JP3603179B2 - 心血管系組織培養用基材および組織再生法 - Google Patents

心血管系組織培養用基材および組織再生法 Download PDF

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Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、生体吸収性高分子からなる基材の芯材として生体吸収性高分子からなる繊維状補強材を組み込むことによって得られた、組織適合性に優れた心血管系組織培養用基材、および、これを用いた人工血管、心臓弁、心膜などの心血管系組織再生方法に関する。
【０００２】
【従来の技術及びその課題】
例えば、血管の分野で人工血管として最も使用されているのは非吸収性高分子を用いた血管である。例えばゴアテックス製人工血管は臨床において最も一般的に使用される。これは物性的に優れているが、非吸収性であるために移植後長期にわたって異物が体内に残存する。また小児に使用した場合、成長に伴って大きくならないため改めて手術する必要がある。
【０００３】
これに対して近年Ｔｉｓｓｕｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇを用いた組織再生方法が試みられている。これは生体吸収性高分子からなる足場に組織の細胞を播種し、培養することによって、自己の組織を再生しようとする試みである。すでに皮膚（Ｍ．Ｌ．Ｃｏｏｐｅｒ，Ｌ． Ｆ．Ｈａｎｓｂｒｏｕｇｈ，Ｒ．Ｌ．Ｓｐｉｅｌｖｏｇｅｌ ｅｔ．ａｌ． ：Ｉｎ ｖｉｖｏ ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｌｉｖｉｎｇ ｄｅｒｍａｌ ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅ ｅｍｐｌｏｙｉｎｇ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｈｕｍａｎ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ ｏｎ ａ ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ ｐｏｌｙｇｌｙｃｏｌｉｃ ａｃｉｄ ｏｒ ｐｏｌｙｇｌａｃｔｉｎ ｍｅｓｈ． Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ， １２：２４３−２４８，１９９１）や軟骨（Ｃ．Ａ．Ｖａｃａｎｔｉ，Ｒ．ｌａｎｇｅｒ，ｅｔ ａｌ：Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｐｏｌｙｍｅｒｓ ｓｅｅｄｅｄ ｗｉｔｈ ｃｈｏｎｄｒｏｃｙｔｅｓ ｐｒｏｖｉｄｅ ａ ｔｅｍｐｌｅｔｅ ｆｏｒ ｎｅｗ ｃａｒｔｉｌａｇｅ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ． Ｐｌａｓｔ．Ｒｅｃｏｎｓｔｒ．Ｓｕｒｇ．，８８：７５３−７５９，１９９１）については多くの研究例が報告されている。
【０００４】
同様に血管についても自己組織から再生できれば、抗凝固剤の使用の必要が なく、また自己組織であるため成長も期待できる。
【０００５】
本発明の目的は、細胞の接着性を十分に保持し、細胞増殖のための最適な足場となり、自己の組織が再生されるまでの期間、血流に対して耐性を有し、最終的には生体内に分解吸収される基材を提供することにある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
心血管系組織培養用基材として、基本的に最も必要とされる条件は播いた細胞が材料にしっかりつくことと血管が再生されたときには材料が吸収されていることの２点である。この条件に最も適した材料として発泡体が考えられる。
【０００７】
しかし血管で使用する場合もうひとつの条件として埋植後血管が再生するまでの期間、血流に耐えて強度を保たせなければならない。
【０００８】
本発明者は、細胞の接着性に優れ、増殖のための最適な足場となる、生体吸収性材料からなる発泡体を、同じく生体吸収性材料からなる補強材で強化することにより、上記課題が達成できることを見出した。
【０００９】
本発明は、下記の１．〜５．を提供するものである。
１． 生体吸収性材料からなる発泡体を生体吸収性材料からなる補強材によって強化した心血管系組織培養用基材。
２． 請求項１に記載の基材に細胞を播種する事によって心血管系組織を再生することを特徴とする心血管系組織再生法。
３． 再生する心血管系組織が血管であることを特徴とする請求項２に記載の心血管系組織再生法。
