JPS6057254A - 免疫学的測定法による糖脂質の定量方法 - Google Patents
免疫学的測定法による糖脂質の定量方法Info
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- JPS6057254A JPS6057254A JP58165223A JP16522383A JPS6057254A JP S6057254 A JPS6057254 A JP S6057254A JP 58165223 A JP58165223 A JP 58165223A JP 16522383 A JP16522383 A JP 16522383A JP S6057254 A JPS6057254 A JP S6057254A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は生体試料中の糖脂質を免疫学的に測定する方法
に関する。
に関する。
さらに詳しくは本発明は生体試料中の糖脂質であるアシ
アロGM、 、アシアロGM2、フコGA、およびパラ
グロボシドをそれぞれに特異的な抗体を用いて免疫学的
に定量する方法に関するものである。
アロGM、 、アシアロGM2、フコGA、およびパラ
グロボシドをそれぞれに特異的な抗体を用いて免疫学的
に定量する方法に関するものである。
日本における死亡率は癌が第−位を占めるに至り癌の早
期発見、早期治療への期待や必要性がますます高まって
いる。早期発見のためには画像診断法などの形態学的検
査と少量の体液採取による非侵襲的検査である免疫生化
学的診断法があるが、免疫化学的診断法がますます重要
な地位を占めるに至っている。現在まで癌の免疫生化学
的診断法として細胞の癌化によって著しく増量してくる
物質−腫瘍関連抗原−の検索に大きな努力が払われてお
り、α−フ二トプロテイン(α−Fetoprotei
n )や癌胎児性抗原(Oarcinoembryon
ic antigen )などの発見およびその測定法
の開発はその大きな成果のひとつであり、臨床上実用に
供されている。しかしながら、癌の早期診断という観点
からするとこれらのマーカーは充分とは言い難いのが現
状であり、さらに新しい腫瘍関連抗原の発見とその測定
法の開発、臨床面への応用が切に望まれている。
期発見、早期治療への期待や必要性がますます高まって
いる。早期発見のためには画像診断法などの形態学的検
査と少量の体液採取による非侵襲的検査である免疫生化
学的診断法があるが、免疫化学的診断法がますます重要
な地位を占めるに至っている。現在まで癌の免疫生化学
的診断法として細胞の癌化によって著しく増量してくる
物質−腫瘍関連抗原−の検索に大きな努力が払われてお
り、α−フ二トプロテイン(α−Fetoprotei
n )や癌胎児性抗原(Oarcinoembryon
ic antigen )などの発見およびその測定法
の開発はその大きな成果のひとつであり、臨床上実用に
供されている。しかしながら、癌の早期診断という観点
からするとこれらのマーカーは充分とは言い難いのが現
状であり、さらに新しい腫瘍関連抗原の発見とその測定
法の開発、臨床面への応用が切に望まれている。
本発明者らは細胞膜成分の一つである糖脂質に注目し、
癌細胞の糖脂質分析・代謝研究を通して糖脂質と細胞接
着性との関連を研究した結果、細胞接着性の相違を糖脂
質代謝の違いとして表わすことができた。特に細胞接着
性を消失した悪性塵の高い癌細胞においては正常細胞で
はほとんど認められない糖脂質を経由する糖脂質の生合
成経路が見い出された。すなわち細胞の癌化に伴って増
加する糖脂質として4種の異なった糖脂質があることを
知り、種々の分析により糖脂質を同定した結果、これら
はアシアロGMI 、アシアロGM2、フコGA、およ
びパラグロボシドであることを明らかにした。それらの
構造を下記に示す。
癌細胞の糖脂質分析・代謝研究を通して糖脂質と細胞接
着性との関連を研究した結果、細胞接着性の相違を糖脂
質代謝の違いとして表わすことができた。特に細胞接着
性を消失した悪性塵の高い癌細胞においては正常細胞で
はほとんど認められない糖脂質を経由する糖脂質の生合
成経路が見い出された。すなわち細胞の癌化に伴って増
加する糖脂質として4種の異なった糖脂質があることを
知り、種々の分析により糖脂質を同定した結果、これら
はアシアロGMI 、アシアロGM2、フコGA、およ
びパラグロボシドであることを明らかにした。それらの
構造を下記に示す。
アシアロGMI
Gal−GalNAc−Gal−Glc −0erアシ
アロGM2 GalNAa−Gal−Glc−OerフコGAI Gal−GalNAc−Gal−Glc−(Eer■ uc パラグロボシド Ga1−GlcNAc−Gal−()lc−CerGa
l ニガラクトース Glc ニゲルコースFuc :
フコース Ga1NAc : N−アセチルガラクトサ
ミンGlcNAc : N−アセチルグルコサミン O
er : セラミド本発明者らは、これらの糖脂質は人
癌細胞においても増量し、かつ体液中の濃度を測定する
ことにより癌の診断に極めて有用であることを知り、新
しい癌のマーカーとなることを明らかにした。
アロGM2 GalNAa−Gal−Glc−OerフコGAI Gal−GalNAc−Gal−Glc−(Eer■ uc パラグロボシド Ga1−GlcNAc−Gal−()lc−CerGa
l ニガラクトース Glc ニゲルコースFuc :
フコース Ga1NAc : N−アセチルガラクトサ
ミンGlcNAc : N−アセチルグルコサミン O
er : セラミド本発明者らは、これらの糖脂質は人
癌細胞においても増量し、かつ体液中の濃度を測定する
ことにより癌の診断に極めて有用であることを知り、新
しい癌のマーカーとなることを明らかにした。
さらに体液中のこれらの糖脂質の濃度は非常に低いため
臨床診断に応用できるような微量定量はこれまで不可能
であったが、本発明者らにより高感度で精度の高い操作
の簡単なこれらの糖脂質の免疫学的測定法が確立され本
発明に至りだ。本発明における糖脂質の定量法はアシア
ロGM、、77700M2.フコGA、およびパラグロ
ボシドに対するそれぞれに特異的な抗体を用いた抗原抗
体反応を利用した免疫学的測定法である。
臨床診断に応用できるような微量定量はこれまで不可能
であったが、本発明者らにより高感度で精度の高い操作
の簡単なこれらの糖脂質の免疫学的測定法が確立され本
発明に至りだ。本発明における糖脂質の定量法はアシア
ロGM、、77700M2.フコGA、およびパラグロ
ボシドに対するそれぞれに特異的な抗体を用いた抗原抗
体反応を利用した免疫学的測定法である。
免疫学的測定法には、標識抗原を用いた競合反応を利用
した方法および標識抗体を用いたサンドウィッチ法とイ
ムノメトリックアッセイがある。
した方法および標識抗体を用いたサンドウィッチ法とイ
ムノメトリックアッセイがある。
アシアロGM、、アシアロGM2、フコGA1およびバ
ラグロボシドの定量のために用いる抗体は、これらの糖
脂質をこれらの糖脂質と異質の担体高分子−たとえばウ
シ血清アルブミン、メチル化ウシ血清アルブミン、赤血
球膜蛋白など−と混合したものを抗原としてヒト以外の
動物、たとえば家兎に皮内注射して産生させることがで
きる。本発明はこのようにして得られた抗体を用いて体
液中のアシアロGM、、アシアロGM2、フコGA1お
よびバラグロボシドを免疫学的方法により定量するもの
である。以下、アシアロGM、を例にとり、本発明方法
について具体的に説明する。
ラグロボシドの定量のために用いる抗体は、これらの糖
脂質をこれらの糖脂質と異質の担体高分子−たとえばウ
シ血清アルブミン、メチル化ウシ血清アルブミン、赤血
球膜蛋白など−と混合したものを抗原としてヒト以外の
動物、たとえば家兎に皮内注射して産生させることがで
きる。本発明はこのようにして得られた抗体を用いて体
液中のアシアロGM、、アシアロGM2、フコGA1お
