JP3368268B2 - ユニバーサルユーバクテリア核酸プローブ及び方法 - Google Patents
ユニバーサルユーバクテリア核酸プローブ及び方法Info
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- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
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- C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は臨床及びその他のサ
ンプル中のバクテリアの検出に関する。そこに何らかの
バクテリアが存在することにより生命が脅やかされるよ
うな通常無菌の身体組織若しくは血液、尿及び髄液等の
体液中のバクテリアを検出する方法は特に重要である。
本発明は、核酸プローブ及び組成物をそのようなサンプ
ル中の何らかのバクテリアを特異的に検出するためにそ
れらを使用する方法とともに提供するものである。
ンプル中のバクテリアの検出に関する。そこに何らかの
バクテリアが存在することにより生命が脅やかされるよ
うな通常無菌の身体組織若しくは血液、尿及び髄液等の
体液中のバクテリアを検出する方法は特に重要である。
本発明は、核酸プローブ及び組成物をそのようなサンプ
ル中の何らかのバクテリアを特異的に検出するためにそ
れらを使用する方法とともに提供するものである。
【０００２】
【従来の技術】ここで用いる“ユーバクテリア（ｅｕｂ
ａｃｔｅｒｉａ）”という用語は、たとえばバージイ
（Ｂｅｒｇｅｙ）の細菌分類マニユアル（Ｎ．Ｒ．クリ
ーブ及びＪ．Ｇ．ホルト編（Ｎ．Ｒ．Ｋｒｉｅｇ ａｎ
ｄ Ｊ．Ｇ．Ｈｏｌｔ，ｅｄ．）、１９８４年、ウイリ
アムズアンド ウイルキンズ社、ボルチモア）に述べら
れている原核生物のグループ（バクテリア）を意味す
る。群としてユーバクテリアは、ヒト若しくは動物に病
気をひき起こすことが知られており検出に関しては最も
重要であるバクテリアを、全て含んでいる。
ａｃｔｅｒｉａ）”という用語は、たとえばバージイ
（Ｂｅｒｇｅｙ）の細菌分類マニユアル（Ｎ．Ｒ．クリ
ーブ及びＪ．Ｇ．ホルト編（Ｎ．Ｒ．Ｋｒｉｅｇ ａｎ
ｄ Ｊ．Ｇ．Ｈｏｌｔ，ｅｄ．）、１９８４年、ウイリ
アムズアンド ウイルキンズ社、ボルチモア）に述べら
れている原核生物のグループ（バクテリア）を意味す
る。群としてユーバクテリアは、ヒト若しくは動物に病
気をひき起こすことが知られており検出に関しては最も
重要であるバクテリアを、全て含んでいる。
【０００３】唯一の他に述べられるバクテリアの群であ
るアルカエバクテリア（始原細菌）は、生物学的及び遺
伝学的にユーバクテリアとは性質が異なる（Ｃ．Ｒ．ウ
オウス（Ｃ．Ｒ．Ｗｏｅｓｅ）、サイエンテイフイツク
アメリカン（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａ
ｎ）、１９８１年、２４４巻、第９８−１０２頁）。ア
ルカエバクテリアは群として、温泉、超低酸素泥、塩水
等の、通常ユーバクテリアが成育できない種々の“過激
な”環境中に住む。アルカエバクテリアで病原体として
知られているものはなく、従つてそれらの検出に臨床上
の意義はほとんどない。
るアルカエバクテリア（始原細菌）は、生物学的及び遺
伝学的にユーバクテリアとは性質が異なる（Ｃ．Ｒ．ウ
オウス（Ｃ．Ｒ．Ｗｏｅｓｅ）、サイエンテイフイツク
アメリカン（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａ
ｎ）、１９８１年、２４４巻、第９８−１０２頁）。ア
ルカエバクテリアは群として、温泉、超低酸素泥、塩水
等の、通常ユーバクテリアが成育できない種々の“過激
な”環境中に住む。アルカエバクテリアで病原体として
知られているものはなく、従つてそれらの検出に臨床上
の意義はほとんどない。
【０００４】真核生物は第３の基本的遺伝系統を構成
し、ユーバクテリア及びアルカエバクテリアと共に全て
の既知の生命形態を含むことになる（図１）。真核生物
にはヒト、動物、植物及び、原生動物、真菌、繊毛虫等
を含む多数の組織的複雑さの低い自由生活性及び寄生性
の“原生生物”が含まれる。臨床関係では、ユーバクテ
リアを、同じ症状を呈するが大きく異なる抗菌若しくは
化学療法を必要とするような真核生物、たとえば真菌及
び原生動物による感染と識別することは特に重要であ
る。従つてこれらの遺伝的識別は診断及び抗菌化学療法
の見地から臨床上重要である。
し、ユーバクテリア及びアルカエバクテリアと共に全て
の既知の生命形態を含むことになる（図１）。真核生物
にはヒト、動物、植物及び、原生動物、真菌、繊毛虫等
を含む多数の組織的複雑さの低い自由生活性及び寄生性
の“原生生物”が含まれる。臨床関係では、ユーバクテ
リアを、同じ症状を呈するが大きく異なる抗菌若しくは
化学療法を必要とするような真核生物、たとえば真菌及
び原生動物による感染と識別することは特に重要であ
る。従つてこれらの遺伝的識別は診断及び抗菌化学療法
の見地から臨床上重要である。
【０００５】ユーバクテリア、ヒト（ヒトのミトコンド
リアのものを含む）及び真菌のｒＲＮＡ分子を識別する
核酸プローブを提供することが、本発明の一面である。
グラム陽性及びグラム陰性のユーバクテリアを識別する
基準を提供するプローブ及びプローブセツトを提供する
ことが、本発明の他の一面である。
リアのものを含む）及び真菌のｒＲＮＡ分子を識別する
核酸プローブを提供することが、本発明の一面である。
グラム陽性及びグラム陰性のユーバクテリアを識別する
基準を提供するプローブ及びプローブセツトを提供する
ことが、本発明の他の一面である。
【０００６】通常無菌の体液中のバクテリアを検出、同
定及び計数する方法はサンプルのタイプ及び疑われる病
原体によつて異なる。現在使用できる方法で全ての病原
体の検出に最適なものはない。しばしば、病原体が検出
される可能性を高めるために複数の方法を用いねばなら
ない。たとえば菌血症若しくは細菌性敗血症の検出に通
常使用される方法は全て、臨床サンプルからの微生物の
インビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）の培養に頼つている。
一般に、血液サンプルは患者から採取されて、富栄養人
工培地中で１ないし１４日間培養及び監視される。この
間、該培地を検査するかあるいは盲目的に二次培養（プ
レート上）するか、若しくは細菌の成育あるいは発酵過
程の証拠を化学的にあるいはアイソトープによりアツセ
イされる。臨床医は通常、陽性の診断のためのわずか１
ないし１０個のコロニーを形成させる単位のバクテリア
をもたらすような１０ｍｌの血液サンプルを２ないし３
個採取する。診断用固型培地上の個々のバクテリアコロ
ニーの分離の後、かつ／又はグラム染色により、該バク
テリア（若しくは真菌）の推定的同定がなされる。
定及び計数する方法はサンプルのタイプ及び疑われる病
原体によつて異なる。現在使用できる方法で全ての病原
体の検出に最適なものはない。しばしば、病原体が検出
される可能性を高めるために複数の方法を用いねばなら
ない。たとえば菌血症若しくは細菌性敗血症の検出に通
常使用される方法は全て、臨床サンプルからの微生物の
インビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）の培養に頼つている。
一般に、血液サンプルは患者から採取されて、富栄養人
工培地中で１ないし１４日間培養及び監視される。この
間、該培地を検査するかあるいは盲目的に二次培養（プ
レート上）するか、若しくは細菌の成育あるいは発酵過
程の証拠を化学的にあるいはアイソトープによりアツセ
イされる。臨床医は通常、陽性の診断のためのわずか１
ないし１０個のコロニーを形成させる単位のバクテリア
をもたらすような１０ｍｌの血液サンプルを２ないし３
個採取する。診断用固型培地上の個々のバクテリアコロ
ニーの分離の後、かつ／又はグラム染色により、該バク
テリア（若しくは真菌）の推定的同定がなされる。
【０００７】培養による方法は全て、以下のような多数
の重大な欠点を持つ： ――材料の高コスト； ――労力の過大さ； ――技術者が危険な体液を広範に処理すること； ――処理による偽りの陽性； ――目に見える細胞数が少ないことによる偽りの陰性； ――可能性のある多くの病原体に対する厄介な培地要件
による偽りの陰性；及び ――陽性の診断及び同定に相対的に長い時間を要するこ
と。 診断を達成するために現在の方法では相対的に長い時間
が必要とされること、及びそのような感染の生命を脅か
しかねない性質により、抗菌療法はしばしばこのような
試験の結果が判明する以前に経験的に開始される。
の重大な欠点を持つ： ――材料の高コスト； ――労力の過大さ； ――技術者が危険な体液を広範に処理すること； ――処理による偽りの陽性； ――目に見える細胞数が少ないことによる偽りの陰性； ――可能性のある多くの病原体に対する厄介な培地要件
による偽りの陰性；及び ――陽性の診断及び同定に相対的に長い時間を要するこ
と。 診断を達成するために現在の方法では相対的に長い時間
が必要とされること、及びそのような感染の生命を脅か
しかねない性質により、抗菌療法はしばしばこのような
試験の結果が判明する以前に経験的に開始される。
【０００８】それゆえ、全てのユーバクテリアに対して
広く特異的であり、かつ好ましくはサンプルである材料
中に存在しうる他の真核生物病原体類、特に真菌に反応
しない核酸プローブを提供することが、本発明の他の一
面である。
広く特異的であり、かつ好ましくはサンプルである材料
中に存在しうる他の真核生物病原体類、特に真菌に反応
しない核酸プローブを提供することが、本発明の他の一
面である。
【０００９】さらに、伝統的な多日数培養法に伴なう多
くの不都合を避ける多様なアツセイ系で使用できるプロ
ーブを提供することが本発明の他の一面である。
くの不都合を避ける多様なアツセイ系で使用できるプロ
ーブを提供することが本発明の他の一面である。
【００１０】また、通常のアツセイ条件下で標的となる
ユーバクテリア生物のリボソームリボ核酸（ｒＲＮＡ）
にハイブリダイズ（対合：ｈｙｂｒｉｄｉｚｅ）するこ
とができるプローブを提供することも本発明の他の一面
である。
ユーバクテリア生物のリボソームリボ核酸（ｒＲＮＡ）
にハイブリダイズ（対合：ｈｙｂｒｉｄｉｚｅ）するこ
とができるプローブを提供することも本発明の他の一面
である。
【００１１】コーネら（Ｋｏｈｎｅ ｅｔ ａｌ．，バ
イオフイジカルジヤーナル（Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ
Ｊｏｕｒｎａｌ）、８巻、第１１０４−１１１８頁、１
９６８年）はｒＲＮＡ配列に対するプローブを製造する
一方法を考察しているが、彼らは広範な特異性を持つユ
ーバクテリア用プローブを作るのに必要な教示を提供し
てはいない。
イオフイジカルジヤーナル（Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ
Ｊｏｕｒｎａｌ）、８巻、第１１０４−１１１８頁、１
９６８年）はｒＲＮＡ配列に対するプローブを製造する
一方法を考察しているが、彼らは広範な特異性を持つユ
ーバクテリア用プローブを作るのに必要な教示を提供し
てはいない。
【００１２】ペースとキヤンベル（Ｐａｃｅ ａｎｄ
Ｃａｍｐｂｅｌｌ，ジヤーナル オブ バクテリオロジ
イ（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇ
ｙ）、１０７巻、第５４３−５４７頁、１９７１年）は
多様なバクテリア種のリボソームリボ核酸の相同関係と
このような相同関係のレベルを数量化するためのハイブ
リダイゼーシヨン法を考察している。彼らは、バクテリ
アは共有するが真核生物には存在しない特定の核酸配列
を同定してはいない。ウオウス（Ｗｏｅｓｅ，ミクロバ
イオロジカル レビユーズ（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉ
ｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ）、５１巻、第２２１−２７１
頁、１９８７年）はユーバクテリアのｒＲＮＡ配列に関
する幅を述べているが、完全なバクテリアの包含性を見
るために興味深い配列を示してはいない。これらの参考
文献は、もつとも、ユーバクテリア用プローブに関して
コーネ（Ｋｏｈｎｅ）の教示に欠けていたものを補つて
はおらず、特に臨床若しくはその他のサンプル中のユー
バクテリアを検出するためのアツセイにおいて有用なユ
ーバクテリアに特異的なプローブを提供してはいない。
Ｃａｍｐｂｅｌｌ，ジヤーナル オブ バクテリオロジ
イ（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇ
ｙ）、１０７巻、第５４３−５４７頁、１９７１年）は
多様なバクテリア種のリボソームリボ核酸の相同関係と
このような相同関係のレベルを数量化するためのハイブ
リダイゼーシヨン法を考察している。彼らは、バクテリ
アは共有するが真核生物には存在しない特定の核酸配列
を同定してはいない。ウオウス（Ｗｏｅｓｅ，ミクロバ
イオロジカル レビユーズ（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉ
ｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ）、５１巻、第２２１−２７１
頁、１９８７年）はユーバクテリアのｒＲＮＡ配列に関
する幅を述べているが、完全なバクテリアの包含性を見
るために興味深い配列を示してはいない。これらの参考
文献は、もつとも、ユーバクテリア用プローブに関して
コーネ（Ｋｏｈｎｅ）の教示に欠けていたものを補つて
はおらず、特に臨床若しくはその他のサンプル中のユー
バクテリアを検出するためのアツセイにおいて有用なユ
ーバクテリアに特異的なプローブを提供してはいない。
【００１３】ジヨバノーニら（Ｇｉｏｖａｎｎｏｎｉ
ｅｔ ａｌ．，ジヤーナル オブバクテリオロジイ（Ｊ
ｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）、１
７０巻、第７２０−７２６頁、１９８８年）は幅広い群
のユーバクテリア、アルカエバクテリア及び真核生物の
同定に有用であると主張される複数のプローブを述べて
いる。もつとも、ジヨバノーニらは本発明のプローブ類
を発表してはいない。彼らはまたそのようなプローブ類
を設計するのに必要な教示も提供していない。
ｅｔ ａｌ．，ジヤーナル オブバクテリオロジイ（Ｊ
ｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）、１
