JPS6112224B2 - - Google Patents
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- JPS6112224B2 JPS6112224B2 JP59120050A JP12005084A JPS6112224B2 JP S6112224 B2 JPS6112224 B2 JP S6112224B2 JP 59120050 A JP59120050 A JP 59120050A JP 12005084 A JP12005084 A JP 12005084A JP S6112224 B2 JPS6112224 B2 JP S6112224B2
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Description
【発明の詳細な説明】
本発明は液体試料とくに尿や血清のような生物
学的液体試料中の抗体、抗原ならびに抗体：抗原
複合体を定量するための試薬に関するものであ
る。以下、簡単のために以後Ab、AgおよびAb：
Ag複合体という記号をそれぞれ抗体、抗原およ
び抗体：抗原複合体の意味に使う。
学的液体試料中の抗体、抗原ならびに抗体：抗原
複合体を定量するための試薬に関するものであ
る。以下、簡単のために以後Ab、AgおよびAb：
Ag複合体という記号をそれぞれ抗体、抗原およ
び抗体：抗原複合体の意味に使う。
よく知られているように生物学的液体中の
Ab、AgおよびAb：Ag複合体の定量は重要であ
る。例えば多くの病気はこのAb：Ag複合体が循
環系に存在することによつて特徴づけられてい
る。Agはバクテリアまたはビールスの存在によ
るたん白質あるいは人体組織またはガン細胞から
放出されたたん白質を含む多種類のたん白質のど
れかである。Abは、もちろん特定のAgに対して
特異性をもつものであり、それしそれはリンパ系
によつて合成されるIgG類の免疫グロブリンが大
部分である。血液中のAb：Ag複合体を検出し、
分離しそしてその特性づけをすることは価値ある
情報を提供し、そして例えば病気の診断に使われ
る。
Ab、AgおよびAb：Ag複合体の定量は重要であ
る。例えば多くの病気はこのAb：Ag複合体が循
環系に存在することによつて特徴づけられてい
る。Agはバクテリアまたはビールスの存在によ
るたん白質あるいは人体組織またはガン細胞から
放出されたたん白質を含む多種類のたん白質のど
れかである。Abは、もちろん特定のAgに対して
特異性をもつものであり、それしそれはリンパ系
によつて合成されるIgG類の免疫グロブリンが大
部分である。血液中のAb：Ag複合体を検出し、
分離しそしてその特性づけをすることは価値ある
情報を提供し、そして例えば病気の診断に使われ
る。
Ag、AbおよびAb：Ag複合体の検出ならびに
定量そして特にAgの性質と量を決定するための
公知の技術は数多くなる。これらの定量技術は
「免疫検定法」と呼ばれている。
定量そして特にAgの性質と量を決定するための
公知の技術は数多くなる。これらの定量技術は
「免疫検定法」と呼ばれている。
自然に生成する物質である補体
（complement）の特定の成分であるClqは、Ab：
Ag複合体とは結合する性質をもつているが遊離
のAgまたは遊離のAbと結合する性質はもたない
ということがある時代に知られた。この性質を
Ab：Ag複合体の検出にある特殊な方法で使うと
いう提案がかつてあつたが、それは定量法または
絶体量の決定のできる方法ではなく、Ab、Agお
よびAb：Ag複合体の分析にClqを有力、有用な
試薬として使うことは末だかつて実現されていな
い。
（complement）の特定の成分であるClqは、Ab：
Ag複合体とは結合する性質をもつているが遊離
のAgまたは遊離のAbと結合する性質はもたない
ということがある時代に知られた。この性質を
Ab：Ag複合体の検出にある特殊な方法で使うと
いう提案がかつてあつたが、それは定量法または
絶体量の決定のできる方法ではなく、Ab、Agお
よびAb：Ag複合体の分析にClqを有力、有用な
試薬として使うことは末だかつて実現されていな
い。
本発明者は、溶解した形にあるClqはAb、Ag
および（または）Ab：Ag複合体を含む分析法に
おいて実際適用範囲の広い試薬となることおよび
それを使うと例えば免疫検定手法を簡易にし、そ
してより精確にすることを見出した。
および（または）Ab：Ag複合体を含む分析法に
おいて実際適用範囲の広い試薬となることおよび
それを使うと例えば免疫検定手法を簡易にし、そ
してより精確にすることを見出した。
Clqは天然の循環するたん白質であり、その分
離や精製の方法は公知である。それは通常ヒト、
ウサギまたはウシの血清から得られるが、その手
法は“ユウグロブリン（euglobulin）沈でん”と
して知られている。〔J.Immunol.，106，304〜
413（1971）〕 本発明はこのClqを不溶性化し分析試薬として
の適用範囲をさらに広げるものである。この不溶
性化は水性液体に不溶性の固体相基質に共有結合
させるか、または吸着させて行う。このような固
体相基質の１例はラテツクスである。
離や精製の方法は公知である。それは通常ヒト、
ウサギまたはウシの血清から得られるが、その手
法は“ユウグロブリン（euglobulin）沈でん”と
して知られている。〔J.Immunol.，106，304〜
413（1971）〕 本発明はこのClqを不溶性化し分析試薬として
