JP3175110B2 - リガーゼ／ポリメラーゼ媒体された単一ヌクレオチド多型のジェネティックビットアナリシスおよび遺伝子解析におけるその使用 - Google Patents

リガーゼ／ポリメラーゼ媒体された単一ヌクレオチド多型のジェネティックビットアナリシスおよび遺伝子解析におけるその使用

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Description

【発明の詳細な説明】 発明の技術分野 本発明は、組換えDNA技術の分野に関する。さらに詳
しくは、本発明は、動物のゲノムの特定の部位、たとえ
ば単一ヌクレオチド多型部位（single nucleotide poly
morphic site）などに存在するヌクレオチドの同一性を
決定するためのリガーゼ／ポリメラーゼ媒体された方法
に関する。本発明はさらに、同一性、祖先または遺伝的
体質を分析するための該決定法の使用に関する。
発明の背景 I.多型部位に存在するヌクレオチドの決定 ウイルス、細菌、植物および動物は、自然にその継続
的な進化の過程で自然突然変異を起こす（グセラ（Guse
lla,J.F.）、Ann.Rev.Biochem.55:831〜854（198
6））。かかる変異は種の成員のすべてに直ちに伝達さ
れるわけではないので、進化の過程によって種の集団中
に共存する多型対立遺伝子が生成される。ある場合に
は、かかる共存は安定なまたは準安定な平衡にある。他
の場合には、該変異は種に生存上または進化上の利点を
与え、それゆえ最終的に（すなわち、進化学的時間をか
けて）該種の各成員のDNA中に取り込まれる。
幾つかのクラスの多型が同定されている。たとえば、
可変ヌクレオチドタイプ多型（variable nucleotide ty
pe polymorphism;「VNTR」）は、ヌクレオチドのジヌク
レオチドまたはトリヌクレオチド繰り返しモチーフの自
発タンデム重複（spontaneous tandem duplications）
により起こる（ウエバー（Weber,J.L.）、米国特許第5.
075,217号；アーマー（Armour,J.A.L.）ら、FEBS Lett.
307:113〜115（1992）；ジョーンズ（Jones,L.）ら、Eu
r.J.Haematol.39:144〜147（1987）；ホーン（Horn,G.
T.）ら、PCT出願第WO91/14003号；ジェフリーズ（Jeffr
eys,A.J.）、ヨーロッパ特許出願第370,719号；ジェフ
リーズ、米国特許第5,175,082号；ジェフリーズら、Ame
r.J.Hum.Genet.39:11〜24（1986）；ジェフリーズら、N
ature 316:76〜79（1985）；グレイ（Gray,I.C.）ら、P
roc.R.Acad.Soc.Lond.243:241〜253（1991）；ムア（Mo
ore,S.S.）ら、Genomics 10;654〜660（1991）；シェフ
リーズら、Anim.Genet.18:1〜15（1987）；ヒレル（Hil
lel,J.）ら、Anim.Genet.20:145〜155（1989）；ヒレル
ら、Genet.124:783〜789（1990））。かかる変異が制限
エンドヌクレアーゼ開裂により生成する断片長を変化さ
せるならば、かかる変異は制限断片長多型（「RFLP」）
と呼ばれる。RFLPは、ヒトおよび動物の遺伝子解析に広
く用いられている（グラスバーグ（Glassberg,J.）、英
国特許出願第2135774号；スコルニク（Skolnick,M.H.）
ら、Cytogen.Cell Genet.32:58〜67（1982）；ボトシュ
タイン（Botstein,D.）ら、Ann.J.Hum.Genet.32:314〜3
31（1980）；フィッシャー（Fischer,S.G.）ら、PCT出
願第WO90/13668号；ウーレン（Uhlen,M.）、PCT出願第W
O90/11369号）。
殆どの多型は、最初に存在した遺伝子配列から単一の
ヌクレオチドのみが置換することにより起こる。稀な場
合には、そのような置換が特定の制限部位の生成または
破壊を引き起こすことがあり、かくしてRFLP多型が構成
される。しかしながら、多くの場合は、そのような単一
のヌクレオチド多型におけるヌクレオチドの置換は制限
断片分析によっては決定することができない。ある場合
には、そのような多型は遺伝子疾患において決定的な特
性となる変異を構成する。実際、そのような変異は、疾
患（すなわち、血友病、鎌型赤血球貧血）を実際に引き
起こすに充分な仕方でタンパク質をコードする遺伝子中
の単一のヌクレオチドに影響を及ぼす。現代遺伝学にお
いてそのような多型が中心的な重要性を担うにもかかわ
らず、多くのそのような多型において２人の個体の対立
遺伝子を平行して比較することを可能にする方法は殆ど
開発されていない。
II.本発明の単一ヌクレオチド多型の属性および遺伝子
解析におけるその使用の利点 「多型」は、種の幾つかの成員のDNA配列における変
異である。それゆえ、多型は、多型の存在のために種の
幾つかの成員では変異しない配列（すなわち、もともと
の「対立遺伝子」）を有し、一方、他の成員は変異した
配列（すなわち、変異「対立遺伝子」）を有するので
「対立遺伝子的（allelic）」であるといわれる。最も
単純な場合では、わずかに一つの変異した配列のみが存
在し、この多型は２対立遺伝子的（diallelic）である
といわれる。２対立遺伝子的な二倍体生物の場合は３つ
の遺伝子型が可能である。これら遺伝子型は、一つの対
立遺伝子に関してはホモ接合性であり、他の対立遺伝子
に関してはホモ接合性であるかまたはヘテロ接合性であ
る。２対立遺伝子的な一倍体生物の場合は、これら遺伝
子型は一つの対立遺伝子または他方の対立遺伝子のいず
れかであり、それゆえ２つの遺伝子型のみが可能であ
る。２対立遺伝子的な多型が本発明の好ましい多型であ
る。他の変異が起こると３対立遺伝子などの多型を引き
起こし得る。対立遺伝子は、変異を含むヌクレオチドに
より言及することができる。本発明は、特定のクラスの
対立遺伝子的多型、および植物または動物の遺伝子型決
定におけるその使用に関する。そのような対立遺伝子的
多型は、本明細書では「単一ヌクレオチド多型（single
nucleotide polymorphisms）」または「SNP」という。
「単一ヌクレオチド多型」は、その特徴的な属性によっ
て定義される。そのような多型の主要な属性は、最も好
ましくは単一のヌクレオチドによって占められる多型部
位「Ｘ」を有することであり、この多型部位は多型の変
異の部位である（ゴレット（Goelet,P.）およびクナッ
プ（Knapp,M.）、米国特許出願第08/145,145号（参照の
ため本明細書に引用する））。
SNPやRFLPやVNTRに比べて幾つかの顕著な利点を有す
る。まず、SNPは他のクラスの多型に比べて安定であ
る。その自然突然変異率は約10-9であり（コーンバーグ
（Kornberg,A.）、DNA Replication、フリーマン（W.H.
Freeman ＆ Co.）、サンフランシスコ、1980）、VNTRよ
りも約1,000倍頻度が低い。有意に、VNTRタイプの多型
は高い突然変異率を特徴とする。
第二に、SNPはRFLPやVNTRに比べて高い頻度および高
い均一性で起こる。VNTRおよびRFLPの特性は多型を検出
するのに使用した方法に大きく依存する。対照的に、SN
Pは配列変異により生じるので、新たな多型はランダム
なゲノム分子またはcDNA分子をシークエンシングするこ
とによって同定することができる。VNTRおよびRFLPまた
はSNPの部分集合と考えることもできる。なぜなら、VNT
RまたはRFLPの領域における変異は該領域における単一
塩基の変化となり得るからである。SNPはまた、欠失、
点変異および挿入によっても起こる。いかなるものが引
き起こすものであれ、あらゆる単一塩基変化はSNPとな
り得る。SNPの頻度が高いことは、それが他のクラスの
多型に比べて一層容易に同定し得ることを意味する。SN
Pの分布の均一性が大きいことは、所望の特定の体質に
「一層近い」SNPを同定することを可能にする。これら
２つの属性が組合わさって得られる効果は、SNPを極め
て価値の高いものにする。たとえば、特定の体質（たと
えば、癌の素質）が特定の遺伝子座での変異を反映して
いるならば、該特定の遺伝子座と連係した多型を用い、
ある個体が該体質を示すであろう蓋然性を予測すること
ができる。
SNPは種々の方法のいずれを用いても特徴付けること
ができる。そのような方法としては、該部位の直接また
は間接シークエンシング、該部位の各対立遺伝子が制限
部位を生成もしくは破壊する場合の制限酵素の使用、対
立遺伝子特異的なハイブリダイゼーションプローブの使
用、該多型の異なる対立遺伝子によってコードされるタ
ンパク質に特異的な抗体の使用、または他の生化学的な
解釈によるものが挙げられる。しかしながら、正確さが
優れ、なおかつ実施するのが容易なアッセイは未だ存在
しない。
III.多型部位の分析法 A.DNAシークエンシング 多型を特徴付ける最も明白な方法は、該多型の両側に
ある遺伝子座および該多型を含む遺伝子座を直接DNAシ
ークエンシングすることを伴う。かかる分析は、「サン
ガー法」としても知られる「ジデオキシにより媒体され
たチェインターミネーション法（dideoxy−mediated ch
ain termination method）」（サンガー（Sanger,F.）
ら、J.Molec.Biol.94:441（1975））かまたは「マクサ
ム−ギルバート法」としても知られる「化学的分解法」
（マクサム（Maxam.A.M.）ら、Proc.Natl.Acad.Sci.（U
SA）74:560（1977））のいずれかを用いて行うことがで
きる。複製連鎖反応（ムリス（Mullis,K.）ら、Cold Sp
ring Harbor Symp.Quant.biol.51:263〜273（1986）；
エーリヒ（Erlich,H.）ら、ヨーロッパ特許出願第50,42
4号；ヨーロッパ特許出願第84,796号、ヨーロッパ特許
出願第258,017号、ヨーロッパ特許出願第237,362号；ム
リス、ヨーロッパ特許出願第201,184号；ムリスら、米
国特許第4,683,202号；エーリヒ、米国特許第4,582,788
号；およびサイキ（Saiki,R.）ら、米国特許第4,683,19
4号）などのゲノム配列特異的な増幅技術を組み合わせ
て用いて所望のポリヌクレオチドの回収を容易にするこ
とができる。直接シークエンシング法は技術的に手間が
かかり、比較的コスト高で、スループット率も低い。そ
の結果、SNPの繰り返しおよび平行分析を簡便にする技
術が必要とされている。
B.エキソヌクレアーゼ耐性 ムンディー（Mundy,C.R.）（米国特許第4,656,127
号）は、特定の多型部位に存在するヌクレオチドの同一
性を決定するための他の方法を論じている。ムンディー
の方法では特殊なエキソヌクレアーゼ耐性ヌクレオチド
誘導体を使用する。多型部位のすぐ３′側の対立遺伝子
配列に相補的なプライマーを、特定の動物またはヒトか
ら得た標的分子にハイブリダイズさせる。標的分子上の
該多型部位が、存在する該特定のエキソヌクレアーゼ耐
性ヌクレオチド誘導体に相補的なヌクレオチドを含むな
ら、該誘導体はハイブリダイズした該プライマーの末端
にポリメラーゼによって組み込まれるであろう。かかる
組み込みによりプライマーはエキソヌクレアーゼに耐性
となり、それによって検出することが可能となる。該試
料のエキソヌクレアーゼ耐性誘導体の同一性はわかって
いるので、プライマーがエキソヌクレアーゼに耐性にな
ったという知見により、標的分子の多型部位に存在する
ヌクレオチドが該反応に用いたヌクレオチド誘導体に相
補的であったということが明らかになる。ムンディーの
方法は、大量の外来配列データを決定する必要がないと
いう点で有利である。この方法は、増幅した標的配列お
よび非修飾プライマーが破壊され、使用した特定のエキ
ソヌクレアーゼ耐性ヌクレオチドのポリメラーゼによる
組み込み率に極めて感受性であるという欠点がある。
C.マイクロシークエンシング（Microsequencing）法 最近、DNA中の多型部位をアッセイするための幾つか
のプライマーによる（primer−guided）ヌクレオチド組
み込み法が記載されている（コムハー（Komher,J.S.）