７０巻、第７２０−７２６頁、１９８８年）は幅広い群
のユーバクテリア、アルカエバクテリア及び真核生物の
同定に有用であると主張される複数のプローブを述べて
いる。もつとも、ジヨバノーニらは本発明のプローブ類
を発表してはいない。彼らはまたそのようなプローブ類
を設計するのに必要な教示も提供していない。
【００１４】ホーガンら（Ｈｏｇａｎ ｅｔ ａｌ．，
欧州特許公開ＷＯ第８８／０３９５７号）はユーバクテ
リアの広範な表現型にハイブリダイズすると開示される
複数のプローブを述べている。もつとも、ホーガンらは
本発明のプローブ類を教示してはおらず、またこれらの
プローブに関してコーネ（Ｋｏｈｎｅ）の教示に欠けて
いたものを補つてもいない。
欧州特許公開ＷＯ第８８／０３９５７号）はユーバクテ
リアの広範な表現型にハイブリダイズすると開示される
複数のプローブを述べている。もつとも、ホーガンらは
本発明のプローブ類を教示してはおらず、またこれらの
プローブに関してコーネ（Ｋｏｈｎｅ）の教示に欠けて
いたものを補つてもいない。
【００１５】リボソームは、それらが細胞の蛋白に遺伝
情報を翻訳するための唯一の手段として働くため、全て
の生物にとつて実に重要である。この重要性を明らかに
示すものが、全ての細胞がリボソームを持つという観察
である。活発に成育しているバクテリアは細胞１個あた
り２０，０００若しくはそれ以上のリボソームを持つも
のと思われる。このことからリボソームは、細胞中の最
も豊富な高分子存在のひとつであり、かつ魅力ある診断
用アツセイの標的となる。
情報を翻訳するための唯一の手段として働くため、全て
の生物にとつて実に重要である。この重要性を明らかに
示すものが、全ての細胞がリボソームを持つという観察
である。活発に成育しているバクテリアは細胞１個あた
り２０，０００若しくはそれ以上のリボソームを持つも
のと思われる。このことからリボソームは、細胞中の最
も豊富な高分子存在のひとつであり、かつ魅力ある診断
用アツセイの標的となる。
【００１６】リボソームは、エシエリヒア・コリ（Ｅｓ
ｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ：大腸菌）において５
Ｓ，１６Ｓ及び２３Ｓ ｒＲＮＡと呼ばれる３個の異な
るＲＮＡ分子を含有する。これらの命名は歴史的に、そ
れらの沈降速度により決定されるＲＮＡ分子の大きさに
符合している。もつとも、実際にはリボソームＲＮＡ分
子は生物間で大きさが異なる。ではあるが、５Ｓ，１６
Ｓ及び２３Ｓ ｒＲＮＡはいずれのバクテリア中にもあ
る相同なＲＮＡ分子に対する一般名として普通に用いら
れており、ここでもその慣習に従うものとする。考察は
１６Ｓ及び２３ＳｒＲＮＡに限定されよう。
ｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ：大腸菌）において５
Ｓ，１６Ｓ及び２３Ｓ ｒＲＮＡと呼ばれる３個の異な
るＲＮＡ分子を含有する。これらの命名は歴史的に、そ
れらの沈降速度により決定されるＲＮＡ分子の大きさに
符合している。もつとも、実際にはリボソームＲＮＡ分
子は生物間で大きさが異なる。ではあるが、５Ｓ，１６
Ｓ及び２３Ｓ ｒＲＮＡはいずれのバクテリア中にもあ
る相同なＲＮＡ分子に対する一般名として普通に用いら
れており、ここでもその慣習に従うものとする。考察は
１６Ｓ及び２３ＳｒＲＮＡに限定されよう。
【００１７】ここでは、プローブ（類）とは、標的とな
る核酸配列に対して、限定されあらかじめ決められた厳
重さ（ｄｅｆｉｎｅｄ ｐｒｅｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ
ｓｔｒｉｎｇｅｎｃｉｅｓ）で特異的に（すなわち、選
択的に、以下のハイブリダイゼーシヨンに関する記載を
参照）それらをハイブリダイズさせる特異的なヌクレオ
チド配列を、設計若しくは選択により含有する、合成若
しくは生物学的に製造された核酸類（ＤＮＡ若しくはＲ
ＮＡ）を意味する。それらのハイブリダイセーシヨン特
性に加えて、プローブ類は特殊なアツセイ条件下でそれ
らが正しく若しくは最適に機能するのにふさわしい何ら
かの構成要素を含んでもよい。たとえば、プローブ類は
ヌクレアーゼ分解に対する耐性を改善する（たとえば、
末端キヤツプによる）、検出用リガンドを付ける（たと
えば、フルオレセイン、３２−リン、ビオチン等）、若
しくは固型担体上へのそれらの捕獲を促進する（たとえ
ば、ポリデオキシアデノシン“テール”）ために修飾し
てもよい。このような修飾は、ハイブリダイゼーシヨン
アツセイにおいて標的及び非標的生物を有効に識別する
能力とも言える基本的プローブ機能への仕上げである。
る核酸配列に対して、限定されあらかじめ決められた厳
重さ（ｄｅｆｉｎｅｄ ｐｒｅｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ
ｓｔｒｉｎｇｅｎｃｉｅｓ）で特異的に（すなわち、選
択的に、以下のハイブリダイゼーシヨンに関する記載を
参照）それらをハイブリダイズさせる特異的なヌクレオ
チド配列を、設計若しくは選択により含有する、合成若
しくは生物学的に製造された核酸類（ＤＮＡ若しくはＲ
ＮＡ）を意味する。それらのハイブリダイセーシヨン特
性に加えて、プローブ類は特殊なアツセイ条件下でそれ
らが正しく若しくは最適に機能するのにふさわしい何ら
かの構成要素を含んでもよい。たとえば、プローブ類は
ヌクレアーゼ分解に対する耐性を改善する（たとえば、
末端キヤツプによる）、検出用リガンドを付ける（たと
えば、フルオレセイン、３２−リン、ビオチン等）、若
しくは固型担体上へのそれらの捕獲を促進する（たとえ
ば、ポリデオキシアデノシン“テール”）ために修飾し
てもよい。このような修飾は、ハイブリダイゼーシヨン
アツセイにおいて標的及び非標的生物を有効に識別する
能力とも言える基本的プローブ機能への仕上げである。
【００１８】ハイブリダイゼーシヨンは、あらかじめ決
められた反応条件下で２本の部分的に若しくは完全に相
補的な鎖の核酸を逆平行に（一方は５′から３′方向
に、他方は３′から５′方向に）合わせて特異的かつ安
定な水素結合による２本鎖の核酸を形成させる過程であ
ると伝統的に考えられている。（核酸は極性を有するこ
とを銘記すべきである；すなわち、核酸鎖の一方の末端
はもう一方とは化学的に異なる。これは、該ヌクレオチ
ド成分の不斉の糖部分の化学結合の極性により定義され
る。５′及び３′という用語は、それらの呼称を持つリ
ボース糖の炭素に特異的に関連する。まれな、若しくは
異常な環境中を除いて、核酸鎖は塩基部分の水素結合に
より平行に会合することはない。この概念は当業者にお
いて周知である。）
められた反応条件下で２本の部分的に若しくは完全に相
補的な鎖の核酸を逆平行に（一方は５′から３′方向
に、他方は３′から５′方向に）合わせて特異的かつ安
定な水素結合による２本鎖の核酸を形成させる過程であ
ると伝統的に考えられている。（核酸は極性を有するこ
とを銘記すべきである；すなわち、核酸鎖の一方の末端
はもう一方とは化学的に異なる。これは、該ヌクレオチ
ド成分の不斉の糖部分の化学結合の極性により定義され
る。５′及び３′という用語は、それらの呼称を持つリ
ボース糖の炭素に特異的に関連する。まれな、若しくは
異常な環境中を除いて、核酸鎖は塩基部分の水素結合に
より平行に会合することはない。この概念は当業者にお
いて周知である。）
【００１９】特定の組のハイブリダイゼーシヨン条件の
厳重度は、２本の核酸の間の誤対合の割合及び結合形態
によるのと同時に、プローブ／標的二本鎖の塩基組成に
よつて定義される。
厳重度は、２本の核酸の間の誤対合の割合及び結合形態
によるのと同時に、プローブ／標的二本鎖の塩基組成に
よつて定義される。
【００２０】厳重度はまた、該ハイブリダイゼーシヨン
溶液中に存在するイオン種の濃度及び型、存在する変性
剤類の型及び濃度、かつ／又はハイブリダイゼーシヨン
温度等の反応パラメーターに左右されることもある。通
常ハイブリダイゼーシヨン条件が厳重になるほど、安定
なハイブリツドを形成させるべき場合にはより長いプロ
ーブが好ましい。結果として、ハイブリダイゼーシヨン
が行なわれる条件の厳重度（たとえば、実施されるアツ
セイの型に基づく）は使用される好ましいプローブの性
質を指図すると考えられる。このような関連性は当業者
に周知であり、容易に処理することができる。
溶液中に存在するイオン種の濃度及び型、存在する変性
剤類の型及び濃度、かつ／又はハイブリダイゼーシヨン
温度等の反応パラメーターに左右されることもある。通
常ハイブリダイゼーシヨン条件が厳重になるほど、安定
なハイブリツドを形成させるべき場合にはより長いプロ
ーブが好ましい。結果として、ハイブリダイゼーシヨン
が行なわれる条件の厳重度（たとえば、実施されるアツ
セイの型に基づく）は使用される好ましいプローブの性
質を指図すると考えられる。このような関連性は当業者
に周知であり、容易に処理することができる。
【００２１】一般に、プローブの長さによつて、このよ
うな人々は厳重な条件というものが約０．９モルの塩溶
液中の約３５℃−６５℃を意味することを理解してい
る。
うな人々は厳重な条件というものが約０．９モルの塩溶
液中の約３５℃−６５℃を意味することを理解してい
る。
【００２２】
【発明が解決しようとする課題】それゆえ、全てのユー
バクテリアに対して広く特異的であり、かつ好ましくは
サンプルである材料中に存在しうる他の真核生物病原体
類、特に真菌に反応しない核酸プローブを提供すること
が、本発明の他の一面である。さらに、伝統的な多日数
培養法に伴なう多くの不都合を避ける多様なアツセイ系
で使用できるプローブを提供することが本発明の他の一
面である。また、通常のアツセイ条件下で標的となるユ
ーバクテリア生物のリボソームリボ核酸（ｒＲＮＡ）に
ハイブリダイズ（対合：ｈｙｂｒｉｄｉｚｅ）すること
ができるプローブを提供することも本発明の他の一面で
ある。
バクテリアに対して広く特異的であり、かつ好ましくは
サンプルである材料中に存在しうる他の真核生物病原体
類、特に真菌に反応しない核酸プローブを提供すること
が、本発明の他の一面である。さらに、伝統的な多日数
培養法に伴なう多くの不都合を避ける多様なアツセイ系
で使用できるプローブを提供することが本発明の他の一
面である。また、通常のアツセイ条件下で標的となるユ
ーバクテリア生物のリボソームリボ核酸（ｒＲＮＡ）に
ハイブリダイズ（対合：ｈｙｂｒｉｄｉｚｅ）すること
ができるプローブを提供することも本発明の他の一面で
ある。
【００２３】
【課題を解決するための手段】本発明の多様な本質及び
局面により、特異的な条件下でユーバクテリアのリボソ
ームＲＮＡ分子（ｒＲＮＡ）、ｒＲＮＡ遺伝子（ｒＤＮ
Ａ）及び、それらの増幅したもの及びインビトロでの翻
訳産物には対合するが、同じ条件下で試験サンプル中に
存在しうる真核細胞のｒＲＮＡ若しくはｒＤＮＡには対
合しないデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）若しくはリボ核酸
（ＲＮＡ）配列を含む核酸プローブ及びプローブセツト
が提供される。さらに、ここで述べるある種のプローブ
類及びプローブセツト類は、ポリメラーゼ鎖反応（ＵＳ
第４，６８３，２０２号）等の方法若しくは転写増幅系
（たとえばＴＡＳ、クオーら（Ｋｗｏｈ ｅｔ ａ
ｌ．）、 プロシーデイングズ オブ ザ ナシヨナル
アカデミイ オブ サイエンス（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎ
ｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍ
ｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ）、８６巻、第１１７３−１
１７７頁、１９８９年）によりサンプル中に存在しうる
ユーバクテリアのｒＲＮＡ若しくはｒＤＮＡ配列の特異
的増幅のプライマーとして使用してもよい。
局面により、特異的な条件下でユーバクテリアのリボソ
ームＲＮＡ分子（ｒＲＮＡ）、ｒＲＮＡ遺伝子（ｒＤＮ
Ａ）及び、それらの増幅したもの及びインビトロでの翻
訳産物には対合するが、同じ条件下で試験サンプル中に
存在しうる真核細胞のｒＲＮＡ若しくはｒＤＮＡには対
合しないデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）若しくはリボ核酸
（ＲＮＡ）配列を含む核酸プローブ及びプローブセツト
が提供される。さらに、ここで述べるある種のプローブ
類及びプローブセツト類は、ポリメラーゼ鎖反応（ＵＳ
第４，６８３，２０２号）等の方法若しくは転写増幅系
（たとえばＴＡＳ、クオーら（Ｋｗｏｈ ｅｔ ａ
ｌ．）、 プロシーデイングズ オブ ザ ナシヨナル
アカデミイ オブ サイエンス（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎ
ｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍ
ｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ）、８６巻、第１１７３−１
１７７頁、１９８９年）によりサンプル中に存在しうる
ユーバクテリアのｒＲＮＡ若しくはｒＤＮＡ配列の特異
的増幅のプライマーとして使用してもよい。
【００２４】本発明のプローブ類は、ヒト若しくは動物
からの血液、尿、髄液、生検（ｂｉｏｐｓｙ）、滑液
（ｓｙｎｏｖｉａｌ ｆｌｕｉｄ）、若しくは他の組織
あるいは液体サンプル等の臨床サンプル中のユーバクテ
リアの特異的検出のための貴重な核酸ハイブリダイゼー
シヨンアツセイの開発における基礎を有利に提供するも
のである。該プローブ類はまた、たとえば品質管理にお
いて、無菌と仮定されている物質、たとえば医薬品を試
験する基礎を提供するものである。ここで述べるプロー
ブ類はある高度に保存されているバクテリア２３Ｓ若し
くは１６Ｓ ｒＲＮＡ配列に特異的に相補的である。
からの血液、尿、髄液、生検（ｂｉｏｐｓｙ）、滑液
（ｓｙｎｏｖｉａｌ ｆｌｕｉｄ）、若しくは他の組織
あるいは液体サンプル等の臨床サンプル中のユーバクテ
リアの特異的検出のための貴重な核酸ハイブリダイゼー
シヨンアツセイの開発における基礎を有利に提供するも
のである。該プローブ類はまた、たとえば品質管理にお
いて、無菌と仮定されている物質、たとえば医薬品を試
験する基礎を提供するものである。ここで述べるプロー
ブ類はある高度に保存されているバクテリア２３Ｓ若し
くは１６Ｓ ｒＲＮＡ配列に特異的に相補的である。
【００２５】核酸ハイブリダイゼーシヨンによるバクテ
リアの検出は、以下の理由により、現在利用できる培養
による試験に比較して、高い成果を得ることができる： ａ）感度が高い；すなわち、与えられたサンプル中の当