の適用範囲をさらに広げるものである。この不溶
性化は水性液体に不溶性の固体相基質に共有結合
させるか、または吸着させて行う。このような固
体相基質の１例はラテツクスである。
Clqを固体相基質に直接的にかまたは間接的に
共有結合させるには、たん白質を不溶性の基質に
共有結合させるために知られているそして使われ
ている一般的方法を使うことができる。この固体
相基質は結合反応のためにアミノ基またはカルボ
キシル基のような反応性基を１つまたは２つもつ
ていなければならない。適当な固体相基質には凝
集した免疫グロブリンのような自然に生成する物
質とアミノ化されたアガロース（agarose）のよ
うな合成物質とがある。ある場合にはClqを直接
固体相に共有結合させたりあるいは吸着させたり
することができる。それは例えば固体相がナイロ
ン、アガロース、セルロース、アクリルアミドも
しくはアクリルポリマー、ポリスチレンまたは種
種のガラス製品である場合がある。しかしながら
グルタルアルデヒドのような架橋物質を使つて
Clqを固体相に結合させることが好ましい。本発
明に使う好ましい試薬はClqをグルタルアルデヒ
ド橋によつてアミノ化されたアガロースに共有結
合させたものである。
共有結合させるには、たん白質を不溶性の基質に
共有結合させるために知られているそして使われ
ている一般的方法を使うことができる。この固体
相基質は結合反応のためにアミノ基またはカルボ
キシル基のような反応性基を１つまたは２つもつ
ていなければならない。適当な固体相基質には凝
集した免疫グロブリンのような自然に生成する物
質とアミノ化されたアガロース（agarose）のよ
うな合成物質とがある。ある場合にはClqを直接
固体相に共有結合させたりあるいは吸着させたり
することができる。それは例えば固体相がナイロ
ン、アガロース、セルロース、アクリルアミドも
しくはアクリルポリマー、ポリスチレンまたは種
種のガラス製品である場合がある。しかしながら
グルタルアルデヒドのような架橋物質を使つて
Clqを固体相に結合させることが好ましい。本発
明に使う好ましい試薬はClqをグルタルアルデヒ
ド橋によつてアミノ化されたアガロースに共有結
合させたものである。
Clqを合成固体相基質上に吸着させることによ
つて不溶性化する場合には、これは例えばClqの
溶液を固体相と接触させることによつて行なわれ
る。
つて不溶性化する場合には、これは例えばClqの
溶液を固体相と接触させることによつて行なわれ
る。
本発明による試薬は粒状または顆粒状例えばア
ミノ化アガロースのビーズ上にClqのコーチング
をもつているようなものが一般に好ましい。しか
しある種の目的例えば連続流れ式分析には、チユ
ーブの少なくとも内面の１部上にコーチングとし
て試薬を形造ることが好都合である。そうすると
チユーブを通る反応物が試薬のコーチングに接触
するようになる。
ミノ化アガロースのビーズ上にClqのコーチング
をもつているようなものが一般に好ましい。しか
しある種の目的例えば連続流れ式分析には、チユ
ーブの少なくとも内面の１部上にコーチングとし
て試薬を形造ることが好都合である。そうすると
チユーブを通る反応物が試薬のコーチングに接触
するようになる。
本発明による不溶性化したClq試薬は生物学的
分析に非常に数多くの用途をもつている。その根
本は、すべてのこれらの用途がこの試薬がAb：
Ag複合体と結合し、そして遊離のAbと遊離のAg
には結合しないという能力に依存するのである。
この能力によつて遊離のAbおよび遊離のAgとの
混合物からAb：Ag複合体を分離するためにこの
試薬を使うことが可能になるのである。
分析に非常に数多くの用途をもつている。その根
本は、すべてのこれらの用途がこの試薬がAb：
Ag複合体と結合し、そして遊離のAbと遊離のAg
には結合しないという能力に依存するのである。
この能力によつて遊離のAbおよび遊離のAgとの
混合物からAb：Ag複合体を分離するためにこの
試薬を使うことが可能になるのである。
この試薬は生物学的液体の連続流れ式分析に使
つて特別の利点がある。そして本発明はこのよう
な用途を含むものである。
つて特別の利点がある。そして本発明はこのよう
な用途を含むものである。
本発明がさらに充分に理解されるように、この
試薬を利用する様様の試験法をここに記載する。
試薬を利用する様様の試験法をここに記載する。
１ 分離法
生物学的（またはその他の）液体からAb：Ag
複合体を分離する方法はその液体を不溶性化した
Clqと接触させることである。液体中の複合体は
不溶性化したClqに結合するようになるが、これ
に反してAbまたはAgのようなそこに共存する他
の物質は結合しない（あるいは少しは結合しても
決して有意な程度にまでは結合することはな
い）。従つて、不溶性化したClqを混合物から分
離することにより。Clqに結合しているAb：Ag
複合体の分離ができる。次に所望により、適当な
塩濃度またはPHの適当な緩衝液で洗浄することに
よつて不溶性化したClqから複合体を分離するこ
とができる。この方法で比較的濃縮された複合体
の溶液を得ることができるのである。
複合体を分離する方法はその液体を不溶性化した
Clqと接触させることである。液体中の複合体は
不溶性化したClqに結合するようになるが、これ
に反してAbまたはAgのようなそこに共存する他
の物質は結合しない（あるいは少しは結合しても
決して有意な程度にまでは結合することはな