よびバラグロボシドを免疫学的方法により定量するもの
である。以下、アシアロGM、を例にとり、本発明方法
について具体的に説明する。
1 競合反応を利用したアシアロGM、の定量定量すべ
きアシアロGM、と一定量の標識アシアロGM、とを一
定量の抗体に対して競合反応させ、次いで抗体と結合し
た標識アシアロGMIと抗体と結合していない標識アシ
アロGM、とを分離し、それらの分画の一方または両方
の標識剤の活性を測定してアシアロGMIを定量する。
きアシアロGM、と一定量の標識アシアロGM、とを一
定量の抗体に対して競合反応させ、次いで抗体と結合し
た標識アシアロGMIと抗体と結合していない標識アシ
アロGM、とを分離し、それらの分画の一方または両方
の標識剤の活性を測定してアシアロGMIを定量する。
このような標識抗原を用いる競合反応を利用した定量方
法においては標識アシアロGM1に代えてアシアロGM
、の糖鎖部分(オリゴ糖)を標識した標識オリゴ糖を用
いて同様に競合反応を行なわせアンアロGM、を定量す
ることもできる。
法においては標識アシアロGM1に代えてアシアロGM
、の糖鎖部分(オリゴ糖)を標識した標識オリゴ糖を用
いて同様に競合反応を行なわせアンアロGM、を定量す
ることもできる。
2 サンドウィッチ法を利用しだアシアロ0肖の定量
不溶性物質(担体)に抗体を結合させた不溶化抗体に定
量すべきアシアロGM、を反応させて、抗体−アシアロ
GM、複合体を形成させ、この複合体に抗体を標識剤で
標識した標識抗体を反応させ、抗体−アシアロGM、−
標識抗体のサンドウィッチ型抗原抗体複合物を生成させ
、該抗原抗体複合物上の標識剤の活性を測定してアシア
ロGM 】を定量する。
量すべきアシアロGM、を反応させて、抗体−アシアロ
GM、複合体を形成させ、この複合体に抗体を標識剤で
標識した標識抗体を反応させ、抗体−アシアロGM、−
標識抗体のサンドウィッチ型抗原抗体複合物を生成させ
、該抗原抗体複合物上の標識剤の活性を測定してアシア
ロGM 】を定量する。
3、 イムノメトリックアッセイを利用したアシアロG
M、の定量 (1)体液中の定量すべきアシアロGM、と抗体を標識
剤で標識した標識抗体の一定量を反応させた後、不溶性
物質(担体)にアシアロGM1を結合させた免疫吸着体
(Immunoadsorbent )で未反応の標識
抗体を吸着し、該免疫吸着体上の標識剤の活性を測定す
ることによりアシアロGM、を定量する。
M、の定量 (1)体液中の定量すべきアシアロGM、と抗体を標識
剤で標識した標識抗体の一定量を反応させた後、不溶性
物質(担体)にアシアロGM1を結合させた免疫吸着体
(Immunoadsorbent )で未反応の標識
抗体を吸着し、該免疫吸着体上の標識剤の活性を測定す
ることによりアシアロGM、を定量する。
(2)定量すべきアシアロGMlと一定量の抗体とを反
応させた後、不溶性物質(担体)にアシアロGM1を結
合させた免疫吸着体(Immunoadsorbent
)により未反応の抗体を吸着し、次いで抗体に対する
抗−Tg()抗体を標識剤で標識した標識抗−IgG抗
体を上記免疫吸着体上の抗体に反応させ、該免疫吸着体
に結合した標識抗−IgG抗体の標識剤の活性を測定し
てアジアOGM、を定量する。
応させた後、不溶性物質(担体)にアシアロGM1を結
合させた免疫吸着体(Immunoadsorbent
)により未反応の抗体を吸着し、次いで抗体に対する
抗−Tg()抗体を標識剤で標識した標識抗−IgG抗
体を上記免疫吸着体上の抗体に反応させ、該免疫吸着体
に結合した標識抗−IgG抗体の標識剤の活性を測定し
てアジアOGM、を定量する。
これらの定量方法においては、あらかじめ体液検体の代
わりに濃度既知の標準アシアロGM、を用い、同様の操
作により描いた標準曲線よりアジアOGM、の量をめる
ものである。
わりに濃度既知の標準アシアロGM、を用い、同様の操
作により描いた標準曲線よりアジアOGM、の量をめる
ものである。
水沫による回収率試験の結果を表1に示した。
表1は3種類の検体に種々の既知濃度のアシアロGM1
を加えて行なった回収率試験の結果を示すものである。
を加えて行なった回収率試験の結果を示すものである。
回収率は82チ〜116チと良好な結果が得られた。
また、第7図は本法による希釈試験の結果を示したもの
であり、希釈曲線は直線性を示し良好な結果であった。
であり、希釈曲線は直線性を示し良好な結果であった。
これら回収率試験および希釈試験の結果からも本法がア
シアロGM、の定量法として正確度の高いものであるこ
とが理解できる。
シアロGM、の定量法として正確度の高いものであるこ
とが理解できる。
アシアロGM2. フコGAIおよびパラグロボシドの
定量も上記(1)、(2)、(3)の方法によりアシア
ロGMlと同様に測定することができる。
定量も上記(1)、(2)、(3)の方法によりアシア
ロGMlと同様に測定することができる。
本発明で使用される体液としては各種の体液が使用でき
、たとえば血液、膨水、腹水、尿等が挙げられる。
、たとえば血液、膨水、腹水、尿等が挙げられる。
標識剤としては放射性物質、酵素および蛍光物質等を挙
げることができる。
げることができる。
アクアロGM、 、アシアロGM2、フコGA、および
パラグロボシドあるいはこれらの糖脂質に対するそれぞ
れの抗体を不溶性物質(担体)に結合させた不溶化糖脂
質(免疫吸着体: Immuno −adsorben
t )あるいは不溶化抗体は、担体にこれらの糖脂質あ
るいは抗体を化学的結合または物理的吸着させることに
より製造される。担体としては一般的に用いられている
ものが使用でキ、セルロース、セファロース、ガラス、
ポリスチレンなどのプラスチック等を挙げることができ
る。
パラグロボシドあるいはこれらの糖脂質に対するそれぞ
れの抗体を不溶性物質(担体)に結合させた不溶化糖脂
質(免疫吸着体: Immuno −adsorben
t )あるいは不溶化抗体は、担体にこれらの糖脂質あ
るいは抗体を化学的結合または物理的吸着させることに
より製造される。担体としては一般的に用いられている
ものが使用でキ、セルロース、セファロース、ガラス、
ポリスチレンなどのプラスチック等を挙げることができ
る。
以上のように本発明者らは抗原・抗体反応を利用した糖
脂質の微量定量法を世界に先がけて開発し、これにより
癌患者をはじめとした種々の疾患において体液中濃度の
測定がはじめて可能となった。
脂質の微量定量法を世界に先がけて開発し、これにより
癌患者をはじめとした種々の疾患において体液中濃度の
測定がはじめて可能となった。
本発明の方法によるアシアロGM、 、アシアロGM2
、フコGA、およびパラグロボシドの測定は再現性に優
れ、高い感度および精度を示し、かつ操作が簡単で日常
の臨床検査法として非常に優れている。
、フコGA、およびパラグロボシドの測定は再現性に優
れ、高い感度および精度を示し、かつ操作が簡単で日常
の臨床検査法として非常に優れている。
本発明の方法による体液中のこれらの糖脂質の定量はア
シアロGM、を例に図4.5.6に示されているように
癌の早期発見および治療経過の判定に極めて有用である
。
シアロGM、を例に図4.5.6に示されているように
癌の早期発見および治療経過の判定に極めて有用である
。
次に実施例を示し本発明をさらに具体的に説明するが本
発明はこれによって限定されるものではない。
発明はこれによって限定されるものではない。
実施例
■ 抗原および抗体の作製
1、 抗原(糖脂質)の精製
(1) アクアロGM、の精製
牛脳の糖脂質分画2.OfをINギ酸存在下で100℃
、1時間加水分解する。加水分解終了後DEAE−セフ
ァデックスA−25カラムクロマトグラフイーによりア
シアロ糖脂質分画を分離した。得られた粗アシアロ糖脂
質を溶媒勾媒が(CHCl3/ CH30H/ H,0
180: 20 : 0.5 0HCIs/ c)13
o)!/)1.o、50 : 45 : 3.5 )で