該バクテリアをより高頻度に検出することができる； ｂ）安価な試薬類の使用と低い労力によりアツセイコス
トを著しく低くすることができる； ｃ）栄養条件の難しいバクテリア株も正確に検出でき
る； ｄ）このような試験は試験に先立つてサンプルから標的
バクテリアを単離する必要がないため、結果が早く出せ
る； ｅ）バツチの形式で多数のサンプルをスクリーニングで
き、“ハイブリダイゼーシヨン陽性”と同定されたもの
だけを培養できる； ｆ）食菌された微生物を検出でき、周期的な“時間帯”
にある生育中の微生物（おそらく宿主の免疫周期によ
る）をサンプリングするために複数回の血液サンプルを
採る必要がない； ｇ）感染の可能性のある体液を取り扱う技術者が少人数
で済む； ｈ）インビトロの核酸増幅を利用して、バクテリアの信
号若しくは標的のいずれかを増幅することにより少数し
かない標的を検出することができる。
リアの検出は、以下の理由により、現在利用できる培養
による試験に比較して、高い成果を得ることができる： ａ）感度が高い；すなわち、与えられたサンプル中の当
該バクテリアをより高頻度に検出することができる； ｂ）安価な試薬類の使用と低い労力によりアツセイコス
トを著しく低くすることができる； ｃ）栄養条件の難しいバクテリア株も正確に検出でき
る； ｄ）このような試験は試験に先立つてサンプルから標的
バクテリアを単離する必要がないため、結果が早く出せ
る； ｅ）バツチの形式で多数のサンプルをスクリーニングで
き、“ハイブリダイゼーシヨン陽性”と同定されたもの
だけを培養できる； ｆ）食菌された微生物を検出でき、周期的な“時間帯”
にある生育中の微生物（おそらく宿主の免疫周期によ
る）をサンプリングするために複数回の血液サンプルを
採る必要がない； ｇ）感染の可能性のある体液を取り扱う技術者が少人数
で済む； ｈ）インビトロの核酸増幅を利用して、バクテリアの信
号若しくは標的のいずれかを増幅することにより少数し
かない標的を検出することができる。
【００２６】本発明のプローブ類をｒＲＮＡに向けたこ
とによる他の有利さには、検出されるｒＲＮＡ類が細胞
質の重要な成分を構成するという事実が含まれることが
知られている。細胞中のリボソーム含量の評価は多様で
あるが、たとえば活発に成育中のエシエリヒア・コリ
（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）は細胞１個あた
りに５０，０００以上のリボソーム、及びそれゆえに
（リボソーム中に１：１：１の化学量で存在する）各ｒ
ＲＮＡの５０，０００以上のコピーを含有すると思われ
る。個々に他の好適性の低い代謝条件下にある他のバク
テリア中のリボソーム量は相当に低いと思われる。もつ
ともいかなる環境においても全ての型の細胞中でｒＲＮ
Ａは最も豊富な細胞内核酸のひとつである。対照的に、
遺伝子若しくはそのＲＮＡ転写物等の他に細胞中標的た
りうる分子は、それらの存在量がはるかに少ないために
理想度からいうとより低い。
とによる他の有利さには、検出されるｒＲＮＡ類が細胞
質の重要な成分を構成するという事実が含まれることが
知られている。細胞中のリボソーム含量の評価は多様で
あるが、たとえば活発に成育中のエシエリヒア・コリ
（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）は細胞１個あた
りに５０，０００以上のリボソーム、及びそれゆえに
（リボソーム中に１：１：１の化学量で存在する）各ｒ
ＲＮＡの５０，０００以上のコピーを含有すると思われ
る。個々に他の好適性の低い代謝条件下にある他のバク
テリア中のリボソーム量は相当に低いと思われる。もつ
ともいかなる環境においても全ての型の細胞中でｒＲＮ
Ａは最も豊富な細胞内核酸のひとつである。対照的に、
遺伝子若しくはそのＲＮＡ転写物等の他に細胞中標的た
りうる分子は、それらの存在量がはるかに少ないために
理想度からいうとより低い。
【００２７】さらに予期しなかつた利点には、ｒＲＮＡ
類（及びそれらを規定する遺伝子類）が現存の生物体間
で横の転移を受けないらしいことがある。このように、
ｒＲＮＡの一次構造は、たとえば現存の生物間の横の伝
達を受けることがあるプラスミド上の遺伝子若しくはそ
の産物の場合にそうであるような遺伝子特異性標的では
なく生物特異性分子標的を提供する。
類（及びそれらを規定する遺伝子類）が現存の生物体間
で横の転移を受けないらしいことがある。このように、
ｒＲＮＡの一次構造は、たとえば現存の生物間の横の伝
達を受けることがあるプラスミド上の遺伝子若しくはそ
の産物の場合にそうであるような遺伝子特異性標的では
なく生物特異性分子標的を提供する。
【００２８】加えて、本発明は試験するユーバクテリア
のほとんど若しくは全てにおいて十分に同等であるユー
バクテリアｒＲＮＡ標的配列に対するプローブ類で、そ
のようなユーバクテリアの標的領域にハイブリダイズす
ることができるプローブ類を提供するものである。好ま
しいことに、これらの同じｒＲＮＡ標的配列はほとんど
の非ユーバクテリアｒＲＮＡ中のものと異なつており、
該プローブ類がユーバクテリアｒＲＮＡにハイブリダイ
ズする条件下ではほとんどの非ユーバクテリアｒＲＮＡ
にハイブリダイスしない。これらのプローブの特性は、
それぞれ包含性及び排他性と定義される。ユーバクテリ
アに関して本発明のプローブ類のような驚くべき包含性
及び排他性特性を持つプローブ徴を生み出しうるという
発見は予測も期待もできなかつた。
のほとんど若しくは全てにおいて十分に同等であるユー
バクテリアｒＲＮＡ標的配列に対するプローブ類で、そ
のようなユーバクテリアの標的領域にハイブリダイズす
ることができるプローブ類を提供するものである。好ま
しいことに、これらの同じｒＲＮＡ標的配列はほとんど
の非ユーバクテリアｒＲＮＡ中のものと異なつており、
該プローブ類がユーバクテリアｒＲＮＡにハイブリダイ
ズする条件下ではほとんどの非ユーバクテリアｒＲＮＡ
にハイブリダイスしない。これらのプローブの特性は、
それぞれ包含性及び排他性と定義される。ユーバクテリ
アに関して本発明のプローブ類のような驚くべき包含性
及び排他性特性を持つプローブ徴を生み出しうるという
発見は予測も期待もできなかつた。
【００２９】表の簡単な説明
表１――１６Ｓ ｒＲＮＡを標的とする本発明の好まし
いプローブ類のヌクレオチド配列をイー・コリ（Ｅ．ｃ
ｏｌｉ）の１６Ｓ ｒＲＮＡにおけるその標的ヌクレオ
チド配列とともに示す。約３５０ヌクレオチドからなる
１６Ｓ及び１８ＳｒＲＮＡ配列に対する非常に広範囲な
配列比較を、本発明のプローブを開発する間に行なつ
た。この分析を詳細に示すことは単に実際的ではない。
もつとも、高度に保存されている１６Ｓ ｒＲＮＡヌク
レオチド部位の一致配列（ＣＯＮＳ−９０％）は代表的
ユーバクテリア間に見られたヌクレオチド配列変異パタ
ーンの要約として提示してある。ＣＯＮＳ−９０％ライ
ン上のヌクレオチドはそのヌクレオチドが検査したユー
バクテリア配列の９０％以上の相同位置に見られること
を示している。該プローブの標的領域は全て、ユーバク
テリア１６Ｓ及び２３Ｓ ｒＲＮＡ分子間で配列が高度
に保存されている集団に対応していることを銘記すべき
である。
いプローブ類のヌクレオチド配列をイー・コリ（Ｅ．ｃ
ｏｌｉ）の１６Ｓ ｒＲＮＡにおけるその標的ヌクレオ
チド配列とともに示す。約３５０ヌクレオチドからなる
１６Ｓ及び１８ＳｒＲＮＡ配列に対する非常に広範囲な
配列比較を、本発明のプローブを開発する間に行なつ
た。この分析を詳細に示すことは単に実際的ではない。
もつとも、高度に保存されている１６Ｓ ｒＲＮＡヌク
レオチド部位の一致配列（ＣＯＮＳ−９０％）は代表的
ユーバクテリア間に見られたヌクレオチド配列変異パタ
ーンの要約として提示してある。ＣＯＮＳ−９０％ライ
ン上のヌクレオチドはそのヌクレオチドが検査したユー
バクテリア配列の９０％以上の相同位置に見られること
を示している。該プローブの標的領域は全て、ユーバク
テリア１６Ｓ及び２３Ｓ ｒＲＮＡ分子間で配列が高度
に保存されている集団に対応していることを銘記すべき
である。
【００３０】イー・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ：大腸菌）の１
６Ｓ及び２３Ｓ ｒＲＮＡ配列は最初にｒＲＮＡ配列が
完全に得られたもののひとつであるため、指定の部位ナ
ンバーは考察中の他のｒＲＮＡ配列中の相同な領域を明
快に同定するための便利かつ一般に認められた基準とな
つている。表１においては、該イー・コリ（Ｅ．ｃｏｌ
ｉ）ＲＮＡ（標的）配列は５′から３′方向に書かれて
いる。プローブ配列は、ｒＲＮＡ自身よりもむしろ該ｒ
ＲＮＡに相補的な配列にハイブリダイズするように設計
されているプローブ１６３８、１６４２及び１６４３を
除いては、ＤＮＡであり３′から５′方向に書かれてい
る。これらの例外のプローブ類は該ｒＲＮＡと同様の
“向き”（すなわち、極性）を持ち、５′から３′方向
に書かれている。
６Ｓ及び２３Ｓ ｒＲＮＡ配列は最初にｒＲＮＡ配列が
完全に得られたもののひとつであるため、指定の部位ナ
ンバーは考察中の他のｒＲＮＡ配列中の相同な領域を明
快に同定するための便利かつ一般に認められた基準とな
つている。表１においては、該イー・コリ（Ｅ．ｃｏｌ
ｉ）ＲＮＡ（標的）配列は５′から３′方向に書かれて
いる。プローブ配列は、ｒＲＮＡ自身よりもむしろ該ｒ
ＲＮＡに相補的な配列にハイブリダイズするように設計
されているプローブ１６３８、１６４２及び１６４３を
除いては、ＤＮＡであり３′から５′方向に書かれてい
る。これらの例外のプローブ類は該ｒＲＮＡと同様の
“向き”（すなわち、極性）を持ち、５′から３′方向
に書かれている。
【００３１】表２――２３Ｓ ｒＲＮＡを標的とする本
発明の好ましいプローブ類のヌクレオチド配列をイー・
コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）の２３Ｓ ｒＲＮＡにおけるその
標的ヌクレオチド配列とともに示す。表１と同様に、イ
ー・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）配列ナンバーを、全２３Ｓ
ｒＲＮＡにおける相同のプローブ標的配列を同定するた
めの基準として用いている。ＣＯＮＳ−９０％は表１に
おけるものと同様の意味を持つ。該２３Ｓ ｒＲＮＡ分
析にあたつては、わずかに約３０の配列しか入手できな
かつた。しかしながら、これらは図２に示される主要な
ユーバクテリア分類のほとんどを代表している。プロー
ブ１７３０の配列において、“Ｒ”はその部位はＡ及び
Ｇの１：１混合であることを示す。
発明の好ましいプローブ類のヌクレオチド配列をイー・
コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）の２３Ｓ ｒＲＮＡにおけるその
標的ヌクレオチド配列とともに示す。表１と同様に、イ
ー・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）配列ナンバーを、全２３Ｓ
ｒＲＮＡにおける相同のプローブ標的配列を同定するた
めの基準として用いている。ＣＯＮＳ−９０％は表１に
おけるものと同様の意味を持つ。該２３Ｓ ｒＲＮＡ分
析にあたつては、わずかに約３０の配列しか入手できな
かつた。しかしながら、これらは図２に示される主要な
ユーバクテリア分類のほとんどを代表している。プロー
ブ１７３０の配列において、“Ｒ”はその部位はＡ及び
Ｇの１：１混合であることを示す。
【００３２】表３――ドツトブロツトハイブリダイゼー
シヨンアツセイにおけるユーバクテリア及び非ユーバク
テリアｒＲＮＡの代表的サンプルに対する複数の好まし
い１６Ｓ ｒＲＮＡ標的プローブの包含性及び排他性の
実例を示す。
シヨンアツセイにおけるユーバクテリア及び非ユーバク
テリアｒＲＮＡの代表的サンプルに対する複数の好まし
い１６Ｓ ｒＲＮＡ標的プローブの包含性及び排他性の
実例を示す。
【００３３】表４――ドツトブロツトハイブリダイゼー
シヨンアツセイにおけるユーバクテリア及び非ユーバク
テリアｒＲＮＡの代表的サンプルに対する複数の好まし
い２３Ｓ ｒＲＮＡ標的プローブの包含性及び排他性の
実例を示す。 表５――ドツトブロツトハイブリダイゼーシヨンアツセ
イにおけるユーバクテリア及び非ユーバクテリアｒＲＮ
Ａの代表的サンプルに対する複数の他の好ましい１６Ｓ
及び２３Ｓ ｒＲＮＡ標的プローブの包含性及び排他性
の実例を示す。これらのプローブは特定なサブグループ
類のユーバクテリア――特にグラム陽性及びグラム陰性
バクテリアに対して有用なハイブリダイゼーシヨンパタ
ーンを示す。
シヨンアツセイにおけるユーバクテリア及び非ユーバク
テリアｒＲＮＡの代表的サンプルに対する複数の好まし
い２３Ｓ ｒＲＮＡ標的プローブの包含性及び排他性の
実例を示す。 表５――ドツトブロツトハイブリダイゼーシヨンアツセ
イにおけるユーバクテリア及び非ユーバクテリアｒＲＮ
Ａの代表的サンプルに対する複数の他の好ましい１６Ｓ
及び２３Ｓ ｒＲＮＡ標的プローブの包含性及び排他性
の実例を示す。これらのプローブは特定なサブグループ
類のユーバクテリア――特にグラム陽性及びグラム陰性
バクテリアに対して有用なハイブリダイゼーシヨンパタ
ーンを示す。
【００３４】
【発明の実施の形態】プローブ開発計画：本発明のプロ
ーブの開発においてとられた第一のステツプには、ユー
バクテリア特異性核酸プローブ類に対する標的部位とな
りうるような１６Ｓ及び２３ＳｒＲＮＡの領域の同定が
含まれた。これには以下の特徴を有する部位の発見が必
要であつた： １）ユーバクテリアｒＲＮＡ配列の間で高度に保存され
ている（ヌクレオチド変化、欠失若しくは挿入がほとん
どない）こと、及び ２）非モーバクテリアｒＲＮＡ配列中では実質的に異な
ること。
ーブの開発においてとられた第一のステツプには、ユー
バクテリア特異性核酸プローブ類に対する標的部位とな
りうるような１６Ｓ及び２３ＳｒＲＮＡの領域の同定が
含まれた。これには以下の特徴を有する部位の発見が必
要であつた： １）ユーバクテリアｒＲＮＡ配列の間で高度に保存され
ている（ヌクレオチド変化、欠失若しくは挿入がほとん
どない）こと、及び ２）非モーバクテリアｒＲＮＡ配列中では実質的に異な
ること。
【００３５】この分析にむけて、入手できた１６Ｓ及び
２３Ｓ ｒＲＮＡ配列を正確に解明した。この努力の一
郡として、複数の１６Ｓ及び２３Ｓ ｒＲＮＡ配列が決
定された。このようなヌクレオチド配列は、該ｒＲＮＡ
類を規定する遺伝子類をクローニングし（マニアチスら
（Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ．）、分子クローニン
グ；実験マニユアル、コールドスプリングハーバー研究