ら、Nucl.Acids Res.17:7779〜7784（1989）；ソコロフ
（Sokolov,B.P.）、Nacl.Acids Res.18:3671（1990）；
シベネン（Syvnen,A.−C.）ら、Genomics ８:684〜69
2（1990）；クップスウォミー（Kuppuswamy,M.N.）ら、
Proc.Natl.Acad.sci.（USA）88:1143〜1147（1991）；
プレザント（Prezant,T.R.）ら、Hum.Mutat.１159〜164
（1992）；ウゴゾッリ（Ugozzoli,L.）ら、GATA ９:107
〜112（1992）；ナイレン（Nyren,P.）ら、Anal.Bioc
hem.208:171〜175（1993））。これら方法は、ジェネテ
ィックビットアナリシス（Genetic BitTM Analysis）
（下記で詳細に記載する「GBMTM」）とは、多型部位の
塩基を識別するために標識デオキシヌクレオチドの組み
込みに依存する点で異なる。そのような態様において、
シグナルは組み込まれたデオキシヌクレオチドの数に比
例するので、同じヌクレオチドの操作で生じた多型から
は該操作の長さに比例するシグナルが得られる（シベネ
ンら、Amer.J.Hum.Genet.52:46〜59（1993））。そのよ
うな遺伝子座特異的な範囲のシグナルは、GBMTM法によ
って生成したシグナルの単純な３つの組の（2:0、1:1、
または0:2）クラスに比べ、特にヘテロ接合体の場合に
解釈が一層複雑である。加えて、幾つかの遺伝子座で
は、たとえ正しいジデオキシヌクレオチドが存在してい
る場合でも正しくないデオキシヌクレオチドの組み込み
が起こり得る（コムハーら、Nucl.Acids Res.17:7779〜
7784（1989））。そのようなデオキシヌクレオチドの間
違った組み込み事象は、ある種の配列の文脈においては
正しく塩基対形成されたジデオキシ基質の比較的低いKm
に匹敵する、間違って塩基対形成したデオキシ基質に対
するDNAポリメラーゼのKmによるものであるかもしれな
い（コーンバーグら、DNA Replication、第２版（199
2）、フリーマン・アンド・カンパニー（W.H.Freeman a
nd Company）、ニューヨーク；テーバー（Tabor,S.）
ら、Proc.Natl.Acad.Sci.（USA）86:4076〜4080（198
9））。この効果は、多型部位探索（interrogation）に
おけるバックグラウンドノイズの一因となる。
D.ddNTPを用いた溶液中での伸長 コーエン（Cohen,D.）らは（フランス特許第2,650,84
0号;PCT出願第WO91/02087号）、多型部位のヌクレオチ
ドの同一性を決定するための溶液ベースの方法を論じて
いる。米国特許第4,656,127号のムンディーの方法と同
様、多型部位のすぐ３′側の対立遺伝子配列に相補的な
プライマーを用いる。この方法では、標識ジデオキシヌ
クレオチド誘導体を用いて該部位のヌクレオチドの同一
性を決定するが、該誘導体は該多型部位のヌクレオチド
に相補的であるなら該プライマーの末端に組み込まれる
であろう。
コーエンの方法は、標識ジデオキシヌクレオシド三リ
ン酸を用いる溶液ベースの伸長法であるという有意の欠
点を有する。標的DNA鋳型は、通常、DNAポリメラーゼの
天然の基質であるデオキシヌクレオシド三リン酸を高濃
度で使用するPCRなどのDNA増幅反応により調製する。こ
れらモノマーは、その後の伸長反応においてジデオキシ
ヌクレオシド三リン酸と競合するであろう。それゆえ、
PCR後に組み込まれなかったdNTPからDNA鋳型を分離する
ためにさらなる精製工程が必要である。この方法は溶液
ベースの方法であるので、組み込まれなかったdNTPを除
去するのは困難であり、高容量の試験には適していな
い。
E.ddNTPを用いた固相伸長 ジェネティックビットアナリシスTMとして知られる別
法が、ゴレット（Goelet,P.）らによって記載されてい
る（PCT出願第92/15712号）。好ましい態様においてゴ
レットらの方法は、標識ターミネーターおよび多型部位
の３′側の配列に相補的なプライマーの混合物を用い
る。それゆえ、組み込まれる標識ターミネーターは、評
価しようとする標的分子の多型部位中に存在するヌクレ
オチドによって決定され、該ヌクレオチドに相補的であ
る。コーエンらの方法（フランス特許第2,650,840号;PC
T出願第WO91/02087号）とは対照的に、ゴレットらの方
法は好ましくは不均一相アッセイであり、プライマーま
たは標的分子が固相に固定化されている。それゆえ、実
施するのが容易であり、コーエンによって論じられてい
る方法よりも一層正確である。
F.オリゴヌクレオチドライゲーションアッセイ 異なる酵素法を用いる他の固相法は「オリゴヌクレオ
チドライゲーションアッセイ」（「OLA」）である（ラ
ンデグレン（Landegren,U.）ら、Science 241:1077〜10
80（1988））。OLAプロトコールでは、標的の一本鎖の
隣接配列にハイブリダイズしうるように設計された２つ
のオリゴヌクレオチドを用いる。これらオリゴヌクレオ
チドの一方はビオチン化され、他方は検出可能なように
標識されている。もしも正確な相補的配列が標的分子中
に認められたなら、これらオリゴヌクレオチドはそれぞ
れの末端が隣接するようにしてハイブリダイズし、ライ
ゲーション基質を生成するであろう。ついで、ライゲー
ションすることにより、アビジンまたは他のビオチンリ
ガンドを用いて標識オリゴヌクレオチドを回収すること
が可能になる。OLAでは点突然変異をも検出することが
できる。ニッカーソン（Nickerson,D.A.）らは、PCRとO
LAとの属性を組み合わせた核酸検出アッセイを記載して
いる（ニッカーソンら、Proc.Natl.Acad.sci.（USA）8
7:8923〜8927（1990））。この方法では、PCRは標的DNA
の対数増幅を達成するのに用いられており、該標的DNA
はついでOLAを用いて検出される。OLAのようなアッセイ
では、各dNTPについて別々のセットのオリゴヌクレオチ
ドを用い、多型の各候補dNTPを別々に調べる必要があ
る。OLAの主要な欠点は、ライゲーションがそれほど識
別力のある方法ではなく、非特異的なシグナルが有意の
問題となるということである。
IV.結論 認識されるであろうように、上記方法の殆どはプライ
マー分子の３′末端にヌクレオチド誘導体を組み込むの
にポリメラーゼを必要とする。単一のヌクレオチド多型
を識別するための一層選択的な方法を開発することが望
まれる。本発明は、多型部位に存在するヌクレオチドの
同一性を決定するためのリガーゼ／ポリメラーゼにより
媒体された方法を提供することにより、この要求を満足
させるものである。工程にリガーゼを加えるということ
は、シグナル、伸長およびライゲーションを生成するた
めに２つの事象が必要であることを意味する。このこと
は、伸長かまたはライゲーションのいずれかを単独で用
いる方法に比べて一層高い特異性および一層低い「ノイ
ズ」を可能とする。オリゴヌクレオチドライゲーション
アッセイとは異なり、本発明では伸長の識別工程はポリ
メラーゼによって媒体されるが、ポリメラーゼはその活
性においてリガーゼよりも特異性が高い。ポリメラーゼ
に基づくアッセイとは異なり、この方法は、シグナルを
固相に結合させるための第二のハイブリダイゼーション
およびライゲーション工程と組み合わせることにより、
ポリメラーゼ工程の特異性が増大している。
発明の要約 本発明は、生物（微生物、植物、非ヒト動物、または
ヒトのいずれか）の多型部位に存在するヌクレオチドの
同一性を決定するためのリガーゼ／ポリメラーゼ媒体さ
れた方法に関する。本発明はさらに、そのような情報を
遺伝子解析に使用する方法に関する。
詳細には、本発明は、標的核酸分子中の前以て選択し
た単一ヌクレオチド部位に存在するヌクレオチドの同一
性を決定する方法を提供するものであり、該方法は、工
程： （Ａ）第一オリゴヌクレオチド（リンカーかまたはプラ
イマーのいずれか）を固相支持体に固定化し、その際、
該第一オリゴヌクレオチドは該標的分子のヌクレオチド
配列に相補的なヌクレオチド配列を有し、ハイブリダイ
ズした第一オリゴヌクレオチドの一方の末端が該前以て
選択した部位にすぐに隣接するように、該標的分子の第
一の領域にハイブリダイズすることができ、 （Ｂ）固定化された第一オリゴヌクレオチドを標的分子
の存在下、およびさらに第二オリゴヌクレオチド（リン
カーかまたはプライマーのいずれか）の存在下でインキ
ュベートし、その際、該ヌクレオチドの添加の順序は重
要ではなく、該第二オリゴヌクレオチドは該標的分子の
配列に相補的な配列を有し、該標的分子の第二の領域に
ハイブリダイズすることができ、その際、該第一の領域
と該第二の領域とは該前以て選択した部位により互いに
隔てられており、該インキュベーションは、該第一オリ
ゴヌクレオチドおよび該第二オリゴヌクレオチドが標的
分子にハイブリダイズしてハイブリダイゼーション生成
物を生成するに充分な条件下で行い、該ハイブリダイゼ
ーション生成物は、これらオリゴヌクレオチドが単一の
ヌクレオチドの空隙により互いに隔てられており、該空
隙は該前以て選択した部位の反対側にあり、 （Ｃ）該ハイブリダイゼーション生成物をポリメラー
ゼ、リガーゼ、および少なくとも一つのデオキシヌクレ
オシド三リン酸を含むヌクレオシド三リン酸混合物の存
在下でさらにインキュベートし、その際、該インキュベ
ーションは、該固定化された第一または第二のハイブリ
ダイズしたオリゴヌクレオチドのいずれかの３′末端に
ヌクレオシド三リン酸を鋳型依存でポリメラーゼ媒体さ
れて組み込むことを可能にするに充分な条件下で行い、
それによってこれらハイブリダイズしたオリゴヌクレオ
チド間の空隙を充填させ、これらオリゴヌクレオチドを
隣接させ、該組み込みは該前以て選択した部位に存在す
るヌクレオチドに相補的なヌクレオシド三リン酸を該ヌ
クレオシド三リン酸混合物が含有しているか否かに依存
し、 （Ｄ）リガーゼにより隣接する第一または第二のハイブ
リダイズしたオリゴヌクレオチドの対をライゲートさ
せ、 （Ｅ）該固定化された第一オリゴヌクレオチドを、非共
有結合により結合した標的または第二オリゴヌクレオチ
ドを該第一オリゴヌクレオチドから分離するに充分な条
件下でさらにインキュベートし、ついで （Ｆ）該第二オリゴヌクレオチドまたはヌクレオシド三
リン酸の一つが固相支持体に固定化されたか否かを決定
することにより、前以て選択した部位のヌクレオチドの
同一性を決定する からなる。
本発明はさらに、第一および第二オリゴヌクレオチド
および標的分子がDNA分子、RNA分子、ペプチド核酸およ
び他の修飾DNA分子である上記方法の態様を包含する。
本発明はまた、工程Ａにおいて第一オリゴヌクレオチ
ド（「リンカー」）の３′末端が固相支持体に固定化さ
れる上記方法の態様、工程Ｃにおいて該条件が該第二の
ハイブリダイズされたオリゴヌクレオチド（「プライマ
ー」）の３′末端へのヌクレオシド三リン酸の組み込み
を可能とするものである上記方法の態様、または工程Ａ
において第一オリゴヌクレオチドの５′末端が固相支持
体に固定化される上記方法の態様、および工程Ｃにおい
て該条件が該第一のハイブリダイズされたオリゴヌクレ
オチド（プライマー）の３′末端へのヌクレオシド三リ
ン酸の組み込みを可能とするものである上記方法の態様
をも包含する。
本発明はさらに、ヌクレオシド三リン酸の一つが検出
可能に標識されている（ハプテン、酵素標識、蛍光標
識、放射性同位元素標識、または化学ルミネセンス標識
などで）上記方法の態様に関する。
本発明は特に、工程Ｃにおいてヌクレオシド三リン酸
混合物が１またはそれ以上の検出可能に標識されたヌク
レオシド三リン酸を含み、他の標識されていないヌクレ
オシド三リン酸がデオキシヌクレオシド三リン酸かまた
はジデオキシヌクレオシド三リン酸のいずれかである上
記方法の態様、および工程Ｆにおいて前以て選択した部
位のヌクレオチドの同一性の決定を、固定化された標識
デオキシ−またはジデオキシヌクレオシド三リン酸の標
識を検出することにより行う上記方法の態様に関する。
本発明はまた、第二オリゴヌクレオチドが検出可能に
標識されている上記方法の態様、工程Ｃにおいてヌクレ
オシド三リン酸混合物が一つのヌクレオシド三リン酸の
みを含み、該ヌクレオシド三リン酸が他の３つのジデオ
