JP3301876B2 - 特定のポリヌクレオチドの検出方法及び当該方法に用いる検出用キット - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、遺伝的疾患や感染症の
診断に有効な試料中に存在する特定の塩基配列を含むポ
リヌクレオチド（以下、標的ポリヌクレオチドという）
の検出方法、及び当該検出方法に使用するポリヌクレオ
チド検出用キットに関する。

【０００２】

【従来の技術】核酸塩基配列の相補性に基づく分析方法
は、遺伝的な特徴を直接的に分析することが可能であ
る。そのため、遺伝的疾患、癌化、微生物の識別等には
非常に有力な手段である。また遺伝子そのものを検出対
象とするために、例えば培養のような時間と手間のかか
る操作を省略できる場合もある。

【０００３】しかし、検体中に目的の遺伝子量が少ない
場合の検出は一般に容易ではなく、標的遺伝子そのもの
を、あるいは検出シグナル等を増幅することが必要とな
る。標的遺伝子を増幅する方法の一つとしてＰＣＲ(Pol
ymerase Chain Reaction) 法が知られている。ＰＣＲ法
は、in vitroにおける核酸の増幅技術として最も一般的
な方法である。しかしながら、当該ＰＣＲ法において
は、実施のために特別な温度調節装置が必要なこと；増
幅反応が対数的に進むことから定量性に問題があるこ
と；試料や反応液が外部からの汚染を受け、誤って混入
した核酸が鋳型として機能してしまうコンタミネーショ
ンの影響を受け易いこと等の問題点が知られている。

【０００４】即ち、ＰＣＲのようにＤＮＡを数百万倍に
まで増幅させる反応では混入した微量ＤＮＡも同様に増
幅されるため、誤った結果が提供される傾向がある。こ
れは特に多数の検体を同時に扱う場合には重大な問題で
ある。かかるコンタミネーション対策として、実験室を
区別したり、あるいはＰＣＲ反応でウラシル基を取り込
ませておき、新たにＰＣＲ反応を行う前にその検体をウ
ラシルグリコシラーゼ処理し、検体中に誤って混入した
他の反応系の増幅産物のみを分解するというような工夫
がなされているが、前記対策としては必ずしも十分では
ない。

【０００５】また、検出シグナルを増幅する方法として
はＱβレプリカーゼでシグナルＲＮＡを増幅する方法
（Bio/Technology, 6, 1197-1202(1988), P.M.Lizardi
et al.）が報告されている。しかし、この方法は増幅さ
せる配列をレプリカーゼが認識する配列内に挿入する必
要があり、その立体構造上の制約から挿入の位置や配列
が制限される等の問題がある。またＱβレプリカーゼで
シグナルＲＮＡを増幅する方法でもＰＣＲ法と同様のコ
ンタミネーションの問題があり、根本的な解決とは言い
難い。

【０００６】前記の方法は検出対象となる塩基配列を増
幅する方法であるが、更に以下に述べるような分解産物
を検出するシグナル増幅法も考案されている。例えば、
標的核酸にオリゴヌクレオチドプローブＤＮＡをハイブ
リダイズさせた後、制限酵素処理し、切断されたプロー
ブ断片を検出するシグナル増幅法が知られている(EP-04
55517/A1) 。この方法は、ＰＣＲ法に比べて検出感度は
低いものの、定量性に優れ、実施に際して特別な装置を
必要としない等の利点がある。しかし、この方法ではプ
ローブＤＮＡ以外に反応が繰り返し起こるようにするた
めの特異的な配列を持つ第二のオリゴヌクレオチドを系
に共存させる必要がある。また検出する部位に制限酵素
切断部位が必要であるために検出可能な部位が制限され
る等の欠点も持つ。

【０００７】そのほかに２本鎖ＤＮＡを特異的に切断す
るλエクソヌクレアーゼを用いたサイクリングアッセイ
法も開発されている（BioTechniques, Vol.13, No.6, 8
82-892(1992), C.G. Copley et al.）。この方法は、オ
リゴヌクレオチドプローブが相補的な配列とハイブリダ
イズして形成された２本鎖ＤＮＡにλエクソヌクレアー
ゼを作用させ、プローブＤＮＡが２本鎖を維持できない
程度まで分解されると新たなプローブＤＮＡと置き替わ
り、続いてこの新たなプローブも分解されることにより
サイクリング反応が起こるというものである。この方法
は、当該プローブの分解産物を検出することにより特定
のＤＮＡ配列の有無を判定することが可能である。また
反応原理が単純であり、しかも検出部位の配列が制限さ
れないという点では制限酵素を用いる方法(EP-0455517/
A1) よりも有利である。

【０００８】しかし、λエクソヌクレアーゼは基質とし
て５’末端がリン酸化されたプローブＤＮＡを要求す
る。ＤＮＡ合成機を用いてプローブＤＮＡを化学合成し
た場合５’末端はリン酸化されておらず、そのため合成
後改めて末端をリン酸化する必要がある。そして、５’
末端が完全にリン酸化されているのかどうかを確認する
ことが難しいためプローブ調製の再現性の点で問題が残
る。更に、λエクソヌクレアーゼを用いたサイクリング
アッセイ法はプローブＤＮＡが鋳型ＤＮＡに繰り返しハ
イブリダイズすることが必要であるが、ハイブリダイゼ
ーションの反応は一定温度では起こりにくいため、これ
が反応系全体における律速となり、サイクリング反応の
ターンオーバー数が少ないという問題点もある（文献で
は約５００回／時間）。

【０００９】エクソヌクレアーゼを用いたサイクリング
アッセイ法としては、特開平５−130870号公報記載の方
法も知られている。この公報記載の方法はプライマーを
起点とする相補鎖の合成反応とともに５’→３’エクソ
ヌクレアーゼを作用させてプライマーを逆方向から分解
する方法である。即ち、５’→３’エクソヌクレアーゼ
によって分解されたプライマーに代って新たなプライマ
ーがハイブリダイズし、ＤＮＡポリメラーゼによって相
補鎖の合成と先に合成された鎖を外す反応が進行しサイ
クリング反応が成立する。当該方法においては、ＰＣＲ
反応のような複雑な温度制御は要求されないが、プライ
マーのハイブリダイズ工程を繰り返す必要があるのでや
はりターンオーバー数（プローブＤＮＡのハイブリダイ
ゼーションの繰り返し数）を上げにくいという問題が残
る。

【００１０】本発明者等は、これらの問題点の解消を目
的として、特定の反応促進剤をエクソヌクレアーゼIII
とともに用いる塩基配列検出方法を開発した（特開平6-
327499号公報）。この方法はプローブの合成が容易な
上、反応時には特殊な温度制御が不要となり、しかもコ
ンタミネーションの影響を殆ど受けずに塩基配列を検出
することが可能となる優れた方法である。しかし、この
技術では反応促進剤は、ターンオーバー数（λエクソヌ
クレアーゼを用いたサイクリングアッセイ法での説明と
同様のプローブＤＮＡのハイブリダイゼーションの繰り
返し数）を増加させる効果は認められるものの、プロー
ブＤＮＡが繰り返しハイブリダイズしなければならない
ことには変わりはなく、必ずしも高感度を得られないと
いう問題点を残していた。

【００１１】加えて今まで述べた遺伝子の増幅法におい
ては、プライマーとして加えたオリゴヌクレオチドは増
幅産物となってプライマーとしては機能しなくなるの
で、予め予想される検出対象量に対して大過剰量のオリ
ゴヌクレオチドをプライマーとして用意しなければなら
ない。特にＰＣＲ法のように対数的に増幅産物が生成す
る系では、非常に多量のオリゴヌクレオチドを用意する
必要があった。オリゴヌクレオチドプライマーは化学的
に合成するにしろ、生物材料に原料を求めるにしろ試薬
成分のコストの点から使用量は少ない方が好ましい。

【００１２】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、特殊な装置
が要求される複雑な温度制御によらず、単純な反応系で
コンタミネーションの影響を受け難い塩基配列の検出技
術の提供を課題とする。また本発明は、これらの目的を
達成するために検出対象となる塩基配列の制限のない、
汎用性に優れる検出技術の提供をも課題とするものであ
る。更に、検出系の選択によっては高い感度と定量性を
得ることが可能な塩基配列の検出技術の提供をも課題と
するものである。

【００１３】

【課題を解決するための手段】本発明者等は、前記課題
の解決を目的として鋭意検討を行った。その結果、一本
鎖ＤＮＡには作用せず二本鎖となったＤＮＡのみを切断
し、かつ塩基配列には限定されないヌクレアーゼをＤＮ
Ａポリメラーゼとともに利用したシグナル増幅法を開発
し、本発明を完成した。

