DE10244456A1

DE10244456A1 - Verfahren zum Nachweis und Differenzierung von Bakterien

Info

Publication number: DE10244456A1
Application number: DE10244456A
Authority: DE
Inventors: Michael Weizenegger; Michaela Bollen
Original assignee: Hain Lifescience GmbH
Current assignee: Hain Lifescience GmbH
Priority date: 2002-09-24
Filing date: 2002-09-24
Publication date: 2004-04-15
Also published as: AU2003270248A1; AU2003270248A8; EP1543151A2; WO2004029299A2; WO2004029299A3

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft das Gebiet der Diagnostik von Mikroorganismen, insbesondere den Nachweis von Bakterien. Die Erfindung betrifft insbesondere Hybridisierungsverfahren und Amplifikationsverfahren sowie gekoppelte Amplifikations-/Hybridisierungsverfahren mit sequenzspezifischen Sonden beziehungsweise Primern.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft das Gebiet der Diagnostik von Mikroorganismen, insbesondere den Nachweis von Bakterien, die in klinisch relevanten Proben vorkommen. Bevorzugt können die hier beschriebenen Nukleinsäuren zur Identifizierung von Bakterien in Kulturen insbesondere in Blutkulturen benützt werden. Die Erfindung betrifft insbesondere Hybridisierungsverfahren und Amplifikationsverfahren, sowie gekoppelte Amplifikations-/ Hybridisierungsverfahren mit sequenzspezifischen Sonden beziehungsweise Primern.

Der Nachweis von Bakterien und ihre genaue Identifizierung spielen eine sehr wichtige Rolle in der medizinischen Mikrobiologie, damit eine entsprechende adäquate Behandlung eingeleitet werden kann. Die Anzucht der Bakterien in flüssigen oder festen Medien ist eine sensitive Standardmethode zum Nachweis von Bakterien in der humanen Primärprobe. Die Differenzierung erfolgt meist durch Mikroskopie kultureller oder primärer Präparate, nach der Morphologie auf Oberflächen kultivierter Kolonien, durch Wachstumstests bei verschiedenen Bedingungen und durch katabolische Eigenschaften, wie z.B. die Verstoffwechslung von Zucker, die Bildung von Säuren u.ä. durch die dazu notwendige Anlage von Sekundärund/oder Tertiärkulturen kann bis zur Befundstellung mehrere Tage vergehen.

Werden Flüssigkulturen eingesetzt, ist eine erste Analyse aufgrund der Koloniemorphologie nicht möglich. Hier müssen immer Sekundärkulturen und mikroskopische Präparate angelegt werden. Besonders wichtig ist hier die Diagnostik bakterieller Infektionen des Blutes. In diesem Fall werden einige Milliliter Blut in ein Nährmedium injiziert und dieses bebrühtet. Bei positivem Wachstum erfolgt die Differenzierung des Keims und eine Prüfung die Empfindlichkeit gegenüber antibakterieller Substanzen. Ungefähr acht bakterielle Spezies finden sich in ca. 65% aller Blutkulturisolaten. Typischerweise sind dies Escherichia coli (ca.20%), Staphylococcus aureus (ca.20%), Pseudomonas aerogenosa (ca.7%), Enterococcus spp.(ca.4%), Proteus spp. und Pneumokokken (ca.3%). Zusätzlich werden Koagulase negative Staphylokokken häufig von Patienten mit intravaskulären Implantaten isoliert die aber klinisch unauffällig sind. Die verbleibenden 35% der Blutkulturisolate erstreckt sich auf über 50 verschiedene Spezies.

In den letzten Jahren sind wichtige Erfindungen gemacht worden, um mit sehr speziesspezifischen Primern in einer Nukleinsäureamplifikationsreaktion Organismen nachzuweisen. Die Detektion erfolgt dabei meist über Gelelektrophorese oder analog der ELISA-Technik über immobilisierte Sonden in Mikrotiterplatten. Allerdings eignen sich diese Methoden nicht, wenn es darum geht aus vielen möglichen pathogenen Organismen einen oder mehrere nachzuweisen.

Gerade bei der Diagnostik aus Blutkulturen ist eine schnelle Diagnostik von großer Bedeutung. Revolutionierend sind hier nukleinsäurebasierende Verfahren, die sich durch hohe Spezifität und Sensitivität auszeichnen. Bisher gibt es kommerziell Sondentests, die durch eine spezifische Hybridisierung an das bakterielle Genom die Spezies identifizieren können. Dies sind aber Einzelsondenteste, die entweder nach ersten Differenzierungshinweisen oder nach Häufigkeitswahrscheinlichkeiten ausgewählt werden müssen.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung war somit die Bereitstellung hoch spezifischer und hoch sensitiver Verfahren zum Nachweis klinisch wichtiger Bakterien, die Entwicklung von Primern zur Durchführung eines Amplifikationsverfahren bakterieller Genomfragmente und/oder deren Transkripte und die Entwicklung eines viele Sonden tragenden Detektionssystems. Bevorzugt laufen diese Tests im Multiplexverfahren.

Diese Aufgabe wurde erfindungsgemäß gelöst durch ein Verfahren zum Nachweis klinisch relevanter Bakterien, bei welchem eine nachzuweisende Nukleinsäure, welche ein Fragment aus dem Genom eines klinisch relevanten Bakteriums ist oder komplementär zu diesem ist, an eine sequenz- und/oder speziesspezifische Nukleinsäuresonde unter stringenten Bedingungen hybridisiert und anschließend die nachzuweisende Nukleinsäure beziehungsweise die Hybridisierung der nachzuweisenden Nukleinsäure an die sequenzspezifische Nukleinsäuresonde detektiert wird, dadurch gekennzeichnet, dass die sequenzspezifische Nukleinsäuresonde ausgewählt ist aus den Sequenzen mit den SEQ ID No.: 1-176 beziehungsweise komplementär zu diesen Sequenzen ist, beziehungsweise ein Fragment davon darstellt beziehungsweise komplementär zu diesem Fragment ist oder eine dieser Sequenzen beziehungsweise die komplementäre Sequenz enthält.

Der Begriff Nukleinsäure und Oligonukleotid bezieht sich im Sinne der vorliegenden Erfindung auf Primer, Proben, Sonden und Oligomerfragmente, welche detektiert werden. Der Begriff Nukleinsäure und Oligonukleotid ist weiterhin generisch zu Polydesoxyribonukleotiden (enthaltend 2-Deoxy-D-Ribose) und zu Polyribonukleotiden (enthaltend D-Ribose) oder zu jedem weiteren Typ von Polynukleotid, das ein N-Glykosid einer Purinbase oder einer Pyrimidinbase ist, beziehungsweise einer modifizierten Purinbase oder einer modifizierten Pyrimidinbase. Eingeschlossen sind erfindungsgemäß auch PNA's, d. h. Polyamide mit Purin-/Pyrimidin-Basen. Die Begriffe Nukleinsäure und Oligonukleotid werden im Sinne der vorliegenden Erfindung nicht als verschieden angesehen, insbesondere soll die Verwendung der Begriffe keine Unterscheidung in Bezug auf die Länge bedeuten. Diese Begriffe schließen sowohl doppel- beziehungsweise einzelsträngige DNA, als auch doppel- beziehungsweise einzelsträngige RNA ein.

Erfindungsgemäß ist insbesondere bevorzugt, dass die sequenzspezifische Nukleinsäuresonde ausgewählt ist aus den Sequenzen mit den SEQ ID No.: 19-54 und 174 – 176 beziehungsweise komplementär zu diesen Sequenzen ist, beziehungsweise ein Fragment davon darstellt beziehungsweise komplementär zu diesem Fragment ist oder eine dieser Sequenzen beziehungsweise die komplementäre Sequenz enthält.

Dem Fachmann ist bewußt, daß ausgehend von der Lehre der vorliegenden Erfindung auch Sonden entworfen werden können, die geringfügig von den erfindungsgemäßen Sonden abweichen, aber dennoch funktionieren. So sind auch Sonden denkbar, die gegenüber den erfindungsgemäßen Sonden mit den Sequenzen SEQ ID No. 1-176 beziehungsweise 19-54 und 174 – 176 am 5'-und/oder 3'-Ende Verlängerungen oder Verkürzungen um wenigstens ein, zwei oder drei Nukleotide aufweisen. Ebenso ist denkbar, daß einzelne oder wenige Nukleotide einer Sonde durch andere Nukleotide austauschbar sind, solange die Spezifität der Sonde nicht zu stark verändert wird und der Schmelzpunkt der Sonde nicht zu stark verändert wird. Das schließt ein, dass bei Abwandlung die Schmelztemperatur der abgewandelten Sonde nicht zu stark von der Schmelztemperatw der ursprünglichen Sonde abweicht. Die Schmelztemperatur wird dabei nach der G ( =4°C) + C ( =2°C) Regel ermittelt. Dem Fachmann ist klar, dass neben den üblichen Nukleotiden A, G, C, T auch modifizierte Nukleotide wie Inosin usw. zur Anwendung kommen können. Die Lehre der vorliegenden Erfindung ermöglicht solche Modifikationen, ausgehend vom Gegenstand der Ansprüche.

Erfindungsgemäß wird eine Zusammensetzung, welche die nachzuweisende Nukleinsäure oder einen Teil davon enthält, mit einer oder mehreren Sonden hybridisiert.

Prinzipiell ist möglich, durch Hybridisierung mit einer einzelnen spezifischen Sonde die nachzuweisende Nukleinsäure und damit beispielsweise die Bakterienspezies zu bestimmen. Es ist aber auch möglich, die Zusammensetzung, welche die nachzuweisende Nukleinsäure oder einen Teil davon enthält, mit mehr als einer Sonde zu hybridisieren. Dadurch wird die Aussagekraft des Verfahrens erhöht. Man erhält dann ein genaues Profil und kann die nachzuweisende Nukleinsäure und damit beispielsweise die Bakterienspezies mit hoher Sicherheit bestimmen.