所、ニユーヨーク、第５４５頁、１９８２年）、配列決
定する（マキシマム及びギルバート（Ｍａｘａｍ ａｎ
ｄ Ｇｉｌｂｅｒｔ）、プロシーデイングズ オブ ザ
ナシヨナルアカデミイ オブ サイエンス ＵＳＡ
（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏ
ｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ ＵＳ
Ａ）、７４巻、第５６０−５６４頁、１９７７年；サン
ガーら（Ｓａｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．）、プロシーデイ
ングズ オブ ザ ナシヨナル アカデミイ オブ サ
イエンス ＵＳＡ（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔ
ｈｅ ＮａｔｉｏｎａｌＡｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉ
ｅｎｃｅ ＵＳＡ）、７４巻、第５４６３−５４６７
頁、１９７７年）か、かつ／又は逆転写酵素を用いて該
ｒＲＮＡ類自身を直接配列決定する（レーンら（Ｌａｎ
ｅ ｅｔ ａｌ．）、プロシーデイングズオブ ザ ナ
シヨナル アカデミイ オブ サイエンス ＵＳＡ（Ｐ
ｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａ
ｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ ＵＳ
Ａ）、８２巻、第６９５５−６９５９頁、１９８５年；
レーン（Ｌａｎｅ）、原稿準備中）ことにより標準的実
験プロトコールにより決定された。
２３Ｓ ｒＲＮＡ配列を正確に解明した。この努力の一
郡として、複数の１６Ｓ及び２３Ｓ ｒＲＮＡ配列が決
定された。このようなヌクレオチド配列は、該ｒＲＮＡ
類を規定する遺伝子類をクローニングし（マニアチスら
（Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ．）、分子クローニン
グ；実験マニユアル、コールドスプリングハーバー研究
所、ニユーヨーク、第５４５頁、１９８２年）、配列決
定する（マキシマム及びギルバート（Ｍａｘａｍ ａｎ
ｄ Ｇｉｌｂｅｒｔ）、プロシーデイングズ オブ ザ
ナシヨナルアカデミイ オブ サイエンス ＵＳＡ
（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏ
ｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ ＵＳ
Ａ）、７４巻、第５６０−５６４頁、１９７７年；サン
ガーら（Ｓａｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．）、プロシーデイ
ングズ オブ ザ ナシヨナル アカデミイ オブ サ
イエンス ＵＳＡ（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔ
ｈｅ ＮａｔｉｏｎａｌＡｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉ
ｅｎｃｅ ＵＳＡ）、７４巻、第５４６３−５４６７
頁、１９７７年）か、かつ／又は逆転写酵素を用いて該
ｒＲＮＡ類自身を直接配列決定する（レーンら（Ｌａｎ
ｅ ｅｔ ａｌ．）、プロシーデイングズオブ ザ ナ
シヨナル アカデミイ オブ サイエンス ＵＳＡ（Ｐ
ｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａ
ｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ ＵＳ
Ａ）、８２巻、第６９５５−６９５９頁、１９８５年；
レーン（Ｌａｎｅ）、原稿準備中）ことにより標準的実
験プロトコールにより決定された。
【００３６】１６Ｓ及び２３Ｓ ｒＲＮＡ配列の組につ
いてコンピユーターアルゴリズムを、ユーバクテリア間
で最も類似性の大きい領域の同定のために用いた。この
ような領域に対する核酸プローブ類は多様なユーバクテ
リア間に最も幅広くハイブリダイズするであろう。
いてコンピユーターアルゴリズムを、ユーバクテリア間
で最も類似性の大きい領域の同定のために用いた。この
ような領域に対する核酸プローブ類は多様なユーバクテ
リア間に最も幅広くハイブリダイズするであろう。
【００３７】ユーバクテリア間で相同性を持つこのよう
な領域を次に非ユーバクテリアｒＲＮＡ配列との相違性
について評価した。特に、ユーバクテリアとヒト、真菌
及びミトコンドリアの配列の間の配列相違性を探求し
た。
な領域を次に非ユーバクテリアｒＲＮＡ配列との相違性
について評価した。特に、ユーバクテリアとヒト、真菌
及びミトコンドリアの配列の間の配列相違性を探求し
た。
【００３８】４１のプローブがこれらの分析に基づいて
設計された；２２は２３Ｓ ｒＲＮＡを標的とし、１９
は１６Ｓ ｒＲＮＡを標的とした。
設計された；２２は２３Ｓ ｒＲＮＡを標的とし、１９
は１６Ｓ ｒＲＮＡを標的とした。
【００３９】これらのプローブ類の広範囲のユーバクテ
リアに対するハイブリダイゼーシヨン特性をドツトブロ
ツトフオーマツトのハイブリダイゼーシヨン分析により
測定した。
リアに対するハイブリダイゼーシヨン特性をドツトブロ
ツトフオーマツトのハイブリダイゼーシヨン分析により
測定した。
【００４０】プローブ類の物理的説明：上述のプローブ
選択計画からサンプル中のユーバクテリアを同定するた
めに有用な複数のプローブが得られ、以下の好ましいオ
リゴヌクレオチドプローブ類が含まれる。
選択計画からサンプル中のユーバクテリアを同定するた
めに有用な複数のプローブが得られ、以下の好ましいオ
リゴヌクレオチドプローブ類が含まれる。
【００４１】
【化１】１６Ｓ ｒＲＮＡ標的プローブ：
プローブ １６３８：５′−ＡＧＡＧＴＴＴＧＡＴＣＣ
ＴＧＧＣＴＣＡＧ−３′ プローブ １６４２：５′−ＡＧＡＧＴＴＴＧＡＴＣＡ
ＴＧＧＣＴＣＡＧ−３′ プローブ １６４３：５′−ＡＧＡＧＴＴＴＧＡＴＣＣ
ＴＧＧＣＴＴＡＧ−３′ プローブ １７３８：５′−ＣＴＧＡＧＣＣＡＧＧＡＴ
ＣＡＡＡＣＴＣＴ−３′ プローブ １７４４：５′−ＣＡＧＣＧＴＴＣＧＴＣＣ
ＴＧＡＧＣＣＡＧＧＡＴＣＡＡＡＣＴ−３′ プローブ １６５９：５′−ＣＴＧＣＴＧＣＣＴＣＣＣ
ＧＴＡＧＧＡＧＴ−３′ プローブ １６６０：５′−ＣＴＧＣＴＧＣＣＴＣＣＣ
ＧＴＡＧＧＡＧＴＴＴＧＧＧＣＣＧＴＧＴＣＴＣＡＧＴ
ＴＣＣＡＧＴＧＴ−３′ プローブ １６６１：５′−ＴＡＴＴＡＣＣＧＣＧＧＣ
ＴＧＣＴＧＧＣＡＣＧＧＡＧＴＴＡＧＣＣＧ−３′ プローブ １７３９：５′−ＧＣＧＴＧＧＡＣＴＡＣＣ
ＧＧＧＧＴＡＴＣＴＡＡＴＣＣＴＧＴＴＴＧＣＴＣＣＣ
ＣＡＣＧＣＴＴＴＣＧ−３′ プローブ １７４０：５′−ＧＧＧＴＴＧＣＧＣＴＣＧ
ＴＴＧＣＧＧＧＡＣＴＴＡＡＣＣＣＧＡＣＡＴＣＴＣＡ
ＣＧＧＣＡＣＧＡＧＣＴＧＡＣＡＡＣＡＧＣＣＡＴＧＣ
ＡＴ−３′ プローブ １７４１：５′−ＣＴＣＡＣＧＧＣＡＣＧＡ
ＧＣＴＧＡＣＧＡＣＡＧＣＣＡＴＧＣＡＴ−３′ プローブ １７４２：５′−ＧＧＧＴＴＧＣＧＣＴＣＧ
ＴＴＧＣＧＧＧＡＣＴＴＡＡＣＣＣＧＡＣＡＴ−３′ プローブ １７４５：５′−ＡＧＣＴＧＡＣＧＡＣＡＡ
ＣＣＡＴＧＣＡＣＣＡＣＣＴＧＴ−３′ プローブ １７４６：５′−ＴＣＡＴＡＡＧＧＧＧＣＡ
ＴＧＡＴＧＡＴＴＴＧＡＣＧＴＣＡＴ−３′ プローブ １７４３：５′−ＧＡＴＣＡＡＧＧＣＣＣＧ
ＧＧＡＡＣＧＴＡＴＴＣＡＣＣＧ−３′ プローブ １６３７：５′−ＡＡＧＧＡＧＧＴＧＡＴＣ
ＣＡＧＣＣ−３′ プローブ １６３９：５′−ＡＣＧＧＴＴＡＣＣＴＴＧ
ＴＴＡＣＧＡＣＴＴ−３′ プローブ １６４０：５′−ＡＣＧＧＣＴＡＣＣＴＴＧ
ＴＴＡＣＧＡＣＴＴ−３′ プローブ １６４１：５′−ＡＣＧＧＡＴＡＣＣＴＴＧ
ＴＴＡＣＧＡＣＴＴ−３′
ＴＧＧＣＴＣＡＧ−３′ プローブ １６４２：５′−ＡＧＡＧＴＴＴＧＡＴＣＡ
ＴＧＧＣＴＣＡＧ−３′ プローブ １６４３：５′−ＡＧＡＧＴＴＴＧＡＴＣＣ
ＴＧＧＣＴＴＡＧ−３′ プローブ １７３８：５′−ＣＴＧＡＧＣＣＡＧＧＡＴ
ＣＡＡＡＣＴＣＴ−３′ プローブ １７４４：５′−ＣＡＧＣＧＴＴＣＧＴＣＣ
ＴＧＡＧＣＣＡＧＧＡＴＣＡＡＡＣＴ−３′ プローブ １６５９：５′−ＣＴＧＣＴＧＣＣＴＣＣＣ
ＧＴＡＧＧＡＧＴ−３′ プローブ １６６０：５′−ＣＴＧＣＴＧＣＣＴＣＣＣ
ＧＴＡＧＧＡＧＴＴＴＧＧＧＣＣＧＴＧＴＣＴＣＡＧＴ
ＴＣＣＡＧＴＧＴ−３′ プローブ １６６１：５′−ＴＡＴＴＡＣＣＧＣＧＧＣ
ＴＧＣＴＧＧＣＡＣＧＧＡＧＴＴＡＧＣＣＧ−３′ プローブ １７３９：５′−ＧＣＧＴＧＧＡＣＴＡＣＣ
ＧＧＧＧＴＡＴＣＴＡＡＴＣＣＴＧＴＴＴＧＣＴＣＣＣ
ＣＡＣＧＣＴＴＴＣＧ−３′ プローブ １７４０：５′−ＧＧＧＴＴＧＣＧＣＴＣＧ
ＴＴＧＣＧＧＧＡＣＴＴＡＡＣＣＣＧＡＣＡＴＣＴＣＡ
ＣＧＧＣＡＣＧＡＧＣＴＧＡＣＡＡＣＡＧＣＣＡＴＧＣ
ＡＴ−３′ プローブ １７４１：５′−ＣＴＣＡＣＧＧＣＡＣＧＡ
ＧＣＴＧＡＣＧＡＣＡＧＣＣＡＴＧＣＡＴ−３′ プローブ １７４２：５′−ＧＧＧＴＴＧＣＧＣＴＣＧ
ＴＴＧＣＧＧＧＡＣＴＴＡＡＣＣＣＧＡＣＡＴ−３′ プローブ １７４５：５′−ＡＧＣＴＧＡＣＧＡＣＡＡ
ＣＣＡＴＧＣＡＣＣＡＣＣＴＧＴ−３′ プローブ １７４６：５′−ＴＣＡＴＡＡＧＧＧＧＣＡ
ＴＧＡＴＧＡＴＴＴＧＡＣＧＴＣＡＴ−３′ プローブ １７４３：５′−ＧＡＴＣＡＡＧＧＣＣＣＧ
ＧＧＡＡＣＧＴＡＴＴＣＡＣＣＧ−３′ プローブ １６３７：５′−ＡＡＧＧＡＧＧＴＧＡＴＣ
ＣＡＧＣＣ−３′ プローブ １６３９：５′−ＡＣＧＧＴＴＡＣＣＴＴＧ
ＴＴＡＣＧＡＣＴＴ−３′ プローブ １６４０：５′−ＡＣＧＧＣＴＡＣＣＴＴＧ
ＴＴＡＣＧＡＣＴＴ−３′ プローブ １６４１：５′−ＡＣＧＧＡＴＡＣＣＴＴＧ
ＴＴＡＣＧＡＣＴＴ−３′
【００４２】
【化２】２３Ｓ ｒＲＮＡ標的プローブ：
プローブ １７３０：５′−ＣＴＴＴＴＣＴＣＣＴＴＴ
ＣＣＣＴＣＲＣＧＧＴＡＣＴＧＧＴＴＣＲＣＴＡＴＣＧ
ＧＴＣ′３ プローブ １７３１：５′−ＣＴＴＴＴＣＧＣＣＴＴＴ
ＣＣＣＴＣＧＣＧＧＴＡＣＴＧＧＴＴＣＧＣＴＡＴＣＧ
ＧＴＣ′３ プローブ １６５８：５′−ＴＣＴＴＴＡＡＡＧＧＧＴ
ＧＧＣＴＧＣＴＴＣＴＡＡＧＣＣＡＡＣＡＴＣＣＴＧＧ
ＴＴＧ−３′ プローブ １６５６：５′−ＣＴＡＣＣＴＧＴＧＴＣＧ
ＧＴＴＴＧＣＧＧＴＡＣＧＧＧＣ−３′ プローブ １６５７：５′−ＧＧＴＡＴＴＣＴＣＴＡＣ
ＣＴＧＡＣＣＡＣＣＴＧＴＧＴＣＧＧＴＴＴＧＧＧＧＴ
ＡＣＧ−３′ プローブ １６５３：５′−ＣＣＴＴＣＴＣＣＣＧＡＡ
ＧＴＴＡＣＧＧＧＧＧＣＡＴＴＴＴＧＣＣＴＡＧＴＴＣ
ＣＴＴ−３′ プローブ １６５４：５′−ＣＣＴＴＣＴＣＣＣＧＡＡ
ＧＴＴＡＣＧＧＧＧＴＣＡＴＴＴＴＧＣＣＧＡＧＴＴＣ
ＣＴＴ−３′ プローブ １６５５：５′−ＣＣＴＴＣＴＣＣＣＧＡＡ
ＧＴＴＡＣＧＧＣＡＣＣＡＴＴＴＴＧＣＣＧＡＧＴＴＣ
ＣＴＴ−３′ プローブ １６５１：５′−ＣＴＣＣＴＣＴＴＡＡＣＣ
ＴＴＣＣＡＧＣＡＣＣＧＧＧＣＡＧＧＣ−３′ プローブ １６５２：５′−ＴＴＣＧＡＴＣＡＧＧＧＧ
ＣＴＴＣＧＣＴＴＧＣＧＣＴＧＡＣＣＣＣＡＴＣＡＡＴ
ＴＡＡ−３′ プローブ １５１２：５′−ＴＴＡＧＧＡＣＣＧＴＴＡ
ＴＡＧＴＴＡＣＧＧＣＣＧＣＣＧＴＴＴＡＣＴＧＧＧＧ
ＣＴＴ−３′ プローブ １２５６：５′−ＧＧＴＣＧＧＡＡＣＴＴＡ
ＣＣＣＧＡＣＡＡＧＧＡＡＴＴＴＣＧＣＴＡＣＣＴＴＡ
Ｇ−３′ プローブ １３９８：５′−ＧＧＴＣＧＧＴＡＴＴＴＡ
ＡＣＣＧＡＣＡＡＧＧＡＡＴＴＴＣＧＣＴＡＣＣＴＴＡ
Ｇ−３′ プローブ １５１１：５′−ＣＧＴＧＣＧＧＧＴＣＧＧ
ＡＡＣＴＴＡＣＣＣＧＡＣＡＡＧＧＡＡＴＴＴＣＧＣＴ
ＡＣＣ３′ プローブ １５９５：５′−ＣＧＡＴＡＴＧＡＡＣＴＣ
ＴＴＧＧＧＣＧＧＴＡＴＣＡＧＣＣＴＧＴＴＡＴＣＣＣ
ＣＧＧ−３′ プローブ １６００：５′−ＣＡＧＣＣＣＣＡＧＧＡＴ
ＧＡＧＡＴＧＡＧＣＣＧＡＣＡＴＣＧＡＧＧＴＧＣＣＡ
ＡＡＣ−３′ プローブ １６０１：５′−ＣＡＧＣＣＣＣＡＧＧＡＴ
ＧＴＧＡＴＧＡＧＣＣＧＡＣＡＴＣＧＡＧＧＴＧＣＣＡ
ＡＡＣ−３′ プローブ １６０２：５′−ＣＡＧＣＣＣＣＡＧＧＡＴ
ＧＣＧＡＴＧＡＧＣＣＧＡＣＡＴＣＧＡＧＧＴＧＣＣＡ
ＡＡＣ−３′ プローブ １５９８：５′−ＣＧＴＡＣＣＧＣＴＴＴＡ
ＡＡＴＧＧＣＧＡＡＣＡＧＣＣＡＴＡＣＣＣＴＴＧＧＧ
ＡＣＣ−３′ プローブ １５９９：５′−ＣＧＴＧＣＣＧＣＴＴＴＡ
ＡＴＧＧＧＣＧＡＡＣＡＧＣＣＣＡＡＣＣＣＴＴＧＧＧ
ＡＣＣ−３′ プローブ １５９６：５′−ＧＡＴＡＧＧＧＡＣＣＧＡ
ＡＣＴＧＴＣＴＣＡＣＧＡＣＧＴＴＴＴＧＡＡＣＣＣＡ
ＧＣＴ−３′ プローブ １５９７：５′−ＧＡＴＡＧＧＧＡＣＣＧＡ
ＡＣＴＧＴＣＴＣＡＣＧＡＣＧＴＴＣＴＧＡＡＣＣＣＡ
ＧＣＴ−３′
ＣＣＣＴＣＲＣＧＧＴＡＣＴＧＧＴＴＣＲＣＴＡＴＣＧ
ＧＴＣ′３ プローブ １７３１：５′−ＣＴＴＴＴＣＧＣＣＴＴＴ
ＣＣＣＴＣＧＣＧＧＴＡＣＴＧＧＴＴＣＧＣＴＡＴＣＧ
ＧＴＣ′３ プローブ １６５８：５′−ＴＣＴＴＴＡＡＡＧＧＧＴ
ＧＧＣＴＧＣＴＴＣＴＡＡＧＣＣＡＡＣＡＴＣＣＴＧＧ
ＴＴＧ−３′ プローブ １６５６：５′−ＣＴＡＣＣＴＧＴＧＴＣＧ
ＧＴＴＴＧＣＧＧＴＡＣＧＧＧＣ−３′ プローブ １６５７：５′−ＧＧＴＡＴＴＣＴＣＴＡＣ
ＣＴＧＡＣＣＡＣＣＴＧＴＧＴＣＧＧＴＴＴＧＧＧＧＴ
ＡＣＧ−３′ プローブ １６５３：５′−ＣＣＴＴＣＴＣＣＣＧＡＡ
ＧＴＴＡＣＧＧＧＧＧＣＡＴＴＴＴＧＣＣＴＡＧＴＴＣ
ＣＴＴ−３′ プローブ １６５４：５′−ＣＣＴＴＣＴＣＣＣＧＡＡ
ＧＴＴＡＣＧＧＧＧＴＣＡＴＴＴＴＧＣＣＧＡＧＴＴＣ
ＣＴＴ−３′ プローブ １６５５：５′−ＣＣＴＴＣＴＣＣＣＧＡＡ
ＧＴＴＡＣＧＧＣＡＣＣＡＴＴＴＴＧＣＣＧＡＧＴＴＣ
ＣＴＴ−３′ プローブ １６５１：５′−ＣＴＣＣＴＣＴＴＡＡＣＣ
ＴＴＣＣＡＧＣＡＣＣＧＧＧＣＡＧＧＣ−３′ プローブ １６５２：５′−ＴＴＣＧＡＴＣＡＧＧＧＧ
ＣＴＴＣＧＣＴＴＧＣＧＣＴＧＡＣＣＣＣＡＴＣＡＡＴ
ＴＡＡ−３′ プローブ １５１２：５′−ＴＴＡＧＧＡＣＣＧＴＴＡ
ＴＡＧＴＴＡＣＧＧＣＣＧＣＣＧＴＴＴＡＣＴＧＧＧＧ
ＣＴＴ−３′ プローブ １２５６：５′−ＧＧＴＣＧＧＡＡＣＴＴＡ
ＣＣＣＧＡＣＡＡＧＧＡＡＴＴＴＣＧＣＴＡＣＣＴＴＡ
Ｇ−３′ プローブ １３９８：５′−ＧＧＴＣＧＧＴＡＴＴＴＡ
ＡＣＣＧＡＣＡＡＧＧＡＡＴＴＴＣＧＣＴＡＣＣＴＴＡ
Ｇ−３′ プローブ １５１１：５′−ＣＧＴＧＣＧＧＧＴＣＧＧ
ＡＡＣＴＴＡＣＣＣＧＡＣＡＡＧＧＡＡＴＴＴＣＧＣＴ
ＡＣＣ３′ プローブ １５９５：５′−ＣＧＡＴＡＴＧＡＡＣＴＣ
ＴＴＧＧＧＣＧＧＴＡＴＣＡＧＣＣＴＧＴＴＡＴＣＣＣ
ＣＧＧ−３′ プローブ １６００：５′−ＣＡＧＣＣＣＣＡＧＧＡＴ
ＧＡＧＡＴＧＡＧＣＣＧＡＣＡＴＣＧＡＧＧＴＧＣＣＡ
