JP2001512665A - 大腸菌種に特異的なオリゴヌクレオチド並びにその種の細菌の検出および視覚化法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、大腸菌ゲノム種（ボイド赤痢菌(S. boydii)血清型１３を除く総ての赤痢菌を含む）／エシェリキア・フェルグソニー(Escherichia fergusonii)のリボゾームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）または相当する遺伝子（ｒＤＮＡ）と特異的にハイブリダイズできるオリゴヌクレオチドに関する。本発明はまた、この種の細菌を検出および表示する方法に関する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 本発明は、サンプルにおける大腸菌ゲノム種に属する細菌の検出および視覚化
のためのオリゴヌクレオチドに関する。さらに詳しくは、本発明は、大腸菌ゲノ
ム種（ボイド赤痢菌血清型１３を除く赤痢菌を含む）／エシェリキア・フェルグ
ソニーのリボゾームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）または相当する遺伝子（ｒＤＮＡ）と特
異的にハイブリダイズできるオリゴヌクレオチドに関する。

【０００２】 本発明はまた、このオリゴヌクレオチドを使用して問題のゲノム種を検出する
方法、ならびに遺伝子増幅手段におけるこのオリゴヌクレオチドの使用に関する
。

【０００３】 本明細書において「大腸菌」とは、株型、大腸菌ＡＴＣＣ１１７７５（＝ＣＩ
Ｐ５８−８）を含むゲノム種（genomic species）を表す。ゲノム種とは、その デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）が、ハイブリダイズしたＤＮＡより５℃低い熱不安
定性を有すると考えられる株型種のＤＮＡと７０％を超える相同性を有する株の
集合である(Grimont, 1988; Wayne et al., 1987)。このような基準に従い、大 腸菌ゲノム種は、通常大腸菌であるとみなされる株の他、従来、赤痢菌属（志賀
赤痢菌(S. dysenteriae)、フレクスナー赤痢菌(S. flexneri)、ボイド赤痢菌(S.
boydii)、ソンネ赤痢菌(S. sonnei)に分類されている株を含む（ただし、ボイ ド赤痢菌血清型１３を除く）(Brenner et al., 1073)。これらの基準を厳密に適
用すると、エシェリキア・フェルグソニーは大腸菌ゲノム種に属することが立証
される(Farmer et al., 1985)。

【０００４】 大腸菌は通常、ヒトおよび温血動物の大腸の共生細菌である。このため、水、
食品の、あるいは環境からのサンプルにおけるその存在は糞便汚染の指標と解釈
される（指標細菌）。従って食品は、所定量の製品中にある一定数を超える生菌
大腸菌（固形培地上でコロニー形成可能）を含んではならない（これらの数は製
品により異なる）。例えば、飲料水は１００ｍｌ中に大腸菌生菌を含んではなら
ない(De Zuane, 1997)。大腸菌の計数は食品の衛生上の品質を評価するのに不可
欠である。

【０００５】 大腸菌ゲノム種株には病原性がある。これらの株の中には、細菌性ヒト赤痢の
病原体である、一般に赤痢菌と呼ばれるものが見られる。一般に大腸菌と呼ばれ
る株は、病原性遺伝子を与えることにより、ヒトまたは動物で種々の感染症を引
き起こし得る（泌尿器感染症、コレラ様または出血性下痢、赤痢症候群、溶血性
および***性症候群、新生児性髄膜炎、種々の化膿性感染症）。 水または食品の糞便汚染を疑うまたは実証するには、大腸菌ゲノム種株の同定
（分類上の同定）が重要である。それはまた、通常無菌またはほとんど無菌の生
物学的媒体（尿、血液、脳脊髄液、組織または身体の閉鎖空間における採取液）
で細菌を単離する際に重要である。身体の開放空間（消化管）または糞便におい
て大腸菌の存在は通常であり、大腸菌の病原性因子の同定は、分類上の同定に主
として重要である。

【０００６】 大腸菌の分類上の同定は通常、固形ゼラチン培地上での細菌の単離および培養
、ならびにいくつかの生化学試験の適用に基づくものである。ゼラチン培地上で
のコロニーの出現には少なくとも１８時間を要する。環境からのサンプルの場合
には、発達すべきコロニーが総て出現するにはしばしば数日を要する。単離コロ
ニーから始まる生化学試験の適用には、さらに１８ないし４８時間が必要である
。例示すれば、水中の大腸菌の計数には、一定容量の水を無菌膜で濾過すること
、半選択培地および／または指標培地上にその膜を置くこと、特徴的（しかし絶
対的に特異的でない）色のコロニーを形成させるインキュベーション（４８時間
）を要し、次いでこれを計数する。各単離コロニーは菌体に由来すると仮定され
るので、容量単位で大腸菌の計数を行うことができる。単離されたコロニーが本
当に大腸菌種に対応するかどうか確認することが賢明であり、これには少なくと
もさらに１８時間を要する。

【０００７】 最近では、大腸菌ゲノム種の特異的なヌクレオチド配列の検出に基づく技術が
記載されている。例えば、β-グルクロニダーゼをコードする遺伝子の遺伝子増 幅（ＰＣＲ型）による検出によってサンプル中の大腸菌の存在を確認することが
可能となる。この方法は特に定性的に用いられ、装置およびいくつかの核酸断片
の実験手段のばらつきによりコンタミネーションの可能性があるので、遺伝子増
幅の解釈は妨げられることがしばしばある。