Bevorzugtes Verfahren für die Differenzierung klinisch relevanter Bakterien ist daher ein Multiplexverfahren, bei dem die für die Differenzierung notwendigen bakteriellen Genomabschnitte in einer gemeinsamen Amplifikations- und Hybridisierungsreaktion angereichert und hybridisiert werden. Für diese Anwendung ist die Amplifikation verschiedener Genfragmente notwendig. Die Sonde und Primer zur Detektion der bakteriellen Spezies liegen auf dem 23S ribosomalen RNS-Gen und oder auf dem Elongationsfaktor TU, die Sonden und Primer zur Unterscheidung der Antibiotikaresistenzen haben als Zielsequenz die entsprechenden genomisch kodierten Resistenzgene. Da die zur Differenzierung notwendigen Polymorphismen auf dem Genom viele 1000 Basen umfassen ist zudem eine Aufsplittung in kleinere Fragmente für eine effektive Amplifikation wichtig. Die Vielzahl von Primern, die alle miteinander agieren können, erfordert ein sorgfältiges Design.

Ein wichtiger Aspekt der Erfindung ist das Multiplexamplifikationsverfahren bestehend aus mindestens 10 und mehr Primern und das multigeplexte reverse Hybridisierungsverfahren. Ein weiterer wichtiger Aspekt ist ein Multiplexverfahren mit einem selbstamplifizierenden Chip.

Beim Hybridisierungsverfahren müssen Sonden mit unterschiedlicher Primärstruktur unter gleichen Bedingungen hybridisieren, wobei die Spezifität ausreichend zur Erkennung von Einzelbasenaustaschen sein sollte. Deshalb sind bei der Stringenzwaschung Salze wie Betain oder Tetramethylammoniumchloid als Modulatoren der Waserstoffbrückenbindungen bevorzugt.

Für den selbstamplifizierenden Chip sind Eigenschaften der Polymerase (z.B. „Hot Start"-Eigenschaften, das Design der Amplifikationsprimer und die Pufferzusammensetzung wichtig. Bevorzugte Polymerasen sind thermostabile "Hotstart-Polymerasen für den selbstamplifizierenden Chip: Bevorzugte Puffer sind PCR-Puffer, die modulierende Chemikalien wie Glycerin enthalten. Bevorzugte Amplifikationsprimer sind ausgewählt aus SEQ ID No. 1-176, beziehungsweise komplementär dazu, beziehungsweise davon ein Fragment oder enthalten eine dieser Sequenzen, insbesondere bevorzugt sind SEQ ID No.: 55-170. Auch hier sind zusätzlich Salze wie Betain oder Tetramethylammoniumchloid bevorzugt, aber auch stabilisierende Proteine wie BSA.

Der Begriff Hybridisierung bezieht sich auf die Bildung von Duplexstrukturen durch zwei einzelsträngige Nukleinsäuren aufgrund von komplementärer Basenpaarung. Hybridisierung kann zwischen komplementären Nukleinsäuresträngen oder zwischen Nukleinsäuresträngen erfolgen, welche kleinere Regionen an Fehlpaarung aufweisen. Die Stabilität des Nukleinsäuren-Duplexes wird gemessen durch die Schmelztemperatur T_m. Die Schmelztemperatur T_m ist die Temperatur (unter definierter Ionenstärke und pH), bei welcher 50% der Basenpaare dissoziiert sind.

Bedingungen, bei denen lediglich vollständig komplementäre Nukleinsäuren hybridisieren, werden als stringente Hybridisierungsbedingungen bezeichnet. Stringente Hybridisierungsbedingungen sind dem Fachmann bekannt ( z.B. Sambrook et al., 1085, Molecular Cloning – A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York). Im allgemeinen, werden stringente Bedingungen so ausgewählt, dass die Schmelztemperatur 5°C niedriger ist als die T_m für die spezifische Sequenz bei einer definierten Innenstärke und pH. Wenn die Hybridisierung unter weniger stringenten Bedingungen durchgeführt wird, dann werden Sequenz-Fehlpaarungen toleriert. Das Ausmaß an Sequenz-Fehlpaarungen kann durch Veränderung der Hybridisierungsbedingungen kontrolliert werden.

Die Durchführung der Hybridisierung unter stringenten Bedingungen ist besonders wichtig für das erfindungsgemäße Verfahren. Stringent im Sinne der vorliegenden Erfindung bedeutet, dass das Detektionsverfahren eine eindeutige Unterscheidung zwischen einer positiven Reaktion und einer negativen Reaktion im Reaktionsfeld des Streifens zulässt. Dies kann durch folgende Maßnahmen erzielt werden:
Struktur der Sonde: Durch die Länge der zur Zielsequenz komplementären Struktur der Sonde; bevorzugt sind 15 bis 20mere.

Laufpuffer: Durch den Salzgehalt wird die Stringenz beeinflusst. Die Ionenstärke liegt bevorzugt zwischen 100-500 mM, insbesondere bevorzugt bei 250 mM.

Weiterhin kann durch die oben erwähnten mild denaturierenden Substanzen im Laufpuffer (DMSO, Formamid, Harnstoff) die Stringenz individuell eingestellt und optimiert werden. Die Stringenz wird auch durch den pH-Wert des Laufpuffers beeinflußt. Alle der oben genannten Maßnahmen sind letztlich Maßnahmen, die Einfluß auf Wasserstoffbrückenbindungen haben.

Die Durchführung des Hybridisierungsverfahrens ist dem Fachmann an sich bekannt. So werden üblicherweise die festen Phasen nach Inkubation mit der Lösung, die den Hybridisierungspartner enthalten kann, stringenten Bedingungen ausgesetzt, um unspezifisch gebundene Nukleinsäuremoleküle zu entfernen. Die Hybridisierung kann in herkömmlicher Weise auf einer Nylon- oder Nitrocellulosemembran durchgeführt werden wie beschrieben (Sambrook et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, 1989). Die darin genannten Prinzipien lassen sich vom Fachmann auf weitere Ausführungsformen übertragen.

Auch die Länge der Zielnukleinsäure spielt eine wichtige Rolle für die Sensitivität der Hybridisierung. Bevorzugt sind Nukleinsäurenstränge mit einer Länge von 30 – 500 Basenpaaren.

Bevorzugt muss die Doppelstrang-Zielnukleinsäure vor der Hybridisierung denaturiert werden. Dies geschieht in der Regel durch basische Chemikalien oder Erwärmung, wobei die für die Doppelstrangstruktur verantwortlichen Wasserstoffbrückenbindungen aufgeschmolzen werden. Bevorzugt als basische Chemikalie ist NaOH in einer Konzentration von 0,1 bis 0,5 M. Besonders bevorzugt ist eine Konzentration von 0,25 M NaOH. Durch Erhitzen einer wässrigen Nukleinsäurelösung auf mindestens 95°C und anschließendem raschen Abkühlen auf 4°C können ebenfalls Einzelstrangstrukturen erreicht werden. Einzelstrangamplifikate z. B. als Produkte der NASBA-Reaktion sollten vor der Hybridisierung ebenfalls denaturiert werden, um intramolekulare Strukturen aufzulösen. Die kann wegen der Empfindlichkeit der RNS gegenüber hohen pH-Werten bevorzugt durch mild denaturierende Chemikalien wie z.B. DMSO oder Formamid erfolgen.

Als Hybridisierungspuffer werden in der Regel wässrige Puffer mit einem Salzgehalt zwischen 0,1 und 0,5 M, und einem pH-Wert von 7,5 – 8,0 verwendet. Für eine gute Benetzung der sondentragenden Phase werden Detergenzien verwendet. Bevorzugt ist Natriumlaurylsultat (SDS) in einer Konzentration von 0,1 – 7%. In der besonders bevorzugten hohen Konzentration von 7% wirkt SDS zudem günstig auf Signal-/Hintergrundverhältnisse, indem unspezifische Bindungen des Enzymkomplexes unterdrückt werden. Die gewünschte Stringenz der Hybridisierung wird neben der Struktur von Zielsequenz und Sonde durch die Zusammensetzung von Hybridisierungs- und Stringenzwaschpuffer bestimmt. Bevorzugt wird nach erfolgter Hybridisierung mit einem Stringenzwaschpuffer inkubiert. Dieser destabilisiert durch eine geringere Innenstärke den Doppelstrang. So werden nicht 100% komplementäre Hybride wieder getrennt. Durch Zusätze von Chemikalien (z.B. Tetramethylammoniumchlorid), welche die Wasserstoffbrückenbindungen des Hybrids beeinflussen, lassen sich die Bindungsstärke von G/C und A/T Paarungen angleichen, was bei Multiplexsondensysteme vorteilhaft sein kann.

Erfindungsgemäß wird nach der Hybridisierung das Ausmaß der Hybridisierung bestimmt. Das erfolgt üblicherweise dadurch, dass die Menge der Markierung bestimmt wird, die an eine feste Phase gebunden ist. Derartige Nachweisreaktionen und Detektionsverfahren sind dem Fachmann an sich bekannt.

Eine bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist dadurch gekennzeichnet, dass die nachzuweisende Nukleinsäure ein Amplifikationsprodukt ist, wobei die Amplifikation mit sequenzspezifischen Amplifikationsprimern durchgeführt wird. Insbesondere ist bevorzugt, dass die nachzuweisende Nukleinsäure ein Amplifikationsprodukt ist, wobei wenigstens ein Amplifikationsprimer ausgewählt ist aus den Sequenzen mit den SEQ ID No.: 1-170, insbesondere SEQ ID No. 1-18 und 171 – 173, beziehungsweise komplementär zu diesen Sequenzen ist, beziehungsweise ein Fragment davon darstellt beziehungsweise komplementär zu diesem Fragment ist oder eine dieser Sequenzen beziehungsweise die komplementäre Sequenz enthält. Am meisten bevorzugt ist, dass wenigstens ein Amplifikationsprimer ausgewählt ist aus den Sequenzen mit den SEQ ID No.: 1-18 und 55-170 und 171 – 173 beziehungsweise komplementär zu diesen Sequenzen ist, beziehungsweise ein Fragment davon darstellt beziehungsweise komplementär zu diesem Fragment ist oder eine dieser Sequenzen beziehungsweise die komplementäre Sequenz enthält.