い）。従つて、不溶性化したClqを混合物から分
離することにより。Clqに結合しているAb：Ag
複合体の分離ができる。次に所望により、適当な
塩濃度またはPHの適当な緩衝液で洗浄することに
よつて不溶性化したClqから複合体を分離するこ
とができる。この方法で比較的濃縮された複合体
の溶液を得ることができるのである。
この方法は不溶性化したClqを含むカラムを用
いて便宜的に実施することができる。Ab：Ag複
合体を含む血清またはその他の試料をカラムを通
すとカラム中のClqに結合して複合体が保持され
る。複合体を次に溶出する。代表的な１つの方法
ではClqがグルタルアルデヒドと共に結合してい
るアミノ化されたアガロースのビーズから成るマ
イクロ―カラムが用いられる。血清をこのカラム
に通し、保持されたAb：Ag複合体を続いて例え
ばチオシアン酸アンモニウムの濃度を1Mから3M
へ増加させながら使つて溶出する。
いて便宜的に実施することができる。Ab：Ag複
合体を含む血清またはその他の試料をカラムを通
すとカラム中のClqに結合して複合体が保持され
る。複合体を次に溶出する。代表的な１つの方法
ではClqがグルタルアルデヒドと共に結合してい
るアミノ化されたアガロースのビーズから成るマ
イクロ―カラムが用いられる。血清をこのカラム
に通し、保持されたAb：Ag複合体を続いて例え
ばチオシアン酸アンモニウムの濃度を1Mから3M
へ増加させながら使つて溶出する。
カラムを使う代りとして、不溶性化したClqを
被検液体と簡単に例えばフラスコの中で混ぜ、そ
れから次に遠心分離またはろ過によつて分離する
こともできる。
被検液体と簡単に例えばフラスコの中で混ぜ、そ
れから次に遠心分離またはろ過によつて分離する
こともできる。
本発明の分離法はAb：Ag複合体ばかりでな
く、間接的に特殊のAbまたはAgを溶液から分離
するのにも有用である。例えばある溶液から抗原
Ag′を分離しようと欲する場合には、それに対し
て特異的な抗体Ab′を過剰に加えてAb′：Ag′複合
体を作り、次にこの複合体を本発明の試薬を使つ
て分離することができる。もし最初の溶液が
Ab：Ag複合体を含んでいるならば、特異的な抗
体Ab′を加える前に通常予備処理によつてこの複
合体を先ず分離して除かねばならない。
く、間接的に特殊のAbまたはAgを溶液から分離
するのにも有用である。例えばある溶液から抗原
Ag′を分離しようと欲する場合には、それに対し
て特異的な抗体Ab′を過剰に加えてAb′：Ag′複合
体を作り、次にこの複合体を本発明の試薬を使つ
て分離することができる。もし最初の溶液が
Ab：Ag複合体を含んでいるならば、特異的な抗
体Ab′を加える前に通常予備処理によつてこの複
合体を先ず分離して除かねばならない。
このような本発明の分離法の特に特徴とすると
ころは、これらの分離法が非常に効果的であるの
で、非常にうすいAb：Ag複合体の溶液からこの
複合体を集めたり濃縮したりすることができるこ
とである。血清やその他の生物学的液体中で複合
体が非常に低濃度で存在することはまれではない
から、上記のことは非常に重要な利点であり、そ
してそのような複合体を分離することは既知の方
法ではきわめて困難なことである。
ころは、これらの分離法が非常に効果的であるの
で、非常にうすいAb：Ag複合体の溶液からこの
複合体を集めたり濃縮したりすることができるこ
とである。血清やその他の生物学的液体中で複合
体が非常に低濃度で存在することはまれではない
から、上記のことは非常に重要な利点であり、そ
してそのような複合体を分離することは既知の方
法ではきわめて困難なことである。
２ 分離的検出および定量
(a) この試験は前記のように不溶性化したClqに
接触させることによつて生物学的液体から
Ab：Ag複合体を選択的に除去し、その後複合
体を検出することを含む。
接触させることによつて生物学的液体から
Ab：Ag複合体を選択的に除去し、その後複合
体を検出することを含む。
例えば血清試料を、その中にあるAb：Ag複
合体を不溶性化したClqに結合させることによ
つて除去するように取扱う。このように結合し
た複合体はClqから遊離されそして例えば可溶
性のClqを使つて検出される。すなわち赤血球
（または免疫グロブリンでコーチングされた粒
子）が可溶性Clqに接触すると凝集反応が起り
始める。しかし溶液中にAb：Ag複合体も存在
するときには、この複合体は比較的すみやかに
Clqと反応し、そしてClqは溶液中でAb：Ag複
合体に結合し、その結果コーチングされた粒子
（または赤血球）の凝集反応は起らなくなる。
このようにして液中のAb：Ag複合体の存在は
例えば血清を（可溶性）Clqと接触させそして
免疫グロブリンでコーチングされた粒子と接触
させることによつて検出することができる。凝
集反応が観察されたならば、その血清はAb：
Ag複合体を全く含んでいないのである。
合体を不溶性化したClqに結合させることによ
つて除去するように取扱う。このように結合し
た複合体はClqから遊離されそして例えば可溶
性のClqを使つて検出される。すなわち赤血球
（または免疫グロブリンでコーチングされた粒
子）が可溶性Clqに接触すると凝集反応が起り
始める。しかし溶液中にAb：Ag複合体も存在
するときには、この複合体は比較的すみやかに
Clqと反応し、そしてClqは溶液中でAb：Ag複
合体に結合し、その結果コーチングされた粒子
