CN108362686A - 一种测定透明质酸的试剂盒及其制备使用方法 - Google Patents
一种测定透明质酸的试剂盒及其制备使用方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种测定透明质酸的试剂盒，包括彼此独立的试剂R1和试剂R2双液体组分，试剂R1包括：MES缓冲液、TWEEN 20、PEG‑8000、NaCl，溶剂为纯化水；试剂R2包括：MES缓冲液、EDC、乳胶微球、透明质酸结合蛋白、BSA，溶剂为纯化水。本发明还公开了一种测定透明质酸的试剂盒的制备和使用方法。本发明相比现有技术的优点在于：(1)操作简单、使用方便、成本低、无污染；(2)可应用于全自动生化分析仪上，适合全自动测试；(3)检测时间仅需10min；(4)首创式的利用透明质酸结合蛋白的特异性结合的特性，联合蛋白与微球偶联的反应放大技术，极大的提高了检测的准确性和特异性。
Description
技术领域
本发明涉及医学及生物化学技术领域，尤其涉及一种适用于全自动生化分析的测定透明质酸的试剂盒及其制备使用方法。
背景技术
透明质酸是一种酸性粘多糖，1934年美国哥伦比亚大学眼科教授Meyer等首先从牛眼玻璃体中分离出该物质。透明质酸以其独特的分子结构和理化性质在机体内显示出多种重要的生理功能，如润滑关节、调节血管壁的通透性、调节蛋白质、水电解质扩散及运转、促进创伤愈合等。尤为重要的是，透明质酸具有特殊的保水作用，是目前发现的自然界中保湿性最好的物质，被称为理想的天然保湿因子(Natural moisturizing factor，NMF)，例如：2％的纯透明质酸水溶液能牢固地保持98％水分。
透明质酸HA广泛分布于人体各部位。血清透明质酸水平主要反映肝脏内皮细胞功能及受损程度：
1、肝硬化：病程长，肝组织纤维化变性程度严重，血清透明质酸水平明显增高，甚至达1000μg/L以上，主要因为肝硬化时门-腔静脉分流，携透明质酸的体循环血进入肝脏分解代谢减少；肝组织受损，肝内皮细胞数量减少，代谢功能降低；肝硬化时透明质酸增高水平与肝组织病理改变程度有密切关系；
2、慢性活动性肝炎和慢性迁延性肝炎：血清透明质酸水平亦有较明显改变，前者高于后者，其水平亦与肝细胞损害和肝纤维化活动程度有关。透明质酸水平达165μg/L，可作为慢性活动性肝炎和慢性迁延性肝炎的分界；
3、急性肝炎：由于肝细胞受损，坏死物质间接刺激肝脏***合成透明质酸增多，血清透明质酸水平可有轻度升高。对肝病患者而言，透明质酸总体水平依据病损和病理改变程度表现为：肝硬化>慢性活动性肝炎>慢性迁延性肝炎>急性肝炎。可见，透明质酸做作为反映肝细胞纤维化损害的指标，优于谷丙转氨酶，因为谷丙转氨酶在肝细胞停止破坏，肝内纤维化，肝硬化时反而不见升高；
4、肝癌：透明质酸亦可有明显增高；
5、慢性肾炎及慢性肾功能不全：血清透明质酸水平明显高于正常对照组，并与肌酐、尿素呈正相关。肾病时血清透明质酸可反映肾功能的损害程度。这与血中有毒代谢物聚集刺激组织***合成透明质酸增多有关；而肾透析前后透明质酸水平没有明显变化，由于透明质酸是一种大分子物质，而透析用透膜只能滤过分子量小于35000的物质，故透析法不能把透明质酸清除；透明质酸作为肾脏功能损害的一项指标，反映肾损害的程度有一定参考价值。
目前，测定血清透明质酸的方法主要有电化学发光法，放射免疫法和酶联免疫法。其中，电化学发光法的检测成本昂贵，检测周期较长，一个检测需要30min，且污染较大；放射免的操作繁琐复杂，检测是时间在30min以上，仪器昂贵，无法大规模开展，且污染较大；酶联免则基本为手工操作，检测时间为90min以上，极难大规模开展。
