JP5139749B2 - 心血管系組織培養用基材の製造方法 - Google Patents

Description

本発明は、細胞を播種して移植することにより血管再生の足場材となり、かつ、高い非漏血性を有する、極めて高い効率で血管を再生することができる心血管系組織培養用基材を製造する方法に関する。

現在、臨床において人工血管として最も使用されているのは、ゴアテックス等の非吸収性高分子を用いたものである。このような人工血管は、極めて血管に近い物性を発揮させることができ、短期的な血管の再建術には一定の成果をあげている。しかしながら、非吸収性高分子を用いた人工血管は、移植後長期にわたって異物が体内に残存することから、継続的に抗凝固剤等を投与しなければならないという問題があった。また、小児に使用した場合、成長に伴って改めて手術する必要が生じるという問題もあった。

これに対して近年、いわゆる再生医療による組織再生方法が試みられている。再生医療とは、足場となる細胞培養基材に組織を構成する細胞を播種し、これを移植することによって、自己の組織を再生しようとする試みである。再生医療については、例えば皮膚（非特許文献１）や軟骨（非特許文献２）をはじめとする種々の組織について多くの研究例が報告されている。

このような再生医療を血管再生術に応用すべく本願発明者らは、生体吸収性高分子からなる発泡体に、芯材として生体吸収性高分子からなる補強材を組み込んだ心血管系組織培養用基材を開発した（特許文献１）。この心血管系組織培養用基材においては、発泡体が播種した細胞をしっかりと接着できる足場となり、かつ、補強材が移植後に血管が再生するまでの期間、血流に耐えて強度を保たせる役割を果したり、縫合に耐える補強材の役目も果たす。発泡体と補強材とが共に生体吸収性高分子からなることにより血管再生後には材料が吸収されることから抗凝固剤等の継続的な使用は不要となる。更に、再生された血管は自己組織であるため成長も期待できる。実際、該心血管系組織培養用基材は、臨床的にも極めて有意義であることが確認されつつある。しかしながら、人工血管を適用する場合、血液が漏出しないこと（非漏血性）が要求される。心血管系組織培養用基材においても、血管再生の足場材としての機能を維持したまま、動脈等に適用した場合にも血液が漏出しないという性能が求められていた。
特開２００１−７８７５０号公報 ＭＬ．Ｃｏｏｐｅｒ，Ｌ．Ｆ．Ｈａｎｓｂｒｏｕｇｈ，Ｒ．Ｌ．Ｓｐｉｅｌｖｏｇｅｌ ｅｔ．ａｌ，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，１２：２４３−２４８，１９９１ Ｃ．Ａ．Ｖａｃａｎｔｉ，Ｒ．ｌａｎｇｅｒ，ｅｔ ａｌ，Ｐｌａｓｔ．Ｒｅｃｏｎｓｔｒ．Ｓｕｒｇ，８８：７５３−７５９，１９９１

本発明は、上記現状に鑑み、細胞を播種して移植することにより血管再生の足場材となり、かつ、高い非漏血性を有する、極めて高い効率で血管を再生することができる心血管系組織培養用基材を製造する方法を提供することを目的とする。

本発明１は、生体吸収性材料からなる発泡体を生体吸収性材料からなる補強材によって強化したチューブ状の心血管系組織培養用基材を製造する方法であって、棒状体に前記補強材を巻きつけて装着する工程と、前記補強材が装着された棒状体を、生体吸収性材料を有機溶媒に溶解した溶液中に浸漬し、凍結した後に凍結乾燥することにより補強材の片面に発泡体が複合化された複合体を形成する工程と、得られた前記補強材の片面に発泡体が複合化された複合体を反転させながら棒状体から取り外した後、再び発泡体側が棒状体に接するように棒状体に装着する工程と、前記補強材の片面に発泡体が複合化された複合体が装着された棒状体を、生体吸収性材料を有機溶媒に溶解した溶液中に浸漬し、凍結した後に凍結乾燥することにより補強材の両面に発泡体が複合化された複合体を形成する工程とを有する心血管系組織培養用基材の製造方法である。

本発明２は、生体吸収性材料からなる発泡体を生体吸収性材料からなる補強材によって強化したチューブ状の心血管系組織培養用基材を製造する方法であって、棒状体に前記補強材を巻きつけて装着する工程と、前記補強材が装着された棒状体を、生体吸収性材料を有機溶媒に溶解した溶液中に浸漬し、凍結した後に凍結乾燥することにより補強材の片面に発泡体が複合化された複合体を形成する工程と、得られた前記補強材の片面に発泡体が複合化された複合体が装着された棒状体を、生体吸収性材料を有機溶媒に溶解した溶液中に浸漬し、凍結した後に凍結乾燥することにより補強材の片面に２層構造の発泡体が複合化された複合体を形成する工程とを有する心血管系組織培養用基材の製造方法である。
以下に本発明を詳述する。

