JP3533223B2

JP3533223B2 - ピロホスフェートの放出の検出に基づくｄｎａ配列決定方法

Info

Publication number: JP3533223B2
Application number: JP52854698A
Authority: JP
Inventors: ナイレン、パイ
Original assignee: パイロシーケンシング・アーベー
Priority date: 1996-12-23
Filing date: 1997-12-22
Publication date: 2004-05-31
Anticipated expiration: 2017-12-22
Also published as: GB9626815D0; JP2001506864A; EP0946752B1; EP0946752A1; DE69713386T2; US6258568B1; AU5331198A; WO1998028440A1; DE69713386D1

Description

【発明の詳細な説明】本発明は、ピロホスフェート（PPi）の放出による塩
基の取り込みの検出および同時の酵素的ヌクレオチド分
解に基づくDNAの配列決定法に関する。

DNA配列決定（シーケンシング）は、分子遺伝学的分
析において必須の道具である。DNAヌクレオチド配列を
決定する能力は、ヒトおよび他の高等生物の大きなゲノ
ムの配列を決定するための努力が開始されたので、ます
ます重要になってきている。DNA配列決定のための２つ
の最も一般的に用いられる方法は、サンガー（Sanger）
の酵素的鎖停止法、およびマキサムおよびギルバート
（Maxam and Gilbert）の化学的切断技術である。両方
法とも、より大きなDNAフラグメントから生成されたDNA
フラグメントを、そのサイズにしたがって解像するため
に、ゲル電気泳動に依存している。電気泳動の工程は、
その後の分離されたDNAフラグメントの検出とともに、
手間のかかる手順であるので、これらの工程を自動化す
るために多大な努力がなされてきた。しかし、自動化さ
れた電気泳動ユニットが商業的に利用可能であるという
事実にもかかわらず、電気泳動は、高性能のスループッ
トを有する比較的費用に対する効果のよいユニットが必
要とされる大規模ゲノムプロジェクトまたは臨床的配列
決定には充分に適していない。したがって、電気泳動に
よらない配列決定法の必要性は大きく、電気泳動の欠点
を克服するためのいくつかの代替的な戦略、例えばスキ
ャニング・トンネル電子顕微鏡術（Driscoll et al.,19
90,Nature,346,294−296）、ハイブリダイゼーションに
よる配列決定法（Bains et al.,1988,J.Theo.Biol.135,
308−307）および単一分子検出法（Jeff et al.,1989,B
iomol.Struct.Dynamics,7,301−306）が記載されてき
た。

単一のDNA塩基の変化の迅速な検出を可能にする技術
もまた、遺伝的解析のための重要な道具である。多くの
場合、単一塩基または少数塩基の検出は、遺伝的解析に
おいて非常に助けとなる。これは、いくつかの遺伝的疾
患およびある種のガンは微少な突然変異に関連している
ためである。固相原理に基づくミニ配列決定プロトコー
ルが記載されていた（Hultman et al.,1988,Nucl.Acid
Res.,17,4937−4946;Syvanen et al.,1990,Genomics,8,
684−692）。放射性標識ヌクレオチドの取り込みを測定
し、ヒトアポリポタンパクＥ遺伝子の３対立遺伝子多型
の解析に用いた。しかし、放射性法は、ルーチンの臨床
的適用には充分に適さず、それゆえ、迅速なDNA配列決
定解析のための簡便な非放射性法も興味が持たれてき
た。

ポリメラーゼ反応中に放出される無機ピロホスフェー
ト（PPi）を検出するコンセプトに基づく配列決定の方
法は、記載されていた（WO93/23564およびWO89/0938
3）。ポリメラーゼ反応中に伸長する核酸鎖に各ヌクレ
オチドが付加されるにしたがって、ピロホスフェート分
子が放出される。これらの条件下で放出されるピロホス
フェートは、酵素的に、例えばルシフェラーゼ−ルシフ
ェリン反応において光を生成することにより、検出する
ことができることが見出された。このような方法は、電
気泳動の必要性および有害な放射性標識の使用を回避し
ながら、塩基が標的位置で同定され、DNAが簡便に迅速
に配列決定されることを可能にする。

しかし、上述のPPiベースの配列決定方法は、欠点が
ないものではない。テンプレート（鋳型）を、各ヌクレ
オチドの添加の間に充分に洗浄し、すべての取り込まれ
なかったデオキシヌクレオチドを除去しなければならな
い。これは、固体支持体に結合していないテンプレート
を配列決定することを困難にする。そのうえ、各デオキ
シヌクレオチドとともに新たな酵素を添加しなければな
らない。

したがって、上述のようなPPiベースの方法は、操作
の容易さと速さにおける改良を表す一方、迅速な検出お
よび配列情報の提供を可能にし、簡便かつ迅速に行え、
自動化の容易な、改良された配列決定法の需要がなお存
在する。

本発明者らは、これらの問題が検討された、中間の洗
浄工程なしで配列決定反応が行われることを可能にし、
例えば単一のマイクロタイタープレート中で、簡便かつ
迅速に手順を行うことを可能にする、新規な改変された
PPiベースの配列決定法を提案する。有利にも、DNAを固
定化する必要はない。好都合なことに、そして以下にお
いてより詳細に説明するように、本発明の新規な方法
は、各ヌクレオチドが取り込まれるにつれて、シグナル
が生成され、検出され、配列決定反応がリアルタイムで
連続的にモニタリングされるよう適合させてもよい。

したがって、１つの側面においては、本発明は、試料
DNA配列中の標的位置の塩基を同定する方法であって、
標的位置にすぐ隣接して試料DNAにハイブリダイズする
伸長プライマーを用意し、試料DNAおよび伸長プライマ
ーを、デオキシヌクレオチドまたはジデオキシヌクレオ
チドの存在下でポリメラーゼ反応に供し、それによりデ
オキシヌクレオチドまたはジデオキシヌクレオチドを、
それが標的位置の塩基と相補的である場合にのみ取り込
まれてピロホスフェート（PPi）を放出するようにし、P
Piの放出を酵素的に検出し、異なるデオキシヌクレオチ
ドまたはジデオキシヌクレオチドを、試料−プライマー
混合物の別個のアリコートに、または同じ試料−プライ
マー混合物に連続的に、添加して、ポリメラーゼ反応に
供し、どのデオキシヌクレオチドまたはジデオキシヌク
レオチドが取り込まれたかを示す方法であって、取り込
まれなかったヌクレオチドが分解されるようにヌクレオ
チド分解酵素をポリメラーゼ反応工程中に包含させるこ
とを特徴とする方法を提供する。

本明細書で用いる場合、「ヌクレオチド分解酵素」と
いう用語は、ヌクレオチド類（少なくともヌクレオシド
トリホスフェート（NTPs）を含み、場合によってはジお
よびモノホスフェートをも含む）を非特異的に分解する
ことができるすべての酵素、および、ヌクレオシドトリ
ホスファターゼまたは他のNTP分解活性が存在すること
を条件に、このような酵素のあらゆる混合物または組み
合わせを含む。ホスファターゼ活性を有するヌクレオチ
ド分解酵素は、本発明ににおいて好都合に用いることが
できるが、ホスフェート基以外の位置で（例えば塩基ま
たは糖残基で）ヌクレオチドを切断する酵素のような、
任意のヌクレオチドまたはヌクレオシド分解活性を有す
る酵素を用いてもよい。したがって、ヌクレオシドトリ
ホスフェート分解酵素は、本発明に関して必須である。
ヌクレオシドジおよび／またはモノホスフェート分解酵
素は、付加的であり、ヌクレオシドトリホスフェート分
解酵素との組み合わせで用いてもよい。好適なこのよう
な酵素としては、最も顕著にはアピラーゼが挙げられ
る。アピラーゼは、ヌクレオシドジホスファターゼおよ
びトリホスファターゼの両方であり、NTP→NMP＋2Piお
よびNTP→NDP＋Pi（ここで、NTPは、ヌクレオシドトリ
ホスフェートであり、NDPは、ヌクレオシドジホスフェ
ートであり、NMPは、ヌクレオシドモノホスフェートで
あり、Piは、ホスフェートである）の反応を触媒する。
アピラーゼは、シグマ・ケミカル・カンパニー（Sigma
Chemical Compamy）から入手してもよい。他の好適なヌ
クレオチドトリホスフェート分解酵素としては、ブタ膵
臓ヌクレオシドトリホスフェートジホスホヒドロラーゼ
（Le Bel et al.,1980,J,Biol.Chem.,255,1227−1233）
が挙げられる。さらなる酵素は文献に記載されている。

異なる組み合わせのヌクレオシドトリ、ジまたはモノ
ホスフェートを用いることができる。このような酵素
は、文献に記載されており、異なる酵素はデオキシヌク
レオチドの分解に関して異なる特徴（例えば異なるKm、
異なるヌクレオチドに関して異なる効率等）を有する可
能性がある。したがって、任意の所定の系においてヌク
レオチド分解工程の効率を増大させるために、ヌクレオ
チド分解酵素の異なる組み合わせを用いてもよい。例え
ば、いくつかの場合においては、さらなるヌクレオシド
トリホスフェートを添加した場合に、残存しているあら
ゆるヌクレオシドジホスフェートをヌクレオシドトリホ
スフェートに転換しうるキナーゼによる汚染に付随する
問題がある可能性がある。このような場合においては、
ヌクレオシドジホスフェートを分解するためにヌクレオ
シドジホスファターゼを含有させることが有利であり得
る。有利には、ヌクレオシドトリ、ジおよびモノホスフ
ァターゼの組み合わされた作用により、すべてのヌクレ
オチドをヌクレオシドに分解してもよい。

一般的に言って、ヌクレオチド分解酵素は、ポリメラ
ーゼに対して相対的に、ヌクレオチドが最初に効率的に
ポリメラーゼによって取り込まれ、次に、取り込まれな
かったヌクレオチドが分解されるように、速度論的特徴
を有するように選択される。したがって、例えば、望ま
しい場合には、ヌクレオチド分解酵素のKmは、ポリメラ
ーゼによって取り込まれなかったヌクレオチドが分解さ
れるように、ポリメラーゼのKmより高くてもよい。これ
は、配列決定手順を、連続的なヌクレオチドの添加の間
にテンプレートを洗浄する工程なしで進めることを可能
にする。さらなる利点の１つは、洗浄工程が回避される
ので、各々の新たなヌクレオチドの添加とともに新たな
酵素、例えばポリメラーゼを添加する必要がなく、した
がって手順の経済性が改善されることである。したがっ
て、ヌクレオチド分解酵素は、単にポリメラーゼ反応混
合物に包含され、連続的な各ヌクレオチド添加の間に、
取り込まれなかったヌクレオチドの実質的にほとんどが
分解されるために充分な時間が与えられる。用いるべき
ヌクレオチド分解酵素の量、およびヌクレオチド添加の
間の時間の長さは、選択した反応体、反応条件等によっ
て、それぞれの特定の系について容易に決定することが
できる。しかし、例えば、酵素アピラーゼは0.25U/ml〜
2U/mlの量で好都合に用いることができることが見出さ
れている。