（または赤血球）の凝集反応は起らなくなる。
このようにして液中のAb：Ag複合体の存在は
例えば血清を（可溶性）Clqと接触させそして
免疫グロブリンでコーチングされた粒子と接触
させることによつて検出することができる。凝
集反応が観察されたならば、その血清はAb：
Ag複合体を全く含んでいないのである。
(b) この試験は試料中の特別のAbまたはAgの存
在を検出するにもまた有用である。例えば特定
の抗原Ag′を試験する場合には、先ず血清に適
当なそれに対して特異的な抗体Ab′を加え、そ
れからこの混合物をその中にある複合体を分離
するように本発明の試薬と接触させる。このよ
うな複合体が少しでもあれば、それは上記(a)で
述べたようにして検出することができる。血清
が始めから他のAb：Ag複合体を含んでいるな
らば、このような複合体はAb′を加える前に除
去することができる。
在を検出するにもまた有用である。例えば特定
の抗原Ag′を試験する場合には、先ず血清に適
当なそれに対して特異的な抗体Ab′を加え、そ
れからこの混合物をその中にある複合体を分離
するように本発明の試薬と接触させる。このよ
うな複合体が少しでもあれば、それは上記(a)で
述べたようにして検出することができる。血清
が始めから他のAb：Ag複合体を含んでいるな
らば、このような複合体はAb′を加える前に除
去することができる。
(c) 別の検出法では限られた量のClqに対して２
種類のAb：Ag複合体の間の競合が含まれる。
すなわち、たとえば過剰のラベル付きAb：Ag
複合体を限られた量の不溶性化したClqに加え
ると、そのときはすべてのClqは複合体に結合
してしまう。もしそのときラベル付き複合体の
外に、さらにラベル付きでないAb：Ag複合体
を含む血清試料を加えるならば、ラベル付き複
合体とラベル付きでない複合体が限られた量の
Clqに対してそのモル数に応じて競合すること
になる。平衡に達した後にClqがそれに結合し
た複合体といつしよに除かれるならば、残つた
溶液中にラベル付きの複合体が存在する（また
は特に最低量に存在する）ことはこの血清試料
はAb：Ag複合体を含んでいたことを示す。こ
の方法は血清試料中の複合体の量を測定するよ
うに定量的に操作することができる。
種類のAb：Ag複合体の間の競合が含まれる。
すなわち、たとえば過剰のラベル付きAb：Ag
複合体を限られた量の不溶性化したClqに加え
ると、そのときはすべてのClqは複合体に結合
してしまう。もしそのときラベル付き複合体の
外に、さらにラベル付きでないAb：Ag複合体
を含む血清試料を加えるならば、ラベル付き複
合体とラベル付きでない複合体が限られた量の
Clqに対してそのモル数に応じて競合すること
になる。平衡に達した後にClqがそれに結合し
た複合体といつしよに除かれるならば、残つた
溶液中にラベル付きの複合体が存在する（また
は特に最低量に存在する）ことはこの血清試料
はAb：Ag複合体を含んでいたことを示す。こ
の方法は血清試料中の複合体の量を測定するよ
うに定量的に操作することができる。
この技術もまた上述のように特別のAgまた
はAbの存在検出のために一般的に使うことが
できる。
はAbの存在検出のために一般的に使うことが
できる。
(d) ことに特定のAgまたはAbを検出するさらに
別の方法（これは定量的に操作できる）は次の
とおりである。例えば血清の試料が特定の抗原
Ag′を含んでいるかどうかを確証しようと欲す
るときには、それに対して特異的な抗体Ab′を
作り、そして例えば酵素でそれにラベル付けを
する。次にこのラベル付きのAb′を不溶性化し
たClqと混合し、そしてそれに血清試料を加え
る。次に不溶性化したClqは（付着している
Ab′：Ag′複合体とともに）分離されそして残
つたその液はその中にあるラベル付きAb′の存
在（またはその量）をテストされる。これが始
めに加えた量よりも少ない場合には、血清試料
中にはそれに対して特異的な抗原Ag′が存在し
たに違いない。
別の方法（これは定量的に操作できる）は次の
とおりである。例えば血清の試料が特定の抗原
Ag′を含んでいるかどうかを確証しようと欲す
るときには、それに対して特異的な抗体Ab′を
作り、そして例えば酵素でそれにラベル付けを
する。次にこのラベル付きのAb′を不溶性化し
たClqと混合し、そしてそれに血清試料を加え
る。次に不溶性化したClqは（付着している
Ab′：Ag′複合体とともに）分離されそして残
つたその液はその中にあるラベル付きAb′の存
在（またはその量）をテストされる。これが始
めに加えた量よりも少ない場合には、血清試料
中にはそれに対して特異的な抗原Ag′が存在し
たに違いない。
１例を挙げると、血清中に特定の抗原たとえ
ばIgEが存在するかどうかは次のようにして知
ることができる。カタラーゼでラベル付けされ
た抗IgE抗体を、テストさるべきサンプル中に
存在するIgEと複合体を形成するのに必要とさ
れる量よりも過剰に、不溶性化したClq（たと
えばアガロース・ビーズ）に添加する。それに
血清サンプルを加え、混合物をインキユベート
する。不溶性化Clqを（形成されたIgEと抗IgE
との複合体も一しよに）分離除去してから、残
留液体の残留酵素活性を測定する。もしも血清
サンプル中にIgEが存在すれば、この残留酵素
活性は添加された抗IgE抗体の初めの活性より
も低くなる。というのは、抗IgE抗体の１部は
血清中のIgEと複合体を形成して不溶性化Clq
と共に除去されるからである。