【０００８】 in situハイブリダイゼーションは、遺伝子増幅の興味深い代替法である。標 識された（一般に蛍光物質による）オリゴヌクレオチドプローブは、この工程を
容易にするために予め処理された菌体に浸透する。リボゾーム核酸がプローブに
相補的な（標的）配列を有するか否かによって、プローブがその標的に固定され
、洗浄によって除去されない。このようにしてプローブを保持させた細菌は標識
され（例えば、蛍光）、顕微鏡観察により視認できる。

【０００９】 リボゾームリボ核酸（ｒＲＮＡ）は、細胞当たりのコピー数（１０，０００〜
３０，０００）が誘導後（１００〜２００）の、または与えられた遺伝子（１〜
数個）のメッセンジャーＲＮＡのコピー数より多いので、in situハイブリダイ ゼーションにおいて好ましい標的となる。リボゾームの小サブユニット（１６Ｓ
ｒＲＮＡ）または大サブユニット（２３Ｓおよび５Ｓ ＲＮＡ）に存在するこ
れらのリボゾームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）は、それらの沈降定数（細菌については５
Ｓ、１６Ｓおよび２３Ｓ）によって同定される。

【００１０】 最大のｒＲＮＡは１６Ｓ（およそ１５００のヌクレオチド）と２３Ｓ（およそ
３０００のヌクレオチド）である。ｒＲＮＡの一部の相補的核酸プローブはこの
ｒＲＮＡとハイブリダイズすることができるだけでなく、このｒＲＮＡをコード
した遺伝子の相補鎖（ｒＤＮＡ）ともハイブリダイズできる。この方法論の様々
な応用が公開されている(Amann et al., 1990; DeLong et al., 1989; Giovanno
ni et al., 1988; Trebesius et al., 1994)。

【００１１】 これらのｒＲＮＡは実際、細菌の進化の分子クロノメーターとして働く最も適
当な分子であることが明らかにされている(Branner et al., 1969; Doi & Iraga
shi, 1965; Moore and McCarthy, 1967; Pace & Campbell, 1971; Takahashi et
al., 1967)。ｒＲＮＡの一次構造（配列）は高度に保存された領域と超可変部 であるその他の部分を含む(Sogin et al., 1972; Woese et al., 1975)。ＤＮＡ
−ｒＲＮＡハイブリダイゼーション法の完成(Gillespie & Spiegelman, 1965)の
後、細菌の分類学および系統学に、また誤って分類された細菌の同定にこのアプ
ローチを応用する非常に多くの刊行物が出されている(Johnson et al., 1970; P
alleroni et al., 1973; De Smebt & De Ley, 1977)。

【００１２】 概して、所定の配列を働かせるハイブリダイゼーション実験のおいてその結果
は温度および反応液のナトリウムイオンのモル濃度に大きく依存する。所定の組
成の反応液ついて、最適なハイブリダイゼーション温度が決められる。温度を上
昇させれば、再結合した鎖は分離によって完成される。この分離に必要な温度は
、完全（見かけ上完全）にハイブリダイズする配列部分の長さおよびそのヌクレ
オチド組成に依存する。最長配列のハイブリダイゼーションを可能にするだけの
温度は（最適、に対し）制限温度と呼ばれる。ハイブリダイゼーション中の誤対
合はハイブリダイズした分子の安定性を低下させる。

【００１３】 従って、in situハイブリダイゼーションの特異性は、ｒＲＮＡに存在する相 補配列を認識し、ハイブリダイズすることができるプローブの質に依存すると考
えられる。

【００１４】 Kohne et al. (1968)は、ｒＲＮＡと反応するプローブを作製する方法を記載 しているが、これにはいかにして大腸菌を特異的に検出するかは示されていない
。

【００１５】 Gobel and Stanbridge (1984)は、組織培養を汚染するマイコプラズマを検出 するためにクローン化ｒＤＮＡ遺伝子を使用する。

【００１６】 Gaipin et al. (1981)は、マウスにおけるマイクプラズマ・プルモニス(Mycop lasma pulmonis)感染を検出するために、ｒＲＮＡをコードする遺伝子のハイブ リダイゼーションを使用した。

【００１７】 米国特許第４，８５１，３３０号には、ｒＲＮＡと反応するプローブとして使
用できる核酸断片を得る戦略が記載されている。

【００１８】 ＷＯ−Ａ−８４／０２７２１には、ｒＲＮＡとハイブリダイズするプローブを
使用することによって、ヒトまたは動物の身体に感染する微生物を検出する方法
が記載されている。それにはいかにして大腸菌を検出または同定するかは示され
ていない。

【００１９】 Berent et al. (1985)は、クローン化したプローブに関してオリゴヌクレオチ
ドプローブにおける関心を示している。

【００２０】 仏国特許第２ ５９６ ７７４号では、細菌ｒＲＮＡの相補的オリゴヌクレオ
チドのプローブとしての使用が提案され、２種の万能オリゴヌクレオチドプロー
ブが記載されている。

【００２１】 Gobel et al. (1987)は、マイコプラズマを同定する目的で、ｒＲＮＡまたは その遺伝子と反応する合成オリゴヌクレオチドを使用している。