キシヌクレオシド三リン酸ともにまたは他の３つのデオ
キシヌクレオシド三リン酸を含むことなく存在するデオ
キシヌクレオシド三リン酸である上記方法の態様、およ
び工程Ｆにおいて前以て選択した部位のヌクレオチドの
同一性の決定を、固定化された標識第二オリゴヌクレオ
チドの標識を検出することにより行う上記方法の態様に
も関する。
別の態様においては、工程Ａ〜Ｄを溶液中で行い、ラ
イゲートされたオリゴヌクレオチドが検出のために固相
上に捕捉される。
さらに別の態様においては、工程Ａ〜Ｄを溶液中で行
い、ライゲートされたオリゴヌクレオチドの検出を溶液
中で行う。
本発明は、ウマ、ヒツジ、ウシ、イヌ、ネコ、植物お
よびヒトよりなる群から選ばれた動物を含む二倍体生物
並びに細菌、真菌およびウイルスを含む一倍体生物の多
型を分析するための上記方法の使用を包含する。
図面の記載 図１は、標識dNTPを用いたリガーゼ媒体GBMTM手順の
模式図である。（１）において、５′リン酸化されたリ
ンカーオリゴヌクレオチドがマイクロウエルの表面上に
結合する。（２）において、鋳型DNAを該リンカーにハ
イブリダイズさせる。（３）において、該固定化された
鋳型にプライマーオリゴヌクレオチドがハイブリダイズ
する。（４）において、DNAポリメラーゼ、リガーゼ、
標識dNTPおよび非標識dNTPの存在下、標識dNTPを組み込
ませ、リンカーとプライマーとをライゲートさせる。
（５）において、ウエルをアルカリで洗浄してライゲー
トしなかったすべてのDNAを除去する。（６）におい
て、酵素結合抗体および基質を用いて該標識塩基を検出
する。
図２は、標識プライマーを用いたリガーゼ媒体GBMTM
手順の模式図である。（１）において、５′リン酸化さ
れたリンカーオリゴヌクレオチドがその３′端にてマイ
クロウエルの表面上に結合する。（２）において、鋳型
DNAを該リンカーにハイブリダイズさせる。（３）にお
いて、該固定化されたリンカーにビオチン化されたプラ
イマーオリゴヌクレオチドをハイブリダイズさせる。
（４）において、DNAポリメラーゼ、リガーゼ、標識dNT
Pおよび３つの非標識ddNTPの存在下、該dNTPを組み込ま
せ、リンカーとプライマーとをライゲートさせる。
（５）において、ウエルをアルカリで洗浄してライゲー
トしなかったDNAを除去する。（６）において、酵素結
合抗体および基質を用いて該標識塩基を検出する。
図３は、標識リンカーを用いたリガーゼ媒体GBMTM手
順の模式図である。（１）において、プライマーオリゴ
ヌクレオチドがその５′端にてマイクロウエルの表面上
に結合する。（２）において、鋳型DNAを該リンカーに
ハイブリダイズさせる。（３）において、該固定化され
た鋳型に５′リン酸化され３′ビオチン化されたリンカ
ーオリゴヌクレオチドがハイブリダイズする。（４）に
おいて、DNAポリメラーゼ、リガーゼ、標識dNTPおよび
３つのddNTPの存在下、該dNTPを組み込ませ、リンカー
とプライマーとをライゲートさせる。（５）において、
ウエルをアルカリで洗浄してライゲートしなかったDNA
を除去する。（６）において、酵素結合抗体および基質
を用いて該標識塩基を検出する。
図４は、溶液中でのリガーゼ媒体GBMTM手順の模式図
である。（１）において、５′リン酸化され３′フルオ
レセイン化されたリンカーオリゴヌクレオチドを鋳型DN
Aおよびプライマーオリゴヌクレオチドとともにインキ
ュベートする。（２）において、これら３つのDNA分子
を溶液中にてハイブリダイズさせる。（３）において、
DNAポリメラーゼ、リガーゼ、標識dNTPおよび非標識dNT
Pの存在下、標識dNTPを組み込ませ、リンカーとプライ
マーとをライゲートさせる。（４）において、該ライゲ
ートされたオリゴヌクレオチドが固相上に捕捉され、ウ
エルを洗浄してライゲートしなかったDNAを除去する。
（５）において、酵素結合抗体および基質を用いて該標
識塩基を検出する。
好ましい態様の記載 I.本発明のリガーゼ／ポリメラーゼ媒体アッセイ A.試料の調製 核酸試料は、「侵入性（invasive）」かまたは「非侵
入性（non−invasive）」のサンプリング手段を用い、
分析すべき種の個体から得ることができる。サンプリン
グ手段は、動物（とりわけ、マウス、ヒト、ヒツジ、ウ
マ、ウシ、ブタ、イヌ、またはネコを含む）の皮膚また
は器官内からの核酸の回収を行う場合に「侵入性」であ
るといわれる。侵入性の方法の例としては、採血、***
の回収、針生検、胸膜吸引などが挙げられる。かかる方
法の例は、キム（Kim,C.H.）ら（J.Virol.66:3879〜388
2（1992））；ビスワス（Biswas,B.）ら（Annals NY Ac
ad.Sci.590:582〜583（1990））；ビスワスら（J.Clin.
Microbiol.29:2228〜2233（1991））において議論され
ている。
対照的に、「非侵入性」のサンプリング手段は、動物
の内部または外部表面から核酸分子を回収するものをい
う。かかる非侵入性のサンプリング手段としては、「ふ
き取り（swabbing）」、涙、唾液、尿、糞便、汗などの
回収が挙げられる。本明細書において「ふき取り」と
は、吸着材料を含むアプリケーター／コレクター（「ス
ワッブ（swab」）を、表面の破片および／または死滅し
たまたは抜け落ちた細胞または細胞の破片を回収するに
充分な仕方で表面に接触させることをいう。そのような
回収は、鼻腔、口腔、直腸口、膣口または耳腔をこする
ことにより、皮膚または涙管に接触させることにより、
または毛包を回収することによって行うことができる。
B.標的配列の増幅 DNAの試料中の多型部位の検出は、DNA増幅法を使用す
ることによって容易にできる。かかる方法は、多型部位
にまたがるまたは該部位を含む配列、または該部位の遠
位もしくは近位に位置する配列濃度を特異的に増大させ
る。かくして増幅された分子は、ゲル電気泳動その他の
手段により容易に検出できる。
そのような増幅を達成する最も好ましい方法は、二本
鎖形態において多型を定める近位配列にハイブリダイズ
しうるプライマー対を用いたPCRを用いることである。
C.一本鎖DNAの調製 本発明の方法は、標的核酸が天然の２つの鎖の一方の
みを含有していることを必要としない。それゆえ、本発
明の方法は、たとえばアルカリ処理により得られたいず
れかの一本鎖DNAかまたは天然のDNAのいずれかに対して
行うことができる。使用されない（鋳型でない）鎖が存
在しても反応に影響を及ぼさない。所望なら、種々の方
法のいずれかを用い、標的DNA分子の天然の２つの鎖の
一方を反応から除去することができる。一本鎖DNA分子
は、一本鎖DNAバクテリオファージM13を用いて生成させ
ることができる（メッシング（Messing,J.）ら、Meth.E
nzymol.101:20（1983）；また、サンブルック（Sambroo
k,J.）ら、モレキュラー・クローニング：ア・ラボラト
リー・マニュアル、コールドスプリングハーバーラボラ
トリープレス、コールドスプリングハーバー、ニューヨ
ーク（1989）をも参照）。
幾つかの別法を用いて一本鎖DNA分子を生成させるこ
とができる。ギレンステン（Gyllensten,U.）ら（Proc.
Natl.Acad.Sci.（USA）85:7652〜7656（1988））および
ミホビロビッチ（Mihovilovic,M.）ら（BioTechniques
７（１）:14（1989））は、「非対称PCR」と称する方法
を記載しており、この方法では異なるモル濃度で存在す
るプライマーを用いて標準「PCR」を行う。ヒグチ（Hig
uchi,R.G.）ら（Nucleic Acids Res.17:5865（1985））
は、一本鎖増幅生成物を生成する別の方法を例示してい
る。この方法は、二本鎖の増幅生成物の一方の鎖の５′
末端をリン酸化し、ついで５′→３′エキソヌクレアー
ゼ（エキソヌクレアーゼなど）によりリン酸化された鎖
を優先的に分解させることを含む。
一本鎖DNA分子を生成するため、他の方法はまたホス
ホロチオエート誘導体のヌクレアーゼ耐性の性質を活用
している（ベンコビッチ（Benkovic）ら、米国特許第4,
521,509号;1985年６月４日）；セイヤーズ（Sayers,J.
R.）ら、Nucl.Acids Res.16:791〜802（1988）；エック
スタイン（Eckstein,F.）ら、Biochemistry 15:1685〜1
691（1976）；オット（Ott,J.）ら、Biochemistry 26:8
237〜8241（1987））。
最も好ましくは、そのような一本鎖分子はニキホロフ
（Nikiforov,T.）により記載された方法（米国特許出願
第08/005,061号、本明細書に参照のため引用する）を用
いて生成されるであろう。簡単に説明すると、これら方
法では、ヌクレアーゼ耐性のヌクレオチド誘導体を用
い、かかる誘導体を天然に存在するヌクレオチドの代わ
りに化学合成または酵素的手段によりプライマー分子ま
たはその伸長生成物中に組み込む。
適当なヌクレオチド誘導体としては、ヌクレオチドの
リン酸残基の１または２の非架橋酸素原子を、たとえば
硫黄含有基（とりわけ、ホスホロチオエート）、アルキ
ル基（とりわけ、メチルまたはエチルアルキル基）、窒
素含有基（とりわけ、アミン）、および／またはセレン
含有基で置換した誘導体が挙げられる。ホスホロチオエ
ートデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド
誘導体（たとえば、ヌクレオシド５′−Ｏ−１−チオ三
リン酸）は、最も好ましいヌクレオチド誘導体である。
かかるホスホロチオエート誘導体を生成するため、種々
の化学的方法のいずれをも用いることができる（たとえ
ば、ゾン（Zon,G.）ら、Anti−Canc.Drug Des.６:539〜
568（1991）；キム（Kim,S.C.）ら、Biochem.Biophys.R
es.Commun.179:1614〜1619（1991）；ヴ（Vu,H.）ら、T
etrahedron Lett.32:3005〜3008（1991）；テイラー（T
aylor,J.W.）ら、Nucl.Acids Res.13:8749〜8764（198
5）；エックスタインら、Biochemistry 15:1685〜1691
（1976）；オットら、Biochemistry 26:8237〜8241（19
87）；ルードビッヒ（Ludwig,J.）ら、J.Org.Chem.54:6
31〜635（1989）、すべて本明細書に参照のため引用す
る）。
重要なことに、上記選択されたヌクレオチド誘導体
は、インビトロのプライマー媒体伸長に適していなけれ
ばならず、該誘導体が組み込まれた核酸分子の領域にヌ
クレアーゼ耐性を付与するものでなければならない。最
も好ましい態様においては、該誘導体は、二本鎖DNAを
その５′端から攻撃するエキソヌクレアーゼ（５′→
３′エキソヌクレアーゼ）に対して耐性を付与するもの
でなければならない。そのようなエキソヌクレアーゼの
例としては、バクテリオファージT7遺伝子６エキソヌク
レアーゼ（「T7エキソヌクレアーゼ」）およびバクテリ
オファージラムダエキソヌクレアーゼ（「エキソヌクレ
アーゼ」）が挙げられる。T7エキソヌクレアーゼおよび
エキソヌクレアーゼの両者ともホスホロチオエート結合
の存在によって有意の程度に阻害され、両鎖の一方の選
択的な分解が可能となる。しかしながら、ヌクレアーゼ
耐性ヌクレオチド誘導体の結合の存在によって活性が影
響を受けることを条件として、いかなる二本鎖特異的な
５′→３′エキソヌクレアーゼをも用いることができ
る。ホスホロチオエート誘導体を用いる場合に好ましい
酵素はT7遺伝子６エキソヌクレアーゼであり、該エキソ
ヌクレアーゼはTaqポリメラーゼを含む多くのDNA依存性
ポリメラーゼ緩衝液について使用した同じ緩衝液で最大
の酵素活性を示す。ホスホロチオエート誘導体を含有す
るDNA分子の５′→３′エキソヌクレアーゼ耐性の性質
は、たとえば、クンケル（Kunkel,T.A.）のNucleic Aci
ds and molecular Biology、第２巻、124〜135（エック
スタインら編）、スプリンガー−フェアラーク、ベルリ
ン（1988）において論じられている。ホスホロチオエー
トヌクレオチドを含有する核酸分子の３′→５′エキソ
ヌクレアーゼ耐性の性質は、パットニー（Putney,S.