因此，目前急需一种操作简单、使用方便、耗时短、成本低、无污染的适用于全自动生化分析的测定透明质酸的试剂盒及其制备使用方法。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供了一种操作简单、使用方便、耗时短、成本低、无污染的适用于全自动生化分析的测定透明质酸的试剂盒及其制备使用方法。
本发明是通过以下技术方案实现的：一种测定透明质酸的试剂盒，包括彼此独立的试剂R1和试剂R2双液体组分，包括的成分及相应含量为：
试剂R1：
试剂R2：
作为本发明的优选方式之一，包括彼此独立的试剂R1和试剂R2双液体组分，包括的成分及相应含量为：
试剂R1：
试剂R2：
作为本发明的优选方式之一，包括彼此独立的试剂R1和试剂R2双液体组分，包括的成分及相应含量为：
试剂R1：
试剂R2：
作为本发明的优选方式之一，所述试剂R1的pH值为7.5。
作为本发明的优选方式之一，所述试剂R2的pH值为7.5。
一种测定透明质酸的试剂盒的制备方法，包括如下步骤：
(1)配制试剂R1
a.按照试剂R1的组分含量，将MES溶于纯化水中，搅拌均匀后，配置成R1缓冲液；
b.按照试剂R1的组分含量，将TWEEN 20溶于R1缓冲液中，搅拌均匀；再将PEG-8000和NaCl溶于其中，搅拌均匀并调节pH值，得试剂R1；
(2)配制试剂R2
a.按照试剂R2的组分含量，将MES溶于纯化水中，搅拌均匀后，配制成R2缓冲液；
b.按照试剂R2的组分含量，将EDC溶于R2缓冲液中，搅拌均匀；再将乳胶微球溶于R2缓冲液中，搅拌均匀后，室温放置12-18min；
c.按照试剂R2的组分含量，将透明质酸结合蛋白溶于上述制得的溶液中，搅拌均匀后，室温放置3-5h；
d.按照试剂R2的组分含量，将BSA溶于上述制得的溶液中，搅拌均匀后，室温放置1-2h，调节pH值，得试剂R2。
一种测定透明质酸的试剂盒的使用方法，包括如下步骤：
(1)将待测样品与试剂R1混合，37℃孵育5min；
(2)加入试剂R2，混合均匀；
(3)采用全自动生化分析仪测定加入试剂R2后的混合液的吸光度A1；
(4)300s后，采用全自动生化分析仪再测定一次混合液的吸光度A2；
(5)根据吸光度变化值计算出样本中的透明质酸的浓度。
作为本发明的优选方式之一，所述步骤(1)和步骤(2)中，试剂R1和试剂R2按照体积比4:1混合。
作为本发明的优选方式之一，所述步骤(3)和步骤(4)中，在主波长600nm处用全自动生化分析仪测定其吸光度。
作为本发明的优选方式之一，所述步骤(5)中，吸光度变化值为ΔA，即ΔA＝A2-A1。
反应原理：在缓冲体系中，透明质酸结合蛋白与乳胶微球以共价结合的方式存在，当样本中含有透明质酸时，就会被透明质酸结合蛋白快速的结合；此时，乳胶微球因为结合变会聚集形成浊度，在特定的波长下样本中透明质酸的含量与其形成的浊度成正比，通过以下公式计算出样本中透明质酸的含量：
式中：ΔAT：以空白管吸光度作对照的样品管吸光度值；
ΔAS：以空白管吸光度作对照的校准管吸光度值；
CS：校准液中HA的浓度。
本发明相比现有技术的优点在于：
(1)操作简单、使用方便、成本低、无污染；
(2)采用本发明试剂盒测定透明质酸，可应用于全自动生化分析仪上，适合全自动测试，利于大批量开展；
(3)本发明试剂盒的检测时间仅需10min，相比现有技术的30min，大大压缩了反应时间，进一步利于检测工作的大规模开展；
