JP3424504B2 - ヒアルロン酸結合タンパク質又はヒアルロン酸の測定方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明はヒアルロン酸結合タ
ンパク質又はヒアルロン酸の測定方法及びそれに用いる
試薬キットに関する。

【０００２】

【従来の技術】担体粒子を用いるイムノアッセイは周知
であり、イムノアッセイの市場の相当の部分を構成して
いる。これは、担体粒子を用いたイムノアッセイが非常
に用途が広く、単純な目視による検出を要する試験に
も、測定装置を用いた定量的な分析方法にも使用する事
ができるためである。この担体粒子を用いるイムノアッ
セイとしては、たとえば抗体又は抗原をラテックス粒子
に結合させ、それぞれ抗原又は抗体を検出するラテック
ス免疫凝集法が知られている。

【０００３】このラテックス免疫凝集法及びそれに用い
る装置は、例えば、「実験免疫学ハンドブック」第１〜
４巻、ブラックウェル・サイエンティフィック（１９８
７）、米国特許第3,088,875号、第3,857,931号、第3,99
2,517号、第4,080,264号、第4,174,952号、第4,203,724
号、第4,480,042号、第4,590,156号、第4,690,906号、
第4,716,123号、第4,772,550号、第4,851,329号及び第
5,100,805号、Grange,J. et al., J. Immunol. Method
18, 365, 1977、Hechemy, K. et al., Lab. Management
27, Jun-Jul, 1984、Looney, C., J. Clin. Immuassay
7, 90, 1984、Von Schulthes, G. et al., Mol. Immun
ol. 1, 81, 1980、Crain, J., Am. Biotech. Lab. 34,
May-Jun, 1987、Heveran, J., J. Forensic Sci. 470,
1977、Kuruma, H., J. Immunol. Method 38, 353, 1980
等に詳述されている。

【０００４】上記の通り、担体粒子を用いるイムノアッ
セイは広く用いられている公知技術であるが、従来のラ
テックス凝集法は、本発明者等の知る限り、抗原−抗体
反応に由来したラテックスの免疫凝集反応によるものに
限られていた。ところで、ヒアルロン酸は、Ｎ−アセチ
ルグルコサミンとグルクロン酸が交互にβ−１，４結合
により重合した酸性ムコ多糖類であり、皮下組織を接合
させる作用を有し、臍帯、関節腔の滑液および眼の硝子
体に含まれている。

【０００５】ヒアルロン酸は、肝疾患（A. E. Laurent
et al., Hepatology 5, 638-642, 1985）、リウマチ性
関節炎（T. C. Laurent et al., Ciba Foundation Symp
osium124, 9-29, 1986）などの繊維化をともなう疾患に
おいて上昇するとの報告があり、血中ヒアルロン酸濃度
の測定は、肝疾患及び慢性関節リウマチの病態把握に有
用である。すなわち、ヒアルロン酸は、肝臓の繊維化に
ともなう合成亢進と肝類洞内皮細胞の機能低下による分
解障害を反映するマーカーである。また、強皮症や癌な
どにおいてもその血中濃度変化と病態との相関が指摘さ
れている（B. Delpech et al., Anal. Biochem. 149, 5
55-565, 1985）。

【０００６】従来、ヒアルロン酸の測定方法として、放
射性ヨウ素を付加したヒアルロン酸結合タンパク質を用
いる放射線分析法（RIA; U. B. G. Laurent et al., An
al.Biochem. 109, 386-394, 1980）、ヒアルロネクチン
を利用した酵素分析法（EIA;A. E. Laurent et al., He
patology 5, 638-642, 1985）、あるいはパーオキシダ
ーゼで標識されたヒアルロン酸結合タンパク質を用いた
サンドイッチ法を基にした酵素免疫分析法の変法（ELIS
A; 特開昭６４−４６９号、近藤孝司ら、臨床病理 第３
６巻（５）、536-540、1991）が知られている。