【００１４】即ち、本発明は以下の事項をその要旨とす
るものである。 (1)検出対象のその塩基配列が既知であるポリヌクレオ
チドに、当該ポリヌクレオチドの一部と相補的な配列を
有しかつヌクレアーゼ耐性を有するオリゴヌクレオチド
プライマーをハイブリダイズさせ、次いでこれに少なく
とも１種のデオキシヌクレオシドトリリン酸、ＤＮＡポ
リメラーゼ及びヌクレアーゼを加えて、前記プライマー
の３’末端に隣接しかつ前記ポリヌクレオチドと相補的
である塩基種を相補鎖合成し引き続いて分解し、かつ当
該相補鎖合成及び分解を少なくとも１回以上繰り返し
て、生成するピロリン酸又はデオキシヌクレオシドモノ
リン酸を検出することを特徴とする、前記ポリヌクレオ
チドの検出方法。

【００１５】(2)オリゴヌクレオチドプライマーが、当
該オリゴヌクレオチドプライマーの３’末端でホスホロ
チオエート化されたものであることを特徴とする前記
(1) 記載のポリヌクレオチドの検出方法。

【００１６】(3)ＤＮＡポリメラーゼが、ＤＮＡポリメ
ラーゼＩ、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメン
ト、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼ
及びＰｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼからなる群から選ば
れるＤＮＡポリメラーゼであることを特徴とする前記
(1) 又は(2) 記載のポリヌクレオチドの検出方法。

【００１７】(4)ヌクレアーゼがエクソヌクレアーゼIII
であることを特徴とする前記(1) 〜(3) のいずれかに
記載のポリヌクレオチドの検出方法。

【００１８】(5)デオキシヌクレオシドトリリン酸のβ
位及びγ位のリン酸分子以外の分子又は原子が、放射性
同位元素で置換標識されており、かつヌクレアーゼによ
る反応により生成するデオキシヌクレオシドモノリン酸
を検出することを特徴とする前記(1) 〜(4) のいずれか
に記載のポリヌクレオチドの検出方法。

【００１９】(6)ヌクレアーゼによる反応により生成す
るデオキシヌクレオシドモノリン酸をクロマトグラフィ
ーによって分離し当該デオキシヌクレオシドモノリン酸
を光学的に測定することを特徴とする前記(1) 〜(4) の
いずれかに記載のポリヌクレオチドの検出方法。

【００２０】(7)前記(1) 〜(4) のいずれかに記載のポ
リヌクレオチドの検出方法において、ＤＮＡポリメラー
ゼによる相補鎖合成により生成するピロリン酸を、アデ
ノシン−５’−ホスホサルフェート及びアデノシントリ
リン酸スルフリラーゼと反応させてアデノシントリリン
酸を生成させ、当該アデノシントリリン酸を検出するこ
とを特徴とするポリヌクレオチドの検出方法。

【００２１】(8)アデノシントリリン酸をルシフェリン
−ルシフェラーゼ反応によって測定することを特徴とす
る前記(7) 記載のポリヌクレオチドの検出方法。

【００２２】(9)以下の１〜４の成分： １．検出対象のその塩基配列が既知であるポリヌクレオ
チドの一部と相補的な配列を有しかつヌクレアーゼ耐性
を有するオリゴヌクレオチドプライマー、 ２．ＤＮＡポリメラーゼ、 ３．少なくとも１種のデオキシヌクレオシドトリリン
酸、及び ４．３’→５’方向に２本鎖ＤＮＡを分解する活性を有
するヌクレアーゼ。を含む前記(1) 〜(8) のいずれかに
記載のポリヌクレオチドの検出方法に使用するポリヌク
レオチド検出用キット。

【００２３】(10) 前記(9) 記載のポリヌクレオチド検
出用キットにおいて、当該検出用キットに、デオキシヌ
クレオシドモノリン酸検出用試薬を含有させたことを特
徴とするポリヌクレオチド検出用キット。

【００２４】(11) 前記(9) 記載のポリヌクレオチド検
出用キットにおいて、当該検出用キットに、ピロリン酸
検出用試薬を含有させたことを特徴とするポリヌクレオ
チド検出用キット。

【００２５】以下、本発明について詳細に説明する。 Ａ．本発明の検出対象は、その塩基配列が既知のポリヌ
クレオチドである。本発明の検出対象は、動物、植物、
細菌、酵母、糸状菌、マイコプラズマ、リケッチア、ウ
イルス他あらゆるものに由来するポリヌクレオチドにお
よぶ。またポリヌクレオチドとしては、ゲノミック核酸
はもちろん、ＲＮＡウイルスやｍＲＮＡから誘導された
ｃＤＮＡを検出対象とすることも可能である。なお実際
に検体を分析するときには、検体に含まれる検出対象以
外のＤＮＡの配列や、ＤＮＡ合成のプライマーとなりう
る配列の存在が問題となることがある。また、ＤＮＡポ
リメラーゼやヌクレアーゼの活性阻害物質、デオキシヌ
クレオシドトリリン酸も混入している可能性もある。更
にピロリン酸を検出対象とする場合には、検体中に共存
するピロリン酸も分析を妨害する要因となる。

【００２６】従って、本発明においては増幅反応を行う
ためには可能な限り前記混入物を除去することが好まし
い。例えば、固相に結合した捕捉プローブ等を用いて標
的ＤＮＡを捕捉し、続いて洗浄により前記不純物を除去
し、その後に本発明を適用するとバックグランドのない
高感度の検出系が可能となる。このとき捕捉プローブを
５’末端で固相と結合しておけば（Eur.J.Immunol., 2
3, 1895-1901(1993), H.Kohsaka et al.; Nucleic Acid
s Research,21, 3469-3472 (1993), H.Kohsakaet al.
)、捕捉プローブそのものをプライマーとして本実験の
方法を適用することも可能となる。なお、前記ピロリン
酸の除去についてはピロホスファターゼによる酵素的な
除去も可能である。

【００２７】また、特に１塩基の伸長〜分解を１サイク
ルとして繰り返す、本発明の好ましい方法においては、
後述するように点突然変異の検出に応用することができ
る。なお、点突然変異の検出方法として、特開昭59-208
465 号公報記載の方法が既に知られている。この方法
は、プライマーに続く相補配列の合成反応において基質
としてヌクレオチドの誘導体を用いることによって点突
然変異が存在する場合（又は存在しない場合）に限りこ
のヌクレオチド誘導体が取り込まれるという反応原理に
基づく方法である。即ち、基質としてヌクレオチド誘導
体を取り込んだ場合には反応産物がエクソヌクレアーゼ
に対する耐性を獲得するので、当該ヌクレアーゼによる
ヌクレオチドの分解の有無を特定することによって点突
然変異を検出することができる。

【００２８】確かに、前記方法で用いられている要素の
一部は本発明と共通するものである。しかしながら、そ
もそも前記方法がヌクレアーゼ耐性獲得の有無を点突然
変異が存在する指標とすることを特徴とする方法である
のに対し、本発明は反応が繰り返し起きるかどうかを点
突然変異の存在の指標として用いるものであるという点
において本質的に異なる。そして、本発明方法による点
突然変異の検出は、前記方法による当該変異の検出に比
べても感度の点で良好であり有利である。

【００２９】Ｂ．本発明は、前記の既知のポリヌクレオ
チドに、当該ポリヌクレオチドの一部と相補的な配列を
有しかつヌクレアーゼ耐性を有するオリゴヌクレオチド
プライマーをハイブリダイズさせることを特徴とする。
本発明において、「相補的」とは、塩基配列が塩基対の
ワトソン・クリック則に従って、もう一方の核酸と水素
結合による二重鎖を形成し得る状態のことをいう。具体
的には、アデニン（Ａ）に対してはチミン（Ｔ）；グア
ニン（Ｇ）に対してはシトシン（Ｃ）が対応する相補性
を有する状態である。なお、本発明に用いるプライマー
は、標的となるポリヌクレオチドの塩基配列に対して完
全に相補的である必要はなく、少なくとも当該オリゴヌ
クレオチドが全体として前記標的ポリヌクレオチドに対
してハイブリダイズすることが可能であれば足りる。具
体的には、オリゴヌクレオチドの３’末端の塩基が標的
ポリヌクレオチドの塩基と対応することを必須として、
オリゴヌクレオチドの塩基全体の少なくとも70％が前記
の相補性を標的ポリヌクレオチドとの関係において有す
ることが必要である。かかる相補性が70％未満になると
前記ハイブリダイズ自体が困難になるため好ましくな
い。一方、３’末端の塩基が標的ポリヌクレオチドの塩
基と対応するという条件は、本発明が３’末端において
塩基の付加反応を行うための必須の条件である。３’末
端で塩基が対応せずプライマーが１本鎖となっている
と、ポリメラーゼやヌクレアーゼが認識できなくなって
しまう。