あるヤトロビーズ(Iatrobeads ニヤトロン
社)カラムクロマトグラフィーによりさらに精製した。
、1時間加水分解する。加水分解終了後DEAE−セフ
ァデックスA−25カラムクロマトグラフイーによりア
シアロ糖脂質分画を分離した。得られた粗アシアロ糖脂
質を溶媒勾媒が(CHCl3/ CH30H/ H,0
180: 20 : 0.5 0HCIs/ c)13
o)!/)1.o、50 : 45 : 3.5 )で
あるヤトロビーズ(Iatrobeads ニヤトロン
社)カラムクロマトグラフィーによりさらに精製した。
以上よシ牛脳の糖脂質202より約6001ngの精製
アシアロGM、が得られた。
アシアロGM、が得られた。
(2) アシアロGM、の精製性
牛脳のGM+ 500■を酢酸緩衝液(pH4,5)に
溶解する。200■の過ヨウ素酸ナトリウムを加え10
時間4℃暗所に放置する。エチレングリコールを2.3
滴加え一夜透析した。ホウ酸緩衝液でpHを80に合わ
せNa B H4を3807Ijg加え、0℃で12時
間放置する。酢酸で反応を停止しpHを4以下に合わせ
た後透析を行なう。01NになるようにH2SO,を加
えて80℃、1時間反応させた後蒸留水に対して透析を
行ない凍結乾燥する。この粉末をCHOIsに溶かした
後ヤトロビーズ(Iatrobeadsニヤトロン社)
カラムクロマトグラフィーにより精製し、約100mg
の精製アシアロGM2を得た。
溶解する。200■の過ヨウ素酸ナトリウムを加え10
時間4℃暗所に放置する。エチレングリコールを2.3
滴加え一夜透析した。ホウ酸緩衝液でpHを80に合わ
せNa B H4を3807Ijg加え、0℃で12時
間放置する。酢酸で反応を停止しpHを4以下に合わせ
た後透析を行なう。01NになるようにH2SO,を加
えて80℃、1時間反応させた後蒸留水に対して透析を
行ない凍結乾燥する。この粉末をCHOIsに溶かした
後ヤトロビーズ(Iatrobeadsニヤトロン社)
カラムクロマトグラフィーにより精製し、約100mg
の精製アシアロGM2を得た。
(3) フコGA、の精製
ラット腹水肝癌AH7974F細胞を凍結乾燥して得た
粉末30yに対して500m/!のCHCl3: 0H
30H:H20(xo−s:1)の溶媒で抽出した。抽
出液をろ過した残渣をさらに同量のCHCl3 : C
HaOH(1: 1 )およびCHCl3 : CH3
0H(1: 2 )の溶媒で順次抽出した。抽出液を合
わせた後、減圧下溶媒を除去する。さらにCHCla
: CHaOH: H20(15: 30 : 4)の
溶媒に溶かし、DEAE・セファデックスA−250カ
ラムクロマトグラフィーにより酸性脂質を除去した。
粉末30yに対して500m/!のCHCl3: 0H
30H:H20(xo−s:1)の溶媒で抽出した。抽
出液をろ過した残渣をさらに同量のCHCl3 : C
HaOH(1: 1 )およびCHCl3 : CH3
0H(1: 2 )の溶媒で順次抽出した。抽出液を合
わせた後、減圧下溶媒を除去する。さらにCHCla
: CHaOH: H20(15: 30 : 4)の
溶媒に溶かし、DEAE・セファデックスA−250カ
ラムクロマトグラフィーにより酸性脂質を除去した。
得られたフコGA、を含む中性糖脂質画分をアセチル化
(無水酢酸:ビリジン=2:3)L、これを70リジル
カラムクロマトグラフイーにて糖脂質画分を他のリン脂
質から分離し、糖脂質画分を脱アセチル化し、透析後凍
結乾燥する。この粉末をCHCl5に溶解させヤトロビ
ーズ(Iatrobeads ニヤトロン社)カラムク
ロマトグラフィーにより精製し、約5mgの精製フコG
A+を得た。
(無水酢酸:ビリジン=2:3)L、これを70リジル
カラムクロマトグラフイーにて糖脂質画分を他のリン脂
質から分離し、糖脂質画分を脱アセチル化し、透析後凍
結乾燥する。この粉末をCHCl5に溶解させヤトロビ
ーズ(Iatrobeads ニヤトロン社)カラムク
ロマトグラフィーにより精製し、約5mgの精製フコG
A+を得た。
(4) パラグロボシドの精製
30tのウシ血液から遠心分離によって赤血球を分離し
、10倍量の05チ酢酸によって溶血きせた後8,00
0rpmにて遠心分離し、赤血球膜を得た。赤血球膜を
5〜10倍のアセトンで処理し、脱水を行なった。次に
20倍量の(:!HCl3: C1(30H(2: l
) 、CHCl3: 0HaOH(1: 1 ) 、
CHCl1 :CH30H(1: 2 )で1順次抽出
し、抽出液を合わせた後減圧下濃縮した。この抽出物を
21のC)lC13: CH30H(2: 1 )の溶
媒に溶かした後、500m13の0.9%NaC1を加
えよく混和し上層を取り出し透析し凍結乾燥した。この
粉末をヤトロビーズ力ラムクロマトグラフィーにより分
離しパラグロボシドにシアル酸の結合したシアロシルパ
ラグロボシドを得る。この物質をINのギ酸により80
℃で1時間処理しシアル酸をはずす。透析後凍結乾燥し
、この粉末をCHCl3に溶かしヤトロビーズ力ラムク
ロマトグラフィーによって精製し約50TIgの精製パ
ラグロボシドを得た。
、10倍量の05チ酢酸によって溶血きせた後8,00
0rpmにて遠心分離し、赤血球膜を得た。赤血球膜を
5〜10倍のアセトンで処理し、脱水を行なった。次に
20倍量の(:!HCl3: C1(30H(2: l
) 、CHCl3: 0HaOH(1: 1 ) 、
CHCl1 :CH30H(1: 2 )で1順次抽出
し、抽出液を合わせた後減圧下濃縮した。この抽出物を
21のC)lC13: CH30H(2: 1 )の溶
媒に溶かした後、500m13の0.9%NaC1を加
えよく混和し上層を取り出し透析し凍結乾燥した。この
粉末をヤトロビーズ力ラムクロマトグラフィーにより分
離しパラグロボシドにシアル酸の結合したシアロシルパ
ラグロボシドを得る。この物質をINのギ酸により80
℃で1時間処理しシアル酸をはずす。透析後凍結乾燥し
、この粉末をCHCl3に溶かしヤトロビーズ力ラムク
ロマトグラフィーによって精製し約50TIgの精製パ
ラグロボシドを得た。
2、 糖脂質抗体の作製
(1)抗アシアロGMI抗血清の作製
アシアロGM12mgとウシ抑清アルブミン4mVを1
ゴの蒸留水に懸濁させた。この懸濁液にソロインドコン
プリートアジュバント1 mlを加え乳化した。この乳
化液2mlを2週間間隔で家兎に3回皮内注射した。最
後の注射の2週間後に全採血した。
ゴの蒸留水に懸濁させた。この懸濁液にソロインドコン
プリートアジュバント1 mlを加え乳化した。この乳
化液2mlを2週間間隔で家兎に3回皮内注射した。最
後の注射の2週間後に全採血した。
アシアロG M 2 、フコGA+、パラグロボシドに
対する抗体も同様にして作製することができた〇(2)
抗アシアロau、抗体の精製 実施例(1)により得られた抗アジアo GMI抗血清
100m(!を硫安50チ飽和で塩析した。沈殿物をリ
ン酸緩衝液(pH7,2) 100 rugに溶解し、
さらに硫安20チ飽和で塩析し、フィブリノーゲンを除
去した。
対する抗体も同様にして作製することができた〇(2)
抗アシアロau、抗体の精製 実施例(1)により得られた抗アジアo GMI抗血清
100m(!を硫安50チ飽和で塩析した。沈殿物をリ
ン酸緩衝液(pH7,2) 100 rugに溶解し、
さらに硫安20チ飽和で塩析し、フィブリノーゲンを除
去した。
上清を硫安35チ飽和で塩析し、r−グロブリン分画を
得た0γ−グロブリンは少量のリン酸緩衝液(、pH7
,2)に溶解し、セファデックスG−200カラムクロ
マトグラフイー(2,5X 110 cm )にかけた
OセファデックスG−200カラムクロマ)・グラフィ
ーにより小さな第1ピーク(IgM分画)と第2ピーク
(、IgG分画)が得られた。■gG分画は蒸留水で透
析した後凍結乾燥した。
得た0γ−グロブリンは少量のリン酸緩衝液(、pH7
,2)に溶解し、セファデックスG−200カラムクロ