【０００７】しかしながら、ＲＩＡ及びＥＩＡはともに
競合反応を利用した方法であり、ヒアルロン酸の測定感
度がせいぜい４０ｎｇとあまり高くない。またＲＩＡで
は放射性元素の使用、サンプルの不安定性、相当な試薬
の調製、高価な測定装置などいくつかの欠点を有し、臨
床検査に応用するのは容易ではない。さらにＥＩＡで
は、ヒト脳由来のヒアルロネクチンを使用しているため
試薬の調製に困難がともなう。また、測定に関しては全
工程を終了するのに１日以上を要するため、臨床検査へ
の応用は容易ではない。ＥＬＩＳＡでは、測定感度と特
異性の向上は認められるものの、供される試薬数が多く
操作も煩雑で、１回の測定に３時間強の時間を要するも
のである。

【０００８】このため、従来よりも操作が簡便で、しか
も高感度かつ短時間で測定可能なヒアルロン酸の測定方
法が要望されていた。

【０００９】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、感度及び特
異性が高く、操作が簡便であり、短時間で測定可能なヒ
アルロン酸結合タンパク質又はヒアルロン酸の測定方法
の提供を目的としてなされたものである。

【００１０】

【課題を解決するための手段】本発明者等は、上記課題
を達成すべく鋭意検討した結果、ヒアルロン酸結合タン
パク質を担体粒子に担持し、これと試料中のヒアルロン
酸とを反応せしめ、反応混合物の吸光の変化を検出すれ
ば、精度が高く且つ簡便に試料中のヒアルロン酸が測定
可能なことを見いだした。本発明は、これらの知見に基
づいて成し遂げられたものである。

【００１１】即ち本発明は、ヒアルロン酸結合タンパク
質又はヒアルロン酸を担体粒子に担持させ、この担持さ
れたヒアルロン酸結合タンパク質又はヒアルロン酸と、
試料中のヒアルロン酸又はヒアルロン酸結合タンパク質
とを反応せしめ、該反応混合物に光を照射して反応混合
物の吸光又は散乱光の変化を検出することを特徴とする
ヒアルロン酸結合タンパク質又はヒアルロン酸の測定方
法である。この発明の好ましい態様によれば、ヒアルロ
ン酸結合タンパク質が、プロテオグリカン、リンクプロ
テイン及びヒアルロネクチンよりなる群から選ばれる上
記方法が提供される。

【００１２】更に、本発明によれば、少なくとも、ヒア
ルロン酸結合タンパク質又はヒアルロン酸が担持された
担体粒子よりなり、この担持されたヒアルロン酸結合タ
ンパク質又はヒアルロン酸と、試料中のヒアルロン酸又
はヒアルロン酸結合タンパク質とを反応せしめ、該反応
混合物に光を照射して反応混合物の吸光又は散乱光の変
化を検出することを特徴とするヒアルロン酸結合タンパ
ク質又はヒアルロン酸を測定するために用いる試薬キッ
トが提供される。

【００１３】この発明の好ましい態様によれば、ヒアル
ロン酸結合タンパク質又はヒアルロン酸が担持された担
体粒子を含有する試薬と、緩衝剤、塩化ナトリウム、多
糖類及び血清アルブミンを含有する試薬とからなる上記
試薬キットが提供される。

【００１４】

【発明の実施の形態】以下、本発明を更に詳細に説明す
る。本発明は、上記の通り、抗原抗体反応によらずヒア
ルロン酸結合タンパク質とヒアルロン酸との特異的な結
合能を利用した、ヒアルロン酸結合タンパク質とヒアル
ロン酸との反応に基づく濁度の変化を吸光又は散乱光の
変化として検出するヒアルロン酸結合タンパク質又はヒ
アルロン酸の測定方法である。

【００１５】測定に際しては、上記ヒアルロン酸結合タ
ンパク質又はヒアルロン酸のどちらか一方を担体粒子に
担持して用いられる。即ち、測定対象物がヒアルロン酸
結合タンパク質である場合はヒアルロン酸を、測定対象
物がヒアルロン酸である場合はヒアルロン酸結合タンパ
ク質を、それぞれ担体粒子に担持して用いる。本発明に
おいては、ヒアルロン酸結合タンパク質を担体粒子に担
持し、ヒアルロン酸を測定対象とするのが最も好まし
い。すなわち、ヒアルロン酸結合タンパク質を担体粒子
に担持させ、この担持されたヒアルロン酸結合タンパク
質と、試料中のヒアルロン酸とを反応せしめ、該反応混
合物に光を照射して反応混合物の吸光又は散乱光の変化
を検出することによりヒアルロン酸を測定することがで
きる。ここで、ヒアルロン酸結合タンパク質としては、
ローレント（A. E. Laurent）らにより精製されたプロ
テオグリカン、リンクプロテイン（Analytical Biochem
istry 109, 386-394, 1980）や、ヒアルロネクチン（He
patology 5, 638-642, 1985）などが挙げられる。

