JPS6057254A - 免疫学的測定法による糖脂質の定量方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は生体試料中の糖脂質を免疫学的に測定する方法
に関する。

さらに詳しくは本発明は生体試料中の糖脂質であるアシ
アロＧＭ、　、アシアロＧＭ２、フコＧＡ、およびパラ
グロボシドをそれぞれに特異的な抗体を用いて免疫学的
に定量する方法に関するものである。

日本における死亡率は癌が第−位を占めるに至り癌の早
期発見、早期治療への期待や必要性がますます高まって
いる。早期発見のためには画像診断法などの形態学的検
査と少量の体液採取による非侵襲的検査である免疫生化
学的診断法があるが、免疫化学的診断法がますます重要
な地位を占めるに至っている。現在まで癌の免疫生化学
的診断法として細胞の癌化によって著しく増量してくる
物質−腫瘍関連抗原−の検索に大きな努力が払われてお
り、α−フ二トプロテイン（α−Ｆｅｔｏｐｒｏｔｅｉ
ｎ　）や癌胎児性抗原（Ｏａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎ
ｉｃ　ａｎｔｉｇｅｎ　）などの発見およびその測定法
の開発はその大きな成果のひとつであり、臨床上実用に
供されている。しかしながら、癌の早期診断という観点
からするとこれらのマーカーは充分とは言い難いのが現
状であり、さらに新しい腫瘍関連抗原の発見とその測定
法の開発、臨床面への応用が切に望まれている。

本発明者らは細胞膜成分の一つである糖脂質に注目し、
癌細胞の糖脂質分析・代謝研究を通して糖脂質と細胞接
着性との関連を研究した結果、細胞接着性の相違を糖脂
質代謝の違いとして表わすことができた。特に細胞接着
性を消失した悪性塵の高い癌細胞においては正常細胞で
はほとんど認められない糖脂質を経由する糖脂質の生合
成経路が見い出された。すなわち細胞の癌化に伴って増
加する糖脂質として４種の異なった糖脂質があることを
知り、種々の分析により糖脂質を同定した結果、これら
はアシアロＧＭＩ　、アシアロＧＭ２、フコＧＡ、およ
びパラグロボシドであることを明らかにした。それらの
構造を下記に示す。

アシアロＧＭＩ Ｇａｌ−ＧａｌＮＡｃ−Ｇａｌ−Ｇｌｃ　−０ｅｒアシ
アロＧＭ２ ＧａｌＮＡａ−Ｇａｌ−Ｇｌｃ−ＯｅｒフコＧＡＩ Ｇａｌ−ＧａｌＮＡｃ−Ｇａｌ−Ｇｌｃ−（Ｅｅｒ■ ｕｃ パラグロボシド Ｇａ１−ＧｌｃＮＡｃ−Ｇａｌ−（）ｌｃ−ＣｅｒＧａ
ｌ　ニガラクトース　Ｇｌｃ　ニゲルコースＦｕｃ　：
フコース　Ｇａ１ＮＡｃ　：　Ｎ−アセチルガラクトサ
ミンＧｌｃＮＡｃ　：　Ｎ−アセチルグルコサミン　Ｏ
ｅｒ　：　セラミド本発明者らは、これらの糖脂質は人
癌細胞においても増量し、かつ体液中の濃度を測定する
ことにより癌の診断に極めて有用であることを知り、新
しい癌のマーカーとなることを明らかにした。

さらに体液中のこれらの糖脂質の濃度は非常に低いため
臨床診断に応用できるような微量定量はこれまで不可能
であったが、本発明者らにより高感度で精度の高い操作
の簡単なこれらの糖脂質の免疫学的測定法が確立され本
発明に至りだ。本発明における糖脂質の定量法はアシア
ロＧＭ、、７７７００Ｍ２．フコＧＡ、およびパラグロ
ボシドに対するそれぞれに特異的な抗体を用いた抗原抗
体反応を利用した免疫学的測定法である。

免疫学的測定法には、標識抗原を用いた競合反応を利用
した方法および標識抗体を用いたサンドウィッチ法とイ
ムノメトリックアッセイがある。

アシアロＧＭ、、アシアロＧＭ２、フコＧＡ１およびバ
ラグロボシドの定量のために用いる抗体は、これらの糖
脂質をこれらの糖脂質と異質の担体高分子−たとえばウ
シ血清アルブミン、メチル化ウシ血清アルブミン、赤血
球膜蛋白など−と混合したものを抗原としてヒト以外の
動物、たとえば家兎に皮内注射して産生させることがで
きる。本発明はこのようにして得られた抗体を用いて体
液中のアシアロＧＭ、、アシアロＧＭ２、フコＧＡ１お
よびバラグロボシドを免疫学的方法により定量するもの
である。以下、アシアロＧＭ、を例にとり、本発明方法
について具体的に説明する。

