JP3097059B2 - 標的ヌクレオチド配列に対する特異的プローブの生成 - Google Patents
標的ヌクレオチド配列に対する特異的プローブの生成Info
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- JP3097059B2 JP3097059B2 JP02101858A JP10185890A JP3097059B2 JP 3097059 B2 JP3097059 B2 JP 3097059B2 JP 02101858 A JP02101858 A JP 02101858A JP 10185890 A JP10185890 A JP 10185890A JP 3097059 B2 JP3097059 B2 JP 3097059B2
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
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Description
【発明の詳細な説明】 本発明は、生物に対して特異的であり、そして複数の
属又は種間を区別できるDNAプローブを生成するための
方法に関する。
属又は種間を区別できるDNAプローブを生成するための
方法に関する。
サンプル中の生物の同定が重要である多の状況が存在
する。これは、臨床、獣医、食品及び環境的サンプルに
おいて真実である。現在、従来の微生物学的方法（増殖
特徴及び／又は生化学的パラメーターがモニターされ
る）、免疫診断方法又はDNAに基づく方法のいづれかに
よりそのような同定を行なうことが可能である。
する。これは、臨床、獣医、食品及び環境的サンプルに
おいて真実である。現在、従来の微生物学的方法（増殖
特徴及び／又は生化学的パラメーターがモニターされ
る）、免疫診断方法又はDNAに基づく方法のいづれかに
よりそのような同定を行なうことが可能である。
DNAプローブは、WO89/06704及びアメリカ特許第4,85
1,330号に記載されるように生物の同定のために使用さ
れて来た。多くのそのようなプローブは、16S及び23Sリ
ボゾームRNA（rRNA）の一部が種により異なるという観
察〔Woese,Scientific America 244（６）1981を参照の
こと〕に由来する。この情報は初め、系統発生学的分析
のために使用されたが、しかしそれは最近、生物の同定
のためのDNAプローブに基づく方法のために使されてい
る。
1,330号に記載されるように生物の同定のために使用さ
れて来た。多くのそのようなプローブは、16S及び23Sリ
ボゾームRNA（rRNA）の一部が種により異なるという観
察〔Woese,Scientific America 244（６）1981を参照の
こと〕に由来する。この情報は初め、系統発生学的分析
のために使用されたが、しかしそれは最近、生物の同定
のためのDNAプローブに基づく方法のために使されてい
る。
生物の特徴を示すrRNA配列が得られる方法は、初め
に、標記DNAが陽性シグナルを付与し、そして区別され
ることが必要とされる生物が陰性シグナルを付与する特
異的なハイブリダイゼーション実験に依存し、又は両方
の種に共通である配列が排除され、そして対象の生物に
ユニークである配列（特性決定されていなくてもよい）
が保持されるハイブリダイゼーション実験を用いる方法
が液体中で行なわれた。DNAプローブのための標的配列
の終極の種類は、生物の特徴を示すある種の抗原又は生
化学的生成物をコードするゲノムの領域である。
に、標記DNAが陽性シグナルを付与し、そして区別され
ることが必要とされる生物が陰性シグナルを付与する特
異的なハイブリダイゼーション実験に依存し、又は両方
の種に共通である配列が排除され、そして対象の生物に
ユニークである配列（特性決定されていなくてもよい）
が保持されるハイブリダイゼーション実験を用いる方法
が液体中で行なわれた。DNAプローブのための標的配列
の終極の種類は、生物の特徴を示すある種の抗原又は生
化学的生成物をコードするゲノムの領域である。
すべての場合、好結果をもたらすDNAプローブは、対
象の生物中の標的配列を検出するその能力に依存し、対
象の生物にひじょうに関連する又は研究中のサンプルに
存在する可能性のある他の一連の生物にハイブリダイズ
しない。標的DNAへのプローブのハイブリダイゼーショ
ンは、DNA配列及び使用されるハイブリダイゼーション
条件に依存する。２種のひじょうに近い関係の配列の間
の区別を可能にするであろうDNAプローブの条件の選択
のための十分に確立した指針が存在する〔Maniatis,T.,
など．（1982）Cold Spring Harbor Publication〕。DN
Aプローブの目的は、標的のDNA配列が他の生物の配列と
の最大の差異を有する場合、及び研究下の領域のDNA配
列のわかりやすいデータバンクが利用できる場合、最適
化され得る。
象の生物中の標的配列を検出するその能力に依存し、対
象の生物にひじょうに関連する又は研究中のサンプルに
存在する可能性のある他の一連の生物にハイブリダイズ
しない。標的DNAへのプローブのハイブリダイゼーショ
ンは、DNA配列及び使用されるハイブリダイゼーション
条件に依存する。２種のひじょうに近い関係の配列の間
の区別を可能にするであろうDNAプローブの条件の選択
のための十分に確立した指針が存在する〔Maniatis,T.,
など．（1982）Cold Spring Harbor Publication〕。DN
Aプローブの目的は、標的のDNA配列が他の生物の配列と
の最大の差異を有する場合、及び研究下の領域のDNA配
列のわかりやすいデータバンクが利用できる場合、最適
化され得る。
生物のゲノムのセグメントのDNA配列は、組換えDNA方
法を使用する人々により広く使用される種々の技法を用
いてDNAセグメントを単離することによって得られる（M
aniatis,T.,など．前記を参照のこと〕。ポリメラーゼ
鎖反応（PCR）〔Saikiなど．（1985）Science 230 1350
〜1354〕のような方法を用いての対象の領域の増幅の方
法が、最近記載されている。
法を使用する人々により広く使用される種々の技法を用
いてDNAセグメントを単離することによって得られる（M
aniatis,T.,など．前記を参照のこと〕。ポリメラーゼ
鎖反応（PCR）〔Saikiなど．（1985）Science 230 1350
〜1354〕のような方法を用いての対象の領域の増幅の方
法が、最近記載されている。
そのPCR技法は、増幅されるべきDNAセグメントを挾む
２種のオリゴヌクレオチドプライマーを必要とする。DN
Aの熱変性、低温でのそのれらの相補的DNA配列へのプラ
イマーのアニーリング、続く４種のデオキシリボヌクレ
オチドの存在下でのDNAポリマラーゼによるアニールさ
れたプライマー（熱安定性である）の拡張の反復循環
は、さらに操作されるべき特異的DNA配列を十分な量生
ぜしめる。
２種のオリゴヌクレオチドプライマーを必要とする。DN
Aの熱変性、低温でのそのれらの相補的DNA配列へのプラ
イマーのアニーリング、続く４種のデオキシリボヌクレ
オチドの存在下でのDNAポリマラーゼによるアニールさ
れたプライマー（熱安定性である）の拡張の反復循環
は、さらに操作されるべき特異的DNA配列を十分な量生
ぜしめる。
PCR方法の１つの使用において、K.,など．〔FEMS Mic
robiology Letters（1989）57,19〜24〕は、試験される
種々の生物に保存される傾向がある16S rRNA遺伝子の領
域に由来するプライマーを用いてE.コリを増幅した。類
似するアプローチがMedlin,L.,など．〔Gene（1988）7
1,191〜499〕により使用されており、ここで彼らは、系
統発生学的研究のために真核生物のrRNAコード領域を増
幅した。
robiology Letters（1989）57,19〜24〕は、試験される
種々の生物に保存される傾向がある16S rRNA遺伝子の領
域に由来するプライマーを用いてE.コリを増幅した。類
似するアプローチがMedlin,L.,など．〔Gene（1988）7
1,191〜499〕により使用されており、ここで彼らは、系
統発生学的研究のために真核生物のrRNAコード領域を増
幅した。
プローブのための標的配列の選択は現在、次のものを
包含する：（ａ）特異的プローブの供給を可能にするで
あろう十分な種間の相違又は変動の領域の同定及び
（ｂ）好ましくは高い数のコピーで生物に存在する標
的。rRNA遺伝子生成物（16S及び23S）は、これらの両方
の基準を満たし、そしてそれ自体、多くの研究のための
標的であり、そして事実、これらの領域に向けられるDN
Aプローブキットがいくつかの生物のために商業的に利
用できる。異なった属からのrRNA遺伝子間のデータの比
較が行なわれ、そしてこれらは隣接するより保存された
領域を端に有する遺伝子内の可変領域のパターンを強調
した。
包含する：（ａ）特異的プローブの供給を可能にするで
あろう十分な種間の相違又は変動の領域の同定及び
（ｂ）好ましくは高い数のコピーで生物に存在する標
的。rRNA遺伝子生成物（16S及び23S）は、これらの両方
の基準を満たし、そしてそれ自体、多くの研究のための
標的であり、そして事実、これらの領域に向けられるDN
Aプローブキットがいくつかの生物のために商業的に利
用できる。異なった属からのrRNA遺伝子間のデータの比
較が行なわれ、そしてこれらは隣接するより保存された
領域を端に有する遺伝子内の可変領域のパターンを強調
した。
関連する種が比較される場合、その“可変”領域は時
折りひじょうに類似する〔例２）を参照のこと〕（同一
ではない）ことが見出された。これは、正しいプローブ
配列及び適切なハイブリダイゼーション条件の選択又は
高い変動性が存在する微生物のゲノムの領域の同定を可
能にする生物のカタログからの配列データを得る方法の
必要性を強調する。
折りひじょうに類似する〔例２）を参照のこと〕（同一
ではない）ことが見出された。これは、正しいプローブ
配列及び適切なハイブリダイゼーション条件の選択又は
高い変動性が存在する微生物のゲノムの領域の同定を可