【００２２】 米国特許第５，０８４，５６５号では、大腸菌のいわゆる特異的オリゴヌクレ
オチドプローブが記載されている。標的としてこれらのプローブは、ヌクレオチ
ド領域４６５〜４７７（Brosius et al. [1978]によるヌクレオチド番号）を有 している。このプローブはエシェリキア・フェルグソニーおよびボイド赤痢菌血
清型１３（大腸菌および赤痢菌属に加えて）とは反応するが、シトロバクター・
コセリ(Citrobacter koseri)とは反応しないと考えられる。系統発生的に大腸菌
と近いセデセア(Cedecea)属の種とこのプローブとの反応については述べられて いない。

【００２３】 米国特許第５，５９３，８４１号では、大腸菌の１６Ｓ ｒＲＮＡの９９５〜
１０３０領域と反応するプローブが記載されている。このプローブはＥ．フェル
グソニーと反応するが、試験されたいずれの大腸菌株とも反応せず、赤痢菌とも
反応しない。系統発生的に大腸菌と近いシトロバクター・コセリ(=C. diversus)
およびセデセア属の種とこのプローブとの反応については述べられていない。

【００２４】 Kwok et al. (1990)は、遺伝子増幅（ＰＣＲ）で使用されるプライマーの３’
末端のレベルでの誤対合が増幅効率に影響を及ぼすことが示している。

【００２５】 Cha et al. (1992)は、「誤対合増幅突然変異アッセイ」と呼ばれる試験を記 載しており、そこではプライマーは、検出される標的突然変異配列と１つの誤対
合、およびそれに対応する野生型対立遺伝子配列と２つの誤対合を示す。これら
の誤対合はプライマーの３’末端部分に関与している。これらの条件の下、彼ら
のＰＣＲ系は変異型対立遺伝子だけを検出する。この方法は、プライマーの３’
末端の次の位置に誤対合を作出することにより、サルモネラ・エンテリカ(Salmo nella enterica)血清型エンテリティディス(Enteritidis)の特異的検出に応用さ
れている(Lampel et al., 1996)。

【００２６】 本発明は、サンプルにおける大腸菌ゲノム種に属する細菌の検出、および特異
的かつ迅速な視覚化オリゴヌクレオチドを提案する。従ってそれは、大腸菌（す
なわち、大腸菌のあらゆる株に特異的）の、赤痢菌（ボイド赤痢菌血清型１３）
の、またエシェリキア・フェルグソニーのゲノム種との特異的ハイブリダイゼー
ションを行えるオリゴヌクレオチドに関する。

【００２７】 さらに詳しくは、このオリゴヌクレオチドは大腸菌の１６Ｓ ＲＮＡの６３７
〜６６０領域（Brosius et al., 1978の番号体系）とハイブリダイズできる。結
果において、この１６Ｓ ＲＮＡ部分はエンテロバクターではかなりよく保存さ
れているが、これらに必ずしも十分特異的でない。しかしながら驚くべきことに
、このことは、他種と交叉反応することなく、前記で定義されたゲノム種の検出
が可能となるという点で非常に興味深いものであることがわかった。本発明のオ
リゴヌクレオチドはまた、大腸菌の１６Ｓ ＲＮＡの６３７〜６６０領域の少な
くとも１０個の連続したヌクレオチドとしか特異的にハイブリダイズできない。
結果において、隣接領域認識し、次いでリガーゼによって連結される２つのオリ
ゴヌクレオチドとともに、より長いオリゴヌクレオチドであって、ゆえによりス
トリンジェントなハイブリダイゼーション条件により制限されるものが得られる
。

【００２８】 従って、本発明のオリゴヌクレオチドの１つの左半分と右半分を示す２つのオ
リゴヌクレオチドを利用して、それらを標的とハイブリダイズさせ、リガーゼの
働きによってそれらを連結し、さらに洗浄温度を引き上げて連結していない小さ
なオリゴヌクレオチドのいずれもが除かれるようにすることができる。バックグ
ラウンドノイズを低くするこの方法が、Alves and Carr (1988)によって提案さ れている。

【００２９】 有利には、本発明のオリゴヌクレオチドは配列番号１に相当する。 結果において、大腸菌の１６Ｓ ＲＮＡの前記６３７〜６６０領域に相補的な
２４のヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドが合成された。これはＥｃ６３
７と呼ばれ、配列番号１と同定されている。

【００３０】 標識は、このオリゴヌクレオチドの各末端に２つの発色基（フルオレセインま
たはテキサスレッド）を接ぎ足すことによって得られる。２２％のホルムアミド
の存在下で４２℃にてのin situハイブリダイゼーション、その後の６０℃での 洗浄において使用されるオリゴヌクレオチドプローブは大腸菌、赤痢菌、フレク
スナー赤痢菌、ボイド赤痢菌（血清型１３を除く）、ソンネ赤痢菌およびエシェ
リキア・フェルグソニー（大腸菌ゲノム群）の菌体に蛍光を与える。それは試験
された他の種および属の大部分とは反応しない。しかしながら、シトロバクター
・コセリおよびセデセア種は６０℃での洗浄後も蛍光を留めていたことが観察さ
れている。

【００３１】 実際に、これらの種がもはや反応しなくなるには、６１℃のオーダーの温度が
達成されねばならない。しかしながら、６１℃では大腸菌群は非常に弱い蛍光し
か示さない。