【００１６】上記担体粒子としては、ヒアルロン酸結合
タンパク質又はヒアルロン酸を担持しうるものであれば
特に制限はなく如何なるものも使用できるが、通常、試
料溶液に不溶性の有機高分子物質又は無機物質の微粒子
が使用される。かかる微粒子としては、ポリスチレン、
スチレン−ブタジエン共重合体、ポリアクリル酸エステ
ル、ポリメタクリル酸エステルなどの合成有機高分子物
質よりなるラテックス粒子；赤血球、バクテリア、細胞
片等の天然有機高分子物質；ガラス、シリカ、アルミ
ナ、シリカ−アルミナ、活性炭、カーボン等の無機物質
等が例示できる。

【００１７】担体粒子の粒径及び該粒子へのヒアルロン
酸結合タンパク質又はヒアルロン酸の担持量等は、特に
制限されないが、例えば、担体粒子がラテックス粒子で
ある場合、平均粒径０．０５〜１．０μｍのものを使用
し、０．１〜１重量％ラテックスに対してヒアルロン酸
結合タンパク質又はヒアルロン酸を０．１〜１ｍｇ／ｍ
ｌの範囲で担持させればよい。また、担持は、担体粒子
へヒアルロン酸結合タンパク質又はヒアルロン酸を物理
的に吸着、又はそれ自体既知の通常用いられる方法によ
り化学的に結合させれば良い。

【００１８】担体粒子として、表面にカルボキシレート
基を有するラテックス粒子を用いる場合、０．１〜０．
６μｍの直径および８〜３５平方オングストロームの表
面カルボキシレート占有領域を有するものが適してい
る。ここで、使用する「表面カルボキシレート占有領域
（Surface carboxylate parking area）」という用
語は、平方オングストロームで測定したラテックス粒子
の表面積を、その表面上のカルボン酸（−ＣＯＯＨ）お
よびカルボキシレート（−ＣＯＯ-）官能基の総数で除
した値を示す。また、「カルボキシレート基」とは、−
ＣＯＯＨ及び−ＣＯＯ-両方の官能基を表す。

【００１９】表面にカルボキシレート基を有するラテッ
クス粒子としては、乳化重合、核剤を使用した乳化重
合、および好ましくは懸濁重合等を含む当業界で一般的
に知られたいずれの技術によっても製造することができ
るカルボキシレート基を有する重合体又は共重合体から
なる粒子を示す。また、製造に際しては、架橋剤を用い
ても用いなくてもよい。さらに、ここでいうラテックス
粒子として、コア−シェル型の粒子も含む。表面に十分
なカルボキシレート基を有するものであれば、いずれの
重合体粒子を使用することができる。特に有用なコア粒
子としては、既にカルボキシレート基を有するＣ1〜Ｃ6
−、好ましくはＣ1〜Ｃ2−（メタ）アクリレート、カル
ボキシレート基を導入したポリスチレン、およびアクリ
ル酸とスチレン単量体との混合物から製造されるものが
挙げられる。