【００３０】また、本発明に用いるオリゴヌクレオチド
プライマーは、既知の標的ポリヌクレオチドの「一部」
と相補的であることを特徴とする。これは、本発明方法
が、オリゴヌクレオチドプライマーの３’末端側にＤＮ
Ａポリメラーゼによって付加される予め反応系に存在さ
せた特定のデオキシヌクレオチドを検出することを特徴
とすることに起因する。即ち、プライマーの３’末端側
に付加されるデオキシヌクレオチドに対して鋳型となる
ヌクレオチドが既知でなければ、予め特定のデオキシヌ
クレオチドを系内に存在させることが困難である故に、
本発明に用いるオリゴヌクレオチドプライマーは、既知
の標的ポリヌクレオチドの「一部」と相補的であること
が必要となる。

【００３１】また、本発明に用いるオリゴヌクレオチド
プライマーは、ヌクレアーゼに対して耐性を有すること
が必要である。これは、本発明においては、系内にヌク
レアーゼを存在させることが必要であるため、かかるヌ
クレアーゼによりオリゴヌクレオチドプライマーが分解
されてしまえば本発明方法を実施することが困難になる
からである。オリゴヌクレオチドプライマーにヌクレア
ーゼ耐性を付与する方法は特に限定されるものではな
く、この分野において通常用いられる方法をいずれも利
用することができる。

【００３２】具体的には、例えばＤＮＡ合成装置でプラ
イマーとなるオリゴヌクレオチドを合成するときに公知
の方法によって必要な部位にホスホロチオエート(Phosp
horothioate)結合を導入すればオリゴヌクレオチドプラ
イマーにヌクレアーゼ耐性を与えることができる。この
ような方法としては、例えば固相ホスホルアミダイト(P
hosphoramidite) 法でＤＮＡを合成する場合であれば、
ヨウ素水等による酸化工程に代えて適当なＳ化試薬（ホ
スホロチオエート化試薬）によって酸化処理を行うこと
で通常のリン酸ジエステル結合ではなくホスホロチオエ
ート結合をオリゴヌクレオチドに導入することができ
る。Ｓ化試薬としては、３Ｈ-1,2-benzodithiole-3-one
1,1-dioxide(Beaucage's Reagent)、TETD/Acetonitril
e(TETD:tetraethylthiuram disulfide) 等が知られてい
る。この方法によれば、ホスホロチオエート結合をオリ
ゴヌクレオチドの任意の部位に導入することができる。

【００３３】あるいは、ＤＮＡポリメラーゼによってＤ
ＮＡを合成する際に、デオキシリボヌクレオシドトリリ
ン酸のα位のリン原子に結合した酸素を硫黄に置換した
ものを基質として用いることによってオリゴヌクレオチ
ドにホスホロチオエート結合を導入することができる。
このような置換化合物としては、α−Ｓ−デオキシチミ
ジントリリン酸、α−Ｓ−デオキシシトシントリリン
酸、α−Ｓ−デオキシアデニントリリン酸及びα−Ｓ−
デオキシグアニントリリン酸等（これらの置換化合物を
総称してＳｄＸＴＰと省略する）を例示することができ
る。ＤＮＡポリメラーゼによる合成反応を行うときに、
デオキシヌクレオシドトリリン酸（以下、ｄＸＴＰと省
略する）に代えてＳｄＸＴＰを基質とすることにより、
合成されたオリゴヌクレオチドはホスホロチオエート化
され、ヌクレアーゼ耐性を獲得する。ＤＮＡポリメラー
ゼによってホスホロチオエート結合を導入する場合は、
実際に検出対象であるポリヌクレオチドにハイブリダイ
ズした状態でこの反応を進行させることができる。つま
り、本発明におけるヌクレアーゼ耐性オリゴヌクレオチ
ドプライマーは、必ずしも予め準備されている必要はな
く反応時にヌクレアーゼ耐性を獲得する方法を採ること
も可能である。

【００３４】一旦ヌクレアーゼ耐性とすれば以降の反応
を後述する反応原理に従って進行させることができる。
なお、この場合はまずＳｄＸＴＰが付加し、次いでｄＸ
ＴＰが付加し、少なくとも２塩基分の伸長反応が必要に
なるが、２つめのｄＸＴＰに対してはヌクレアーゼが作
用するので本発明方法を実施することができる。いずれ
にしても、プライマーの３’末端付近のホスホジエステ
ル結合をホスホロチオエート結合とすることによって、
３’側から攻撃するヌクレアーゼに耐性を示すオリゴヌ
クレオチドプライマーとなる。ただし、オリゴヌクレオ
チド全体をホスホロチオエート結合とすればヌクレアー
ゼ耐性度は更に上昇するが、同時にハイブリダイズする
効率が低下することになる。従ってホスホロチオエート
結合の数は、末端から１〜数個とすることが好ましい。
ホスホロチオエート結合は末端の１個のみでもよいが、
数個分、好ましくは３個分を連続してホスホロチオエー
ト結合とすれば、より完全なヌクレアーゼ耐性を期待で
きる。

【００３５】ただし、前記のようにＤＮＡポリメラーゼ
によるＤＮＡへの取り込みの効率はＳｄＸＴＰがｄＸＴ
Ｐよりかなり低いので、始めにＳｄＸＴＰを取り込ませ
た後に分解用のｄＸＴＰを加えるか、あるいはＳｄＸＴ
Ｐ濃度を高めに設定しておくといった工夫が必要な場合
もある。

【００３６】ヌクレアーゼ耐性の付与手段としては、前
記ホスホロチオエート化の他に、メチルホスホネート(M
ethylphosphonate) 結合、ホスホロアミデート(Phospho
roamidate)結合、ポリアミド核酸(Polyamide nucleic a
cid(PNA) )結合等の導入を示すことができる。これらの
結合によってヌクレオチドのリン酸結合部位、リボース
部位、そして核酸の塩基部位が修飾、あるいは構造をモ
ディファイされてヌクレアーゼ耐性を獲得する。

【００３７】この他に、オリゴヌクレオチドプライマー
としてＲＮＡプライマーを用いることも可能である。Ｒ
ＮＡはＤＮＡに作用するヌクレアーゼに対してほぼ耐性
を有するものである。従って、ＲＮＡプライマーを用い
れば、特別な修飾を施さなくてもＤＮＡに作用するヌク
レアーゼ耐性を有するオリゴヌクレオチドプライマーを
用意することが可能である。ただし、ＤＮＡに作用する
ヌクレアーゼやＤＮＡポリメラーゼの中にはＲＮａｓｅ
Ｈ活性を併せ持つものも存在し、このような場合にはＲ
ＮＡプライマー自身が分解されるため酵素の組み合わせ
によっては高感度を得にくい場合もある。

【００３８】本発明におけるオリゴヌクレオチドプライ
マーは、塩基数で少なくとも６以上、好ましくは10〜5
0、特に好ましくは15〜30程度とする。６未満では通常
の条件ではハイブリダイズしにくいばかりでなく、確率
的にも非特異的な反応につながる可能性が増す。他方例
えばホスホロチオエート化することによってヌクレアー
ゼ耐性としたオリゴヌクレオチドプライマーは、鋳型に
対する親和性（Ｔｍ）が低下するので、この低下分を補
うためにもある程度の長さを与えることが必要になる。
これに対して30を越えると化学的に合成する時に収率が
低下し易くなるので経済的に不利であるので好ましくな
い。更に、必要以上に長いプライマーを用いる場合はプ
ライマー間、あるいはプライマー内の水素結合による２
本鎖が形成されやすくなり非特異的な反応が起こりやす
くなる。このように不必要に長いプライマーは、非特異
増幅等の原因となる場合が有るので好ましくない。