(4)本发明首创式的利用透明质酸结合蛋白的特异性结合的特性，联合蛋白与微球偶联的反应放大技术，极大的提高了检测的准确性和特异性。
附图说明
图1是实施例9中的本试剂盒对不同浓度样本的测定结果相关性表示图；
图2是实施例9中的本试剂盒与电化学发光试剂A检测结果对比图；
图3是实施例9中的本试剂盒检测结果的精密度测试图。
具体实施方式
下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实施例1
本实施例的一种测定透明质酸的试剂盒，包括彼此独立的试剂R1和试剂R2双液体组分，包括的成分及相应含量为：
试剂R1(pH 7.5)：
试剂R2(pH 7.5)：
实施例2
本实施例的一种测定透明质酸的试剂盒，包括彼此独立的试剂R1和试剂R2双液体组分，包括的成分及相应含量为：
试剂R1(pH 7.5)：
试剂R2(pH 7.5)：
实施例3
本实施例的一种测定透明质酸的试剂盒，包括彼此独立的试剂R1和试剂R2双液体组分，包括的成分及相应含量为：
试剂R1(pH 7.5)：
试剂R2(pH 7.5)：
实施例4
本实施例的一种测定透明质酸的试剂盒，包括彼此独立的试剂R1和试剂R2双液体组分，包括的成分及相应含量为：
试剂R1(pH 7.5)：
试剂R2(pH 7.5)：
实施例5
本实施例的一种制备上述实施例中测定透明质酸的试剂盒的方法，包括如下步骤：
(1)配制试剂R1
a.按照试剂R1的组分含量，将MES溶于纯化水中，搅拌均匀后，配置成R1缓冲液；
b.按照试剂R1的组分含量，将TWEEN 20溶于R1缓冲液中，搅拌均匀；再将PEG-8000和NaCl溶于其中，搅拌均匀并调节pH值，得试剂R1；
(2)配制试剂R2
a.按照试剂R2的组分含量，将MES溶于纯化水中，搅拌均匀后，配制成R2缓冲液；
b.按照试剂R2的组分含量，将EDC溶于R2缓冲液中，搅拌均匀；再将乳胶微球溶于R2缓冲液中，搅拌均匀后，室温放置12min；
c.按照试剂R2的组分含量，将透明质酸结合蛋白溶于上述制得的溶液中，搅拌均匀后，室温放置3h；
d.按照试剂R2的组分含量，将BSA溶于上述制得的溶液中，搅拌均匀后，室温放置1h，调节pH值，得试剂R2。
实施例6
本实施例的一种制备上述实施例中测定透明质酸的试剂盒的方法，包括如下步骤：
(1)配制试剂R1
a.按照试剂R1的组分含量，将MES溶于纯化水中，搅拌均匀后，配置成R1缓冲液；
b.按照试剂R1的组分含量，将TWEEN 20溶于R1缓冲液中，搅拌均匀；再将PEG-8000和NaCl溶于其中，搅拌均匀并调节pH值，得试剂R1；
(2)配制试剂R2
a.按照试剂R2的组分含量，将MES溶于纯化水中，搅拌均匀后，配制成R2缓冲液；
b.按照试剂R2的组分含量，将EDC溶于R2缓冲液中，搅拌均匀；再将乳胶微球溶于R2缓冲液中，搅拌均匀后，室温放置18min；
c.按照试剂R2的组分含量，将透明质酸结合蛋白溶于上述制得的溶液中，搅拌均匀后，室温放置5h；
d.按照试剂R2的组分含量，将BSA溶于上述制得的溶液中，搅拌均匀后，室温放置2h，调节pH值，得试剂R2。
实施例7
本实施例的一种制备上述实施例中测定透明质酸的试剂盒的方法，包括如下步骤：
(1)配制试剂R1
a.按照试剂R1的组分含量，将MES溶于纯化水中，搅拌均匀后，配置成R1缓冲液；
b.按照试剂R1的组分含量，将TWEEN 20溶于R1缓冲液中，搅拌均匀；再将PEG-8000和NaCl溶于其中，搅拌均匀并调节pH值，得试剂R1；