【００２０】ヒアルロン酸結合タンパク質又はヒアルロ
ン酸を担体粒子に担持させる際、該担体粒子の表面上に
は、さらにタンパク質又はリガンド等の他の分子種が固
着しうる表面部分が存在し、測定すべき試料を添加した
際に試料中に含まれる測定対象物やその他の血中成分な
どが固着するおそれがある。このため、担持の際にヒア
ルロン酸結合タンパク質又はヒアルロン酸が固着してい
ない部分を被覆しておくことが好ましい。本発明におい
ては、上記のようにして得られたヒアルロン酸結合タン
パク質又はヒアルロン酸が担持された担体粒子の保存安
定性をさらに向上させ、測定の精度を向上させるため
に、上記担体粒子、例えばラテックス粒子をブロッキン
グ剤で処理するのが好ましい。ブロッキング剤として
は、通常、ウシなどから容易に入手できる血清アルブミ
ン、γ−グロブリン、フィブリノーゲン、血清等；合成
ペプチド類等が使用できる。ブロッキング剤の濃度は、
通常０．０１〜２％、好ましくは０．１〜０．５％が適
当である。

【００２１】ブロッキング剤による処理は、例えば、ヒ
アルロン酸結合タンパク質又はヒアルロン酸が担持され
たラテックス粒子浮遊液を遠心分離して上清を除き、得
られる沈殿物を上記ブロッキング剤で、通常、数分間か
ら数時間程度攪拌下に処理する。ついで遠心分離し、上
清を除き、得られたラテックス粒子を緩衝液に浮遊させ
て、目的とするラテックス試薬（浮遊液）を得る。この
際に用いられる緩衝液としては特に制限がなく、例えば
ｐＨ５〜１０程度のリン酸、ホウ酸系等の緩衝液が挙げ
られる。

【００２２】かくして得られるヒアルロン酸結合タンパ
ク質又はヒアルロン酸を担持させた担体粒子と、血液や
体液等の試料溶液とを混合し、試料中のヒアルロン酸結
合タンパク質又はヒアルロン酸とを反応せしめ、該反応
混合物に光を照射して凝集反応に基づく吸光又は散乱光
の変化を検出し、試料中のヒアルロン酸結合タンパク質
又はヒアルロン酸の存在又は濃度を測定する。上記反応
は、好ましくは水を基材とし、塩化ナトリウムを含有す
るｐＨ４．５〜１０、好ましくはｐＨ５．５〜９．５の
緩衝液中で行われる。緩衝液中に存在する塩化ナトリウ
ムの量は１．０〜５．０重量％、好ましくは１．５〜
４．５重量％、最も好ましくは２．０〜４．０重量％で
ある。また、本発明で用いる緩衝液としては、それ自体
既知の通常用いられるｐＨ緩衝剤が挙げられる。尚、こ
こで「緩衝剤」という用語は、酸またはアルカリを添加
した際に水素イオン濃度の変化に抵抗する単一の物質ま
たは複数の物質の組み合わせを意味する。そのような緩
衝剤の例としては、トリス−（ヒドロキシメチル）−ア
ミノメタン、リン酸緩衝剤、ピアスの「免疫技術カタロ
グおよびハンドブック」等に列記されたもの等が含まれ
る。尚、前記および後記の緩衝液中の各成分の重量％
は、緩衝液の全重量を基準としたものである。

【００２３】本発明で用いる緩衝液は、デキストラン硫
酸ナトリウム、メチルセルロース等の少なくとも１つの
多糖類をも含むことが好ましい。その他、カルボキシメ
チルセルロース、デキストラン等の多糖類を含有してい
てもよい。緩衝液中に含有する多糖類の量、例えば、デ
キストラン硫酸ナトリウムの量は、好ましくは０．２〜
３．０重量％、より好ましくは０．６〜２．０重量％、
最も好ましくは１．０〜１．８重量％、メチルセルロー
スの量は、好ましくは０．０５〜１．０重量％、より好
ましくは０．１〜０．４重量％、最も好ましくは０．１
５〜０．３重量％程度が適当である。

【００２４】さらに、上記緩衝液には、血清アルブミ
ン、好ましくは脂肪酸を実質的に含有しない脂肪酸非含
有血清アルブミンを含有するのが好ましい。脂肪酸非含
有血清アルブミンは、例えば、R. J. Chen, Biol. Che
m., 242, 173 (1967)に記載された方法によって調製す
ることができ、また、シグマ社およびマイルス社から種
々の分子種および等級で購入することができる。また、
ヒト、ウシ、ウサギ、ヒツジ等の血清アルブミンも使用
することができる。このうち脂肪酸非含有ウシ血清アル
ブミンが最も好ましい。また、脂肪酸を含有せずグロブ
リンを含有しない血清アルブミンも好適である。緩衝液
中の血清アルブミンの量は、緩衝液の全容量を基準とし
て５〜１００ｍｇ／ｍＬ、好ましくは７．５〜６０ｍｇ
／ｍＬ、最も好ましくは１０〜４０ｍｇ／ｍＬ程度が適
当である。