１　競合反応を利用したアシアロＧＭ、の定量定量すべ
きアシアロＧＭ、と一定量の標識アシアロＧＭ、とを一
定量の抗体に対して競合反応させ、次いで抗体と結合し
た標識アシアロＧＭＩと抗体と結合していない標識アシ
アロＧＭ、とを分離し、それらの分画の一方または両方
の標識剤の活性を測定してアシアロＧＭＩを定量する。

このような標識抗原を用いる競合反応を利用した定量方
法においては標識アシアロＧＭ１に代えてアシアロＧＭ
、の糖鎖部分（オリゴ糖）を標識した標識オリゴ糖を用
いて同様に競合反応を行なわせアンアロＧＭ、を定量す
ることもできる。

２　サンドウィッチ法を利用しだアシアロ０肖の定量 不溶性物質（担体）に抗体を結合させた不溶化抗体に定
量すべきアシアロＧＭ、を反応させて、抗体−アシアロ
ＧＭ、複合体を形成させ、この複合体に抗体を標識剤で
標識した標識抗体を反応させ、抗体−アシアロＧＭ、−
標識抗体のサンドウィッチ型抗原抗体複合物を生成させ
、該抗原抗体複合物上の標識剤の活性を測定してアシア
ロＧＭ　】を定量する。

３、　イムノメトリックアッセイを利用したアシアロＧ
Ｍ、の定量 （１）体液中の定量すべきアシアロＧＭ、と抗体を標識
剤で標識した標識抗体の一定量を反応させた後、不溶性
物質（担体）にアシアロＧＭ１を結合させた免疫吸着体
（Ｉｍｍｕｎｏａｄｓｏｒｂｅｎｔ　）で未反応の標識
抗体を吸着し、該免疫吸着体上の標識剤の活性を測定す
ることによりアシアロＧＭ、を定量する。

（２）定量すべきアシアロＧＭｌと一定量の抗体とを反
応させた後、不溶性物質（担体）にアシアロＧＭ１を結
合させた免疫吸着体（Ｉｍｍｕｎｏａｄｓｏｒｂｅｎｔ
　）により未反応の抗体を吸着し、次いで抗体に対する
抗−Ｔｇ（）抗体を標識剤で標識した標識抗−ＩｇＧ抗
体を上記免疫吸着体上の抗体に反応させ、該免疫吸着体
に結合した標識抗−ＩｇＧ抗体の標識剤の活性を測定し
てアジアＯＧＭ、を定量する。

これらの定量方法においては、あらかじめ体液検体の代
わりに濃度既知の標準アシアロＧＭ、を用い、同様の操
作により描いた標準曲線よりアジアＯＧＭ、の量をめる
ものである。

水沫による回収率試験の結果を表１に示した。

表１は３種類の検体に種々の既知濃度のアシアロＧＭ１
を加えて行なった回収率試験の結果を示すものである。

回収率は８２チ〜１１６チと良好な結果が得られた。

また、第７図は本法による希釈試験の結果を示したもの
であり、希釈曲線は直線性を示し良好な結果であった。

これら回収率試験および希釈試験の結果からも本法がア
シアロＧＭ、の定量法として正確度の高いものであるこ
とが理解できる。

アシアロＧＭ２．　フコＧＡＩおよびパラグロボシドの
定量も上記（１）、（２）、（３）の方法によりアシア
ロＧＭｌと同様に測定することができる。

本発明で使用される体液としては各種の体液が使用でき
、たとえば血液、膨水、腹水、尿等が挙げられる。

標識剤としては放射性物質、酵素および蛍光物質等を挙
げることができる。

アクアロＧＭ、　、アシアロＧＭ２、フコＧＡ、および
パラグロボシドあるいはこれらの糖脂質に対するそれぞ
れの抗体を不溶性物質（担体）に結合させた不溶化糖脂
質（免疫吸着体：　Ｉｍｍｕｎｏ　−ａｄｓｏｒｂｅｎ
ｔ　）あるいは不溶化抗体は、担体にこれらの糖脂質あ
るいは抗体を化学的結合または物理的吸着させることに
より製造される。担体としては一般的に用いられている
ものが使用でキ、セルロース、セファロース、ガラス、
ポリスチレンなどのプラスチック等を挙げることができ
る。

以上のように本発明者らは抗原・抗体反応を利用した糖
脂質の微量定量法を世界に先がけて開発し、これにより
癌患者をはじめとした種々の疾患において体液中濃度の
測定がはじめて可能となった。

本発明の方法によるアシアロＧＭ、　、アシアロＧＭ２
、フコＧＡ、およびパラグロボシドの測定は再現性に優
れ、高い感度および精度を示し、かつ操作が簡単で日常
の臨床検査法として非常に優れている。