【００３９】なお、本発明に使用し得るＤＮＡポリメラ
ーゼは後述するが、その中にはＤＮＡポリメラーゼＩの
ように弱いながら２本鎖ＤＮＡに対する５’→３’エク
ソヌクレアーゼ活性を有するものも存在する。この種の
酵素をＤＮＡポリメラーゼとして用いる時にはハイブリ
ダイズしたプローブが５’側からの分解を受けるので
５’側もヌクレアーゼ耐性としておくとよい。なお、同
じＤＮＡポリメラーゼでもクレノウフラグメントやＰｈ
ｉ２９ＤＮＡポリメラーゼはこの活性を有しないので
５’側は特に修飾する必要がなく、この点においては好
ましい。

【００４０】オリゴヌクレオチドプライマーの使用量
は、検出対象となる塩基配列に対して十分量となるよう
に添加する。従来の塩基配列の増幅法では、プライマー
として加えたオリゴヌクレオチドが増幅産物となってプ
ライマーとしては機能しなくなるので鋳型となる塩基配
列の量に対して大過剰量で用いる必要があったが、本発
明では１度ハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドプラ
イマーが繰り返しプライマーとして機能するため少なく
とも鋳型となる塩基配列と等モル存在すれば定量的な反
応が可能となる。実際には、平衡状態をハイブリダイズ
する方に傾けるために十分量のオリゴヌクレオチドプラ
イマーを利用するのが好ましい。検出対象となる標的配
列の量をあらかじめ予想することは困難であるが、少な
くとも希望する検出範囲の量に対して等モルを越える量
を、好ましくは５倍以上の過剰量でオリゴヌクレオチド
プライマーを用いることが高い感度を確保するうえで好
ましい条件となる。

【００４１】ハイブリダイズの条件は特に限定されない
が、ハイブリダイズ後はＤＮＡポリメラーゼとヌクレア
ーゼの存在下で全ての反応を進行させる必要があること
に着目する必要がある。特にヌクレアーゼはＰＣＲ法で
用いられるＴａｑポリメラーゼのような高度の耐熱性を
持たないので、当該ヌクレアーゼの酵素活性を維持でき
る条件を採用する必要がある。また温度以外の要素であ
る緩衝液の選択やｐＨの設定等も、ハイブリダイズのみ
ならずヌクレアーゼの活性が十分に発現できる条件を選
択すべきである。具体的な条件を例示すれば、緩衝液と
してトリス−塩酸緩衝液等を用いたとき、ｐＨは約７〜
９とし、20〜55℃で反応を行わせる。特に好ましい条件
としては、ｐＨ7.5 〜8.5 、温度は30〜45℃を示すこと
ができる。

【００４２】例えば、実施例に示したように、0.1pmol
のプライマー、50mMのＴｒｉｓ／ＨＣｌ緩衝液（pH7.
5)、10mM ＭｇＣｌ₂ のみからなる溶液中で加熱処理
（100 ℃で５分間）後、65℃で10分間アニーリングす
る。この場合は、すぐに37℃でＤＮＡポリメラーゼ反応
及びヌクレアーゼ反応を進行させることが可能である。
なお、最終的に反応系に蓄積されるピロリン酸を酵素的
に測定する場合には、この酵素反応についても好適な反
応条件が提供されなければならない。即ちｐＨ、塩濃
度、温度等を酵素反応に適するように設定する。

【００４３】また、反応液中にＤＮＡポリメラーゼやヌ
クレアーゼの安定化剤を添加することができる。かかる
安定化剤としては、例えば牛血清アルブミン（ＢＳ
Ａ）、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、β−メルカプト
エタノール等を挙げることができる。かかる安定化剤の
添加量は、ＢＳＡは10〜500 μg/ml、ＤＴＴは１mM程
度、β−メルカプトエタノールは10mM程度である。検出
対象となるポリヌクレオチドが二本鎖状態である場合に
は、予め一本鎖に変性する必要がある。かかる変性方法
としては、通常公知の変性方法、例えば加熱変性、酸変
性、アルカリ変性等を挙げることができるが、方法の簡
便性と確実性に鑑みれば、加熱変性（90℃〜100 ℃で５
分以上加熱）を採用するのが好ましい。

【００４４】また、目的としたプライマー以外のＤＮＡ
のハイブリダイズを抑制するか、又は非特異的にハイブ
リダイズしたＤＮＡを除去して非特異的な反応を抑制す
るために、ＤＮＡポリメラーゼ添加前にあらかじめエク
ソヌクレアーゼ処理を行うこともできる。

【００４５】Ｃ．本発明は、次いで、前記ハイブリダイ
ズの後、系に少なくとも１種のデオキシヌクレオシドト
リリン酸、ＤＮＡポリメラーゼ及びヌクレアーゼを加え
て、前記プライマーの３’末端に隣接しかつ前記ポリヌ
クレオチドと相補的である塩基種を相補鎖合成し引き続
いて分解し、かつ当該相補鎖合成及び分解を少なくとも
１回以上繰り返すことを特徴とする。以下に本発明の反
応原理を示す。本発明の反応原理を図１及び下記式１に
示す。

【００４６】

【化１】

【００４７】まず、検出対象となる１本鎖の核酸にハイ
ブリダイズしたオリゴヌクレオチドプライマーをもとに
ＤＮＡポリメラーゼの作用によって相補鎖の合成がスタ
ートする。このときに１分子のｄＸＴＰの付加にともな
い１分子のピロリン酸（以下ＰＰｉと省略することもあ
る）が生成する。一方、この状態で２本鎖のＤＮＡの
３’末端から分解していくヌクレアーゼを作用させる
と、伸長した部分を分解する反応が進行する。しかしオ
リゴヌクレオチドプライマーはヌクレアーゼ耐性である
ためプライマー部分は分解されないでそのまま残り、再
度ＤＮＡポリメラーゼによる伸長反応の起点となる。こ
のように繰り返し反応が起ることによって反応系にはピ
ロリン酸、あるいはヌクレアーゼの分解によって生成す
るデオキシヌクレオシドモノリン酸が蓄積していく。

【００４８】なお前述したように、前記反応時にＤＮＡ
ポリメラーゼの作用により、オリゴヌクレオチドプライ
マーをヌクレアーゼ耐性として前記工程に付することも
可能である。このピロリン酸か、又はヌクレアーゼによ
る分解によって生成するデオキシヌクレオシドモノリン
酸を検出することによって検出対象となる塩基配列の有
無を検出又は定量することが可能となる。

【００４９】更に、本発明の検出方法によって点突然変
異を検出する系を構成することが可能である。即ち、予
め点突然変異の起る部位がわかっている場合に、当該部
位の５’側に隣接する領域に相補な配列をオリゴヌクレ
オチドプライマーとして利用する。伸長する鎖の基質と
なるｄＸＴＰとして、正常な配列のときのみ伸長が起る
ように１種の基質のみ加えておけば、点突然変異がおき
ている場合には伸長できないので反応が停止する。この
ようにして点突然変異の有無を容易に確認することが可
能となる（下記式２）。

【００５０】

【化２】

【００５１】またオリゴヌクレオチドプライマーがハイ
ブリダイズすべき領域に変異が起れば、当然のことなが
らハイブリダイズの効率が低下するので反応全体が進行
しにくくなり、これにより点突然変異の有無を知ること
ができる。前記において使用するＤＮＡポリメラーゼ
は、鋳型となる１本鎖の核酸に相補鎖がハイブリダイズ
して構成された２本鎖部分を起点として５’→３’方向
に相補鎖を伸長する反応を触媒するＤＮＡポリメラーゼ
を用いる。実際には現在知られているＤＮＡポリメラー
ゼは、全て５’→３’方向へのＤＮＡ合成酵素活性を持
つ。また、ＤＮＡ合成が起こるには必ずプライマーが必
要であり、プライマーが存在しない場合やハイブリダイ
ズできない場合にはＤＮＡの合成は起こり得ない。これ
が、本発明がプライマーと鋳型鎖に依存して特異性が高
くなる理由の一つである。具体的に本発明において用い
るＤＮＡポリメラーゼとしては、ＤＮＡポリメラーゼ
Ｉ、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメント、Ｔ
４ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｈ
ｉ２９ＤＮＡポリメラーゼ等又はこれらのＤＮＡポリメ
ラーゼの変異体を挙げることができる。