ばIgEが存在するかどうかは次のようにして知
ることができる。カタラーゼでラベル付けされ
た抗IgE抗体を、テストさるべきサンプル中に
存在するIgEと複合体を形成するのに必要とさ
れる量よりも過剰に、不溶性化したClq（たと
えばアガロース・ビーズ）に添加する。それに
血清サンプルを加え、混合物をインキユベート
する。不溶性化Clqを（形成されたIgEと抗IgE
との複合体も一しよに）分離除去してから、残
留液体の残留酵素活性を測定する。もしも血清
サンプル中にIgEが存在すれば、この残留酵素
活性は添加された抗IgE抗体の初めの活性より
も低くなる。というのは、抗IgE抗体の１部は
血清中のIgEと複合体を形成して不溶性化Clq
と共に除去されるからである。
この一般的な手順のもう１つの例として抗原
モルヒネの検出法を述べる。この手順において
はモルヒネか酵素たとえばアミラーゼによつて
ラベル付けされる。特異的な抗モルヒネ抗体
Ab″を調製して、モルヒネの存在をテストする
べきたとえば血清または尿の試料と混ぜる。
モルヒネの検出法を述べる。この手順において
はモルヒネか酵素たとえばアミラーゼによつて
ラベル付けされる。特異的な抗モルヒネ抗体
Ab″を調製して、モルヒネの存在をテストする
べきたとえば血清または尿の試料と混ぜる。
もしいくらかでもモルヒネが存在すればそれ
はAb″と複合体を形成する。ついで酵素でラベ
ル付けされたモルヒネを加えると、それは血清
または尿中のモルヒネ濃度に比例してAb″と複
合体を形成する。
はAb″と複合体を形成する。ついで酵素でラベ
ル付けされたモルヒネを加えると、それは血清
または尿中のモルヒネ濃度に比例してAb″と複
合体を形成する。
それに不溶性化したClqを添加して、Ab″と
血清中のモルヒネとの間において、ならびに
Ab″とラベル付けされたモルヒネとの間におい
て形成された複合体を吸着させる。ついで不溶
性化Clqを（複合体と共に）溶液から除去す
る。溶液中にラベル付けされたモルヒネが残留
するので、その酵素活性を測定することによつ
て最初の血清サンプルがモルヒネを含有してい
たかどうか、さらに含有していた場合はどれだ
けの量のモルヒネが存在していたかを決定する
ことができる。
血清中のモルヒネとの間において、ならびに
Ab″とラベル付けされたモルヒネとの間におい
て形成された複合体を吸着させる。ついで不溶
性化Clqを（複合体と共に）溶液から除去す
る。溶液中にラベル付けされたモルヒネが残留
するので、その酵素活性を測定することによつ
て最初の血清サンプルがモルヒネを含有してい
たかどうか、さらに含有していた場合はどれだ
けの量のモルヒネが存在していたかを決定する
ことができる。
上述の例はモルヒネにのみ言及したが、同じ
手順がその他の抗原の検出にも使用し得るこ
と、さらにそれが抗体の検出しも準用し得るこ
とは理解されるであろう。ラベル付けは必ずし
も酵素によるものでなくてよい。
手順がその他の抗原の検出にも使用し得るこ
と、さらにそれが抗体の検出しも準用し得るこ
とは理解されるであろう。ラベル付けは必ずし
も酵素によるものでなくてよい。
(e) 本発明の試薬またはネフエロメータによる免
疫検定（nephelometric immunoassays）にお
いて有用であり、とりわけそのような検定の感
度向上に役立つ。とりわけ、不溶性化したClq
の使用は、定量されるべき抗原によつて吸着さ
れた後のAbの残留活性を測定するためのネフ
エロメータ使用による抑制免疫検定の手順を非
常に容易なものとした。たとえばα１―胎たん
白質（foetoprotein）を測定するための手順に
おいては、まず血清を抗α１―胎たん白質血清
と混ぜる。形成されたAb：Ag複合体は非常に
濃度が低くてそれらを遠心分離によつて分離除
去することはできないから、それら複合体を溶
液から除去するために不溶性化Clqを加えてそ
れらと結合させる。ついで、溶液中に残留遊離
しているAbをα１―胎たん白質と混ぜて、Ab
の残留濃度に依存する溶液の粒子密度をネフエ
ロメトリーによつて測定する。
疫検定（nephelometric immunoassays）にお
いて有用であり、とりわけそのような検定の感
度向上に役立つ。とりわけ、不溶性化したClq
の使用は、定量されるべき抗原によつて吸着さ
れた後のAbの残留活性を測定するためのネフ
エロメータ使用による抑制免疫検定の手順を非
常に容易なものとした。たとえばα１―胎たん
白質（foetoprotein）を測定するための手順に
おいては、まず血清を抗α１―胎たん白質血清
と混ぜる。形成されたAb：Ag複合体は非常に
濃度が低くてそれらを遠心分離によつて分離除
去することはできないから、それら複合体を溶
液から除去するために不溶性化Clqを加えてそ
れらと結合させる。ついで、溶液中に残留遊離
しているAbをα１―胎たん白質と混ぜて、Ab
の残留濃度に依存する溶液の粒子密度をネフエ
ロメトリーによつて測定する。
３ 特性確認（Characterisation）
不溶性化したClqの使用を包含する先に概述さ
れた手順の多くがAb、AgまたはAb：Ag複合体
の特性確認において有用な予備手続であることは
理解されるだろう。これらの手順のあるものは直
接的に特定のAgまたはAbを同定することを可能
にする。たとえば、特定のAbの存在が予想され
る場合にそれに対して特異的なAgを加えてAb：
Ag複合体の存在を検出することによつて前記Ag