能にする生物のカタログからの配列データを得る方法の
必要性を強調する。
すばやく且つ有用な態様でプローブ及びハイブリダイ
ゼーション条件の選択のためのDNAデータベースを提供
するために使用され得る、DNA配列を得るための方法を
提供することが本発明の目的である。
ゼーション条件の選択のためのDNAデータベースを提供
するために使用され得る、DNA配列を得るための方法を
提供することが本発明の目的である。
生物間の高度の多様性を含む新しい標的領域を同定
し、そして臨床医、獣医、食品技術者及び環境問題研究
者に対象の多くの種類の生物に対する特異的DNAプロー
ブを生成することがさらに本発明の目的である。
し、そして臨床医、獣医、食品技術者及び環境問題研究
者に対象の多くの種類の生物に対する特異的DNAプロー
ブを生成することがさらに本発明の目的である。
従って、本発明は、同定されるべき生物に対して特異
的であり、そして複数の属又は種の間を区別できるDNA
プローブを生成するための方法を提供し、そして該方法
は、系統発生的に関連する多くの生物のゲノムの可変領
域、又は同定され、そしてそのゲノム中に前記可変領域
を有する前記生物を含む一定のサンプルに存在すると思
われる多くの生物のゲノムの可変領域を、一対のオリゴ
ヌクレオチドプライマー（該プライマーの少なくとも１
つは、既知であり又は前記生物に保持されていると思わ
れるDNA配列に対応する）を用いて増幅し、この増幅さ
れた領域の配列を決定し、前記他の増幅された領域との
比較により、同定されるべき前記生物に対して特異的な
プローブを生成するために前記配列又はその一部を選択
し、そして選択されたプローブの正確なヌクレオチド配
列に基づいて特異的シグナルを得るために必要とされる
ハイブリダイゼーション条件を定義することを含んで成
る。
的であり、そして複数の属又は種の間を区別できるDNA
プローブを生成するための方法を提供し、そして該方法
は、系統発生的に関連する多くの生物のゲノムの可変領
域、又は同定され、そしてそのゲノム中に前記可変領域
を有する前記生物を含む一定のサンプルに存在すると思
われる多くの生物のゲノムの可変領域を、一対のオリゴ
ヌクレオチドプライマー（該プライマーの少なくとも１
つは、既知であり又は前記生物に保持されていると思わ
れるDNA配列に対応する）を用いて増幅し、この増幅さ
れた領域の配列を決定し、前記他の増幅された領域との
比較により、同定されるべき前記生物に対して特異的な
プローブを生成するために前記配列又はその一部を選択
し、そして選択されたプローブの正確なヌクレオチド配
列に基づいて特異的シグナルを得るために必要とされる
ハイブリダイゼーション条件を定義することを含んで成
る。
本発明の方法は、ひじょうに近い関連する生物間を区
別できるDNAプローブの生成を可能にする。従って、本
発明の方法は、たった２個の塩基が与えられた遺伝子座
で異なる生物間をこの後記載されるようにして区別する
ことができる。
別できるDNAプローブの生成を可能にする。従って、本
発明の方法は、たった２個の塩基が与えられた遺伝子座
で異なる生物間をこの後記載されるようにして区別する
ことができる。
本発明の方法は、与えられた生物のゲノムの可変領域
に対するDNAプローブの生成において普遍的な適用を有
する。オリゴヌクレオチドプライマーは、前記可変領域
又はその一部に隣接する保存された領域又はその一部の
DNA配列に対応する。
に対するDNAプローブの生成において普遍的な適用を有
する。オリゴヌクレオチドプライマーは、前記可変領域
又はその一部に隣接する保存された領域又はその一部の
DNA配列に対応する。
本発明の方法は、サンプルに存在すると思われる多く
の生物についての領域のためのDNA配列データバンクを
すばやく確立し、そしてプローブの配列及びそれが他の
生物のものと異なる程度により決定されるハイブリダイ
ゼーション条件下で対象の生物を同定するであろうDNA
プローブフラグメントを得ることによって、ゲノムの未
知領域の標的を定めるために使用され得る。本発明の方
法は、DNAプローブとして有用な配列を同定するために
存在する方法以上の有意な改良点を表わす。
の生物についての領域のためのDNA配列データバンクを
すばやく確立し、そしてプローブの配列及びそれが他の
生物のものと異なる程度により決定されるハイブリダイ
ゼーション条件下で対象の生物を同定するであろうDNA
プローブフラグメントを得ることによって、ゲノムの未
知領域の標的を定めるために使用され得る。本発明の方
法は、DNAプローブとして有用な配列を同定するために
存在する方法以上の有意な改良点を表わす。
DNAプロービングのための遺伝子座としての16S rRNA
遺伝子は、いくらかの場合において不適切性であるの
で、DNAプローブのための情報を与える標的を供給する
それらの能力のための他のゲノム領域を分析するために
本発明の方法の普遍性を利用して来た。初めに、最っと
も少なく保存される傾向がある領域が調べられた。この
考慮は、遺伝子間スペーサー、すなわち機能的な遺伝子
間スペーサーであるゲノムのこれらの領域に、それらの
領域を保存するために最小の進化的な圧力が存在すべき
であるように注意を向ける。
遺伝子は、いくらかの場合において不適切性であるの
で、DNAプローブのための情報を与える標的を供給する
それらの能力のための他のゲノム領域を分析するために
本発明の方法の普遍性を利用して来た。初めに、最っと
も少なく保存される傾向がある領域が調べられた。この
考慮は、遺伝子間スペーサー、すなわち機能的な遺伝子
間スペーサーであるゲノムのこれらの領域に、それらの
領域を保存するために最小の進化的な圧力が存在すべき
であるように注意を向ける。
E.コリ〔Brosiusなど.,J.Mol.Biol.148 107〜127（19
81）〕、ストレプトマイセス リビダンス（Streptomyc
es lividans及びマイコバクテリウムボビスBCG〔Suzuki
など.J.Bact.170 2886〜2889（1988）〕及びバシラス
サズチリス〔Greenなど.Gene 37,261〜266（1985）〕に
ついての16S及び23S rRNA間の遺伝子間領域に対する公
開されたデータが存在する。これらの配列の研究は、こ
れらの無関係な属間に高い変動性が存在することを示し
た。
81）〕、ストレプトマイセス リビダンス（Streptomyc
es lividans及びマイコバクテリウムボビスBCG〔Suzuki
など.J.Bact.170 2886〜2889（1988）〕及びバシラス
サズチリス〔Greenなど.Gene 37,261〜266（1985）〕に
ついての16S及び23S rRNA間の遺伝子間領域に対する公
開されたデータが存在する。これらの配列の研究は、こ
れらの無関係な属間に高い変動性が存在することを示し
た。
本発明の１つの観点において、可変領域は遺伝子間可
変領域であり、そしてそのプライマーは、前記遺伝子間
領域を挾む保存された領域又はその一部に対応する。従
って、例として、プライマーの１つは16S rRNA遺伝子の
保存された領域に対応し、そして他のプライマーは23S
rRNA遺伝子の保存された領域に対応することができる。
変領域であり、そしてそのプライマーは、前記遺伝子間
領域を挾む保存された領域又はその一部に対応する。従
って、例として、プライマーの１つは16S rRNA遺伝子の
保存された領域に対応し、そして他のプライマーは23S
rRNA遺伝子の保存された領域に対応することができる。
他方、プライマーの１つは、16S rRNA遺伝子の保存さ
れた３′末端に対応し、そして他のプライマーは23S rR
NA遺伝子の保存された５′末端に対応することができ
る。
れた３′末端に対応し、そして他のプライマーは23S rR
NA遺伝子の保存された５′末端に対応することができ
る。
プライマーは、16S及び23S遺伝子のための利用できる
配列データに由来することができる。そのようなプライ
マーが本発明に従って、PCR技法に用いて増幅される場
合、いくらかの情況において、その増幅された（遺伝子
間）領域は、この後記載されるように大きさが異なり、
たとえば種間で異なる。
配列データに由来することができる。そのようなプライ
マーが本発明に従って、PCR技法に用いて増幅される場
合、いくらかの情況において、その増幅された（遺伝子
間）領域は、この後記載されるように大きさが異なり、
たとえば種間で異なる。
そのような増幅された領域をDNA配列決定することに
よって、一連の微生物に対する追加の詳細な情報（ひじ
ょうに関連する生物間を区別することができるDNAプロ
ーブの調製を可能にする）が得られた。
よって、一連の微生物に対する追加の詳細な情報（ひじ
ょうに関連する生物間を区別することができるDNAプロ
ーブの調製を可能にする）が得られた。
16S及び23S遺伝子の間の遺伝子間領域は、例１に使用
される標的であるけれども、機能的な遺伝子の既知配列
により結合される他の遺伝子間領域もまた、本発明のDN
Aプローブのための標的として使用され得る。
される標的であるけれども、機能的な遺伝子の既知配列
により結合される他の遺伝子間領域もまた、本発明のDN
Aプローブのための標的として使用され得る。
本発明の方法においては、他の生物、たとえばE.コリ
からの既知配列の保存された領域が、個々の前記プライ
マーを生成するために使用され得る。最良の適合した配
列は、個々のプライマーを生成するために多くの生物か
らの既知配列に由来することができる。
からの既知配列の保存された領域が、個々の前記プライ
マーを生成するために使用され得る。最良の適合した配
列は、個々のプライマーを生成するために多くの生物か
らの既知配列に由来することができる。
増幅は、PCR技法により好ましくは実施され得る。使
用されるポリマラーゼは好ましくは、熱安定性ポリマラ
ーゼ、たとえばテルマス アクアチカス（Thermus aqua
ticus）（Taq）の酵素である。本発明のDNAプローブの
ための標的配列として同定された生物のゲノムの領域
は、好ましくはPCR増幅法以外の方法を用いて単離され
得る。
用されるポリマラーゼは好ましくは、熱安定性ポリマラ
ーゼ、たとえばテルマス アクアチカス（Thermus aqua