【００５２】なお、ＤＮＡポリメラーゼとしてＴ４ＤＮ
ＡポリメラーゼやＴ７ＤＮＡポリメラーゼのように強力
な３’→５’エクソヌクレアーゼ活性を併せ持つものを
用いれば、別途添加するヌクレアーゼ量を節約すること
が可能であり、又は核酸に作用する酵素として１種の強
力な３’→５’エクソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡ
ポリメラーゼのみを加えることで本発明の反応系を構成
することも可能である。ただし、これらのＤＮＡポリメ
ラーゼはヌクレアーゼ耐性であるホスホロチオエート結
合もある程度分解するので、高感度を期待できない場合
もあり得る。故に、この場合はプライマーの末端付近の
ホスホジエステル結合を、複数の結合に亙って修飾する
か、あるいはホスホロチオエート化以外の修飾によって
ヌクレアーゼ耐性とすることが望ましい。

【００５３】前記において使用するヌクレアーゼは、２
本鎖のＤＮＡを３’→５’方向に分解する活性を持つヌ
クレアーゼである。このようなヌクレアーゼとしては、
エクソヌクレアーゼIII が知られている。エクソヌクレ
アーゼIII としては現在のところ大腸菌由来のものが市
販されているが、これに限定されるものではなく他の微
生物やあるいは遺伝子組み換えによって得られたもので
あっても利用することができる。エクソヌクレアーゼII
I を用いた場合には、ＤＮＡポリメラーゼとして例示し
たＤＮＡポリメラーゼＩ、そのクレノウフラグメント、
Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ等とほぼ同じ反応条件で酵素活
性を示すため、ＤＮＡポリメラーゼによる反応と平行し
て同一の反応液中で同時に反応を進行させることができ
る。エクソヌクレアーゼIII は、２本鎖ＤＮＡを３’→
５’方向に特異的に分解すること、１本鎖ＤＮＡには作
用しないので検出対象である配列やプライマーは攻撃さ
れない、ＳｄＸＴＰによりプライマーを簡単にヌクレア
ーゼ耐性にすることができる、等の特徴から本発明の反
応サイクルの循環に非常に好適な酵素である。

【００５４】ＤＮＡポリメラーゼによるオリゴヌクレオ
チドプライマーを起点とするＤＮＡの伸長反応の基質に
は、デオキシヌクレオシドトリリン酸（ｄＸＴＰ）を用
いる。そして、本発明においては予め配列の明らかな部
分について少なくとも１塩基分が伸長すれば分析が可能
となるので、少なくともこの１塩基分に対応する１種の
ヌクレオチドのみを用いることで所望の反応を進行させ
ることができる。当該基質濃度は、検出対象となる塩基
配列のモル数に対して十分量となるように添加する。一
般的には検出対象の量を正確に予測することは困難なの
で、少なくとも0.1 μM 、好ましくは１μM 以上のヌク
レオチドを添加しておけば、ほとんどの場合は基質が不
足する事態を避けることができる。

【００５５】Ｄ．本発明は、生成するピロリン酸又はデ
オキシヌクレオシドモノリン酸を検出することを特徴と
する。 生成するデオキシヌクレオシドモノリン酸の検出 本発明方法では、ヌクレアーゼによるヌクレオチド鎖の
分解反応により生成するデオキシヌクレオシドモノリン
酸（以下、ｄＸＭＰと記載する）を検出することで、即
ちＤＮＡポリメラーゼによる伸長反応によって付加した
ｄＸＴＰに対応するｄＸＭＰを検知することによって、
所望のポリヌクレオチドを検出することができる。

【００５６】基質として用いるｄＸＴＰのα位のリン原
子を放射性同位元素（³²Ｐ又は³³Ｐ）で置換標識するこ
とにより；α位のリン酸の、デオキシリボースの、若し
くは塩基の水素原子を³Ｈで置換標識することにより；
又はデオキシリボースの炭素原子を¹⁴Ｃで標識すること
により、ｄＸＴＰとｄＸＭＰとをイオン交換樹脂などで
クロマト的に分離して放射活性を追跡することによって
分解産物であるｄＸＭＰの放射活性を測定することが可
能である。なお、現在α位のリン原子が³²Ｐ標識したｄ
ＸＴＰとしては、ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ及びｄ
ＴＴＰが市販されている。また、現在α位のリン原子が
³³Ｐ標識したｄＸＴＰとしては、ｄＡＴＰ及びｄＣＴＰ
が市販されている。また、塩基部分を³Ｈ標識したもの
としては、ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰ
が市販されている。

【００５７】ラジオアイソトープ標識を持つｄＸＭＰ
は、イオン交換樹脂を用いた薄層クロマトグラフィーで
分離すれば放射活性をオートラジオグラフィーによって
簡便に、かつ定性的に検出することができる。また、実
施例に示すようにこの放射活性を有するスポットを削り
取ってシンチレーションカウンターで計数すれば、定量
的な分析も可能である。更に必ずしもアイソトープで標
識した基質を用いなくとも次のような操作によればｄＸ
ＭＰの分離、測定が可能である。即ち、反応液を市販の
蛍光色素を塗布した薄層クロマトグラフィーによって分
離し、これに紫外線を照射すればヌクレオチドが紫外線
を吸収するため、非蛍光スポットとしてｄＸＭＰを視認
することができる。また、液体クロマトグラフィーによ
って分離し紫外線吸収を計測すればｄＸＭＰを定量的に
検出することができる。

【００５８】ＤＮＡポリメラーゼによる鎖伸長反応に
より生ずるピロリン酸の定量 本発明方法では、ＤＮＡポリメラーゼによるｄＸＭＰの
付加にともなうＰＰｉの生成を測定することにより、所
望のポリヌクレオチドを検出することができる。このＤ
ＮＡポリメラーゼによるｄＸＭＰの付加にともない生成
するＰＰｉを追跡する方法によれば、酵素的に測定する
ことが可能なうえ、反応液をクロマトグラフィー等で分
離する作業も省略できるため非常に簡便な方法となる。
具体的には、下記式３の反応等が知られている。当該式
３の反応（J. Immunological Methods, 156, 55-60 (19
92), T.Tabary et al.）では、高感度な測定が可能とな
るうえ、均一系で分析できるため操作も簡単である。

【００５９】

【化３】

【００６０】この他のピロリン酸の測定法としては、
「Anal. Biochem., 94, 117-120 (1979)」に引用された
方法等が知られている。

【００６１】Ｅ．具体例 以下に具体的なオリゴヌクレオチドプライマーの配列と
その配列を用いた場合の本発明による反応系を例示する
（下記式４）。

【００６２】

【化４】

【００６３】ヒトサイトメガロウイルス（以下ＣＭＶ
と省略する）の検出を例にとると、ＣＭＶゲノムＤＮＡ
中の制限酵素EcoRI 切断断片のＤフラグメントに由来
し、ＣＭＶゲノムに特異的な配列をプライマーとする。
具体的な配列は式４に示したとおりである。式４に示す
配列のどの部分を用いても良いが、以下の説明では式４
中の→←で挟まれた部分にハイブリダイズする相補鎖を
プライマーとする（配列番号１）。３’側のA-T の間の
ホスホジエステル結合をホスホロチオエート結合とす
る。ＰＰｉ又は分解産物であるｄＡＭＰを測定すること
により、ＣＭＶ配列が検体中に存在するか否かを知るこ
とができる。

【００６４】特に１塩基の伸長〜分解を１サイクルと
して繰り返す、本発明の好ましい方法では、先に述べた
ように点突然変異の検出に応用することができる。以下
に点突然変異の検出例としてヒト癌遺伝子Ｋｉ−ｒａｓ
／１２の検出系を示す。Ｋｉ−ｒａｓ／１２には、下記
式５に示されるような変異体が知られている（下記式５
中でドットで示したのは異常の生じていない正常な配列
部分である）。

【００６５】

【化５】

【００６６】プライマーとしては式５中に示した部分の
配列（配列番号２）を用いる。なお３’側のT-G 間をホ
スホロチオエート結合としヌクレアーゼ耐性としてお
き、ＤＮＡポリメラーゼによる合成用の基質としてはｄ
ＧＴＰのみを加えておく。この例では、検出対象が正常
であればｄＧＴＰを取りこむ反応が進行し、ＰＰｉとｄ
ＧＭＰが蓄積される。しかし、検出対象が変異体である
場合には、相補鎖の合成に必要なｄＴＴＰがないため反
応が進行しない。逆にｄＴＴＰのみを基質に加えた時に
反応が進行すれば、検出対象となった配列には点突然変
異が含まれていることがわかる。本発明ではこのように
して点突然変異を検出することが可能である（下記式６
参照）。

【００６７】

【化６】

【００６８】なお、式５及び式６ではプライマーが上段
に、鋳型配列が下段に表示されており、前記式１、２及
び４（鋳型配列が上段で、プライマーが下段）とは表示
が異なっている。