の存在が確認される場合の手順である。前述の記
載から明らかなように、本発明の試薬はAb、Ag
およびAb：Ag複合体の特性確認に非常に有用で
ある。
れた手順の多くがAb、AgまたはAb：Ag複合体
の特性確認において有用な予備手続であることは
理解されるだろう。これらの手順のあるものは直
接的に特定のAgまたはAbを同定することを可能
にする。たとえば、特定のAbの存在が予想され
る場合にそれに対して特異的なAgを加えてAb：
Ag複合体の存在を検出することによつて前記Ag
の存在が確認される場合の手順である。前述の記
載から明らかなように、本発明の試薬はAb、Ag
およびAb：Ag複合体の特性確認に非常に有用で
ある。
一般的にいえば、Agの同定（すなわち特性確
認）はさまざまの手順、たとえば核酸の存在を検
出するための分光測定法、ビールスを同定するた
めの電子顕微鏡法およびビールスまたは組織抗原
に対して特異的な抗血清による免疫螢光法
（immunofluorescence）、によつて達成される。
最後に挙げた手順は結合されたAb：Ag複合体を
包含する不溶性化Clq（たとえばアガロース・ビ
ーズ）と共に使用し得る。換言すれば、複合体を
最初に除去する必要はない。
認）はさまざまの手順、たとえば核酸の存在を検
出するための分光測定法、ビールスを同定するた
めの電子顕微鏡法およびビールスまたは組織抗原
に対して特異的な抗血清による免疫螢光法
（immunofluorescence）、によつて達成される。
最後に挙げた手順は結合されたAb：Ag複合体を
包含する不溶性化Clq（たとえばアガロース・ビ
ーズ）と共に使用し得る。換言すれば、複合体を
最初に除去する必要はない。
ある特別の目的のためには不溶性化Clqをラベ
ル付けすることが便利であり、これはたとえば
I125または螢光または補酵素（NADH）によるラ
ベル付けによつて達成し得る。
ル付けすることが便利であり、これはたとえば
I125または螢光または補酵素（NADH）によるラ
ベル付けによつて達成し得る。
不溶性化されたClqはAb：Ag複合体と結合す
るばかりでなく凝集免疫グロブリンとも結合す
る。当業者には明らかなことであるが、上述の手
順を遂行する場合にこの事実を銘記すべきことは
言うまでもない。凝集免疫グロブリンはたとえば
放射性よう素原子またはフルオロクロムによつて
ラベル付けすることができ、そのようにして上記
の分析手順においてラベル付けされたAb：Ag複
合体の代りに使用し得る。
るばかりでなく凝集免疫グロブリンとも結合す
る。当業者には明らかなことであるが、上述の手
順を遂行する場合にこの事実を銘記すべきことは
言うまでもない。凝集免疫グロブリンはたとえば
放射性よう素原子またはフルオロクロムによつて
ラベル付けすることができ、そのようにして上記
の分析手順においてラベル付けされたAb：Ag複
合体の代りに使用し得る。
本発明をより深く理解するために、本発明の種
種の観点から例示する実施例を示す。
種の観点から例示する実施例を示す。
例 １
Clqの固相へのカツプリング。
グルタルアデヒド25％の水性溶液１mlをPH8.5
の炭酸塩緩衝液５ml中の予め塩溶液で膨潤させた
アミノ化されたアガロース（AH―セフアロー
ス）５mlに加える。混合物を15分間室温でかきま
ぜ次に炭酸塩緩衝液100mlで洗う。混合物を遠心
分離し上澄みを傾斜し、さらに炭酸塩緩衝液５ml
を固体に加える。連続的に振とうしながら、精製
したClq1.25mgと十分なグリシンをこれでグリシ
ン中の最終の0.2モル溶液になるように加える。
振とうを10〜12時間続け、固相を次に遠心分離し
生理的塩水で洗う。
の炭酸塩緩衝液５ml中の予め塩溶液で膨潤させた
アミノ化されたアガロース（AH―セフアロー
ス）５mlに加える。混合物を15分間室温でかきま
ぜ次に炭酸塩緩衝液100mlで洗う。混合物を遠心
分離し上澄みを傾斜し、さらに炭酸塩緩衝液５ml
を固体に加える。連続的に振とうしながら、精製
したClq1.25mgと十分なグリシンをこれでグリシ
ン中の最終の0.2モル溶液になるように加える。
振とうを10〜12時間続け、固相を次に遠心分離し
生理的塩水で洗う。
例 ２
ラベル付けしたClqの製造。
PH7.4の50ｍモルのりん酸塩緩衝液酸200mlを
Clq100μｇに加える。
Clq100μｇに加える。
混合物を20μのアリコートに分割し、I12510
μＣ続いてクロルアミン―Ｔ―50μｇを各アリコ
ートに加える。酸化を30秒間進行させ、反応を塩
50μｇ含有しているメタ亜硫酸水素ナトリウム水
溶液50μを加えて終結させる。次にセフアデツ
クスG25のカラムに上記の混合物を通して所望の
ラベル付けされた材料を上記のりん酸塩緩衝液で
溶離してラベル付けしたClqをI125から分離す
る。
μＣ続いてクロルアミン―Ｔ―50μｇを各アリコ
ートに加える。酸化を30秒間進行させ、反応を塩
50μｇ含有しているメタ亜硫酸水素ナトリウム水
溶液50μを加えて終結させる。次にセフアデツ
クスG25のカラムに上記の混合物を通して所望の
ラベル付けされた材料を上記のりん酸塩緩衝液で
溶離してラベル付けしたClqをI125から分離す
る。
溶離画分をγ―活性で分析し、活性ピークをも
つ画分を一緒に集め、必要なときまで栓をして冷
凍する。
つ画分を一緒に集め、必要なときまで栓をして冷
凍する。
例 ３
AH―セフアロース―4B―Clq
C.R.SledgeおよびD.H.Bingの方法（J.