ticus）（Taq）の酵素である。本発明のDNAプローブの
ための標的配列として同定された生物のゲノムの領域
は、好ましくはPCR増幅法以外の方法を用いて単離され
得る。
増幅後、及び配列決定の前、その増幅されたヌクレオ
チド配列は、適切なベクターに連結され、次に前記ベク
ターにより適切な宿主生物が形質転換される。それによ
って、増幅された配列が、より容易に利用できるように
供給される。
チド配列は、適切なベクターに連結され、次に前記ベク
ターにより適切な宿主生物が形質転換される。それによ
って、増幅された配列が、より容易に利用できるように
供給される。
他方、増幅の後、増幅された配列又はその一部は、ヌ
クレオチドプローブとして使用するために化学的に合成
され得る。いづれかの情況において、可変領域のDNA配
列は、ジデオキシ方法〔Sanger,F.など.Proc.Natl.Aca
d.Sci.（1977）74,5463〜5467〕のような方法を用いて
確立される。その得られる配列は、生物のためのプロー
ブの選択を導びくために使用され、そして最とも適切な
配列が選択される。
クレオチドプローブとして使用するために化学的に合成
され得る。いづれかの情況において、可変領域のDNA配
列は、ジデオキシ方法〔Sanger,F.など.Proc.Natl.Aca
d.Sci.（1977）74,5463〜5467〕のような方法を用いて
確立される。その得られる配列は、生物のためのプロー
ブの選択を導びくために使用され、そして最とも適切な
配列が選択される。
増幅のために使用されるDNAはオートクレーブされた
サンプルからのものである。これは、サンプルの容易な
保存及び実験室の研究者のための高い安全性を可能にす
るように、特に有用である。
サンプルからのものである。これは、サンプルの容易な
保存及び実験室の研究者のための高い安全性を可能にす
るように、特に有用である。
標的生物は、適切には微生物である。たとえば、それ
らの生物は、アエロモナス、バシラス、クロストリジウ
ム、エンテロコーカス、エスシリシア、クレブシエラ、
マイコバクテリウム、プスードモナス、サルモネラ、セ
ラチア、スタフィロコーカス又はストレプトコーカスの
種から選択され得る。これらの種間の特定の微生物種
は、アエロモナス カビアエ（Aeromonas caviae）、ア
エロモナス ヒドロフィラ（Aeromonas hydrophila）、
アエロモナス メジア（Aeromonas media）、アエロモ
ナス サルモニシダ（Aeromonas salmonicida）、アエ
ロモナス ソブリア（Aeromonas sobria）、バシラス
サブチリス（Bacillus subtilis）、クロストリジウム
ブチリカム（Clostridium butyricum）、クロストリ
ジウム ジフィシル（Clostridium difficile）、クロ
ストリジウム パステウリアナム（Clostridium pasteu
rianum）、クロストリジウム ペルフリンゲンス（Clos
tridium perfringens）、クロストリジウム チロブチ
リカム（Clostridium tyrobutyricum）、エスシリシア
コリ（Eschericia coli）、エンテロコーカス ファエ
カリス（Enterococcus faecalis）、クレブシエラ プ
ネウモニアエ（Klebsiella pneumoniae）、マイコバク
テリウム アビウム（Mycobacterium avium）、マイコ
バクテリウム ボビス（Mycobacterium bovis）、マイ
コバクテリウム ツベルキュロシス（Mycobacterium tu
berculosis）、プスードモナス アエロギノサ（Pseudo
monas aeroginosa）、プスードモナス フルオレスセン
ス（Pseudomonas fluorescens）、サルモネラ チピム
リウム（Salmonella typhimurium）、セラチア メルセ
スカンス（Serratia mercescans）、スタフィロコーカ
ス アウレウス（Staphylococcus aureus）及びストレ
プトコーカス ピオゲンス（Streptococcus pyogenes）
を包含する。
らの生物は、アエロモナス、バシラス、クロストリジウ
ム、エンテロコーカス、エスシリシア、クレブシエラ、
マイコバクテリウム、プスードモナス、サルモネラ、セ
ラチア、スタフィロコーカス又はストレプトコーカスの
種から選択され得る。これらの種間の特定の微生物種
は、アエロモナス カビアエ（Aeromonas caviae）、ア
エロモナス ヒドロフィラ（Aeromonas hydrophila）、
アエロモナス メジア（Aeromonas media）、アエロモ
ナス サルモニシダ（Aeromonas salmonicida）、アエ
ロモナス ソブリア（Aeromonas sobria）、バシラス
サブチリス（Bacillus subtilis）、クロストリジウム
ブチリカム（Clostridium butyricum）、クロストリ
ジウム ジフィシル（Clostridium difficile）、クロ
ストリジウム パステウリアナム（Clostridium pasteu
rianum）、クロストリジウム ペルフリンゲンス（Clos
tridium perfringens）、クロストリジウム チロブチ
リカム（Clostridium tyrobutyricum）、エスシリシア
コリ（Eschericia coli）、エンテロコーカス ファエ
カリス（Enterococcus faecalis）、クレブシエラ プ
ネウモニアエ（Klebsiella pneumoniae）、マイコバク
テリウム アビウム（Mycobacterium avium）、マイコ
バクテリウム ボビス（Mycobacterium bovis）、マイ
コバクテリウム ツベルキュロシス（Mycobacterium tu
berculosis）、プスードモナス アエロギノサ（Pseudo
monas aeroginosa）、プスードモナス フルオレスセン
ス（Pseudomonas fluorescens）、サルモネラ チピム
リウム（Salmonella typhimurium）、セラチア メルセ
スカンス（Serratia mercescans）、スタフィロコーカ
ス アウレウス（Staphylococcus aureus）及びストレ
プトコーカス ピオゲンス（Streptococcus pyogenes）
を包含する。
本発明はまた、前記方法により得られる特異的プロー
ブもまた供給する。
ブもまた供給する。
本発明に従って標的を定められた可変領域は、16S rR
NAをコードする遺伝子のV2又はV6領域である。V2及びV6
領域は、種間の最っとも相同差異が時折り観察される２
種の十分に特徴化された可変領域である。本発明の方法
に従ってV2及びV6領域を用いて、２種の異なったプロー
ブが、対象の生物のために生成され得る。
NAをコードする遺伝子のV2又はV6領域である。V2及びV6
領域は、種間の最っとも相同差異が時折り観察される２
種の十分に特徴化された可変領域である。本発明の方法
に従ってV2及びV6領域を用いて、２種の異なったプロー
ブが、対象の生物のために生成され得る。
本発明は、16S rRNA及び23S rRNAをコードする遺伝子
に介在する遺伝子間可変領域から得られ、そして下記ヌ
クレオチド配列又はそれへの相補的配列に由来する種々
のプローブを供給する： 上記特別に言及されたプローブは、本発明の方法に従
って生成され得る特異的プローブのいくつかの例であ
る。
に介在する遺伝子間可変領域から得られ、そして下記ヌ
クレオチド配列又はそれへの相補的配列に由来する種々
のプローブを供給する： 上記特別に言及されたプローブは、本発明の方法に従
って生成され得る特異的プローブのいくつかの例であ
る。
翻訳されていないDNAプローブ（すなわち高いコピー
数）の第二必要条件を満足せしめるためには、転写され
た領域が分析のために選択された。なぜならば、これら
は、翻訳されるべきであるメッセンジャーRNAの役割以
外の機能的役割を満たすからである。リボソーム遺伝子
の遺伝子間領域の有用性のために、他の遺伝子間領域
が、DNAプローブのための適切な標的として調べられ
た。
数）の第二必要条件を満足せしめるためには、転写され
た領域が分析のために選択された。なぜならば、これら
は、翻訳されるべきであるメッセンジャーRNAの役割以
外の機能的役割を満たすからである。リボソーム遺伝子
の遺伝子間領域の有用性のために、他の遺伝子間領域
が、DNAプローブのための適切な標的として調べられ
た。
関連する属及び種を区別できるプローブの定義を可能
にするために、本発明の完全にされた方法を用いて、ひ
じょうに関連する生物のためのDNAをすばやく定義した
（例２を参照のこと）。16S rRNAの遺伝子間領域が標的
を定められる方法の１つの例示において、２個の塩基に
よってのみ異なる配列が区別されるプローブ／ハイブリ
ダイゼーション条件が定義される。
にするために、本発明の完全にされた方法を用いて、ひ
じょうに関連する生物のためのDNAをすばやく定義した
（例２を参照のこと）。16S rRNAの遺伝子間領域が標的
を定められる方法の１つの例示において、２個の塩基に
よってのみ異なる配列が区別されるプローブ／ハイブリ
ダイゼーション条件が定義される。
本発明の方法の一般的な有用性を示すために、E.コリ
からの利用できるDNA配列を用いて、広範囲のグラム陽
性、グラム陰性、好気性及び嫌気性生物のためのプライ
マーを供給した。
からの利用できるDNA配列を用いて、広範囲のグラム陽
性、グラム陰性、好気性及び嫌気性生物のためのプライ
マーを供給した。
16S rRNAをコードする遺伝子の可変領域が種−特異的
プローブの基本であるが、本発明のPCRのためのプライ
マーとしての不変領域の使用は、配列又はハイブリダイ
ゼーション分析が行なわれなかった種からの16S rRNAを
コードする遺伝子のその部分のすばやい単離を可能にす
る。増幅された領域の続くDNA配列決定は、研究下の生
物の可変部に対する情報を付与し、そしてこれは定義さ
れた条件下での続く実験においてDNAプローブとして使