(2)配制试剂R2
a.按照试剂R2的组分含量，将MES溶于纯化水中，搅拌均匀后，配制成R2缓冲液；
b.按照试剂R2的组分含量，将EDC溶于R2缓冲液中，搅拌均匀；再将乳胶微球溶于R2缓冲液中，搅拌均匀后，室温放置15min；
c.按照试剂R2的组分含量，将透明质酸结合蛋白溶于上述制得的溶液中，搅拌均匀后，室温放置4h；
d.按照试剂R2的组分含量，将BSA溶于上述制得的溶液中，搅拌均匀后，室温放置1.5h，调节pH值，得试剂R2。
实施例8
本实施例的一种使用上述实施例中测定透明质酸的试剂盒的方法：
1、检测仪器：贝克曼AU680全自动生化分析仪。
2、待测样本：空腹采集，新鲜不溶血血清，无脂浊，2-8℃可稳定七天。
3、具体步骤：
(1)设置测定管组和空白管组，其中，测定管组：将5uL待测样品与200uL试剂R1混合，37℃孵育5min；空白管组：将5uL蒸馏水与200uL试剂R1混合，37℃孵育5min；
(2)各组中分别加入50uL试剂R2，混合均匀；
(3)采用全自动生化分析仪在主波长600nm处测定加入试剂R2后的混合液的吸光度A1；
(4)300s后，采用全自动生化分析仪在主波长600nm处再测定一次混合液的吸光度A2；
(5)根据吸光度变化值ΔA＝A2-A1，再结合计算公式计算出样本中的透明质酸的浓度。
4、计算结果：
按照如下计算公式计算：
式中：ΔAT：以空白管吸光度作对照的样品管吸光度值；
ΔAS：以空白管吸光度作对照的校准管吸光度值；
CS：校准液中HA的浓度。
5、参考值范围：20-110ug/L。
6、精密度：批内CV≤5％；批间相对极差≤10％。
7、准确度：相对偏差控制在±10％内。
8、线性范围：在5-1000ug/L范围内，相关系数r≥0.990。
本实施例采用两点终点法，反应方向向上，从开始到结束仅需10min，操作简单、使用方便、成本低、无污染、耗时短，且准确性和特异性高。
实施例9
本实施例对上述实施例中测定透明质酸的试剂盒进行具体实验数据分析。
1、参照图1，图1为根据本试剂盒对5个梯度浓度的样本的测定结果绘制出的检测结果相关性表示图，其中，X轴表示的是标准浓度，Y轴表示的是检测浓度。
结果分析：由图1可知，其相关性线性方程为y＝0.9923x-10.5，相关系数r2＝0.9996，本试剂盒检测结果相关性良好，能满足临床线性的要求。
2、参照图2，图2为基于贝克曼AU680全自动生化分析仪检测的本试剂盒与现有的电化学发光试剂A的检测结果对比图。本实验分别采用本试剂盒和电化学发光试剂A对50份样本(包含正常和异常样本)，按各自方法进行测定，并对测定值进行相关分析，图2中，X轴表示的是本发明试剂的测定值，Y轴表示的是电化学发光试剂A的测定值。
结果分析：由图2可知，其相关性线性方程为：y＝0.9468x+12.325，相关系数r2＝0.9538，本试剂盒结果准确性可靠，相关性良好，具有高度的临床符合性。
3、参照图3，图3为本试剂盒检测结果的精密度测试图。采用本试剂盒对同一样品中连续抽取20次进行测定，计算测定值的均数标准差SD和变异系数CV，其中，图3中，X轴表示的是重复次数，Y轴表示的是检测浓度。
结果分析：变异系数CV通常用于衡量一项测定方法的精密度，CV值越小，表示该测定方法的结果精密度越好；对于临床化学检验项目而言，CV小于5％的方法精密度公认是可以接受的；结合图3可知，其均值为标准差SD＝10.365，CV＝3.15％，CV值小于5％，表明本发明方法具有优良的精密度。