Immunol.第111巻、第661頁、1973）の後、ヒト
血清から、低いイオン濃度およびPHでの真性グロ
ブリンの沈殿とヒトIgG―セフアロース上への免
疫吸収（Imunoabsorption）とにより精製した
Clqを製造する。AH―セフアロース―4BはPH8.5
の炭酸塩緩衝液５ml中、洗浄ゲル５mlにグルタル
アルデヒドの25％水溶液１mlを添加することによ
り活性化したグルタルアルデヒドである。この添
加後直ちに黄色色調が現われる。反応を室温で15
分間行い、混合物を遠心分離し、上澄み液をデカ
ンテーシヨンして除き、固形物を再洗浄し、遠心
分離し、そして最後に炭酸塩緩衝液５ml中に懸濁
する。精製したClq0.2mgを活性化セフアロース１
ml中に添加する。混合物を室温で10分間インキユ
ベートし、そして次にグリシン緩衝液20mlで５回
洗浄する。混合物を次にPH8.5の0.2モルグリシン
緩衝液により４℃でさらに16時間インキユベート
して存在する末反応のグルタルアルデヒド基をブ
ロツクする。ゲルを再び上澄み液から分離し、そ
してグリシン緩衝液中に再び懸濁する。
Immunol.第111巻、第661頁、1973）の後、ヒト
血清から、低いイオン濃度およびPHでの真性グロ
ブリンの沈殿とヒトIgG―セフアロース上への免
疫吸収（Imunoabsorption）とにより精製した
Clqを製造する。AH―セフアロース―4BはPH8.5
の炭酸塩緩衝液５ml中、洗浄ゲル５mlにグルタル
アルデヒドの25％水溶液１mlを添加することによ
り活性化したグルタルアルデヒドである。この添
加後直ちに黄色色調が現われる。反応を室温で15
分間行い、混合物を遠心分離し、上澄み液をデカ
ンテーシヨンして除き、固形物を再洗浄し、遠心
分離し、そして最後に炭酸塩緩衝液５ml中に懸濁
する。精製したClq0.2mgを活性化セフアロース１
ml中に添加する。混合物を室温で10分間インキユ
ベートし、そして次にグリシン緩衝液20mlで５回
洗浄する。混合物を次にPH8.5の0.2モルグリシン
緩衝液により４℃でさらに16時間インキユベート
して存在する末反応のグルタルアルデヒド基をブ
ロツクする。ゲルを再び上澄み液から分離し、そ
してグリシン緩衝液中に再び懸濁する。
例 ４
免疫複合体（Immune Complex）の決定
例３で製造したセフアロース粒子の直径は約
220μであり、顕微鏡を通して見ることができ
る。ヒトIgGでコーテイングした直径0.8μのラテ
ツクス粒子をこれに混合すると、セフアロース粒
子の表面は白くそしてきめ粗くなる。セフアロー
スを最初に免疫複合体を含む血清と混合すると、
免疫複合体はセフアロース表面上のClqと優先的
に結合し、ラテツクス粒子との結合をブロツクす
る。次にセフアロース表面はなめらかにみえるよ
うになる。試験は液滴上で行うことができるの
で、非常に低い濃度の免疫複合体も非常に小さい
試料中で測定できる。
220μであり、顕微鏡を通して見ることができ
る。ヒトIgGでコーテイングした直径0.8μのラテ
ツクス粒子をこれに混合すると、セフアロース粒
子の表面は白くそしてきめ粗くなる。セフアロー
スを最初に免疫複合体を含む血清と混合すると、
免疫複合体はセフアロース表面上のClqと優先的
に結合し、ラテツクス粒子との結合をブロツクす
る。次にセフアロース表面はなめらかにみえるよ
うになる。試験は液滴上で行うことができるの
で、非常に低い濃度の免疫複合体も非常に小さい
試料中で測定できる。
多量の場合には、セフアロースを遠心分離し、
ビーズを洗いそして次にPH値を小さくすることに
より、溶液から免疫複合体を分離することができ
る。
ビーズを洗いそして次にPH値を小さくすることに
より、溶液から免疫複合体を分離することができ
る。
例 ５
たん白質―ヒト血清アルブミンの定量分析
ヒト血清アルブミン（HSA）を含む適当に希
釈した血清中に125Iでラベル付けした抗ヒトアル
ブミン抗体の過剰量を添加し、そして混合物を４
℃で一夜または37℃で１時間インキユベートす
る。次にこの混合物にPH7.2の1/15モルリン酸塩
緩衝液中、50％w/wセフアロース―Clq懸濁液0.5
ml中の結合部位を完全に飽和するため、抗ヒトト
ランスフエリン―ヒトトランスフエリン（59Feで
ラベル付け）免疫複合体十分量を添加する。アル
ブミン―抗アルブミン125I免疫複合体／59Feトラ
ンスフエリン―抗トランスフエリン免疫複合体混
合物を次にセフアロース―Clq懸濁液0.5ml中に加
え、37℃で１時間インキユベートする。セフアロ
ース―Clq上の上澄み液をデカンテーシヨンして
除き、ビーズをリン酸塩緩衝液で２回洗浄し、そ
して125Iの活性を計数する。アルブミン量を増加
させながら使用すると、第１図に示した応答曲線
をプロツトすることができる。引続いてアルブミ
ン濃度は次にこの応答曲線から評価することがで
きる。この方法は測定すべき物質とその抗体とに
より形成した大部分の免疫複合体を低濃度で検出
するのに敏感な技術を提供する。他方では、アル
ブミン―抗アルブミンの一定量中で59Feトランス
フエリンの活性を測定することにより、この方法
はトランスフエリンを定量するために使用するこ
とができる。
釈した血清中に125Iでラベル付けした抗ヒトアル
ブミン抗体の過剰量を添加し、そして混合物を４
℃で一夜または37℃で１時間インキユベートす
る。次にこの混合物にPH7.2の1/15モルリン酸塩
緩衝液中、50％w/wセフアロース―Clq懸濁液0.5
ml中の結合部位を完全に飽和するため、抗ヒトト
ランスフエリン―ヒトトランスフエリン（59Feで
ラベル付け）免疫複合体十分量を添加する。アル
ブミン―抗アルブミン125I免疫複合体／59Feトラ
ンスフエリン―抗トランスフエリン免疫複合体混
合物を次にセフアロース―Clq懸濁液0.5ml中に加
え、37℃で１時間インキユベートする。セフアロ
ース―Clq上の上澄み液をデカンテーシヨンして
除き、ビーズをリン酸塩緩衝液で２回洗浄し、そ
して125Iの活性を計数する。アルブミン量を増加
させながら使用すると、第１図に示した応答曲線
をプロツトすることができる。引続いてアルブミ
ン濃度は次にこの応答曲線から評価することがで
きる。この方法は測定すべき物質とその抗体とに
より形成した大部分の免疫複合体を低濃度で検出
するのに敏感な技術を提供する。他方では、アル