本発明の方法による体液中のこれらの糖脂質の定量はア
シアロＧＭ、を例に図４．５．６に示されているように
癌の早期発見および治療経過の判定に極めて有用である
。

次に実施例を示し本発明をさらに具体的に説明するが本
発明はこれによって限定されるものではない。

実施例 ■　抗原および抗体の作製 １、　抗原（糖脂質）の精製 （１）　アクアロＧＭ、の精製 牛脳の糖脂質分画２．ＯｆをＩＮギ酸存在下で１００℃
、１時間加水分解する。加水分解終了後ＤＥＡＥ−セフ
ァデックスＡ−２５カラムクロマトグラフイーによりア
シアロ糖脂質分画を分離した。得られた粗アシアロ糖脂
質を溶媒勾媒が（ＣＨＣｌ３／　ＣＨ３０Ｈ／　Ｈ，０
１８０：　２０　：　０．５　０ＨＣＩｓ／　ｃ）１３
ｏ）！／）１．ｏ、５０　：　４５　：　３．５　）で
あるヤトロビーズ（Ｉａｔｒｏｂｅａｄｓ　ニヤトロン
社）カラムクロマトグラフィーによりさらに精製した。

以上よシ牛脳の糖脂質２０２より約６００１ｎｇの精製
アシアロＧＭ、が得られた。

（２）　アシアロＧＭ、の精製性 牛脳のＧＭ＋　５００■を酢酸緩衝液（ｐＨ４，５）に
溶解する。２００■の過ヨウ素酸ナトリウムを加え１０
時間４℃暗所に放置する。エチレングリコールを２．３
滴加え一夜透析した。ホウ酸緩衝液でｐＨを８０に合わ
せＮａ　Ｂ　Ｈ４を３８０７Ｉｊｇ加え、０℃で１２時
間放置する。酢酸で反応を停止しｐＨを４以下に合わせ
た後透析を行なう。０１ＮになるようにＨ２ＳＯ，を加
えて８０℃、１時間反応させた後蒸留水に対して透析を
行ない凍結乾燥する。この粉末をＣＨＯＩｓに溶かした
後ヤトロビーズ（Ｉａｔｒｏｂｅａｄｓニヤトロン社）
カラムクロマトグラフィーにより精製し、約１００ｍｇ
の精製アシアロＧＭ２を得た。

（３）　フコＧＡ、の精製 ラット腹水肝癌ＡＨ７９７４Ｆ細胞を凍結乾燥して得た
粉末３０ｙに対して５００ｍ／！のＣＨＣｌ３：　０Ｈ
３０Ｈ：Ｈ２０（ｘｏ−ｓ：１）の溶媒で抽出した。抽
出液をろ過した残渣をさらに同量のＣＨＣｌ３　：　Ｃ
ＨａＯＨ（１：　１　）およびＣＨＣｌ３　：　ＣＨ３
０Ｈ（１：　２　）の溶媒で順次抽出した。抽出液を合
わせた後、減圧下溶媒を除去する。さらにＣＨＣｌａ　
：　ＣＨａＯＨ：　Ｈ２０（１５：　３０　：　４）の
溶媒に溶かし、ＤＥＡＥ・セファデックスＡ−２５０カ
ラムクロマトグラフィーにより酸性脂質を除去した。

得られたフコＧＡ、を含む中性糖脂質画分をアセチル化
（無水酢酸：ビリジン＝２：３）Ｌ、これを７０リジル
カラムクロマトグラフイーにて糖脂質画分を他のリン脂
質から分離し、糖脂質画分を脱アセチル化し、透析後凍
結乾燥する。この粉末をＣＨＣｌ５に溶解させヤトロビ
ーズ（Ｉａｔｒｏｂｅａｄｓ　ニヤトロン社）カラムク
ロマトグラフィーにより精製し、約５ｍｇの精製フコＧ
Ａ＋を得た。

（４）　パラグロボシドの精製 ３０ｔのウシ血液から遠心分離によって赤血球を分離し
、１０倍量の０５チ酢酸によって溶血きせた後８，００
０ｒｐｍにて遠心分離し、赤血球膜を得た。赤血球膜を
５〜１０倍のアセトンで処理し、脱水を行なった。次に
２０倍量の（：！ＨＣｌ３：　Ｃ１（３０Ｈ（２：　ｌ
　）　、ＣＨＣｌ３：　０ＨａＯＨ（１：　１　）　、
ＣＨＣｌ１　：ＣＨ３０Ｈ（１：　２　）で１順次抽出
し、抽出液を合わせた後減圧下濃縮した。この抽出物を
２１のＣ）ｌＣ１３：　ＣＨ３０Ｈ（２：　１　）の溶
媒に溶かした後、５００ｍ１３の０．９％ＮａＣ１を加
えよく混和し上層を取り出し透析し凍結乾燥した。この
粉末をヤトロビーズ力ラムクロマトグラフィーにより分
離しパラグロボシドにシアル酸の結合したシアロシルパ
ラグロボシドを得る。この物質をＩＮのギ酸により８０
℃で１時間処理しシアル酸をはずす。透析後凍結乾燥し
、この粉末をＣＨＣｌ３に溶かしヤトロビーズ力ラムク
ロマトグラフィーによって精製し約５０ＴＩｇの精製パ
ラグロボシドを得た。