ＡＡＣ−３′ プローブ １６０１：５′−ＣＡＧＣＣＣＣＡＧＧＡＴ
ＧＴＧＡＴＧＡＧＣＣＧＡＣＡＴＣＧＡＧＧＴＧＣＣＡ
ＡＡＣ−３′ プローブ １６０２：５′−ＣＡＧＣＣＣＣＡＧＧＡＴ
ＧＣＧＡＴＧＡＧＣＣＧＡＣＡＴＣＧＡＧＧＴＧＣＣＡ
ＡＡＣ−３′ プローブ １５９８：５′−ＣＧＴＡＣＣＧＣＴＴＴＡ
ＡＡＴＧＧＣＧＡＡＣＡＧＣＣＡＴＡＣＣＣＴＴＧＧＧ
ＡＣＣ−３′ プローブ １５９９：５′−ＣＧＴＧＣＣＧＣＴＴＴＡ
ＡＴＧＧＧＣＧＡＡＣＡＧＣＣＣＡＡＣＣＣＴＴＧＧＧ
ＡＣＣ−３′ プローブ １５９６：５′−ＧＡＴＡＧＧＧＡＣＣＧＡ
ＡＣＴＧＴＣＴＣＡＣＧＡＣＧＴＴＴＴＧＡＡＣＣＣＡ
ＧＣＴ−３′ プローブ １５９７：５′−ＧＡＴＡＧＧＧＡＣＣＧＡ
ＡＣＴＧＴＣＴＣＡＣＧＡＣＧＴＴＣＴＧＡＡＣＣＣＡ
ＧＣＴ−３′
【００４３】上記のプローブ類の特異的性質は、かなり
の範囲がそれらの用いられるアツセイフオーマットに依
存している。逆に、該アツセイフオーマツトが特定のプ
ローブ類の何らかの最適の設計要件を指図するであろ
う。本発明のプローブ類の“本質”は指定されたプロー
ブ類の特定のヌクレオチド列に限定されると解釈すべき
ではない。例えば、これらの特定のオリゴヌクレオチド
の長さは下で述べるドツトブロツトアツセイ（及び何ら
かの他の予想されるアツセイ）における使用に最適にし
た。最適なプローブの長さは選択されたハイブリダイゼ
ーシヨン条件の厳重度の関数となり、それゆえに本プロ
ーブ類の長さはそれらに応して変化するであろうことは
当業者には周知である。また、２個以上のプローブを含
むセツトを考える場合、全てのプローブがそれらの便用
される特定のフオーマツトにおいて矛盾のない方式で機
能することが望ましい。このように、特定のプローブの
正確な長さはその特異的な意図された使用法をある程度
反映するであろう。さらに、本発明のプローブ類につい
て言えば、通常の当業者はこれらを熟知している。ここ
で述べるプローブ類の“本質”は、上で述べられており
表１及び表２に示されている特異的配列の発見及び利用
にある。
の範囲がそれらの用いられるアツセイフオーマットに依
存している。逆に、該アツセイフオーマツトが特定のプ
ローブ類の何らかの最適の設計要件を指図するであろ
う。本発明のプローブ類の“本質”は指定されたプロー
ブ類の特定のヌクレオチド列に限定されると解釈すべき
ではない。例えば、これらの特定のオリゴヌクレオチド
の長さは下で述べるドツトブロツトアツセイ（及び何ら
かの他の予想されるアツセイ）における使用に最適にし
た。最適なプローブの長さは選択されたハイブリダイゼ
ーシヨン条件の厳重度の関数となり、それゆえに本プロ
ーブ類の長さはそれらに応して変化するであろうことは
当業者には周知である。また、２個以上のプローブを含
むセツトを考える場合、全てのプローブがそれらの便用
される特定のフオーマツトにおいて矛盾のない方式で機
能することが望ましい。このように、特定のプローブの
正確な長さはその特異的な意図された使用法をある程度
反映するであろう。さらに、本発明のプローブ類につい
て言えば、通常の当業者はこれらを熟知している。ここ
で述べるプローブ類の“本質”は、上で述べられており
表１及び表２に示されている特異的配列の発見及び利用
にある。
【００４４】プローブ特性のハイブリダイゼーシヨン分
析 発表された標的配列の発見を導いた配列比較は該プロー
ブ類の多くはかなりの数のユーバクテリアにハイブリダ
イズするであろうことを示唆した。１６Ｓ ｒＲＮＡ分
析については、該プローブ類の設計において約３５０の
配列が考察され、２３Ｓ ｒＲＮＡ分析については約３
０の配列しか入手できなかつた。全てのユーバクテリア
株を試験することは不可能であるため、より大きな配列
の多様性が配列分析によつて調べられていない他のユー
バクテリア株に存在し、そのような未試験のユーバクテ
リアに対して見込みがあるプローブ類によるハイブリダ
イゼーシヨンを減少若しくは消失させると思われる。表
３、４及び５に見ることができるように、非常に幅広い
包含性を持つプローブのいくつかはそれにもかかわらず
ある種のバクテリアにはハイブリダイズしない。それゆ
えに、多数の全体を代表するような数のユーバクテリア
に対するハイブリダイゼーシヨン特性を注意深く証明す
ることは、そのようなプローブ類が全てのユーバクテリ
アを検出しうることを証明するための、若しくはそうで
きない場合はどのユーバクテリアが検出されないかを証
明するための重要な要素である。そのような“検出され
ないこと”は臨床的には重要でないと思われ、若しくは
代わりに本発明の他のプローブ類の適当な包含性により
補われるであろう。
析 発表された標的配列の発見を導いた配列比較は該プロー
ブ類の多くはかなりの数のユーバクテリアにハイブリダ
イズするであろうことを示唆した。１６Ｓ ｒＲＮＡ分
析については、該プローブ類の設計において約３５０の
配列が考察され、２３Ｓ ｒＲＮＡ分析については約３
０の配列しか入手できなかつた。全てのユーバクテリア
株を試験することは不可能であるため、より大きな配列
の多様性が配列分析によつて調べられていない他のユー
バクテリア株に存在し、そのような未試験のユーバクテ
リアに対して見込みがあるプローブ類によるハイブリダ
イゼーシヨンを減少若しくは消失させると思われる。表
３、４及び５に見ることができるように、非常に幅広い
包含性を持つプローブのいくつかはそれにもかかわらず
ある種のバクテリアにはハイブリダイズしない。それゆ
えに、多数の全体を代表するような数のユーバクテリア
に対するハイブリダイゼーシヨン特性を注意深く証明す
ることは、そのようなプローブ類が全てのユーバクテリ
アを検出しうることを証明するための、若しくはそうで
きない場合はどのユーバクテリアが検出されないかを証
明するための重要な要素である。そのような“検出され
ないこと”は臨床的には重要でないと思われ、若しくは
代わりに本発明の他のプローブ類の適当な包含性により
補われるであろう。
【００４５】該プローブ類の包含性と同じくらい重要な
ものがそれらの排他性、すなわちそれらの非ユーバクテ
リアに対する反応性である。先に述べたようにヒト及び
真菌のｒＲＮＡ類にハイブリダイゼーシヨンしないこと
の立証はこのようなプローブ類に想定されるタイプの臨
床応用においては非常に大きな重要性を持つ。それゆ
え、代表的なユーバクテリア、ヒト及び真菌のｒＲＮＡ
に対する該プローブ類の特性をドツトブロツト法を用い
てのハイブリダイゼーシヨン分析により測定した。
ものがそれらの排他性、すなわちそれらの非ユーバクテ
リアに対する反応性である。先に述べたようにヒト及び
真菌のｒＲＮＡ類にハイブリダイゼーシヨンしないこと
の立証はこのようなプローブ類に想定されるタイプの臨
床応用においては非常に大きな重要性を持つ。それゆ
え、代表的なユーバクテリア、ヒト及び真菌のｒＲＮＡ
に対する該プローブ類の特性をドツトブロツト法を用い
てのハイブリダイゼーシヨン分析により測定した。
【００４６】
【実施例】実 施 例 １：プローブハイブリダイゼー
シヨン特性のドツト−ブロツト分析 周知の手法によるドツト−ブロツト分析は、ニトロセル
ロース、ナイロン、若しくは容易に購入できるこの目的
用に特殊に誘導された膜等のフイルター上に核酸若しく
は核酸群を固定することを含む。ＤＮＡかＲＮＡのいず
れかをそのようなフイルター上に容易に固定することが
でき、続いて多様な条件（すなわち厳重度）のいずれか
における興味のあるヌクレオチド配列若しくはプローブ
に対するハイブリダイゼーシヨンについて、プローブと
作用させる若しくは試験することができる。厳重な条件
下では、標的配列に対してより大きな相補性を持つヌク
レオチド配列のプローブ類は相補性のより小さなプロー
ブ類に比べて高いハイブリダイゼーシヨンレベルを示す
と思われる。ここで述べるオリゴヌクレオチドプローブ
のほとんどについて、６０℃で１４−１６時間のｒＲＮ
Ａ標的に対するハイブリダイゼーシヨン（０．９Ｍ Ｎ
ａＣｌ、０．１２Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．８、
６ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１Ｍ ＫＰＯ４、０．１％ＳＤ
Ｓ、０．１％ピロリン酸、０．００２％フイコール、
０．０２％ＢＳＡ及び０．００２％ポリビニルピロリジ
ンを含むハイブリダイゼーシヨン溶液中で行ない、その
後未結合の、及び非特異的にハイブリダイズしたプロー
ブを除去するための標準的後ハイブリダイゼーシヨン洗
浄（６０℃；０．０３Ｍ ＮａＣｌ、０．００４Ｍ Ｔ
ｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．８、０．２ｍＭ ＥＤＴＡ及
び０．１％ＳＤＳ中）を行なう）は、表３、４及び５に
表わした特異性レベルをもたらすに十分の厳重度を持つ
と思われる。これらの条件についての例外は、プローブ
１７３８（３７℃でハイブリダイズさせた）及びプロー
ブ１７４６（３７℃でハイブリダイズさせ、５０℃で洗
浄した）である。
シヨン特性のドツト−ブロツト分析 周知の手法によるドツト−ブロツト分析は、ニトロセル
ロース、ナイロン、若しくは容易に購入できるこの目的
用に特殊に誘導された膜等のフイルター上に核酸若しく
は核酸群を固定することを含む。ＤＮＡかＲＮＡのいず
れかをそのようなフイルター上に容易に固定することが
でき、続いて多様な条件（すなわち厳重度）のいずれか
における興味のあるヌクレオチド配列若しくはプローブ
に対するハイブリダイゼーシヨンについて、プローブと
作用させる若しくは試験することができる。厳重な条件
下では、標的配列に対してより大きな相補性を持つヌク
レオチド配列のプローブ類は相補性のより小さなプロー
ブ類に比べて高いハイブリダイゼーシヨンレベルを示す
と思われる。ここで述べるオリゴヌクレオチドプローブ
のほとんどについて、６０℃で１４−１６時間のｒＲＮ
Ａ標的に対するハイブリダイゼーシヨン（０．９Ｍ Ｎ
ａＣｌ、０．１２Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．８、
６ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１Ｍ ＫＰＯ４、０．１％ＳＤ
Ｓ、０．１％ピロリン酸、０．００２％フイコール、
０．０２％ＢＳＡ及び０．００２％ポリビニルピロリジ
ンを含むハイブリダイゼーシヨン溶液中で行ない、その
後未結合の、及び非特異的にハイブリダイズしたプロー
ブを除去するための標準的後ハイブリダイゼーシヨン洗
浄（６０℃；０．０３Ｍ ＮａＣｌ、０．００４Ｍ Ｔ
ｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．８、０．２ｍＭ ＥＤＴＡ及
び０．１％ＳＤＳ中）を行なう）は、表３、４及び５に
表わした特異性レベルをもたらすに十分の厳重度を持つ
と思われる。これらの条件についての例外は、プローブ
１７３８（３７℃でハイブリダイズさせた）及びプロー
ブ１７４６（３７℃でハイブリダイズさせ、５０℃で洗
浄した）である。
【００４７】粗（未精製）細胞溶解物中に存在するＤＮ
Ａ若しくはＲＮＡを、問題の核酸を最初に精製する必要
なく固定できる技法も使用できる（たとえば、マニアチ
ス，Ｔ．，フリツツエ，Ｅ．Ｆ．及びサンブルツク，
Ｊ．（Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．
Ｆ．ａｎｄ Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．）、分子クローニ
ング：実験マニユアル、１９８２年）。
Ａ若しくはＲＮＡを、問題の核酸を最初に精製する必要
なく固定できる技法も使用できる（たとえば、マニアチ
ス，Ｔ．，フリツツエ，Ｅ．Ｆ．及びサンブルツク，
Ｊ．（Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．
Ｆ．ａｎｄ Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．）、分子クローニ
ング：実験マニユアル、１９８２年）。
【００４８】表３、４及び５に示したドツト−ブロツト
ハイブリダイゼーシヨンデータは表示のプローブの表示
のユーバクテリア、真菌及びヒト種から精製されたＲＮ
Ａに対するハイブリダイゼーシヨンから出された。バク
テリア及び真菌のＲＮＡは表示の微生物の純粋培養から
精製した。マウスＲＮＡはＬ細胞（組織培養細胞系列）
から精製した。小麦胚芽ＲＮＡは市販の穀物製品から精
製した。ヒト血液ＲＮＡ及び大便ＲＮＡは正常な健康個
体から得た適当な標本から精製した。
ハイブリダイゼーシヨンデータは表示のプローブの表示
のユーバクテリア、真菌及びヒト種から精製されたＲＮ
Ａに対するハイブリダイゼーシヨンから出された。バク
テリア及び真菌のＲＮＡは表示の微生物の純粋培養から
精製した。マウスＲＮＡはＬ細胞（組織培養細胞系列）
から精製した。小麦胚芽ＲＮＡは市販の穀物製品から精
製した。ヒト血液ＲＮＡ及び大便ＲＮＡは正常な健康個
体から得た適当な標本から精製した。
【００４９】複数の単純な技術的理由から細胞溶解物よ
りも、精製したＲＮＡを使用した。これらの理由のうち
最も重要なものは個々の生物に対するある特定のプロー
ブのハイブリダイゼーシヨンから得られる相対的シグナ
ルの適正な解釈に関わつている。細胞あたりのＲＮＡ含
量は種々のバクテリア間で大きく異なることが知られて
おり、バクテリアと真核細胞の間ではより大きく異なつ
ている。さらに採収時の細胞の特定の代謝状態は回収さ
れるＲＮＡの量及び完成度に大きな影響を与えうる。た
とえば、ある種のバクテリアは定常的成長期に到達する
と直ちにそのＲＮＡを分解し始める。表３、４及び５に
示した生物はあらゆる点で非常に多様な採集を含む。グ
ラム陽性及びグラム陰性バクテリア、光合成及び化学合
成、有機栄養及び無機栄養、及び嫌気性及び好気性の代
謝を代表している。個々の“ドツト”中に既知の等量の
精製ＲＮＡを使用することにより、各プローブの各生物
に対するハイブリダイゼーシヨンの相対レベルが、表示
の個々のタイプのバクテリアからの核酸調製物の特異性
に関係なく、意味を持つて比較できる。
りも、精製したＲＮＡを使用した。これらの理由のうち
最も重要なものは個々の生物に対するある特定のプロー
ブのハイブリダイゼーシヨンから得られる相対的シグナ
ルの適正な解釈に関わつている。細胞あたりのＲＮＡ含
量は種々のバクテリア間で大きく異なることが知られて
おり、バクテリアと真核細胞の間ではより大きく異なつ
ている。さらに採収時の細胞の特定の代謝状態は回収さ
れるＲＮＡの量及び完成度に大きな影響を与えうる。た
とえば、ある種のバクテリアは定常的成長期に到達する
と直ちにそのＲＮＡを分解し始める。表３、４及び５に