Die Amplifikationsprimer sollten so ausgewählt sein, daß das Amplifikationsprodukt gute sterische Verhältnisse in- Kombination mit der immobilisierten Sonde aufweist. Pallindromstrukturen, die zu intramolekularen Faltungen führen, können durch geeignete Primerauswahl vermieden werden. Im Falle der Markierung mit Hapten ist die räumliche Anordnung des Haptens (z.B. Biotin) im Hybrid Sonde/Zielnukleinsäure wichtig. Das Hapten sollte für den Antikörper-Enzymkomplex gut zugänglich sein.

Eine Ausführungsform des Verfahrens ist dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäuresonden immobilisiert sind. In diesem Falle ist es vorteilhaft, wenn die nachzuweisende Nukleinsäure markiert ist.

In einer anderen Form des Verfahrens sind die Nukleinsäuresonden markiert. In diesem Falle ist es vorteilhaft, wenn die nachzuweisende Nukleinsäure immobilisiert ist.

Gegenstand der Erfindung ist des weiteren ein Verfahren zum Nachweis klinisch assoziierter Bakterien,

– bei welchem eine nachzuweisende Nukleinsäure, welche ein Fragment aus dem Genom eines Klinisch relevanten Bakteriums beziehungsweise komplementär zu diesem ist, amplifiziert wird, wobei die Amplifikation mit Primern durchgefihrt, von denen mindestens einer eine Sequenz aufweist, die im wesentlichen eine Teilsequenz der nachzuweisenden Nukleinsäure darstellt,
– und bei welchem anschließend die amplifizierte nachzuweisende Nukleinsäure detektiert wird, dadurch gekennzeichnet, dass die Sequenz dieses Primer ausgewählt ist aus den Sequenzen mit den SEQ ID No.: 1 - 176 beziehungsweise komplementär zu diesen Sequenzen ist, beziehungsweise ein Fragment davon darstellt beziehungsweise komplementär zu diesem Fragment ist oder eine dieser Sequenzen beziehungsweise die komplementäre Sequenz enthält. Diese Ausführungsform der Erfindung wird im folgenden kurz Amplifikationsverfahren genannt. Der Begriff Amplifikationsverfahren schließt alle bevorzugten Ausführungsformen ein.

Dem Fachmann ist bewusst, dass ausgehend von der Lehre der vorliegenden Erfindung auch Primer entworfen werden können, die geringfügig von den erfindungsgemäßen Primern abweichen, aber dennoch funktionieren. So sind auch Primer denkbar, die gegenüber den erfindungsgemäßen Primern am 5'- und/oder 3'-Ende Verlängerungen oder Verkürzungen um wenigstens ein, zwei oder drei Nukleotide aufweisen. Insbesondere Verlängerungen oder Verkürzungen am 5'-Ende der Primer können immer noch funktionsfähige Primer liefern, die erfindungsgemäß eingesetzt werden können. Ebenso ist denkbar, daß einzelne oder wenige Nukleotide eines Primers durch andere Nukleotide austauschbar sind, solange die Spezifität der Primer nicht zu stark verändert wird und der Schmelzpunkt der Primer nicht zu stark verändert wird. Dem Fachmann ist klar, dass neben den üblichen Nukleotiden A, G, C, T auch modifizierte Nukleotide wie Inosin usw. zur Anwendung kommen können. Die Lehre der vorliegenden Erfindung ermöglicht solche Modifikationen, ausgehend vom Gegenstand der Ansprüche.

Am meisten bevorzugt ist das letztgenannte Verfahren, wenn mindestens zwei Primer eine Sequenz aufweisen, die im wesentlichen eine Teilsequenz der nachzuweisenden Nukleinsäure darstellt, wobei die Sequenzen dieser Primer ausgewählt sind aus den Sequenzen mit den SEQ ID No.: 1 - 176 beziehungsweise komplementär zu diesen Sequenzen sind, beziehungsweise ein Fragment davon darstellt beziehungsweise komplementär zu diesem Fragment ist oder eine dieser Sequenzen beziehungsweise die komplementäre Sequenz enthält. Insbesondere bevorzugt ist, dass der bzw. die Primer eine Sequenz aufweisen, die im wesentlichen eine Teilsequenz der nachzuweisenden Nukleinsäure darstellt, wobei die Sequenzen dieser Primer ausgewählt sind aus den Sequenzen mit den SEQ ID No.: 1-18 und 171 – 173 und SEQ ID No.: 55-170 beziehungsweise komplementär zu diesen Sequenzen sind, beziehungsweise ein Fragment davon darstellt beziehungsweise komplementär zu diesem Fragment ist oder eine dieser Sequenzen beziehungsweise die komplementäre Sequenz enthält. Erfindungsgemäß bevorzugt ist dass die Primer markiert sind.

Die folgenden Ausführungen gelten sowohl für das erfindungsgemäße Hybridisierungsverfahren als auch für das erfindungsgemäße Amplifikationsverfahren als auch für das gekoppelte Amplifikations-/ Hybridisierungsverfahren. Gerade für die Identifizierung und Differenzierung von Bakterien ist dieser sogenannte „Multiplexansatz" von großem Nutzen.

Als Nukleinsäureamplifikationsreaktion können verschiedene Reaktionen eingesetzt werden. Bevorzugt wird die Polymerasekettenreaktion (PCR) eingesetzt. Die verschiedenen Ausgestaltungen der PCR-Technik sind dem Fachmann bekannt, siehe z.B. Mullis (1990) Target amplification for DNA analysis by the polymerase chain reaction. Ann Biol Chem (Paris) 48(8), 579-582. Weitere Amplifikationstechniken, die zur Anwendung kommen können, sind "nucleic acid strand-based amplification" (NASBA), "transcriptase mediated amplification" (TMA), "reverse transcriptase polymerase chain reaction" (RT-PCR), "Q-β replicase amplification" (β-Q-Replicase) und die "single strand displacement amplification" (SDA). NASBA und andere Transkriptions-basierte Amplifikationsmethoden werden in Chan und Fox, Reviews in Medical Microbiology (1999), 10 (4), 185-196 erläutert.

In der einfachsten Form der Detektion der nachzuweisenden Nukleinsäure wird das Amplifikat z.B. durch Verdau mit einem Restriktionsenzym spezifisch geschnitten und die entstandenen Ethidiumbromid-gefärbten Fragmente auf einem Agarosegel analysiert. Weit verbreitet sind auch Hybridisierungsysteme. Die Hybridisierung findet üblicherweise so statt, daß entweder die Zusammensetzung, die das Amplifikationsprodukt oder einen Teil davon enthält, oder die Sonde auf einer festen Phase immobilisiert wird und mit dem jeweils anderen Hybridisierungspartner in Kontakt gebracht wird. Als feste Phasen sind verschiedenste Materialien vorstellbar, beispielsweise Nylon, Nitrocellulose, Polystyrol, silikatische Materialien usw. Es ist auch denkbar, daß als feste Phase eine Mikrotiterplatte eingesetzt wird. Die Zielsequenz kann dabei auch in Lösung zuvor mit einer Fangsonde hybridisieren und danach wird die Fangsonde an eine feste Phase gebunden. In der Regel ist wenigstens eine Sonde oder wenigstens ein Primer bei der Amplifikation der nachzuweisenden Nukleinsäure markiert. Verschiedenste Markierungen sind dabei denkbar, wie z.B. Fluoreszenzfarbstoffe, Biotin oder Digoxigenin. Bekannte Fluoreszenzmarkierungen sind Fluoreszein, Cyaninfarbstoffe usw. Die Markierungen sind üblicherweise kovalent mit den Oligonukleotiden verbunden. Während eine Fluoreszenzmarkierung direkt nachgewiesen werden kann, können Biotin- und Digoxigeninmarkierungen nach Inkubation mit geeigneten Bindemolekülen nachgewiesen werden. Beispielsweise kann ein Biotin-markiertes Oligonukleotid nachgewiesen werden, indem es mit einer Lösung in Kontakt gebracht wird, die Streptavidin gekoppelt an ein Enzym enthält, wobei das Enzym, z.B. Peroxidase oder alkalische Phosphatase, ein Substrat umsetzt, das einen Farbstoff erzeugt oder zu Chemielumineszenz führt.

In einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens werden die Nukleinsäuresonden auf der festen Phase immobilisiert, und anschließend wird diese feste Phase mit der Zusammensetzung, welche die nachzuweisenden markierten Nukleinsäuren oder einen Teil davon enthält, in Kontakt gebracht. Vorzugsweise werden wenigstens zwei Sonden auf der festen Phase immobilisiert, bevorzugter wenigstens fünf Sonden, noch bevorzugter wenigstens zehn Sonden. Verschiedene Sonden können in verschiedenen Zonen immobilisiert sein. Durch Inkubation des Amplifikationsprodukts beziehungsweise der Probe enthalten die nachzuweisende Nukleinsäure oder eines Teils davon mit einer derart vorbereiteten festen Phase mit immobilisierten Sonden kann durch einen einzigen Hybridisierungsschritt eine Aussage über die Hybridisierung des Amplifikationsprodukts mit allen immobilisierten Sonden gewonnen werden. Die feste Phase ist daher bevorzugt ein Mikroarray von immobilisierten Sonden auf einer festen Phase. Derartige "DNA-Chips" erlauben es, daß auf einem kleinen Bereich eine hohe Anzahl verschiedener Oligonukleotide irrmobilisiert werden. Die festen Phasen, die für DNA-Chips geeignet sind, bestehen vorzugsweise aus silikatischen Materialien wie Glas usw. Die Markierung der Primer ist in dieser Ausführungsform vorzugsweise eine Fluoreszenzmarkierung. Der DNA-Chip kann nach Inkubation mit dem Amplifikationsprodukt beziehungsweise der Probe enthalten die nachzuweisende Nukleinsäure oder eines Teils davon durch eine Scanvorrichtung rasch analysiert werden. Derartige Vorrichtungen sind dem Fachmann bekannt. Eine Übersicht über die Chip-Technologie gibt McGlennen (2001) Miniaturization technologies for molecular diagnostics. Clin Chem 47(3), 393-402.