上述したように、ヌクレオチド分解酵素は、ポリメラ
ーゼ反応工程中に含有させることができる。これは、ポ
リメラーゼ反応（すなわち鎖伸長またはヌクレオチド取
り込み）が起こる前またはそれと同時に、例えばポリメ
ラーゼおよび／またはヌクレオチドを試料／プライマー
に添加する前またはそれと同時に、酵素をポリメラーゼ
反応混合物に単に添加することにより達成してもよい。

１つの態様においては、ヌクレオチド分解酵素は、ポ
リメラーゼ反応のための反応混合物の溶液に単に含有さ
せてもよく、ポリメラーゼ反応は、ポリメラーゼまたは
ヌクレオチドの添加により開始させてもよい。

あるいは、ヌクレオチド分解酵素は、固体支持体、例
えば粒子固体支持体（例えば磁性ビーズ）またはフィル
ター、またはディップスティック等の上に固体化しても
よく、それを好都合な時間にポリメラーゼ反応混合物に
添加してもよい。取り込まれたヌクレオチドが加水分解
される場合には、次のヌクレオチドを添加する前に、固
定化された酵素を反応混合物から除去してもよい（例え
ば磁性粒子の場合には磁性によって、それを、例えば取
り出し、または捕獲する）。次いで、この手順を、より
多くの塩基を配列決定するために、繰り返してもよい。
このようなアレンジは、短い期間により多くのヌクレオ
チド分解酵素が添加されることを可能にするので、より
効率的なヌクレオチド分解が達成され得るという利点を
有する。このアレンジはまた、DNA重合およびヌクレオ
チド分解という２つの競合する反応の間とバランスの最
適化を容易にし得る。

別の態様においては、ヌクレオチド分解酵素の固定化
を、溶液中の酵素の使用と組み合わせてもよい。例え
ば、より少ない量をポリメラーゼ反応混合物中に含有さ
せてもよく、必要な場合、上述のような固定化酵素を添
加することによりヌクレオチド分解活性を高めてもよ
い。

本明細書で用いる場合、「ジデオキシヌクレオチド」
という用語は、3'−ヒドロキシル基が欠如し、または改
変されており、したがって、ポリメラーゼの存在下でプ
ライマーに付加されることはできるが、その後の重合反
応に入ることはできない、すべての2'−デオキシヌクレ
オチドを包含する。

PPiは、多くの異なる方法によって測定することがで
き、多数の酵素的方法が文献に記載されている（Reeves
et al.,（1969）,Anal.Biochem.,28,282−287;Guillor
y et al.,（1971）,Anal.Biochem.,39,170−180;Johnso
n et al.,（1968）,Anal.Biochem.,15,273;Cook et a
l.,（1978）,Anal.Biochem.91,557−565;およびDrake e
t al.,（1979）,Anal.Biochem.94,117−120）。

ピロホスフェートの放出を同定するために、ルシフェ
ラーゼおよびルシフェリンを組み合わせで用いることが
好ましい。これは、生成される光の量は、放出されたピ
ロホスフェートの量に実質的に比例し、放出されたピロ
ホルフェートの量は、取り込まれた塩基の量に正比例す
るためである。光の量は、ルミノメーターのような好適
な光感受性装置により容易に概算することができる。

PPiの放出を検出するためのルシフェリン−ルシフェ
ラーゼ反応は、当業界で周知である。特に、酵素ATPス
ルフリラーゼおよびルシフェラーゼに基づいてPPi放出
を連続的にモニタリングする方法は、NyrenおよびLundi
n（Anal.Biochem.,151,504−509,1985）により開発され
ており、ELIDA（Enzymatic Luminometric Inorganic Py
rophosphate Detection Assay;酵素的ルミノメトリック
無機ピロホスフェート検出アッセイ）と呼ばれる。PPi
を検出するためのELIDA法の使用は、本発明によれば、
好ましい。しかし、この方法は、例えばより熱安定性の
高いルシフェラーゼ（Kaliyama et al.,1994,Biosci.Bi
otech.Biochem.,58,1170−1171）および／またはATPス
ルフリラーゼ（Onda et al.,1996,Bioscience,Biotechn
ology and Biochemistry,60:10,1740−42）の使用によ
り、改変してもよい。この方法は、以下の反応に基づい
ている：したがって、PPi検出反応に関与する好ましい検出酵
素は、ATPスルフリラーゼおよびルシフェラーゼであ
る。

本発明の方法は、例えばWO93/23564およびWO89/09283
に記載されたように、２つの工程で行ってもよく、最初
にポリメラーゼ反応工程、すなわちヌクレオチドが取り
込まれるプライマー伸長工程を行い、続いてPPiの放出
をモニタリングまたは検出し、ヌクレオチド取り込が起
こったかどうかを検出する第二の検出工程を行ってもよ
い。したがって、ポリメラーゼ反応が起こった後に、ポ
リメラーゼ反応混合物からの試料を、採取して、例えば
試料のアリコートをELIDA酵素および反応体を含有する
反応混合物中に添加することにより、ELIDAによって解
析してもよい。

しかし、上述したように、本発明の方法は、配列決定
（すなわち塩基の取り込み）反応をリアルタイムで連続
的にモニタリングすることを可能にし得る。これは、
「検出酵素」を鎖伸長反応混合物中に含有させることに
よって、鎖伸長および検出（またはシグナル生成）反応
を実質的に同時に行うことによって、簡便に達成され
る。これは、上述の文献で考察されたPPiベースの配列
決定手順において報告されたアプローチ（ここでは、鎖
伸長反応を第一の反応工程として分離して最初に行い、
続いて別個の「検出」反応を行い、ここで伸長反応の生
成物を、続いてルシフェリン−ルシフェラーゼベースの
シグナル生成（「検出」）反応に供する）からの逸脱を
表す。この「リアルタイム」手順は、本発明の好ましい
態様を表す。

本発明の方法のこの好ましい態様を実施するために
は、PPi検出酵素をポリメラーゼ反応工程、すなわち鎖
伸長反応工程に含有させる。したがって、検出酵素は、
ポリメラーゼ反応の前、それと同時またはその後に、ポ
リメラーゼ工程のための反応混合物に添加される。した
がって、ELIDA検出反応の場合には、ポリメラーゼ反応
のための反応混合物は、少なくとも、ヌクレオチド（デ
オキシまたはジデオキシ）、ポリメラーゼ、ルシフェリ
ン、APS、ATPスルフリラーゼおよびルシフェラーゼをヌ
クレオチド分解酵素とともに含有することができる。ポ
リメラーゼ反応は、ポリメラーゼ、より好ましくはヌク
レオチドの添加により開始させてもよく、あるいは、好
ましくは、検出酵素は、反応が開始される時に既に存在
するか、反応を開始させる試薬とともに添加してもよ
い。

したがって、本発明のこの後者の態様は、ポリメラー
ゼ反応中にPPi放出が検出されることを可能にし、リア
ルタイムのシグナルを与える。配列決定反応は、リアル
タイムで連続的にモニタリングしてもよい。したがっ
て、PPi放出の迅速な検出のための手順が本発明により
可能になる。ELIDA反応は、２秒未満で起こると概算さ
れている（Nyren and Lundin、前出）。律速工程は、AT
PスルフリラーゼによるPPiのATPへの変換であり、一
方、ルシフェラーゼ反応は素早く、0.2秒未満で起こる
と概算されている。ポリメラーゼについての取り込み率
もまた、種々の方法で概算されており、例えばKlenow
（クレノウ）ポリメラーゼの場合には、１つの塩基の完
全な取り込みが0.5秒未満で起こりうることが見出され
ている。したがって、ELIDAによる１つの塩基の取り込
みおよび検出のための概算の総時間は、およそ３秒であ
る。したがって、非常に早い反応時間が可能であり、リ
アルタイムの検出が可能になることがわかるであろう。
反応時間は、より熱安定性の高いルシフェラーゼを用い
ることにより、さらに短縮しうる。存在する半分のヌク
レオチドを分解するために秒のオーダーの時間でヌクレ
オチド分解酵素を用いることにより、数秒〜数分の時間
枠内で効率的な分解を達成することができる。

したがって、本発明の方法は、４種までまたはそれ以
上の酵素の反応混合物、すなわち多酵素混合物が関与す
る単一の反応工程において行ってもよい。複数の相互に
関連した酵素反応間の有益で協調的な効果を本発明にし
たがって起こすことができ、有益な結果が得られること
は驚くべきことである。

したがって、カップリングした配列決定／検出系は、
以下の反応に基づいていることができる：アピラーゼのようなヌクレオチド分解酵素は、ルシフ
ェラーゼ反応において使用されないATPも分解するであ
ろうことは注目される。したがって、すべてのヌクレオ
チドトリホスフェートが分解される。

実際、本発明にしたがってPPi放出をルシフェラーゼ
ベースの反応、例えばELIDAによって検出する場合、こ
のATP分解活性は、特にルシフェリン／ルシフェラーゼ
反応による光生成を「消灯」することにおいて、重要な
利点であり得る。これも、ルシフェラーゼ酵素の低い
「燃焼率」とともに、有利であり得る。

PPIベースの配列決定方法に関して従来観察された潜
在的な問題の１つは、配列決定（鎖伸長）反応において
用いられるdATPが、ルシフェラーゼ酵素の基質として作
用することにより、その後のルシフェラーゼベースの検
出反応において干渉することである。これは、デオキシ
またはジデオキシアデノシントリホスフェート（ATP）
の代わりに、ポリメラーゼの基質としては作用すること
ができるが上記PPi検出酵素の基質としては作用するこ
とができないdATPまたはddATPアナログを用いることに
より低減または回避することができる。

「作用することができない」という用語は、PPi検出
反応において実質的に有意な干渉がない、または無視で
きる程度の干渉しかないように、検出酵素のための貧弱
な基質であるアナログ、または実質的に基質として作用
することができないアナログをも含む。