示した生物はあらゆる点で非常に多様な採集を含む。グ
ラム陽性及びグラム陰性バクテリア、光合成及び化学合
成、有機栄養及び無機栄養、及び嫌気性及び好気性の代
謝を代表している。個々の“ドツト”中に既知の等量の
精製ＲＮＡを使用することにより、各プローブの各生物
に対するハイブリダイゼーシヨンの相対レベルが、表示
の個々のタイプのバクテリアからの核酸調製物の特異性
に関係なく、意味を持つて比較できる。
【００５０】ＲＮＡは当研究所で開発した標準公示方法
の変法（Ｗ．ワイスバーグ（Ｗ．Ｗｅｉｓｂｕｒｇ）、
未発表）により調製した。該方法からは迅速に大量の高
分子量ＲＮＡが高精製度だが比較的分別されていない形
態で得られる。この様式ではＤＮＡ若しくは低分子量Ｒ
ＮＡ種は調製されたＲＮＡ中にほとんど若しくは全く見
られない。完全な細胞中での該ＲＮＡがそうであるよう
に該ＲＮＡの大部分は１６Ｓ及び２３Ｓ ｒＲＮＡであ
る（真核生物では１８Ｓ及び２８Ｓ ｒＲＮＡであ
る）。該方法は迅速かつ便利であるが、他のものは表
３、４及び５に表わしたドツト−ブロツトの結果の解釈
については適切でない。妥当な無傷性を持つＲＮＡを得
るための、文献中に見られる他の現在許容できるほとん
どの方法は同等のハイブリダイゼーシヨン結果をもたら
すであろう。
の変法（Ｗ．ワイスバーグ（Ｗ．Ｗｅｉｓｂｕｒｇ）、
未発表）により調製した。該方法からは迅速に大量の高
分子量ＲＮＡが高精製度だが比較的分別されていない形
態で得られる。この様式ではＤＮＡ若しくは低分子量Ｒ
ＮＡ種は調製されたＲＮＡ中にほとんど若しくは全く見
られない。完全な細胞中での該ＲＮＡがそうであるよう
に該ＲＮＡの大部分は１６Ｓ及び２３Ｓ ｒＲＮＡであ
る（真核生物では１８Ｓ及び２８Ｓ ｒＲＮＡであ
る）。該方法は迅速かつ便利であるが、他のものは表
３、４及び５に表わしたドツト−ブロツトの結果の解釈
については適切でない。妥当な無傷性を持つＲＮＡを得
るための、文献中に見られる他の現在許容できるほとん
どの方法は同等のハイブリダイゼーシヨン結果をもたら
すであろう。
【００５１】表３、４及び５に報告したハイブリダイゼ
ーシヨン実験については、プローブ類を標準手法を用い
て放射性３２Ｐで末端ラベルした。上述のようにハイブ
リダイゼーシヨン及び洗浄した後、ハイブリダイゼーシ
ヨンフイルターをＸ線フイルムに感光し、既知の配列の
既知の量の標的ＲＮＡを含有する対照ＲＮＡスポツトの
シグナル強度に対して該シグナル強度を評価した。
ーシヨン実験については、プローブ類を標準手法を用い
て放射性３２Ｐで末端ラベルした。上述のようにハイブ
リダイゼーシヨン及び洗浄した後、ハイブリダイゼーシ
ヨンフイルターをＸ線フイルムに感光し、既知の配列の
既知の量の標的ＲＮＡを含有する対照ＲＮＡスポツトの
シグナル強度に対して該シグナル強度を評価した。
【００５２】＋＋＋＋（対照スポツトと同等のハイブリ
ダイゼーシヨンシグナル）から＋（Ｘ線フイルムに長期
間感光してもほとんど検出不能）までの範囲のハイブリ
ダイゼーシヨン強度のスケールを、生物とプローブ類と
の間のハイブリダイゼーシヨンシグナルを比較するのに
用いた。＋＋＋シグナルは対照スポツトよりわずかに強
度が劣るのみの非常に強いシグナルを示す。＋＋は明ら
かに認められるハイブリダイゼーシヨンシグナルではあ
るが、対照スポツトよりも著しく弱いものを示す。ハイ
ブリダイゼーシヨンシグナルを記録するためのより“定
量的”な方法もあるが、それらははるかに使用しづら
く、我々の経験では、表３、４及び５で使用した方法に
比べてプローブ評価において実際には少しも有用ではな
いことを銘記すべきである。事実、このような異種生物
類から得られた（同等の無傷性を持つ）標的ＲＮＡを正
確に同等量スポツトする際のある制御できない変数によ
り、数に関してより正確なカウント方法は誤解を招くだ
けの定量性のよさにすぎない。我々の経験では、特定の
プローブに対して＋＋以上のシグナルを示す微生物は
“−”シグナルを示すものとは容易に識別できる。この
ことは試験した多様なアツセイフオーマツトにあてはま
る。
ダイゼーシヨンシグナル）から＋（Ｘ線フイルムに長期
間感光してもほとんど検出不能）までの範囲のハイブリ
ダイゼーシヨン強度のスケールを、生物とプローブ類と
の間のハイブリダイゼーシヨンシグナルを比較するのに
用いた。＋＋＋シグナルは対照スポツトよりわずかに強
度が劣るのみの非常に強いシグナルを示す。＋＋は明ら
かに認められるハイブリダイゼーシヨンシグナルではあ
るが、対照スポツトよりも著しく弱いものを示す。ハイ
ブリダイゼーシヨンシグナルを記録するためのより“定
量的”な方法もあるが、それらははるかに使用しづら
く、我々の経験では、表３、４及び５で使用した方法に
比べてプローブ評価において実際には少しも有用ではな
いことを銘記すべきである。事実、このような異種生物
類から得られた（同等の無傷性を持つ）標的ＲＮＡを正
確に同等量スポツトする際のある制御できない変数によ
り、数に関してより正確なカウント方法は誤解を招くだ
けの定量性のよさにすぎない。我々の経験では、特定の
プローブに対して＋＋以上のシグナルを示す微生物は
“−”シグナルを示すものとは容易に識別できる。この
ことは試験した多様なアツセイフオーマツトにあてはま
る。
【００５３】表３及び表４に明らかなように、２３Ｓ
ｒＲＮＡ標的プローブ類１６００、１６０２、１５９
６、１２５６及び１５１２、及び１６Ｓ ｒＲＮＡ標的
プローブ類１７３８、１６６０、１６３９、１７３９、
１７４０、１７４１及び１７４３は該ユーバクテリア間
に最も幅広くハイブリダイズし、そのために最も好まし
い。他のプローブ類は種々のパターンをもつてユーバク
テリアのサブグループ類にハイブリダイズし、それらの
サブグループの検出用若しくはより広範な包含性を持つ
プローブセツトの成分として好ましいと思われる。たと
えば、プローブ１５９９、１６５６、１７４４、１７４
５及び１７４６はグラム陽性バクテリアに優先的にハイ
ブリダイズする。プローブ１６５７、１５９８及び１５
９５はグラム陰性バクテリア、特にいわゆる“紅色（パ
ープル）バクテリア”分類の仲間に優先的にハイブリダ
イスする（図２及び表５）。
ｒＲＮＡ標的プローブ類１６００、１６０２、１５９
６、１２５６及び１５１２、及び１６Ｓ ｒＲＮＡ標的
プローブ類１７３８、１６６０、１６３９、１７３９、
１７４０、１７４１及び１７４３は該ユーバクテリア間
に最も幅広くハイブリダイズし、そのために最も好まし
い。他のプローブ類は種々のパターンをもつてユーバク
テリアのサブグループ類にハイブリダイズし、それらの
サブグループの検出用若しくはより広範な包含性を持つ
プローブセツトの成分として好ましいと思われる。たと
えば、プローブ１５９９、１６５６、１７４４、１７４
５及び１７４６はグラム陽性バクテリアに優先的にハイ
ブリダイズする。プローブ１６５７、１５９８及び１５
９５はグラム陰性バクテリア、特にいわゆる“紅色（パ
ープル）バクテリア”分類の仲間に優先的にハイブリダ
イスする（図２及び表５）。
【００５４】表３、４及び５のデータを見て明らかなよ
うに、他のプローブ類は他の有用なハイブリダイゼーシ
ヨンパターンを示す。これらのプローブ類は多様な方法
で組み合わせて、成分となるプローブ類の複合ハイブリ
ダイゼーシヨン特性を示すプローブセツトを創造するこ
とができる。このようなハイブリダイゼーシヨンフオー
マツトの一例を下に示す（実施例２）。
うに、他のプローブ類は他の有用なハイブリダイゼーシ
ヨンパターンを示す。これらのプローブ類は多様な方法
で組み合わせて、成分となるプローブ類の複合ハイブリ
ダイゼーシヨン特性を示すプローブセツトを創造するこ
とができる。このようなハイブリダイゼーシヨンフオー
マツトの一例を下に示す（実施例２）。
【００５５】あるいは、該プローブ類は標的である微生
物に特異的なプローブ類に先立つて、あるいはそれらと
同時に、微生物の混合群中に存在するプールから特異的
ｒＲＮＡ分子を取り除く多様な負のハイブリダイゼーシ
ヨン計画に使用することができる（たとえば、コリンズ
（Ｃｏｌｌｉｎｓ）、欧州特許出願第８７３０９３０８
２号）。
物に特異的なプローブ類に先立つて、あるいはそれらと
同時に、微生物の混合群中に存在するプールから特異的
ｒＲＮＡ分子を取り除く多様な負のハイブリダイゼーシ
ヨン計画に使用することができる（たとえば、コリンズ
（Ｃｏｌｌｉｎｓ）、欧州特許出願第８７３０９３０８
２号）。
【００５６】実 施 例 ２：二重プローブ、サンドイ
ツチハイブリダイゼーシヨンアツセイ 本発明のプローブ類若しくはそれらの誘導体類は多様な
他のハイブリダイゼーシヨンフオーマツトにおいて有効
に使用することができる。そのようなフオーマツトのひ
とつは、たとえばＵＳＳＮ第２７７，５７９号；ＵＳＳ
Ｎ第１６９，６４６号、若しくはＵＳＳＮ第２３３，６
８３号に述べられているような二重プローブ、サンドイ
ツチ型ハイブリダイゼーシヨンアツセイである。このよ
うな二重プローブ使用では、一方のプローブ（たとえ
ば、プローブ１６０２若しくはその誘導体）は理想的に
は３′末端に約２０−２００デオキシアデノシン（ｄ
Ａ）残基からなる領域を含むように誘導されるであろ
う。これは、試験サンプル中から該標的ｒＲＮＡを（液
体中のハイブリダイゼーシヨンの後）、この目的のため
にポリデオキシチミジン（ｄＴ）で適当に誘導しておい
た固型担体（たとえば、ビーズ、プラスチツク表面、フ
イルター等）上に“捕獲”するために用られるであろ
う。第２のプローブ（たとえば、プローブ１５９６若し
くはその誘導体）は検出プローブとして有効に使用さ
れ、何らかの検出リガンド（たとえば、３２Ｐ、フルオ
レセイン、ビオチン等）により適当に誘導されているで
あろう。そうして試験サンプル中の標的核酸の存在の検
出力、一連のハイブリダイゼーシヨン相互作用を通じて
該固体表面上に該検出リガンドを捕獲することにより示
されるであろう：
ツチハイブリダイゼーシヨンアツセイ 本発明のプローブ類若しくはそれらの誘導体類は多様な
他のハイブリダイゼーシヨンフオーマツトにおいて有効
に使用することができる。そのようなフオーマツトのひ
とつは、たとえばＵＳＳＮ第２７７，５７９号；ＵＳＳ
Ｎ第１６９，６４６号、若しくはＵＳＳＮ第２３３，６
８３号に述べられているような二重プローブ、サンドイ
ツチ型ハイブリダイゼーシヨンアツセイである。このよ
うな二重プローブ使用では、一方のプローブ（たとえ
ば、プローブ１６０２若しくはその誘導体）は理想的に
は３′末端に約２０−２００デオキシアデノシン（ｄ
Ａ）残基からなる領域を含むように誘導されるであろ
う。これは、試験サンプル中から該標的ｒＲＮＡを（液
体中のハイブリダイゼーシヨンの後）、この目的のため
にポリデオキシチミジン（ｄＴ）で適当に誘導しておい
た固型担体（たとえば、ビーズ、プラスチツク表面、フ
イルター等）上に“捕獲”するために用られるであろ
う。第２のプローブ（たとえば、プローブ１５９６若し
くはその誘導体）は検出プローブとして有効に使用さ
れ、何らかの検出リガンド（たとえば、３２Ｐ、フルオ
レセイン、ビオチン等）により適当に誘導されているで
あろう。そうして試験サンプル中の標的核酸の存在の検
出力、一連のハイブリダイゼーシヨン相互作用を通じて
該固体表面上に該検出リガンドを捕獲することにより示
されるであろう：
【００５７】
【化３】
これは該標的核酸が試験サンプル中に存在する場合にの
み起こり得るであろう。原則として、上記の機構はたと
えば該アツセイの包含性の改善若しくは感度の向上の目
的で複数の捕獲及び検出プローブ類により用いることが
できるであろう。
み起こり得るであろう。原則として、上記の機構はたと
えば該アツセイの包含性の改善若しくは感度の向上の目
的で複数の捕獲及び検出プローブ類により用いることが
できるであろう。
【００５８】実 施 例 ３：１６Ｓ ｒＲＮＡのＰＣ
Ｒ増幅 ポリメラーゼ鎖反応（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉ
ｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ：ＰＣＲ）は２個の標的配列間に
ある核酸配列を“コピー”することにより標的核酸を増
幅する周知の方法である（ＵＳ第４，６８３，２０２
号）。該ＰＣＲ過程はたとえば非ウイルス性病原体を該
病原体のｒＲＮＡ若しくはｒＲＮＡ遺伝子をコード化し
ている遺伝子を増幅した後、その産物を検出することに
より診断するためのアツセイにおいて有用であろう。こ
の診断方法の実行には該標的微生物（類）のｒＲＮＡを
増幅することができるプライマーの発明が必要である。
このようなプライマーの第２の重要な応用は増幅された
ｒＲＮＡ遺伝子のクローニングにおいてなされ、第３の
応用は増幅されたｒＲＮＡ遺伝子の直接配列決定であ
る。
Ｒ増幅 ポリメラーゼ鎖反応（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉ
ｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ：ＰＣＲ）は２個の標的配列間に
ある核酸配列を“コピー”することにより標的核酸を増
幅する周知の方法である（ＵＳ第４，６８３，２０２
号）。該ＰＣＲ過程はたとえば非ウイルス性病原体を該
病原体のｒＲＮＡ若しくはｒＲＮＡ遺伝子をコード化し
ている遺伝子を増幅した後、その産物を検出することに
より診断するためのアツセイにおいて有用であろう。こ
の診断方法の実行には該標的微生物（類）のｒＲＮＡを
増幅することができるプライマーの発明が必要である。
このようなプライマーの第２の重要な応用は増幅された
ｒＲＮＡ遺伝子のクローニングにおいてなされ、第３の
応用は増幅されたｒＲＮＡ遺伝子の直接配列決定であ
る。
【００５９】プローブ１６３８、１６４２、１６４３、
１６３７、１６３９、１６４０及び１６４１はユーバク
テリアの１６Ｓ ｒＲＮＡ類若しくはそれらをコード化
する遺伝子類を酵素的にコピーかつ／又は増幅するため
のプライマーとして理想的に使用することができる。該
ＰＣＲ処置は該標的核酸が一本鎖であるか若しくは二本
鎖であるか、及びそれがＤＮＡであるか若しくはＲＮＡ
であるかによつてわずかに異なる。しかしながら、いず
れの場合も原理は同じである。該ステツプは簡単には次
のようである： １）二本鎖ＤＮＡを変性させる、 ２）姉妹ＤＮＡ鎖のそれぞれに相補的なオリゴヌクレオ
チドプライマーをアニールさせる、及び ３）ＤＮＡポリメラーゼかつ／又は逆転写酵素を用いて
該プライマー類をその３′末端から延長させることによ
り新たに合成された姉妹ＤＮＡ鎖中にデオキシヌクレオ
チド３リン酸プリカーサー（ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ）を組
み入れる。
１６３７、１６３９、１６４０及び１６４１はユーバク
