use in constitutive expression of transgenic genes in plants
US8697857B2 (en) 2007-11-20 2014-04-15 E. I. Du Pont De Nemours And Company Soybean EF1A2 promoter and its use in constitutive expression of transgenic genes in plants
US8115055B2 (en) 2007-12-18 2012-02-14 E.I. Du Pont De Nemours And Company Down-regulation of gene expression using artificial microRNAs
US8937217B2 (en) 2007-12-18 2015-01-20 E. I. Du Pont De Nemours And Company Down-regulation of gene expression using artificial microRNAs
US8143475B2 (en) 2007-12-18 2012-03-27 E I Du Pont De Nemours And Company Soybean promoter LTP4 and flower-preferred expression thereof in transgenic plants
WO2009114321A2 (en) 2008-03-11 2009-09-17 Precision Biosciencs, Inc. Rationally-designed meganucleases for maize genome engineering
US8026412B2 (en) 2008-09-09 2011-09-27 E. I. Du Pont De Nemours And Company Soybean MTH1 promoter and its use in constitutive expression of transgenic genes in plants

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1564870A (zh) * 2001-07-10 2005-01-12 蒙特利尔大学 植物转录阻遏物,结合其的蛋白质核因子,及它们的应用
WO2003029453A2 (en) * 2001-09-28 2003-04-10 Novartis Forschungsstiftung, Zweigniederlassung Friedrich Miescher Institute For Biomedical Research Induction of gene expression by silencing of repressor genes
CN102264758A (zh) * 2008-10-28 2011-11-30 先锋国际良种公司 磺酰脲-响应性的阻遏蛋白
CN102905517A (zh) * 2010-04-23 2013-01-30 先锋国际良种公司 基因开关组合物及使用方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
刘智等: "真核转录抑制因子调控机制的研究进展", 《生理科学进展》 *

Also Published As

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