【００２５】前記凝集反応は、通常、プラスチック又は
ガラスセル内で行い、セル外部より波長４４０〜１００
０ｎｍから選ばれる適当な波長の光又は白色光を照射
し、吸光度の変化又は散乱光の強度を測定することによ
り、予め作成した検量線から試料溶液内のヒアルロン酸
結合タンパク質又はヒアルロン酸が算出できる。次に、
試料中のヒアルロン酸濃度の測定方法について具体的に
説明する。

【００２６】まず、それ自体既知の通常用いられる方法
により、ヒアルロン酸結合タンパク質を精製し、該タン
パク質を担体粒子の表面に結合する。ヒアルロン酸結合
タンパク質は、担体粒子あたり８００から１，５００個
となるように適当な緩衝液、例えば０．０１〜０．５Ｍ
ホウ酸緩衝液（ｐＨ８．０）等に溶解し、当量のラテッ
クス−ホウ酸緩衝液（ｐＨ８．０）と室温で１時間攪拌
し、ラテックス粒子上に担持する。

【００２７】次いで、反応容器内に分注した前記の反応
用緩衝液に、試料を添加する。この際、試料はヒアルロ
ン酸が抽出分離されている必要はなく、人体などの血液
や体液をそのまま使用できる。あるいは適当な試料希釈
用緩衝液や希釈血清で試料を溶解したものを、上記の操
作に供する事もできる。その後、上記ヒアルロン酸結合
タンパク質が担持されたラテックス試薬（浮遊液）を反
応容器内に分注する。

【００２８】次に、ラテックス試薬（浮遊液）分注後、
担持されたヒアルロン酸結合タンパク質と試料中のヒア
ルロン酸との間の結合反応（凝集反応）の速度を吸光の
増加として測定し、この結合反応の速度からヒアルロン
酸を定量する。この際、反応容器内におけるラテックス
試薬の凝集は、測定対象物であるヒアルロン酸のみに起
因しており、生化学的もしくは物理的な要因を問わず断
片化された成分すなわちヒアルロン酸結合タンパク質に
対して複数の結合サイトを持たないものはラテックス粒
子の凝集の原因とはなりえない。

【００２９】従って、担持されたヒアルロン酸結合タン
パク質と試料中のヒアルロン酸とに起因するラテックス
粒子の凝集による吸光の増加を測定することで、上記ラ
テックス粒子の凝集に関与しうる試料中ヒアルロン酸の
みが定量される。本発明の方法では、あらかじめ使用す
る測定対象物のヒアルロン酸について、既知濃度の試料
を用意し、吸光の増加速度と該既知濃度の関係について
検量線を作成しておき、測定値を校正可能とすることが
好ましい。

【００３０】上記反応及び測定工程等を含むヒアルロン
酸結合タンパク質又はヒアルロン酸の存在または濃度を
測定するために用いる試薬キットは、それ自体既知の通
常用いられる方法により調製できる。このようなキット
は、通常の免疫凝集反応を利用した試薬キットと同様の
構成によって提供される。すなわち、これらの試薬に
は、前記したヒアルロン酸結合タンパク質又はヒアルロ
ン酸が担持された担体粒子と、緩衝剤、塩化ナトリウ
ム、血清アルブミン、デキストラン硫酸ナトリウムまた
はメチルセルロースのような多糖類を含む緩衝液が含ま
れる。

【００３１】また、本発明では、一方に前記したヒアル
ロン酸結合タンパク質又はヒアルロン酸が担持された担
体粒子を含有し、他方に緩衝剤を含有する２つの収容手
段を備えるキットも提供される。収容手段としては、あ
らゆる手段を使用することができ、これには、例えばバ
イアル、ジャー、チューブ、ボトル、ホイルパック等が
含まれる。また開閉可能なように封止した容器および封
止していない容器のいずれをも使用することができる。
収容手段および封止手段は、ガラス、プラスチック、金
属、複合材料等のあらゆる材料から製造することができ
る。