In dieser Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist die nachzuweisende Nukleinsäure markiert. Verschiedenste Markierungen sind dabei denkbar, wie z.B. Fluoreszenzfarbstoffe, Biotin oder Digoxigenin.

Bekannte Fluoreszenzmarkierungen sind Fluoreszein, FITC, Cyaninfarbstoffe, Rhodamine, Rhodamin₆₀₀R-phycoerythrin, Texas Red usw.

Vorstellbar ist auch eine radioaktive Markierung, wie z.B. ¹²⁵I, ³⁵S, ³²P, ³⁵P.

Vorstellbar ist auch eine Partikelmarkierung wie z.B. mit Latex. Solche Partikel sind üblicherweise trocken, im Micron-Bereich und uniform.

Die Markierungen sind üblicherweise kovalent mit den Oligonukle otiden verbunden. Während eine Fluoreszenzmarkierung beispielsweise direkt nachgewie sen werden kann, können Biotin- und Digoxigeninmarkierungen nach Inkubation mit geeigneten Bindemolekülen oder Konjugatspartnern nachgewiesen werden. Andere Ftindungspartner als beispielsweise Biotin/Streptavidin sind Antigen/Antibody-Systeme, Hapten/Anti-Hapten-Systeme, Biotin/Avidin, Folsäure/Folat-bindende Proteine, Komplementäre Nukleinsäuren, Proteine A, G und Immunoglobulin usw. (M. N. Bobrov, et a1. J. Immunol. Methods, 125, 279, (1989).

Beispielsweise kann ein Biotin-markiertes Oligonukleotid nachgewiesen werden, indem es mit einer Lösung in Kontakt gebracht wird, die Streptavidin gekoppelt an ein Enzym enthält, wobei das Enzym, z.B. Peroxidase oder alkalische Phosphatase, ein Substrat umsetzt, das einen Farbstoff erzeugt oder zu Chemielumineszenz führt. Mögliche Enzyme für diesen Verwendungszweck sind Hydrolasen, Lyasen, Oxido-Reduktasen, Transferasen, Isomerasen und Ligasen. Weitere Beispiele sind Peroxidasen, Glukoseoxidasen, Phosphatasen, Esterasen, und Glykosidasen. Derartige Verfahren sind dem Fachmann an sich bekannt (Wetmur JG.

Crit Rev Biochem Mol Biol 1991 ; (3-4) : 227-59; Temsamani J. et al. Mol Biotechnol 1996 Jun;5(3): 223-32). Bei manchen Methoden, bei denen Enzyme als Konjugatspartner fungieren, müssen farbändernde Substanzen anwesend sein (Tijssen, P. Practice and Theory of Enzyme Immunoassays in Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, eds. R. H. Burton and P.H. van Knippenberg (1998).

Ein weiteres bevorzugtes Konjugat umfaßt ein Enzym, welches an einen Antikörper gekoppelt wird (Williams, J. Immunol. Methods, 79, 261 (1984). Weiterhin ist üblich die Markierung der nachzuweisenden Nukleinsäure mit einem Gold Streptavidin Konjugat, wobei dann ein Biotin-markiertes Oligonukleotid nachgewiesen werden kann. Vorstellbar sind jedoch auch Bindungspartner, die kovalente Bindungen miteinander eingehen, wie z.B. Sulfhydryl-reaktive Gruppen wie Maleimide und Haloacetyl-Derivate und Amin-reaktive Gruppen wie Isothiocyanate, Succinimidylester und Sulfonylhalide.

Werden die nachzuweisenden Nukleinsäuren markiert, dann sind die Sonden in der Regel nicht markiert. Die Markierung der nachzuweisenden Nukleinsäuren erfolgt somit im wesentlichen nach im Stand der Technik beschriebenen Methoden (siehe auch US 6,037,127 ). Das Einbringen der Markierung in die nachzuweisende Nukleinsäure kann durch chemische oder enzymatische Methoden erfolgen, oder durch direkte Inkorporation von markierten Basen in die nachzuweisende Nukleinsäure. In einer bevorzugten Ausführungsform werden nachzuweisende Sequenzen, die Markierungen inkorporiert haben, durch markierte Basen oder markierte Primer während der PCR hergestellt. Markierte Primer können hergestellt werden durch chemische Synthese z.B. mittels der Phosphoramidit-Methode durch die Substitution von Basen des Primers durch markierte Phosphoramiditbasen während der Primer-Synthese. Alternativ dazu können Primer hergestellt werden mit modifizierten Basen, an welche nach der Primer-Synthese Markierungen chemisch gebunden werden.

Denkbar sind auch Verfahren ohne, dass die zu detektierende Nukleinsäure amplifiziert oder mit einer Modifikation versehen wird. Beispielsweise können ribosomale RNS Spezies mit einer DNS-Sonde spezifisch hybridisieren und mit einem RNS/DNS-spezifischen Antikörper als RNS/DNS-Hybrid nachgewiesen werden.

Eine andere Möglichkeit ist das Einbringen von Markierungen mit Hilfe der T4 Polynucleotide-Kinase oder eines terminalen Transferase-Enzyms. Vorstellbar sind so das Einbringen von radioaktiven oder fluoreszierenden Markierungen (Sambrook et. al, Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Vol. 2, 9.34-9.37 (1989); Cardullo et. al. PNAS, 85, 8790; Morrison, Anal. Biochem, 174, 101 (1988).

Markierungen können in eines oder in beide Enden der Nukleinsäuresequenz der nachzuweisenden Nukleinsäure eingebracht werden. Markierungen können auch innerhalb der Nukleinsäuresequenz der nachzuweisenden Nukleinsäure eingebracht werden. In eine nachzuweisende Nukleinsäure können mehrere Markierungen eingebracht werden.

In einer anderen Ausführungsform weist wenigstens eine der Sonden eine Markierung auf. Üblicherweise wird dann die Zusammensetzung, die das Amplifikationsprodukt oder einen Teil davon enthält, auf einer festen Phasen immobilisiert und mit einer Zusammensetzung in Kontakt gebracht, die wenigstens eine Sonde enthält. Auch in dieser Ausführungsform ist es bevorzugt, eine Hybridisierung mit mehr als einer Sonde durchzuführen. Dazu können mehrere feste Phasen bereitgestellt werden, auf denen das Amplifikationsprodukt beziehungsweise die Probe enthaltend die nachzuweisende Nukleinsäure immobilisiert ist. Es ist aber auch möglich, auf einer festen Phase an mehreren räumlich voneinander getrennten Bereichen kleine Mengen des Amplifikationsprodukts zu immobilisieren. Diese verschiedenen Spots werden dann mit jeweils verschiedenen Sonden in Kontakt gebracht (Hybridisierung).

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist des weiteren eine Vorrichtung zum Nachweis Klinisch relevanter Bakterien umfassend eine feste Phase, auf der eine oder mehrere sequenzund/oder speziesspezifische Nukleinsäuresonden immobilisiert sind, dadurch gekennzeichnet, dass die sequenzspezifische Nukleinsäuresonde ausgewählt ist aus den Sequenzen mit den SEQ ID No.: 1-176 beziehungsweise komplementär zu diesen Sequenzen ist, beziehungsweise ein Fragment davon darstellt beziehungsweise komplementär zu diesem Fragment ist oder eine dieser Sequenzen beziehungsweise die komplementäre Sequenz enthält.

Besonders bevorzugt ist diese Vorrichtung, wenn die sequenzspezifische Nukleinsäuresonde ausgewählt ist aus den Sequenzen mit den SEQ ID No.: 19 -54 und 174 – 176 beziehungsweise komplementär zu diesen Sequenzen ist, beziehungsweise ein Fragment davon darstellt beziehungsweise komplementär zu diesem Fragment ist oder eine dieser Sequenzen beziehungsweise die komplementäre Sequenz enthält.

Wenn mehrere Oligonukleotide immobilisiert sind, sind diese auf der festen Phase räumlich voneinander getrennt. Vorzugsweise ist die feste Phase als DNA-Chip ausgebildet.

Bevorzugt ist als feste Phase ein selbstamplifizierender DNS-Chip, der in jeder Auftragseinheit („Spot") minderstens zwei oder mehr Oligonukleotide an ihren 5'-Enden immobilisiert hat. Diese fungieren hier als Amplifikationsprimer. Die Spezifität diese immobilisierten Primer ist durch ihre Struktur besonders im Bereich der 3'-Region biologisch definiert. Damit ist dieser DNS-Chip kein Hybridisierungschip, sondern ein Nukleinsäureamplifikationschip. Dies ist analog einer Multiplex-Amplifikation, die in einem Ansatz mehr als zwei Primer enthält und damit mehr als ein Amplifikationsprodukt liefert. Eine solche im Reaktionsgefäß ablaufende Amplifikationsreaktion ist stark in ihrer Multiplexfähigkeit limitiert. 30- bis 60 Amplifikationsprodukte in einer Reaktion stellen zurzeit ein technisches Maximum dar. Im Unterschied zum Hybridisierungschip ist beim Nukleinsäureamplifikationschip die Multiplexfähikeit nur durch die Chipfläche begrenzt. Je nach verwendeter Spotgröße können hier einige 10.000 Spots pro cm² aufgebracht werden. Damit ergibt sich die Möglichkeit in einer Reaktion Primer komplementär zu beliebigen Positionen eines kompletten Genoms als Zielmolekül zu benützen.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist somit ein DNA-Chip, welcher immobilisierte Amplifikationsprimer aufweist. Bevorzugte Amplifikationsprimer sind ausgewählt aus den SEQ ID No. 1-176 beziehungsweise komplementär zu diesen Sequenzen, beziehungsweise ein Fragment davon beziehungsweise komplementär zu diesem Fragment oder enthält eine dieser Sequenzen beziehungsweise die komplementäre Sequenz, besonders bevorzugt für diesen Gegenstand der Erfindung sind die SEQ ID No.: 55-170.