マトグラフイー(2,5X 110 cm )にかけた
OセファデックスG−200カラムクロマ)・グラフィ
ーにより小さな第1ピーク(IgM分画)と第2ピーク
(、IgG分画)が得られた。■gG分画は蒸留水で透
析した後凍結乾燥した。
得られたIgG分画50ml1+をリン酸緩衝液(+)
H7,2) 30 trtl!に溶解しアシアロGM、
のオリコ゛糖を結合したAH−セファロース4B” 1
0 mlをつめたカラムに流した後、カラムをリン酸緩
衝液(pH7,2)1.20 rrtlで洗浄した。次
に3,0tvl Na5CN 1.Q Omlで溶出し
た。溶出は10 m、l 7時間で行ない、5耐ずつの
分画を集めた。
H7,2) 30 trtl!に溶解しアシアロGM、
のオリコ゛糖を結合したAH−セファロース4B” 1
0 mlをつめたカラムに流した後、カラムをリン酸緩
衝液(pH7,2)1.20 rrtlで洗浄した。次
に3,0tvl Na5CN 1.Q Omlで溶出し
た。溶出は10 m、l 7時間で行ない、5耐ずつの
分画を集めた。
溶出された抗アシアロ(iM、抗体の特異活性は25〜
26補体結合力価/ 10−20μ7蛋白/ vtlで
あった。
26補体結合力価/ 10−20μ7蛋白/ vtlで
あった。
抗アシアロal14.抗体は脱塩後、l)M3Q膜(A
m1.con )を用いて濃縮した。
m1.con )を用いて濃縮した。
アシアロGM、のオリゴ糖を結合したAl−1−七ファ
ロース4BカラムはNa5ONがなくなるまでリン酸緩
衝液(pH7,2)で洗浄して繰り返し使用できる。
ロース4BカラムはNa5ONがなくなるまでリン酸緩
衝液(pH7,2)で洗浄して繰り返し使用できる。
アシアロGMI 100 mWをメタノール:へキサン
(4: 3 )20mlに溶かした後、オゾンを30分
間通気する。脂質様浮遊物を遠心分離で除き、炭酸ナト
リウム水溶液を加え18時間室温放置する( pH10
,5〜11)。その後10.00Orpm 20分遠心
分離し上清にDowex 50 (H” form )
を加え、ナトリウムイオンヲ除いり後、セファデックス
G−25カラムクロマトグラフイーにより約40■のオ
リゴ糖が得られた。
(4: 3 )20mlに溶かした後、オゾンを30分
間通気する。脂質様浮遊物を遠心分離で除き、炭酸ナト
リウム水溶液を加え18時間室温放置する( pH10
,5〜11)。その後10.00Orpm 20分遠心
分離し上清にDowex 50 (H” form )
を加え、ナトリウムイオンヲ除いり後、セファデックス
G−25カラムクロマトグラフイーにより約40■のオ
リゴ糖が得られた。
得られたオリゴ糖5■とNaBCNH320■を蒸留水
20m1に溶解した。この溶液をAH−セファロース4
B20ieと混合し5時間還流した。今後、オリゴ糖と
反応したAH−セファロース4Bは遠心分離し、蒸留水
で数回洗浄した。
20m1に溶解した。この溶液をAH−セファロース4
B20ieと混合し5時間還流した。今後、オリゴ糖と
反応したAH−セファロース4Bは遠心分離し、蒸留水
で数回洗浄した。
上記より得られたアシアロGMlのオリゴ糖を結合しだ
AH−セファロース4Bはリン酸緩衝液(pH7,2)
によシ平衡化した後、抗体の精製に用いた。
AH−セファロース4Bはリン酸緩衝液(pH7,2)
によシ平衡化した後、抗体の精製に用いた。
3、 抗−家兎γ−グロブリン抗体の作製家兎r−グロ
ブリンIT1gを生理食塩水2 mlに溶かしフロイン
トコンプリートアジュバント2 rrtlを加え乳化し
た。この乳化液を2週間間隔でヤギに5回注射した。最
後の注射の2週間後に全採血し、抗血清を得た。
ブリンIT1gを生理食塩水2 mlに溶かしフロイン
トコンプリートアジュバント2 rrtlを加え乳化し
た。この乳化液を2週間間隔でヤギに5回注射した。最
後の注射の2週間後に全採血し、抗血清を得た。
■ 競合反応を利用した糖脂質の定量
1、 ア770GM、の定量
測定用試験管に標準アシアロGM、または抑清検体10
0μtとオリゴ糖−テロジン−I251100μt1抗
−−アシアロGMI 抗体100μtを加えインキュベ
ーション後、抗−家兎r−グロブリン抗体500μtを
加えインキュベーションした。
0μtとオリゴ糖−テロジン−I251100μt1抗
−−アシアロGMI 抗体100μtを加えインキュベ
ーション後、抗−家兎r−グロブリン抗体500μtを
加えインキュベーションした。
3.00 Orpmで20分遠心分離後上清を除去し、
沈殿の放射能を測定した。
沈殿の放射能を測定した。
1−1 アシアロGM、の糖鎖部分の作製アシアロGM
、 100■をメタノール:ヘキサン(4:3)20s
t7!に溶かした後、オゾンを30分間通気する。脂質
様浮遊物を遠心分離で除き、炭酸ナトリウム水溶液を加
え18時間室温放置する(pH10,5〜11)。その
後10.00Orpm 20分遠心分離し上清にDow
ex 5Q (H” form )を加え、ナトリウム
イオンを除いた後、セファデックスG−25カラムクロ
マトグラフイーにより約401ngのオリゴ糖が得られ
た。
、 100■をメタノール:ヘキサン(4:3)20s
t7!に溶かした後、オゾンを30分間通気する。脂質
様浮遊物を遠心分離で除き、炭酸ナトリウム水溶液を加
え18時間室温放置する(pH10,5〜11)。その
後10.00Orpm 20分遠心分離し上清にDow
ex 5Q (H” form )を加え、ナトリウム
イオンを除いた後、セファデックスG−25カラムクロ
マトグラフイーにより約401ngのオリゴ糖が得られ
た。
1−2 アシアロGM、のオリゴ糖のチロシン誘導体の
作製 +I (blで得られたアシアロGM、のオリゴ糖5■
とNaBCNH320■を蒸留水20 dに溶解し、こ
れにジアミノヘキサン5 mgを加え5時間還流した。
作製 +I (blで得られたアシアロGM、のオリゴ糖5■
とNaBCNH320■を蒸留水20 dに溶解し、こ
れにジアミノヘキサン5 mgを加え5時間還流した。
冷後反応液を減圧上濃縮し、セファデックスG−25カ
ラムクロマトグラフイーによシヘキシルアミンオリゴ糖
を精製した。
ラムクロマトグラフイーによシヘキシルアミンオリゴ糖
を精製した。
一方、1ONグのチロシンをN−ハイドロキシサクシイ
ミド、ジサイクロへキシルカルボジイミドの存在下でN
−ハイドロキシサクシイミドエステルを形成させる。こ
れに先に得たヘキシルアミンオリゴ糖5 mgを添加し
24〜72時間室温にて反応させる。セファデックスG
−25カラムクロマトグラフイーにより約6■のアシア
ロGM、オリゴ糖のチロシン誘導体を得た。
ミド、ジサイクロへキシルカルボジイミドの存在下でN
−ハイドロキシサクシイミドエステルを形成させる。こ
れに先に得たヘキシルアミンオリゴ糖5 mgを添加し
24〜72時間室温にて反応させる。セファデックスG
−25カラムクロマトグラフイーにより約6■のアシア
ロGM、オリゴ糖のチロシン誘導体を得た。
1−3 オリゴ糖の12J標識
試験管K 1 mciのNatzsI20 μll、
0.5 Mリン酸緩衝液(pH7,4) 25μ11チ
ロシンを導入したアシアロGMIのオリゴ糖1.5μV
およびクロラミンT(1〜/m7)25μlを加えた後
約30秒間振とう反応させり後、ヒロ亜硫酸ナトリウム
(1”i//ilり100μlを加えて反応を停止した
。
0.5 Mリン酸緩衝液(pH7,4) 25μ11チ
ロシンを導入したアシアロGMIのオリゴ糖1.5μV
およびクロラミンT(1〜/m7)25μlを加えた後
約30秒間振とう反応させり後、ヒロ亜硫酸ナトリウム
(1”i//ilり100μlを加えて反応を停止した
。
セファデックスG−25カラムクロマトグラフイーによ
り遊離の121Jを除去し、オリゴ糖−チロジン−12
51を得た。
り遊離の121Jを除去し、オリゴ糖−チロジン−12
51を得た。
■ サンドウィッチ法を利用した糖脂質の定量1、 ア