用され得る。
プローブの基本であるが、本発明のPCRのためのプライ
マーとしての不変領域の使用は、配列又はハイブリダイ
ゼーション分析が行なわれなかった種からの16S rRNAを
コードする遺伝子のその部分のすばやい単離を可能にす
る。増幅された領域の続くDNA配列決定は、研究下の生
物の可変部に対する情報を付与し、そしてこれは定義さ
れた条件下での続く実験においてDNAプローブとして使
用され得る。
本発明は、16S rRNAをコードする遺伝子のV2可変領域
から得られ、そして下記ヌクレオチド配列又はそれへの
相補的配列に由来する種々のプローブを供給する： 本発明はまた、16S rRNAをコードする遺伝子のV6可変
領域から得られ、そして下記ヌクレオチド配列又はそれ
への相補的配列に由来する種々のプローブを供給する： 上記に特別に言及されたプローブは、本発明の方法に
従って生成され得る特異的プローブのいくつかの追加の
例である。
から得られ、そして下記ヌクレオチド配列又はそれへの
相補的配列に由来する種々のプローブを供給する： 本発明はまた、16S rRNAをコードする遺伝子のV6可変
領域から得られ、そして下記ヌクレオチド配列又はそれ
への相補的配列に由来する種々のプローブを供給する： 上記に特別に言及されたプローブは、本発明の方法に
従って生成され得る特異的プローブのいくつかの追加の
例である。
この後、例２及び上記に提供されるデータは、16S rR
NA遺伝子の遺伝子間領域における配列に基づかれた。翻
訳のための鋳型の役割以外の機能的な役割を有する他の
RNA分子もまた、高いコピー数で存在するRNAに対する特
異的プローブの生成のための標的部位として有用であ
る。そのような転写されているが、しかし場合によって
は、翻訳された遺伝子領域の例は、リボヌクレアーゼＰ
成分RNA（M1）である。公開されたデータ〔Bryan,D.Jam
esなど．（1988）Cell 52,19〜26〕の研究は、このRNA
内に可変領域が存在することを示した。効果的なプライ
マーが、これらの可変領域の増幅を可能にするであろう
利用できるデータから調製され得ることが示された（例
３）。本発明の方法を用いて、増幅された領域のDNA配
列のパネルを導びくことができ、そして本発明に従って
特定された方法を用いて、得られるDNA配列の比較に基
づいてのDNAプローブを開発することができる。
NA遺伝子の遺伝子間領域における配列に基づかれた。翻
訳のための鋳型の役割以外の機能的な役割を有する他の
RNA分子もまた、高いコピー数で存在するRNAに対する特
異的プローブの生成のための標的部位として有用であ
る。そのような転写されているが、しかし場合によって
は、翻訳された遺伝子領域の例は、リボヌクレアーゼＰ
成分RNA（M1）である。公開されたデータ〔Bryan,D.Jam
esなど．（1988）Cell 52,19〜26〕の研究は、このRNA
内に可変領域が存在することを示した。効果的なプライ
マーが、これらの可変領域の増幅を可能にするであろう
利用できるデータから調製され得ることが示された（例
３）。本発明の方法を用いて、増幅された領域のDNA配
列のパネルを導びくことができ、そして本発明に従って
特定された方法を用いて、得られるDNA配列の比較に基
づいてのDNAプローブを開発することができる。
本発明は、可変領域（遺伝子間又は遺伝子内である）
の分析を可能にし、そして選択されたDNAに選択された
条件下で特異的にハイブリダイズするであろうDNAプロ
ーブの供給を可能にする。
の分析を可能にし、そして選択されたDNAに選択された
条件下で特異的にハイブリダイズするであろうDNAプロ
ーブの供給を可能にする。
非実験的な方法でのいづれか特定のプローブのための
適切なハイブリダイゼーション条件の選択は、本発明の
方法に固有である。ハイブリダイゼーション条件は、こ
の後、例でさらに記載されるようにひじょうに関連する
種の配列と選択される配列とを区別するために、安定し
たハイブリダイゼーションのためのそれ自体既知の方法
で決定され得るプローブの正確なヌクレオチド配列に基
づいて選択される。いづれか与えられた情況における最
適なハイブリダイゼーションのために選択される生化学
的及び物理的なパラメーターは、ハイブリダイゼーショ
ンに関与するA:T対:G:C対の比に基づかれ、そして従っ
て、ハイブリダイゼーション媒体の温度及び塩濃度を主
に変性する。最適なハイブリダイゼーション条件の決定
は、増幅された配列と利用できる又は新たに創造された
データバンクにおけるひじょうに関連する配列との比較
を包含する。従って、本発明の方法は、最適且つ調整さ
れたハイブリダイゼーション条件の決定による高められ
た感度及び生物のゲノムのいづれかの領域に対して適切
な種特異的プローブの生成による特異性の両者を有す
る。
適切なハイブリダイゼーション条件の選択は、本発明の
方法に固有である。ハイブリダイゼーション条件は、こ
の後、例でさらに記載されるようにひじょうに関連する
種の配列と選択される配列とを区別するために、安定し
たハイブリダイゼーションのためのそれ自体既知の方法
で決定され得るプローブの正確なヌクレオチド配列に基
づいて選択される。いづれか与えられた情況における最
適なハイブリダイゼーションのために選択される生化学
的及び物理的なパラメーターは、ハイブリダイゼーショ
ンに関与するA:T対:G:C対の比に基づかれ、そして従っ
て、ハイブリダイゼーション媒体の温度及び塩濃度を主
に変性する。最適なハイブリダイゼーション条件の決定
は、増幅された配列と利用できる又は新たに創造された
データバンクにおけるひじょうに関連する配列との比較
を包含する。従って、本発明の方法は、最適且つ調整さ
れたハイブリダイゼーション条件の決定による高められ
た感度及び生物のゲノムのいづれかの領域に対して適切
な種特異的プローブの生成による特異性の両者を有す
る。
本発明の方法は、生物の種々の種の検出のためのDNA
プローブ及び与えられた属の多くのメンバーを検出する
ことができるプローブの生成を提供する。本発明は、生
物における標的部位のより一般的な例示を提供し、そし
て従って、DNAプローブのための現在の標的及びDNAプロ
ーブ配列の論理的且つデータベース的選択並びにそれら
が使用されるべきであるハイブリダイゼーションの条件
の改良点を示す。
プローブ及び与えられた属の多くのメンバーを検出する
ことができるプローブの生成を提供する。本発明は、生
物における標的部位のより一般的な例示を提供し、そし
て従って、DNAプローブのための現在の標的及びDNAプロ
ーブ配列の論理的且つデータベース的選択並びにそれら
が使用されるべきであるハイブリダイゼーションの条件
の改良点を示す。
本発明の方法に従って得られるプローブは、標的配列
に相補的な配列を有するプローブと生物とを接触するこ
とによって、標的ヌクレオチド配列を含む又は含むと思
われる生物の検出及び／又は決定のために使用され得
る。
に相補的な配列を有するプローブと生物とを接触するこ
とによって、標的ヌクレオチド配列を含む又は含むと思
われる生物の検出及び／又は決定のために使用され得
る。
上記プローブの適用は、多くの情況において有益なも
のであろう。たとえばマイコバクテリウム ボビスのた
めのプローブは、家畜（又は他の種）におけるこの生物
の存在のために非主観的試験を提供するであろう。現
在、ウシT.B.は、いくつかのヨーロッパの国々において
及びひじょうに多くの進行国において主な経済的重要な
病気である。マイコバクテリウム ツベルキュロシスの
ためのプローブの解説は、ヒトにおけるこのやっかいな
生物の検出を可能にし（現在、それは臨床的に陽性の患
者の50％に標準の微生物学的方法により検出されな
い）、そしてこれは、完全に進行したAIDSを有する人の
約20％に存在するので、重要なものになっている。
のであろう。たとえばマイコバクテリウム ボビスのた
めのプローブは、家畜（又は他の種）におけるこの生物
の存在のために非主観的試験を提供するであろう。現
在、ウシT.B.は、いくつかのヨーロッパの国々において
及びひじょうに多くの進行国において主な経済的重要な
病気である。マイコバクテリウム ツベルキュロシスの
ためのプローブの解説は、ヒトにおけるこのやっかいな
生物の検出を可能にし（現在、それは臨床的に陽性の患
者の50％に標準の微生物学的方法により検出されな
い）、そしてこれは、完全に進行したAIDSを有する人の
約20％に存在するので、重要なものになっている。
アエロモナス サルモニシダのためのプローブは、フ
ルンケル症を引き起こすこの病原体の環境及び魚におけ
る検出を可能にし、そしてこの病原体はサケの養殖産業
において主な経済的損失である。ひじょうに関連する生
物アエロモナス ヒドロフィラ（このためのプローブも
また記載される）は、食品に存在する場合、下痢及び胃
腸炎を引き起こす。最後に、これらのプローブの有用性
の追加の例として、種々のクロストリジア属（たとえば
クロストリジウム ジフィシル）は、臨床的分析又は食
品産業において有用なものである。
ルンケル症を引き起こすこの病原体の環境及び魚におけ
る検出を可能にし、そしてこの病原体はサケの養殖産業
において主な経済的損失である。ひじょうに関連する生
物アエロモナス ヒドロフィラ（このためのプローブも
また記載される）は、食品に存在する場合、下痢及び胃
腸炎を引き起こす。最後に、これらのプローブの有用性
の追加の例として、種々のクロストリジア属（たとえば
クロストリジウム ジフィシル）は、臨床的分析又は食
品産業において有用なものである。
本発明は、生物の混合物における特定の生物を検出す
るための方法をさらに提供し、該方法とは、前記特定の
生物の２種の選択されたヌクレオチド領域の配列（該配
列の少なくとも１つは、前記生物のヌクレオチド可変領
域からのものである）を、前記特定された方法に示され
た一連の段階により決定し、そして前記生物の特異的ヌ
クレオチド領域を選択的に増幅するための一対のプライ
マーを生成するために前記配列決定された領域を用い、
そしてそれによって前記特定の生物を検出することを含
んで成る。生物は、適切には、特別に前記で言及された
ものの中のいづれかの１種である。
るための方法をさらに提供し、該方法とは、前記特定の