本発明者らは、鋭意検討の結果、生体吸収性材料からなる発泡体を生体吸収性材料からなる補強材によって強化したチューブ状の心血管系組織培養用基材について、特定の製造方法により製造したときに特に高い非漏血性を発揮できることを見出し、本発明を完成するに至った。

まず、本発明１の心血管系組織培養用基材の製造方法について説明する。
本発明１の心血管系組織培養用基材の製造方法は、棒状体に補強材を巻きつけて装着する工程（以下、装着工程ともいう）を有する。
前記補強材は、生体吸収性材料からなるものであって、心血管系組織培養用基材に埋植後血管が再生するまでの期間、血流に耐えて強度を保たせる役割を付与するものである。

上記補強材を構成する生体吸収性材料としては特に限定されず、例えば、ポリグリコリド、ポリラクチド（Ｄ、Ｌ、ＤＬ体）、ポリカプロラクトン、グリコリド−ラクチド（Ｄ、Ｌ、ＤＬ体）共重合体、グリコリド−ε−カプロラクトン共重合体、ラクチド（Ｄ、Ｌ、ＤＬ体）−ε−カプロラクトン共重合体、ポリ（ｐ−ジオキサノン）、グリコリド−ラクチド（Ｄ、Ｌ、ＤＬ体）−ε−カプロラクトン共重合体等が挙げられる。

上記補強材としては特に限定されないが、例えば、繊維状体、不織布等が好適である。
上記繊維状体としては特に限定されないが、例えば、糸を筒状に編成した平編地、織り地、たて編み、天竺織り、ツインニット等が挙げられる。
上記不織布の調製方法としては特に限定されず、例えば、溶融紡糸法等により上記生体吸収性材料の繊維を作製し、この繊維を編織して得た布を多数の針のついたニードルパンチ機に通して繊維を機械的に絡み合わせるニードルパンチ法；溶融した上記生体吸収性材料を多数のノズルから同時に吹き出して細い繊維を作りながら、この繊維をあらゆる方向にクモの巣状に配置して均一な厚さのウェブを作製し、自然に又は機械的に糸同士を接着するメルトブロー法、また、溶融した上記生体吸収性材料に高電圧をかけることでスプレーを引き起こして細い繊維を作りながら基板上に均一で、ナノ繊維径のウェブを作製し、自然に又は機械的に糸同士を接着するＥＳＤ法等が挙げられる。

上記装着工程においては、別に調製した上記補強材を棒状体に巻きつけて装着する。
上記棒状体としては、目的とする心血管系組織培養用基材の内径に相当する直径を有するものであれば特に限定されないが、例えば、ガラス棒やフッ素樹脂製の棒等の離型性に優れるものが好適である。

本発明１の心血管系組織培養用基材の製造方法では、次いで、補強材が装着された棒状体を、生体吸収性材料を有機溶媒に溶解した溶液中に浸漬し、凍結した後に凍結乾燥することにより補強材の片面に発泡体が複合化された複合体を形成する工程（以下、１回目の発泡体形成工程ともいう）を行う。

発泡体を形成するための生体吸収性材料としては特に限定されず、上記補強材を構成するものと同様のものを挙げることができる。
なお、発泡体と補強材を構成する生体吸収性材料の組み合わせは任意であるが、例えば血管の場合、発泡体として乳酸−カプロラクトン共重合体、補強材として動脈の場合ポリ乳酸、静脈の場合ポリグリコリドの組み合わせが例示できる。更に、心臓弁、心膜の場合は発泡体として乳酸−カプロラクトン共重合体、補強材としてポリ乳酸の組み合わせが例示できる。

上記生体吸収性材料を溶解する有機溶媒としては特に限定されず、例えば、ジオキサン、クロロホルム等が好適である。
上記生体吸収性材料を有機溶媒に溶解した溶液の濃度としては特に限定されないが、好ましい下限は１重量％、好ましい上限は１０重量％である。１重量％未満であると、充分な厚みと密度とを持った発泡体が形成されないことがあり、１０重量％を超えると、得られる発泡体が緻密になりすぎて、細胞の侵入性に劣ることがある。

上記補強材が装着された棒状体を上記溶液中に浸漬し、凍結した後に凍結乾燥することにより、補強材の片面に発泡体が複合化された複合体が形成される。
上記凍結及び凍結乾燥の条件としては特に限定されないが、例えば、−８０℃で凍結し、−４０〜４０℃で１２時間凍結乾燥する条件で行うことが挙げられる。上記溶液の濃度のほか、凍結及び凍結乾燥の条件を選択することによっても得られる発泡体の厚さや孔径を制御することができる。