D.）らのProc.Natl.Acad.Sci.（USA）78:7350〜7354（1
981）およびグプタ（Gupta,A.P.）らのNucl.Acids Res.
12:5897〜5911（1984）に開示されている。
D.固定化法 リンカーまたはプライマーオリゴヌクレオチドを固相
支持体に固定化するため、種々の方法のいずれをも用い
ることができる。その後にハイブリダイゼーションベー
スのアッセイに使用するためのオリゴヌクレオチドプラ
イマーのかかる固定化を達成するのに最も広く用いられ
る方法の一つは、これら固相をストレプトアビジンまた
はアビジンで非共有結合によりコーティングし、ついで
ビオチン化したオリゴヌクレオチドを固定化することか
らなる（ホルムストロム（Holmstrom,K.）ら、Anal.Bio
chem.209:278〜283（1993））。他の最近の方法（ラニ
ング（Runnning,J.A.）ら、BioTechniques ８:276〜277
（1990）；ニュートン（Newton,C.R.）ら、Nucl.Acids
Res.21:1155〜1162（1993））は、ポリスチレンまたは
ガラス固相をポリ−Ｌ−Lysまたはポリ−Ｌ−Lys,Pheで
前以てコーティングし、ついで２官能性の架橋剤を用い
てアミノ−またはスルフヒドリル−修飾したオリゴヌク
レオチドを共有結合させることを必要とする。両方法と
も、修飾したオリゴヌクレオチドの使用並びに固相の前
処理を必要とするという欠点を有する。
他の刊行された方法（カワイ（Kawai,S.）ら、Anal.B
iochem.209:63〜69（1993））では、短いオリゴヌクレ
オチドプローブを一緒にライゲートしてマルチマーを生
成させ、これらをライゲートしてファージミド（phagem
id）ベクターとする。これら一本鎖の形態のファージミ
ドをインビトロ増幅および単離した後、ポリスチレンプ
レート上に固定化し、254nmにてUV照射して固定させ
る。ついで、このようにして固定化されたプローブを用
いてビオチン化PCR生成物を捕捉および検出する。
短い５′リン酸化されたプライマーの化学修飾された
ポリスチレンプレート（「コバリンク（Covalink）」プ
レート、ヌンク（Nunc））への直接共有結合法もまた刊
行されている（ラスムッセン（Rasmussen,S.R.）ら、An
al.Biochem.198:138〜142（1991））。修飾したオリゴ
ヌクレオチドと固相表面との間の共有結合は、水溶性の
カルボジイミドを用いた縮合により導入される。この方
法は、オリゴヌクレオチドの５′リン酸を介して５′結
合が優勢に生成することを確実にしていると主張されて
いる。しかしながら、この方法は特別に調製した高価な
プレートを必要とする。
最も好ましくは、本発明のオリゴヌクレオチドの固定
化は、市販のポリスチレンマイクロウエルプレート（EL
ISAプレート）や顕微鏡ガラススライド（ニキホロフお
よびクナップ、米国特許出願第08/162,397号、本明細書
に参照のため引用する）を前処理する必要なく直接使用
することのできる方法を用いて行う。ELISA試験では96
ウエルのポリスチレンプレートが広く用いられているの
で、その後のハイブリダイゼーションアッセイのために
これらプレートのウエルに短いオリゴヌクレオチドプラ
イマーを固定化する方法を開発することに顕著な関心が
もたれてきた。同様に関心がもたれているのは、顕微鏡
ガラススライドへの固定化法である。なぜなら、これは
いわゆるスライドイムノエンザイマティックアッセイ
（Slide Immunoenzymatic Assay;SIA）に用いられるか
らである（デ・マカリオ（de Macario,E.C.）ら、BioTe
chniques ３:138〜145（1985））。
固相支持体はガラス、プラスチック、紙などであって
よい。支持体はビーズ、ディップスティック（dipstic
k）、試験管、または他の種々の形状として形成するこ
とができる。好ましい態様において、支持体は複数のウ
エルを有するマイクロタイターディッシュであろう。診
断研究所および組織培養に用いられる従来の96−ウエル
マイクロタイターディッシュは好ましい支持体である。
かかる支持体を用いることにより、多数の試料およびコ
ントロールを同時に測定することが可能となり、それゆ
え分析が容易になる。そのようなマイクロタイターディ
ッシュに試薬を供給するために自動化デリバリーシステ
ムを用いることができる。同様に、分光光度法を用いて
多型部位を解析することができ、そのような解析は自動
分光光度計を用いて行うことができる。
本発明に従い、親水性の表面を有することを条件とし
て、多くの市販のあらゆるポリスチレンプレートを固定
化に直接用いることができる。適当なプレートの例とし
ては、イムロン（Immulon）４プレート（ダイナテック
（Dynatech））およびマキシソープ（Maxisorp）プレー
ト（ヌンク）が挙げられる。
プレートへのオリゴヌクレオチドの固定化は、単に適
当な塩の存在下でインキュベートすることによって行う
（ニキホロフおよびクナップ、PCT出願第08/162,397
号、本明細書に参照のため引用する）。塩の不在下で
は、すなわちオリゴヌクレオチドが水溶液中に存在する
場合にはハイブリダイゼーションは起こらない。適当な
塩の例は、50−250mM NaCl;30−100mM 1−エチル−３−
（３′−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸
塩（EDC）、pH6.8;50−150mMオクチルジメチル−アミン
塩酸塩、pH7.0;50−250mMテトラメチルアンモニウムク
ロライドである。固定化は、好ましくは室温で３〜24時
間インキュベートすることにより行う。かかるインキュ
ベーションの後、プレートを好ましくは150mM NaClおよ
び0.05重量％のツイーン20を含有する10mMトリスHCl、p
H7.5の溶液（TNTw）で洗浄する。後者の成分は、その後
のハイブリダイゼーション工程の過程でオリゴヌクレオ
チドの非特異的な結合が起こらないように、ポリスチレ
ン表面上に依然として存在するすべての遊離のオリゴヌ
クレオチド結合部位をブロックするうえで重要な役割を
果たす。放射性標識されたオリゴヌクレオチドを用いる
ことにより、ウエル当たりに固定化されたオリゴヌクレ
オチドの量は少なくとも500フィコモルと決定された。
オリゴヌクレオチドはプレートの表面上に充分な安定性
にて固定化されているので、0.5M NaOH溶液で上昇温度
にて長期間インキュベーションすることによってのみ除
去することができる。プレートを水、TNTw（ツイーン2
0）、PBS、1.5M NaCl、その他類似の溶液で洗浄するこ
とによってはオリゴヌクレオチドは除去されない。
この結合法は極めて簡単であり、あらゆるオリゴヌク
レオチドで行うことができ、その相補的な配列へハイブ
リダイズするオリゴヌクレオチドの能力を保持してい
る。マイクロタイタープレートに加え、オリゴヌクレオ
チドは顕微鏡スライドやシリコンチップなどの小型フォ
ーマットに固定化することができる。オリゴヌクレオチ
ドはまた、インク−ジェットプリンティングや写真平板
などの技術を用い、これらのフォーマットに特定のパタ
ーンで適用することもできる。これら小型フォーマット
中のパターンの検出は、蛍光標識したヌクレオチドまた
はオリゴヌクレオチドおよび蛍光顕微鏡などの装置を用
いて光学的方法により行うことができる。
E.反応成分および反応条件 本発明は、その最も好ましい態様において、一つのオ
リゴヌクレオチドを固相支持体上に固定化した不均一相
アッセイを包含する。３つの好ましい変種またはフォー
マットを用いることができ、これらはいずれも同様に首
尾よく行える。これらは、（ａ）標識dNTPを非標識リン
カーオリゴヌクレオチドおよび非標識プライマーオリゴ
ヌクレオチドとともに用いること（図１）；（ｂ）標識
プライマーオリゴヌクレオチドを非標識リンカーオリゴ
ヌクレオチドおよび非標識dNTPとともに用いること（図
２）；（ｃ）標識リンカーオリゴヌクレオチドを非標識
プライマーオリゴヌクレオチドおよび非標識dNTPととも
に用いること（図３）である。オリゴヌクレオチドの順
序は変えることができるが、伸長の方向は、ポリメラー
ゼによって決定されるように常に３′から５′方向であ
る。ハイブリダイゼーション、伸長およびライゲーショ
ンはまた溶液中でも行うことができ、ライゲートしたオ
リゴヌクレオチドを検出のため固相上に捕捉させる（図
４）。
固定化されたオリゴヌクレオチドは、該分子を相補的
な分子に安定かつ特異的にハイブリダイズさせるに充分
な長さである。本明細書において「安定な」ハイブリダ
イゼーションとは、それ以下の温度で探索アッセイを行
う温度（一般に20〜40℃）よりも高いTmを有するハイブ
リダイゼーションをいう。「特異的な」ハイブリダイゼ
ーションとは、ハイブリダイゼーションに関与するオリ
ゴヌクレオチドの長さおよび／または配列の複雑さが所
望でない偽のハイブリダイゼーション（たとえば、部分
的にのみ相補的な配列間で起こるであろうように）を排
除するに充分であることをいう。ハイブリダイゼーショ
ンは、通常、1.5M NaClおよび10mM EDTAを含む溶液中、
室温にて15〜30分間行う。他のハイブリダイゼーション
条件も別法として用いることができる。固定化するオリ
ゴヌクレオチドの配列は、探索すべき多型の多型部位の
両側に存在する不変領域にハイブリダイズするように選
択する。
好ましい態様において、固定化されるオリゴヌクレオ
チドは、３′端にて固相支持体に繋ぎ留められるリンカ
ーである。この態様におけるリンカーオリゴヌクレオチ
ドは、組み込まれるヌクレオチドおよびプライマーオリ
ゴヌクレオチドを固相に連結させる（伸長およびライゲ
ーション後に）働きをする。
ついで、標的配列（多型を含有する）および第二のオ
リゴヌクレオチドの両方の存在下で反応を行う。該第二
のオリゴヌクレオチドの配列は、固定化されたオリゴヌ
クレオチドと該第二のオリゴヌクレオチドがともに同じ
標的分子にハイブリダイズしたときに、該プライマーオ
リゴの３′端と該リンカーオリゴヌクレオチドの５′端
とが該多型の可変ヌクレオチド部位（Ｘ）の正確に反対
側に位置する単一の塩基の「空隙」により隔てられるよ
うに選択される。
DNAの一つの標識した２′−デオキシヌクレオシド
５′三リン酸を３つの非標識dNTPとともに反応液に加え
る。これにより、反応液中のすべてのプライマー分子が
伸長され、ライゲートされる。単一を越えるヌクレオチ
ドのプライマー末端への組み込みを防ぎ、鎖置換（stra
nd replacement）もまた潜在的に回避されるように、非
標識ヌクレオシド三リン酸はまたジデオキシヌクレオシ
ド三リン酸であってもよい。これはGBATMとは異なる
が、それはGBATMが伸長の過程でdNTPではなくddNTPをプ
ライマーに組み込むからである。
ポリメラーゼが反応液中に存在し、反応条件をプライ
マーオリゴヌクレオチドの３′末端が単一のヌクレオチ
ド（すなわち、多型の可変部位の反対側にあるヌクレオ
チド）によって伸長されるように維持する。
所望のプライマー伸長は、第二のオリゴヌクレオチド
が標的分子に正しくハイブリダイズした場合にのみ起こ
るであろう。ハイブリダイズしたプライマーオリゴヌク
レオチドの伸長は空隙を「充填」し、それによってリン
カーとプライマーオリゴヌクレオチドとが互いにライゲ
ートすることが可能になる。
反応液中にリガーゼが存在すると、隣接するオリゴヌ