４． 再生する心血管系組織が心臓弁であることを特徴とする請求項２に記載の心血管系組織再生法。
５． 再生する心血管系組織が心膜であることを特徴とする請求項２に記載の心血管系組織再生法。
【００１０】
【発明の実施の形態】
生体吸収性材料としては、ポリグリコール酸、ポリ乳酸（Ｄ、Ｌ、ＤＬ）、ポリカプロラクトン、グリコール酸−乳酸（Ｄ、Ｌ、ＤＬ）共重合体、グリコール酸−カプロラクトン共重合体、乳酸（Ｄ、Ｌ、ＤＬ）−カプロラクトン共重合体、ポリ（ｐ−ジオキサノン）等が挙げられる。
【００１１】
心血管系組織としては、血管、心臓弁、心膜などが挙げられる。
【００１２】
本発明の基材は、生体吸収性材料からなる発泡体を生体吸収性材料からなる補強材（繊維状、不織布状、フィルム状）によって強化する。なお、発泡体と補強材を構成する生体吸収性材料の組み合わせは任意であるが、例えば血管の場合、発泡体として乳酸−カプロラクトン共重合体、補強材として動脈の場合ポリ乳酸、静脈の場合ポリグリコール酸の組み合わせが例示できる。更に、心臓弁、心膜の場合は発泡体として乳酸−カプロラクトン共重合体、補強材としてポリ乳酸の組み合わせが例示できる。
【００１３】
発泡体の孔径は細胞が適当に接着し、増殖すると同時に心血管系組織として移植した際に血液漏れしないことが好ましく、その孔径は通常１ｍｍ以下、好ましくは５〜１００μｍである。構造は心血管系組織が血管の場合には円筒形、心膜、心臓弁の場合には平面状であり、血管の場合、内径及び長さは目的とする血管に合わせて作製する。基材の厚みは吸収期間あるいは縫合のしやすさから決定され、通常５ｍｍ以下、好ましくは５００μｍから２ｍｍである。
【００１４】
発泡体の作製方法としては、以下の方法が例示できる。
（１）凍結乾燥法
基材とするポリマー溶液を型に入れて凍結した後、凍結乾燥する。凍結温度、ポリマーの濃度によって種々の空孔径を有する発泡体が得られる。（実施例に記載）
（２）溶出法
水溶性物質を基材とするポリマー溶液に混合し、乾燥後、当該水溶性物質を水洗によって洗い流す。水溶性物質の粒子に応じた径を有する発泡体が得られる。本例においてはシュークロースが適当に使用できる。
【００１５】
補強材は基材となる発泡体より強度が大きい必要がある。繊維状、不織布状、フィルム状等から選択できる。
【００１６】
補強材は発泡体と一体になっていることが好ましく、その位置は内面，中心，外面のいずれでも可能であるが発泡体の内面は血管内皮細胞との接着に関与するため、中心あるいは外面が好ましいが、内面でも可能である。
【００１７】
播種する細胞としては、心血管系組織ではほぼ共通の細胞種を用いる。即ち、内皮細胞、平滑筋細胞、線維芽細胞で、これらの２種または３種の混合培養細胞が例示でき、混合培養細胞を使用して、組織構築を行う。
【００１８】
使用する細胞の培養条件、播種方法を以下に示す。
Ａ．細胞単離、細胞培養、細胞数増大
完全清潔下に採取した血管組織を細胞培養液に浸漬し、クリーンベンチ内でリン酸化生食を用いて洗浄する。次に、ペトリディッシュ上で外科メスを用いて単純なｅｘｐｌａｎｔ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ に準じて組織の裁断を行う。約１−２ｍｍ２大の細組織片を均等にディッシュ上に分配し、約２０分後、組織がディッシュ下面に強固に接着した後に培養液を加える。培養液は、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅｓ Ｍｅｄｉａ （ＤＭＥＭ）に１０％牛胎児血清と１％の抗生物質溶液（Ｌ−グルタミン２９．２ｍｇ／ｍｌ、ペニシリンＧ １０００ｕ／ｍｌ、ストレプトマイシン硫酸塩１０，０００μｇ／ｍｌ）を補填したものを使用する。血管壁細胞は、５−７日後に、細胞が組織からディッシュ上に移動し始め、さらに１週間後には混合細胞コロニーがｅｘｐｌａｎｔ組織片の周囲に形成される。その２〜３週後に、混合細胞はディッシュ上でコンフルエントの状態を形成する。直ちに０．２５％トリプシンにてＰａｓｓａｇｅを行い、７５ｃｍ２の培養フラスコ上での培養を開始するが、概ねこのフラスコがｃｏｎｆｌｕｅｎｔになると約二百万個の細胞を得たことになる。５％ＣＯ２、２１％Ｏ２の環境下で細胞培養を行い、１０×１０６個の細胞数を得るまで培養を続ける。培養液は４−５日ごとに交換するが、予備実験の結果では細胞のｄｏｕｂｌｉｎｇ ｔｉｍｅは、約４８時間である。尚、経過中の細胞数の算定はトリパンブルーによる古典的なｅｘｃｌｕｓｉｏｎ法に従って行う。
Ｂ．細胞隔離、内皮細胞純化