したがって、本発明のさらに好ましい特徴は、酵素的
PPi検出反応においては干渉しないが、それにもかかわ
らずポリメラーゼによって伸長するDNA鎖に正常に取り
込まれることができ、かつヌクレオチド分解酵素によっ
て分解されることもできるdATPまたはddATPアナログの
使用である。「正常に取り込まれる」とは、ヌクレオチ
ドは正常な正しい塩基対を形成して取り込まれることを
意味する。ルシフェラーゼがPPi検出酵素である本発明
の好ましい態様においては、本発明にしたがって用いる
ための好ましいアナログは、デオキシまたはジデオキシ
ATPの〔１−チオ〕トリホスフェート（またはα−チオ
トリホスフェート）アナログ、好ましくはデオキシアデ
ノシン〔１−チオ〕トリホスフェート、またはこれも公
知のデオキシアデノシンα−チオトリホスフェート（α
ATPαＳ）である。dATPαＳは、dCTP、dGTPおよびdTTP
のα−チオアナログとともに、New England Nuclear La
bsから購入することができる。実験により、dATPをdATP
αＳで置換することは、dATPαＳとルシフェラーゼとの
間での相互作用の欠如のため、低いバックグラウンドシ
グナルでのポリメラーゼによる効率的な取り込みを可能
にすることが示された。dATPの代わりにヌクレオチドア
ナログを用いることにより、それがルシフェラーゼの基
質として作用することができるdATPの能力により引き起
こされるバックグラウンドを排除し、シグナル対ノイズ
比は増大する。特に、dATPによる干渉に起因するルシフ
ェリン−ルシフェラーゼ系による光の生成によるバック
グラウンドシグナルが実質的に減少する一方で、ポリメ
ラーゼを用いての効率的な取り込みが達成され得る。他
のヌクレオチドのdNTPαＳアナログも、すべてのdNTPの
代わりに用いてもよい。

試料DNA（すなわちDNAテンプレート）は、好都合には
一本鎖であることができ、固体支持体上に固定されてい
てもよく、溶液中にあってもよい。本発明にしたがった
ヌクレオチド分解酵素の使用は、洗浄工程はもはや必要
ではないので、洗浄を容易にするためにテンプレートDN
Aを固定化する必要がないことを意味する。熱安定性酵
素を用いることにより、二本鎖DNAテンプレートもまた
用い得る。

試料DNAは、例えばPCRまたは他の増幅フラグメント、
M13またはプラスミドのようなベクター中のインサート
を含む任意の望ましいDNA供給源により提供することが
できる。

本発明の方法をサイクルとして繰り返し、それによっ
て試料DNAを配列決定するために、また、一本鎖試料DNA
をその相補鎖から分離するのを助けるために、試料DNA
を、場合により固定化するか、または固体支持体への付
着のための手段とともに提供することが望ましい。さら
に、利用可能な試料DNAの量は少量である可能性があ
り、したがって、本発明の方法を実行する前に試料DNA
を増幅することが望ましいことがある。

試料DNAは増幅してもよく、例えば、PCRもしくはSelf
Sustained Sequence Replication（3SR）によりインビ
トロで、またはベクターを用いてインビボで、任意の方
法を用いることができ、望ましい場合には、インビトロ
およびインビボの増幅を、組み合わせて用いてもよい。
いずれの増幅方法を用いる場合であっても、手順は、増
幅されたDNAを固定化し、または固体支持体への付着手
段とともに提供するよう改変することができる。例え
ば、PCRプライマーを固定化してもよく、または固定支
持体への付着手段とともに提供してもよい。また、ベク
ターは、増幅された試料DNAおよび付着手段が一緒に切
り出されるように、試料DNAの挿入部位の隣に固体支持
体への付着手段を含んでいてもよい。

増幅されたDNAの固定化は、１または２以上のプライ
マーを支持体に付着させる場として、PCR増幅反応それ
自身の一部として起こってもよく、あるいは１または２
以上のPCRプライマーがその後の固定化を可能にする官
能基、例えばビオチンまたはチオール基を有していても
よい。プライマーの5'末端による固定化は、DNAの鎖が
固体支持体に付着すべきプライマーから発し、その3'末
端が支持体から離れてその後の伸長プライマーとのハイ
ブリダイゼーションおよびポリメラーゼによる鎖伸長に
利用可能であることを可能にする。

固体支持体は、好都合にはマイクロタイターウェルの
形態をとってもよく、これは、有利には８×12の従来の
フォーマット、またはプライマーDNAを結合するように
活性化されるポリスチレン製であってもよい計量棒（デ
ィップスティック）の形態であってもよい（K.Almer,Do
ctoral Theses,Royal Institute of Technology,Stockh
olm,Sweden,1988）。しかし、当業界で記載されている
非常に多数のいずれのものをも含め、任意の固体支持体
を好都合に用いることができ、例えば分離／固定化反応
または固相アッセイ用のものがある。したがって、支持
体は、例えば、アガロース、セルロース、アルギネー
ト、テフロン（商標）またはポリスチレン製の、粒子、
繊維またはキャピラリ（毛細管）を含んでいてよい。磁
性粒子、例えばDynal AS（Oslo,Norway）によって生産
される超常磁性ビーズもまた、支持体として用いてもよ
い。

固体支持体は、プライマーの付着のために、ヒドロキ
シル、カルボキシル、アルデヒドまたはアミノ基のよう
な官能基、あるいは他の部分（アビジンまたはストレプ
トアビジン等）を担持していてもよい。これらは、一般
に、支持体を処理してこのような官能基の１つを担持す
るポリマーの表面コーティングを提供することにより提
供され得る。例えば、ポリグリコールとともにポリウレ
タンを用いてヒドロキシル基が提供され、またはセルロ
ース誘導体によりヒドロキシル官能基、アクリル酸また
はメタクリル酸のポリマーまたはコポリマーによりカル
ボキシル基、またはアミノアルキル化ポリマーによりア
ミノ基が提供される。米国特許第4654267号には、多く
のこのような表面コーティングの導入が記載されてい
る。

反応副生成物の蓄積が起こり得る。これは、一定数
（例えば15〜25回）の反サイクルの後、試料を洗浄する
ことにより容易に回避することができる。洗浄は、試料
を固体表面に固定化することにより容易にすることがで
きる。

アッセイ技術は、非常に簡便で迅速であり、したがっ
て多数の試料を迅速に解析する可能性がある場合にはロ
ボット装置を用いることによって自動化することが容易
となる。好ましい検出および定量は発光計測反応に基づ
いているので、これは、分光光度分析的に容易に行うこ
とができる。ルミノメーターの使用は、当業界で周知で
あり、文献に記載されている。

したがって、本発明のピロホスフェート検出法は、大
規模な、電気泳動によらない、固体配列決定手順のため
の自動化アプローチの可能性を拓くものであり、これ
は、時間とともに重合反応の進行を連続的に計測するこ
とを可能にする。また、本発明の方法は、複数の試料を
並行して取り扱うことができるという利点も有する。

標的DNAは、試料中のRNAから合成されたcDNAであって
もよく、したがって、本発明の方法は、特徴的なRNAに
基づく診断に適用可能である。このような予備的合成
は、逆転写酵素を用いる予備的処理により、好都合には
用いる場合その後のPCR工程の緩衝液および塩基類と同
じ系において、実行することができる。PCR手順は、鎖
の分離を行うために加熱を必要とするので、逆転写酵素
は最初のPCRサイクルで不活性化されることになる。mRN
Aが試料核酸である場合、すべてのmRNAをその末端のポ
リＡ配列を介して取り出すために、最初の試料、例えば
血清試料を、固定化ポリdTオリゴヌクレオチドでの処理
に供することが有利である可能性がある。あるいは、特
異的オリゴヌクレオチド配列を用いて、そのRNAを、特
異的RNA配列を介して取り出してもよい。オリゴヌクレ
オチドは、次に、WO89/0982に記載されているようにcDN
A合成のプライマーとして役立つことができる。

有利には、伸長プライマーは、標的位置のすぐ5'側の
配列との適切なハイブリダイゼーションを提供するのに
充分に長いものであり、なおかつ不要な化学合成を避け
るために妥当に短いものである。Ｃ−Ｇペアリング（対
合）においてより多い水素結合が利用できるので、伸長
プライマーのサイズおよびハイブリダイゼーションの安
定性がある程度Ａ−Ｔ対Ｃ−Ｇの塩基ペアリングの比に
依存することは、当業者には明らかであろう。また、当
業者は、伸長プライマーと増幅される配列の他の部分と
の間の相同性の度合いも考慮して、それにしたがってス
トリンジェンシー（厳密性）を選択するであろう。この
ようなルーチンの実験のための指針は、例えばSambroo
k,J.,Fritsch E.F.およびManiatis,T（1989）の「Molec
ular Cloning;A Laboratory Manual」のような文献に見
出すことができる。配列決定プライマーがテンプレート
の3'末端から少なくとも１塩基内側にハイブリダイズす
ることを確実にすることが、平滑末端DNAポリメラーゼ
活性を排除するために有利であり得る。別個のアリコー
ト（すなわち各塩基について１つの、４つのアリコー
ト）を用いる場合、伸長プライマーは、各アリコートに
別個に添加してもよいが、好ましくは試料を４つのアリ
コートに分ける前に添加する。伸長プライマーは、PCR
プライマーと同一であってもよいが、系にさらなる特異
性の要素を導入するために、好ましくは異なるものであ
ることは注意すべきである。

あるいは、リン酸化された5'末端を有する、ループを
含み、それ自身および一本鎖テンプレートの3'末端にア
ニーリングするプライマーを用いることができる。テン
プレートの3'末端がＴ（テンプレート）で示される配列
領域を有する場合、プライマーは、5'末端から始まる以
下の配列を有する:P−Ｌ−P'−T'、ここで、Ｐはプライ
マー特異的であり（５〜30ヌクレオチド）、Ｌはループ
であり（好ましくは４〜10ヌクレオチド）、P'はＰに相
補的であり（好ましくは５〜30ヌクレオチド）、T'は3'
末端のテンプレート配列（Ｔ）（少なくとも４ヌクレオ
チド）に相補的である。このプライマーは、T4DNAリガ
ーゼまたは同様の酵素を用いて一本鎖テンプレートに連
結させることができる。これは、テンプレートとプライ
マーとの間に共有結合リンクを提供し、したがってハイ
バリダイズしたプライマーがプロトコールの最中に洗い
落とされる可能性を回避する。