本発明１の心血管系組織培養用基材の製造方法では、次いで、得られた前記補強材の片面に発泡体が複合化された複合体を反転させながら棒状体から取り外した後、再び発泡体側が棒状体に接するように棒状体に装着する工程（以下、反転装着工程ともいう）を行う。

本発明１の心血管系組織培養用基材の製造方法では、次いで、上記補強材の片面に発泡体が複合化された複合体が装着された棒状体を、生体吸収性材料を有機溶媒に溶解した溶液中に浸漬し、凍結した後に凍結乾燥することにより補強材の両面に発泡体が複合化された複合体を形成する工程（以下、２回目の発泡体形成工程ともいう）を行う。
上記反転装着工程において、補強材の片面に発泡体が複合化された複合体の発泡体側が棒状体に接するように装着されていることから、２回目の発泡体形成工程により補強材の他方の面に発泡体が形成され、補強材の両面に発泡体が複合化された複合体、即ち、心血管系組織培養用基材が形成される。

上記２回目の発泡体形成工程において用いる生体吸収性材料を有機溶媒に溶解した溶液や、凍結、凍結乾燥の条件等は、上記１回目の発泡体形成工程と同じであってもよく、変わっていてもよい。

次に、本発明２の心血管系組織培養用基材の製造方法について説明する。
本発明２の心血管系組織培養用基材の製造方法においても、まず、装着工程、１回目の発泡体形成工程を行う点では本発明１の心血管系組織培養用基材の製造方法の場合と同様である。
本発明２の心血管系組織培養用基材の製造方法においては、１回目の発泡体形成工程において得られた補強材の片面に発泡体が複合化された複合体を棒状体から取り外すことなく（即ち、本発明１の心血管系組織培養用基材の製造方法における反転装着工程を行わずに）、生体吸収性材料を有機溶媒に溶解した溶液中に浸漬し、凍結した後に凍結乾燥することにより補強材の片面に２層構造の発泡体が複合化された複合体を形成する工程（以下、２回目の発泡体形成工程ともいう）を行う。
上記１回目の発泡体形成工程において、既に補強材の片面には発泡体が複合化されており、２回目の発泡体形成工程により該発泡体上に更に別の発泡体を積層された複合体、即ち、心血管系組織培養用基材が形成される。

このようにして得られた本発明１及び本発明２の心血管系組織培養用基材は、発泡体が播種した細胞をしっかりと接着できる足場となり、かつ、補強材が移植後に血管が再生するまでの期間、血流に耐えて強度を保たせる役割を果したり、縫合に耐える補強材の役目も果たす。発泡体と補強材とが共に生体吸収性高分子からなることにより血管再生後には材料が吸収されることから抗凝固剤等の継続的な使用も不要となる。再生された血管は自己組織であるため成長も期待できる。

更に、本発明１及び本発明２の製造方法により製造された心血管系組織培養用基材は、従来の製造方法により製造されたものに比べて特に高い非漏血性が発揮される。
この理由については定かではないが、おそらく、２回目の発泡体形成工程において上記補強材の片面に発泡体が複合化された複合体を生体吸収性材料を有機溶媒に溶解した溶液中に浸漬したときに、発泡体の表面の一部が有機溶媒により溶解され、それが凍結、凍結乾燥されることにより、細胞の足場としての機能に影響しない程度のごく薄いフイルム状の層が形成されるためではないかと考えられる。

本発明によれば、細胞を播種して移植することにより血管再生の足場材となり、かつ、高い非漏血性を有する、極めて高い効率で血管を再生することができる心血管系組織培養用基材を製造する方法を提供することができる。

以下に実施例を挙げて本発明の態様を更に詳しく説明するが、本発明はこれら実施例にのみ限定されるものではない。

（実施例１）
繊維径１４０デニールのポリグリコリドの糸を筒状に編成した平編地を作成した。これを外径８ｍｍのフッ素樹脂製の棒に装着した。
Ｌ−ラクチド−ε−カプロラクトン共重合体（モル比５０：５０）の４重量％ジオキサン溶液を調製し、この溶液中に平編地が装着された棒を浸漬した後、−８０℃で凍結、−４０℃〜４０℃で１２時間凍結乾燥した。

次いで得られた複合体をフッ素樹脂製の棒から反転させながら取り外した後、再び発泡体側が棒に接するように棒に装着した。これをＬ−ラクチド−ε−カプロラクトン共重合体（モル比５０：５０）の４重量％ジオキサン溶液に浸漬した後、−８０℃で凍結、−４０℃〜４０℃で１２時間凍結乾燥して、ポリグリコリド編地で補強されたサンドイッチ構造のチューブ状の心血管系組織培養用基材を得た。なお、発泡層（スポンジ層）の厚さは両面で計約０．７ｍｍであった。