【００３２】すなわち、本発明のキットは、好ましくは
ヒアルロン酸結合タンパク質又はヒアルロン酸が担持さ
れた担体粒子と、専用に調製された緩衝剤、塩化ナトリ
ウム、多糖類及び血清アルブミンを含有する反応用緩衝
液とからなる２試薬で構成され、さらに任意の要素とし
て、試料希釈液、洗浄液、標準物質（ヒアルロン酸結合
タンパク質又はヒアルロン酸）、防腐剤、消泡剤等を含
む試薬により構成される。

【００３３】

【実施例】以下、実施例により、さらに本発明を詳細に
説明するが、本発明は以下の実施例に何ら限定されるも
のではない。 参考例１ ヒアルロン酸結合タンパク質の精製 ローレントら（A. E. Laurent et al., Anal. Biochem.
109, 386-394, 1980）に記載の方法に従って、以下通
りヒアルロン酸結合タンパク質を抽出、精製した。

【００３４】まず、牛の鼻中隔軟骨３００ｇ（三菱化学
（株）中標津事業所より入手）をハサミ及びナタによっ
て小片に切断し、あらかじめ４℃に保持された塩酸グア
ニジン４Ｍを含む酢酸ナトリウム０．５Ｍ溶液（ｐＨ
５．８）（以下これを「緩衝液Ａ」と称する）に投入し
て４℃に保持したまま一夜攪拌抽出した。次いで、１
３，０００Ｇ、４℃にて４５分間遠心分離した後、上清
液を分離採取した。上清液を精製水に透析させた後、凍
結乾燥し、得られた固形分を粉砕して粗抽出粉末を得
た。

【００３５】粗抽出粉末１．６ｇとトリプシン（シグマ
社製）０．８ｍｇとを酢酸ナトリウム０．１Ｍを含む
０．１Ｍトリス−塩酸緩衝溶液（ｐＨ７．３）２５ｍｌ
中に加え、３７℃にて２時間、トリプシン処理した。次
いで、大豆トリプシン阻害剤１ｍｇ（シグマ社製）を加
え、さらに０．５Ｍの酢酸ナトリウム溶液を加えて総容
量を５０ｍＬとした。

【００３６】得られたトリプシン処理ヒアルロン酸結合
タンパク質含有溶液から、アフィニティークロマトグラ
フィーを用いて、次のようにしてヒアルロン酸結合タン
パク質を精製した。先ず、ヒアルロン酸ナトリウム６０
０ｍｇ（生化学工業）、ＥＡＨ−セファロース４Ｂ（フ
ァルマシア）７５ｍＬおよび精製水２００ｍＬの混合液
に、水溶性カルボジイミド（Ｄｏｊｉｎ）１．４ｇを溶
解した精製水５ｍＬを５回に分けて添加した後、室温に
て２４時間放置した。この反応液に酢酸１０ｍＬを加え
て反応を停止させた。得られたゲルを取り出し、それぞ
れ１Ｌの１Ｍ塩化ナトリウム水溶液、１Ｍ塩化ナトリウ
ムを含む０．１Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．１）、
０．０５Ｍギ酸水溶液（ｐＨ３．１）、精製水および
０．５Ｍ酢酸ナトリウム水溶液（ｐＨ５．７）により、
順次、ゲルを洗浄してヒアルロン酸結合セファロースゲ
ルを得た。