伸長プライマーおよびデオキシヌクレオチドの存在下
でのポリメラーゼ反応は、ジデオキシヌクレオチドを取
り込むであろうポリメラーゼ、例えばT7ポリメラーゼ、
クレノウまたはシークエナーゼ（Sequenase）Ver.2.0
（USB U.S.A.）を用いて実行する。任意の好適なポリメ
ラーゼを好都合に用いることができ、多くが当業界で公
知であり、文献に報告されている。しかし、多くのポリ
メラーゼはプルーフリーディングまたはエラーチェック
能を有すること、および鎖伸長に利用可能である3'末端
はしばしば１または２以上のヌクレオチドにより消化さ
れることが公知である。本発明の方法においてこのよう
な消化が起こる場合、バックグラウンドのノイズのレベ
ルが上昇する。この問題を避けるために、プルーフリー
ディングのないポリメラーゼ、例えばエキソヌクレアー
ゼ欠損（exo^-）クレノウポリメラーゼを用いてもよい。
そうでない場合、ポリメラーゼによる3'消化を抑制する
フッ化物イオンまたはヌクレオチドモノホスフェートを
各アリコートに添加することが望ましい。正確な反応条
件、反応体の濃度等は、選択にしたがって各系について
容易に決定することができる。しかし、すべての遊離3'
末端が伸長されることを確実にするために、プライマー
／テンプレートに対して過剰のポリメラーゼを用いるこ
とが有利であり得る。

本発明の方法において、充分に伸長されていないテン
プレートが蓄積する場合に起こりうるバックグラウンド
シグナルの急速な増大のため、各伸長工程において高い
効率を有するDNAポリメラーゼが必要である。各工程に
おける高い正確性も望ましく、これは、エキソヌクレア
ーゼ活性を有するポリメラーゼを用いて達成することが
できる。しかし、これは、プライマーの分解が起こりう
るという上述の不利益を有する。クレノウポリメラーゼ
のエキソヌクレアーゼ活性は低いが、本発明者らは、プ
ライマーの3'末端がヌクレオチドの不存在下でのより長
いインキュベーションで分解されることを見出した。重
合工程におけるインデュースト・フィット結合メカニズ
ムは、10⁵〜10⁶の正確性に向かっての正味の貢献を有す
る正しいdNTPの結合について非常に効率的に選択する。
エキソヌクレアーゼ欠損ポリメラーゼ、例えば（exo^-）
クレノウまたはシークエナーゼ2.0は、ヌクレオチドの
取り込みを触媒するが、これは、相補的なdNTPが存在す
るときのみ観察され、プルーフリーディングエキソヌク
レアーゼ活性が存在しなくても、これらの酵素の高い正
確性が確認された。シークエナーゼ2.0と比較して（exo
^-）クレノウDNAポリメラーゼを用いる主な利点は、そ
の、ヌクレオチドに対するより低いKmであり、これが低
いヌクレオチド濃度であってさえ、高率のヌクレオチド
取り込みを可能にする。すべてのdNTPをヌクレオチドア
ナログまたは非天然ヌクレオチド（例えばdNTPαＳ）で
置換することも可能であり、このようなアナログは、エ
キソヌクレアーゼ活性を有するDNAポリメラーゼととも
に用いるためには好ましいことがある。

ある種の場合、例えばより長い試料テンプレートを用
いるような場合には、正しくない（ミスマッチ）ヌクレ
オチドについてよりも正しい（マッチ）ヌクレオチドの
取り込みについてより低いKmを有するポリメラーゼを用
いることが有利であり得る。これは、本方法の正確性お
よび効率を改善し得る。このような好適なポリメラーゼ
酵素としては、ショウジョウバエ（Drosophila）のαポ
リメラーゼが挙げられる。

多くの診断用の適用、例えば遺伝的疾患のキャリアに
ついての遺伝的試験において、試料は、ヘテロ接合体の
物質を含むことになる。これは、標的位置に、そのDNA
の半分がある１つのヌクレオチドを有し、他の半分が別
のヌクレオチドを有することになるということである。
したがって、本発明の１つの態様において４つのアリコ
ートを用いる場合、２つは陰性のシグナルを示すであろ
うし、２つは陽性のシグナルの半分を示すであろう。し
たがって、各試料中に検出されるシグナルの量を定量的
に測定することが望ましいことがわかるであろう。ま
た、同じ塩基の２またはそれ以上がプライマーの3'末端
に隣接する場合、より大きなシグナルが生成されること
も理解されるであろう。ホモ接合体の試料の場合には、
試料を４つのアリコートにするとき、３つの陰性および
１つの陽性シグナルがあることは明らかであろう。

さらに本方法の正確性を増強するために、両方向の配
列決定、すなわち二本鎖テンプレートの両鎖の配列決定
を行ってもよい。これは、例えばヘテロ接合体の材料を
配列決定する場合に有利であり得る。好都合には、これ
は、二本鎖試料テンプレートを一方の鎖によって、例え
ば粒子上またはマイクロタイターウェル中に、固定化
し、第二の鎖を溶出し、そして両鎖を別個に本発明の方
法による配列決定に供することにより達成してもよい。

本発明の方法を実施する場合、試薬（例えばNTP溶
液）の、PPiによる可能性のあるあらゆる汚染は望まし
くなく、試薬溶液中に、好ましくは少量で、ピロホスフ
ァターゼを含有させることにより、容易に回避すること
ができる。実際、あらゆる種類の汚染は回避することが
望ましく、例えばキナーゼによる汚染を回避するため
に、高純度の、または注意深く精製された試薬を用いる
ことが好ましい。

反応効率は、試薬（NTPおよび／またはポリメラー
ゼ）溶液中にMg²⁺イオンを含有させることにより改質し
てもよい。

プライマーのすぐ3'側の標的塩基がその3'側と同じ塩
基を有する場合、および重合がデオキシヌクレオチド
（ジデオキシヌクレオチドでなく）を用いて行われる場
合、伸長反応により、同時い２つの塩基が付加され、実
際、試料中の連続する同一の塩基のあらゆる配列は、プ
ライマー中への対応する塩基の同時取り込みをもたらす
ことは理解されるであろう。しかし、そのような反復を
検出するのに何の困難もないように、解放されるピロホ
スフェートの量は、取り込まれた塩基の数に明らかに比
例するであろう。

プライマーは、上述の手順で単一の塩基（または同一
の塩基の配列）ことに伸長されるので、伸長されたプラ
イマーは、正確に同じようにして、繰り返した手順にお
いて配列中の次の塩基の決定に役立つことができ、した
がって試料全体の配列決定が可能になる。

上述したように、本発明の方法においては、異なるデ
オキシまたはジデオキシヌクレオチドを試料−プライマ
ー混合物の別個のアリコートに添加してもよく、あるい
は同じ試料−プライマー混合物に連続的に添加してもよ
い。これは、ある一定の反応において個別のおよび複数
の両方の標的DNA試料（そのDNA試料は同じであっても異
なるものであってもよい）を用いる状況をカバーする。
したがって、例えば以下においてより詳細に記載するよ
うに、本発明のある種の態様においては、１つの容器中
で１つの反応（伸長される１つの試料DNA、すなわち１
つの標的DNA配列の意味において）があってもよく、そ
の一方で、他の態様においては、同じ反応チャンバー中
に異なるプライマー−試料の組み合わせが存在してもよ
いが、例えば領域選択的固定化により、分離状態に保た
れる。

本発明は、固定化DNAの配列決定の、２つの基本的な
方法を提供する。

A.本発明は、試料DNAの配列決定の第一の方法を提供す
る。この方法においては、試料DNAを増幅に供し；増幅
されたDNAを場合により固定化して、次に鎖分離に供
し、一方の鎖、例えば場合により固定化された鎖または
固定化されていない鎖を除去し（すなわちいずれの鎖を
配列決定してもよい）、配列決定すべきDNAの部分にす
ぐに隣接する試料DNAにハイブリダイズする伸長プライ
マーを用意し；次に、一本鎖DNAの４つのアリコートの
各々を、デオキシヌクレオチドの存在下でポリメラーゼ
反応に供し、各アリコートには異なるデオキシヌクレオ
チドを用いることによって、標的位置の塩基に相補的な
デオキシヌクレオチドのみが取り込まれるようにし；塩
基取り込みにより放出されたピロホスフェートを同定す
る。取り込まれたヌクレオチドの同定の後、ヌクレオチ
ド分解酵素を添加する。異なるアリコートからのヌクレ
オチド分解酵素の分離の際、例えばそれが磁性ビーズ上
に固定化されている場合には、その４つのアリコートを
ヌクレオチド添加の新たなサイクルにおいて用いること
ができる。次に、この手順を連続的に繰り返すことがで
きる。

B.本発明は、試料DNAを配列決定する第二の方法も提供
する。この方法においては、試料DNAを増幅に供し；増
幅されたDNAを場合により固定化し、次に鎖分離に供
し、一方の鎖、例えば場合により固定化されている鎖ま
たは固定化されていない鎖を除去し、配列決定すべきDN
Aの部分にすぐ隣接する試料DNAにハイブリダイズする伸
長プライマーを提供し；次に、一本鎖DNAを第一のデオ
キシヌクレオチドの存在下でポリメラーゼ反応に供し、
ピロホスフェートの放出の度合いを決定し、取り込まれ
なかったヌクレオチドをヌクレオチド分解酵素によって
分解し、反応を、第二、第三、第四のデオキシヌクレオ
チドの連続的な添加によって、ピロホスフェートの陽性
の放出が特定のデオキシヌクレオチドのプライマー中へ
の取り込みを示すまで繰り返し、そこで、手順を、１度
に１塩基プライマーを伸長するよう、また、各段階で伸
長されたプライマーのすぐ3'側の塩基を決定するよう、
繰り返す。

解析のための代替的なフォーマットの１つは、アレイ
フォーマットを用いることであり、このフォーマットに
おいては、試料を、例えば微小に製作されたチップの表
面に分布させ、それにより規則正しい試料のセットを２
次元フォーマットに固定化してもよい。多くの試料をこ
れにより並行して解析することができる。本発明の方法
を用いれば、酵素および１つのヌクレオチドを含有する
溶液を表面から流出させて、次に各試料について生成さ
れたシグナルを検出することにより、このようにして多
くの固定化テンプレートを解析することができる。次
に、この手順を繰り返すことができる。あるいは、テン
プレートに相補的ないくつかの異なるオリゴヌクレオチ
ドを表面に分布させ、続いてテンプレートのハイブリダ
イゼーションを行ってもよい。デオキシヌクレオチドま
たはジデオキシヌクレオチドの取り込みは、プライマー
として種々のオリゴヌクレオチドを用いて生成されたシ
グナルにより各オリゴヌクレオチドについてモニタリン
グしてもよい。表面の異なる区域からのシグナルを一緒
にすることにより、配列ベースの解析を、種々のジデオ
キシヌクレオチドを用いるポリメラーゼ反応の４つのサ
イクルにより行ってもよい。