生物の２種の選択されたヌクレオチド領域の配列（該配
列の少なくとも１つは、前記生物のヌクレオチド可変領
域からのものである）を、前記特定された方法に示され
た一連の段階により決定し、そして前記生物の特異的ヌ
クレオチド領域を選択的に増幅するための一対のプライ
マーを生成するために前記配列決定された領域を用い、
そしてそれによって前記特定の生物を検出することを含
んで成る。生物は、適切には、特別に前記で言及された
ものの中のいづれかの１種である。
上記方法は、好ましくは、生物の遺伝子の２種の選択
された可変領域の配列を決定し、そして前記遺伝子の特
異的可変領域を選択的に増幅するための一対のプライマ
ーを生成するために前記配列決定された領域を用い、そ
してそれによって、前記特定の生物のための種特異的プ
ローブを生成し、又は増幅生成物を検出することを含ん
で成る。
された可変領域の配列を決定し、そして前記遺伝子の特
異的可変領域を選択的に増幅するための一対のプライマ
ーを生成するために前記配列決定された領域を用い、そ
してそれによって、前記特定の生物のための種特異的プ
ローブを生成し、又は増幅生成物を検出することを含ん
で成る。
従って、たとえばrRNA遺伝子の可変部分のほとんどの
可変領域からのDNA配列を得ることができる。これらの
可変領域の２種の領域が得られる場合、それらは、対象
の特定の生物のためのひじょうに特異的なプライマーと
して作用することができる。好ましくは、このようにし
て生成されるプライマーは、前記のようなプローブと同
等のものである。
可変領域からのDNA配列を得ることができる。これらの
可変領域の２種の領域が得られる場合、それらは、対象
の特定の生物のためのひじょうに特異的なプライマーと
して作用することができる。好ましくは、このようにし
て生成されるプライマーは、前記のようなプローブと同
等のものである。
他方、上記のような１つの種特異的プライマー及び一
定の又は保存された領域プライマーの組合せは、対象の
種を特異的に増幅するために組合して使用され得る。
定の又は保存された領域プライマーの組合せは、対象の
種を特異的に増幅するために組合して使用され得る。
上記方法での対象の種の選択的増幅は、種に対して特
異的なプローブの使用によりさらに確保され得る。たと
えば、次の特定の生物、アエロモナス サルモニシダ、
アエロモナス ヒドロフィラ、クロストリジウム ジフ
ィシル、クロストリジウム ペルフリンゲンス、スタフ
ィロコーカス アウレウス、クレブシエラ プネウモニ
アエ、プスードモナス フルオレスセンス、マイコバク
テリウム ボビス及びサルモネラ チピムリウムの場
合、V2/V6のためのプローブは、第3a又は3b表に与えら
れる適切な可変領域のための配列を比較することによっ
て容易に同定され得る。
異的なプローブの使用によりさらに確保され得る。たと
えば、次の特定の生物、アエロモナス サルモニシダ、
アエロモナス ヒドロフィラ、クロストリジウム ジフ
ィシル、クロストリジウム ペルフリンゲンス、スタフ
ィロコーカス アウレウス、クレブシエラ プネウモニ
アエ、プスードモナス フルオレスセンス、マイコバク
テリウム ボビス及びサルモネラ チピムリウムの場
合、V2/V6のためのプローブは、第3a又は3b表に与えら
れる適切な可変領域のための配列を比較することによっ
て容易に同定され得る。
好ましくは、本発明の方法は、最少の装置及び前記よ
りも少ない操作を含む“ワン−チューブ（one−tub
e）”方法であり得る。従って、本発明は、DNA調製及び
増幅が単一のチューブで行なわれる、前記特定されたい
づれかの方法を提供する。
りも少ない操作を含む“ワン−チューブ（one−tub
e）”方法であり得る。従って、本発明は、DNA調製及び
増幅が単一のチューブで行なわれる、前記特定されたい
づれかの方法を提供する。
本発明の方法は、動物、植物及び微生物に適用され得
る。好ましくは、本発明で調製されたプローブは、種々
の用途のためのバイオセンサーとして使用され得る。
る。好ましくは、本発明で調製されたプローブは、種々
の用途のためのバイオセンサーとして使用され得る。
本発明は、次の例によりさらに例示されるであろう。
例１ 微生物からDNAの単離及びPCR増幅のための一般的方法：
遺伝子間領域に適用される方法の例示 新鮮な培養物50μ（105〜10個の細菌）を、ベンチ
トップ遠心分離器により１分間、10,000r.p.m.で遠心分
離することによってペレット化し、そして上清液を捨て
た。細菌培養物は、Department of Microbiology,Unive
rsity College Galway,Ireland,University College Ho
spital,Galway,Ireland及びVeterinary College,Univer
sity College Dublin,Irelandの種々の実験室から得ら
れた。次に、ペレットを、水25μ中に再懸濁した。サ
ンプルを、750μのEppendorf管中において95℃で10分
間加熱し、すばやく遠心分離し、管のふたから凝集物を
除き、そして次に、55℃で15分間、プロテイナーゼＫ
（50μg/mlの濃度で）の存在下でインキュベートした。
次に、プロテイナーゼＫを95℃で15分間、変性せしめ
た。凝集物を再びEppendorfふたからすばやい遠心分離
により除き、そしてDNアーゼフリーRNアーゼＡ（Sigm
a）を添加し、最終濃度を10μg/mlにし、そして37℃で1
5分間インキュベートし、RNAを変性せしめた。これらの
インキュベーション及び反応は、Perkin−Elmer−Cetus
−Thermo−サイクラーを用いて行なわれた。
遺伝子間領域に適用される方法の例示 新鮮な培養物50μ（105〜10個の細菌）を、ベンチ
トップ遠心分離器により１分間、10,000r.p.m.で遠心分
離することによってペレット化し、そして上清液を捨て
た。細菌培養物は、Department of Microbiology,Unive
rsity College Galway,Ireland,University College Ho
spital,Galway,Ireland及びVeterinary College,Univer
sity College Dublin,Irelandの種々の実験室から得ら
れた。次に、ペレットを、水25μ中に再懸濁した。サ
ンプルを、750μのEppendorf管中において95℃で10分
間加熱し、すばやく遠心分離し、管のふたから凝集物を
除き、そして次に、55℃で15分間、プロテイナーゼＫ
（50μg/mlの濃度で）の存在下でインキュベートした。
次に、プロテイナーゼＫを95℃で15分間、変性せしめ
た。凝集物を再びEppendorfふたからすばやい遠心分離
により除き、そしてDNアーゼフリーRNアーゼＡ（Sigm
a）を添加し、最終濃度を10μg/mlにし、そして37℃で1
5分間インキュベートし、RNAを変性せしめた。これらの
インキュベーション及び反応は、Perkin−Elmer−Cetus
−Thermo−サイクラーを用いて行なわれた。
RNA消化の後、２×PCR反応緩衝液（カクテル）（100m
mのKCl、20mmのTris、pH8.3、3mmのMgCl2）、0.2％のゼ
ラチン、400μｍのdNTP、適切な濃度のプライマー（20
マーのためにそれぞれ500pモル）及び2.5単位のTaqポ
リマラーゼを添加し、そして50μの最終体積で30回の
PCR循環を行なった。典型的には、PCR循環は、94℃で１
分間のDNA加熱変性、37℃〜55℃で２分間のプライマー
のアニーリング及び72℃で１〜３分間の拡張反応期間か
ら成る。サンプルを室温に徐々に冷却し、そして反応物
の1/10（５μ）を、４％Nu−Sieve（Nu−Sieveは商標
である）アガロース最少ゲル上でのゲル電気泳動により
分析し、増幅の結果を測定した（第1,3及び５図を参照
のこと）。
mのKCl、20mmのTris、pH8.3、3mmのMgCl2）、0.2％のゼ
ラチン、400μｍのdNTP、適切な濃度のプライマー（20
マーのためにそれぞれ500pモル）及び2.5単位のTaqポ
リマラーゼを添加し、そして50μの最終体積で30回の
PCR循環を行なった。典型的には、PCR循環は、94℃で１
分間のDNA加熱変性、37℃〜55℃で２分間のプライマー
のアニーリング及び72℃で１〜３分間の拡張反応期間か
ら成る。サンプルを室温に徐々に冷却し、そして反応物
の1/10（５μ）を、４％Nu−Sieve（Nu−Sieveは商標
である）アガロース最少ゲル上でのゲル電気泳動により
分析し、増幅の結果を測定した（第1,3及び５図を参照
のこと）。
プロテイナーゼＫ、界面活性剤、フェノール抽出及び
エタノール沈殿の組合せを用いる他の方法がまた、DNA
の調製のために都合良く使用され得る。
エタノール沈殿の組合せを用いる他の方法がまた、DNA
の調製のために都合良く使用され得る。
16S rRNA遺伝子の３′末端及び23S rRNA遺伝子の５′
末端から生じる20−マーのオリゴヌクレオチドプライマ
ーを、Applied Biosystems又はBeckman（これらは商標
である）製のオリゴヌクレオチド合成器上で合成した。
このようにして合成されたプライマーは、利用できる16
S及び23S rRNA配列のClustal Analysis（Higginsなど.,
Gene,73 237〜244,1988）により定義されるように前記
領域における保存された配列に対応する。
末端から生じる20−マーのオリゴヌクレオチドプライマ
ーを、Applied Biosystems又はBeckman（これらは商標
である）製のオリゴヌクレオチド合成器上で合成した。
このようにして合成されたプライマーは、利用できる16
S及び23S rRNA配列のClustal Analysis（Higginsなど.,
Gene,73 237〜244,1988）により定義されるように前記
領域における保存された配列に対応する。
16S rRNAの３′プライマー配列は、下記の通りであ
る： 23S rRNAの５′プライマーの配列は、下記の通りであ
り： ここで、“/"は、その位置での塩基の分解性選択を示
す。