【００３７】次に、トリプシン処理ヒアルロン酸結合タ
ンパク質含有溶液５０ｍＬに、上記ヒアルロン酸結合セ
ファロースゲル５０ｍＬを加えて混合し、直ちに透析膜
の中に入れた後、４℃に冷却した２０倍量の精製水中で
一夜透析させた。透析後、ゲル全量を内径３．２ｃｍの
カラムに充填した後、１Ｍの塩化ナトリウム水溶液で洗
浄し、未吸着分を除去した。さらに１〜３Ｍの塩化ナト
リウム水溶液で順次洗浄して不要なタンパク質を除去し
た後、緩衝液Ａで吸着分を溶出させて回収した。回収画
分を４℃に冷却した精製水中にて一夜透析した後、凍結
乾燥した。得られた粉末を緩衝液Ａに溶解して全量を４
ｍＬとし、セファロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）６Ｂ−
ＣＬカラム（φ１．６ｘ８３ｃｍ）を通過させた。第２
および第３ピークを示す成分を回収し、それぞれ、ＤＩ
ＡＦＬＯ ＰＭ−１０（アミコン社製）で濃縮し、ヒア
ルロン酸結合タンパク質を得た。

【００３８】ここで得られたヒアルロン酸結合タンパク
質は、クリスナーら（Christner, J.D. et al., (1979)
J. Biol. Chem. 254, 4624-4630）によって同定された
プロテオグリカンと同等であり、ヒアルロン酸との結合
能を持つコアタンパク質（分子量約９万）とリンクタン
パク質（分子量約４．４万）とからなる複合体である。
コアタンパク質はヒアルロン酸と〜１μＭの結合能を持
つ。

【００３９】実施例１ 表面にカルボキシレート基を有するラテックス粒子浮遊
液（固体重量：１０ｗｔ％、直径：０．３６８μｍ、カ
ルボキシレート基量：０．３３ｍｅｑ／ｇ、セラダイン
社製）１００ｍＬに対し、２ｇのイオン交換樹脂（Bior
ad社：ＡＧ５０１−Ｘ８）を添加し、緩く撹拌しながら
室温で２時間静置した。その後ガラス繊維フィルターを
使用して浮遊液を濾過し樹脂を除去した。これによって
ラテックス粒子をタンパク質又はリガンドと結合しうる
状態とした。５ｍＬのポリカーボネート製遠心チューブ
に対し、１ｍＬの５０ｍＭ ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ７．
０）および１００μＬの前記洗浄した１０％固体ラテッ
クス浮遊液を添加し、撹拌しながら室温で１０分間イン
キュベートした後、反応させた。１０ｍｇ／ｍＬの１−
エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボ
ジイミド塩酸塩（ＥＤＣ、新たに水に溶解したもの）を
混合物に５０μＬ添加し、ラテックス表面のカルボキシ
ル残基を１０分間活性化した。活性化の後に、１ｍｇ／
ｍＬの前記精製したヒアルロン酸結合タンパク質を激し
く撹拌しながら４００μＬ添加し、１時間インキュベー
トした。１０ｍｇ／ｍＬウシ血清アルブミン水溶液を３
００μＬ添加することにより反応を停止し、ラテックス
表面上のヒアルロン酸結合タンパク質が結合（担持）さ
れていない領域を被覆した。さらに１０分間インキュベ
ートして反応を停止させた。

【００４０】次いで、ヒアルロン酸結合タンパク質が担
持されたラテックス粒子浮遊液を２５，０００Ｇで１０
分間遠心分離した。上清を除去し、容器底部のペレット
に２ｍＬの水を添加した。その後激しく撹拌しながらペ
レットを再浮遊させ、同様の洗浄操作を４回繰り返し
た。ただし、最後の再浮遊では、０．０５％のアジ化ナ
トリウム水溶液を保存液として使用した。最後に、ラテ
ックス浮遊液を超音波処理する事によって完全に浮遊さ
せた後、直ちに使用できる濃度（通常は、０．１〜０．
４ｗ／ｖ％）に希釈した。