本出願人らにより係属中の出願WO90/11369に記載され
ているような（ネステッド・プライマーを用いる）２段
階PCRを用いて、シグナル対ノイズ比を強化し、それに
より本発明の方法の感度を増大させてもよい。このよう
な予備的な増幅により、標的DNAの濃度は、試料中に存
在しうる他のDNAに関して大きく増大し、標的DNAの異な
る配列に対して特異的な少なくとも１つのプライマーを
用いる第二段階の増幅により、「バックグラウンドノイ
ズ」に対して標的DNAによるシグナルが有意に増強され
る。

一段階または二段階PCRのどちらを行うかに拘らず、P
CRの効率は重要ではない。これは、本発明は、アリコー
トとは異なる区別される差異に依存するためである。し
かし、上述したように、増幅されたDNAの存在または不
存在のチェックとして、例えばWO90/11369に記載されて
いるようなDIANA法（Detection of Immobilized Amplif
ied Nucleic Acids）による最初の定性的PCRを行うこと
が好ましい。

任意の好適なポリメラーゼを用いてよいが、PCRの各
サイクルにおいて、さらにポリメラーゼ（例えばクレノ
ウフラグメント）を添加することなしに反復的な温度サ
イクルを行うことを可能にするために、Taqポリメラー
ゼのような好熱性酵素を用いることが好ましい。

上記で論じたPCRは、最初に標的DNAを増幅する好まし
い方法であるが、当業者はPCRの代わりに、またはそれ
と組み合わせて、他の方法を用いてもよいことを理解す
るであろう。温度サイクルまたは熱安定性ポリメラーゼ
の使用を必要としない増幅技術の最近の開発の１つは、
Self Sustained Sequence Replication（3SR）である。
3SRは、レトロウイルスの複製をモデルとしており、増
幅に用いることができる（Gingeras,T.R.et al.,PNAS
（USA）87:1874−1878およびGingeras,T.R.et al.,PCR
Methods and Applications Vol.1,pp.25−33）。

上で示したように、この方法は、ジデオキシヌクレオ
チド残基がDNA鎖の末端に取り込まれる場合、ピロホス
フェートの放出を同定することに適用することができ
る。WO93/23562は、DNA配列の単一の標的位置での塩基
の同定方法（ミニ・シーケンシング）に関する。この方
法においては、試料DNAを増幅に供し；増幅されたDNAを
固定化し、次に鎖分離に供し、固定化されていない鎖を
除去し、標的位置にすぐ隣接する固定化DNAにハイブリ
ダイズする伸長プライマーを用意し；固定化された一本
鎖DNAの４つのアリコートの各々を、次に、ジデオキシ
ヌクレオチドの存在下でポリメラーゼ反応に供し、各ア
リコートには異なるジデオキシヌクレオチドを用いて、
それにより標的位置の塩基に相補的なジデオキシヌクレ
オチドのみが取り込まれるようにし；次に、４つのアリ
コートを４つすべてのデオキシヌクレオチドの存在下で
伸長反応に供し、それにより各アリコートにおいてジデ
オキシヌクレオチドと反応していないDNAを伸長させて
二本鎖DNAを形成させ、一方、ジデオキシでブロックさ
れたDNAフラグメントを一本鎖のまま残るようにし；続
いて二本鎖および／または一本鎖DNAを同定してどのジ
デオキシヌクレオチドが取り込まれたか、それゆえどの
塩基が標的位置に存在したかを示す。明らかに、鎖停止
ジデオキシヌクレオチド反応におけるピロホスフェート
の放出は、どの塩基が取り込まれたかを示すが、その後
のデオキシヌクレオチドプライマー伸長反応（いわゆる
チェース反応）において放出された比較的大量のピロホ
スフェートは、はるかに強いシグナルを与えるので、よ
り高感度である。

通常、ジデオキシヌクレオチドなしの対照（コントロ
ール）および４つすべてのジデオキシヌクレオチドの混
合物を含有する「ゼロ」対照を設けることが望ましい。

WO93/23562は、「ジデオキシヌクレオチド」という用
語を、さらなる鎖伸長を防止することにより同じように
作用する3'保護2'−デオキシヌクレオチドを含むものと
して定義している。しかし、3'保護基が、例えば加水分
解によって除去可能であれば、鎖伸長（単一塩基ごと）
の後に3'位のブロック除去を続け、伸長された鎖をさら
なる伸長反応の準備ができた状態にしてもよい。このよ
うにして、鎖伸長は、上で論じたような同一塩基の配列
についての複雑さなしに、一度に１つの位置を進むこと
ができる。したがって、上述の方法ＡおよびＢは、改変
することができ、それにより各段階で付加された塩基が
3'保護2'−デオキシヌクレオチドであり、この塩基が付
加された（および発光が検出された）後に、3'保護基を
除去してさらに3'保護2'−デオキシヌクレオチドが付加
されるのを可能にする。好適な保護基としては、アルカ
ノール基のようなアシル基、例えばアセチル、または実
際当業界で公知の任意のヒドロキシル保護基、例えば
「Protective Groups in Organic Chemistry」JFW McOn
ie,Plenum Press,1973に記載されているものが挙げられ
る。

本発明は、上記の態様において、単一塩基変化の検出
のための簡便で迅速な方法を提供する。１つのフォーマ
ットにおいては、これは２つの技術、すなわち固相技術
（磁性ビーズに結合させたDNA）および酵素的発光計測
検出アッセイ（ELIDA）を成功裏に一緒にする。この方
法は、選択的に増幅されたDNAフラグメントを同定およ
び定量するために用いることができる。それはまた、単
一塩基置換の検出および増幅された多型遺伝子フラグメ
ントについてのヘテロ接合性インデックスの推定のため
にも用いることができる。これは、この方法が、後天的
および遺伝性疾患の両方に関与する希な点突然変異につ
いてスクリーニングするため、DNA多型を同定するた
め、また、ウイルスまたは細菌の薬剤耐性および薬剤感
受性株を区別するためにさえ、遠心分離、ろ過、抽出ま
たは電気泳動する必要なしに用いることができることを
意味する。この方法は、その簡便性のため、多くの医療
的（広い範囲の遺伝性疾患におけるルーチンの解析）お
よび商業的適用に好適である。

以下に表す陽性の実験結果は、本発明の方法が段階的
単一デオキシヌクレオチドの取り込みを伴う、オンライ
ン自動化非電気泳動DNA配列決定法に適用可能であるこ
とを示す。一本鎖DNAを得るための増幅およびプライマ
ーとのアニーリングの後、テンプレート／プライマーフ
ラグメントを、dNTPインキュベーションの反復的サイク
ルにおいて用いる。試料は、ELIDAにおいて連続的にモ
ニタリングする。DNAの合成には、取り込まれたヌクレ
オチドの量と等しい量の無機ピロホスフェート（PPi）
の放出が付随するので、ELIDAにおけるシグナルは、相
補的な塩基が取り込まれたときにのみ観測される。PPi
を定量的に決定するこの方法の能力のため、２つまたは
いくつかの同時の取り込みから単一塩基の取り込みを区
別することが可能である。DNAテンプレートは、好まし
くはPCRによって得られるため、そのようなアッセイに
ついて必要とされるDNAの量を増加させることは、比較
的容易である。

上述のように、本発明者らの結果は、電気泳動によら
ない大規模なDNA配列決定の新規なアプローチの可能性
を拓くものであり、この配列決定法は、時間とともに重
合反応の進行を連続的に測定することを可能にする。こ
のようなアプローチの成功のためには、「フェーズが合
っていない（not“in phase"）」テンプレートが蓄積す
る場合に急速に増大するバックグラウンドシグナルのた
め、DNAポリメラーゼの高い効率の必要性がある。この
新規なアプローチは、標準的配列決定法と比較して、い
くつかの利点を有する。第一に、この方法は、複数の試
料を並行して取り扱うのに適している。第二に、比較的
費用に対する効果のよい装置を企図することができる。
さらに、この方法は、電気泳動の使用を避け、それによ
り試料の装填およびゲルの作製を回避する。

本発明の方法のさらなる利点は、標準的なサンガー法
配列決定プロトコールにおいてゲル電気泳動工程中に圧
縮を起こす配列を解析するために用いることができるこ
とである。

本発明の方法は、他の配列決定法における適用をも見
出し得る。例えば、プローブまたはアダプターの連結お
よびその後の切断に基づく多数の反復配列決定法（有利
には、二本鎖標的DNAの配列決定を可能にするもの）が
記載されてきた（例えば米国特許第5,599,675号およびJ
ones,Bio Techniques,22:938−946,1997を参照された
い）。このような方法は、一般に、クラスII Sヌクレア
ーゼ認識部位を含有する二本鎖プローブ（またはアダプ
ター）を、二本鎖標的（試料）DNAへ連結すること、お
よびプローブ／アダプター−標的複合体を連結部位から
の１または２以上のヌクレオチドの標的DNA内の部位で
切断することを包含し、短くなった標的DNAが残され
る。次に、連結および切断サイクルを繰り返す。標的DN
Aの末端の１または２以上のヌクレオチドを同定するこ
とにより配列情報が得られる。末端ヌクレオチドの同定
は、本発明の方法を用いる鎖伸長により達成してもよ
い。

さらに二本鎖DNAの配列決定を可能にするために、例
えばニックの導入による、鎖置換に基づく配列決定プロ
トコール（例えばFu et al.,Nucleic Acids Research,1
977,25（３）:677−679に記載されている）において本
発明の方法を用いてもよい。このような方法において
は、試料DNAを、例えば非リン酸化もしくはモノリン酸
化またはジデオキシヌクレオチドを含有させることによ
り、ニックを導入するために役立つ二本鎖プローブまた
はアダプター配列を連結することにより改変してもよ
い。鎖置換ポリメラーゼを用いることにより、ニックの
ところでプローブ／アダプターの3'末端を伸長させるこ
とにより配列決定反応が起こることが可能になり、本発
明の方法にしたがってヌクレオチドの取り込みが検出さ
れる。