る： 23S rRNAの５′プライマーの配列は、下記の通りであ
り： ここで、“/"は、その位置での塩基の分解性選択を示
す。
ブロック解除の後、オリゴヌクレオチドの精製を、分
離用ポリアクリルアミドゲルからの溶離により行ない、
そしてNAP 10カラム上でのクロマトグラフィー処理によ
り精製した。
離用ポリアクリルアミドゲルからの溶離により行ない、
そしてNAP 10カラム上でのクロマトグラフィー処理によ
り精製した。
上記プライマーによるPCR増幅を、次の微生物につい
て上記で概略された条件を用いて行なった： アエロモナス カビアエ、アエロモナス ヒドロフィ
ラ、アエロモナス サルモニシダ、アエロモナス ソブ
リア、バシラス サブチリス、クロストリジウム ブチ
リカム、クロストリジウム、ジフィシル、クロストリジ
ウム パステウリアナム、クロストリジウム ペルフリ
ンゲンス、クロストリジウム チロブチリカム、エスシ
リシア コリ、エンテロコーカス ファエカリス、マイ
コバクテリウム アビウム、マイコバクテリウム ボビ
ス、マイコバクテリウム ツベルキュロシス、プスード
モナス アエロギノサ、セラチア メルセスカンス、ス
タフィロコーカス アウレウス及びストレプトコーカス
ピオゲンス。増幅された領域の大きさは、200〜650塩
基対の範囲であった。５種のクロストリジウム種につい
てのデータが、第１図に示され、ここでレーン１〜６
は、次のことを表わす： レーン1:クロストリジウム ペルフリンゲンスの増幅さ
れた16S−23S rRNA遺伝子間領域 レーン2:クロストリジウム ジフィシルの増幅された16
S−23S rRNA遺伝子間領域 レーン3:クロストリジウム パステウリアナムの増幅さ
れた16S−23S rRNA遺伝子間領域 レーン4:クロストリジウム ブチリカムの増幅された16
S−23S rRNA遺伝子間領域 レーン5:クロストリジウム チロブチリカムの増幅され
た16S−23S rRNA遺伝子間領域 レーン6:pBR Hae IIIサイズマーカー PCR増幅DNAを、Sma I部位中へのブランド末端連結に
よりベクターM13mp II中にサブクローンした。その挿入
されたDNAを、Sangerジデオキシ鎖終結方法により配列
決定した。これらの操作は、増幅されたDNA（PCR反応の
約20μ）50ngを、TE緩衝液（10mMのTris、pH8、1mMの
EDTA）1000倍体積に対して２時間、滴下透析することに
よって行なわれた。DNAをHeto−Vac（Heto−Vacは商標
である）乾燥機中で乾燥せしめ、そして次にSma I消化
されたM13Mp II（10ng）及びT4リガーゼ１単位を含む連
結緩衝液10μ中に再懸濁した。連結は、10℃で少なく
とも５時間行なわれた。そのDNA混合物を用いて、E.コ
リJM201を形質転換せしめた。一本鎖DNAを、T7ポリマラ
ーゼを用いてジデオキシ配列決定のための組換え体から
調製した。得られたDNA配列は、上記に示される。
て上記で概略された条件を用いて行なった： アエロモナス カビアエ、アエロモナス ヒドロフィ
ラ、アエロモナス サルモニシダ、アエロモナス ソブ
リア、バシラス サブチリス、クロストリジウム ブチ
リカム、クロストリジウム、ジフィシル、クロストリジ
ウム パステウリアナム、クロストリジウム ペルフリ
ンゲンス、クロストリジウム チロブチリカム、エスシ
リシア コリ、エンテロコーカス ファエカリス、マイ
コバクテリウム アビウム、マイコバクテリウム ボビ
ス、マイコバクテリウム ツベルキュロシス、プスード
モナス アエロギノサ、セラチア メルセスカンス、ス
タフィロコーカス アウレウス及びストレプトコーカス
ピオゲンス。増幅された領域の大きさは、200〜650塩
基対の範囲であった。５種のクロストリジウム種につい
てのデータが、第１図に示され、ここでレーン１〜６
は、次のことを表わす： レーン1:クロストリジウム ペルフリンゲンスの増幅さ
れた16S−23S rRNA遺伝子間領域 レーン2:クロストリジウム ジフィシルの増幅された16
S−23S rRNA遺伝子間領域 レーン3:クロストリジウム パステウリアナムの増幅さ
れた16S−23S rRNA遺伝子間領域 レーン4:クロストリジウム ブチリカムの増幅された16
S−23S rRNA遺伝子間領域 レーン5:クロストリジウム チロブチリカムの増幅され
た16S−23S rRNA遺伝子間領域 レーン6:pBR Hae IIIサイズマーカー PCR増幅DNAを、Sma I部位中へのブランド末端連結に
よりベクターM13mp II中にサブクローンした。その挿入
されたDNAを、Sangerジデオキシ鎖終結方法により配列
決定した。これらの操作は、増幅されたDNA（PCR反応の
約20μ）50ngを、TE緩衝液（10mMのTris、pH8、1mMの
EDTA）1000倍体積に対して２時間、滴下透析することに
よって行なわれた。DNAをHeto−Vac（Heto−Vacは商標
である）乾燥機中で乾燥せしめ、そして次にSma I消化
されたM13Mp II（10ng）及びT4リガーゼ１単位を含む連
結緩衝液10μ中に再懸濁した。連結は、10℃で少なく
とも５時間行なわれた。そのDNA混合物を用いて、E.コ
リJM201を形質転換せしめた。一本鎖DNAを、T7ポリマラ
ーゼを用いてジデオキシ配列決定のための組換え体から
調製した。得られたDNA配列は、上記に示される。
マイコバクテリウム種の配列のクラスター整合が、第
１表に示される。それらの間の可変領域は、低密度の保
存された塩基（星印）により示されている。プローブ生
成のための多くの可能性が、この分析から生じる。下線
部の20bの１つのフラグメント（9bの差異を包含する）
を選択し（第１表に）、マイコバクテリウム ボビスが
マイコバクテリウム アビウム（該マイコバクテリウム
アビウムは、ウシT.B.のための現在の試験において家
畜の非病原性感染の指示体として使用される）と区別さ
れ得ることを示した。この配列がr32PATPの存在下でポ
リヌクレオチドキナーゼ（Amersham）により放射性ラベ
ルされ、そしてNytran（Nytranは商標である）膜（Schl
eiser and Schnell）にスロットブロットされたマイコ
バクテリウム ボビス及びマイコバクテリウム アビウ
ムの増幅された遺伝子間領域にプローブとして使用され
る場合、マイコバクテリウム ボビスが検出され、とこ
ろがマイコバクテリウム アビウムは検出されなかった
（第２図）。第２図において、“A"は、マイコバクテリ
ウム ボビスに対応し、そして“B"は、マイコバクテリ
ウム アビウムに対応する。ハイブリダイゼーションの
ための条件は、６×SSPE,0.1％S.D.S.における55℃での
２時間であり、そして洗浄は６×SSC,0.1％S.D.S.中に
おいて室温で２度および６×SSC,0.1％S.D.S.中におお
いて55℃で２分間、１度、行なわれた。類似する方法で
得られたクロストリジウム種のためのDNA配列は、第２
表に示される。再び、DNAプローブのための可能性は、
クラスター分析から明らかである。クロストリジウムの
３種の種について第２表に示される配列の分析は、同一
の一連の配列（星印により示される）が生じる領域を示
し、これは、必要なら、クロストリジウムのための属特
異的プローブの基礎として作用することができる。
１表に示される。それらの間の可変領域は、低密度の保
存された塩基（星印）により示されている。プローブ生
成のための多くの可能性が、この分析から生じる。下線
部の20bの１つのフラグメント（9bの差異を包含する）
を選択し（第１表に）、マイコバクテリウム ボビスが
マイコバクテリウム アビウム（該マイコバクテリウム
アビウムは、ウシT.B.のための現在の試験において家
畜の非病原性感染の指示体として使用される）と区別さ
れ得ることを示した。この配列がr32PATPの存在下でポ
リヌクレオチドキナーゼ（Amersham）により放射性ラベ
ルされ、そしてNytran（Nytranは商標である）膜（Schl
eiser and Schnell）にスロットブロットされたマイコ
バクテリウム ボビス及びマイコバクテリウム アビウ
ムの増幅された遺伝子間領域にプローブとして使用され
る場合、マイコバクテリウム ボビスが検出され、とこ
ろがマイコバクテリウム アビウムは検出されなかった
（第２図）。第２図において、“A"は、マイコバクテリ
ウム ボビスに対応し、そして“B"は、マイコバクテリ
ウム アビウムに対応する。ハイブリダイゼーションの
ための条件は、６×SSPE,0.1％S.D.S.における55℃での
２時間であり、そして洗浄は６×SSC,0.1％S.D.S.中に
おいて室温で２度および６×SSC,0.1％S.D.S.中におお
いて55℃で２分間、１度、行なわれた。類似する方法で
得られたクロストリジウム種のためのDNA配列は、第２
表に示される。再び、DNAプローブのための可能性は、
クラスター分析から明らかである。クロストリジウムの
３種の種について第２表に示される配列の分析は、同一
の一連の配列（星印により示される）が生じる領域を示
し、これは、必要なら、クロストリジウムのための属特
異的プローブの基礎として作用することができる。
例２ 微生物のV2及びV6領域の増幅及びそれからのプローブの
生成 増幅を、例１に示される方法に従って行なった。16S
rRNA遺伝子のV2（R1/R2）及びV6（U1/U2）可変領域を個
々の端に有する20マーのオリゴヌクレオチドプライマー
を、利用できるデータから選択した〔Damsなど.Nucleic
Acids Research Supplement 16r87−r173（1988）〕。
生成 増幅を、例１に示される方法に従って行なった。16S
rRNA遺伝子のV2（R1/R2）及びV6（U1/U2）可変領域を個
々の端に有する20マーのオリゴヌクレオチドプライマー
を、利用できるデータから選択した〔Damsなど.Nucleic
Acids Research Supplement 16r87−r173（1988）〕。
このようにして合成されたプライマーは、次の配列を
有した： それぞれV2及びV6のためのプライマーとしてR1/R2及
びU1/U2によるPCR増幅を、次の微生物のために上記で概
