JP2001078750A - 心血管系組織培養用基材および組織再生法 - Google Patents
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Abstract
の最適な足場となり、自己の組織が再生されるまでの期
間、血流に対して耐性を有し、最終的には分解吸される
基材を提供する。 【解決手段】生体吸収性材料からなる発泡体を生体吸収
性材料からなる補強材によって強化した心血管系組織培
養用基材。
Description
からなる基材の芯材として生体吸収性高分子からなる繊
維状補強材を組み込むことによって得られた、組織適合
性に優れた心血管系組織培養用基材、および、これを用
いた人工血管、心臓弁、心膜などの心血管系組織再生方
法に関する。
血管として最も使用されているのは非吸収性高分子を用
いた血管である。例えばゴアテックス製人工血管は臨床
において最も一般的に使用される。これは物性的に優れ
ているが、非吸収性であるために移植後長期にわたって
異物が体内に残存する。また小児に使用した場合、成長
に伴って大きくならないため改めて手術する必要があ
る。
いた組織再生方法が試みられている。これは生体吸収性
高分子からなる足場に組織の細胞を播種し、培養するこ
とによって、自己の組織を再生しようとする試みであ
る。すでに皮膚(M.L.Cooper,L.F.Hansbrough,R.L.Spiel
vogel et.al. :In vivo optimization of a living der
mal substitute employing cultured human fibroblast
s on a biodegradablepolyglycolic acid or polyglact
in mesh. Biomaterials, 12:243-248,1991)や軟骨(C.
A.Vacanti,R.langer,et al:Synthetic polymers seeded
with chondrocytes provide a templete for new cart
ilage formation. Plast.Reconstr.Surg.,88:753-759,1
991)については多くの研究例が報告されている。
きれば、抗凝固剤の使用の必要がなく、また自己組織で
あるため成長も期待できる。
持し、細胞増殖のための最適な足場となり、自己の組織
が再生されるまでの期間、血流に対して耐性を有し、最
終的には生体内に分解吸収される基材を提供することに
ある。
として、基本的に最も必要とされる条件は播いた細胞が
材料にしっかりつくことと血管が再生されたときには材
料が吸収されていることの2点である。この条件に最も
適した材料として発泡体が考えられる。
件として埋植後血管が再生するまでの期間、血流に耐え
て強度を保たせなければならない。
ための最適な足場となる、生体吸収性材料からなる発泡
体を、同じく生体吸収性材料からなる補強材で強化する
ことにより、上記課題が達成できることを見出した。
のである。 1. 生体吸収性材料からなる発泡体を生体吸収性材料
からなる補強材によって強化した心血管系組織培養用基
材。 2. 請求項1に記載の基材に細胞を播種する事によっ
て心血管系組織を再生することを特徴とする心血管系組
織再生法。 3. 再生する心血管系組織が血管であることを特徴と
する請求項2に記載の心血管系組織再生法。 4. 再生する心血管系組織が心臓弁であることを特徴
とする請求項2に記載の心血管系組織再生法。 5. 再生する心血管系組織が心膜であることを特徴と
する請求項2に記載の心血管系組織再生法。
リコール酸、ポリ乳酸(D、L、DL)、ポリカプロラ
クトン、グリコール酸−乳酸(D、L、DL)共重合
体、グリコール酸−カプロラクトン共重合体、乳酸
(D、L、DL)−カプロラクトン共重合体、ポリ(p
−ジオキサノン)等が挙げられる。
膜などが挙げられる。
発泡体を生体吸収性材料からなる補強材(繊維状、不織
布状、フィルム状)によって強化する。なお、発泡体と
補強材を構成する生体吸収性材料の組み合わせは任意で
あるが、例えば血管の場合、発泡体として乳酸−カプロ
ラクトン共重合体、補強材として動脈の場合ポリ乳酸、
静脈の場合ポリグリコール酸の組み合わせが例示でき
る。更に、心臓弁、心膜の場合は発泡体として乳酸−カ
プロラクトン共重合体、補強材としてポリ乳酸の組み合
わせが例示できる。
すると同時に心血管系組織として移植した際に血液漏れ
しないことが好ましく、その孔径は通常1mm以下、好ま
しくは5〜100μmである。構造は心血管系組織が血管の
場合には円筒形、心膜、心臓弁の場合には平面状であ
り、血管の場合、内径及び長さは目的とする血管に合わ
せて作製する。基材の厚みは吸収期間あるいは縫合のし
やすさから決定され、通常5mm以下、好ましくは500μm
から2mmである。
例示できる。 (1)凍結乾燥法 基材とするポリマー溶液を型に入れて凍結した後、凍結
乾燥する。凍結温度、ポリマーの濃度によって種々の空
孔径を有する発泡体が得られる。(実施例に記載) (2)溶出法 水溶性物質を基材とするポリマー溶液に混合し、乾燥
後、当該水溶性物質を水洗によって洗い流す。水溶性物
質の粒子に応じた径を有する発泡体が得られる。本例に
おいてはシュークロースが適当に使用できる。
い必要がある。繊維状、不織布状、フィルム状等から選
択できる。