有利には、本発明の方法は、WO93/23563において教示
されている方法と組み合わせてもよい。その方法は、PC
Rを用いて、目的のDNA鎖の3'末端に永久的に付着した3'
プライマーを提供するループ構造を導入する。例えば、
このような改変された方法においては、伸長プライマー
を、標的位置を含む二本鎖DNAの１つの鎖の標的配列上
に3'末端ループ構造の一部として導入し、前記標的配列
は、その3'末端に領域Ａを有し、場合によっては領域Ａ
から3'側に伸びるDNA領域Ｂを有し、それにより、標的
配列に相補的な配列の3'末端にハイブリダイズする第一
のプライマー（この第一のプライマーは固定化されてい
るか、または固体支持体への付着手段を備えている）
と、標的配列のＡおよび／またはＢの少なくとも一部に
ハイブリダイズする3'末端配列を有する一方で実質的に
Ａと同一の配列をその5'末端に有する第二のプライマー
とを用いて前記二本鎖DNAをポリメラーゼ連鎖反応（PC
R）増幅に供し、前記増幅により標的配列の3'末端に以
下の順序：領域Ａ、ループを形成することができる領域
および配列Ａに相補的な配列A'を有する二本鎖の標的DN
Aを生成し、その後、増幅された二本鎖DNAを固定化形態
で鎖分離に供し、それにより固定化されていない標的鎖
を放出させて、領域A'が領域Ａにハイブリダイズできる
ようにするかハイブリダイズを起こさせ、それにより前
記ループを形成する。領域A'の3'末端は、標的位置のす
ぐ隣にハイブリダイズする。ジデオキシおよび／または
伸長反応は、ハイブリダイズした部分をプライマーとし
て用いる。

本発明の方法は、公知の単一塩基変化のリアルタイム
の検出のために用いてもよい。このコンセプトは、ミス
マッチの3'末端に対するマッチした3'末端の、DNAポリ
メラーゼによるプライマー伸長効率における差異の測定
に依存する。DNAポリメラーゼ触媒プライマー伸長反応
の速度は、従来記載されているELIDAにより測定され
る。重合反応において形成されたPPiは、ATPスルフリラ
ーゼによってATPに変換され、このATP産生は、ホタルル
シフェラーゼにより連続的にモニタリングされる。単一
塩基検出アッセイにおいては、一本鎖DNAフラグメント
をテンプレートして用いる。3'末端で１塩基異なる２つ
の検出プライマーを設計する；一方は突然変異していな
いDNA配列に完全に相補的であり、他方は突然変異したD
NA配列に完全に相補的である。プライマーを、目的の塩
基に対して3'末端でハイブリダイズさせ、プライマー伸
長速度を、DNAポリメラーゼおよびデオキシヌクレオチ
ドとのインキュベーションの後、ELIDAを用いて測定す
る。検出プライマーがテンプレートに正確に一致する場
合、高い伸長速度が観察される。これに対し、検出プラ
イマーの3'末端がテンプレートに正確に一致しない（ミ
スマッチ）場合、プライマー伸長速度ははるかに低くな
る。こうして、ミスマッチの3'末端に対するマッチした
末端のDNAポリメラーゼによるプライマー伸長速度の差
異は、単一塩基差異のために用いることができる。した
がって、突然変異DNA配列の存在を、突然変異していな
い配列から区別することができる。相対ミスマッチ伸長
効率は、3'ミスマッチ末端の後の次の正しい天然デオキ
シヌクレオチドをα−チオトリホスフェートで置換する
ことにより、かなり低減され得る。ヌクレオチド分解酵
素の存在下でこのアッセイを行うことにより、A:T、T:G
およびC:Tのような伸長されやすいタイプのミスマッチ
とマッチとの間を区別することがより容易になる。

本発明はまた、本発明の方法における用途のためのキ
ットをも含む。キットは、通常、少なくとも以下の構成
成分を含む：（ａ）標的位置がプライマーの3'末端に直接隣接するよ
うに試料DNAにハイブリダイズする試験特異的プライマ
ー；（ｂ）ポリメラーゼ；（ｃ）ピロホスフェート放出を同定するための検出酵素
手段；（ｄ）ヌクレオチド分解酵素；（ｅ）デオキシヌクレオチド、または場合によってはデ
オキシヌクレオチドアナログ、場合によっては、dATPの
代わりに、ポリメラーゼの基質として作用することがで
きるが前記PPi検出酵素の基質として作用することはで
きないdATPアナログを含む；および（ｆ）場合により、ジデオキシヌクレオチド、または場
合によってはジデオキシヌクレオチドアナログ、場合に
よっては、ddATPは、ポリメラーゼの基質として作用す
ることができるが前記PPi検出酵素の基質として作用す
ることはできないddATPアナログで置換されているも
の。

キットが、最初のPCR増幅について使用するためのも
のである場合、通常は、以下の構成成分もまた含む：（ｉ）少なくとも１つのプライマーがプライマーの固
定化を可能にする手段を有する１対のPCRプライマー；（ii）好ましくは熱安定性である、ポリメラーゼ（例
えばTaq Iポリメラーゼ）；（iii） PCR反応のための緩衝液；および（iv）デオキシヌクレオチド。

本発明を、非制限的な例を用いて、図面を参照しなが
ら説明する。

図面において、図１は、本発明の新規なDNA配列決定法の模式図であ
る。４つの異なるヌクレオチドをプライマーにハイブリ
ダイズしたテンプレートに段階的に添加する。DNAポリ
メラーゼ触媒反応において放出されたPPiを、ATPスルフ
リラーゼおよびルシフェラーゼにより触媒される反応に
よって検出する。シグナルの高さは、取り込まれた塩基
の数に比例する。添加されたヌクレオチドは、ヌクレオ
チド分解酵素により連続的に分解される。最初に添加さ
れたヌクレオチドの分解の後、次のヌクレオチドを添加
する。これらの工程をサイクルで繰り返し、テンプレー
トの配列を推定する。

図２は、35塩基長のオリゴヌクレオチドテンプレート
上でのDNA配列決定を示す。約2pmolのテンプレート／プ
ライマー（E3PN/NUSPT）を、4pmolの（exo^-）クレノウ
および0.2Uのアピラーゼとともにインキュベートした。
反応は、0.4nmolの示したデオキシヌクレオチドの各々
の添加により開始させ、放出させたPPiをELIDAによって
リアルタイムで検出した。テンプレートのDNA配列を図
に示す。実験条件は例１に記載したとおりである。

図３は、35塩基長のオリゴヌクレオチドテンプレート
上でのDNA配列決定を示す。約5pmolのテンプレート／プ
ライマー（E3PN/NUSPT）を、8pmolの（exo^-）クレノウ
および0.2Uのアピラーゼとともにインキュベートした。
反応は、0.4nmolで示したデオキシヌクレオチドの各々
の添加により開始させ、放出されたPPiをELIDANによっ
て検出した。テンプレートのDNA配列を図に示す。実験
条件は例１に記載したとおりであった。

図４は、35塩基長のオリゴヌクレオチドテンプレート
上でのDNA配列決定を示す。約5pmolのテンプレート／プ
ライマー（PEBE25/RIT27）を、8pmolの（exo^-）クレノ
ウおよび0.2Uのアピラーゼとともにインキュベートし
た。反応は、0.4nmolの示したデオキシヌクレオチドの
各々の添加により開始させ、放出されたPPiをELIDAによ
って検出した。テンプレートのDNA配列を図に示す。実
験条件は例１に記載したとおりであった。

図５は、160塩基長の一本鎖PCR生成物上で行ったリア
ルタイムDNA配列決定を示す。約5pmolのテンプレート／
プライマー（NUSPT）を、8pmolの（exo^-）クレノウおよ
び0.2Uのアピラーゼとともにインキュベートした。反応
は、0.4nmolの示したデオキシヌクレオチドの各々の添
加により開始させ、放出されたPPiをELIDAによって検出
した。プライマーの後のDNA配列を図に示す。実験条件
は例１に記載したとおりであった。

図６は、例２に記載したとおりの配列決定プライマー
にハイブリダイズした130塩基長の一本鎖PCR生成物上で
行った本発明の配列決定法を示す。約2pmolのテンプレ
ート／プライマーを、アッセイにおいて用いた。反応
は、0.6nmolの示したデオキシヌクレオチドの各々の添
加により開始させ、放出されたPPiを、記載した方法に
よって検出した。プライマーの後のDNA配列を図に示
す。

例１材料および方法オリゴヌクレオチドの合成および精製オリゴヌクレオチドPEBE25（35mer:5'−GCAACGTCGCCA
CACACAACATACGAGCCGGAAGG−3'）、RIT27（23mer:5'−GC
TTCCGGCTCGTATGTTGTGTG−3'）、E3PN（35mer:5'−GCTGG
AATTCGTCAGACTGGCGCTCGTTTTACAAC−3'）、NUSPT（17me
r:5'−GTAAAACGACGGCCAGT−3'）、RIT203（51mer:5'−A
GCTTGGGTTCGAGGAGATCTTCCGGGTTACGGCGGAAGATCTCCTCGAGG
−3'）、RIT204（51mer:5'−AGCTCCTCGAGGAGATCTTCCGCC
GTAACCCGGAAGATCTCCTCGAACCCA−3'）、ROMO205S（5'−C
GAGGAGATCTTCCGGGTTACGGCG−3'）、ROMO205B（25mer:5'
−ビオチン−CGAGGAGATCTTCCGGGTTACGGCG−3'）、RIT2
8、RIT29、およびUSP（Hultman,et al.（1990）Nucleic
Acids Res.18,5107−5112）を、自動化DNA合成装置（G
ene Assembler Plus,Pharmacia Biotech,Uppsala,Swede
n）を用いてホスホルアミダイト化学により合成した。
精製は、迅速タンパク液体クロマトグラフィpepRPC5/5
カラム（Pharmacia Biotech）によって行った。

インビトロ増幅およびテンプレート調製 PCR反応を、Hultmanら（前出）にしたがって、プラス
ミドpRT28のマルチリンカー上で7.5pmolの一般的プライ
マーRIT28およびRIT29（ビオチニル化されている）を用
いて行った。ビオチニル化されたPCR生成物を、ストレ
プトアビジンでコーティングされた超常磁性ビーズDyna
beads（登録商標）M280−ストレプトアビジンまたはM45
0−ストレプトアビジン（Dynal A.S.,Oslo,Norway）上
に固定化した。0.10M NaOH中で５分間の固定化されたP
CR生成物のインキュベーションの後、上清を除去するこ
とにより、一本鎖DNAを得た。固定化された一本鎖DNAの
洗浄および配列決定プライマーとのハイブリダイゼーシ
ョンは、以前に記載されたように行った（Nyren,et al.
（1993）Anal.Biochem.208,171−175）。