２、　糖脂質抗体の作製 （１）抗アシアロＧＭＩ抗血清の作製 アシアロＧＭ１２ｍｇとウシ抑清アルブミン４ｍＶを１
ゴの蒸留水に懸濁させた。この懸濁液にソロインドコン
プリートアジュバント１　ｍｌを加え乳化した。この乳
化液２ｍｌを２週間間隔で家兎に３回皮内注射した。最
後の注射の２週間後に全採血した。

アシアロＧ　Ｍ　２　、フコＧＡ＋、パラグロボシドに
対する抗体も同様にして作製することができた〇（２）
　抗アシアロａｕ、抗体の精製 実施例（１）により得られた抗アジアｏ　ＧＭＩ抗血清
１００ｍ（！を硫安５０チ飽和で塩析した。沈殿物をリ
ン酸緩衝液（ｐＨ７，２）　１００　ｒｕｇに溶解し、
さらに硫安２０チ飽和で塩析し、フィブリノーゲンを除
去した。

上清を硫安３５チ飽和で塩析し、ｒ−グロブリン分画を
得た０γ−グロブリンは少量のリン酸緩衝液（、ｐＨ７
，２）に溶解し、セファデックスＧ−２００カラムクロ
マトグラフイー（２，５Ｘ　１１０　ｃｍ　）にかけた
ＯセファデックスＧ−２００カラムクロマ）・グラフィ
ーにより小さな第１ピーク（ＩｇＭ分画）と第２ピーク
（、ＩｇＧ分画）が得られた。■ｇＧ分画は蒸留水で透
析した後凍結乾燥した。

得られたＩｇＧ分画５０ｍｌ１＋をリン酸緩衝液（＋）
Ｈ７，２）　３０　ｔｒｔｌ！に溶解しアシアロＧＭ、
のオリコ゛糖を結合したＡＨ−セファロース４Ｂ”　１
０　ｍｌをつめたカラムに流した後、カラムをリン酸緩
衝液（ｐＨ７，２）１．２０　ｒｒｔｌで洗浄した。次
に３，０ｔｖｌ　Ｎａ５ＣＮ　１．Ｑ　Ｏｍｌで溶出し
た。溶出は１０　ｍ、ｌ　７時間で行ない、５耐ずつの
分画を集めた。

溶出された抗アシアロ（ｉＭ、抗体の特異活性は２５〜
２６補体結合力価／　１０−２０μ７蛋白／　ｖｔｌで
あった。

抗アシアロａｌ１４．抗体は脱塩後、ｌ）Ｍ３Ｑ膜（Ａ
ｍ１．ｃｏｎ　）を用いて濃縮した。

アシアロＧＭ、のオリゴ糖を結合したＡｌ−１−七ファ
ロース４ＢカラムはＮａ５ＯＮがなくなるまでリン酸緩
衝液（ｐＨ７，２）で洗浄して繰り返し使用できる。

アシアロＧＭＩ　１００　ｍＷをメタノール：へキサン
（４：　３　）２０ｍｌに溶かした後、オゾンを３０分
間通気する。脂質様浮遊物を遠心分離で除き、炭酸ナト
リウム水溶液を加え１８時間室温放置する（　ｐＨ１０
，５〜１１）。その後１０．００Ｏｒｐｍ　２０分遠心
分離し上清にＤｏｗｅｘ　５０　（Ｈ”　ｆｏｒｍ　）
を加え、ナトリウムイオンヲ除いり後、セファデックス
Ｇ−２５カラムクロマトグラフイーにより約４０■のオ
リゴ糖が得られた。

得られたオリゴ糖５■とＮａＢＣＮＨ３２０■を蒸留水
２０ｍ１に溶解した。この溶液をＡＨ−セファロース４
Ｂ２０ｉｅと混合し５時間還流した。今後、オリゴ糖と
反応したＡＨ−セファロース４Ｂは遠心分離し、蒸留水
で数回洗浄した。

上記より得られたアシアロＧＭｌのオリゴ糖を結合しだ
ＡＨ−セファロース４Ｂはリン酸緩衝液（ｐＨ７，２）
によシ平衡化した後、抗体の精製に用いた。

３、　抗−家兎γ−グロブリン抗体の作製家兎ｒ−グロ
ブリンＩＴ１ｇを生理食塩水２　ｍｌに溶かしフロイン
トコンプリートアジュバント２　ｒｒｔｌを加え乳化し
た。この乳化液を２週間間隔でヤギに５回注射した。最
後の注射の２週間後に全採血し、抗血清を得た。

■　競合反応を利用した糖脂質の定量 １、　ア７７０ＧＭ、の定量 測定用試験管に標準アシアロＧＭ、または抑清検体１０
０μｔとオリゴ糖−テロジン−Ｉ２５１１００μｔ１抗
−−アシアロＧＭＩ　抗体１００μｔを加えインキュベ
ーション後、抗−家兎ｒ−グロブリン抗体５００μｔを
加えインキュベーションした。