テリアの１６Ｓ ｒＲＮＡ類若しくはそれらをコード化
する遺伝子類を酵素的にコピーかつ／又は増幅するため
のプライマーとして理想的に使用することができる。該
ＰＣＲ処置は該標的核酸が一本鎖であるか若しくは二本
鎖であるか、及びそれがＤＮＡであるか若しくはＲＮＡ
であるかによつてわずかに異なる。しかしながら、いず
れの場合も原理は同じである。該ステツプは簡単には次
のようである： １）二本鎖ＤＮＡを変性させる、 ２）姉妹ＤＮＡ鎖のそれぞれに相補的なオリゴヌクレオ
チドプライマーをアニールさせる、及び ３）ＤＮＡポリメラーゼかつ／又は逆転写酵素を用いて
該プライマー類をその３′末端から延長させることによ
り新たに合成された姉妹ＤＮＡ鎖中にデオキシヌクレオ
チド３リン酸プリカーサー（ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ）を組
み入れる。
【００６０】このように、該標的遺伝子中の各鎖に相補
的な一組のオリゴヌクレオチドプライマーが該ＰＣＲ反
応には必要である。それらは一方のプライマーの新たに
合成された産物が他方のプライマーの標的／鋳型にもな
るように配置される。このように２個のプライマーがア
ニールした部位の間にある標的ヌクレオチド配列は、列
挙したステツプを約２０ないし３０回繰り返すことによ
り何倍にも増幅できる。
的な一組のオリゴヌクレオチドプライマーが該ＰＣＲ反
応には必要である。それらは一方のプライマーの新たに
合成された産物が他方のプライマーの標的／鋳型にもな
るように配置される。このように２個のプライマーがア
ニールした部位の間にある標的ヌクレオチド配列は、列
挙したステツプを約２０ないし３０回繰り返すことによ
り何倍にも増幅できる。
【００６１】プローブ１６３８、１６４２、１６４３、
１６３７、１６３９、１６４０及び１６４１はユーバク
テリアの１６Ｓ ｒＲＮＡ類若しくはそれらをコード化
する遺伝子類の酵素的コピーかつ／又は増幅におけるプ
ライマーとしての使用に適している。すなわち、セツト
として、それらはユーバクテリアのｒＲＮＡ類及びｒＲ
ＮＡ遺伝子類の間に非常に幅広くアニールし、その結果
サンプル中に存在するいずれのユーバクテリアｒＲＮＡ
配列をも増幅すると思われる。
１６３７、１６３９、１６４０及び１６４１はユーバク
テリアの１６Ｓ ｒＲＮＡ類若しくはそれらをコード化
する遺伝子類の酵素的コピーかつ／又は増幅におけるプ
ライマーとしての使用に適している。すなわち、セツト
として、それらはユーバクテリアのｒＲＮＡ類及びｒＲ
ＮＡ遺伝子類の間に非常に幅広くアニールし、その結果
サンプル中に存在するいずれのユーバクテリアｒＲＮＡ
配列をも増幅すると思われる。
【００６２】プローブ１６３７、１６３９、１６４０及
び１６４１は１６Ｓ ｒＲＮＡ（若しくはリボソームＲ
ＮＡ遺伝子のｒＲＮＡ様鎖）の３′末端付近に対合する
（表１）。該鋳型鎖は３′から５′方向に読まれ、該プ
ライマー自身をその５′末端に組み込んだｒＲＮＡ相補
性鎖を産生する。
び１６４１は１６Ｓ ｒＲＮＡ（若しくはリボソームＲ
ＮＡ遺伝子のｒＲＮＡ様鎖）の３′末端付近に対合する
（表１）。該鋳型鎖は３′から５′方向に読まれ、該プ
ライマー自身をその５′末端に組み込んだｒＲＮＡ相補
性鎖を産生する。
【００６３】プローブ１６３８、１６４２及び１６４３
は該ｒＲＮＡ遺伝子のｒＲＮＡ相補性鎖の５′末端付
近、若しくはすぐ上で述べたように産生された相補物に
ハイブリダイズする。
は該ｒＲＮＡ遺伝子のｒＲＮＡ相補性鎖の５′末端付
近、若しくはすぐ上で述べたように産生された相補物に
ハイブリダイズする。
【００６４】それぞれ、上記の１６Ｓ ｒＲＮＡ増幅プ
ライマー類はおよそ以下の特異性を持つ： ５′プライマー： プローブ１６３８：ほとんどのユーバクテリア プローブ１６４２：腸内細菌（ｅｎｔｅｒｉｃｓ）及び
その近縁菌 プローブ１６４３：ボレリア（Ｂｏｒｒｅｌｉａ）スピ
ロヘータ ３′プライマー： プローブ１６３７：ほとんどのユーバクテリア プローブ１６３９：腸内細菌（ｅｎｔｅｒｉｃｓ）、デ
イノコツカス（Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）、カンピロバ
クター（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ） プローブ１６４０：ほとんどのユーバクテリア プローブ１６４１：紡錘菌、ある種のバチルス（Ｂａｃ
ｉｌｌｕｓ）種
ライマー類はおよそ以下の特異性を持つ： ５′プライマー： プローブ１６３８：ほとんどのユーバクテリア プローブ１６４２：腸内細菌（ｅｎｔｅｒｉｃｓ）及び
その近縁菌 プローブ１６４３：ボレリア（Ｂｏｒｒｅｌｉａ）スピ
ロヘータ ３′プライマー： プローブ１６３７：ほとんどのユーバクテリア プローブ１６３９：腸内細菌（ｅｎｔｅｒｉｃｓ）、デ
イノコツカス（Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）、カンピロバ
クター（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ） プローブ１６４０：ほとんどのユーバクテリア プローブ１６４１：紡錘菌、ある種のバチルス（Ｂａｃ
ｉｌｌｕｓ）種
【００６５】標的バクテリアが既知である試験サンプル
においては、特異的プライマーを使用することができ
る。標的微生物が明確には知られていない（たとえば、
何らかのユーバクテリアである）場合には、上記のプラ
イマー類のすべてをセツトにして使用することができ
る。
においては、特異的プライマーを使用することができ
る。標的微生物が明確には知られていない（たとえば、
何らかのユーバクテリアである）場合には、上記のプラ
イマー類のすべてをセツトにして使用することができ
る。
【００６６】上述のプライマー類は１６Ｓ ｒＲＮＡ配
列のほぼ全体を増幅するように設計されている。本発明
の他のプローブ類及びそれらの誘導体のいずれも１６Ｓ
及び２３Ｓ ｒＲＮＡ類、及び遺伝子類のサブセグメン
トをすぐ上で述べたのと同様の様式で増幅させるのに使
用することができる。
列のほぼ全体を増幅するように設計されている。本発明
の他のプローブ類及びそれらの誘導体のいずれも１６Ｓ
及び２３Ｓ ｒＲＮＡ類、及び遺伝子類のサブセグメン
トをすぐ上で述べたのと同様の様式で増幅させるのに使
用することができる。
【００６７】このようなプライマー類はいずれも、増幅
された転写物中にたとえばＲＮＡポリメラーゼプロモー
ター類、クローニング部位等を組み込むような多数の方
法により修飾することができる。
された転写物中にたとえばＲＮＡポリメラーゼプロモー
ター類、クローニング部位等を組み込むような多数の方
法により修飾することができる。
【００６８】本発明の記述はｒＲＮＡの検出に関してな
されているが、ここに述べたプローブ類及びここに述べ
たものに相補的なプローブ類は該ｒＲＮＡを規定する遺
伝子類（ＤＮＡ）の検出にも有用であろうということ、
及び従つてこのようなプローブ類は記述されているプロ
ーブ類と同等であると考え、本発明の精神及び範囲及び
請求の範囲の中に含まれるべきであるということは容易
に理解されよう。
されているが、ここに述べたプローブ類及びここに述べ
たものに相補的なプローブ類は該ｒＲＮＡを規定する遺
伝子類（ＤＮＡ）の検出にも有用であろうということ、
及び従つてこのようなプローブ類は記述されているプロ
ーブ類と同等であると考え、本発明の精神及び範囲及び
請求の範囲の中に含まれるべきであるということは容易
に理解されよう。
【００６９】
【表１】
【００７０】
【表２】
【００７１】
【表３】
【００７２】
【表４】
【００７３】
【表５】
以下の図中の表記を参照することにより、本発明の本質
及び局面をさらに理解できると思われる：
及び局面をさらに理解できると思われる：
【図１】図１――主な遺伝学上の生命の“王国”の進化
の“樹”（ウオウス，（Ｗｏｅｓｅ，ミクロバイオロジ
カル レビユーズ（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ
Ｒｅｖｉｅｗｓ）、５１巻、第２２１−２７１頁、１９
８７年）を示す。枝分かれのパターンは表示の生物の１
６Ｓ ｒＲＮＡ配列間の変異の間隔を表わしている。こ
のような比較から、ユーバクテリアはアルカエバクテリ
ア及び真核生物から容易に区別される。
の“樹”（ウオウス，（Ｗｏｅｓｅ，ミクロバイオロジ
カル レビユーズ（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ
Ｒｅｖｉｅｗｓ）、５１巻、第２２１−２７１頁、１９
８７年）を示す。枝分かれのパターンは表示の生物の１
６Ｓ ｒＲＮＡ配列間の変異の間隔を表わしている。こ
のような比較から、ユーバクテリアはアルカエバクテリ
ア及び真核生物から容易に区別される。
【図２】図２――ユーバクテリア界のより詳細な進化の
樹を示す（同章）。これまでに約１０の主な分類／門が
１６Ｓ配列の比較に基づいて定義されている。ユーバク
テリア門の中での確実な識別は臨床関係において重要な
ことがあり、本発明のプローブのあるものは１個以上の
ユーバクテリア門に選択的にハイブリダイゼーシヨンす
る。それゆえに、表３、４及び５に掲げた被験生物は、
重要なハイブリダイゼーシヨンパターンが最も容易に認
められるように図２に示された分類に従つてグループ分
けされている。
樹を示す（同章）。これまでに約１０の主な分類／門が
１６Ｓ配列の比較に基づいて定義されている。ユーバク
テリア門の中での確実な識別は臨床関係において重要な
ことがあり、本発明のプローブのあるものは１個以上の
ユーバクテリア門に選択的にハイブリダイゼーシヨンす
る。それゆえに、表３、４及び５に掲げた被験生物は、
重要なハイブリダイゼーシヨンパターンが最も容易に認
められるように図２に示された分類に従つてグループ分
けされている。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(72)発明者 バーリン，アメリア
アメリカ合衆国マサチューセッツ州
01701，フレイミンガム，ポンド・スト
リート ７
(72)発明者 ワイズバーグ，ウィリアムス・ジー
アメリカ合衆国マサチューセッツ州
01757，ミルフォード，ジルソン・サー
クル ３
(56)参考文献 特表 昭64−500001（ＪＰ，Ａ)
欧州特許出願公開250662（ＥＰ，Ａ
１)
(58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名)
C12N 15/00 - 15/90
C12Q 1/68
ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ)
ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／Ｇ
ｅｎｅＳｅｑ
Claims (7)
- 【請求項１】サンプル中の、Acinetobacter calcoaceti
cus, Aeromonas sobria, Alteromonas putrefaciens, C
itrobacter amalonaticus, Citrobacter diversus, Cit
robacter freundii, Edwardsiella tarda, Enterobacte
r agglomerans, Enterobacter cloacae, Enterobacter
sakazakii, Escherichia coli, Haemophilus influenz
a, Haemophilus ducreyi, Hafnia alvei, Morgenella m
organii, Klebsiella pneumoniae, Proteus mirabilis,
Providencia alcalifaciens, Pseudomonas aeruginos
a, Salmonella arizona, Salmonella typhimurium, Ser
ratia marcescens, Shigella flexneri, Vibrio paraha
emolyticus, Xanthomonas maltophilia, Yersinia ente
rocolitica, Alcaligenes faecalis, Branhamella cata
rrhalis, Chromobacterium violaceum, Kingella indol
ogenes, Moraxella osloensis, Moraxella phenylpyruv
ica, Borrelia burgdorferi, Borrelia turicatae, Lep
tospira interrogans-pomona, Leptospira biflexa(Pat
oc-Patoc), Leptospira biflexa(CDC), Spirochaeta au
rantia, Bacteroides fragilis, Bacteroides thetaiot
aomicron, Bacterioides melaninogenicus Flavobacter
ium meningosepticum,Chlamydia psittaci, Chlamydia
trachomatis, Chlorobium limicola, Chloroflexus aur
antiacus, Deinococcus radiodurans, Planctomyces ma
ris, Mycoplasma pneumoniae, Mycoplasma putrefacien
s, Peptostreptococcus productus, Planococcus citre
us, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermi
s, Staphylococcus haemolyticus, Streptococcus agal
actiae, Streptococcus bovis,Streptococcus faecali
s, Streptococcus morbillorum, Streptococcus mutan
s,Streptococcus pneumoniae, Streptococcus salivari
us, Streptococcus sanguis, Bifidobacterium dentiu
m, Corynebacterium genitalium, Corynebacteriumglut
amicum, Corynebacterium pseudodiphtheriticum, Cory
nebacterium pseudotuberculosis, Corynebacterium py