Die feste Phase der erfindungsgemäßen Vorrichtung kann ein chromatographisches Material sein. Da der Analyt hauptsächlich hydrophiler Natur ist, sind hydrophile Eigenschaften des chromatographischen Materials des Teststreifens wichtig für die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens. Das chromatographische Material kann umfassen anorganische Puder wie silikatische Materialien, Magnesiumsulfat und Aluminium, kann weiterhin umfassen synthetische oder modifizierte natürlich vorkommende Polymere wie Nitrocellulose, Zelluloseacetat, Zellulose, Polyvinylchlorid oder -acetat, Polyacrylamid, Nylon, vernetztes Dextran, Agarose, Polyacrylat u.s.w., kann weiterhin umfassen beschichtete Werkstoffe wie keramische Materialien und Glas. Am meisten bevorzugt ist die Verwendung von Nitrocellulose als chromatographisches Material. Zusätzlich kann die Einführung von positiv geladenen Ionengruppen in z.B. Nitrocellulose oder Nylonmembranen die hydrophilen Eigenschaften des chromatographischen Materials verbessern.

Das chromatographische Material kann in einem Gehäuse oder ähnlichem montiert sein. Dieses Gehäuse ist in der Regel Wasser unlöslich, rigide und kann aus einer Vielzahl von organischen und anorganischen Materialien bestehen. Wichtig ist, dass das Gehäuse nicht mit den kapillaren Eigenschaften des chromatographischen Materials interferiert, dass das Gehäuse nicht Testkomponenten unspezifisch bindet, und dass das Gehäuse nicht mit dem Detektionssystem interferiert.

Bevorzugt wird als feste Phase für den selbstamplifizierenden Chip ein beschichteter Glasträger verwendet. Dem Fachmann sind solche Glasträger bekannt.

Die erfindungsgemäße Vorrichtung ist bevorzugt, wenn die sequenz- und/oder speziesspezifische Nukleinsäuresonden über einen Linker an die feste Phase der Vorrichtung gebunden ist. Der Linker fungiert als Abstandshalter der Sonde zur Membran. Dies sind im vorliegenden Falle meist Polymere, die den zur Zielsequenz komplementären Teil der Sonde am 5'- oder 3'-Ende verlängern, aber selbst nicht kodierend sind. Dies können Basenabfolgen einer nichtkodierender Nukleinsäuresäurestruktur sein oder andere Polymereinheiten wie z.B. Polyether, Polyester u.ä. Der Linker muss so beschaffen sein, dass er die Hybridisierungseigenschaften der Sonde nicht oder nur schwach negativ beeinflusst wird. Dies kann dadurch vermieden werden, dass keine selbstkomplementären Strukturen vorhanden sind. Auch müssen die chemischen Voraussetzungen für die irreversible Kopplung der Sonde an das Trägermaterial gegeben sein. Eine entscheidende Voraussetzung für ein gutes Funktionieren der Sonde über ihre Eigenschaften ein stabiles Hybrid mit der Zielsequenz zu bilden hinaus, ist die Chemie der Kopplung an die Oberfläche. Es müssen chemische Gruppen vorhanden sein, die bei den verwendeten Immobilisierungstechniken eine irreversible Bindung ermöglichen. Dies können Amine-, Thiolgruppen, Carboimide, Succinimide u.ä. sein.

Dem Fachmann sind jedoch auch andere Möglichkeiten bekannt, Abstandshalter beziehungsweise Linker zwischen der Sonde und der Membran zu schaffen. Sondenoligonukleotide können beispielsweise über Proteine an die Membranoberfläche gebunden werden. Die mit der Sonde beladenen Proteine können dann nach Standardverfahren an. die poröse Membran gebunden werden. Standardverfahren sind zum Beispiel die Kopplung über homobifunktionelle Kopplungsreagenzien oder heterobifunktionelle Kopplungsreagenzien. Bei homobifunktionellen sind die reaktiven Gruppen gleich. Typischerweise sind dies Amine und/oder Thiole. Thiole können synthetisch direkt an Oligonukleotide gekoppelt werden und unter oxidativen Bedingungen mit z.B. Cysteinresten zu Disulfidbrücken reagieren. Für die Kopplung Amin-Amin können Amine als homobifunktionelle Kopplungsreagenzien direkt synthetisch an Oligonukleotide gekoppelt werden und über Imidoester oder Succinimidester an die Oberfläche oder das Protein gebunden werden. Bei heterobifunktionelle Kopplungsreagenzien sind die reaktiven Gruppen unterschiedlich und erlauben die Kopplung von verschiedenen funktionellen Gruppen. Bevorzugt ist die Ausbildung von Amino-Thiol-Kopplungen. Mit einem heterobifunktionellen Kopplungsreagenz, welches sowohl eine Succinimidester-Maleimid oder Iodacetimid beinhaltet, können thiolierte Oligonukleotide gekoppelt werden. Ein weiteres wichtiges Kopplungsagent sind die Carbodümide, die Carbonylreste an Amine koppeln. Wichtigster Vertreter ist hier das 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodümid (EDAC). Hier können an Membranen mit Carbonylresten aminomodifizierte Oligonukleotide gekoppelt werden. Bei dieser Chemie wird das Kopplungsreagenz nicht in die Verbindung eingebaut.

Die Hybridisierung der Sonden kann auch „in Lösung" als homogenes Verfahren durchgeführt werden. Dazu können die Sonden so modifiziert werden, dass sie nach Markierung mit Farbstoffen (z.B. Rhodaminen, Floureszinen und ihren Derivaten) in Kombination mit lichtunterdrückenden („Quencher")-Molekülen in ihren hybridisierten und freien Zuständen unterscheidbar sind. Dies kann durch intramolekulare, selbsthybridisierende Strukturen der Sonde wie bei der „molcular beacon"-Technik oder durch den Einsatz von mindestens 2 Sonden wie bei „Light cycler" (Roche) oder dem „Smart cycler" (Cepheid) geschehen. Auch „Minisequencing"-Systeme wie „Pyrosequencing" (Pyrosequencing) sind für dafür geeignet. Grundsätzlich eigen sich aber auch Ansätze, die Hybride aufgrund ihrer geänderten Therodynamik oder Kinetik von einzelsträngigen Formen unterscheiden können. Gegenstand der vorliegenden Erfindung des weiteren ist eine Nukleinsäure welche ausgewählt ist aus den Sequenzen mit den SEQ ID No.: 1-176 beziehungsweise komplementär zu diesen Sequenzen ist, beziehungsweise ein Fragment davon darstellt, beziehungsweise komplementär zu diesem Fragment ist oder eine dieser Sequenzen beziehungsweise die komplementäre Sequenz enthält. Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist des weiteren eine Zusammensetzung beziehungsweise ein Kit zum Nachweis klinisch relevanter Bakterien enthaltend eine oder mehrere der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren.

Insbesondere ist Gegenstand der vorliegenden Erfindung ein Kit zur Amplifikation einer nachzuweisenden Nukleinsäure, welche ein oder mehrere Fragmente aus dem Genom eines klinisch relevanten Bakteriums beziehungsweise komplementär zu diesem ist, enthaltend eine oder mehrere der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren.

Zusätzlich enthält der Kit alle für die Amplifikation der Zielsequenz notwendigen Komponenten, wie Primer, Puffersysteme und Enzyme und die irrmobilisierten Sonden für Nachweis und Spezifizierung des Amplifikats mit den dazu notwendigen Puffersystemen.

Am meisten bevorzugt ist ein Kit zur Amplifikation einer nachzuweisenden Nukleinsäure, welche ein Fragment aus dem Genom eines Klinisch relevanten Bakteriums beziehungsweise komplementär zu diesem ist, enthaltend eine oder mehrere Nukleinsäuren ausgewählt aus den Sequenzen mit den SEQ ID No.: 1-18, 171-173 und 55-170 beziehungsweise komplementär zu diesen Sequenzen, beziehungsweise ein Fragment davon, beziehungsweise komplementär zu diesem Fragment ist oder eine dieser Sequenzen beziehungsweise die komplementäre Sequenz enthält.

Die Erfindung betrifft auch die Verwendung der erfindungsgemäßen Vorrichtung zum Nachweis klinisch relevanter Bakterien. Die Erfindung betrifft weiterhin die Verwendung der erfindungsgemäßen Nukleinsäure beziehungsweise des erfindungsgemäßen Kits zum Nachweis klinisch relevanter Bakterien.

Die nachzuweisende Nukleinsäure kann sich in jeder Zusammensetzung befinden, die im Verdacht steht, Bakterien zu enthalten, insbesondere klinisch relevante Bakterien. Es kann sich um Primärmaterial, z.B. Sekrete, Sulkusflüssigkeit, Abstriche und Blut usw. Oder um Kulturen von Mikroorganismen, die bereits in Flüssig- oder Festmedien angezogen wurden.

Abbildungsbeschreibungen:

1 Densitometrisches Auswertungsbeispiel einer Dorblothybridisierung mit biotinilierten Sonden.

Legende:

Haemophilus influencae (HIN) Seq ID No. 19, Proteus mirabilis (PMI) Seq ID No. 20, Serratia marcescens (SMA) Seq ID No. 21, Escherichia coli (ECO) Seq ID No. 22, Pseudomonas pudica (PPU) Seq ID No. 24, Pseudomonas fluorescens (PFL) Seq ID No. 25, Acinoetobacter baumanü (ABA) Seq ID No. 26, Klebsiella oxytoca (KOX) Seq ID No. 27, Klebsiella pneumoniae (KPN) Seq ID No. 28, Enterobacter aerogenes (EAE) Seq ID No. 29, Pseudomonas aerogenosa (PAE) Seq ID No. 30, Proteus vulgaris (PVU) Seq ID No. 31, Burgholderia cepacia (BCE) Seq ID No 32.