シアロGMIの定量 測定用プレートに標準アシアロGM、または血清検体1
00μ4と0.1MMリン酸緩衝液pH8,6) 10
0μlを入れる。抗−アシアロGM、抗体ビーズ1個を
加えインキュベート後反応液を除去し生理食塩水で2回
洗浄する。さらに抗−アシアロGM、抗体−+2J20
0μlを加えインキュベートする。反応液を除去した後
生理食塩水で3回洗浄しビーズをカウント用試験管に移
して放射能を測定した。
シアロGMIの定量 測定用プレートに標準アシアロGM、または血清検体1
00μ4と0.1MMリン酸緩衝液pH8,6) 10
0μlを入れる。抗−アシアロGM、抗体ビーズ1個を
加えインキュベート後反応液を除去し生理食塩水で2回
洗浄する。さらに抗−アシアロGM、抗体−+2J20
0μlを加えインキュベートする。反応液を除去した後
生理食塩水で3回洗浄しビーズをカウント用試験管に移
して放射能を測定した。
1−1 抗−アシアロGMl抗体の固相化ポリスチレン
ビーズ500個を100mJのふた付ビンに入れる。ビ
ーズ1個当たり抗−アシアロGMI抗体2 tty /
0.16 rnl 0.1Mリン酸緩衝液(pH7,
8,)を加え密栓して一夜ローテーションする。0.9
%NaCl液で5回洗浄後デシケータ−中で乾燥し固相
化抗体を得た。
ビーズ500個を100mJのふた付ビンに入れる。ビ
ーズ1個当たり抗−アシアロGMI抗体2 tty /
0.16 rnl 0.1Mリン酸緩衝液(pH7,
8,)を加え密栓して一夜ローテーションする。0.9
%NaCl液で5回洗浄後デシケータ−中で乾燥し固相
化抗体を得た。
1−2 抗−アシアロGM1抗体の1251標識シリコ
ン処理した試験管にl mCiのNa125120μl
、0.5Mリン酸緩衝液(pH7,5) 25μgを加
える。抗−アジアロOM、抗体液を50μl加え、さら
にクロラミンT (3mW / m、l! ) 25
ttllを加える。20〜30秒間よく振って反応させ
た後、メタ重亜硫酸ソーダ(3mg/m1)100μl
を加えて反応を停止する。これにヨウ化カリウム(50
mW / ml ) 25μ11 ウシ血清アルブミン
液(5% ) 100μlを加え、セファデックスG−
25によるゲル沢過で遊離の125■を除去し +2J
標識抗−アシアロGM、抗体を得た。
ン処理した試験管にl mCiのNa125120μl
、0.5Mリン酸緩衝液(pH7,5) 25μgを加
える。抗−アジアロOM、抗体液を50μl加え、さら
にクロラミンT (3mW / m、l! ) 25
ttllを加える。20〜30秒間よく振って反応させ
た後、メタ重亜硫酸ソーダ(3mg/m1)100μl
を加えて反応を停止する。これにヨウ化カリウム(50
mW / ml ) 25μ11 ウシ血清アルブミン
液(5% ) 100μlを加え、セファデックスG−
25によるゲル沢過で遊離の125■を除去し +2J
標識抗−アシアロGM、抗体を得た。
1−3 抗−アシアロGMI 抗体のフルオレセイン標
識 抗−アシアロGMl抗体5〜を0.1M ) jlス塩
酸緩衝液(pH8,0) 1 mlに溶解した。この溶
液にフルオレセインインチオシアネート(FITC)
50μmの食塩水溶液を攪拌しながら加えた後IN N
aOHをpH9,5になるまでゆっくり攪拌しながら加
え、さらに室温で1時間攪拌しながら反応させた。反応
終了後0.01Mリン酸緩衝液(pH7,6)に対して
4℃で−・夜透析した後セファデックス()−25でゲ
ルf過し、標識抗体を得た。
識 抗−アシアロGMl抗体5〜を0.1M ) jlス塩
酸緩衝液(pH8,0) 1 mlに溶解した。この溶
液にフルオレセインインチオシアネート(FITC)
50μmの食塩水溶液を攪拌しながら加えた後IN N
aOHをpH9,5になるまでゆっくり攪拌しながら加
え、さらに室温で1時間攪拌しながら反応させた。反応
終了後0.01Mリン酸緩衝液(pH7,6)に対して
4℃で−・夜透析した後セファデックス()−25でゲ
ルf過し、標識抗体を得た。
1−4 抗−アシアロC)Ml抗体のペルオキシダーゼ
標識 ペルオキシダーゼ5■を0.3M重炭酸すトリウム緩衝
液(pH8,1) 1 mlに溶解した後、1チ1−フ
ルオロ−2,4−ジニトロベンゼン(FDNP)エタノ
ール溶液0.I WLlを加え、室温で1時間反応させ
た。さらに0.06M過ヨウ素酸す) IJウム 1
ynlを加え室温で30分間反応させた後、0.16M
エチレングリコールIWLlを加え室温で1時間反応さ
せた。次に001M炭酸ナトリウム緩衝液(pH9,5
)に対し4℃で一夜透析した後、抗−アシアロGMl抗
体5■を加え、室温で2時間反応させた。さらに水素化
硼素ナトリウム5qを加え4℃で一夜放置し、 0.0
1M +77酸塩緩衝塩化ナトリウム液に対し、4℃で
一夜透析した後、セファデックスG −200でゲル沢
過し標識抗体を得た。
標識 ペルオキシダーゼ5■を0.3M重炭酸すトリウム緩衝
液(pH8,1) 1 mlに溶解した後、1チ1−フ
ルオロ−2,4−ジニトロベンゼン(FDNP)エタノ
ール溶液0.I WLlを加え、室温で1時間反応させ
た。さらに0.06M過ヨウ素酸す) IJウム 1
ynlを加え室温で30分間反応させた後、0.16M
エチレングリコールIWLlを加え室温で1時間反応さ
せた。次に001M炭酸ナトリウム緩衝液(pH9,5
)に対し4℃で一夜透析した後、抗−アシアロGMl抗
体5■を加え、室温で2時間反応させた。さらに水素化
硼素ナトリウム5qを加え4℃で一夜放置し、 0.0
1M +77酸塩緩衝塩化ナトリウム液に対し、4℃で
一夜透析した後、セファデックスG −200でゲル沢
過し標識抗体を得た。
■ イムノメトリックアッセイ法を利用した糖脂質の定
量 1 ラジオアイソトープを使用したイムノメトリックア
ッセイによるアシアロGMlの定量測定用プレートに標
準アシアロGM、または血清検体100μlと抗−アシ
アロGM、抗体希釈液100 ttlJを加え、インキ
ュベーション(第1反応)後、アジアOGM、結合ビー
ズ1個を加えさらにインキュベーション(第2反応)し
た。次に0.9%Na1lで4回ビーズを洗浄してから
抗−家兎r−グロブリン抗体−1251200μlを加
えインキュベーション(第3反応)した。09%NaC
lで4回洗浄後ビーズをカウント用試験管へ移して放射
能を測定し7た。
量 1 ラジオアイソトープを使用したイムノメトリックア
ッセイによるアシアロGMlの定量測定用プレートに標
準アシアロGM、または血清検体100μlと抗−アシ
アロGM、抗体希釈液100 ttlJを加え、インキ
ュベーション(第1反応)後、アジアOGM、結合ビー
ズ1個を加えさらにインキュベーション(第2反応)し
た。次に0.9%Na1lで4回ビーズを洗浄してから
抗−家兎r−グロブリン抗体−1251200μlを加
えインキュベーション(第3反応)した。09%NaC
lで4回洗浄後ビーズをカウント用試験管へ移して放射
能を測定し7た。
この様にして得られた標準曲線の1例と癌患者血中のア
シアロ0Ml値の測定結果を図1.4.5.6に示した
。
シアロ0Ml値の測定結果を図1.4.5.6に示した
。
1−1 不溶化アシアロGM、 (免疫吸着体)の調製
ポリスチレンビーズが1〜2層となるように適当な大き
さのビーカーに入れ、純水で5回洗浄した。アシアロG
MI液をビーズ1個当たり0.2ml加えテ室温テロ0
〜90分静置した。アシアロGMr液ヲデカンテーショ
ンで除去後、リン酸塩緩衝塩化ナトリウム液(PBS)
で4回洗浄後、PBS中で4℃保存した。
さのビーカーに入れ、純水で5回洗浄した。アシアロG
MI液をビーズ1個当たり0.2ml加えテ室温テロ0
〜90分静置した。アシアロGMr液ヲデカンテーショ
ンで除去後、リン酸塩緩衝塩化ナトリウム液(PBS)
で4回洗浄後、PBS中で4℃保存した。
不溶化アジアO0M2 、不溶化フコGA1および不溶
化バラグロボシドも同様にして調製することができた。