略された条件を用いて行なった： アエロモナス サルモニシダ、クロストリジウム ジフ
ィシル、クレブシエラ プネウモニアエ、マイコバクテ
リウム ボビス、プスードモナス フルオレスセンス、
サルモネラ チピムリウム及びスタフィロコーカス ア
ウレウス。これらの種のR1/R2増幅は、分析されるすべ
ての場合において約120個の塩基対フラグメントを生ぜ
しめた。U1/U2プライマー増幅は、約100個の塩基対フラ
グメントを生ぜしめた。第３図は、R1/R2プライマーV2
増幅及びU1/U2プライマーV6増幅のために得られた結果
を示し、ここでレーン１〜16は次のことを表わす： レーン1:pBR Hae IIIサイズマーカー レーン2:アエロモナス サルモニシダのV2増幅 レーン3:アエロモナス サルモニシダのV6増幅 レーン4:クロストリジウム ジフィシルのV2増幅 レーン5:クロストリジウム ジフィシルのV6増幅 レーン6:クレブシエラ プネウモニアエのV2増幅 レーン7:クレブシエラ プネウモニアエのV6増幅 レーン8:マイコバクテリウム ボビスのV2増幅 レーン9:マイコバクテリウム ボビスのV6増幅 レーン10:プスードモナス フルオレスセンスのV2増幅 レーン11:プスードモナス フルオレスセンスのV6増幅 レーン12:サルモネラ チピムリウムのV2増幅 レーン13:サルモネラ チピムリウムのV6増幅 レーン14:スタフィロコーカス アウレウスのV2増幅 レーン15:スタフィロコーカス アウレウスのV6増幅 レーン16:pBR Hae IIIサイズマーカー。
有した： それぞれV2及びV6のためのプライマーとしてR1/R2及
びU1/U2によるPCR増幅を、次の微生物のために上記で概
略された条件を用いて行なった： アエロモナス サルモニシダ、クロストリジウム ジフ
ィシル、クレブシエラ プネウモニアエ、マイコバクテ
リウム ボビス、プスードモナス フルオレスセンス、
サルモネラ チピムリウム及びスタフィロコーカス ア
ウレウス。これらの種のR1/R2増幅は、分析されるすべ
ての場合において約120個の塩基対フラグメントを生ぜ
しめた。U1/U2プライマー増幅は、約100個の塩基対フラ
グメントを生ぜしめた。第３図は、R1/R2プライマーV2
増幅及びU1/U2プライマーV6増幅のために得られた結果
を示し、ここでレーン１〜16は次のことを表わす： レーン1:pBR Hae IIIサイズマーカー レーン2:アエロモナス サルモニシダのV2増幅 レーン3:アエロモナス サルモニシダのV6増幅 レーン4:クロストリジウム ジフィシルのV2増幅 レーン5:クロストリジウム ジフィシルのV6増幅 レーン6:クレブシエラ プネウモニアエのV2増幅 レーン7:クレブシエラ プネウモニアエのV6増幅 レーン8:マイコバクテリウム ボビスのV2増幅 レーン9:マイコバクテリウム ボビスのV6増幅 レーン10:プスードモナス フルオレスセンスのV2増幅 レーン11:プスードモナス フルオレスセンスのV6増幅 レーン12:サルモネラ チピムリウムのV2増幅 レーン13:サルモネラ チピムリウムのV6増幅 レーン14:スタフィロコーカス アウレウスのV2増幅 レーン15:スタフィロコーカス アウレウスのV6増幅 レーン16:pBR Hae IIIサイズマーカー。
増幅されたバンドは、不変領域のプライマーがグラム
陽性、グラム陰性、好気性及び嫌気性生物のために効果
的であることを示す。
陽性、グラム陰性、好気性及び嫌気性生物のために効果
的であることを示す。
DNA配列を、例１で記載されるようにして得た。V2及
びV6領域の両者のために得られたDNA配列のいくつかの
例が、第3a及び3b表に示される。E.コリ以外の生物につ
いての配列を、本発明に記載される方法を用いて得た。
普遍的なプライマーに対応する領域をボックスで囲む。
それらの間の可変領域は、低密度の保存された塩基（星
印）により示される。この分析の基礎に基づいて選択さ
れたアエロモナス サルモニシダに対して特異的なDNA
プローブを、点線により示す（第3b表）。このV6プロー
ブ配列は、これらの培養物がV6を端に有する不変領域の
ためのプライマーを用いて増幅される場合、好結果を伴
って、アエロモナス サルモニシダとE.コリ、サルモネ
ラ チピムリウム、クロストリジウム ジフィシル、ア
エロモナス ヒドロフィラ、アエロモナス メジア及び
アエロモナス カビアエとを区別した（第４図を参照の
こと）。使用されるハイブリダイゼーション条件（ハイ
ブリダイゼーションは、６×SSPE,0.1％SDS中において5
7℃で２時間行なわれ、そして２×SSC中において60℃で
30分間の強い洗浄を伴う）は、プローブによるA.サルモ
ニシダとA.ヒドロフィラとの間の区別を可能にした（こ
こでたった２個の塩基対の相違が存在する）ことが注目
されるであろう。
びV6領域の両者のために得られたDNA配列のいくつかの
例が、第3a及び3b表に示される。E.コリ以外の生物につ
いての配列を、本発明に記載される方法を用いて得た。
普遍的なプライマーに対応する領域をボックスで囲む。
それらの間の可変領域は、低密度の保存された塩基（星
印）により示される。この分析の基礎に基づいて選択さ
れたアエロモナス サルモニシダに対して特異的なDNA
プローブを、点線により示す（第3b表）。このV6プロー
ブ配列は、これらの培養物がV6を端に有する不変領域の
ためのプライマーを用いて増幅される場合、好結果を伴
って、アエロモナス サルモニシダとE.コリ、サルモネ
ラ チピムリウム、クロストリジウム ジフィシル、ア
エロモナス ヒドロフィラ、アエロモナス メジア及び
アエロモナス カビアエとを区別した（第４図を参照の
こと）。使用されるハイブリダイゼーション条件（ハイ
ブリダイゼーションは、６×SSPE,0.1％SDS中において5
7℃で２時間行なわれ、そして２×SSC中において60℃で
30分間の強い洗浄を伴う）は、プローブによるA.サルモ
ニシダとA.ヒドロフィラとの間の区別を可能にした（こ
こでたった２個の塩基対の相違が存在する）ことが注目
されるであろう。
第４図において、レーン１〜７は次のものを表わす： レーン1:アエロモナス サルモニシダ レーン2:アエロモナス ヒドロフィラ レーン3:アエロモナス メジア レーン4:アエロモナス カビアエ レーン5:エスシリシア コリ レーン6:サルモネラ チピムリウム レーン7:クロストリジウム ジフィシル。
例３ リボヌクレアーゼP RNA遺伝子の遺伝子間可変領域の増
幅 例１及び２に記載される方法を用いて、リボヌクレア
ーゼＰの遺伝子内可変領域を端に有するDNAプライマー
〔公開されたデータ（Bryan,D.Jamesなど．（1988）前
記〕の分析から保護されるようにして選択された〕を、
合成した。そのプライマーの配列は、次の通りである： これらを用いて、アエロモナス サルモニシダ、クロ
ストリジウム ジフィシル、クロストリジウム パステ
ウリアナム、エスシリシア コリ、エンテロコーカス
ファエカリス及びセラチア メルセスカンスにおけるそ
の対応する遺伝子内領域を増幅した。その結果（第５図
に示される）は、グラム陽性、グラム陰性、好気性及び
嫌気性生物がこれらのプライマーを用いて増幅され得る
ことを示す。第５図において、レーンｂ〜ｈは次のもの
を表わす： レーンb:エスシリシア コリ レーンc:エンテロコーカス ファエカリス レーンd:セラチア メルセスカンス レーンe:アエロモナス サルモニシダ レーンf:クロストリジウム パステウリアナム レーンg:クロストリジウム ジフィシル レーンh:1kbのラダーサイズのマーカー。
幅 例１及び２に記載される方法を用いて、リボヌクレア
ーゼＰの遺伝子内可変領域を端に有するDNAプライマー
〔公開されたデータ（Bryan,D.Jamesなど．（1988）前
記〕の分析から保護されるようにして選択された〕を、
合成した。そのプライマーの配列は、次の通りである： これらを用いて、アエロモナス サルモニシダ、クロ
ストリジウム ジフィシル、クロストリジウム パステ
ウリアナム、エスシリシア コリ、エンテロコーカス
ファエカリス及びセラチア メルセスカンスにおけるそ
の対応する遺伝子内領域を増幅した。その結果（第５図
に示される）は、グラム陽性、グラム陰性、好気性及び
嫌気性生物がこれらのプライマーを用いて増幅され得る
ことを示す。第５図において、レーンｂ〜ｈは次のもの
を表わす： レーンb:エスシリシア コリ レーンc:エンテロコーカス ファエカリス レーンd:セラチア メルセスカンス レーンe:アエロモナス サルモニシダ レーンf:クロストリジウム パステウリアナム レーンg:クロストリジウム ジフィシル レーンh:1kbのラダーサイズのマーカー。
矢印は、リボヌクレアーゼＰ増幅DNAを示す。
第１図は、例１で調製されたクロストリジウム種のため
の増幅された16S−23S遺伝子間領域のアガロースゲルの
写真であって、図面に代わる写真であり、 第２図は、マイコバクテリウム ボビス及びマイコバク
テリウム アビウムDNAへのマイコバクテリウム ボビ
スの16S−23S遺伝子間領域のためのDNAプローブのハイ
ブリダイゼーションのオートラジオグラム写真であっ
て、図面に代わる写真であり、 第３図は、例２で調製されたような一連の生物の増幅さ
れた16S rRNA領域のアガロースゲルの写真であって、図
面に代わる写真であり、 第４図は、一連の生物へのアエロモナス サルモニシダ
の16S rRNA遺伝子内領域のためのDNAプローブのハイブ
リダイゼーションのオートラジオグラム写真であって、
図面に代わる写真であり、そして 第５図は、例３で調製されたような一連の生物からの増
幅されたリボヌクレアーゼＰ領域のアガロースゲルの写
真であって、図面に代わる写真である。
の増幅された16S−23S遺伝子間領域のアガロースゲルの
写真であって、図面に代わる写真であり、 第２図は、マイコバクテリウム ボビス及びマイコバク
テリウム アビウムDNAへのマイコバクテリウム ボビ
スの16S−23S遺伝子間領域のためのDNAプローブのハイ
ブリダイゼーションのオートラジオグラム写真であっ
て、図面に代わる写真であり、 第３図は、例２で調製されたような一連の生物の増幅さ
れた16S rRNA領域のアガロースゲルの写真であって、図