2 Densitometrisches Auswertungsbeispiel einer Dorblothybridisierung mit biotinilierten Sonden.

Legende

Staphylococcusaureus (SAU) Seq ID No. 33, Enterococcus gallinarum (EGA) Seq ID No. 34, Staphylococcus capitis (SCA) Seq ID No. 35, Enterococcus faecalis (EFA) Seq ID No. 36, Enterococcus durans (EDU) Seq ID No. 37, Staphylokokken Gruppe F (SGF) Seq ID No. 38, Enterococcus faecium (EFC) Seq ID No. 39, Enterococcus durans (EDU) Seq ID No. 40, Streptococcus pyogenes (SPY) Seq ID No. 41, Streptococcus sciuni (SCI) Seq ID No. 42, Streptococcus oralis (SOR) Seq ID No. 43, Staphylococcus saprophyticus (PVU) Seq ID No. 44, Staphylococcus cohaii (SCO) Seq ID No. 45, Staphylococcus lugdunensis/haemolyticus/hominis (SLHH) Seq ID No. 46, Staphylococcus warneri (SWA) Seq ID No. 47, Staphylococcus epidermidis (SEP) Seq ID No. 48, Staphylococcus lyticans (SLY) Seq ID No. 49, Staphylococcus schleiferi (SOR) Seq ID No. 50;

3 Hybridisierungsbeispiel: Bakterielle DNS wurde mit den Primern SEQ ID No.: 5, 6, 9 – 16 und 19 – 21 amplifiziert

Positive Banden Streifen 1 hybridisiert mit amplifizierter DNS von Staphylococcus aureus: biotinilierte DNS, SEQ ID No.: 55, SEQ ID No.: 33

Positive Banden Streifen 2 hybridisiert mit amplifizierter DNS von Staphylococcus epidermidis: biotinilierte DNS, SEQ ID No.: 55, SEQ ID No.: 48

Positive Banden Streifen 3 hybridisiert mit amplifizierter DNS von Enterococcus faecium: biotinilierte DNS, SEQ ID No.: 55, SEQ ID No.: 39

Positive Banden Streifen 4 hybridisiert mit amplifizierter DNS von Streptococcus oxalis: biotinilierte DNS, SÉQ ID No.: 55, SEQ ID No.: 43

Positive Banden Streifen 5 hybridisiert mit amplifizierter DNS von Enterococcus faecalis: biotinilierte DNS, SEQ ID No.: 55, SEQ ID No.: 36

Positive Banden Streifen 6 hybridisiert mit amplifizierter DNS von Streptococcus pyogenes: biotinilierte DNS, SEQ ID No.: 55, SEQ ID No.: 41

Positive Banden Streifen 7 hybridisiert mit amplifizierter DNS von Enterococcus gallinarum: biotinilierte DNS, SEQ ID No.: 55, SEQ ID No.: 34

Positive Banden Streifen 8 hybridisiert mit amplifizierter DNS von Enterococcus casseliflavus: biotinilierte DNS, SEQ ID No.: 55, SEQ ID No.: 56

Positive Banden Streifen 9 hybridisiert mit amplifizierter DNS von Enterococcus durans: biotinilierte DNS, SEQ ID No.: 55, SEQ ID No.: 40

Positive Banden Streifen 10 hybridisiert mit amplifizierter DNS von Staphylococcus saprophyticus: biotinilierte DNS, SEQ ID No.: 55, SEQ ID No.: 44

Positive Banden Streifen 11 hybridisiert mit amplifizierter DNS von Staphylococcus cohnii: biotinilierte DNS, SEQ ID No.: 55, SEQ ID No.: 45

Positive Banden Streifen 12 hybridisiert mit amplifizierter DNS von Staphylococcus warneri: biotinilierte DNS, SEQ ID No.: 55, SEQ ID No.: 47

Positive Banden Streifen 13 hybridisiert mit amplifizierter DNS von Staphylococcus lyticans: biotinilierte DNS, SEQ ID No.: 55, SEQ ID No.: 49

Positive Banden Streifen 14 hybridisiert mit amplifizierter DNS von Staphylococcus schleiferi: biotinilierte DNS, SEQ ID No.: 55, SEQ ID No.: 50

Positive Banden Streifen 15 hybridisiert mit amplifizierter DNS von Enterococcus casseliflavus: biotinilierte DNS, SEQ ID No.: 55, SEQ ID No.: 56, SEQ ID No.: 54

Positive Banden Streifen 16 hybridisiert mit amplifizierter DNS von Enterococcus faecalis: biotinilierte DNS, SEQ ID No.: 55, SEQ ID No.: 36, SEQ ID No.: 51

Positive Banden Streifen 17 hybridisiert mit amplifizierter DNS von Enterococcus gallinarum: biotinilierte DNS, SEQ ID No.: 55, SEQ ID No.: 34, SEQ ID No.: 53

Positive Banden Streifen 18 hybridisiert mit amplifizierter DNS von Enterococcus faecium: biotinilierte DNS, SEQ ID No.: 55, SEQ ID No.: 39, SEQ ID No.: 52

4 Analysebeispiel eins selbstamplifizierender Chip

Der Glasträger wurde mit folgenden Primerpaaren beschichtet:
Staphylococcus lyticans Seq ID No. 126/127, Staphylococcus aureus Seq ID No. 122/123, Enterococcus gallinarum Seq ID No. 120/121, Moraxella catarrhalis Seq ID No. 69/70, Escherichia coli Seq ID No.67/68, Salmonella typhimurium Seq ID No. 55/56, Enterobacter aerogenes Seq ID No. 63/64, Burgholderia cepacia Seq ID No. 100/101, Alcaligines faecalis Seq ID No. 102/103, Proteus vulgaris Seq ID No. 57/58, Stenotrophomonas maltophilia Seq ID No. 55/56. Pufferkontrolle: Primerauftragepuffer ohne Oligonukleotid;

Beispiele

Mit den hier beschriebenen Methoden können die entsprechenden Bakterien entweder aus Primärmaterial (z.B. Abstrichen, Blut u.ä.) oder aus bakteriellen Flüssig- oder Festmedien identifiziert und differenziert werden.

DNA/RNA-Isolierung:

Bakterielle Nukleinsäure wurde entweder von Festnährmedien, Flüssigmedien oder aus Primärmaterial nach entsprechender Vorbehandlung gewonnen.

Dazu wurde von Festmedien mit einer sterilen Impföse bakterielles Material entnommen und in 300μl 10mM Tris/HCl pH 7,5 suspendiert. Aus Flüssigkulturen wurde 1ml entnommen, 5min bei 13.000rpm in einer Tischzentrifuge zentrifugiert, der Überstand verworfen und in 300μl 10mM Tris/HCl pH 7,5 resuspendiert. Die bakterielle Suspension wurde 15min bei 95°C in einem Thermomixer (Eppendorf Hamburg, Deutschland) inkubiert, 15min in einem Ultraschallbad (Bandelin, Berlin,) beschallt und 10min bei 13.000rpm in einer Tischzentrifuge (Eppendorf, Hamburg, Deutschland) zentrifugiert. Vom Überstand wurden jeweils 5μl in die Amplifikationsreaktion eingesetzt.

Beispiel 1 Dotblothybridisierung

Amplifikation:

Alle Primer und Sonden wurden kommerziell synthetisiert. (Interactiva, Ulm, Deutschland).

Als Primer zur Amplifikation von Zielsequenzen der oben angegebenen Organismen wurden die Seq ID No. 1 – 6 verwendet.

Der PCR-Ansatz enthielt 1 × Taq-Puffer (Qiagen, Hilden, Deutschland), je 1 μM Primer, 200μM dNTP (Roche, Mannheim, Deutschland) und 1U Hotstar Taq-Polymerase (Qiagen, Hilden, Deutschland). Die PCR-Amplifikation wurde auf einem Thermocycler PE 9600 (ABI, Weiterstadt, Deutschland) mit 15min 95°C, 30 Zyklen mit 20sek 95°C und 30sek 60°C durchgeführt.

Detektion der Amplifikate durch Sondenhybridisierung:

Alle Sonden wurden am 5'-Ende biotiniliert, um Zielsequenz/Sonden-Hybride über an Streptavidin gekoppelte Reporterenzyme nachweisen zu können. Als Sonden werden Oligonukleotide mit den Sequenzen Tabelle 1 SEQ ID NO 19 – 22, 24 – 50 eingesetzt.

Saugfähiges Papier (Blotting Papier GB002, Schleicher & Schüll, Dassel, Deutschland), und eine Nylonmembran (Biodyne A, Pall, Portsmouth, England) wurden auf die Größe der Blotapparatur (Minifold Schleicher & Schüll, Dassel, Deutschland) geschnitten und mit 10 x SSC getränkt. In die Öffnungen der zusammengebauten Apparatur wurden 250μl Denaturierungslösung (50 mM NaOH; 1,5 M NaCl) vorgelegt und 20 μl Amplifikat zupipettiert. Nach Anlegen eines Vakuums wurde gewartet, bis alle Flüssigkeit vollständig durchgesaugt war. Anschließend wurde mit 10 x SSC-Puffer nachgespült. Die Membran wurde, nachdem sie vollständig getrocknet war in einem UV-Crosslinker (UV-Stratalinker 2400, Stratagene, La Jolla, USA) bei 1200 Joule/cm² fixiert und mit destilliertem Wasser gewaschen und getrocknet.