【００３２】 従って本発明はまた、特異性の点でいっそう良好な結果が得られるオリゴヌク
レオチドに関する。

【００３３】 結果において、Ｅｃ６３７オリゴヌクレオチドは、任意の誤対合を作り出すた
めに、対応する１６Ｓ ｒＲＮＡ配列の保存された（不変の）位置にあるヌクレ
オチドのレベルで改変された。この誤対合はオリゴヌクレオチドの中央部で起こ
された。得られた配列はＣｏｌｉｎｓｉｔｕと呼ばれ、配列番号２として同定さ
れた。中央の誤対合の導入は、得られるハイブリッドを弱くすることを目的とす
るものである。配列が大腸菌の６３７〜６６０のヌクレオチド配列だけで異なる
ならば、これは選択された実験条件の下でハイブリダイズしないＣｏｌｉｎｓｉ
ｔｕプローブとの２カ所の誤対合を引き起こす。このプローブは大腸菌ゲノム種
に関して反応性を残し、他の総ての種および属に関して不活性となる。この特性
は５１℃〜５９℃に拡大される広い洗浄温度範囲に維持される。

【００３４】 Ｃｏｌｉｎｓｉｔｕプローブはin situハイブリダイゼーションで使用しても よいが、また、フィルター上のハイブリダイゼーション、液相ハイブリダイゼー
ション、リバースハイブリダイゼーション、または遺伝子増幅系にける特異的プ
ライマーとして使用してもよい。

【００３５】 本発明はまた、以下に記載されるオリゴヌクレオチドの相補的オリゴヌクレオ
チドに関する。

【００３６】 その他のタイプのプローブ標識（放射性、化学または酵素標識）はin situハ イブリダイゼーションに使用できる。

【００３７】 さらに詳しくは、本発明のオリゴヌクレオチドはそれらの３’もしくは５’、
または３’および５’末端で標識され得る。 菌体の顕微鏡観察またはフローサイトメトリーによる検出を伴うin situハイ ブリダイゼーションで適用されるこのプローブの利点は、臨床学的サンプルおよ
び獣医学的サンプル（特に、尿）、水およびその他の飲料水、食品、環境などの
種々のサンプルにおいて大腸菌ゲノム種の菌体を検出、同定および計数すること
ができることである。

【００３８】 本発明はまた、サンプルにおける大腸菌ゲノム種（ボイド赤痢菌血清型１３を
除く赤痢菌属の総てを含む）／エシェリキア・ヘルマニーの細菌の検出および視
覚化のための方法であって、そのゲノム種の細菌のリボゾームＲＮＡと、本発明
のオリゴヌクレオチド、さらに詳しくは配列番号１および配列番号２から選択さ
れるオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーション工程を含んでなる方法に関
する。

【００３９】 さらに詳しくは、問題のハイブリダイゼーションはin situハイブリダイゼー ション、フィルター上ハイブリダイゼーション、液層ハイブリダイゼーションま
たはリバースハイブリダイゼーションであり得る。

【００４０】 本発明の目的のリバースハイブリダイゼーションとは、注目されるオリゴヌク
レオチドプローブが支持体に固定化され、検出される核酸および／または検出さ
れる核酸を含有する生物が液中に存在するハイブリダイゼーション反応を意味す
るものと理解される。

【００４１】 本発明のリバースハイブリダイゼーション反応を行う特定の方法によれば、オ
リゴヌクレオチドプローブはオリゴヌクレオチドのマトリックスバンクを含んで
なる検出装置内で使用できる。かかるマトリックスバンクの作製の例は、支持体
へ固定化したオリゴヌクレオチドプローブマトリックスからなってよく、所定の
長さの各プローブの配列は、前記プローブに関して１以上の塩基のギャップを伴
って存在し、従ってマトリックスの並びの各プローブは、検出される標的ＤＮＡ
またはＲＮＡの異なる配列に相補的であり、さらに、既知配列の各プローブは、
支持体上の所定の位置に固定化されている。検出される標的配列は放射性標識す
ることもできし、または非放射性標識することもできる。標識された標的配列が
マトリックスディバイスのと接触して置かれると、これは相補配列のプローブと
ハイブリッドを形成する。ヌクレアーゼで処理した後に洗浄することにより、完
全には相補的でない標的ハイブリッドプローブ配列を除去することができる。

【００４２】 マトリックスの所定の位置にあるプローブの配列が正確にわかっているため、
次ぎに標的ＤＮＡまたはＲＮＡ配列のヌクレオチド配列を推定することができ、
結果として大腸菌のリボゾームＤＮＡに位置している可能性のある突然変異、さ
らに詳しくは大腸菌の１６Ｓ ｒＲＮＡをコードするＤＮＡの６３７〜６６０領
域に影響を及ぼす突然変異を推定することができる。

【００４３】 標識された標的配列の使用に変わるものとしては、支持体が、例えばハイブリ
ッドが形成されたマトリックスの位置で電子供与体として働くことができる材料
からなる、またはそのような材料を含んでなる場合に、マトリックス支持体のプ
ローブ上での標的配列のハイブリダイゼーションの「バイオエレクトロニクス的
」検出が可能となる支持体の使用がある。かかる電子供与体材料としては、例え
ば金がある。次いで標的ＤＮＡまたはＲＮＡのヌクレオチド配列の検出は、エレ
クトロニクスディバイスによって決定される。

【００４４】 前記で定義されたようなバイオセンサーの作成例は、欧州特許出願ＥＰ−０
７２１ ０１６号(Affymax Technologies N.V.)、あるいは米国特許第５，２０ ２，２３１号(Crkvenjakov and Drmanac)に記載されている。