クレオチドが連結される。T4DNAリガーゼ、大腸菌DNAリ
ガーゼ、熱安定性DNAリガーゼおよびRNAリガーゼを含む
種々のリガーゼを用いることができる。ライゲーション
後、固相支持体に結合しなかった核酸を除去するために
反応容器を洗浄するかまたはその他の処理を行う。理解
されるであろうように、ライゲート可能な基質は、標的
分子が第一および第二のオリゴヌクレオチドと確かにハ
イブリダイズし、第二のオリゴヌクレオチドがポリメラ
ーゼによって適切に伸長された場合にのみ生成される。
かかるライゲーションの結果、それまでは繋ぎ留められ
ていなかったプライマーオリゴヌクレオチドが固定化さ
れる。それゆえ、プライマーオリゴヌクレオチドは標的
ヌクレオチドにより伸長され、標識が固定化される結果
となるであろう。
重要なことに、このような固定化は多型部位Ｘの反対
側に相補的なヌクレオシドが組み込まれることに依存す
る。それゆえ、標識の固定化は、反応液に加えたヌクレ
オシド三リン酸が多型部位の可変ヌクレオシド三リン酸
に相補的であったことを明らかにする。好ましい態様に
おいて、リンカーオリゴヌクレオチドのみが特定の標的
分子にライゲートした場合にはライゲート可能な基質は
生成されず、（ヌクレオチド）標識は固定化されない。
同様に、好ましい態様において、プライマーオリゴヌク
レオチドのみが標的分子にハイブリダイズした場合には
固定化は起こらず、標識分子は洗浄によって失われてし
まうであろう。
第二の態様においては、固定化されるオリゴヌクレオ
チドは、その３′端によって固相支持体に繋ぎ留められ
たリンカーである。反応は上記と同様にして行うが、標
識はプライマーオリゴヌクレオチドの５′端に存在する
（図２）。
第三の態様においては、固定化されるオリゴヌクレオ
チドは、その５′端によって固相支持体に繋ぎ留められ
たプライマーである。反応は上記と同様にして行うが、
標識はリンカーオリゴヌクレオチドの３′端に存在する
（図３）。
第四の態様においては、ハイブリダイゼーション、伸
長およびライゲーションを溶液中で行い、ライゲートし
たオリゴヌクレオチドを検出のため固相上に捕捉させる
（図４）。
第五の態様においては、ハイブリダイゼーション、伸
長およびライゲーションを溶液中で行い、ライゲートし
たオリゴヌクレオチドを溶液中で検出する。
本発明の方法に従い、従来より用いられている放射性
同位元素標識、酵素標識、蛍光標識または化学ルミネセ
ンス標識のいずれも用いることができる。そのような標
識の代わりに、ビオチンなどのハプテン標識、またはリ
ガンド、抗原などの他の標識を用いることができる。適
当な標識は、たとえば、クリルスキー（Kourilsky）ら
（米国特許第4,581,333号）、アルバレラ（Albarella）
ら（EP144914号）、シェルドン（Sheldon III）ら（米
国特許第4,582,789号）、アルバレラら（米国特許第4,5
63,417号）、およびミヨシ（Miyoshi）ら（EP119448
号）によって論じられている。
好ましい態様において、反応液には単一の標識ヌクレ
オシド三リン酸および３つの非標識ヌクレオシド三リン
酸が含まれるであろう。該標識ヌクレオシドが前以て選
択した部位のヌクレオチドに相補的であるなら、上記方
法に従って第二のプライマーオリゴヌクレオチドが固定
化されるであろう。それゆえ、洗浄後に固相支持体上に
保持される標識を検出することによって、該前以て選択
された部位のヌクレオチドの同一性が決定される。
本発明のリガーゼ／ポリメラーゼ媒体された多型探索
法は、上記で論じたGBATM法の改良法である。GBATMプラ
イマーの約15〜20％が、鋳型の不在下でさえもある種の
ddNTPの組み込みを行う（鋳型非依存性のノイズ）。こ
の鋳型非依存性のノイズは、ポリメラーゼによって伸長
しうる自己相補的な配列がプライマー分子内に存在する
ことによるものである。この鋳型非依存性のノイズは、
２つの方法のいずれかにより、鋳型の存在下で減少さ
せ、最小にすることができる。第一に、鋳型非依存性の
伸長が多型のタイプ分けを妨害しない塩基によって行わ
れるように、鋳型として働き特定のddNTPの組み込みを
行う塩基を異なる塩基で置換することができる。このこ
とは、２対立遺伝子座で可能である。第二に、プライマ
ー内の特定の塩基を非塩基の1,3−プロパンジオールリ
ンカーで置換することができ、これはポリメラーゼがい
ずれの塩基からも伸長させるのを妨害するであろう。そ
れゆえ、GBATMは正確な結果を生み出すけれども、鋳型
非依存性の組み込みを生じにくい方法が非常に望まれて
いる。
GBATMはまた、鋳型依存性のノイズも生じるが、これ
は多型部位のヌクレオチドに相補的でないヌクレオチド
のGBATMプライマーへの組み込みである。鋳型依存性の
ノイズは幾つかの要因により引き起こされ得る。第一
に、GBATMプライマーは非特異的にハイブリダイズする
ことがあり、それによって関係のない位置での標識ddNT
Pの組み込みを起こさせる。第二に、GBATMプライマーは
ポリメラーゼ伸長工程の過程で鋳型に沿って数塩基スラ
イドすることがあり、この場合も関係のない塩基の組み
込みを起こさせる。第三に、たとえ上記原因が排除され
たとしても、ポリメラーゼは比較的高率で組み込みの誤
りを起こし得る。この率は、天然のdNTP基質を用いた場
合よりも伸長工程で用いた非天然の標識ddNTPの場合の
方が高いと予測される。
II.遺伝子解析におけるSNPのリガーゼ／ポリメラーゼ媒
体探索の使用 A.遺伝子解析に単一ヌクレオチド多型を使用することに
ついての一般的考察 本発明の多型部位の有用性は、所定の多型に関して２
人の個体が同じ対立遺伝子を有する統計学的蓋然性を予
測するために該部位を使用することができることに由来
する。
かかる統計学的分析は、種々の目的に用いることがで
きる。特定の動物を以前に試験しておいた場合に、かか
る試験をある動物が該特定の動物であるか否かを決定す
る「指紋」として用いることができる。推定の一方の親
または両方の親を試験した場合には、本発明の方法はあ
る特定の動物が該親の子孫であるか否かの見込みを決定
するのに用いることができる。それゆえ、SNPの検出お
よび分析は、特定の個体について雄の父性（特定の子馬
に対する雄馬の父性など）を排除するため、または特定
の個体が選択された雌の子孫である（特定の子馬および
選択された雌馬）蓋然性を評定するのに用いることがで
きる。
一組の同種（ヒト、ウマなど）の個体、または一組の
密接に関連する種の個体において検出された多型を分析
することにより、特定の多型の存在または不在が特定の
体質と相関関係を有するかどうかを決定することができ
る。
かかる多型分析を行うため、一組の個体について一組
の多型（すなわち、「多型アレイ」）の存在または不在
を決定する。これら一組の個体のある者は特定の体質を
示し、また別のある者は相互に排他的な特性（たとえ
ば、ウマに関しては、脆い骨vs脆くない骨；成体期発症
性盲目vs盲目なし；喘息または心血管系疾患に対する素
質vsかかる素質のないこと）を示す。ついで、これら一
組の各多型の対立遺伝子を調べ、特定の対立遺伝子の存
在が興味のもたれる特定の体質と関連があるかどうかを
決定する。そのような相関関係により、個々の種の遺伝
子地図が定められる。ある特定の体質に関してランダム
に分離していない対立遺伝子は、特定の動物が該特性を
発現するであろう蓋然性を予測するのに用いることがで
きる。たとえば、ある特定の多型対立遺伝子が心血管状
態を示す種の成員の20％にのみ存在するなら、その対立
遺伝子を含む種のある特定の成員はかかる心血管状態を
示すことに関して20％の蓋然性を有することになる。指
摘したように、この分析の予測能力は特定の多型対立遺
伝子と特定の特性との連関の程度に従って増大する。同
様に、この分析の予測能力は、複数の多型遺伝子座と特
定の体質とを同時に分析することにより増大し得る。上
記例において、第二の多型対立遺伝子もまた上記心血管
状態を示す成員の20％に存在することが見いだされた
が、かかる心血管状態を示す評価した成員のすべてがこ
れら第一および第二の多型の特定の組み合わせを有して
いたなら、かかる対立遺伝子を両方含む特定の成員は心
血管状態を示す非常に高い蓋然性を有することになる。
複数の多型部位の検出は、かかる部位がある集団で独
立に分離する頻度を定めることを可能にする。たとえ
ば、２つの多型部位がランダムに分離するなら、これら
は別の染色体上に乗っているかまたは同じ染色体上で互
いに離れて存在している。逆に、有意の頻度で共に遺伝
される２つの多型部位は同じ染色体上で互いに連関して
いる。それゆえ、分離頻度を分析することによってマー
カーの遺伝子地図を確立することができる。
本発明は標的種の遺伝子地図の構築を容易にする。そ
れゆえ、遺伝病、状態または体質への特定の動物（また
は植物）の素質を予測するため、特定の多型アレイを特
定の体質と関連付けることができる。本明細書において
「体質」とは、「遺伝病」、「状態」または「特性」を
包含する。「遺伝病」とは突然変異によって引き起こさ
れる病的状態をいい、それが検出できるか無症候性であ
るかを問わない。「状態」とは、特性（喘息、弱い骨、
盲目、潰瘍、癌、心臓または心血管系の疾患、骨格−筋
肉系の不具など）への素質をいう。「特性」とは、植物
または動物に経済的価値を付与する属性をいう。特性の
例としては、長生き、敏速さ、忍耐力、老化速度、生殖
能力などが挙げられる。
遺伝子地図の解像力は、それが含むマーカーの数に比
例する。本発明の方法は多数の多型部位を単離すること
ができるので、あらゆる所望の程度の解像力を有する遺
伝子地図を作成するのに用いることができる。
多型部位のシークエンシングは、遺伝子マッピングに
おける多型部位の有用性を非常に高める。かかるシーク
エンシングは、染色体を「ウォーキング（walk）」する
ことにより新たなマーカー部位の同定に用いることがで
きるオリゴヌクレオチドプライマーおよびプローブを設
計するのに用いることができる（ベンダー（Bender,
W.）ら、J.Supra.Molec.Struc.10（補遺）:32（197
9）；シノールト（Chinault,A.C.）ら、Gene ５:111〜1
26（1979）；クラーク（Clarke,L.）ら、Nature 287:50
4〜509（1980））。
遺伝子地図の解像力は、ゲノムがマッピングされてい
る植物または動物の他の属性の表現型に関するデータと
多型分析とを組み合わせることによってさらに増大させ
ることができる。それゆえ、特定の多型が褐色の毛髪の
色とともに分離するなら、その多型は毛髪の色を担う遺
伝子の近くの遺伝子座にマッピングされる。同様に、生
化学的データもまた遺伝子地図の解像力を増大させるの
に用いることができる。この態様においては、生化学的
な決定（血清型またはイソ型など）がいずれかの多型部
位とともに分離するかどうかを決定するために該生化学
的な決定を調べる。かかるマッピングは、たとえば、新
たな遺伝子配列を同定するため、または疾患の原因とな
る突然変異を同定するために用いることができる。
実際、本発明のSNPの同定は、相補的なオリゴヌクレ
オチドをPCRその他の反応においてプライマーとして用
い、該SNPのいずれかの側に位置する新たな遺伝子配列
を単離および配列決定することを可能にする。本発明
は、かかる新規な遺伝子配列を含む。かかるプライマー
の使用によってクローン的に単離することのできるゲノ
ム配列は、RNAに転写し、タンパク質として発現させる
ことができる。本発明はまた、かかるタンパク質並びに
該タンパク質に結合することのできる抗体その他の分子