３．００　Ｏｒｐｍで２０分遠心分離後上清を除去し、
沈殿の放射能を測定した。

１−１　アシアロＧＭ、の糖鎖部分の作製アシアロＧＭ
、　１００■をメタノール：ヘキサン（４：３）２０ｓ
ｔ７！に溶かした後、オゾンを３０分間通気する。脂質
様浮遊物を遠心分離で除き、炭酸ナトリウム水溶液を加
え１８時間室温放置する（ｐＨ１０，５〜１１）。その
後１０．００Ｏｒｐｍ　２０分遠心分離し上清にＤｏｗ
ｅｘ　５Ｑ　（Ｈ”　ｆｏｒｍ　）を加え、ナトリウム
イオンを除いた後、セファデックスＧ−２５カラムクロ
マトグラフイーにより約４０１ｎｇのオリゴ糖が得られ
た。

１−２　アシアロＧＭ、のオリゴ糖のチロシン誘導体の
作製 ＋Ｉ　（ｂｌで得られたアシアロＧＭ、のオリゴ糖５■
とＮａＢＣＮＨ３２０■を蒸留水２０　ｄに溶解し、こ
れにジアミノヘキサン５　ｍｇを加え５時間還流した。

冷後反応液を減圧上濃縮し、セファデックスＧ−２５カ
ラムクロマトグラフイーによシヘキシルアミンオリゴ糖
を精製した。

一方、１ＯＮグのチロシンをＮ−ハイドロキシサクシイ
ミド、ジサイクロへキシルカルボジイミドの存在下でＮ
−ハイドロキシサクシイミドエステルを形成させる。こ
れに先に得たヘキシルアミンオリゴ糖５　ｍｇを添加し
２４〜７２時間室温にて反応させる。セファデックスＧ
−２５カラムクロマトグラフイーにより約６■のアシア
ロＧＭ、オリゴ糖のチロシン誘導体を得た。

１−３　オリゴ糖の１２Ｊ標識 試験管Ｋ　１　ｍｃｉのＮａｔｚｓＩ２０　μｌｌ、　
０．５　Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，４）　２５μ１１チ
ロシンを導入したアシアロＧＭＩのオリゴ糖１．５μＶ
およびクロラミンＴ（１〜／ｍ７）２５μｌを加えた後
約３０秒間振とう反応させり後、ヒロ亜硫酸ナトリウム
（１”ｉ／／ｉｌり１００μｌを加えて反応を停止した
。

セファデックスＧ−２５カラムクロマトグラフイーによ
り遊離の１２１Ｊを除去し、オリゴ糖−チロジン−１２
５１を得た。

■　サンドウィッチ法を利用した糖脂質の定量１、　ア
シアロＧＭＩの定量 測定用プレートに標準アシアロＧＭ、または血清検体１
００μ４と０．１ＭＭリン酸緩衝液ｐＨ８，６）　１０
０μｌを入れる。抗−アシアロＧＭ、抗体ビーズ１個を
加えインキュベート後反応液を除去し生理食塩水で２回
洗浄する。さらに抗−アシアロＧＭ、抗体−＋２Ｊ２０
０μｌを加えインキュベートする。反応液を除去した後
生理食塩水で３回洗浄しビーズをカウント用試験管に移
して放射能を測定した。

１−１　抗−アシアロＧＭｌ抗体の固相化ポリスチレン
ビーズ５００個を１００ｍＪのふた付ビンに入れる。ビ
ーズ１個当たり抗−アシアロＧＭＩ抗体２　ｔｔｙ　／
　０．１６　ｒｎｌ　０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，
８，）を加え密栓して一夜ローテーションする。０．９
％ＮａＣｌ液で５回洗浄後デシケータ−中で乾燥し固相
化抗体を得た。

１−２　抗−アシアロＧＭ１抗体の１２５１標識シリコ
ン処理した試験管にｌ　ｍＣｉのＮａ１２５１２０μｌ
、０．５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，５）　２５μｇを加
える。抗−アジアロＯＭ、抗体液を５０μｌ加え、さら
にクロラミンＴ　（３ｍＷ　／　ｍ、ｌ！　）　２５　
ｔｔｌｌを加える。２０〜３０秒間よく振って反応させ
た後、メタ重亜硫酸ソーダ（３ｍｇ／ｍ１）１００μｌ
を加えて反応を停止する。これにヨウ化カリウム（５０
ｍＷ　／　ｍｌ　）　２５μ１１　ウシ血清アルブミン
液（５％　）　１００μｌを加え、セファデックスＧ−
２５によるゲル沢過で遊離の１２５■を除去し　＋２Ｊ
標識抗−アシアロＧＭ、抗体を得た。