Alle Hybridisierungen wurden bei 45°C in einem Hybridisierungsofen (Hybaid Mini Oven MkII, MWG-Biotech, Ebersberg, Deutschland) in Glasröhren durchgeführt. Die mit DNA/RNA-Amplifikat beschichtete Membran wurde in trockenem Zustand eingerollt und in eine Glasröhre gegeben. Anschließend wurde die Membran unter ständiger Rotation Smin mit vorgewärmten Hybridisierungspuffer inkubiert. Nach Zugabe von 2 pmol biotinilierter Sonde erfolgte für eine Stunde die Hybridisierungsreaktion. Nichtgebundene oder nur partial gebundene Sonde wurde durch 30min Inkubation mit Stringent-Puffer bei 45°C mit einmaligem Tausch des vorgewärmten Stringent-Puffers entfernt. Anschließend wurde Blocking-Reagens zugegeben und 15min bei 37°C weiterinkubiert. Die Hybride wurden durch ein Streptavidin-Alkalische Phosphatase-Konjugat durch Zugabe von NBT/BCIP kolorimetrisch oder durch Aufsprühen von Chemielumineszenzsubstrat (Lumi-Phos 530, Cellmark Diagnostics, Abindon, England) autoradiographisch detektiert. Dazu wurde Streptavidin-Alkalische Phosphatase-Konjugat zugegeben und 30min bei 37°C inkubiert. Anschließend wurde die Membran zweimal 15min mit Substratpuffer gewaschen. Die Membran wurde dann entnommen, Lumi-Phos-Reagens wurde aufgesprüht, gefolgt von 2h Exposition eines Röntgenfilms. Alternativ dazu wurde Substratpuffer mit NBT/BCIP zugegeben und die Farbentwicklung abgewartet.

Verwendete Lösungen:

10 × SSC-Lösung (Standard-Saline-Citrat):
1,5M NaCl, 0,15M Trinatriumcitrat;
Hybridisierungspuffer:
7% SDS (Na-dodecylsulfat), 0,25M Phosphatpuffer pH 7,5;
Stringentwaschlösung (Stringent-Puffer):
3M TMCL (Tetramethylammoniumchlorid), 50mM Tris/Cl, 2mM EDTA, 0,1% SDS;
Lösung zur Absättigung der Membranbindungsstellen:
5g/l Blockingreagenz (Roche) in Maleinsäurepuffer pH 7,5 (4,13g NaCl und 5,53g
Maleinsäure in 500ml Wasser, pH mit 5M NaOH auf 7,5 eingestellt); Substratpuffer:
274mM Tris/Cl pH 7,5, 68,6 mM Na₃Citrat, 200mM NaCI, 27,4 mM MgCl₂ * 6 H₂O;
BCIP:
50 mg/ml 5-bromo-4-chloro-3-indonylphosphat-toluidiniumsalz in 100% Dimethylformamid;
NBT:
75 mg/ml Nitroblautetrazoliumsalz in 70% Dimethylformamid;

Die Autoradiogramme wurden densitometrisch ausgewertet. Als 100%-Wert wurde der Amplifikatdot der Spezies, aus der die Sondensequenz abgeleitet wurde, zugrundegelegt. Als Kontrollen wurden immer eine Probe, der statt Nukleinsäurelösung Wasser zugegeben wurde und eine Probe mit 100ng isolierter humaner DNS als Dots auf der Membran mitgeführt.

In 1 und 2 sind die Ergebnisse von Beispiel 1 dargestellt. Angegeben sind die %-Werte der densitometrischen Auswertung. Der Wert der für die Spezies homologen Sonde wurde 100% gesetzt.

Beispiel 2 Reverse Hybridisierungsstreifen

Herstellung des Hybridisierungsstreifens mit immobolisierten Sonden:

Eine Nylonmembran (Biodyne A, Pall, Portsmouth, England) wurden auf die Größe der Blotapparatur geschnitten und mit 10 × SSC getränkt. In die Öffnungen der zusammengebauten Apparatur wurden 250 μ1 einer 1 μM Sondenlösung wie in 3 beschrieben in 10 × SSC in schlitzförmigen Öffnungen der Blotapparatur vorgelegt. Nach Anlegen eines Vakuums wurde gewartet, bis alle Flüssigkeit vollständig durchgesaugt war. Anschließend wurde mit 10 × SSC-Puffer nachgespült. Die Membran wurde, nachdem sie vollständig getrocknet war in einem UV-Grosslinker (UV-Stratalinker 2400, Stratagene, La Jolla, USA) bei 1200 Joule/cm² fixiert und mit destilliertem Wasser gewaschen, getrocknet und in ca. 4mm breite Streifen geschnitten.

Alle Hybridisierungen wurden bei 50°C in einem Wasserbad (Thermolab, GFL, Burgwedel, Deutschland) durchgeführt. Die mit Sonden beschichtete Membran wurde in Streifen geschnitten und in einer Inkubationswanne (Corning costar, Bodenheim, Deutschland) mit vorgewärmtem Hybridisierungspuffer inkubiert. Nach Zugabe von 20μl in 0,4M NaOH denaturiertem Amplifikat erfolgte für eine Stunde die Hybridisierungsreaktion. Nichtgebundene oder nur partial gebundenes Amplifikat wurde durch 30min Inkubation mit Stringent-Puffer bei 50°C mit einmaligem Tausch des vorgewärmten Stringent-Puffers entfernt. Anschließend wurde Blocking-Reagens zugegeben und 15min bei 37°C inkubiert. Die Hybride wurden kolorimetrisch durch ein Streptavidin-Alkalische Phosphatase-Konjugat mit Zugabe von NBT/BCIP detektiert. Dazu wurde Streptavidin-Alkalische Phosphatase-Konjugat zugegeben und 30min bei 37°C inkubiert. Anschließend wurde die Membran zweimal 15min mit Substratpuffer gewaschen. Die Membran wurde in Substratpuffer mit NBT/BCIP 10min inkubiert und die Farbentwicklung durch Waschen mit H₂O_bidest gestoppt (s. 3).

Beispiel 3: Selbstamplifizierender Chip

Isolierung bakterieller genomischer DNS:

1,5 ml einer positiven Bakterienulture wurden in ein 2ml Reaktionsgefäß gefüllt und bei 8000g 10 Minuten zentrifugiert, der Überstand wurde dekantiert und das Sediment wird zweimal in 500 μ1 deionisiertem Wasser gewaschen. Daraufhin erfolgte eine 30minütige Inkubation bei 95° C in einem Heizblock (Eppendorf, Hamburg, Deutschland) und eine 15minütige Ultraschallbehandlung (Bandelin, Berlin, Deutschland) . Nach 10minütiger Zentrifugation bei 14.000g werden 400 μl des Überstandes abgenommen und in eine neues Reaktionsgefäß transferiert.

Immobilisierung der spezies-spezifischen Oligonukleotide

Die spezies-spezifischen aminomodifizierten Oligonukleotidpaare (Interactiva, Ulm, Deutschland) werden in Na-Phosphatpuffer 20μM verdünnt und in eine Platte mit 384 Vertiefungen pipettiert. Die Oligonukleotidpaare werden mit einem Volumen von 1nl in runden Feldern (="spots") mit einem Durchmesser von je 200 μm einzeln nebeneinander auf dem Glasträger (75 × 25 mm) aufgetragen. Die Oligonukleotidpaare werden immer in doppelter Ausführung nebeneinander immobilisiert (Duplikatspots).

Die Immobilisierung der aminomodifizierten Oligonukleotidpaare (Interactiva, Ulm, Deutschland) auf die oberflächenmodifizierten Glasträger erfolgt in allen Fällen durch „Kontakt printing" mit Hilfe des OMNI-GRID (GeneMachines, San Carlos, USA) spotters. Von den Vertiefungen der Mikrotiterplatte werden von einem mit einer Reihe von Präzisionsspitzen versehenen Roboterarm die spezies-spezifischen Oligonukleotide und setzt sie an genau definierten Stellen auf den Glas-Objekträgern ab.

Die verwendeten Chiprohlinge „Motorola Activated slides" (Motorola, Schaumburg, Illinois USA) besitzen reaktive Gruppen auf ihrer Oberfläche, die aminomodifizierte Oligonukleotide an der Oberfläche kovalent binden können (keine weiteren Angaben des Herstellers).

Prozessierung der gespotteten Arrays:

Die gespotteten Glasträger werden über Nacht in einer Feuchtkammer mit gesättigter Natriumchlorid-Lösung bei Raumtemperatur inkubiert. Darauf werden die Glasträger 15 Minuten bei 50°C in Blockierungs-Reagenz inkubiert und 2 × 5 Minuten bei Raumtemperatur in deionisiertem Wasser gewaschen. Darauf erfolgt eine 15 minütige Inkubation bei 50°C im Waschpuffer Motorola und wiederum werden die Glasträger 2 × 5 Minuten bei Raumtemperatur in deionisiertem Wasser gewaschen. Die Glasträger werden durch 5minütiges Zentrifugieren bei 1000rpm getrocknet.

Festphasen-PCR

Verwendete Materialien/Geräte

Materialstoffe

Geräte

Alle Komponenten werden in einem 1,5 ml Reaktionsgefäß vermischt und zunächst 15 Minuten bei 95°C inkubiert. Der komplette PCR-Reaktionsansatz wird direkt auf das Reaktionsfeld der Glasträger pipettiert, auf dem die Oligonukleotide immobilisiert sind. Die PCR-Reaktion wird mit einem Deckglas bedeckt und der Glasträger in den in-situ-Aufsatz (Twin Towers block) des Thermocyclers gelegt. Während der ersten Inkubationsphasen bei 95°C verschließt das „self-seal"-Reagenz den Raum zwischen den Rändern des Deckglases und dem darunter befindlichen Glasträger; dies verhindert zum einen eine Evaporation des PCR-Reaktionsansatzes während der Hitzeschritte der PCR und zum anderen wird dadurch eine luftdichte Reaktionskammer für die PCR-Reaktion ausgebildet.

PCR-Programm:

Waschprotokoll nach erfolgter Festphasen-PCR

Nach der Festphasen-PCR werden die Glasträger aus dem Thermocycler entnommen und das Deckglas wird vorsichtig entfernt. Die Glasträger werden 15 Minuten bei 68°C in Waschpuffer 1, 5 Minuten bei Raumtemperatur in Waschpuffer 2 und 5 Minuten bei Raumtemperatur in Waschpuffer 3 gewaschen. Darauf werden sie mit Hilfe von Druckluft getrocknet.