化バラグロボシドも同様にして調製することができた。
1−2 抗−家兎γ−グロブリン抗体の+51標識
シリコン処理した試験管に1mciのNa”51 20
μl、0.5Mリン酸緩衝液(pH7,5) 25μl
を加える。
μl、0.5Mリン酸緩衝液(pH7,5) 25μl
を加える。
抗−家兎γ−グロブリン抗体液を50μl加え、さらに
クロラミンT(3〜/m1)25μlを加える。
クロラミンT(3〜/m1)25μlを加える。
20〜30秒間よく振って反応させた後、メタ重亜硫酸
ソーダ(3η/mlり100μlを加えて反応を停止す
る。これにヨウ化カリウム(50■/ d ) 25μ
11ウシ血清アルラ゛ミン液(5% ) tooμlを
加え、セファデックスG−25によるゲルr過で遊離の
1251を除去し 1251標識抗−家兎γ−グロブリ
ン抗体を得た。
ソーダ(3η/mlり100μlを加えて反応を停止す
る。これにヨウ化カリウム(50■/ d ) 25μ
11ウシ血清アルラ゛ミン液(5% ) tooμlを
加え、セファデックスG−25によるゲルr過で遊離の
1251を除去し 1251標識抗−家兎γ−グロブリ
ン抗体を得た。
2、 酵素を使用したイムノメトリックアッセイによる
アシアロ()Mfiの定量 測定用プレートに標準アシアロGM2100μlと抗−
アシアロGM2抗体希釈液100μlを加えインキュベ
ーション後、アシアロGM2結合ビーズ1個を加えさら
にインキュベーションした。次に0.01Mリン酸緩衝
塩化ナトリウム液(PBX)で5回ビーズを洗浄してか
らペルオキシダーゼ結合抗−家兎r−グロブリン抗体2
00μlを加えインキュベージコンした。PBSで5回
ビーズを洗浄後、酵素基質(0,05チ過酸化水素:
O,OS%5−アミンサリチル酸=9:1、NaOHを
加えpHを6.0とする)225μlを加えインキ−ベ
ートし、450nmにおける吸光度をこのようにして得
られた標準曲線の1例を第2図に示した。
アシアロ()Mfiの定量 測定用プレートに標準アシアロGM2100μlと抗−
アシアロGM2抗体希釈液100μlを加えインキュベ
ーション後、アシアロGM2結合ビーズ1個を加えさら
にインキュベーションした。次に0.01Mリン酸緩衝
塩化ナトリウム液(PBX)で5回ビーズを洗浄してか
らペルオキシダーゼ結合抗−家兎r−グロブリン抗体2
00μlを加えインキュベージコンした。PBSで5回
ビーズを洗浄後、酵素基質(0,05チ過酸化水素:
O,OS%5−アミンサリチル酸=9:1、NaOHを
加えpHを6.0とする)225μlを加えインキ−ベ
ートし、450nmにおける吸光度をこのようにして得
られた標準曲線の1例を第2図に示した。
2−1 抗−家兎r−グロブリン抗体のペルオキシダー
ゼ標識 ペルオキシダーゼ5mgを0.3M重炭酸ナトリウム緩
衝液(pH8,1) 1 m/に溶解した後、1%1−
フルオロ−2,4−ジニトロベンゼン(FDNP) エ
タノール溶液0.1罰を加え、室温で1時間反応させた
。さらに0.06M過ヨウ素酸ナトリウム1dを加え室
温で30分反応させた後、0.16Mエチレングリコー
ル1mlを加え室温で1時間反応させた。次に0.01
M 炭酸ナトリウム緩衝液(pH9,5)に対し、4℃
で一夜透析した後、抗−家兎r−グロブリン抗体5■を
加え、室温で2時間反応させた。さらに水素化硼素ナト
リウム5■を加え4℃で一夜放置し、0.01Mリン酸
塩緩衝塩化ナトリウム液に対し、4℃で一夜透析した後
、セファデックスG −200でゲル沢過し標識抗体を
得た。
ゼ標識 ペルオキシダーゼ5mgを0.3M重炭酸ナトリウム緩
衝液(pH8,1) 1 m/に溶解した後、1%1−
フルオロ−2,4−ジニトロベンゼン(FDNP) エ
タノール溶液0.1罰を加え、室温で1時間反応させた
。さらに0.06M過ヨウ素酸ナトリウム1dを加え室
温で30分反応させた後、0.16Mエチレングリコー
ル1mlを加え室温で1時間反応させた。次に0.01
M 炭酸ナトリウム緩衝液(pH9,5)に対し、4℃
で一夜透析した後、抗−家兎r−グロブリン抗体5■を
加え、室温で2時間反応させた。さらに水素化硼素ナト
リウム5■を加え4℃で一夜放置し、0.01Mリン酸
塩緩衝塩化ナトリウム液に対し、4℃で一夜透析した後
、セファデックスG −200でゲル沢過し標識抗体を
得た。
3、 酵素を使用したイムノメトリックアッセイによる
パラグロボシドの定量 測定用プレートに標準パラグロボシド100μlと抗−
パラグロボシド抗体希釈液100μlを加えインキュベ
ーション後、パラグロボシド結合ビーズ1個を加えさら
にインキュベートした。次に0.QIMリン酸緩衝塩化
ナトリウム液(PBS)で5回ビーズを洗浄してからペ
ルオキシダーゼ結合抗−家兎γ−グロブリン抗体200
μlを加えインキュベーションした。PBSで5回ビー
メイ浄後、酵素基質(0゜05チ過酸化水素:008%
5−アミノサリチル酸=9:1、NaOHを加えpHを
6.0とする)225μlを加えインキュベー) L
450 nmにおける吸光度を測定した。
パラグロボシドの定量 測定用プレートに標準パラグロボシド100μlと抗−
パラグロボシド抗体希釈液100μlを加えインキュベ
ーション後、パラグロボシド結合ビーズ1個を加えさら
にインキュベートした。次に0.QIMリン酸緩衝塩化
ナトリウム液(PBS)で5回ビーズを洗浄してからペ
ルオキシダーゼ結合抗−家兎γ−グロブリン抗体200
μlを加えインキュベーションした。PBSで5回ビー
メイ浄後、酵素基質(0゜05チ過酸化水素:008%
5−アミノサリチル酸=9:1、NaOHを加えpHを
6.0とする)225μlを加えインキュベー) L
450 nmにおける吸光度を測定した。
このようにして得られた標準曲線の1例を第3図に示し
た。
た。
3−1 抗−家兎r−グロブリン抗体のペルオキシダー
ゼ標識 ペルオキシダーゼ511qを0.3M重炭酸ナトリウム
緩衝液(pH8,1) 1だlに溶解した後、1%1−
フルオロ−2,4−ジニトロベンゼン(FDNP)エタ
ノール溶液0.1 mlを加え、室温で1時間反応させ
た。さらに0.06M過ヨウ素酸ナトリウム1 rul
を加え室温で30分反応させた後、0.16Mエチレン
グリコール1dを加え室温で1時間反応させた。次に0
.01M 炭酸ナトリウム緩衝液(pH9,5)に対し
、4℃で一夜透析した後、抗−家兎r−グロブリン抗体
5 mgを加え、室温で2時間反応させた。さらに水素
化硼素ナトリウム5■を加え4℃で一夜放置し、0.0
1Mリン酸塩緩衝塩化ナトリウム液に対し、4℃で一夜
透析した後、セファデックスG−200でゲルr過し標
識抗体を得だ。
ゼ標識 ペルオキシダーゼ511qを0.3M重炭酸ナトリウム
緩衝液(pH8,1) 1だlに溶解した後、1%1−
フルオロ−2,4−ジニトロベンゼン(FDNP)エタ
ノール溶液0.1 mlを加え、室温で1時間反応させ
た。さらに0.06M過ヨウ素酸ナトリウム1 rul
を加え室温で30分反応させた後、0.16Mエチレン
グリコール1dを加え室温で1時間反応させた。次に0
.01M 炭酸ナトリウム緩衝液(pH9,5)に対し
、4℃で一夜透析した後、抗−家兎r−グロブリン抗体
5 mgを加え、室温で2時間反応させた。さらに水素
化硼素ナトリウム5■を加え4℃で一夜放置し、0.0
1Mリン酸塩緩衝塩化ナトリウム液に対し、4℃で一夜
透析した後、セファデックスG−200でゲルr過し標
識抗体を得だ。
4、抗−家兎γ−グロブリン抗体のフルオレセイン標識
抗−家兎γ−グロブリン抗体5mグを0.1M トリス
塩酸緩衝液(pH8,0) 1 dに溶解した。この溶
液にフルオレセインイソチオシアネート(FITC)
50μmの食塩水溶液を攪拌しながら加えた後、IN
NaOHをpH9,5になるまでゆっく9攪拌しながら
加え、さらに室温で1時間攪拌しながら反応させた。反
応終了後、 0.01M +77酸緩衝液(pH7,6