１−３　抗−アシアロＧＭＩ　抗体のフルオレセイン標
識 抗−アシアロＧＭｌ抗体５〜を０．１Ｍ　）　ｊｌス塩
酸緩衝液（ｐＨ８，０）　１　ｍｌに溶解した。この溶
液にフルオレセインインチオシアネート（ＦＩＴＣ）　
５０μｍの食塩水溶液を攪拌しながら加えた後ＩＮ　Ｎ
ａＯＨをｐＨ９，５になるまでゆっくり攪拌しながら加
え、さらに室温で１時間攪拌しながら反応させた。反応
終了後０．０１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，６）に対して
４℃で−・夜透析した後セファデックス（）−２５でゲ
ルｆ過し、標識抗体を得た。

１−４　抗−アシアロＣ）Ｍｌ抗体のペルオキシダーゼ
標識 ペルオキシダーゼ５■を０．３Ｍ重炭酸すトリウム緩衝
液（ｐＨ８，１）　１　ｍｌに溶解した後、１チ１−フ
ルオロ−２，４−ジニトロベンゼン（ＦＤＮＰ）エタノ
ール溶液０．Ｉ　ＷＬｌを加え、室温で１時間反応させ
た。さらに０．０６Ｍ過ヨウ素酸す）　ＩＪウム　１　
ｙｎｌを加え室温で３０分間反応させた後、０．１６Ｍ
エチレングリコールＩＷＬｌを加え室温で１時間反応さ
せた。次に００１Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９，５
）に対し４℃で一夜透析した後、抗−アシアロＧＭｌ抗
体５■を加え、室温で２時間反応させた。さらに水素化
硼素ナトリウム５ｑを加え４℃で一夜放置し、　０．０
１Ｍ　＋７７酸塩緩衝塩化ナトリウム液に対し、４℃で
一夜透析した後、セファデックスＧ　−２００でゲル沢
過し標識抗体を得た。

■　イムノメトリックアッセイ法を利用した糖脂質の定
量 １　ラジオアイソトープを使用したイムノメトリックア
ッセイによるアシアロＧＭｌの定量測定用プレートに標
準アシアロＧＭ、または血清検体１００μｌと抗−アシ
アロＧＭ、抗体希釈液１００　ｔｔｌＪを加え、インキ
ュベーション（第１反応）後、アジアＯＧＭ、結合ビー
ズ１個を加えさらにインキュベーション（第２反応）し
た。次に０．９％Ｎａ１ｌで４回ビーズを洗浄してから
抗−家兎ｒ−グロブリン抗体−１２５１２００μｌを加
えインキュベーション（第３反応）した。０９％ＮａＣ
ｌで４回洗浄後ビーズをカウント用試験管へ移して放射
能を測定し７た。

この様にして得られた標準曲線の１例と癌患者血中のア
シアロ０Ｍｌ値の測定結果を図１．４．５．６に示した
。

１−１　不溶化アシアロＧＭ、　（免疫吸着体）の調製 ポリスチレンビーズが１〜２層となるように適当な大き
さのビーカーに入れ、純水で５回洗浄した。アシアロＧ
ＭＩ液をビーズ１個当たり０．２ｍｌ加えテ室温テロ０
〜９０分静置した。アシアロＧＭｒ液ヲデカンテーショ
ンで除去後、リン酸塩緩衝塩化ナトリウム液（ＰＢＳ）
で４回洗浄後、ＰＢＳ中で４℃保存した。

不溶化アジアＯ０Ｍ２　、不溶化フコＧＡ１および不溶
化バラグロボシドも同様にして調製することができた。

１−２　抗−家兎γ−グロブリン抗体の＋５１標識 シリコン処理した試験管に１ｍｃｉのＮａ”５１　２０
μｌ、０．５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，５）　２５μｌ
を加える。

抗−家兎γ−グロブリン抗体液を５０μｌ加え、さらに
クロラミンＴ（３〜／ｍ１）２５μｌを加える。

２０〜３０秒間よく振って反応させた後、メタ重亜硫酸
ソーダ（３η／ｍｌり１００μｌを加えて反応を停止す
る。これにヨウ化カリウム（５０■／　ｄ　）　２５μ
１１ウシ血清アルラ゛ミン液（５％　）　ｔｏｏμｌを
加え、セファデックスＧ−２５によるゲルｒ過で遊離の
１２５１を除去し　１２５１標識抗−家兎γ−グロブリ
ン抗体を得た。

２、　酵素を使用したイムノメトリックアッセイによる
アシアロ（）Ｍｆｉの定量 測定用プレートに標準アシアロＧＭ２１００μｌと抗−
アシアロＧＭ２抗体希釈液１００μｌを加えインキュベ
ーション後、アシアロＧＭ２結合ビーズ１個を加えさら
にインキュベーションした。次に０．０１Ｍリン酸緩衝
塩化ナトリウム液（ＰＢＸ）で５回ビーズを洗浄してか
らペルオキシダーゼ結合抗−家兎ｒ−グロブリン抗体２
００μｌを加えインキュベージコンした。ＰＢＳで５回
ビーズを洗浄後、酵素基質（０，０５チ過酸化水素：　
Ｏ，ＯＳ％５−アミンサリチル酸＝９：１、ＮａＯＨを
加えｐＨを６．０とする）２２５μｌを加えインキ−ベ
ートし、４５０ｎｍにおける吸光度をこのようにして得
られた標準曲線の１例を第２図に示した。