ヘアピンベクターpRIT28HPの構築およびPCR増幅テンプ
レートの調製オリゴヌクレオチドRIT203およびRIT204を、Hind II
（Pharmacia Biotech）で予め制限したプラスミドpRIT
28にハイブリダイズさせ、連結した（得られたプラスミ
ドを、pRIT28HPと名づけた）。プラスミドpRIT28HTのマ
ルチリンカー上で、7.5pmolのプライマー対、RIT29/ROM
O205SまたはRIT27/ROMO205B、200μＭのdNTP、20mMのト
リス−HCl（pH8.7）、2mM MgCl₂、0.1％Tween 20、お
よび１単位のAmpliTaq DNAポリメラーゼを用いて、最終
容量50μＬでPCR反応を行った。温度プロフィールは、9
5℃で15秒間の変性工程および72℃で90秒間のハイブリ
ダイゼーション／伸長工程を含んでいた。これらの工程
を、GeneAmp PCRシステム、9600（Perkin Elmer、Eme
ryville、USA）を用いて35回繰り返した。RIT29/ROMO20
58増幅反応から得られた固定化された（上述のとおり）
一本鎖DNAまたはRIT27/ROMO205B増幅反応からの非ビオ
チニル化一本鎖DNAフラグメントを、20mM トリス−HCl
（pH7.5）、8mM MgCl₂中で65℃で５分間ハイブリダイ
ズさせ、自己プライミング・ループ構造を作製した。

DNA配列決定オリゴヌクレオチドE3PN、PEBE25、および上述のPCR
生成物を、DNA配列決定のためのテンプレートとして用
いた。オリゴヌクレオチドE3PN、PEBE25、および一本鎖
RIT28/RIT29増幅PCR生成物を、それぞれプライマーNUSP
T、RIT27およびNUSPTにハイブリダイズさせた。ハイブ
リダイズさせたDNAフラグメント、または自己プライミ
ング・ループ構造を、改変T7DNAポリメラーゼ（Sequena
se 2.0;U.S.Biochemical,Cleveland,OH,USA）またはエ
キソヌクレアーゼ欠損（exo^-）クレノウDNAポリメラー
ゼ（Amersham,UK）のいずれかとともにインキュベート
した。配列決定手順は、異なるデオキシヌクレオチドト
リホスフェート（Pharmacia Biotech）の連続的な付加
の際のプライマー鎖の段階的伸長、およびアピラーゼに
よるヌクレオチドの同時分解により行った。ヌクレオチ
ドの取り込みによるPPi放出を、ELIDAによって検出し
た。生成されたATPおよび取り込まれなかったデオキシ
ヌクレオチドを、アピラーゼによりリアルタイムで分解
した。発光は、ポテンシオメトリックレコーダーに接続
したLKB1250ルミノメーターを用いて測定した。ルミノ
メーターは、内部光標準について10mVの応答を与えるよ
うに較正した。発光アウトプットは、既知の量のATPま
たはPPiの添加により較正した。標準的アッセイ容量
は、0.2mlであり、以下の成分を含有していた:0.1Mトリ
ス−アセテート（pH7.75）、2mM EDTA、10mMマグネシ
ウムアセテート、0.1％ウシ血清アルブミン、1mMジチオ
スレイトール、２μＭアデノシン5'−ホスホスルフェー
ト（APS）、0.4mg/mlポリビニルピロリドン（360,00
0）、100μg/ml Ｄ−100μg/ml D−ルシフェリン（Bio
Therma,Dalar,Sweden）、４μg/ml L−ルシフェリン
（Bio Therma,Dalar,Sweden）、120〜140mU/ml ATP
スルフリラーゼ（ATP:スルフェートアデニリルトランス
フェラーゼ;EC2.7.7.4）（Sigma Chemical Co.）、100
〜400mUアピラーゼ（ヌクレオシド5'トリホスファター
ゼおよびヌクレオシド5'ジホスファターゼ;EC3.6.1.5）
（Sigma Chemical Co.）、精製ルシフェラーゼ（Sigma
Chemical Co.、）、0.1μＭ ATPについて200mVの応答
を与える量。１〜5pmolのDNAフラグメントおよび３〜15
pmolのDNAポリメラーゼを上記の溶液に添加した。配列
決定反応は、0.2〜1.0nmolのデオキシヌクレオチドの１
つ（Pharmacia biotech）を添加することによって開始
させた。反応は、室温で行った。

従来のDNA配列決定新規なDNA配列決定により得られた配列データを、放
射能標識ターミネーターを用いた半自動化固相配列決定
法（Hultman,et al.（1991）Bio Techniques 10,84−9
3）により確認した。ループ構造PCR生成物から生成され
たサンガーフラグメントは、ゲルにかける前にBgl II制
限エンドヌクレアーゼにより制限した。

結果配列決定法の原理新規な配列決定法の原理を図１において説明する。目
的の特異的DNAフラグメント（一本鎖DNAテンプレートに
ハイブリダイズした配列決定プライマー、または自己プ
ライミング一本鎖生成物）を、DNAポリメラーゼ、ATPス
ルフリラーゼ、ルシフェラーゼおよびヌクレオチド分解
酵素とともにインキュベートし、反復サイクルのヌクレ
オチドインキュベーションを行う。DNAの合成は、取り
込まれたヌクレオチドのそれに等しいモラリティのPPi
の放出を伴う。それにより、酵素的無機ピロリン酸検出
アッセイ（ELIDA）により、相補的な塩基が取り込まれ
た場合にのみ、リアルタイムのシグナルが得られる。EL
IDAにおいては、生成されたPPiを、ATPスルフリラーゼ
によりATPに変換し、次に、ATPの量をルシフェラーゼア
ッセイによって決定する（図１）。添加されたヌクレオ
チドはヌクレオチド分解酵素によって連続的に分解され
るので、特定の時間間隔の後、新たなヌクレオチドを添
加することができる。ELIDAの結果から、プライマーの
後の配列を推定する。本発明のDNA配列決定法を、「パ
イロシーケンシング」（pyrosequencing）と名づける。

方法の最適化新規なDNA配列決定法のいくつかの異なるパラメータ
ーを、合成DNAテンプレートを用いてモデル系において
最適化した。本方法は、DNAポリメラーゼによる添加さ
れたデオキシヌクレオチドの利用、カップリングした酵
素系による放出されたPPiの検出およびヌクレオチドの
連続的分解に基づいているため、アッセイにおいて用い
られる異なる成分の濃度は、注意深くバランスをとるべ
きである。

添加された正しいデオキシヌクレオチドの数の関数と
してのシグナル−程度を図２に示す。反応は、３つの最
初の正しい塩基（dCTP、dTTPおよびdGTP）の添加により
開始させた。軌跡は、塩基の取り込みの間のPPi（ATPス
ルフリラーゼによりATPに変換される）の放出、および
それに続くATPの分解を示す。３つの残基の取り込みを
記した。短いタイムラグの後（アピラーゼ反応は約２分
間進行させた）、dATPαＳを添加した。１つの残基の取
り込みに相当するシグナルが観察された。その後、次の
２つの正しいデオキシヌクレオチド（dCTPおよびdGTP）
を添加した。今回は、２つの残基の取り込みが観察され
た。図２に示す結果は、このDNA配列決定のアプローチ
が機能することを示す；添加されたデオキシヌクレオチ
ドは、各添加の間にアピラーゼにより分解され、観察さ
れたシグナルは取り込まれたヌクレオチドの量に比例
し、相補的でない塩基が添加された場合にはPPiの放出
が観察されなかった（示していない）。

上述の実験においては、32mU ATPスルフリラーゼ、2
00mU アピラーゼ、2U（exo^-）クレノウ、2pmolテンプ
レート／プライマー、および0.4pmolデオキシヌクレオ
チドを用いた。24〜48mU ATPスルフリラーゼ、100〜40
0mU アピラーゼ、１〜5U（exo^-）クレノウ、１〜5pmol
テンプレート／プライマー、および0.2〜1.0nmol デ
オキシヌクレオチド、の範囲で異なる化合物を変化させ
た場合に、同様の結果が得られた（示していない）。プ
ライマー／テンプレートに対して過剰のポリメラーゼを
用いることが、すべての遊離3'末端が伸長されることを
確実にするために重要であり得る。また、配列決定プラ
イマーがテンプレートの3'末端から少なくとも１塩基内
側にハイブリダイズすることも、平滑末端DNAポリメラ
ーゼ活性（Clark,1991,Gene,104,75−80）を排除するた
めに重要であり得る。

DNA配列決定この新規なアプローチの能力を調べるために、次の一
連の実験において、２つの異なる合成テンプレートなら
びにPCR生成物を配列決定した。図３および４は、２つ
の異なる合成テンプレート上で行ったDNA配列決定の結
果を示す。両テンプレートとも、末端まで配列決定し、
両方の場合において真の配列を決定することができた。
ポリメラーゼがテンプレートの末端に達するとき、シグ
ナルはかなり低減し、最後の塩基について重合が遅くな
ることを示す。より長いテンプレートを配列決定した場
合、シグナルは、同じ程度では低減しなかった（図
５）。非相補的塩基を添加した場合に観察された少量の
シグナルは、ヌクレオチド溶液中のPPi汚染によるもの
である。このバックグラウンドシグナル（偽シグナル）
の後での増大は、おそらく、ヌクレオシドジホスフェー
トキナーゼ活性によるものである（SigmaからのATPスル
フリラーゼ調製物中の汚染物）。ヌクレオシドジホスフ
ェートキナーゼは、新規なデオキシヌクレオチドトリホ
スフェートを添加すると、分解されていないデオキシヌ
クレオシドジホスフェートをデオキシヌクレオシドトリ
ホスフェートに変換する。こうして、形成されたデオキ
シヌクレオシドトリホスフェートは、伸長するプライマ
ー中に取り込まれることができる。この影響は、合成テ
ンプレートE3PNを配列決定した場合に特に明らかであっ
た。最初の正しいヌクレオチド（dCTP）を添加したと
き、分解されなかったdTDPのいくらかがdTTPに変換され
る。DCMPが取り込まれた後、形成されたdTTのいくらか
が取り込まれ得る。この「フェーズがあっていない（ou
t−of−phase）」得られたDNAは、dGTPが添加されると
さらに伸長され得る。これは、フェーズがあっていない
DNAが、２つのＡが取り込まれるべき位置に達したとき
に明らかに示される。ここでは、偽シグナルの方が強
い。２つのＴおよびＣの後も、より強いシグナルを与え
るが、一方、次の単一のＡはより低いシグナルを与え
る。図５において、自己プライミングした160塩基長の
一本鎖PCR生成物の20塩基の配列決定を示す。得られた
配列は、半自動的固相サンガー配列決定法により確認さ
れた（データは示していない）。配列決定がフェーズが
合わない主要な理由は、ジャガイモアピラーゼ（Liebec
q,C.Lallemand A,and Deguldre−Guillaume,M.J.（196
3）Bull.Soc.Chim.Biol.45,573−594）によりデオキシ
ヌクレオシドジホスフェート（少なくともdNDPのいくつ
か）の遅い分解と、Sigmaから入手したATPスルフリラー
ゼ調製物中のデオキシヌクレオチドジホスフェートキナ
ーゼ汚染との組み合わせである。ATPスルフリラーゼの
純粋調製物を用いることにより、またはより効率的なdN
DP分解酵素（Doremus,H.D.and Blevins,D.G.（1988）Pl
ant Physiol.87（１）,41−45）を用いることにより、
この問題を克服することが可能である。ATPスルフリラ
ーゼの純粋調製物を用いる場合であっても、ヌクレオチ
ド分解酵素（NTPase、NDPaseおよびNMPase）の組み合わ
せを用いることが、分解プロセスの速度を増大させ、か
つ熱流動性平衡濃度のdNTPを低減させるために有利であ
り得る。さらに、ブタ膵臓ヌクレオシドトリホスフェー
トジホスホヒドロラーゼ（Le Bel,D.,Piriet,G.G.Phane
uf,S.,St−Jean,P.,Laliberte,J.F.and Beudoin,A.R.
（1980）J.Biol.Chem.255,1337−1233;Laliberte,J.F.S
t−Jean,P.and Beudoin,R.（1982）J.Biol.Chem.257,38
69−3871）のようなdNTPについて低いKmを有する酵素を
用いることは、利点であり得る。