【００４５】 本発明はまた、ＰＣＲのような遺伝子増幅法を実施するためのプライマーとし
ての、配列番号１もしくは配列番号２に相当するか、または１つのヌクレオチド
で配列番号１とは異なるオリゴヌクレオチド、あるいは相補的オリゴヌクレオチ
ドの使用に関する。

【００４６】 本発明のオリゴヌクレオチドはまた、ハイブリダイゼーション阻害法にも使用
できる。結果において、大腸菌の１６Ｓ ＲＮＡの６３７〜６６０領域と同一ま
たは相同なオリゴヌクレオチドを支持体（フィルター、カップまたはマイクロチ
ップ）へ固定化することが意図でき、本発明のこの領域に相補的なオリゴヌクレ
オチドをいずれかの方式で標識することができる。競合するＤＮＡまたはＲＮＡ
の不在下では、この２種のオリゴヌクレオチドは完全に再結合するはずである。
この系に、一方または他方のヌクレオチドと再結合することができる核酸（例え
ば、本発明が目的とする種の１つに属する核酸）またはその双方（２本の分離鎖
の場合）を導入すると、遊離状態の、標識された、本発明に従うオリゴヌクレオ
チドの支持体への固定化が阻害される。

【００４７】 本発明はまた、使用されるオリゴヌクレオチドプローブの特異性を最適にする
ことができるハイブリダイゼーションによって微生物の検出および視覚化する方
法に関する。結果において、オリゴヌクレオチドは特異的であればあるほど、一
方でその標的配列との、また他方でその他の配列とのハイブリダイゼーション能
力においてそれが持つ正味の違いが増す。実験的ハイブリダイゼーション条件の
下、この違いが検出しやすければしやすいほど、前記のオリゴヌクレオチドと、
それとハイブリダイゼーションが可能な配列との間にある配列の違い（または誤
対合）が増す。結果として、一般に検出しようとする配列のレベルで高度に保存
されているヌクレオチドのレベルで、ハイブリダイゼーションに使用されるオリ
ゴヌクレオチドを改変することにより、これらの誤対合の数を人為的に増やすこ
とが有利となる。

【００４８】 結果として、本発明は、微生物の標的配列に相補的なオリゴヌクレオチド（た
だし、そのオリゴヌクレオチドの中央部に位置するヌクレオチドは除く）を利用
するハイブリダイゼーションによって、微生物（または微生物群）の検出および
視覚化する方法に関する。問題のヌクレオチドは、その微生物の標的配列の不変
部位に、好ましくは中央部に位置する。

【００４９】 例えば、２０塩基対の長さを有する相補的オリゴヌクレオチドについては、非
相補的ヌクレオチドは、そのＮ末端から始まるオリゴヌクレオチドの番号に従い
７〜１３番目を含む間に位置し、好ましくは問題のヌクレオチドは１０番目に位
置する。

【００５０】 従って本発明は、大腸菌ゲノム種（ボイド赤痢菌血清型１３を除く総ての赤痢
菌を含む）／エシェリキア・フェルグソニーの細菌に適用される、前記のような
検出および視覚化のための方法に関する。

【００５１】 このように本発明において、前記方法にに使用される相補的オリゴヌクレオチ
ドは、本発明に従い、ただ１つのオリゴヌクレオチドが配列番号１とは異なり、
好ましくは配列番号２に相当するオリゴヌクレオチドである。

【００５２】 本発明の可能性ある応用のうち、以下にさらに詳しく説明する： 定型的でない大腸菌株がその種に確かに属するかどうかを確認する調査。Ｒｅ
ｆｅｒｅｎｃｅ Ｃｅｎｔｅｒは定型的でない可能性のある大腸菌の株を受け取 ることがしばしばある。それらは臭気またはガスの産生に関する陰性反応、ｏ−
ニトロフェノール−β−ガラクトピラノシドの加水分解、β−グルクロニダーゼ
の加水分解といったその種で通常でない生化学的反応、通常でない発酵反応を示
したり、通常の培地で極めて低い増殖を示したりする。Ｃｏｌｉｎｓｉｔｕプロ
ーブは、これらの株が大腸菌ゲノム種Ｅ．フェルグソニーに属するかどうか確認
することを可能にする。プローブとの反応が陽性であれば、アドニトールの発酵
、およびセロビオースの発酵により、Ｅ．フェルグソニーが容易に識別される。

【００５３】 患者または感染動物の尿における大腸菌の検出、同定および計数。泌尿器感染
症の大部分は大腸菌によるものであり、泌尿器におけるコロニー形成または感染
は、１ｍｌ当たり１０００または１０，０００を超える菌の存在によって特徴づ
けられ、適当な尿希釈物のＣｏｌｉｎｓｉｔｕとのin situハイブリダイゼーシ ョンは、確認またそのために計数される大腸菌が２〜３時間尿中で存在できるも
のでなければならない。

【００５４】 水および食品中の大腸菌の検出および計数。大腸菌は水および食品の糞便汚染
の主要な生物学的指標である。既知かつ十分量の水を濾過し、そうして得られた
フィルター上でin situハイブリダイゼーションを行えば十分である。マイクロ メーターおよび網線によって、顕微鏡で観察された表面に対する濾過容量がわか
り、水中の大腸菌の菌体数が定量できる。濾過できない食品で、２５ｇ当たり１
個の大腸菌しか含んではいけない食品の場合、増殖は２５ｇの食品から始めなけ
ればならず、次ぎに培地上で行われるin situハイブリダイゼーションが大腸菌 が存在するかどうかの指標となる。