【００６９】Ｆ．本発明ポリヌクレオチド検出用キット 以上のような本発明に必要な各種成分は、予め組み合せ
た試薬の形で供給することができる。あらためて本発明
による塩基配列検出用試薬の構成を次に示す。以下に示
す試薬には、更に標識の検出に必要な資材や反応液を構
成する緩衝剤、あるいは陰性や陽性の対照等の任意の成
分を組み合せてキットの形とすることもできる。

【００７０】本発明ポリヌクレオチド検出用キットの構
成は以下のごとくである。 １．検出対象のその塩基配列が既知であるポリヌクレオ
チドの一部と相補的な配列を有しかつヌクレアーゼ耐性
を有するオリゴヌクレオチドプライマー、 ２．ＤＮＡポリメラーゼ、 ３．少なくとも１種のデオキシヌクレオシドトリリン
酸、 ４．３’→５’方向に２本鎖ＤＮＡを分解する活性を有
するヌクレアーゼ。

【００７１】以上１〜４を含むキットに、前記のポリヌ
クレオチドの検出の指標に応じて、検出用試薬を含ませ
ることができる。即ち、ｄＸＭＰの検出を企図する場合
には、デオキシヌクレオシドモノリン酸検出用試薬を含
有させることができる。かかる検出用キットの具体例と
しては、例えば以下に挙げる検出用キットを挙げること
ができる。

【００７２】即ち、反応用試薬として、ホスホロチオエ
ート化オリゴヌクレオチド、ＤＮＡポリメラーゼＩ ク
レノウフラグメント、デオキシヌクレオシドトリリン酸
（³²Ｐ標識）、エクソヌクレアーゼIII 、Ｔｒｉｓ／Ｈ
Ｃｌ緩衝液、ＭｇＣｌ₂ 、ＢＳＡ及びＤＴＴを含み；反
応停止液としてＥＤＴＡを含み；ｄＸＭＰ検出用試薬と
して、薄層クロマトグラフィー用イオン交換セルロース
（ＰＥＩ＝ポリエチレンイミンセルロース）及びＬｉＣ
ｌ（展開溶媒）、又はピロリン酸検出用試薬として、Ａ
ＴＰスルフィラーゼ、アデノシン−５’−ホスホサルフ
ェート、ルシフェリン及びルシフェラーゼを含む検出用
キットを挙げることができる。

【００７３】以下に、本発明の作用機序と実際上の効果
を集約して記載する。本発明におけるオリゴヌクレオチ
ドプライマーは、検出対象となる塩基配列に特異的にハ
イブリダイズしＤＮＡポリメラーゼによる伸長反応の起
点となる。また予めヌクレアーゼ耐性としておくか、あ
るいはＤＮＡポリメラーゼの作用でデオキシヌクレオチ
ド誘導体（ＳｄＸＴＰ等）を付加してヌクレアーゼ耐性
とすることによって、以下に続くＤＮＡポリメラーゼの
作用によるデオキシヌクレオシドトリリン酸（ｄＸＴ
Ｐ）の付加〜ヌクレアーゼの作用による分解という２つ
の反応を繰り返し起こすことを可能とする。この反応が
繰り返し直線的に起きるので、本発明においてはヌクレ
アーゼ分解産物が反応系に蓄積し、定量的でしかも高感
度な検出系が実現できる。

【００７４】そして、プライマーがミスマッチにより非
特異的な配列にハイブリダイズしたとしても、それに隣
接する領域の相補鎖を合成していく工程において予め基
質として用意したｄＸＴＰが適合していなければ以降の
反応が進まず誤った結果は生じないという利点を有す
る。また、本発明では高温処理によるＤＮＡの変性操作
を繰り返す必要がないのでＤＮＡポリメラーゼをはじめ
とする試薬成分には熱安定性が要求されず、しかも複雑
な温度制御を必要としない。そのため、操作を自動化す
ることが容易であるという利点をも有する。

【００７５】本発明におけるＤＮＡポリメラーゼは、前
記プライマーがハイブリダイズした領域に隣接する配列
に対して相補な鎖を合成するものである。合成時には、
１モルのｄＸＴＰの付加反応について１モルのＰＰｉを
生成する。ＰＰｉは酵素反応により特異的に測定するこ
とができるので、本発明においては合成反応によって同
時に信号を生成するシステムとなっている。また、別の
実施態様においては、この反応で伸長した部分がヌクレ
アーゼによって分解された産物を検出対象とすることが
できる。ＤＮＡポリメラーゼは、オリゴヌクレオチドプ
ライマーとしてヌクレアーゼ耐性でないものを利用する
ときにデオキシヌクレオチド誘導体を基質とすることに
よってこれをヌクレアーゼ耐性に変換する作用を持つ。

【００７６】本発明におけるヌクレアーゼは、検出対象
となる配列とハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドプ
ライマーを起点として伸長した部分を前記ヌクレアーゼ
耐性部位まで特異的に加水分解する作用を持つ。標的配
列が存在しない時にはこの分解は起こらず、またたとえ
標的配列が存在していてもオリゴヌクレオチドプライマ
ーのハイブリダイズとＤＮＡポリメラーゼによる伸長反
応が起きない限り加水分解されることはない。ヌクレア
ーゼのこのような特性により本発明において反応液中に
蓄積する分解産物は、検出対象に対して特異的に、そし
て直線的に増加し、定量性の高い分析が可能となる。

【００７７】また、本発明の利点の一つとして、コンタ
ミネーションの影響を受け難いことが挙げられる。即
ち、たとえ反応後のサンプルがこれから反応させようと
する溶液中に誤って混入しても、蓄積した分解産物その
ものは新たな鋳型としては機能しないのでこれをもとに
反応が進行することがなく実用上大変有利である。

【００７８】更に、本発明の固有の効果として、均一系
で簡便な操作を提供できる点が挙げられる。ＤＮＡポリ
メラーゼによるｄＸＴＰの付加にともない生成するＰＰ
ｉを追跡する方法を採用すれば、付加的なプローブとの
ハイブリダイズや電気泳動による分離等の操作を全く必
要としない反応系を提供できる。ＰＰｉは純粋に酵素的
な反応によって特異的に測定することができるので、合
成と分解反応を行った反応液中でそのまま連続して反応
を継続することが可能となり非常に実用的である。本発
明のこのような利点は、ＰＣＲ法による増幅産物を検出
するためにはプローブとのハイブリダイズや電気泳動に
よる分離が要求されることと比べるとより明瞭である。

【００７９】その他、反応の第一段階で検出対象配列に
ハイブリダイズしたプライマーをそのまま継続して反応
に利用するメリットとして、プライマーを比較的少量し
か用意しなくてもよいことが挙げられる。ＰＣＲのよう
に増幅産物によってプライマーが消費される系では大過
剰のプライマーを用意しなければならないが、本発明で
は検出対象配列のモル数に対してわずかに過剰のプライ
マーを用意すれば十分である。そして、同様のことは基
質となるデオキシヌクレオシドトリリン酸についてもい
える。即ち、例えばＰＣＲでは伸長する領域に必要な基
質を全て用意しなければならない。本発明では、ハイブ
リダイズした領域に隣接する配列に相補な塩基を少なく
とも１種類だけ用意すればよいので試薬構成を単純化で
きるという利点を有する。

【００８０】本発明の付随的な効果として点突然変異の
検出に応用可能なことを挙げることができる。即ち、予
め点突然変異を起こす部位が判明している時には、この
部分に隣接する領域をプライマーとして選び点突然変異
の起った時には反応が進行しないように反応系を設定す
ることにより点突然変異の有無を確認することが可能で
ある。以上のように本発明によるポリヌクレオチドの検
出方法は種々の利点を有するものであり、遺伝子の分析
において有効な方法となることが期待できる。

【００８１】

【実施例】以下、実施例に基づいて本発明を更に詳細に
説明する。しかしながら、本実施例により本発明の技術
的範囲が限定されて解釈されるものではない。 〔実施例〕 ＨＢＶ・ＤＮＡのＨＢＶ−ｅ抗原遺伝子の
検出 ＨＢＶ・ＤＮＡのＨＢＶ−ｅ抗原遺伝子の検出を試み
た。ヌクレアーゼには大腸菌由来のエクソヌクレアーゼ
III （寶酒造製）を、またプライマーＤＮＡには配列番
号３に示す塩基配列を持つオリゴヌクレオチドを化学合
成して用いた。