をも含む。
巨視的な植物および動物のSNPの同定に加え、本発明
は微生物の遺伝子型の決定にも有用であるに違いない。
一つの例は、ヒト免疫不全ウイルス１型（HIV−１）お
よびHIV−２のタイピングである。感染した患者からのH
IVの迅速なタイピングは、潜在的なワクチンの開発およ
びモニタリングにおいて重要な役割を果たす。というの
は、ある種のワクチンは特定のHIV株に対してのみ有効
であるかもしれないからである。HIVタイピングはま
た、治療の試みのモニタリングにおいて、および潜在的
な処置を患者に受けさせるうえで重要である。迅速なタ
イピングを要するウイルスの他の例はＣ型肝炎ウイルス
（HCV）であるが、その感染源を追跡し、Ｃ型肝炎疾患
の経過を予測し、適切な処置くを決定するためである。
細菌の遺伝子型決定の例は疫学的研究のためのマイコバ
クテリウム・ツベルクローシス（Mycobacterium tuberc
ulosis）株のタイピングであり、これをマイコバクテリ
ウム・ボビス（Mycobacterium bovis）から識別し、多
剤耐性株を迅速に検出するためである。
本発明をその態様の一つ（ウマおよびウマの遺伝学）
に関して下記に説明する。遺伝学の基本的な原理は種に
関係なく適用されるので、かかる説明はヒトを含む他の
いかなる種にも同様に適合することができる。それゆ
え、当業者は、他のいかなる種においてもSNPを分析す
るために上記方法を直接使用し、それによって本発明の
遺伝子解析を行うだけでよい。
本発明を一般的に記載したので、ウマの多型の単離お
よび分析に関する下記例示を参照 することによって本発明は一層容易に理解されるであろ
う。これら例示は説明 のために記載するものであって、本発明を限定すること
を意図するものではない。
実施例１ 標識dNTPおよび非標識ddNTPを用いたウマ多型の分析 単一ヌクレオチドのウマ多型を探索するため、下記オ
リゴヌクレオチドを用いた（ｐはリン酸基を示す）。
オリゴヌクレオチド＃1654および＃1112は固相伸長／
ライゲーションアッセイに用いた。オリゴヌクレオチド
＃1214および＃1215は、ウマゲノムDNAの所望の断片を
増幅するのに用いたPCRプライマーであった。PCRプライ
マー＃1214は、４つのホスホロチオエート結合を導入す
ることにより５′端において修飾した。これらは、二本
鎖PCR生成物の鎖の一方がT7遺伝子６エキソヌクレアー
ゼにより加水分解されるのを防ぐ働きをする。ホスホロ
チオエート結合は、該配列の下線残基間に位置する。
PCR増幅 PCR増幅反応におけるDNA源はウマゲノムDNAであっ
た。反応は50μｌの全容量で行った。PCRプライマーの
最終濃度は05μＭであった。95℃での最初の２分間の変
性工程の後、それぞれ変性（95℃で１分間）、アニーリ
ング（60℃で２分間）および伸長（72℃で３分間）から
なるサイクルを35サイクル行った。TaqDNAポリメラーゼ
はパーキン−エルマー（Parkin−Elmer）から入手し、
0.025単位／μｌの濃度で使用した。PCR緩衝液の最終組
成は、1.5mM MgCl2、50mM KCl、10mMトリス−HCl、pH8.
3および200μg/mlBSAであった。
一本鎖PCR生成物の調製 二本鎖PCR生成物の鎖の一方をエキソヌクレアーゼ加
水分解から保護するため、４つのホスホロチオエート結
合を合成の段階でPCRプライマーの一つ（＃1214）の
５′端に導入した。一本鎖PCR生成物を生成させるた
め、PCR増幅後にT7遺伝子６エキソヌクレアーゼを２単
位／μlPCR反応液の最終濃度にて加えた。インキュベー
ションを室温にて１時間行った。T7遺伝子６エキソヌク
レアーゼはUSBから購入し、製造業者によって推奨され
た緩衝液中に希釈した。
マイクロタイタープレート中に固定化されたオリゴヌク
レオチドへの一本鎖PCR断片のハイブリダイゼーション エキソヌクレアーゼ処理後、等容量の3M NaCl、20mM
EDTAを反応混合物に加え、得られた溶液の20μｌアリコ
ートを固定化オリゴヌクレオチド＃1654を含む各ウエル
に移した。このハイブリダイゼーション溶液に1.5ピコ
モルのオリゴヌクレオチドプライマー＃1112を加えた。
ハイブリダイゼーションを室温にて30分間行い、ついで
TNTwで洗浄した。
伸長／ライゲーション反応 伸長／ライゲーション混合物は下記成分を有してい
た:20mMトリス−HCl、pH7.5;10mM MgCl2;25mM NaCl;1mM
ATP;0.65単位／ウエルのシークエナーゼおよび0.4単位
／ウエルのT4DNAリガーゼ。加えて、幾つかのウエルに
は30μＭのビオチン−14−dCTP（ギブコーBRL（GIBCO−
BRL）より入手）および各30μＭの他のddNTPが含まれて
いた。他のウエルには30μＭのビオチン−dCTP（ギブコ
ーBRL）および各30μＭの他のddNTPが含まれていた。伸
長／ライゲーション反応を室温にて15分間行い、ついで
ウエルを0.1N NaOHで洗浄して固定化オリゴヌクレオチ
ドに共有結合しなかった分子をすべて除去した。その
後、１％BSAを含むTNTw中の抗−ビオチン西洋ワサビペ
ルオキシダーゼ結合体（ベクター・ラボラトリーズ（Ve
ctor Laboratories））の1:1200希釈とともに室温にて3
0分間ウエルをインキュベートした。プレートをTNTwで
６回洗浄し、ついで1mg/mlのｏ−フェニレンジアミン
（OPD）および0.012％H2O2を含む0.1Mクエン酸緩衝液
（pH4.5）の溶液を加えた。プレートを直ちにプレート
リーダーで読み取り、発色を450nmにて２分間追跡し
た。３頭の異なるウマから得られた結果（mOD/分として
示す）を表１にまとめて示す。 表１ ウマNo. Ａシグナル Ｃシグナル Ｔシグナル 1534 0.4 382.1 1.7 866 0.3 302.0 96.8 527 0.2 0.9 161.9 DNAなし 0.3 0.5 0.3 表１に示す結果は、この多型遺伝子座については、ウ
マ＃1534はＣホモ接合であり、ウマ＃866はCTヘテロ接
合であり、ウマ＃527はＴホモ接合であることを示して
いる。
実施例２ 非標識のdNTP、ddNTPおよび標識したオリゴヌクレオチ
ドリンカー分子を用いた単一ヌクレオチド多型のリガー
ゼ／ポリメラーゼ媒体されたジェネティック・ビットTM
アナリシス 使用したオリゴヌクレオチドは下記の通りである（Fl
はフルオレセイン残基を示す）： この実験ではオリゴヌクレオチド＃1376を合成鋳型と
して用いた。このオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレ
オチドプライマー＃713−１および標識リンカー分子＃1
401の両方にハイブリダイズする。＃1376の配列中の下
線塩基はモデル単一ヌクレオチド多型として働く。
オリゴヌクレオチドプライマー＃713−１を96ウエル
ポリスチレンプレート（イムロン４、ダイナテック）の
ウエルに固定化した。このプライマーは標識オリゴヌク
レオチド＃1401の存在下で合成鋳型分子＃1376にハイブ
リダイズした。下記量の＃1376を用いた：ウエル当たり
250および500フィコモル。オリゴヌクレオチド＃1401は
過剰に用いた（ウエル当たり1.5ピコモル）。ハイブリ
ダイゼーションは上記実施例１と同様にして行った。プ
レートを洗浄し、上記のようにして伸長／ライゲーショ
ン反応を行ったが、非標識ヌクレオチド（濃度はすべて
30μＭ）のみの存在下で行った。下記４つのヌクレオチ
ド混合物を用いた:dATPプラスddGTP、ddCTPおよびddTT
P;dCTPプラスddATP、ddGTPおよびddTTP;dGTPプラスddAT
P、ddCTPおよびddTTP;dTTPプラスddATP、ddGTPおよびdd
CTP。伸長／ライゲーション反応後、固定化オリゴヌク
レオチドに共有結合しなかったすべての分子を除去する
ためプレートを0.1N NaOHで洗浄した。ついで、１％BSA
を含むTNTw中に1:500希釈した抗フルオレセイン西洋ワ
サビペルオキシダーゼ結合体（デュポン（DuPont））を
用い、ウエル中のフルオレセインの存在を室温にて30分
間検出した。酵素検出は実施例１の記載と同様にして行
った。その結果を表２にまとめて示す。
コントロールとして同様の反応を行ったが、伸長混合
物からポリメラーゼを除いた。これら結果を表３に示
す。
これら結果から、多型塩基の性質がＣであることが明
らかになった。
実施例３ 標識dNTPおよび非標識dNTPを用いたウマ多型の分析 特定のウマ多型を探索するため、２つのオリゴヌクレ
オチドを合成した。これら分子は下記配列を有してい
た。
オリゴヌクレオチド＃1357は３′端および５′端の両
方がリン酸化されていた。オリゴヌクレオチド＃713は
末端リン酸基を欠いていた。
Ｎ−エチル−Ｎ′−（３−ジメチルアミノ）プロピル
カルボジイミド塩酸塩（EDC）を用い、オリゴヌクレオ
チド＃1357を96ウエルポリスチレンプレートのウエルに
結合させた。洗浄して未結合物質を除去した後、約250
フィコモルの増幅した55bpのウマゲノム配列を加えた。
このウマ配列はウマゲノムDNAからPCRにより製造したも
のであった。この増幅生成物は下記配列を含んでいた。
ハイブリダイゼーションを1.5M NaCl、10mM EDTA中、
室温にて30分間行った。ハイブリダイゼーション工程に
はまた１ピコモルの第二のオリゴヌクレオチド（＃71
3）も含まれていた。両オリゴヌクレオチド（＃713およ
び＃1357）はPCR生成物にハイブリダイズし、配列番号:
10の残基A26の反対側に位置する正確に一つの塩基の空
隙を＃713の３′端と＃1357の５′端との間に残した。
ハイブリダイゼーション工程の後、プレートを洗浄
し、ハイブリダイゼーション複合体を含むウエルを下記
組成の伸長−ライゲーション混合物とともにインキュベ
ートした:20mMトリス−HCl、pH7.5;10mM MgCl2;25mM Na
Cl;10mM DTT;1mM ATP;0.65単位（ウエル当たり）のシー
クエナーゼTM;0.4単位（ウエル当たり）のT4DNAリガー
ゼ。
加えて、幾つかのウエルには30μＭのビオチン−14−
dATP（ギブコーBRLより入手）および各30μＭの他の３
つのdNTPが含まれていた。他のウエルには30μＭのビオ
チン−21−dUTP（クローンテック（Clontech）より入
手）および30μＭの他の３つのdNTPが含まれていた。伸
長／ライゲーション反応を室温にて15分間行った。ウエ
ルを1N NaOHで洗浄し、ついで、抗−ビオチン−西洋ワ
サビペルオキシダーゼ結合体の希釈液とともにインキュ
ベートした。洗浄後、動力学モードのマイクロプレート
リーダーを用い、H2O2およびｏ−フェニレンジアミン塩
酸塩を用いて酵素の存在を検出した。ビオチン化dTTPを
含むウエルは168mOD/分の値を与えた。ビオチン化dATP
を含むウエルは7.8mOD/分の値を与えた。それゆえ、こ
れら２つのオリゴヌクレオチド間の空隙は標識Ｔで充填
され、それゆえ反対鎖をＡとして同定した。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 カーン，ジョナサン イギリス国エルビー２ ５エイチジェ イ、リトル・シェルフォード、ホックス トウ・ロード53番 (72)発明者 ゴレット，フィリップ アメリカ合衆国21030メリーランド、ク ッキーズビル、ウエスタン・ラン・ロー ド301番 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12Q 1/68 C12N 15/09 ZNA ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ)