【００５５】 本発明は前記の説明に限定されるものではなく、そのあらゆる変形を包含する
。下記実施例は単に例示として記載されるものであるが、これにより本発明はよ
りよく理解できる。

【００５６】

【実施例】使用した細菌株 合計で２０８菌株を使用してプローブの特異性を評価した。 菌株の純血種性はＢｉｏｔｙｐｅ−１００ギャラリー(BioMerieux, La Balme-
les-Grottes, France)に対してそれらを再同定することにより確かめた。製造業
者の使用説明書に従ってギャラリーを接種した。認識プログラム(Taxolab Insti
tut Pasteur, Paris)およびＭａｃｉｎｔｏｓｈ Ｐｏｗｅｒｂｏｏｋ５３００ｃ
ｅコンピューター(Apple Computers)を用いて自動同定を実施した。

【００５７】実施例１: in situハイブリダイゼーション 試験の過程において、１６Ｓ ｒＲＮＡの４６５〜４８７領域を認識するＥｃ
４６５と呼ばれる２３個のヌクレオチドの配列、５’−ＧＧＴ ＡＡＣ ＧＴＣ
ＡＡＴ ＧＡＧ ＣＡＡ ＡＧＧ ＴＡ−３’も合成した。配列番号３に相当
する、このＥｃ４６５配列を対照の目的で用いた。

【００５８】 公開された方法（Trebesius et al., 1994)にいくつかの改良を加えた。６０ ０ｎｍで０．０１０の吸光度が得られるよう培養物を滅菌蒸留水で希釈し、１０
０μｌを０．２２μｍのＰＣフィルター(Millipore, St Quentin-en-Yvelines,
France)で濾過した。パラホルムアルデヒドの３％水溶液を用いて固定を行った 。ハイブリダイゼーション混合物中のホルムアミドは容量の２２％に相当した。
プローブを２５ｐｍｏｌの濃度で加えた。ハイブリダイゼーションは４２℃で２
時間行った。洗浄（特異性を決定する工程：Ｃｏｌｉｎｓｉｔｕについては５１
℃で２０分、Ｅｃ６３７については６０℃、Ｅｃ４６５については４８℃）後、
フィルターをスライドグラス上に置き、５μｌのＶｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ(Vecto
r Laboratories, Burlingame, CA)で覆い、カバーグラスで覆った。 スライドグラス上に乗せたフィルターをＷＩＢＡ（フルオレセイン用）または
ＮＧフィルター（テキサスレッド用）およびＤＥＩ−４７０カラーカメラ(Optro
nics)を装備したオリンパスＢＸ６０顕微鏡を用いてエピフルオレッセンスによ って試験した。

【００５９】 表は蛍光プローブであるＣｏｌｉｎｓｉｔｕ、Ｅｃ６３７およびＥｃ４６５を
用いたin situハイブリダイゼーションによって得られた結果を示す。試験した 大腸菌、赤痢菌（ボイド赤痢菌血清型１３を除く）およびエシェリキア・フェル
グソニーの菌株は総てＣｏｌｉｎｓｉｔｕプローブを用いるハイブリダイゼーシ
ョン反応によって蛍光を示す。他のゲノム種は反応しない。プローブがＥｃ６３
７である場合には、シトロバクター・コセリおよびセデセア属の種との反応が得
られる。

【００６０】 対照として使用したＥｃ４６５プローブは大腸菌およびブチアウキセラ(Butti
auxella)の菌株と弱く反応したが、実験はそれ以上続行しなかった。

【００６１】 in situハイブリダイゼーションの結果、すなわち蛍光を示す菌体もまた、顕 微鏡よりもむしろフローサイトメトリーによって視覚化できる。

【００６２】

【表１】 符号の説明 ＋： 菌体の強い蛍光 ＋ｆ： 弱い蛍光 −： 蛍光なし （無）： 実験せず

【００６３】実施例２：遺伝子増幅 Ｃｏｌｉｎｓｉｔｕオリゴヌクレオチド（非標識）および下記のヌクレオチド
（１６Ｓ ｒＲＮＡの８〜３２保存領域に対して相補的）：５’−ＡＴＴ ＴＧ
Ａ ＡＧＡ ＧＴＴ ＴＧＡ ＴＣＡ ＴＧＧ ＣＴＣ ＡＧ−３’（配列番号
４）を大腸菌の１６Ｓ ｒＲＮＡをコードする遺伝子の特異的増幅のためのプラ
イマーとして使用した。増幅キット「ＧｅｎｅＡｍｐ（登録商標）ＤＮＡ増幅試
薬キット」(Perkin Elmer Cetus, Norwalk, CT)をＤＮＡポリメラーゼ「Ａｍｐ ｌｉＴａｑ（登録商標）」および「ＤＮＡサーマルサイクラー４８０」サーモサ
イクラー(Perkin Elmer Cetus)とともに製造業者の使用説明書に従って使用した
。反応容量は１０μｌの緩衝液、２．５ユニットのＡｍｐｌｉＴａｑ、２００μ
Ｍの各ヌクレオチドｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ、１００ｐｍｏｌ
の各プライマーおよび３０〜５０ｎｇの総ＤＮＡを含んでなる１００μｌとした
。増幅条件は下記の通り：９４℃で３分間の初期変性、変性については９４℃で
６０秒の２５サイクル、再結合については６５．５℃で６０秒、伸長については
７２℃で１２０秒。増幅産物は、１．３％アガロース(Appligene, Illkirch, Fr
ance)での電気泳動に付した。増幅断片の予想されるサイズは約６００塩基対で あった。この系の使用はこの断片を大腸菌−赤痢菌−Ｅ．フェルグソニーのゲノ
ム種に対して特異的に増幅させるのに効果的である。