２−１　抗−家兎ｒ−グロブリン抗体のペルオキシダー
ゼ標識 ペルオキシダーゼ５ｍｇを０．３Ｍ重炭酸ナトリウム緩
衝液（ｐＨ８，１）　１　ｍ／に溶解した後、１％１−
フルオロ−２，４−ジニトロベンゼン（ＦＤＮＰ）　エ
タノール溶液０．１罰を加え、室温で１時間反応させた
。さらに０．０６Ｍ過ヨウ素酸ナトリウム１ｄを加え室
温で３０分反応させた後、０．１６Ｍエチレングリコー
ル１ｍｌを加え室温で１時間反応させた。次に０．０１
Ｍ　炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９，５）に対し、４℃
で一夜透析した後、抗−家兎ｒ−グロブリン抗体５■を
加え、室温で２時間反応させた。さらに水素化硼素ナト
リウム５■を加え４℃で一夜放置し、０．０１Ｍリン酸
塩緩衝塩化ナトリウム液に対し、４℃で一夜透析した後
、セファデックスＧ　−２００でゲル沢過し標識抗体を
得た。

３、　酵素を使用したイムノメトリックアッセイによる
パラグロボシドの定量 測定用プレートに標準パラグロボシド１００μｌと抗−
パラグロボシド抗体希釈液１００μｌを加えインキュベ
ーション後、パラグロボシド結合ビーズ１個を加えさら
にインキュベートした。次に０．ＱＩＭリン酸緩衝塩化
ナトリウム液（ＰＢＳ）で５回ビーズを洗浄してからペ
ルオキシダーゼ結合抗−家兎γ−グロブリン抗体２００
μｌを加えインキュベーションした。ＰＢＳで５回ビー
メイ浄後、酵素基質（０゜０５チ過酸化水素：００８％
５−アミノサリチル酸＝９：１、ＮａＯＨを加えｐＨを
６．０とする）２２５μｌを加えインキュベー）　Ｌ　
４５０　ｎｍにおける吸光度を測定した。

このようにして得られた標準曲線の１例を第３図に示し
た。

３−１　抗−家兎ｒ−グロブリン抗体のペルオキシダー
ゼ標識 ペルオキシダーゼ５１１ｑを０．３Ｍ重炭酸ナトリウム
緩衝液（ｐＨ８，１）　１だｌに溶解した後、１％１−
フルオロ−２，４−ジニトロベンゼン（ＦＤＮＰ）エタ
ノール溶液０．１　ｍｌを加え、室温で１時間反応させ
た。さらに０．０６Ｍ過ヨウ素酸ナトリウム１　ｒｕｌ
を加え室温で３０分反応させた後、０．１６Ｍエチレン
グリコール１ｄを加え室温で１時間反応させた。次に０
．０１Ｍ　炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９，５）に対し
、４℃で一夜透析した後、抗−家兎ｒ−グロブリン抗体
５　ｍｇを加え、室温で２時間反応させた。さらに水素
化硼素ナトリウム５■を加え４℃で一夜放置し、０．０
１Ｍリン酸塩緩衝塩化ナトリウム液に対し、４℃で一夜
透析した後、セファデックスＧ−２００でゲルｒ過し標
識抗体を得だ。

４、抗−家兎γ−グロブリン抗体のフルオレセイン標識 抗−家兎γ−グロブリン抗体５ｍグを０．１Ｍ　トリス
塩酸緩衝液（ｐＨ８，０）　１　ｄに溶解した。この溶
液にフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）　
５０μｍの食塩水溶液を攪拌しながら加えた後、ＩＮ　
ＮａＯＨをｐＨ９，５になるまでゆっく９攪拌しながら
加え、さらに室温で１時間攪拌しながら反応させた。反
応終了後、　０．０１Ｍ　＋７７酸緩衝液（ｐＨ７，６
）に対して４℃で一夜透析した後セファデックスＧ−２
５でゲル沢過し、標識抗体を得た。