【００８２】(1)-1 プライマーＤＮＡの調製 前記配列（配列番号３）のオリゴヌクレオチドは、β−
シアノエチルアミダイト法（J.Am.Chem.Soc., 112, 125
3-1254 (1990))に従って合成した。Ｓ化試薬として、3H
-1,2-benzodithiole-3-one 1,1-dioxide(Beaucage's Re
agent)を用い、３’末端側のT-C 間をホスホロチオエー
ト結合としてヌクレアーゼ耐性プライマーＤＮＡを得
た。ＤＮＡ合成機としてＣｙｃｌｏｎｅ（登録商標）Ｐ
ｌｕｓ ＤＮＡ／ＲＮＡシンセサイザー（日本ミリポア
リミテッド）を用いた。合成したホスホロチオエート化
オリゴヌクレオチドは、常法に従いＨＰＬＣで精製して
使用した。

【００８３】(1)-2 塩基配列の検出 プライマーＤＮＡを、標的配列となるＨＢＶ・ＤＮＡを
一部にもつM13 ファージＤＮＡと混合し、実際に本発明
による反応を行わせた。具体的な反応液の組成は下に示
す通りであった。なお、下に示した数値はいずれも最終
濃度である。反応が実際に進行しているのかどうかを確
認するために、各成分を除いた反応系を設けて結果を比
較した。またヌクレアーゼ耐性プライマーの必要性を確
認するため同じ配列を持つがヌクレアーゼ耐性を持たな
いプライマーについても実験を行った。本実施例で用い
たプライマーをハイブリダイズさせた場合、３’側に隣
接する配列はＧであり、従ってその相補鎖の合成にはｄ
ＣＴＰが必要である。そしてこのｄＣＴＰのヌクレアー
ゼ分解産物は、ｄＣＭＰとなる。

【００８４】＜反応液の組成＞ 第１反応（５μl ） 10fmol 標的配列（Ｍ13ファージＤＮＡ上にＨＢＶ−ｅ
抗原遺伝子領域を持つ１本鎖ＤＮＡ） １pmol プライマーＤＮＡ 50mM Tris/HCl（ｐＨ7.5 ） 10mM MgCl₂ 第２反応（10μl ） １unit ＤＮＡポリメラーゼＩクレノウフラグメン
ト ５units エクソヌクレアーゼIII 10μM ｄＣＴＰ（³²P 標識、５×10⁴cpm） 50μg/ml 牛血清アルブミン（以下ＢＳＡと略す） 10mM ジチオスレイトール

【００８５】第１反応では反応液（５μl ）を100 ℃で
５分間加熱してＤＮＡを１本鎖とした後、65℃で10分間
置いてプライマーＤＮＡをハイブリダイズさせた。次い
で第２反応に必要な成分を含む試薬液を加えて更に37℃
で反応させた。１時間反応させた後、20mMのEDTAを１μ
l 加えて反応を停止した。反応を停止した反応液の全量
を薄層クロマトグラフィー（薄層：ＰＥＩ−Cellulose
Ｆ（メルク（Merck)社製），展開溶媒：0.4M LiCl によ
り室温で40分間展開）により分離し、ヌクレアーゼ分解
産物であるｄＣＭＰをオートラジオグラフィーによって
確認した。

【００８６】図２から明らかなように、検出対象となる
配列、クレノウフラグメント、エクソヌクレアーゼIII
のいずれを欠いてもヌクレアーゼ分解産物であるｄＣＭ
Ｐは検出されず（レーン２−４）、本発明の反応が特異
的に進行していることが確認された（レーン１）。な
お、レーン１は検出対象配列＋全ての試薬成分について
の系であり、レーン２は試薬成分のみの系であり、レー
ン３は試薬成分中クレノウフラグメントを除く系であ
り、レーン４は試薬成分中、エクソヌクレアーゼIII を
除く系である。

【００８７】またプライマーとしてヌクレアーゼ耐性を
持たないものを用いた場合には、他の成分を満足する反
応系であってもヌクレアーゼ分解産物としてｄＣＭＰが
蓄積しないことを確認した（図３：レーン１はヌクレア
ーゼ耐性プライマーを利用、レーン２は修飾を施してい
ないプライマー、即ちヌクレアーゼ感受性のプライマー
を利用）。これは、ヌクレアーゼによりプライマーの
３’側領域（即ち、ｄＣＴＰの付加部位）が分解される
ためにｄＣＴＰが付加できなくなることが原因と考えら
れる。

【００８８】(2)鋳型特異性 プライマーが検出対象配列と相補性を持つ場合にのみ、
ヌクレアーゼによる基質の分解が起きることを確認する
ため次のような実験を行った。即ち、検出対象配列とし
てプライマーと全く相補性を持たない配列を用いる場
合、及び検出対象配列の存在しない場合という２つの条
件について、前記(1) と同じ操作により実際に反応を行
った。

【００８９】その結果、図４（レーン１：検出対象配列
がプライマー配列と相補、レーン２：検出対象配列がプ
ライマー配列と同じセンス配列、即ち相補でない、レー
ン３：検出対象配列を含まない）に示すように検出対象
配列とプライマーＤＮＡが相補的であれば分解産物であ
るｄＣＭＰが蓄積する（レーン１）が、センス配列、即
ちプライマーと同じ配列であり相補的でない場合（レー
ン２）、及び検出対象配列が存在しない場合（レーン
３）には分解産物は蓄積しないことが確認された。この
実験により、本発明の反応は検出対象配列がプライマー
と相補的な配列を持つ時に進行することが立証された。

【００９０】(3)基質（デオキシヌクレオシドトリリン
酸）特異性 基質であるデオキシヌクレオシドトリリン酸がプライマ
ーに取り込まれるｄＣＴＰの時にのみヌクレアーゼによ
る分解が起ることを確認するために、前記(1)における
基質をｄＧＴＰに置き換えて反応させた。その結果、図
５（レーン１：基質としてｄＣＴＰを利用、レーン２：
基質としてｄＧＴＰを利用、レーン３：マーカーとして
ｄＣＭＰとｄＣＴＰを展開、レーン４：マーカーとして
ｄＧＭＰとｄＧＴＰを展開）に示すとおり基質がｄＣＴ
Ｐの時にのみ反応が進行し分解産物であるｄＣＭＰが確
認され（レーン１）、ｄＧＴＰを加えた時には反応が進
行しない（分解産物は生成しない、レーン２）ことを確
認した。そして、この結果から本発明による検出方法が
点突然変異の検出に利用できることが明らかになった。

【００９１】(4)本発明の検出感度 前記(1) と同じ操作で検出対象となるＤＮＡ量を０〜１
pmolに変化させて本発明による検出方法の感度を確認し
た（表１参照）。図６（レーン１：検出対象配列を含む
ＤＮＡを１pmol添加し反応させた、レーン２：検出対象
配列を含むＤＮＡを0.1pmol 添加し反応させた、レーン
３：検出対象配列を含むＤＮＡを0.01pmol添加し反応さ
せた、レーン４：検出対象配列を含むＤＮＡを１fmol添
加し反応させた、レーン５：検出対象配列を含むＤＮＡ
を0.1fmol 添加し反応させた、レーン６：検出対象配列
を含むＤＮＡを0.01fmol添加し反応させた、レーン７：
検出対象配列を含むＤＮＡを１amol添加して反応させ
た、レーン８：検出対象配列を含むＤＮＡを添加せず、
反応させた）に示すように、１fmol（レーン４）のＤＮ
Ａを検出可能なことが確認された。この結果により、本
発明による検出方法の感度は極めて高いことが判明し
た。また本発明による塩基配列検出方法の定量性を確認
するため、各バンドを切り出して液体シンチレーション
カウンターにより放射活性を測定した。結果を表１に示
す。表１において、（Ａ）及び（Ｂ）の値は、各スポッ
トの放射活性（ＣＰＭ）を示す。0.1fmol 〜0.01pmolの
範囲で定量性を確保できることが確認された。

【００９２】なお本実施例では、³²Ｐ標識したｄＣＴＰ
の使用量をオートラジオグラフィーのスポットの大きさ
に差が生じやすい範囲に非標識のｄＣＴＰで予め希釈調
整している。従って、ｄＣＴＰに占める標識物の割合を
高くすれば、更に高感度を実現することが可能である。

【００９３】

【表１】 表１ 本発明検出方法の検出感度の検討 ──────────────────────────────────── 検出対象 (A) (B) A-B/Total dCMP 蓄積率 ＤＮＡ量 dCTP dCMP (%) (pmol) (dCMP/Target DNA) ──────────────────────────────────── 1pmol 6566 17883 70.9 70.9 70.9 0.1 8805 25204 72.5 72.5 725 0.01 18381 15212 43.7 43.7 4370 1fmol 32552 1808 3.67 3.67 3670 0.1 31550 681 0.42 0.42 4200 none 35997 547 - - ────────────────────────────────────