得られた心血管系組織培養用基材の断面の電子顕微鏡写真を図１に示した。
図１より、２層の発泡層の間に、ごく薄いフィルム状体が形成されていることが認められた（図１の矢印部分）。

（実施例２）
繊維径１４０デニールのポリグリコリドの糸を筒状に編成した平編地を作成した。これを外径８ｍｍのフッ素樹脂製の棒に装着した。
Ｌ−ラクチド−ε−カプロラクトン共重合体（モル比５０：５０）の４重量％ジオキサン溶液を調製し、この溶液中に平編地が装着された棒を浸漬した後、−８０℃で凍結、−４０℃〜４０℃で１２時間凍結乾燥した。

次いで得られた複合体をフッ素樹脂製の棒から取り外すことなく、再びＬ−ラクチド−ε−カプロラクトン共重合体（モル比５０：５０）の４重量％ジオキサン溶液に浸漬した後、−８０℃で凍結、−４０℃〜４０℃で１２時間凍結乾燥して、ポリグリコリド編地で補強されたサンドイッチ構造のチューブ状の心血管系組織培養用基材を得た。なお、発泡層（スポンジ層）の厚さは全体で計約０．７ｍｍであった。

（比較例１）
繊維径１４０デニールのポリグリコリドの糸を筒状に編成した平編を作成した。これを外径８ｍｍのフッ素樹脂製の棒に装着した。
Ｌ−ラクチド−ε−カプロラクトン共重合体（モル比５０：５０）の４重量％ジオキサン溶液を調製し、この溶液中に平編地が装着された棒を浸漬した後、−８０℃で凍結、−４０℃〜４０℃で１２時間凍結乾燥し、ポリグリコリド編地が片面に露出した構造のチューブ状の心血管系組織培養用基材を得た。なお、発泡層（スポンジ層）の厚さは計約０．６ｍｍであった。

（漏血性の評価）
実施例１、２及び比較例１で得られた心血管系組織培養用基材について、以下の方法により漏血性を評価した。
即ち、得られた心血管系組織培養用基材の壁を一部切り抜き、φ２４ｍｍにカットし、耐圧漏水試験機にセットした後、１２０ｍｍＨｇの圧力で水を１分間押しつけ、そのときに漏れ出た水の重さを測定した。なお、試験は各々５回行い、その平均値をとった。
結果を表１に示した。

本発明によれば、細胞を播種して移植することにより血管再生の足場材となり、かつ、高い非漏血性を有する、極めて高い効率で血管を再生することができる心血管系組織培養用基材を製造する方法を提供することができる。

実施例１で作製した心血管系組織培養用基材の断面の電子顕微鏡写真である。

Claims (2)

1. 生体吸収性材料からなる発泡体を生体吸収性材料からなる補強材によって強化したチューブ状の心血管系組織培養用基材を製造する方法であって、
   棒状体に前記補強材を巻きつけて装着する工程と、
   前記補強材が装着された棒状体を、生体吸収性材料を有機溶媒に溶解した溶液中に浸漬し、凍結した後に凍結乾燥することにより補強材の片面に発泡体が複合化された複合体を形成する工程と、
   得られた前記補強材の片面に発泡体が複合化された複合体を反転させながら棒状体から取り外した後、再び発泡体側が棒状体に接するように棒状体に装着する工程と、
   前記補強材の片面に発泡体が複合化された複合体が装着された棒状体を、生体吸収性材料を有機溶媒に溶解した溶液中に浸漬し、凍結した後に凍結乾燥することにより補強材の両面に発泡体が複合化された複合体を形成する工程とを有することを特徴とする心血管系組織培養用基材の製造方法。
2. 生体吸収性材料からなる発泡体を生体吸収性材料からなる補強材によって強化したチューブ状の心血管系組織培養用基材を製造する方法であって、
   棒状体に前記補強材を巻きつけて装着する工程と、
   前記補強材が装着された棒状体を、生体吸収性材料を有機溶媒に溶解した溶液中に浸漬し、凍結した後に凍結乾燥することにより補強材の片面に発泡体が複合化された複合体を形成する工程と、
   得られた前記補強材の片面に発泡体が複合化された複合体が装着された棒状体を、生体吸収性材料を有機溶媒に溶解した溶液中に浸漬し、凍結した後に凍結乾燥することにより補強材の片面に２層構造の発泡体が複合化された複合体を形成する工程とを有することを特徴とする心血管系組織培養用基材の製造方法。