面に代わる写真であり、 第４図は、一連の生物へのアエロモナス サルモニシダ
の16S rRNA遺伝子内領域のためのDNAプローブのハイブ
リダイゼーションのオートラジオグラム写真であって、
図面に代わる写真であり、そして 第５図は、例３で調製されたような一連の生物からの増
幅されたリボヌクレアーゼＰ領域のアガロースゲルの写
真であって、図面に代わる写真である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (73)特許権者 999999999 ベルナード フランシス クサビア ガ ノン アイルランド国，ガルウェイ，サルスィ ル，ポルナローマ，“マーガン”（番地 なし) (73)特許権者 999999999 リチャード パウウェル アイルランド国，ガルウェイ，サルスィ ル，グレナード クレセント 10 (73)特許権者 999999999 ユニバーシティ カレッジ ガルウェイ アイルランド国，ガルウェイ（番地な し) (72)発明者 トーマス ジェラルド バリー アイルランド国，カウンティ ガルウェ イ，キンバラ，ザ キー（番地なし) (72)発明者 ベルナード フランシス クサビア ガ ノン アイルランド国，ガルウェイ，サルスィ ル，ポルナローマ，“マーガン”（番地 なし) (72)発明者 リチャード パウウェル アイルランド国，ガルウェイ，サルスィ ル，グレナード クレセント 10 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＣＡ（ＳＴＮ) ＥＰＡＴ（ＱＵＥＳＴＥＬ) ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (13)
- 【請求項１】同定されるべき生物に対して特異的であり
そして、複数の属又は種の間を区別することができるDN
Aプローブの生成方法であって、 ａ）１対のオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、同
定されるべき生物中の、及び該同定されるべき生物を含
有する所与の試料中に存在することが予想されるか又は
系統発生的に関連する多数の生物であってその中に遺伝
子間可変領域を有するもの中の、ゲノムの遺伝子間可変
領域を増幅し、前記プライマーは前記生物中に保存され
ていることが知られているか又は予想され且つ前記遺伝
子間可変領域を挟む領域又はその部分に対応し； ｂ）増幅された領域の配列を決定し； ｃ）前記他の増幅された領域との比較によって、前記配
列又はその部分を選択することにより同定されるべき生
物に特異的な前記プローブを生成せしめ；そして ｄ）選択されたプローブの正確なヌクレオチド配列に基
く特異的シグナルを得るのに要求されるハイブリダイゼ
ーション条件を定義する； 段階を含んで成る方法。 - 【請求項２】前記プライマーの１つが16S rRNA遺伝子の
保存された領域に対応し、そして前記他のプライマーが
23S rRNa遺伝子の保存された領域に対応する請求項１記
載の方法。 - 【請求項３】前記プライマー配列が、リボヌクレアーゼ
Ｐ成分RNAに由来する請求項１記載の方法。 - 【請求項４】前記増幅される可変領域が、同定されるべ
き生物を含むオートクレーブされたサンプルから増幅さ
れる請求項１〜３のいづれか１項記載の方法。 - 【請求項５】前記微生物を、アエロモナス（Aeromona
s）、バシラス（Bacillus）、クロストリジウム（Clost
ridium）、エンテロコーカス（Enterococcus）、エスシ
リシア（Eschericia）、クレブシエラ（Klebsiella）、
マイコバクテリウム（Mycobacterium）、プスードモナ
ス（Pseudomonas）、サルモネラ（Salmonella）、セラ
チア（Serratia）、スタフィロコーカス（Staphylococc
us）又はストレプトコーカス（Streptococcus）の種か
ら選択する請求項１〜４のいづれか１項記載の方法。 - 【請求項６】16S rRNA及び23S rRNAをコードする遺伝子
に介在する遺伝子間可変領域から得られ、そして下記ヌ
クレオチド配列： もしくはそれへの相補的配列、又は10塩基以上を有する
これらの配列の部分から成るクロストリジウム ジフィ
シル（Clostridium difficile）のためのDNAプローブ。 - 【請求項７】16S rRNA及び23S rRNAをコードする遺伝子
に介在する遺伝子間可変領域から得られ、そして下記ヌ
クレオチド配列： もしくはそれへの相補的配列、又は10塩基以上を有する
これらの配列の部分から成るクロストリジウム パステ
ウリアナム（Clostridium pasteurianum）のためのDNA
プローブ。 - 【請求項８】16S rRNA及び23S rRNAをコードする遺伝子
に介在する遺伝子間可変領域から得られ、そして下記ヌ
クレオチド配列： もしくはそれへの相補的配列、又は10塩基以上を有する
これらの配列の部分から成るクロストリジウム ペルフ
リンゲンス（Clostridium perfringens）のためのDNAプ
ローブ。 - 【請求項９】16S rRNA及び23S rRNAをコードする遺伝子
に介在する遺伝子間可変領域から得られ、そして下記ヌ
クレオチド配列： もしくはそれへの相補的配列、又は10塩基以上を有する
これらの配列の部分から成るマイコバクテリウム アビ
ウム（Mycobacterium avium）のためのDNAプローブ。 - 【請求項１０】16S rRNA及び23S rRNAをコードする遺伝
子に介在する遺伝子間可変領域から得られ、そして下記
ヌクレオチド配列： もしくはそれへの相補的配列、又は10塩基以上を有する
これらの配列の部分から成るマイコバクテリウム ボビ
ス（Mycobacterium bovis）のためのDNAプローブ。 - 【請求項１１】16S rRNA及び23S rRNAをコードする遺伝
子に介在する遺伝子間可変領域から得られ、そして下記
ヌクレオチド配列： もしくはそれへの相補的配列、又は10塩基以上を有する
これらの配列の部分から成るマイコバクテリウム ツベ
ルキュロシス（Mycobacterium tuberculosis）のための
DNAプローブ。 - 【請求項１２】標的ヌクレオチド配列を含む又は含むと
思われる生物の検出及び／又は決定のための方法であっ
て、前記生物と、請求項６〜11のいづれか１項記載の前
記標的配列に相補的なプローブとを接触せしめることを
含んで成る方法。 - 【請求項１３】生物の混合物における特定の生物を検出
するための方法であって、前記特定の生物の２種の選択
されたヌクレオチド領域の配列を、請求項１〜５のいづ
れか１項記載の一連の段階により決定し、そして前記生
物の特異的領域を選択的に増幅するための一対のプライ
マーを生成するために前記配列決定された領域を用い、
そしてそれによって前記特定の生物を検出することを含
んで成る方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| IE128789A IE81145B1 (en) | 1989-04-20 | 1989-04-20 | Generation of specific probes for target nucleotide sequences |
| IE1287/89 | 1989-04-20 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH03130099A JPH03130099A (ja) | 1991-06-03 |
| JP3097059B2 true JP3097059B2 (ja) | 2000-10-10 |
Family
ID=11024937
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP02101858A Expired - Lifetime JP3097059B2 (ja) | 1989-04-20 | 1990-04-19 | 標的ヌクレオチド配列に対する特異的プローブの生成 |
Country Status (11)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5574145A (ja) |
| EP (1) | EP0395292B1 (ja) |
| JP (1) | JP3097059B2 (ja) |
| AT (1) | ATE150091T1 (ja) |
| AU (1) | AU630932B2 (ja) |
| DE (1) | DE69030131T2 (ja) |
| DK (1) | DK0395292T3 (ja) |
| ES (1) | ES2100161T3 (ja) |
| GR (1) | GR3023600T3 (ja) |
| IE (1) | IE81145B1 (ja) |
| ZA (1) | ZA902924B (ja) |
Families Citing this family (58)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0452596A1 (en) * | 1990-04-18 | 1991-10-23 | N.V. Innogenetics S.A. | Hybridization probes derived from the spacer region between the 16S and 23S rRNA genes for the detection of non-viral microorganisms |
| US5536638A (en) * | 1990-04-18 | 1996-07-16 | N.V. Innogenetics S.A. | Hybridization probes derived from the spacer region between the 16S and 23S rRNA genes for the detection of Neisseria gonorrhoeae |
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