4、参照表1，表1为本试剂盒检测结果的准确度统计表。本实验采用本试剂盒用同一质控品，重复测定3次，取平均值，与质控品靶值相对偏差应在±10％范围内。
表1准确度统计表
结果分析：结合表1可知，相对偏差CB＝6.97％，处于±10％范围内，表明本发明方法具有优良的准确度。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种测定透明质酸的试剂盒，其特征在于，包括彼此独立的试剂R1和试剂R2双液体组分，包括的成分及相应含量为：
试剂R1：
试剂R2：
2.根据权利要求1所述的测定透明质酸的试剂盒，其特征在于，包括彼此独立的试剂R1和试剂R2双液体组分，包括的成分及相应含量为：
试剂R1：
试剂R2：
3.根据权利要求1所述的测定透明质酸的试剂盒，其特征在于，包括彼此独立的试剂R1和试剂R2双液体组分，包括的成分及相应含量为：
试剂R1：
试剂R2：
4.根据权利要求1-3任一项所述的测定透明质酸的试剂盒，其特征在于，所述试剂R1的pH值为7.5。
5.根据权利要求1-3任一项所述的测定透明质酸的试剂盒，其特征在于，所述试剂R2的pH值为7.5。
6.一种制备如权利要求1-5任一项所述的测定透明质酸的试剂盒的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)配制试剂R1
a.按照试剂R1的组分含量，将MES溶于纯化水中，搅拌均匀后，配置成R1缓冲液；
b.按照试剂R1的组分含量，将TWEEN 20溶于R1缓冲液中，搅拌均匀；再将PEG-8000和NaCl溶于其中，搅拌均匀并调节pH值，得试剂R1；
(2)配制试剂R2
a.按照试剂R2的组分含量，将MES溶于纯化水中，搅拌均匀后，配制成R2缓冲液；
b.按照试剂R2的组分含量，将EDC溶于R2缓冲液中，搅拌均匀；再将乳胶微球溶于R2缓冲液中，搅拌均匀后，室温放置12-18min；
c.按照试剂R2的组分含量，将透明质酸结合蛋白溶于上述制得的溶液中，搅拌均匀后，室温放置3-5h；
d.按照试剂R2的组分含量，将BSA溶于上述制得的溶液中，搅拌均匀后，室温放置1-2h，调节pH值，得试剂R2。
7.一种使用如权利要求1-5任一项所述的测定透明质酸的试剂盒的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将待测样品与试剂R1混合，37℃孵育5min；
(2)加入试剂R2，混合均匀；
(3)采用全自动生化分析仪测定加入试剂R2后的混合液的吸光度A1；
(4)300s后，采用全自动生化分析仪再测定一次混合液的吸光度A2；
(5)根据吸光度变化值计算出样本中的透明质酸的浓度。
8.根据权利要求7所述的测定透明质酸的试剂盒的使用方法，其特征在于，所述步骤(1)和步骤(2)中，试剂R1和试剂R2按照体积比4:1混合。
9.根据权利要求7所述的测定透明质酸的试剂盒的使用方法，其特征在于，所述步骤(3)和步骤(4)中，在主波长600nm处用全自动生化分析仪测定其吸光度。
10.根据权利要求7所述的测定透明质酸的试剂盒的使用方法，其特征在于，所述步骤(5)中，吸光度变化值为ΔA，即ΔA＝A2-A1。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20180803 |
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