好ましく、その位置は内面,中心,外面のいずれでも可
能であるが発泡体の内面は血管内皮細胞との接着に関与
するため、中心あるいは外面が好ましいが、内面でも可
能である。
ほぼ共通の細胞種を用いる。即ち、内皮細胞、平滑筋細
胞、線維芽細胞で、これらの2種または3種の混合培養
細胞が例示でき、混合培養細胞を使用して、組織構築を
行う。
に示す。 A.細胞単離、細胞培養、細胞数増大 完全清潔下に採取した血管組織を細胞培養液に浸漬し、
クリーンベンチ内でリン酸化生食を用いて洗浄する。次
に、ペトリディッシュ上で外科メスを用いて単純なexpl
ant technique に準じて組織の裁断を行う。約1−2m
m2大の細組織片を均等にディッシュ上に分配し、約2
0分後、組織がディッシュ下面に強固に接着した後に培
養液を加える。培養液は、Dulbecco's Modified Eagles
Media (DMEM)に10%牛胎児血清と1%の抗生物質溶液(L
−グルタミン29.2mg/ml、ペニシリンG 1000u/ml、スト
レプトマイシン硫酸塩10,000μg/ml)を補填したものを
使用する。血管壁細胞は、5−7日後に、細胞が組織か
らディッシュ上に移動し始め、さらに1週間後には混合
細胞コロニーがexplant組織片の周囲に形成される。そ
の2〜3週後に、混合細胞はディッシュ上でコンフルエ
ントの状態を形成する。直ちに0.25%トリプシンにてPas
sageを行い、75cm2の培養フラスコ上での培養を開始す
るが、概ねこのフラスコがconfluentになると約二百万
個の細胞を得たことになる。5%CO2、21%O2の環
境下で細胞培養を行い、10×10 6個の細胞数を得る
まで培養を続ける。培養液は4−5日ごとに交換する
が、予備実験の結果では細胞のdoubling timeは、約4
8時間である。尚、経過中の細胞数の算定はトリパンブ
ルーによる古典的なexclusion法に従って行う。 B.細胞隔離、内皮細胞純化 混合細胞がコンフルエントに達し、ある程度の細胞数が
得られた段階で、以下の手順に従い、FACSを用いて混合
細胞から内皮細胞を選別分離する。BiomedicalTechnolo
gies社のDil-acetylated LDL(蛍光色素マーカー)(以
下Dil-Ac-LDL)を混合細胞培養液中に1μg/mlの濃度で
添加し、24時間のincubationを行う。このマーカーは
内皮細胞、マクロファージに特有なスキャベンジャー経
路を通過して細胞内に取り込まれる。24時間後にtrip
sinizeを行い、混合細胞浮遊液を作成し、セルソーター
(FACS machine: Bectin Dickenson社製)を使用してソ
ートする。細胞は、その大きさと蛍光発光に基づいてDi
l-Ac-LDL陽性と陰性に選別される。分離後これらを別々
に培養し、内皮細胞が二百万個になるまで継続する。 C.組織構築 組織を構築する第1段階は、in vitroにおける細胞播種
である。具体的には、生分解性の培養基材に約100万
個/1cm2のDil-Ac-LDL陰性の線維芽細胞を播種する。
は、30−60分間培養皿上でクリーンベンチ内に放置
し、その後約50mlの培養液を添加する。培養液は基
本的に毎日交換し、7日後、外科的移植の一日前に内皮
細胞の細胞浮遊液(約二百万個)でさらなる播種を行
い、この作業で単一層の内皮細胞化を図る。
作製の際の細胞採取、培養、播種方法を例示するもので
ある。
明する。 実施例1 ・血管再生用材料の作製 外径10mmのガラス製試験管にポリ−L−乳酸繊維からな
る平織(写真)を円筒状にして2重にまきつけた。これを
内径12mmの型枠内に設置し、間隙にL−乳酸−カプロラ
クトンからなる共重合体(50:50)のジオキサン溶液
(5%)を流し込み、凍結後凍結乾燥した。
構造で、心材に繊維状強化材が組み込まれた構造をして
いた(図1,図2)。 ・細胞の培養 皮膚小切開より約5mm長の末梢静脈片を完全清潔下に
採取し、直ちに組織培養液に浸漬する。単純explan法を
もちいて、細胞の単離を行った。細胞培養液は上述した
一般的細胞培養液のDMEM液を使用し、2−3日ごとに培
養液の交換を行った。 ・細胞の播種 培養した細胞を作製したマトリックスに1cm2あたり約10
0万個の内皮細胞と線維芽細胞の混合細胞を播種し、さ
らに表面が細胞によって被われるまで、約1週間培養を
継続した。
ころ、破裂閉塞は認められず、術後3ヶ月目の血管造影
検査でも良好な開存が認められた(血管造影写真、図
3)。さらに6ヶ月後に開胸したところ、移植部位に一
致して自己血管の再生が認められた。
は置換後1週間後に破裂し実験動物は突然死した。
写真である。
写真である。
真である。
Claims (5)
- 【請求項1】生体吸収性材料からなる発泡体を生体吸収
性材料からなる補強材によって強化した心血管系組織培
養用基材。 - 【請求項2】請求項1に記載の基材に細胞を播種するこ
とによって心血管系組織を再生することを特徴とする心
血管系組織再生法。 - 【請求項3】再生する心血管系組織が血管であることを
特徴とする請求項2に記載の心血管系組織再生法。 - 【請求項4】再生する心血管系組織が心臓弁であること
を特徴とする請求項2に記載の心血管系組織再生法。 - 【請求項5】再生する心血管系組織が心膜であることを
特徴とする請求項2に記載の心血管系組織再生法。
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