【００６４】実施例３：フィルター上ハイブリダイゼーション ニトロセルロース、ナイロンまたはセルロースフィルター上ハイブリダイゼー
ションは単一のプローブを多数（約１００）のＤＮＡのサンプルに対して適用す
ることを可能にする実用的な方法である。ハイブリダイゼーションはコロニー上
で行える。この場合には、炭酸ナトリウム（細菌を溶解し、ＲＮＡを破壊し、次
いでＤＮＡを変性させる）を含浸させた膜をコロニーに接触させ、次いで標識さ
れたプローブの存在下、好適な緩衝液中に置く。十分な曝露時間（数時間）の後
、膜を洗浄し、オーブン中で乾燥し（ＤＮＡを不可逆的に固定するため）、次い
で標識を視覚化する。本方法ではプレート上にコロニーを有する必要があるが、
何千もの中から反応する１個のコロニーを選択することが可能となる。かかるプ
ロトコールにより、コロニーについてのものと同様の方法で９６サンプルを、処
理した膜で濾過することが可能となる。

【００６５】実施例４：液相ハイブリダイゼーション サンプルを処理して細菌を溶解させ、次いでＤＮＡを抽出する場合には、これ
を変性させ、放射活性プローブ（例えば１２５Ｉ）とハイブリダイズさせること
ができる。ハイドロキシアパタイト上でのクロマトグラフィーによるハイブリダ
イズしていないプローブに結合した放射活性の分離後、ハイブリダイズしたＤＮ
Ａと結合した放射活性を計測することができる（γ測定）。

【００６６】実施例５：リバースハイブリダイゼーション オリゴヌクレオチドプローブは支持体（フィルター、マイクロプレート、マイ
クロチップ）上に固定できる。また、いくつかのプローブは単一の支持体上で利
用できる。標的遺伝子を増幅し、次いで標識し、さらに単位複製配列をプローブ
のサンプル群とともにハイブリダイゼーション条件下に置く。洗浄および標識の
視覚化後、プローブの１つへの標識の固定により同定が可能となる。増幅を多細
菌サンプル(Rijpens et al., 1995)から抽出したＤＮＡに対して行う場合には、
本研究方法によって数種の生物の同時検出も可能となる。公開された研究では標
的として１６および２３Ｓ ｒＲＮＡをコードする遺伝子の間の遺伝子間区域を
使用するが、本研究方法は１６Ｓ ｒＲＮＡをコードする遺伝子を適用できる。

【００６７】実施例６：Ｃｏｌｉｎｓｉｔｕプローブの特異性 現在では、赤痢菌属の種（ボイド菌血清型１３を除く）が大腸菌ゲノム種に属
する（Brenner et al., 1973)ということは十分に確証されている。それゆえ、 Ｃｏｌｉｎｓｉｔｕプローブが赤痢菌と反応するということは驚くべきことでは
ない。エシェリキア属では、Ｅ．フェルグソニーが、ハイブリダイズした分子の
熱不安定性が４．５℃である大腸菌との５９〜６３％の相同性（ＤＮＡのハイブ
リダイゼーションによる）を有する(Farmer et al., 1985)。従って、Ｅ．フェ ルグソニーの菌株はそれらを大腸菌ゲノム種に含める基準をある程度満たしてい
る。これらの基準は、ハイブリダイズした分子の熱不安定性が５℃以下またはこ
れと同等でのって、７０％以上またはこれと同等の相同性である(Wayne et al.,
1987)ということが想起される。これらの基準は柔軟に解釈されなければならな
い(Wayne et al., 1987)。従って、Ｅ．フェルグソニーをこのゲノム種に入れる
とすれば、Ｃｏｌｉｎｓｉｔｕプローブは大腸菌ゲノム種に対して厳密に特異的
である。

【００６８】 検討された、または検討されるであろうＣｏｌｉｎｓｉｔｕプローブの特異性
の他のプローブのそれとの比較は、例として示された下記の参照菌株により明確
になろう。

【００６９】記載された条件下でＣｏｌｉｎｓｉｔｕによって視覚化できる菌株： 大腸菌 ＣＩＰ ５４．８（＝ＡＴＣＣ １１７７５） 赤痢菌血清型 １ ＮＣＤＣ １００７〜７１ フレクスナー赤痢菌血清型 １ａ ＣＩＰ ５４〜５８ ボイド赤痢菌血清型 １５ ＮＣＤＣ ９６５〜５８ ソンネ赤痢菌 ＣＩＰ ５２〜５５ エシェリキア・フェルグソニー ＣＩＰ １０３３５７（＝ＡＴＣＣ ３５４６
９）