Darauf werden die Glasträger mit Hilfe eines konfokalen Laserscanners (Scan Array 4000, DSS Imagetech, New Dehli, Indien) gescannt und es resultiert die bildliche Darstellung des Fluoreszenz-Signals auf dem Glasträger. Je intensiver das Fluoreszenzsignal auf dem Glasträger ist, desto weißer erscheint der jeweilige Spot und umgekehrt desto schwächer das Signal ist, desto schwärzer erscheint der jeweilige Spot. Zwischen weißem und schwarzem Spot erscheinen in der Intensitätsskala die Farben rot-grün-blau.

Die Integration der Fluoreszenzsignale in Zahlenwerte erfolgte durch die ImaGene software (ImaGene Standard edition; Biodiscovery, Marina del Ray, USA) (s. 4).

Tabelle 1

Tabelle 2:

Tabelle 3

Die Primer SEQ ID No. 55-170 sind als speziespezifische Amplifikationsprimer für den selbstamplifizierenden Chip konstruiert.

Tabelle 4

Tabelle 5

SEQUENCE LISTING

Claims

Verfahren zum Nachweis Klinisch relevanter Bakterien, bei welchem eine nachzuweisende Nukleinsäure, welche ein Fragment aus dem Genom eines Klinisch relevanter Bakteriums ist oder komplementär zu diesem ist an eine sequenz- und/oder speziesspezifische Nukleinsäuresonde unter stringenten Bedingungen hybridisiert und anschließend die nachzuweisende Nukleinsäure beziehungsweise die Hybridisierung der nachzuweisenden Nukleinsäure an die sequenzspezifische Nukleinsäuresonde detektiert wird, dadurch gekennzeichnet, dass die sequenzspezifische Nukleinsäuresonde ausgewählt ist aus den Sequenzen mit den SEQ ID No.: 1-176 beziehungsweise komplementär zu diesen Sequenzen ist, beziehungsweise ein Fragment davon darstellt beziehungsweise komplementär zu diesem Fragment ist oder eine dieser Sequenzen beziehungsweise die komplementäre Sequenz enthält.
Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die sequenzspezifische Nukleinsäuresonde ausgewählt ist aus den Sequenzen mit den SEQ ID No.: 19-54 und 174-176 beziehungsweise komplementär zu diesen Sequenzen ist, beziehungsweise ein Fragment davon darstellt beziehungsweise komplementär zu diesem Fragment ist oder eine dieser Sequenzen beziehungsweise die komplementäre Sequenz enthält.
Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die nachzuweisende Nukleinsäure ein Amplifikationsprodukt ist, wobei die Amplifikation mit sequenzspezifischen Amplifikationsprimern durchgeführt wurde.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die nachzuweisende Nukleinsäure ein Amplifikationsprodukt ist, wobei wenigstens ein Amplifikationsprimer ausgewählt ist aus den Sequenzen mit den SEQ ID No.: 1-176 beziehungsweise komplementär zu diesen Sequenzen ist, beziehungsweise ein Fragment davon darstellt beziehungsweise komplementär zu diesem Fragment ist oder eine dieser Sequenzen beziehungsweise die komplementäre Sequenz enthält.
Verfahren gemäß Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass wenigstens ein Amplifikationsprimer ausgewählt ist aus den Sequenzen mit den SEQ ID No.: 1-18, 171-173 und 55-170 beziehungsweise komplementär zu diesen Sequenzen ist, beziehungsweise ein Fragment davon darstellt beziehungsweise komplementär zu diesem Fragment ist oder eine dieser Sequenzen beziehungsweise die komplementäre Sequenz enthält.
Verfahren gemäß einem Anspruch -, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäuresonden immobilisiert sind.
Verfahren Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass die nachzuweisende Nukleinsäure markiert ist.
Verfahren gemäß einem Anspruch 1-5, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäuresonden markiert sind.
Verfahren zum Nachweis klinisch relevanter Bakterien, – bei welchem eine nachzuweisende Nukleinsäure, welche ein Fragment aus dem Genom eines klinisch relevanten Bakteriums beziehungsweise komplementär zu diesem ist, amplifiziert wird, wobei die Amplifikation mit Primern durchgeführt, von denen mindestens einer eine Sequenz aufweist, die im wesentlichen eine Teilsequenz der nachzuweisenden Nukleinsäure darstellt, – und bei welchem anschließend die amplifizierte nachzuweisende Nukleinsäure detektiert wird, dadurch gekennzeichnet, dass die Sequenz dieses Primer ausgewählt ist aus den Sequenzen mit den SEQ ID No.: 1-176 beziehungsweise komplementär zu diesen Sequenzen ist, beziehungsweise ein Fragment davon darstellt beziehungsweise komplementär zu diesem Fragment ist oder eine dieser Sequenzen beziehungsweise die komplementäre Sequenz enthält.
Verfahren gemäß Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens zwei Primer eine Sequenz aufweisen, die im wesentlichen eine Teilsequenz der nachzuweisenden Nukleinsäure darstellt, wobei die Sequenzen dieser Primer ausgewählt sind aus den Sequenzen mit den SEQ ID No.:1-176 beziehungsweise komplementär zu diesen Sequenzen sind, beziehungsweise ein Fragment davon darstellt beziehungsweise komplementär zu diesem Fragment ist oder eine dieser Sequenzen beziehungsweise die komplementäre Sequenz enthält.
Verfahren gemäß Anspruch 9 oder 10, dadurch gekennzeichnet, dass der bzw. die Primer eine Sequenz aufweisen, die im wesentlichen eine Teilsequenz der nachzuweisenden Nukleinsäure darstellt, wobei die Sequenzen dieser Primer ausgewählt sind aus den Sequenzen mit den SEQ ID No.: 1-18, 171 – 173 und 55-170 beziehungsweise komplementär zu diesen Sequenzen sind, beziehungsweise ein Fragment davon darstellt beziehungsweise komplementär zu diesem Fragment ist oder eine dieser Sequenzen beziehungsweise die komplementäre Sequenz enthält.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 9 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass die Amplifikation mit der Polymerase-Ketten-Reaktion erfolgt.
Verfahren gemäß einer der Ansprüche 9 bis 12 dadurch gekennzeichnet, dass die Primer markiert sind.
Vorrichtung zum Nachweis Klinisch relevanter Bakterien umfassend eine feste Phase, auf der eine oder mehrere sequenz- und/oder speziesspezifische Nukleinsäuresonden immobilisiert sind, dadurch gekennzeichnet, dass die sequenzspezifische Nukleinsäuresonde ausgewählt ist aus den Sequenzen mit den SEQ ID No.: 1-176 beziehungsweise komplementär zu diesen Sequenzen ist, beziehungsweise ein Fragment davon darstellt beziehungsweise komplementär zu diesem Fragment ist oder eine dieser Sequenzen beziehungsweise die komplementäre Sequenz enthält.
Vorrichtung gemäß Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass die sequenzspezifische Nukleinsäuresonde ausgewählt ist aus den Sequenzen mit den SEQ ID No.: 19 -54 und 174 – 176 beziehungsweise komplementär zu diesen Sequenzen ist, beziehungsweise ein Fragment davon darstellt beziehungsweise komplementär zu diesem Fragment ist oder eine dieser Sequenzen beziehungsweise die komplementäre Sequenz enthält.
Vorrichtung gemäß Anspruch 14 oder 15, dadurch gekennzeichnet, dass die sequenzund/oder speziesspezifische Nukleinsäuresonden über einen Linker an die feste Phase der Vorrichtung gebunden ist.
Nukleinsäure welche ausgewählt ist aus den Sequenzen mit den SEQ ID No.: 1 -176 beziehungsweise komplementär zu diesen Sequenzen ist, beziehungsweise ein Fragment davon darstellt, beziehungsweise komplementär zu diesem Fragment ist oder eine dieser Sequenzen beziehungsweise die komplementäre Sequenz enthält.
Kit zum Nachweis klinisch relevanter Bakterien enthaltend eine oder mehrere Nukleinsäuren gemäß Anspruch 17.
Kit zur Amplifikation einer nachzuweisenden Nukleinsäure, welche ein Fragment aus dem Genom eines klinisch relevanten Bakteriums beziehungsweise komplementär zu diesem ist, enthaltend eine oder mehrere Nukleinsäuren gemäß Anspruch 17.
Kit zur Amplifikation einer nachzuweisenden Nukleinsäure, welche ein Fragment aus dem Genom eines Klinisch relevanten Bakteriums beziehungsweise komplementär zu diesem ist, enthaltend eine oder mehrere Nukleinsäuren. ausgewählt aus den Sequenzen mit den SEQ ID No.: 1-18, 171 – 173 und 55-170 beziehungsweise komplementär zu diesen Sequenzen, beziehungsweise ein Fragment davon, beziehungsweise komplementär zu diesem Fragment ist oder eine dieser Sequenzen beziehungsweise die komplementäre Sequenz enthält.
Verwendung der Vorrichtung gemäß einem der Ansprüche 14 bis 16 zum Nachweis Klinisch relevanter Bakterien.
Verwendung der Nukleinsäure gemäß Anspruch 17 beziehungsweise des Kits gemäß einem der Ansprüche 18 bis 20 zum Nachweis klinisch relevanter Bakterien.
DNA-Array umfassend eine feste Phase auf dem Nukleinsäuren immobilisiert sind, wobei die Nukleinsäuren ausgewählt sind aus den Sequenzen mit den SEQ ID No.: 1 -176 beziehungsweise komplementär zu diesen Sequenzen ist, beziehungsweise ein Fragment davon darstellt, beziehungsweise komplementär zu diesem Fragment ist oder eine dieser Sequenzen beziehungsweise die komplementäre Sequenz enthält.
DNA-Array gemäß Anspruch 23, wobei die Nukleinsäuren ausgewählt sind aus den Sequenzen mit den SEQ ID No.: 55-170 beziehungsweise komplementär zu diesen Sequen zen ist, beziehungsweise ein Fragment davon darstellt, beziehungsweise komplementär zu diesem Fragment ist oder eine dieser Sequenzen beziehungsweise die komplementäre Sequenz enthält.