この標識抗体はイムノメトリックアッセイ法の標識化合
物として用いることができる。

【図面の簡単な説明】

第１図はラジオアイソトープを使用したイムノメトリッ
クアッセイ法による濃度既知の標準アシアロＧＭ、溶液
を用いて作成した標準曲線である。 図中、横軸にはアンアロＧＭ、濃度（”Ｖ／アｌ）を、
縦軸にはカラン）　（ｘ１０３ｃｐｍ）をとっており、
この標準曲線によって測定対象試料のカウントより対応
するアシアロＧＭ、の濃度を読みとり、その値を知るこ
とができる。 第２図および第３図は酵素を使用したイムノメトリック
アッセイ法によるアシアロＧＭ２およびパラダロボシド
のそれぞれの標準曲線である。 第４図は本発明の方法により測定した癌患者血清中のア
シアロ０Ｍｌ値のプロットを示した図であり、良性疾患
患者および正常者より得られた値と比較して示されてい
る。横軸はアシアロＧＭ、濃度（ｎｙ／扉ｌ）である。 第５図は、本発明の方法により測定した癌患者血清中の
アシアロＧＭ、値のプロットを癌の部位別に示したもの
である。 第６図は本発明の方法により測定した化学療法中の肺癌
患者血清中のアシアロ０Ｍｌ値を経時的に追跡した結果
を示すものである。 第７図は３種類の検体を用いて、図に示すような希釈倍
率で本発明方法により定量した試験結果を示すものであ
る。 特許出願人　ダイナボ、ト株式会社 第２図 アシアロＧＭ、濃度（μｆ／ｍｔ） 第３図 ノぞラグロボシド濃度（μｆ／ｍｌ） 手　続　補　正　書　（方式） 昭和５ｇ年７０月７７日 特許庁長官　若　杉　和　夫　殿 １、事件の表示 昭和ｓｇ年特許願第１６！２２３号 ２、発明の名称 免疫学的測定法による糖脂質の定量方法３、補正をする
者 事件との関係　特許出願人 住所　東京都港区虎ノ門３−ｇ−２７ 第３３森ビル乙階 名称　グイナボット株式会社 ４、代　理　人 住所　東京都千代田区麹町３丁目２番地相互第一ビル 電話（２１，！；　）デ乙４ｔｑ ７、補正の内容　図面の浄書（内容に変更なし）以　上

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、　定量しようとする体液中の糖脂質を該糖脂質に対
   する特異抗体を用いて免疫学的方法により測定すること
   を特徴とする糖脂質の測定方法。 ２　定量しようとする体液中の糖脂質と標識剤で標識し
   た標識糖脂質（あるいは標識オリゴ糖）とを抗−糖脂質
   抗体に対して競合反応させ、次いで抗体が結合した標識
   糖脂質（あるいは標識オリゴ糖）と抗体が結合していな
   い標識糖脂質（あるいは標識オリゴ糖）とを分離し、そ
   れらの分画の一方または両方の標識剤の活性を測定する
   ことを特徴とする特許請求の範囲第１項記載の方法。 ３　標識剤が放射性物質、酵素あるいは蛍光物質である
   特許請求第２項記載の方法。 ４糖ＩＩＷ　質カアシアロＧＭ、　、アシアロＧＭ２、
   フコＧＡ、あるいはパラグロボシドである特許請求の範
   囲第２項記載の方法。 ５　不溶性物質（担体）に抗−糖脂質抗体を結合させた
   不溶化抗体に定量しようとする体液中の糖脂質を反応さ
   せ、次いで標識剤で標識した標識抗−糖脂質抗体と反応
   させた後、不溶化抗体上の糖脂質と結合した標識抗−糖
   脂質抗体の標識剤の活性を測定することを特徴とする特
   許請求の範囲第１項記載の方法。 ６、標識剤が放射性物質、酵素あるいは蛍光物質である
   特許請求の範囲第５項記載の方法・７　糖脂質がアシア
   ロＧＭ、、アシアロ（）Ｍ２．７コＧＡ、あるいはパラ
   グロボシドである特許請求の範囲第５項記載の方法。 ８、定量しようとする体液中の糖脂質と標識剤で標識し
   た標識抗−糖脂質抗体の一定量とを反応させた後、不溶
   性物質（担体）に糖脂質を結合させた免疫吸着体（Ｉｍ
   ｍｕｎｏａｄｓｏｒｂｅｎｔ　）で未反応の標識抗−糖
   脂質抗体を吸着し、該免疫吸着体」二の標識剤の活性を
   測定することを特徴とする特許請求の範囲第１項記載の
   方法。 ９、標識剤が放射性物質、酵素および蛍光物質である特
   許請求の範囲第８項記載の方法。 ８項記載の方法。 １１、定量しようとする体液中の糖脂質と一定量の抗−
   糖脂質抗体と反応させた後、不溶性物質（担体）に糖脂
   質を結合させた免疫吸着体（Ｉｍｍｕｎｏ−ａｄｓｏｒ
   ｂｅｎｔ　）　で未反応の抗−糖脂質抗体を吸着し、次
   いで該免疫吸着体を分離し、さらに抗−糖脂質抗体に対
   する抗＝ＩｇＧ抗体を標識剤で標識した標識抗−ＩｇＧ
   抗体と反応させ、該免疫吸着体に結合した標識抗−Ｉｇ
   Ｇ抗体の標識剤の活性を測定することを特徴とする特許
   請求の範囲第１項記載の方法。 １２、標識剤が放射性物質、酵素あるいは蛍光物質であ
   る特許請求の範囲第１１項記載の方法。 １３　オリゴ糖がアシアロＧＭ、　、７７７００Ｍ２．
   フコＧＡ、あるいはパラグロボシドの糖鎖部分である特
   許請求の範囲第１１項記載の方法。