ogenes, Corynebacterium xerosis, Mycobacterium bov
is, Mycobacterium kansasii, Nocardia asteroides, R
hodococcusrhodochorous, Aerococcus viridans, Fusob
acterium necrophorum, Fusobacterium prausnitzii, G
emella haemolysans, Helicobacillus mobilis, Phormi
dium ectocarpi, Plectonema boryanum, Neissria gonor
rhoeae, Neisseria meningitidis, Pseudomonas acidov
orans, Pseudomonas cepacia, Rhodocyclus gelatinos
a, Vitreoscilla stercoraria, Achromobacter xerosi
s, Acidiphilium cryptum, Agrobacterium tumefacien
s, Brucella abortus, Flavobacterium capsulatum, My
coplana bullata, Pseudomonas diminuta, Rhodobacter
sphaeroides, Rhodospirillum rubrum, Thiobacillus
versutus, Desulfovibrio desulfuricans,Cardiobacter
ium hominis, Francisella tularensis, Campylobacter
jejuni,Campylobacter pylori, Campylobacter sputor
um, Bacillus brevis, Bacillussubtilis, Clostridium
clostridioforme, Clostridium sordellii, Clostridi
um sporogenes, Clostridium histolyticum, Clostridi
um perfringens, Clostridium ramosum, Kurthia zopfi
i, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus planta
rum 及び Listeria monocytogenes, からなるグループから選択されるユーバクテリアの少な
くとも４３種の存在 を検出するための方法であって、 ａ）前記サンプルを以下の： プローブ１６５６：５’−ＣＴＡＣＣＴＧＴＧＴＣＧＧＴＴＴＧＣＧＧＴＡＣ ＧＧＧＣ−３’； プローブ１６５７：５’−ＧＧＴＡＴＴＣＴＣＴＡＣＣＴＧＡＣＣＡＣＣＴＧ ＴＧＴＣＧＧＴＴＴＧＧＧＧＴＡＣＧ−３’； プローブ１６５３：５’−ＣＣＴＴＣＴＣＣＣＧＡＡＧＴＴＡＣＧＧＧＧＧＣ ＡＴＴＴＴＧＣＣＴＡＧＴＴＣＣＴＴ−３’； プローブ１６５４：５’−ＣＣＴＴＣＴＣＣＣＧＡＡＧＴＴＡＣＧＧＧＧＴＣ ＡＴＴＴＴＧＣＣＧＡＧＴＴＣＣＴＴ−３’； プローブ１６５５：５’−ＣＣＴＴＣＴＣＣＣＧＡＡＧＴＴＡＣＧＧＣＡＣＣ ＡＴＴＴＴＧＣＣＧＡＧＴＴＣＣＴＴ−３’； プローブ１６５１：５’−ＣＴＣＣＴＣＴＴＡＡＣＣＴＴＣＣＡＧＣＡＣＣＧ ＧＧＣＡＧＧＣ−３’； プローブ１５９５：５’−ＣＧＡＴＡＴＧＡＡＣＴＣＴＴＧＧＧＣＧＧＴＡＴ ＣＡＧＣＣＴＧＴＴＡＴＣＣＣＣＧＧ−３’； プローブ１５９８：５’−ＣＧＴＡＣＣＧＣＴＴＴＡＡＡＴＧＧＣＧＡＡＣＡ ＧＣＣＡＴＡＣＣＣＴＴＧＧＧＡＣＣ−３’；および プローブ１５９９：５’−ＣＧＴＧＣＣＧＣＴＴＴＡＡＴＧＧＧＣＧＡＡＣＡ ＧＣＣＣＡＡＣＣＣＴＴＧＧＧＡＣＣ−３’； から成るプローブのグループから選択される少なくとも
１個の核酸プローブに、前記少なくとも４３種のユーバ
クテリアが当該サンプル中の存在する場合にはそのｒＲ
ＮＡ若しくはｒＤＮＡに当該プローブがハイブリダイズ
してハイブリッド核酸複合体を形成させるが、マウスＬ
細胞、小麦胚芽、ヒト血液、およびカンジダ・アルビカ
ンスのｒＲＮＡおよびｒＤＮＡとは前記プローブがハイ
ブリダイズしない条件下で接触させ；そして ｂ）工程ａ）で形成されたハイブリッド核酸複合体を当
該サンプル中の前記ユーバクテリアの存在の指標として
検出することを含む、前記方法。 - 【請求項２】以下の条件下、 ａ）０．９Ｍ ＮａＣｌ、６０℃でインキュベーション
を行い、次いで； ｂ）０．０３Ｍ ＮａＣｌ、６０℃で洗浄するでハイブ
リダイゼーションを行う、請求項１に記載の方法。 - 【請求項３】以下の条件下： ａ）０．９Ｍ ＮａＣｌ、０．１２Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣ
ｌ、ｐＨ７．８、６ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１Ｍ ＫＰＯ
4、０．１％ ＳＤＳ、０．１％ ピロリン酸、０．０
０２％ フィコール、０．０２％ ＢＳＡ及び０．００
２％ ポリビニルピロリジン中で、１４−１６時間、６
０℃、次いで； ｂ）０．０３Ｍ ＮａＣｌ、０．００４Ｍ Ｔｒｉｓ−
ＨＣｌ、ｐＨ７．８、０．２ｍＭ ＥＤＴＡ及び０．１
％ ＳＤＳの溶液中、６０℃で洗浄するでハイブリダイ
ゼーションを行う、請求項１または２に記載の方法。 - 【請求項４】前記ユーバクテリアがグラム陽性であり、
かつ前記核酸プローブが１５９９および１６５６から成
るプローブのグループから選択される、請求項１ないし
３のいずれか１項に記載の方法。 - 【請求項５】前記ユーバクテリアがグラム陰性であり、
かつ前記核酸プローブが１６５７、１５９８および１５
９５から成るプローブのグループから選択される、請求
項１ないし３のいずれか１項に記載の方法。 - 【請求項６】以下の条件下： ａ）０．９Ｍ ＮａＣｌ、０．１２Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣ
ｌ、ｐＨ７．８、６ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１Ｍ ＫＰＯ
4、０．１％ ＳＤＳ、０．１％ ピロリン酸、０．０
０２％ フィコール、０．０２％ ＢＳＡ及び０．００
２％ ポリビニルピロリジン中で、１４−１６時間、６
０℃、次いで； ｂ）０．０３Ｍ ＮａＣｌ、０．００４Ｍ Ｔｒｉｓ−
ＨＣｌ、ｐＨ７．８、０．２ｍＭ ＥＤＴＡ及び０．１
％ ＳＤＳの溶液中、６０℃で洗浄するにおいて、 Acinetobacter calcoaceticus, Aeromonas sobria, Alt
eromonas putrefaciens,Citrobacter amalonaticus, Ci
trobacter diversus, Citrobacter freundii, Edwardsi
ella tarda, Enterobacter agglomerans, Enterobacter
cloacae, Enterobacter sakazakii, Escherichia col
i, Haemophilus influenza, Haemophilusducreyi, Hafn
ia alvei, Morgenella morganii, Klebsiella pneumoni
ae, Proteus mirabilis, Providencia alcalifaciens,
Pseudomonas aeruginosa, Salmonella arizona, Salmon
ella typhimurium, Serratia marcescens, Shigella fl
exneri, Vibrio parahaemolyticus, Xanthomonas malto
philia, Yersinia enterocolitica, Alcaligenes faeca
lis, Branhamella catarrhalis, Chromobacterium viol
aceum, Kingella indologenes, Moraxella osloensis,
Moraxella phenylpyruvica, Borrelia burgdorferi, Bo
rrelia turicatae, Leptospira interrogans-pomona, L
eptospira biflexa(Patoc-Patoc), Leptospira biflexa
(CDC), Spirochaeta aurantia, Bacteroides fragilis,
Bacteroides thetaiotaomicron, Bacterioides melani
nogenicus Flavobacterium meningosepticum, Chlamydi
a psittaci, Chlamydia trachomatis, Chlorobium limi
cola, Chloroflexus aurantiacus, Deinococcus radiod
urans, Planctomyces maris, Mycoplasma pneumoniae,
Mycoplasma putrefaciens, Peptostreptococcus produc
tus, Planococcus citreus, Staphylococcus aureus, S
taphylococcus epidermis, Staphylococcus haemolytic
us, Streptococcus agalactiae, Streptococcus bovis,
Streptococcus faecalis, Streptococcus morbilloru
m, Streptococcus mutans, Streptococcus pneumoniae,
Streptococcus salivarius, Streptococcus sanguis,
Bifidobacterium dentium, Corynebacterium genitaliu
m, Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium pse
udodiphtheriticum, Corynebacterium pseudotuberculo
sis, Corynebacterium pyogenes, Corynebacterium xer
osis, Mycobacterium bovis, Mycobacterium kansasii,
Nocardia asteroides, Rhodococcus rhodochorous, Ae
rococcus viridans, Fusobacterium necrophorum, Fuso
bacterium prausnitzii,Gemella haemolysans, Helicob
acillus mobilis, Phormidium ectocarpi, Plectonema
boryanum, Neissria gonorrhoeae, Neisseria meningit
idis, Pseudomonas acidovorans, Pseudomonas cepaci
a, Rhodocyclus gelatinosa, Vitreoscilla stercorari
a, Achromobacter xerosis, Acidiphilium cryptum, Ag
robacterium tumefaciens, Brucella abortus, Flavoba
cterium capsulatum, Mycoplana bullata, Pseudomonas
diminuta, Rhodobacter sphaeroides, Rhodospirillum
rubrum, Thiobacillus versutus, Desulfovibrio desu
lfuricans, Cardiobacteriumhominis, Francisella tul
arensis, Campylobacter jejuni, Campylobacter pylor
i, Campylobacter sputorum, Bacillus brevis, Bacill
us subtilis, Clostridium clostridioforme, Clostrid
ium sordellii, Clostridium sporogenes, Clostridium
histolyticum, Clostridium perfringens, Clostridiu
m ramosum, Kurthia zopfii, Lactobacillus acidophil
us, Lactobacillus plantarum and Listeria monocytog
enes, からなるグループから選択されるユーバクテリアの少な
くとも４３種のｒＲＮＡ若しくはｒＤＮＡにハイブリダ
イズするが、マウスＬ細胞、小麦胚芽、ヒト血液、およ
びカンジダ・アルビカンスのｒＲＮＡおよびｒＤＮＡと
は前記条件下でハイブリダイズしない、実質的に精製さ
れた核酸フラグメントであって、 プローブ１６５６：５’−ＣＴＡＣＣＴＧＴＧＴＣＧＧＴＴＴＧＣＧＧＴＡＣ ＧＧＧＣ−３’； プローブ１６５７：５’−ＧＧＴＡＴＴＣＴＣＴＡＣＣＴＧＡＣＣＡＣＣＴＧ ＴＧＴＣＧＧＴＴＴＧＧＧＧＴＡＣＧ−３’； プローブ１６５３：５’−ＣＣＴＴＣＴＣＣＣＧＡＡＧＴＴＡＣＧＧＧＧＧＣ ＡＴＴＴＴＧＣＣＴＡＧＴＴＣＣＴＴ−３’； プローブ１６５４：５’−ＣＣＴＴＣＴＣＣＣＧＡＡＧＴＴＡＣＧＧＧＧＴＣ ＡＴＴＴＴＧＣＣＧＡＧＴＴＣＣＴＴ−３’； プローブ１６５５：５’−ＣＣＴＴＣＴＣＣＣＧＡＡＧＴＴＡＣＧＧＣＡＣＣ ＡＴＴＴＴＧＣＣＧＡＧＴＴＣＣＴＴ−３’； プローブ１６５１：５’−ＣＴＣＣＴＣＴＴＡＡＣＣＴＴＣＣＡＧＣＡＣＣＧ ＧＧＣＡＧＧＣ−３’； プローブ１５９５：５’−ＣＧＡＴＡＴＧＡＡＣＴＣＴＴＧＧＧＣＧＧＴＡＴ ＣＡＧＣＣＴＧＴＴＡＴＣＣＣＣＧＧ−３’； プローブ１５９８：５’−ＣＧＴＡＣＣＧＣＴＴＴＡＡＡＴＧＧＣＧＡＡＣＡ ＧＣＣＡＴＡＣＣＣＴＴＧＧＧＡＣＣ−３’；および プローブ１５９９：５’−ＣＧＴＧＣＣＧＣＴＴＴＡＡＴＧＧＧＣＧＡＡＣＡ ＧＣＣＣＡＡＣＣＣＴＴＧＧＧＡＣＣ−３’； あるいは、これらの相補体、から成るグループから選択
される、前記核酸フラグメント。 - 【請求項７】少なくとも２種類の核酸フラグメントを含
むプローブのセットであって、そのうち少なくとも１種
類の核酸フラグメントが請求項６いずれかの実質的に精
製された核酸フラグメントである、前記プローブセッ
ト。
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