)に対して4℃で一夜透析した後セファデックスG−2
5でゲル沢過し、標識抗体を得た。
塩酸緩衝液(pH8,0) 1 dに溶解した。この溶
液にフルオレセインイソチオシアネート(FITC)
50μmの食塩水溶液を攪拌しながら加えた後、IN
NaOHをpH9,5になるまでゆっく9攪拌しながら
加え、さらに室温で1時間攪拌しながら反応させた。反
応終了後、 0.01M +77酸緩衝液(pH7,6
)に対して4℃で一夜透析した後セファデックスG−2
5でゲル沢過し、標識抗体を得た。
この標識抗体はイムノメトリックアッセイ法の標識化合
物として用いることができる。
物として用いることができる。
第1図はラジオアイソトープを使用したイムノメトリッ
クアッセイ法による濃度既知の標準アシアロGM、溶液
を用いて作成した標準曲線である。 図中、横軸にはアンアロGM、濃度(”V/アl)を、
縦軸にはカラン) (x103cpm)をとっており、
この標準曲線によって測定対象試料のカウントより対応
するアシアロGM、の濃度を読みとり、その値を知るこ
とができる。 第2図および第3図は酵素を使用したイムノメトリック
アッセイ法によるアシアロGM2およびパラダロボシド
のそれぞれの標準曲線である。 第4図は本発明の方法により測定した癌患者血清中のア
シアロ0Ml値のプロットを示した図であり、良性疾患
患者および正常者より得られた値と比較して示されてい
る。横軸はアシアロGM、濃度(ny/扉l)である。 第5図は、本発明の方法により測定した癌患者血清中の
アシアロGM、値のプロットを癌の部位別に示したもの
である。 第6図は本発明の方法により測定した化学療法中の肺癌
患者血清中のアシアロ0Ml値を経時的に追跡した結果
を示すものである。 第7図は3種類の検体を用いて、図に示すような希釈倍
率で本発明方法により定量した試験結果を示すものであ
る。 特許出願人 ダイナボ、ト株式会社 第2図 アシアロGM、濃度(μf/mt) 第3図 ノぞラグロボシド濃度(μf/ml) 手 続 補 正 書 (方式) 昭和5g年70月77日 特許庁長官 若 杉 和 夫 殿 1、事件の表示 昭和sg年特許願第16!223号 2、発明の名称 免疫学的測定法による糖脂質の定量方法3、補正をする
者 事件との関係 特許出願人 住所 東京都港区虎ノ門3−g−27 第33森ビル乙階 名称 グイナボット株式会社 4、代 理 人 住所 東京都千代田区麹町3丁目2番地相互第一ビル 電話(21,!; )デ乙4tq 7、補正の内容 図面の浄書(内容に変更なし)以 上
クアッセイ法による濃度既知の標準アシアロGM、溶液
を用いて作成した標準曲線である。 図中、横軸にはアンアロGM、濃度(”V/アl)を、
縦軸にはカラン) (x103cpm)をとっており、
この標準曲線によって測定対象試料のカウントより対応
するアシアロGM、の濃度を読みとり、その値を知るこ
とができる。 第2図および第3図は酵素を使用したイムノメトリック
アッセイ法によるアシアロGM2およびパラダロボシド
のそれぞれの標準曲線である。 第4図は本発明の方法により測定した癌患者血清中のア
シアロ0Ml値のプロットを示した図であり、良性疾患
患者および正常者より得られた値と比較して示されてい
る。横軸はアシアロGM、濃度(ny/扉l)である。 第5図は、本発明の方法により測定した癌患者血清中の
アシアロGM、値のプロットを癌の部位別に示したもの
である。 第6図は本発明の方法により測定した化学療法中の肺癌
患者血清中のアシアロ0Ml値を経時的に追跡した結果
を示すものである。 第7図は3種類の検体を用いて、図に示すような希釈倍
率で本発明方法により定量した試験結果を示すものであ
る。 特許出願人 ダイナボ、ト株式会社 第2図 アシアロGM、濃度(μf/mt) 第3図 ノぞラグロボシド濃度(μf/ml) 手 続 補 正 書 (方式) 昭和5g年70月77日 特許庁長官 若 杉 和 夫 殿 1、事件の表示 昭和sg年特許願第16!223号 2、発明の名称 免疫学的測定法による糖脂質の定量方法3、補正をする
者 事件との関係 特許出願人 住所 東京都港区虎ノ門3−g−27 第33森ビル乙階 名称 グイナボット株式会社 4、代 理 人 住所 東京都千代田区麹町3丁目2番地相互第一ビル 電話(21,!; )デ乙4tq 7、補正の内容 図面の浄書(内容に変更なし)以 上
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1、 定量しようとする体液中の糖脂質を該糖脂質に対
する特異抗体を用いて免疫学的方法により測定すること
を特徴とする糖脂質の測定方法。 2 定量しようとする体液中の糖脂質と標識剤で標識し
た標識糖脂質(あるいは標識オリゴ糖)とを抗−糖脂質
抗体に対して競合反応させ、次いで抗体が結合した標識
糖脂質(あるいは標識オリゴ糖)と抗体が結合していな
い標識糖脂質(あるいは標識オリゴ糖)とを分離し、そ
れらの分画の一方または両方の標識剤の活性を測定する
ことを特徴とする特許請求の範囲第1項記載の方法。 3 標識剤が放射性物質、酵素あるいは蛍光物質である
特許請求第2項記載の方法。 4糖IIW 質カアシアロGM、 、アシアロGM2、
フコGA、あるいはパラグロボシドである特許請求の範
囲第2項記載の方法。 5 不溶性物質(担体)に抗−糖脂質抗体を結合させた
不溶化抗体に定量しようとする体液中の糖脂質を反応さ
せ、次いで標識剤で標識した標識抗−糖脂質抗体と反応
させた後、不溶化抗体上の糖脂質と結合した標識抗−糖
脂質抗体の標識剤の活性を測定することを特徴とする特
許請求の範囲第1項記載の方法。 6、標識剤が放射性物質、酵素あるいは蛍光物質である
特許請求の範囲第5項記載の方法・7 糖脂質がアシア
ロGM、、アシアロ()M2.7コGA、あるいはパラ
グロボシドである特許請求の範囲第5項記載の方法。 8、定量しようとする体液中の糖脂質と標識剤で標識し
た標識抗−糖脂質抗体の一定量とを反応させた後、不溶
性物質(担体)に糖脂質を結合させた免疫吸着体(Im
munoadsorbent )で未反応の標識抗−糖
脂質抗体を吸着し、該免疫吸着体」二の標識剤の活性を
測定することを特徴とする特許請求の範囲第1項記載の
方法。 9、標識剤が放射性物質、酵素および蛍光物質である特
許請求の範囲第8項記載の方法。 8項記載の方法。 11、定量しようとする体液中の糖脂質と一定量の抗−
糖脂質抗体と反応させた後、不溶性物質(担体)に糖脂
質を結合させた免疫吸着体(Immuno−adsor
bent ) で未反応の抗−糖脂質抗体を吸着し、次
いで該免疫吸着体を分離し、さらに抗−糖脂質抗体に対
する抗=IgG抗体を標識剤で標識した標識抗−IgG
抗体と反応させ、該免疫吸着体に結合した標識抗−Ig
G抗体の標識剤の活性を測定することを特徴とする特許
請求の範囲第1項記載の方法。 12、標識剤が放射性物質、酵素あるいは蛍光物質であ
る特許請求の範囲第11項記載の方法。 13 オリゴ糖がアシアロGM、 、77700M2.
フコGA、あるいはパラグロボシドの糖鎖部分である特
許請求の範囲第11項記載の方法。
Priority Applications (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP58165223A JPS6057254A (ja) | 1983-09-09 | 1983-09-09 | 免疫学的測定法による糖脂質の定量方法 |
US06/861,086 US4757003A (en) | 1983-09-09 | 1986-05-08 | Method for the detection of cancer |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP58165223A JPS6057254A (ja) | 1983-09-09 | 1983-09-09 | 免疫学的測定法による糖脂質の定量方法 |