ブミン―抗アルブミンの一定量中で59Feトランス
フエリンの活性を測定することにより、この方法
はトランスフエリンを定量するために使用するこ
とができる。
第１図は例５において得られたデータについ
て、放射能（計数／分）を縦軸とし、アルブミン
―抗アルブミン量（μ）を横軸として両者の関
係を示す、線図的説明図である。
て、放射能（計数／分）を縦軸とし、アルブミン
―抗アルブミン量（μ）を横軸として両者の関
係を示す、線図的説明図である。
Claims (1)
- １ 水性液体に溶けない固体相基質に共有結合し
たかまたは吸着した、抗体：抗原複合体とは結合
するが、遊離の抗体または抗原とは結合しない性
質をもつ補体の１成分（Clq）を含んで成る、液
体試料中の抗体、抗原または抗体：抗原複合体を
定量するための試薬。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GB22377/74A GB1508132A (en) | 1974-05-20 | 1974-05-20 | Analysis of biological fluids |
| GB22377/74 | 1974-05-20 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6022662A JPS6022662A (ja) | 1985-02-05 |
| JPS6112224B2 true JPS6112224B2 (ja) | 1986-04-07 |
Family
ID=10178404
Family Applications (4)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP50060114A Expired JPS598779B2 (ja) | 1974-05-20 | 1975-05-20 | 抗体、抗原または抗体：抗原複合体の分析法 |
| JP50060115A Expired JPS5949545B2 (ja) | 1974-05-20 | 1975-05-20 | 抗体、抗原または、抗体：抗原複合体分析用試薬 |
| JP58105968A Granted JPS5915860A (ja) | 1974-05-20 | 1983-06-15 | 抗体、抗原または抗体：抗原複合体の分析法 |
| JP59120050A Granted JPS6022662A (ja) | 1974-05-20 | 1984-06-13 | 抗体、抗原または抗体：抗原複合体分析用試薬 |
Family Applications Before (3)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP50060114A Expired JPS598779B2 (ja) | 1974-05-20 | 1975-05-20 | 抗体、抗原または抗体：抗原複合体の分析法 |
| JP50060115A Expired JPS5949545B2 (ja) | 1974-05-20 | 1975-05-20 | 抗体、抗原または、抗体：抗原複合体分析用試薬 |
| JP58105968A Granted JPS5915860A (ja) | 1974-05-20 | 1983-06-15 | 抗体、抗原または抗体：抗原複合体の分析法 |
Country Status (11)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US4062935A (ja) |
| JP (4) | JPS598779B2 (ja) |
| AU (2) | AU498364B2 (ja) |
| BE (2) | BE829278A (ja) |
| CH (4) | CH631015A5 (ja) |
| DE (3) | DE2560554C2 (ja) |
| FR (2) | FR2272102B1 (ja) |
| GB (1) | GB1508132A (ja) |
| IT (1) | IT1038305B (ja) |
| NL (2) | NL182175C (ja) |
| SE (4) | SE435425B (ja) |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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| US4283383A (en) * | 1974-05-20 | 1981-08-11 | Technicon Instruments Corporation | Analysis of biological fluids |
| SE441042B (sv) * | 1976-09-08 | 1985-09-02 | Pharmacia Diagnostics Ab | Sett att pavisa rheumatoida faktorer |
| SE441041B (sv) * | 1976-09-08 | 1985-09-02 | Pharmacia Diagnostics Ab | Sett vid pavisning av rheumatoida faktorer |
| JPS5339265U (ja) * | 1976-09-09 | 1978-04-05 | ||
| GB1590524A (en) * | 1976-11-24 | 1981-06-03 | Nat Res Dev | Assay of immune complexes |
| GB1603406A (en) * | 1977-08-31 | 1981-11-25 | Nat Res Dev | Assay of immune complexes |
| GB1592450A (en) * | 1976-12-10 | 1981-07-08 | Technicon Instr | Biological analysis |
| JPS5387877U (ja) * | 1976-12-21 | 1978-07-19 | ||
| JPS5387876U (ja) * | 1976-12-21 | 1978-07-19 | ||
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