【００４１】上記で調製したヒアルロン酸結合タンパク
質が担持されたラテックス試薬を用いて 、ヒアルロン
酸標準品の濃度を０、２０、６０、２００、６００ｎｇ
／ｍｌとした場合についてそれぞれ試料を作成し、全自
動免疫診断システム（ＬＰＩＡ−Ｓ５００：三菱化学
（株）製）による測定に供した。検体溶液１０μＬを反
応容器に分注し、さらに専用に調製された反応用緩衝液
（２００ｍＭのトリス−（ヒドロキシメチル）−アミノ
メタン、０．９％のＮａＣｌ、１％のデキストラン硫酸
ナトリウム、０．５％のウシ血清アルブミン、０．０５
％のアジ化ナトリウム、０．００５％の消泡剤（ダウ・
コ−ニング社製：１４１０）を水に溶解し、塩酸でｐＨ
を８．２に調製し作成）１８０μＬと精製水７０μＬを
加え全体を２６０μＬとする。上記で得られたラテック
ス試薬（浮遊液）は、上記装置で自動的に４０μＬ
（０．２％ラテックス浮遊液）供され、合計３００μＬ
のラテックス浮遊液の生化学的に特異な結合反応による
吸光度の変化を経時的に測定した。その変化量（反応速
度）に応じて、既知濃度の標準品で検量線を作成した。

【００４２】得られた結果を図１に示す。これより、本
発明の測定方法によれば１０ｎｇのオーダーのヒアルロ
ン酸の検出および測定が可能であることがわかる。

【００４３】実施例２ 従来法の標識されたヒアルロン酸結合タンパク質を用い
たサンドイッチ法（ＥＬＩＳＡ）による高値検体（中外
製薬（株）社製キットを用いて測定）を用いて、実施例
１の方法によりヒアルロン酸濃度の測定を行った。得ら
れた結果を図２に示す。これにより、本発明の測定方法
によれば高値検体についても従来法と矛盾することのな
い結果が得られることがわかった。

【００４４】

【発明の効果】本発明によれば、免疫反応（抗原抗体反
応）によらず、ヒアルロン酸結合タンパク質又はヒアル
ロン酸を、感度及び特異性が高く、操作が簡便で、短時
間で測定できる。特に、本発明の方法により、競合反応
を用いずとも精度高くヒアルロン酸が測定可能である。
即ち、予め精製したヒアルロン酸を必要とせず、しかも
操作が簡便であり、１０ｎｇという極めて微量のヒアル
ロン酸の検出および定量が可能である。また、本発明の
方法は、サンプルの予備処理の必要がなく、かつ予め調
製された２試薬によって構成されるので臨床化学の分野
で使用される市販の自動分析装置にも適合するものであ
る。

【図面の簡単な説明】

【図１】 本発明のヒアルロン酸の測定方法により得ら
れたヒアルロン酸濃度と反応速度との関係を示す図（検
量線）である。

【図２】 従来法である標識されたヒアルロン酸結合タ
ンパク質を用いたサンドイッチ法（ＥＬＩＳＡ）との、
高値検体における相関を示すグラフである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 特開 昭64−469（ＪＰ，Ａ) 特開 平８−101198（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) G01N 33/543 587 G01N 33/557 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (4)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ヒアルロン酸結合タンパク質又はヒアル
   ロン酸を担体粒子に担持させ、この担持されたヒアルロ
   ン酸結合タンパク質又はヒアルロン酸と、試料中のヒア
   ルロン酸又はヒアルロン酸結合タンパク質とを反応せし
   め、該反応混合物に光を照射して反応混合物の吸光又は
   散乱光の変化を検出することを特徴とするヒアルロン酸
   結合タンパク質又はヒアルロン酸の測定方法。
2. 【請求項２】 ヒアルロン酸結合タンパク質が、プロテ
   オグリカン、リンクプロテイン及びヒアルロネクチンよ
   りなる群から選ばれる請求項１に記載の方法。
3. 【請求項３】 少なくとも、ヒアルロン酸結合タンパク
   質又はヒアルロン酸が担持された担体粒子よりなり、こ
   の担持されたヒアルロン酸結合タンパク質又はヒアルロ
   ン酸と、試料中のヒアルロン酸又はヒアルロン酸結合タ
   ンパク質とを反応せしめ、該反応混合物に光を照射して
   反応混合物の吸光又は散乱光の変化を検出することを特
   徴とするヒアルロン酸結合タンパク質又はヒアルロン酸
   を測定するために用いる試薬キット。
4. 【請求項４】 ヒアルロン酸結合タンパク質又はヒアル
   ロン酸が担持された担体粒子を含有する試薬と、緩衝
   剤、塩化ナトリウム、多糖類及び血清アルブミンを含有
   する試薬とからなる請求項３に記載の試薬キット。