Related Child Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP23697090A Division JPH03115863A (ja) | 1990-09-10 | 1990-09-10 | 免疫学的測定法による糖脂質の定量方法 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPS6057254A true JPS6057254A (ja) | 1985-04-03 |
Family
ID=15808189
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP58165223A Pending JPS6057254A (ja) | 1983-09-09 | 1983-09-09 | 免疫学的測定法による糖脂質の定量方法 |
Country Status (2)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US4757003A (ja) |
JP (1) | JPS6057254A (ja) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS63222265A (ja) * | 1987-01-21 | 1988-09-16 | イー・アイ・デュポン・ドゥ・ヌムール・アンド・カンパニー | リポ多糖類の非免疫化学的結合およびそのサンドイッチ法による分析方法 |
JP2013528185A (ja) * | 2010-05-27 | 2013-07-08 | ジーイー・ヘルスケア・バイオサイエンス・アクチボラグ | タンパク質の標識法及びキット |
Families Citing this family (12)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
SE468231B (sv) * | 1984-05-18 | 1992-11-23 | Kabi Pharmacia Ab | Foerfarande foer att paavisa smaacelligt lungcarcinomantigen och anvaendning av antikroppar mot fukosylsialosylgangliotetraos foer framstaellning av komposition foer behandling eller in vivo/ diagnos |
US4906562A (en) * | 1984-12-21 | 1990-03-06 | Oncogen | Monocolonal antibodies and antigen for human non-small cell lung carcinomas |
US4737295A (en) * | 1986-07-21 | 1988-04-12 | Venture Chemicals, Inc. | Organophilic polyphenolic acid adducts |
US4942224A (en) * | 1987-01-12 | 1990-07-17 | The Biomembrane Institute | A-associated H-antigens, monoclonal antibodies specific thereto and methods for employing the same in blood typing |
US4857639A (en) * | 1987-01-12 | 1989-08-15 | The Biomembrane Institute | A-associated H-antigens, monoclonal antibodies specific thereto and methods for employing the same in blood typing |
US4971905A (en) * | 1987-08-11 | 1990-11-20 | Pacific Northwest Research Foundation | Diagnosis of cancerous or precancerous conditions in human secretory epithelia by enzyme activity of β-1-3N-acetylglucosaminyltransferase |
US5403717A (en) * | 1987-08-11 | 1995-04-04 | Pacific Northwest Research | Diagnosis of premalignant or malignant conditions of human secretory epithelia |
US4944343A (en) * | 1987-08-29 | 1990-07-31 | Mueller Fritz | Apparatus for heating fuel |
DE3840044A1 (de) * | 1988-11-27 | 1990-06-07 | Behringwerke Ag | Glykosphingolipide mit kopplungsfaehiger gruppe im sphingoidanteil, ihre herstellung und verwendung |
US5620864A (en) * | 1992-06-29 | 1997-04-15 | Health Research, Inc. | Acceptor for fucosyl transferase |
JP2002184581A (ja) * | 2000-12-13 | 2002-06-28 | Sanyo Electric Co Ltd | 有機発光素子 |
EP3771909A1 (en) * | 2019-07-30 | 2021-02-03 | Medizinische Hochschule Hannover | Analytical method and immunological treatment for bladder cancer |
-
1983
- 1983-09-09 JP JP58165223A patent/JPS6057254A/ja active Pending
-
1986
- 1986-05-08 US US06/861,086 patent/US4757003A/en not_active Expired - Lifetime
Non-Patent Citations (4)
Title |
---|
ARCHIVES OF BIOCHEMISTRY AND BIOPHYSICS=1980 * |
J.BIOCHEM=1982 * |
JOURNAL OF IMMUNOLICAL METHODS=1979 * |
JOURNAL OF NEUROMMUNOLOGY=1982 * |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS63222265A (ja) * | 1987-01-21 | 1988-09-16 | イー・アイ・デュポン・ドゥ・ヌムール・アンド・カンパニー | リポ多糖類の非免疫化学的結合およびそのサンドイッチ法による分析方法 |
JP2013528185A (ja) * | 2010-05-27 | 2013-07-08 | ジーイー・ヘルスケア・バイオサイエンス・アクチボラグ | タンパク質の標識法及びキット |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
US4757003A (en) | 1988-07-12 |
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