【００７０】記載された条件下でＣｏｌｉｎｓｉｔｕによって視覚化できない菌株： ボイド赤痢菌血清型 １３ ＣＤＣ １６１０〜５５ エシェリキア・ブルネリス ＣＤＣ ８７５〜７２（＝ＡＴＣＣ ３３８２１） エシェリキア・ヘルマニー ＣＤＣ ９８０〜７２（＝ＡＴＣＣ ３３６５０） シトロバクター・コセリ（＝Ｃ．ディバーサス） ＣＤＣ ３６１３〜６３（＝
ＡＴＣＣ ２７１５６） シトロバクター・ブラスキー ８０〜５８（＝ＡＴＣＣ ５１１１３） セデセア・ダビセ ＣＩＰ ８０．３４（＝ＡＴＣＣ ３３４３１） セデセア・ラパゲイ ＣＩＰ ８０．３５（＝ＡＴＣＣ ３３４３２） セデセア・ネテリ ＣＩＰ １０３２４１（＝ＡＴＣＣ ３３８５５） クレブシエラ・ニューモニエ亜種ニューモニエＫ２ オベサムバクテリウム・プロテウス ＣＩＰ １０４８６２ サルモネラ・エンテリカ血清型チフィムリウム（＝ネズミチフス菌ＬＴ２（＝Ｃ
ＩＰ ６０．６２、ＡＴＣＣ ４３９７１）

【００７１】 参考文献

【表２】

【配列表】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ， ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，Ｄ Ｋ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ， ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，Ｌ Ｖ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ， ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，Ｕ Ｓ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (71)出願人 28， ｒｕｅ ｄｕ Ｄｏｃｔｅｕｒ Ｒ ｏｕｘ／75724 ＰＡＲＩＳ ＣＥＤＥＸ 15／ＦＲＡＮＣＥ (72)発明者 モニク、コラン フランス国バニュ、アブニュ、ド、スタラ ングラ、９ Ｆターム(参考） 4B024 AA05 AA13 CA01 CA09 CA12 CA20 DA06 HA08 HA11 HA12 HA14 4B063 QA01 QQ06 QQ16 QQ18 QQ42 QQ54 QR31 QR55 QR56 QR62 QR66 QR82 QS02 QS25 QS34 QX02

Claims (16)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 大腸菌ゲノム種（ボイド赤痢菌(S. boydii)血清型１３を除く総ての赤痢菌を 含む）／エシェリキア・フェルグソニー(Escherichia fergusonii)のリボゾーム
   ＲＮＡ（ｒＲＮＡ）または相当する遺伝子（ｒＤＮＡ）と特異的にハイブリダイ
   ズできるオリゴヌクレオチド。
2. 【請求項２】 大腸菌の１６Ｓ ｒＲＮＡの６３７〜６６０領域と特異的にハイブリダイズで
   きる、請求項１記載のオリゴヌクレオチド。
3. 【請求項３】 大腸菌の１６Ｓ ｒＲＮＡの６３７〜６６０領域の少なくとも１０個のヌクレ
   オチドと特異的にハイブリダイズできる、請求項２記載のオリゴヌクレオチド。
4. 【請求項４】 配列番号１に相当する、請求項１〜３のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオ
   チド。
5. 【請求項５】 配列番号１のヌクレオチドとは異なる、請求項１〜３のいずれか１項に記載の
   オリゴヌクレオチド。
6. 【請求項６】 配列番号２に相当する、請求項３記載のオリゴヌクレオチド。
7. 【請求項７】 請求項１〜６のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチドの相補的オリゴヌク
   レオチド。
8. 【請求項８】 ３’もしくは５’末端または３’および５’末端が標識されている、請求項１
   〜７のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド。
9. 【請求項９】 サンプル中の大腸菌ゲノム種（ボイド赤痢菌血清型１３を除く総ての赤痢菌を
   含む）／エシェリキア・フェルグソニーの細菌を検出および視覚化する方法であ
   って、請求項１〜８のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチドを有するゲノム
   種の細菌のリボゾームＲＮＡのハイブリダイゼーション工程を含んでなる方法。
10. 【請求項１０】 オリゴヌクレオチドが配列番号１および配列番号２から選択される、請求項９
    記載の方法。
11. 【請求項１１】 ハイブリダイゼーションがin situハイブリダイゼーション、フィルター上ハ イブリダイゼーション、液相ハイブリダイゼーション、またはリバースハイブリ
    ダイゼーションである、請求項９および１０のいずれか１項に記載の方法。
12. 【請求項１２】 遺伝子増幅法を行うためのプライマーとしての、請求項４〜７のいずれか１項
    に記載のオリゴヌクレオチドの使用。
13. 【請求項１３】 ハイブリダイゼーションによって微生物を検出および視覚化する方法であって
    、微生物の標的配列に相補的なオリゴヌクレオチド（ただし、そのオリゴヌクレ
    オチドの中心部分にあるヌクレオチドは除く）を使用することを特徴とする方法
    。
14. 【請求項１４】 非相補的ヌクレオチドが微生物の不変の位置にある、請求項１３記載の検出お
    よび視覚化方法。
15. 【請求項１５】 微生物が大腸菌ゲノム種（ボイド赤痢菌血清型１３を除く赤痢菌を含む）／エ
    シェリキア・フェルグソニーの細菌である、請求項１３または１４記載の検出お
    よび視覚化方法。
16. 【請求項１６】 使用される相補的オリゴヌクレオチドが請求項５または６に定義された通りで
    ある、請求項１５記載の検出および視覚化方法。