Claims (37)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】一本鎖標的核酸分子中の前以て選択した単
    一ヌクレオチド長部位に存在するヌクレオチドの同一性
    を決定する方法であって、該方法は該標的分子にハイブ
    リダイズすることができる２つのオリゴヌクレオチドか
    らなるオリゴヌクレオチドのセットを用い、工程： （Ａ）プライマーオリゴヌクレオチドかまたはリンカー
    オリゴヌクレオチドのいずれかである該オリゴヌクレオ
    チドのセットの第一オリゴヌクレオチドを固相支持体に
    固定化し、その際、該第一オリゴヌクレオチドは該標的
    分子の第一の領域のヌクレオチド配列に相補的なヌクレ
    オチド配列を有し、ハイブリダイズした第一オリゴヌク
    レオチドの末端が該前以て選択した部位にすぐに隣接す
    るように、該標的分子の該第一の領域にハイブリダイズ
    することができ、 （Ｂ）該固定化された第一オリゴヌクレオチドを該標的
    分子の存在下、およびさらに該オリゴヌクレオチドのセ
    ットの標識したまたは非標識の第二オリゴヌクレオチド
    の存在下でインキュベートし、その際、該第二オリゴヌ
    クレオチドは、該第一オリゴヌクレオチドがリンカーオ
    リゴヌクレオチドである場合はプライマーオリゴヌクレ
    オチドであり、該第一オリゴヌクレオチドがプライマー
    オリゴヌクレオチドである場合はリンカーオリゴヌクレ
    オチドであり、該標的分子の第二の領域の配列に相補的
    な配列を有し、該標的分子の該第二の領域にハイブリダ
    イズすることができ、その際、該第一の領域と該第二の
    領域とは該前以て選択した部位により互いに隔てられて
    おり、該インキュベーションは、該第一オリゴヌクレオ
    チドおよび該第二オリゴヌクレオチドが該標的分子にハ
    イブリダイズしてハイブリダイゼーション生成物を生成
    するに充分な条件下で行い、該ハイブリダイゼーション
    生成物は、該第一オリゴヌクレオチドおよび該第二オリ
    ゴヌクレオチドが単一のヌクレオチドの空隙により互い
    に隔てられており、該空隙は該前以て選択した部位の反
    対側にあり、 （Ｃ）該ハイブリダイゼーション生成物をポリメラー
    ゼ、リガーゼ、および該前以て選択した部位のヌクレオ
    チドに相補的であり該第二オリゴヌクレオチドが標識さ
    れていない場合には検出可能に標識されたヌクレオシド
    三リン酸種を含むヌクレオシド三リン酸混合物の存在下
    でさらにインキュベートし、その際、該混合物は、該前
    以て選択した部位のヌクレオチドの同一性にかかわら
    ず、鋳型依存でポリメラーゼ媒体された伸長反応が起こ
    り、該前以て選択した部位のヌクレオチドに相補的な該
    ヌクレオシド三リン酸混合物のヌクレオシド三リン酸種
    が該第一オリゴヌクレオチドまたは該第二オリゴヌクレ
    オチドのいずれがプライマーオリゴヌクレオチドである
    かに拘わらずその３′末端に組み込まれるように、一つ
    のデオキシヌクレオシド三リン酸種と３つのジデオキシ
    ヌクレオシド三リン酸種とからなり、該インキュベーシ
    ョンは、該鋳型依存でポリメラーゼ媒体された組み込み
    を可能にするに充分な条件下で行い、それによってハイ
    ブリダイズしたオリゴヌクレオチド間の空隙を充填さ
    せ、該オリゴヌクレオチドを隣接させ、 （Ｄ）リガーゼにより隣接する第一および第二のハイブ
    リダイズしたオリゴヌクレオチドをライゲートさせ、 （Ｅ）該固定化された第一オリゴヌクレオチドを、非共
    有結合により結合した標的または第二オリゴヌクレオチ
    ドを該第一オリゴヌクレオチドから分離するに充分な条
    件下でさらにインキュベートし、ついで （Ｆ）工程Ｅの該固定化された第一オリゴヌクレオチド
    が標識されたか否かを決定し、その際、固定化された標
    識オリゴヌクレオチドの存在は該前以て選択した部位の
    該ヌクレオチドの同一性が該デオキシヌクレオシド三リ
    ン酸混合物のデオキシヌクレオシド三リン酸に相補的で
    あることを示す からなることを特徴とする方法。
  2. 【請求項２】該第一および第二オリゴヌクレオチドおよ
    び該標的分子がDNA分子である請求項１に記載の方法。
  3. 【請求項３】該第一および第二オリゴヌクレオチドおよ
    び該標的分子がRNA分子である請求項１に記載の方法。
  4. 【請求項４】該ポリメラーゼが逆転写酵素であり、該リ
    ガーゼがRNAリガーゼである請求項３に記載の方法。
  5. 【請求項５】工程Ａにおいて該第一オリゴヌクレオチド
    がリンカーオリゴヌクレオチドであり、該第一オリゴヌ
    クレオチドの３′末端が該固相支持体に固定化され、工
    程Ｃにおいて該条件が該第二のハイブリダイズされたオ
    リゴヌクレオチドの３′末端への該ヌクレオシド三リン
    酸の組み込みを可能とするものであり、該第二オリゴヌ
    クレオチドがプライマーオリゴヌクレオチドである、請
    求項２に記載の方法。
  6. 【請求項６】工程Ｃにおいて該ヌクレオシド三リン酸混
    合物が少なくとも１の検出可能に標識されたヌクレオシ
    ド三リン酸を含む、請求項２に記載の方法。
  7. 【請求項７】該検出可能な標識が、酵素標識、蛍光標
    識、放射性同位元素標識、または化学ルミネセンス標識
    である、請求項６に記載の方法。
  8. 【請求項８】工程Ｆにおいて該前以て選択した部位の該
    ヌクレオチドの同一性の決定を、該ヌクレオシドの固定
    化された標識を検出することにより行う、請求項６に記
    載の方法。
  9. 【請求項９】該第二オリゴヌクレオチドがプライマーオ
    リゴヌクレオチドであり、工程Ｂにおいて該第二オリゴ
    ヌクレオチドが検出可能に標識されており、ヌクレオシ
    ド三リン酸のすべてが標識されていない、請求項２に記
    載の方法。
  10. 【請求項１０】該検出可能な標識が、酵素標識、蛍光標
    識、放射性同位元素標識、または化学ルミネセンス標識
    である、請求項９に記載の方法。
  11. 【請求項１１】工程Ｆにおいて、該前以て選択した部位
    の該ヌクレオシドの同一性を、工程Ｃに用いたデオキシ
    ヌクレオシド三リン酸およびジデオキシヌクレオシド三
    リン酸の混合物から推定する、請求項９に記載の方法。
  12. 【請求項１２】該第一オリゴヌクレオチドがプライマー
    オリゴヌクレオチドであり、工程Ａにおいて該第一オリ
    ゴヌクレオチドの５′末端が該固相支持体に固定化さ
    れ、工程Ｃにおいて該条件が該固定化オリゴヌクレオチ
    ドの３′末端への該ヌクレオシド三リン酸の組み込みを
    可能とするものである、請求項１に記載の方法。
  13. 【請求項１３】該第二オリゴヌクレオチドがリンカーオ
    リゴヌクレオチドであり、該第二オリゴヌクレオチドが
    その３′端で検出可能に標識されている、請求項12に記
    載の方法。
  14. 【請求項１４】工程Ｆにおいて、該前以て選択した部位
    の該ヌクレオシドの同一性を、工程Ｃに用いたデオキシ
    ヌクレオシド三リン酸およびジデオキシヌクレオシド三
    リン酸の混合物から推定する、請求項13に記載の方法。
  15. 【請求項１５】該標的分子が多型を含み、該前以て選択
    した部位が該多型の可変ヌクレオチドを含む、請求項１
    に記載の方法。
  16. 【請求項１６】該標的分子が、ウマ、ヒツジ、ウシ、イ
    ヌ、ネコ、およびヒトよりなる群から選ばれた動物から
    得られたものである、請求項15に記載の方法。
  17. 【請求項１７】該標的分子が動物の核酸からインビトロ
    で増幅される、請求項15に記載の方法。
  18. 【請求項１８】該動物が、ウマ、ヒツジ、ウシ、イヌ、
    ネコ、およびヒトよりなる群から選ばれる請求項17に記
    載の方法。
  19. 【請求項１９】該標的分子が植物から得られたものであ
    る請求項15に記載の方法。
  20. 【請求項２０】該標的分子が植物の核酸からインビトロ
    で増幅される、請求項15に記載の方法。
  21. 【請求項２１】該標的分子が、ウイルス、細菌、酵母ま
    たは真菌から得られたものである請求項15に記載の方
    法。
  22. 【請求項２２】該標的分子がウイルス、細菌、酵母また
    は真菌の核酸からインビトロで増幅される、請求項15に
    記載の方法。
  23. 【請求項２３】一本鎖標的核酸分子中の前以て選択した
    単一ヌクレオチド長部位に存在するヌクレオチドの同一
    性を決定する方法であって、該方法は該標的分子にハイ
    ブリダイズすることができる２つのオリゴヌクレオチド
    からなるオリゴヌクレオチドのセットを用い、工程： （Ａ）該標的分子を該オリゴヌクレオチドのセットの第
    一オリゴヌクレオチドの存在下でインキュベートし、そ
    の際、該第一オリゴヌクレオチドはプライマーオリゴヌ
    クレオチドまたはリンカーオリゴヌクレオチドであり、
    該第一オリゴヌクレオチドはビオチンおよびフルオレセ
    インよりなる群から選ばれた結合したリガンドを含み、
    該標的分子の第一の領域のヌクレオチド配列に相補的な
    ヌクレオチド配列を有し、ハイブリダイズした第一オリ
    ゴヌクレオチドの末端が該前以て選択した部位にすぐに
    隣接するように、該標的分子の該第一の領域にハイブリ
    ダイズすることができ、 （Ｂ）該提供された第一オリゴヌクレオチドおよび該標
    的分子を、さらに該オリゴヌクレオチドのセットの標識
    したまたは非標識の第二オリゴヌクレオチドの存在下で
    インキュベートし、その際、該第二オリゴヌクレオチド
    は、該第一オリゴヌクレオチドがリンカーオリゴヌクレ
    オチドである場合はプライマーオリゴヌクレオチドであ
    り、該第一オリゴヌクレオチドがプライマーオリゴヌク
    レオチドである場合はリンカーオリゴヌクレオチドであ
    り、該標的分子の第二の領域の配列に相補的な配列を有
    し、該標的分子の該第二の領域にハイブリダイズするこ
    とができ、その際、該第一の領域と該第二の領域とは該
    前以て選択した部位により互いに隔てられており、該イ
    ンキュベーションは、該第一オリゴヌクレオチドおよび
    該第二オリゴヌクレオチドが該標的分子にハイブリダイ
    ズしてハイブリダイゼーション生成物を生成するに充分
    な条件下で行い、該ハイブリダイゼーション生成物は、
    該第一および第二オリゴヌクレオチドが単一のヌクレオ
    チドの空隙により互いに隔てられており、該空隙は該前
    以て選択した部位の反対側にあり、 （Ｃ）該ハイブリダイゼーション生成物をポリメラー
    ゼ、リガーゼ、および該前以て選択した部位のヌクレオ
    チドに相補的であり該第二オリゴヌクレオチドが標識さ
    れていない場合には検出可能に標識されたヌクレオシド