例２ PCR生成物の「パイロシーケンシング」ビオチニル化されたPCR生成物を、ストレプトアビジ
ンでコーティングされた超常磁性ビーズであるDynabead
s（登録商標）M280−ストレプトアビジン（Dynal）上に
固定化した。一本鎖DNAの溶出および配列決定プライマ
ー（JA80;5'−GATGGAAACCAAAAATGATAGA−3'）へのハイ
ブリダイゼーションは、以前記載されたように行ったハイブリダイズしたテンプレート／プライマーを、シー
クエナーゼ2.0 DNAポリメラーゼ（Amersham）とともに
インキュベートした。配列決定手順は、異なるデオキシ
ヌクレオシドトリホスフェート（Pharmacia Biotech）
の連続的な添加の際のプライマー鎖の段階的な伸長、お
よびアピラーゼによるヌクレオチドの同時分解により行
った。アピラーゼは、等級VI、高ATPase/ADPase比（ヌ
クレオシド5'−トリホスファターゼおよびヌクレオシド
5'−ジホスファターゼ;EC3.61.5）のものであった（Sig
ma Chemical Co.）。配列決定反応は、室温で行い、0.6
nmolのデオキシヌクレオチドの１つ（Pharmacia Biotec
h）の添加により開始させた。ヌクレオチドの取り込み
により放出されたPPiは、以前記載されたように検出し
た（例１を参照されたい）。JA80は、ホスホルアミダイ
ド化学により合成した（Interactiva）。パイロシーケ
ンシング法により得られた配列決定データは、Hultman
らにしたがった半自動化固相サンガー配列決定法により
確認された反応は室温で行った。結果を図６に示す。

フロントページの続き (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12N 15/00 - 15/90 C12N 9/00 - 9/99 C12Q 1/00 - 1/70 G01N 33/50 - 33/98 ＰｕｂＭｅｄＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ) ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＥＵＲＯＰＡＴ（ＱＵＥＳＴＥＬ) ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ／ＰＩＲ／ＧｅｎｅＳｅｑ

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】試料DNA配列中の標的位置の塩基を同定す
る方法であって、標的位置にすぐ隣接して試料DNAにハ
イブリダイズする伸長プライマーを用意し、試料DNAお
よび伸長プライマーを、デオキシヌクレオチドまたはジ
デオキシヌクレオチドの存在下でポリメラーゼ反応に供
し、それによりデオキシヌクレオチドまたはジデオキシ
ヌクレオチドを、それが標的位置の塩基と相補的である
場合にのみ取り込まれてピロホスフェート（PPi）を放
出するようにし、PPiの放出を酵素的に検出し、異なる
デオキシヌクレオチドまたはジデオキシヌクレオチド
を、試料−プライマー混合物の別個のアリコートに、ま
たは同じ試料−プライマー混合物に連続的に添加して、
ポリメラーゼ反応に供し、どのデオキシヌクレオチドま
たはジデオキシヌクレオチドが取り込まれたかを示す方
法であって、取り込まれなかったヌクレオチドが分解さ
れるようにヌクレオチド分解酵素をポリメラーゼ反応工
程中に包含させることを特徴とする方法。
【請求項２】ヌクレオチド分解酵素が、アピラーゼであ
る、請求項１記載の方法。
【請求項３】ヌクレオシドトリホスファターゼ、ヌクレ
オシドジホスファターゼおよびヌクレオシドモノホスフ
ァターゼ活性を有するヌクレオチド分解酵素の混合物を
用いる、請求項１または２記載の方法。
【請求項４】ヌクレオチド分解酵素が、固体支持体に固
定化されている、請求項１〜３のいずれか１項記載の方
法。
【請求項５】前記固定化ヌクレオチド分解酵素を、ポリ
メラーゼによるヌクレオチド取り込みが起こった後に添
加し、次に、続くヌクレオチド取り込み反応工程の前に
除去する、請求項４記載の方法。
【請求項６】PPi放出を、酵素発光計測無機ピロホスフ
ェート検出アッセイ（ELIDA）を用いて検出する、請求
項１〜５のいずれか１項記載の方法。
【請求項７】PPi検出酵素を、ポリメラーゼ反応工程に
包含させ、ポリメラーゼ反応工程およびPPi放出検出工
程を実質的に同時に行う、請求項１〜６のいずれか１項
記載の方法。
【請求項８】ポリメラーゼ反応工程において、ポリメラ
ーゼの基質として作用することができるPPi検出酵素の
基質としては作用することができないdATPまたはddATP
アナログを用いる、請求項１〜７のいずれか１項記載の
方法。
【請求項９】dATPアナログが、デオキシアデノシンα−
チオトリホスフェート（dATPαＳ）である、請求項８記
載の方法。
【請求項１０】dCTP、dGTPおよびdTTPのα−チオアナロ
グの使用をさらに包含する、請求項１〜９のいずれか１
項記載の方法。
【請求項１１】試料DNAを、固定化する、または固体支
持体への付着手段とともに提供する、請求項１〜10のい
ずれか１項記載の方法。
【請求項１２】試料DNAを、最初に増幅する、請求項１
〜11のいずれか１項記載の方法。
【請求項１３】伸長プライマーが、ループを含み、それ
自身および試料DNAの3'末端にアニーリングする、請求
項１〜12のいずれか１項記載の方法。
【請求項１４】エキソヌクレアーゼ欠損（exo−）高純
度ポリメラーゼを用いる、請求項１〜13のいずれか１項
記載の方法。
【請求項１５】DNA配列中の単一の標的位置の塩基の同
定のための、請求項１〜14のいずれか１項記載の方法で
あって、試料DNAを増幅に供し；増幅されたDNAを固定化
し、次に鎖分離に供し、固定化されていない鎖を除去
し、標的位置にすぐ隣接して固定化DNAにハイブリダイ
ズする伸長プライマーを用意し；固定化一本鎖DNAの４
つのアリコートの各々を、次にジデオキシヌクレオチド
の存在下でポリメラーゼ反応に供し、各アリコートに異
なるジデオキシヌクレオチドを用い、それにより標的位
置の塩基に相補的なジデオキシヌクレオチドのみが取り
込まれるようにし；次に４つのアリコートを４つ全ての
デオキシヌクレオチドの存在下で伸長に供し、それによ
り各アリコートにおいてジデオキシヌクレオチドと未反
応のDNAを伸長させて二本鎖DNAを形成させる一方で、ジ
デオキシヌクレオチドでブロックされたDNAを一本鎖DNA
のままに残し；その後、二本鎖DNAおよび／または一本
鎖DNAを同定して、どのジデオキシヌクレオチドが取り
込まれたか、したがってどの塩基が標的位置に存在した
かを示す、方法。
【請求項１６】請求項１〜３のいずれか１項記載の方法
において用いるためのキットであって、（ａ）ポリメラーゼ；（ｂ）ピロホスフェート放出を同定するための検出酵
素手段；（ｃ）試料−プライマー混合物中の溶液中の包含のた
めのヌクレオチド分解酵素；および（ｄ）デオキシヌクレオチドを含むキット。
【請求項１７】請求項１〜３のいずれか１項記載の方法
において用いるためのキットであって、（ａ）ポリメラーゼ；（ｂ）ピロホスフェート放出を同定するための検出酵
素手段；（ｃ）ヌクレオチド分解酵素の混合物；および（ｄ）デオキシヌクレオチドを含むキット。
【請求項１８】以下の１またはそれ以上をさらに含む、
請求項16または17記載のキット：（ｉ）ポリメラーゼの基質として作用することができる
が前記PPi検出酵素の基質としては作用することができ
ないデオキシヌクレオチドアナログ；（ii）標的位置がプライマーの3'末端に直接隣接するよ
うに試料DNAにハイブリダイズする試験特異的プライマ
ー；（iii）ジデオキシヌクレオチド；および（iv）ポリメラーゼの基質として作用することができる
が前記PPi検出酵素の基質としては作用することができ
ないジデオキシヌクレオチドアナログを含むキット。
【請求項１９】さらに以下のものを含む、最初のPCR増
幅とともに用いるための、請求項16、17または18記載の
キット：（ｉ）少なくとも１つのプライマーがプライマーの固定
化を可能にする手段を有する、１対のPCRプライマー；（ii）PCRのためのポリメラーゼ；（iii）デオキシヌクレオチド。
【請求項２０】複数の試料DNA配列とともに用いるため
の請求項１〜15のいずれか１項記載の方法であって、前
記DNA配列が、固相上にアレイフォーマットで配置され
ている、方法。
【請求項２１】複数の試料DNA配列とともに用いるため
の請求項16〜19のいずれか１項記載のキットであって、
前記DNA配列が、固相上にアレイフォーマットで配置さ
れている、キット。