混合細胞がコンフルエントに達し、ある程度の細胞数が得られた段階で、以下の手順に従い、ＦＡＣＳを用いて混合細胞から内皮細胞を選別分離する。Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社のＤｉｌ−ａｃｅｔｙｌａｔｅｄ ＬＤＬ（蛍光色素マーカー）（以下Ｄｉｌ−Ａｃ−ＬＤＬ）を混合細胞培養液中に１μｇ／ｍｌの濃度で添加し、２４時間のｉｎｃｕｂａｔｉｏｎを行う。このマーカーは内皮細胞、マクロファージに特有なスキャベンジャー経路を通過して細胞内に取り込まれる。２４時間後にｔｒｉｐｓｉｎｉｚｅを行い、混合細胞浮遊液を作成し、セルソーター（ＦＡＣＳ ｍａｃｈｉｎｅ： Ｂｅｃｔｉｎ Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎ社製）を使用してソートする。細胞は、その大きさと蛍光発光に基づいてＤｉｌ−Ａｃ−ＬＤＬ陽性と陰性に選別される。分離後これらを別々に培養し、内皮細胞が二百万個になるまで継続する。
Ｃ．組織構築
組織を構築する第１段階は、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける細胞播種である。具体的には、生分解性の培養基材に約１００万個／１ｃｍ２のＤｉｌ−Ａｃ−ＬＤＬ陰性の線維芽細胞を播種する。
【００１９】
濃縮細胞浮遊液のポリマー上への播種直後は、３０−６０分間培養皿上でクリーンベンチ内に放置し、その後約５０ｍｌの培養液を添加する。培養液は基本的に毎日交換し、７日後、外科的移植の一日前に内皮細胞の細胞浮遊液（約二百万個）でさらなる播種を行い、この作業で単一層の内皮細胞化を図る。
【００２０】
上記のＡ．〜Ｃ．は、心臓弁、心膜、血管作製の際の細胞採取、培養、播種方法を例示するものである。
【００２１】
【実施例】
以下、本発明を実施例を用いてより詳細に説明する。
実施例１
・血管再生用材料の作製
外径１０ｍｍのガラス製試験管にポリ−Ｌ−乳酸繊維からなる平織（写真）を円筒状にして２重にまきつけた。これを内径１２ｍｍの型枠内に設置し、間隙にＬ−乳酸−カプロラクトンからなる共重合体（５０：５０）のジオキサン溶液（５％）を流し込み、凍結後凍結乾燥した。
【００２２】
取り出した円筒形人工血管は基材が発泡体構造で、心材に繊維状強化材が組み込まれた構造をしていた（図１，図２）。
・細胞の培養
皮膚小切開より約５ｍｍ長の末梢静脈片を完全清潔下に採取し、直ちに組織培養液に浸漬する。単純ｅｘｐｌａｎ法をもちいて、細胞の単離を行った。細胞培養液は上述した一般的細胞培養液のＤＭＥＭ液を使用し、２−３日ごとに培養液の交換を行った。
・細胞の播種
培養した細胞を作製したマトリックスに１ｃｍ２あたり約１００万個の内皮細胞と線維芽細胞の混合細胞を播種し、さらに表面が細胞によって被われるまで、約１週間培養を継続した。
【００２３】
【発明の効果】
動物実験
上記で作製した人工血管を子犬の下大静脈に移植したところ、破裂閉塞は認められず、術後３ヶ月目の血管造影検査でも良好な開存が認められた（血管造影写真、図３）。さらに６ヶ月後に開胸したところ、移植部位に一致して自己血管の再生が認められた。
【００２４】
一方ポリ−Ｌ−乳酸繊維で強化しない材料は置換後１週間後に破裂し実験動物は突然死した。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の血管培養用基材の断面を示す図面代用写真である。
【図２】本発明の血管培養用基材の平面を示す図面代用写真である。
【図３】術後３ヶ月目の血管造影写真を示す図面代用写真である。

Claims (4)

  1. 生体吸収性材料からなる発泡体を生体吸収性材料からなる補強材によって強化した心血管系組織培養用基材であって、生体吸収性材料がポリグリコール酸、ポリ乳酸（Ｄ、Ｌ、ＤＬ）、ポリカプロラクトン、グリコール酸−乳酸（Ｄ、Ｌ、ＤＬ）共重合体、グリコール酸−カプロラクトン共重合体、乳酸（Ｄ、Ｌ、ＤＬ）−カプロラクトン共重合体、ポリ（ｐ−ジオキサノン）からなる群から選ばれ、厚みが５００μｍ〜５ｍｍであり、前記補強材が中心或いは外面に位置し、内面は生体吸収性材料からなる発泡体である心血管系組織培養用基材。
  2. 請求項１に記載の基材に細胞をin vitroで播種し、さらにin vitroで培養することを特徴とする基材表面が細胞で被われた移植用心血管系組織の製造方法。
  3. 請求項１に記載の基材に細胞をin vitroで播種し、さらに培養することによって心血管系組織をin vitroで再生することを特徴とする心血管系組織再生法。
  4. 請求項１に記載の基材に細胞をin vitroで播種し、さらにin vitroで培養して得られる内皮細胞化された移植用心血管系組織。
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