    三リン酸種を含むヌクレオシド三リン酸混合物の存在下
    でさらにインキュベートし、その際、該混合物は、該前
    以て選択した部位のヌクレオチドの同一性にかかわら
    ず、鋳型依存でポリメラーゼ媒体された伸長反応が起こ
    り、該前以て選択した部位のヌクレオチドに相補的な該
    ヌクレオシド三リン酸混合物のヌクレオシド三リン酸種
    が該第一オリゴヌクレオチドまたは該第二オリゴヌクレ
    オチドのいずれがプライマーオリゴヌクレオチドである
    かに拘わらずその３′末端に組み込まれるように、一つ
    のデオキシヌクレオシド三リン酸種と３つのジデオキシ
    ヌクレオシド三リン酸種とからなり、該インキュベーシ
    ョンは、該鋳型依存でポリメラーゼ媒体された組み込み
    を可能にするに充分な条件下で行い、それによって該ハ
    イブリダイズしたオリゴヌクレオチド間の空隙を充填さ
    せ、該オリゴヌクレオチドを隣接させ、 （Ｄ）リガーゼにより隣接する第一および第二のハイブ
    リダイズしたオリゴヌクレオチドをライゲートさせ、そ
    れによって第一オリゴヌクレオチドと第二オリゴヌクレ
    オチドとのライゲーション生成物を生成させ、 （Ｅ）該第一オリゴヌクレオチドと第二オリゴヌクレオ
    チドとのライゲーション生成物を該リガンドを用いて固
    相上に捕捉し、該提供された第一オリゴヌクレオチド
    を、非共有結合により結合した標的または第二オリゴヌ
    クレオチドを該インキュベーションから除去するに充分
    な条件下でさらにインキュベートし、ついで （Ｆ）工程Ｅの該固定化された第一オリゴヌクレオチド
    が標識されたか否かを決定し、その際、固定化された標
    識オリゴヌクレオチドの存在は該前以て選択した部位の
    該ヌクレオチドの同一性が該デオキシヌクレオシド三リ
    ン酸混合物のデオキシヌクレオシド三リン酸に相補的で
    あることを示す からなることを特徴とする方法。
  24. 【請求項２４】一本鎖標的核酸分子中の前以て選択した
    単一ヌクレオチド長部位に存在するヌクレオチドの同一
    性を決定する方法であって、該方法は該標的分子にハイ
    ブリダイズすることができる２つのオリゴヌクレオチド
    からなるオリゴヌクレオチドのセットを用い、工程： （Ａ）該標的分子を該オリゴヌクレオチドのセットの第
    一オリゴヌクレオチドの存在下でインキュベートし、そ
    の際、該第一オリゴヌクレオチドはプライマーオリゴヌ
    クレオチドまたはリンカーオリゴヌクレオチドであり、
    該第一オリゴヌクレオチドはビオチンおよびフルオレセ
    インよりなる群から選ばれた結合したリガンドを含み、
    該標的分子の第一の領域のヌクレオチド配列に相補的な
    ヌクレオチド配列を有し、ハイブリダイズした第一オリ
    ゴヌクレオチドの末端が該前以て選択した部位にすぐに
    隣接するように、該標的分子の該第一の領域にハイブリ
    ダイズすることができ、 （Ｂ）該提供された第一オリゴヌクレオチドおよび該標
    的分子を、さらに該オリゴヌクレオチドのセットの第二
    オリゴヌクレオチドの存在下でインキュベートし、その
    際、該第二オリゴヌクレオチドは、該第一オリゴヌクレ
    オチドがリンカーオリゴヌクレオチドである場合はプラ
    イマーオリゴヌクレオチドであり、該第一オリゴヌクレ
    オチドがプライマーオリゴヌクレオチドである場合はリ
    ンカーオリゴヌクレオチドであり、該標的分子の第二の
    領域の配列に相補的な配列を有し、該標的分子の該第二
    の領域にハイブリダイズすることができ、その際、該第
    一の領域と該第二の領域とは該前以て選択した部位によ
    り互いに隔てられており、該インキュベーションは、該
    第一オリゴヌクレオチドおよび該第二オリゴヌクレオチ
    ドが該標的分子にハイブリダイズしてハイブリダイゼー
    ション生成物を生成するに充分な条件下で行い、該ハイ
    ブリダイゼーション生成物は、該第一および第二オリゴ
    ヌクレオチドが単一のヌクレオチドの空隙により互いに
    隔てられており、該空隙は該前以て選択した部位の反対
    側にあり、 （Ｃ）該ハイブリダイゼーション生成物をポリメラー
    ゼ、リガーゼ、および該前以て選択した部位のヌクレオ
    チドに相補的であり該第二オリゴヌクレオチドが標識さ
    れていない場合には検出可能に標識されたヌクレオシド
    三リン酸種を含むヌクレオシド三リン酸混合物の存在下
    でさらにインキュベートし、その際、該混合物は、該前
    以て選択した部位のヌクレオチドの同一性にかかわら
    ず、鋳型依存でポリメラーゼ媒体された伸長反応が起こ
    り、該前以て選択した部位のヌクレオチドに相補的な該
    ヌクレオシド三リン酸混合物のヌクレオシド三リン酸種
    が該第一オリゴヌクレオチドまたは該第二オリゴヌクレ
    オチドのいずれがプライマーオリゴヌクレオチドである
    かに拘わらずその３′末端に組み込まれるように、一つ
    のデオキシヌクレオシド三リン酸種と３つのジデオキシ
    ヌクレオシド三リン酸種とからなり、該インキュベーシ
    ョンは、該鋳型依存でポリメラーゼ媒体された組み込み
    を可能にするに充分な条件下で行い、それによって該ハ
    イブリダイズしたオリゴヌクレオチド間の空隙を充填さ
    せ、該オリゴヌクレオチドを隣接させ、 （Ｄ）リガーゼにより隣接する第一および第二のハイブ
    リダイズしたオリゴヌクレオチドをライゲートさせ、そ
    れによって第一オリゴヌクレオチドと第二オリゴヌクレ
    オチドとのライゲーション生成物を生成させ、 （Ｅ）該提供された第一オリゴヌクレオチドを、非共有
    結合により結合した標的または第二オリゴヌクレオチド
    を該第一オリゴヌクレオチドから分離し、該ライゲート
    したオリゴヌクレオチドを溶液中に保持するに充分な条
    件下でさらにインキュベートし、ついで （Ｆ）工程Ｅの該第一オリゴヌクレオチドが標識された
    か否かを決定し、その際、標識オリゴヌクレオチドの存
    在は該前以て選択した部位の該ヌクレオチドの同一性が
    該デオキシヌクレオシド三リン酸混合物のデオキシヌク
    レオシド三リン酸に相補的であることを示す からなることを特徴とする方法。
  25. 【請求項２５】一本鎖標的核酸分子中の前以て選択した
    単一ヌクレオチド部位に存在するヌクレオチドの同一性
    を決定する方法であって、該方法は該標的分子にハイブ
    リダイズすることができる第一オリゴヌクレオチドおよ
    び第二オリゴヌクレオチドとの少なくとも２つの成員を
    有するオリゴヌクレオチドのセットを用い、工程： （Ａ）該標的分子を該オリゴヌクレオチドのセットの存
    在下でインキュベートし、その際、該セットの該第一オ
    リゴヌクレオチドは、ハイブリダイズした第一オリゴヌ
    クレオチドの３′末端が該前以て選択した部位にすぐに
    隣接するように該標的分子の第一の領域にハイブリダイ
    ズするプライマーオリゴヌクレオチドであり、該セット
    の該第二オリゴヌクレオチドは、ハイブリダイズした第
    二オリゴヌクレオチドの５′末端が該ハイブリダイズし
    た第一オリゴヌクレオチドの３′末端から該前以て選択
    した部位の位置にて単一のヌクレオチドの空隙により隔
    てられるように、該標的分子の第二の領域にハイブリダ
    イズし、 （Ｂ）該ハイブリダイズした分子をポリメラーゼ、およ
    びジデオキシヌクレオシド三リン酸種と一つのデオキシ
    ヌクレオシド三リン酸種とからなるヌクレオシド三リン
    酸混合物の存在下、該前以て選択した部位のヌクレオチ
    ドの同一性にかかわらず、鋳型依存でポリメラーゼ媒体
    された伸長反応が起こり、該前以て選択した部位のヌク
    レオチドに相補的な該ヌクレオシド三リン酸混合物のヌ
    クレオシド三リン酸種が該ハイブリダイズした第一オリ
    ゴヌクレオチドの３′末端に組み込まれるようにインキ
    ュベートし、それによって該ハイブリダイズした第一オ
    リゴヌクレオチドと第二オリゴヌクレオチドとの間の空
    隙を充填させ、該オリゴヌクレオチドを隣接させ、 （Ｃ）該ハイブリダイズした分子をリガーゼの存在下、
    該ヌクレオシド三リン酸混合物のデオキシヌクレオシド
    三リン酸種が該ハイブリダイズした第一オリゴヌクレオ
    チドの３′末端に組み込まれていた場合には、隣接する
    ハイブリダイズした第一および第二オリゴヌクレオチド
    をリガーゼによりライゲートさせ、それによってライゲ
    ーション生成物を生成するのに充分な条件下でインキュ
    ベートし、ついで （Ｄ）ライゲーション生成物が生成したか否かを決定す
    る ことを特徴とする方法。
  26. 【請求項２６】該デオキシヌクレオシド三リン酸種が第
    一の標識を含む、請求項25に記載の方法。
  27. 【請求項２７】該第一オリゴヌクレオチドまたは第二オ
    リゴヌクレオチドの少なくとも一方が第二の標識を含
    む、請求項26に記載の方法。
  28. 【請求項２８】該第一オリゴヌクレオチドまたは第二オ
    リゴヌクレオチドの少なくとも一方が標識を含む、請求
    項25に記載の方法。
  29. 【請求項２９】組み込まれたデオキシヌクレオチド種を
    該第一の標識を介して固相上に固定化する工程、および
    該ライゲーション生成物を、該第一オリゴヌクレオチド
    にライゲートしなかった第二オリゴヌクレオチドをイン
    キュベーションから除去するのに充分な条件下で該ライ
    ゲーション生成物をインキュベートする工程をさらに含
    む、請求項27に記載の方法。
  30. 【請求項３０】該工程Ｄが、該ライゲーション生成物が
    固定化されたか否かを決定することを含む、請求項27に
    記載の方法。
  31. 【請求項３１】該第一の標識が、放射性標識、蛍光標
    識、生物発光標識、化学ルミネセンス標識、核酸標識、
    ハプテン標識および酵素標識よりなる群から選ばれたも
    のである、請求項26に記載の方法。
  32. 【請求項３２】該標識が、放射性標識、蛍光標識、生物
    発光標識、化学ルミネセンス標識、核酸標識、ハプテン
    標識および酵素標識よりなる群から選ばれたものであ
    る、請求項28に記載の方法。
  33. 【請求項３３】該第一の標識が、蛍光標識、核酸標識、
    ハプテン標識および酵素標識よりなる群から選ばれたも
    のである、請求項30に記載の方法。
  34. 【請求項３４】該第二の標識が、放射性標識、蛍光標
    識、生物発光標識、化学ルミネセンス標識、核酸標識、
    ハプテン標識および酵素標識よりなる群から選ばれたも
    のである、請求項27に記載の方法。
  35. 【請求項３５】該第二の標識がビオチンである、請求項
    34に記載の方法。
  36. 【請求項３６】該第一の標識または第二の標識の少なく
    とも一方が蛍光標識である、請求項27に記載の方法。
  37. 【請求項３７】該リガーゼが熱安定リガーゼである、請
    求項25に記載の方法。
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