【００９４】(5) Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼによる本発
明の検出方法 前記(1) におけるクレノウフラグメントに代えてＴ４Ｄ
ＮＡポリメラーゼを用い、本発明による塩基配列の検出
方法を試みた。Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼは、先に述べた
とおり３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を合わせ持つ
酵素であるため、ヌクレアーゼ活性を持つ酵素として別
の酵素を加えなくても反応系を構成することが可能であ
る。

【００９５】Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼを４units 用い、
反応系を下に示す組成とした。他は前記(1) と同じ条件
に基づいて反応を行った。結果は図７（レーン１：クレ
ノウフラグメント＋エクソヌクレアーゼのみで検出対象
配列を含まない、レーン２：クレノウフラグメント＋エ
クソヌクレアーゼ＋検出対象配列、レーン３：Ｔ４ＤＮ
Ａポリメラーゼのみ、レーン４：Ｔ４ＤＮＡポリメラー
ゼ＋検出対象配列）に示すとおりである。対照として示
した前記(1) の結果に比べるとスポットは小さいが、ヌ
クレアーゼ分解産物であるｄＣＭＰの生成が確認され
た。このようにＴ４ＤＮＡポリメラーゼを用いればヌク
レアーゼ活性を持つ酵素として別の物質を加えなくても
本発明による反応が進行することが判明した。

【００９６】＜反応液の組成＞ 第一反応（５μl ） 10fmol 標的配列 １pmol プライマーＤＮＡ 67mM Tris/ HCl (pH8.8) 6.7mM MgCl₂ 16.7mM (NH₄)₂SO₄ 6.7mM EDTA 第二反応（１０μl ） 10mM β- メルカプトエタノール 10μM ｄＣＴＰ (³²P 標識、5 x 10⁴cpm) 50μg/ml ＢＳＡ ４ units Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ（寶酒造製）

【００９７】

【発明の効果】本発明によれば、遺伝的疾患や感染症の
診断に有効な試料中に存在する特定の塩基配列を含むポ
リヌクレオチドの検出方法及び当該検出方法に使用する
ポリヌクレオチド検出用キットが提供される。

【００９８】

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：25 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 起源 生物名：サイトメガロウィルス（ＣＭＶ） 配列 CCCCGAAATG GGACCCAGTA CGGAT

【００９９】配列番号：２ 配列の長さ：24 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 起源 生物名：ヒト癌遺伝子Ｋｉ−ｒａｓ／１２ 配列 ATAAACTTGT GGTAGTTGGA GCTG 24

【０１００】配列番号：３ 配列の長さ：25 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 起源 生物名：ＨＢＶ・ＤＮＡのＨＢＶ−ｅ抗原遺伝子 配列 AATGCCCCTA TCTTATCAAC ACTTC 25

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の反応原理を示す模式図である。

【図２】本発明によるＨＢＶ−ｅ抗原遺伝子の検出方法
によって得られたオートラジオグラフィ−の結果を示す
図である。

【図３】本発明による反応系におけるヌクレアーゼ耐性
プライマーの必要性について調査したオートラジオグラ
フィーの結果を示す図である。

【図４】プライマーの配列と検出対象のポリヌクレオチ
ドの塩基配列の相補性とヌクレアーゼ分解産物の関係を
調査したオートラジオグラフィーの結果を示す図であ
る。

【図５】基質とヌクレアーゼ分解産物の関係を調査した
オートラジオグラフィーの結果を示す図である。

【図６】標的ポリヌクレオチドの濃度を変化させて感度
を調査したオートラジオグラフィーの結果を示す図であ
る。

【図７】Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼを用いた場合について
調査したオートラジオグラフィーの結果を示す図であ
る。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 特開 平６−327499（ＪＰ，Ａ) 特開 昭59−208465（ＪＰ，Ａ) 国際公開93／21340（ＷＯ，Ａ１) ＡＮＡＬＹＴＩＣＡＬ ＢＩＯＣＨＥ ＭＩＳＴＲＹ，1988，Ｖｏｌ．174，ｐ. 423−436 ＡＮＡＬＹＴＩＣＡＬ ＢＩＯＣＨＥ ＭＩＳＴＲＹ，1993，Ｖｏｌ．208，ｐ. 171−175 (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12Q 1/68 ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (11)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 検出対象のその塩基配列が既知であるポ
   リヌクレオチドに、当該ポリヌクレオチドの一部と相補
   的な配列を有しかつヌクレアーゼ耐性を有するオリゴヌ
   クレオチドプライマーをハイブリダイズさせ、次いでこ
   れに少なくとも１種のデオキシヌクレオシドトリリン
   酸、ＤＮＡポリメラーゼ及びヌクレアーゼを加えて、前
   記プライマーの３’末端に隣接しかつ前記ポリヌクレオ
   チドと相補的である塩基種を相補鎖合成し引き続いて分
   解し、かつ当該相補鎖合成及び分解を少なくとも１回以
   上繰り返して、生成するピロリン酸又はデオキシヌクレ
   オシドモノリン酸を検出することを特徴とする、前記ポ
   リヌクレオチドの検出方法。
2. 【請求項２】 オリゴヌクレオチドプライマーが、当該
   オリゴヌクレオチドプライマーの３’末端でホスホロチ
   オエート化されたものであることを特徴とする請求項１
   記載のポリヌクレオチドの検出方法。
3. 【請求項３】 ＤＮＡポリメラーゼが、ＤＮＡポリメラ
   ーゼＩ、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメン
   ト、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼ
   及びＰｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼからなる群から選ば
   れるＤＮＡポリメラーゼであることを特徴とする請求項
   １又は２記載のポリヌクレオチドの検出方法。
4. 【請求項４】 ヌクレアーゼがエクソヌクレアーゼIII
   であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に
   記載のポリヌクレオチドの検出方法。
5. 【請求項５】 デオキシヌクレオシドトリリン酸のβ位
   及びγ位のリン酸分子以外の分子又は原子が、放射性同
   位元素で置換標識されており、かつヌクレアーゼによる
   反応により生成するデオキシヌクレオシドモノリン酸を
   検出することを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項
   に記載のポリヌクレオチドの検出方法。
6. 【請求項６】 ヌクレアーゼによる反応により生成する
   デオキシヌクレオシドモノリン酸をクロマトグラフィー
   によって分離し当該デオキシヌクレオシドモノリン酸を
   光学的に測定することを特徴とする請求項１〜５のいず
   れか１項に記載のポリヌクレオチドの検出方法。
7. 【請求項７】 請求項１〜４のいずれか１項に記載のポ
   リヌクレオチドの検出方法において、ＤＮＡポリメラー
   ゼによる相補鎖合成により生成するピロリン酸を、アデ
   ノシン−５’−ホスホサルフェート及びアデノシントリ
   リン酸スルフリラーゼと反応させてアデノシントリリン
   酸を生成させ、当該アデノシントリリン酸を検出するこ
   とを特徴とするポリヌクレオチドの検出方法。
8. 【請求項８】 アデノシントリリン酸をルシフェリン−
   ルシフェラーゼ反応によって測定することを特徴とする
   請求項７記載のポリヌクレオチドの検出方法。
9. 【請求項９】 以下の１〜４の成分： １．検出対象のその塩基配列が既知であるポリヌクレオ
   チドの一部と相補的な配列を有しかつヌクレアーゼ耐性
   を有するオリゴヌクレオチドプライマー、 ２．ＤＮＡポリメラーゼ、 ３．少なくとも１種のデオキシヌクレオシドトリリン
   酸、及び ４．３’→５’方向に２本鎖ＤＮＡを分解する活性を有
   するヌクレアーゼ。 を含む請求項１〜８のいずれか１項に記載のポリヌクレ
   オチドの検出方法に使用するポリヌクレオチド検出用キ
   ット。
10. 【請求項１０】 請求項９記載のポリヌクレオチド検出
    用キットにおいて、当該検出用キットに、デオキシヌク
    レオシドモノリン酸検出用試薬を含有させたことを特徴
    とするポリヌクレオチド検出用キット。
11. 【請求項１１】 請求項９記載のポリヌクレオチド検出
    用キットにおいて、当該検出用キットに、ピロリン酸検
    出用試薬を含有させたことを特徴とするポリヌクレオチ
    ド検出用キット。