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Diese Erfindung betrifft den Nachweis von Bakterien in Proben,
beispielsweise in klinischen Proben. Verfahren zum Nachweis von Bakterien in normalerweise
sterilen Körpergeweben oder -flüssigkeiten, beispielsweise Blut, Urin und zerebrospinale
Flüssigkeit - in denen das Vorhandensein von Bakterien lebensbedrohlich sein
kann - sind besonders wichtig. Die vorliegende Erfindung stellt Nucleinsäuresonden und
Zusammensetzungen sowie Verfahren zu ihrer Verwendung zum spezifischen Nachweis
beliebiger Bakterien in derartigen Proben bereit.
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EP-A-0 272 009 (Hogan et al. - entspricht der WO-A-8802957) offenbart
mehrere Nucleinsäuresonden, die an bakterielle RNA, jedoch nicht an rRNA von Hefe
oder menschliche rRNA hybridisieren und die in Hybridisierungstests zum Nachweis
von nicht-viralen Organismen verwendet werden können, ein Verfahren zu ihrer
Herstellung.
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EP-A-0 245 129 (Institut Pasteur und INSERM) offenbart
Oligonucleotidsonden, die an bakterielle rRNA hybridisieren können, und ihre Verwendung in
Hybridisierungstests zum Nachweis von Bakterien.
Hintergrund der Erfindung
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Der hier verwendete Begriff "Eubakterien" bezeichnet eine Gruppe von
prokaryotischen Organismen (Bakterien), wie sie beispielsweise in "Bergey's Manual of
Systematic Bacteriology (N. R. Krieg und J. G. Holt (Hrsg.), 1984, Williams &
Wilkins, Baltimore) beschrieben ist. Zu dieser Gruppe der Eubakterien gehören alle
Bakterien, die bei Menschen oder Tieren Erkrankungen bewirken und deren Nachweis
sehr wichtig ist.
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Als einzige andere Gruppe werden die Archaebakterien beschrieben, die sich
biologisch und genetisch von den Eubakterien unterscheiden (C. R. Woese, Scientific
American Bd. 244 (1981), 98-102). Die Gruppe der Archaebakterien besetzt einige
"extreme" Milieus, beispielsweise heiße Quellen, stark sauerstoffarmer Schlamm,
Salzlösungen etc., die das Wachstum von Eubakterien üblicherweise nicht fördern. Es
gibt keine bekannten archaebakteriellen Pathogene, und ihr Nachweis ist daher klinisch
von geringer Bedeutung.
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Eukaryotische Organismen bilden die dritte genetische
Hauptabstammungslinie, die zusammen mit den Eubakterien und Archaebakterien alle
bekannten Lebensformen umfassen (Figur 1). Beispiele für Eukaryoten sind Menschen,
Tiere, Pflanzen und die zahllosen, weniger komplexen Organismen der freilebenden und
parasitären "Protisten", beispielsweise Protozoen, Pilze, Ziliata etc. Im klinischen
Zusammenhang ist es besonders wichtig, zwischen Infektionen durch Eubakterien und
durch Eukaryoten, z. B. Pilze und Protozoen, zu unterscheiden, da sie die gleichen
Symptome zeigen können, jedoch eine vollkommen andere antimikrobielle Behandlung
oder Chemotherapie erfordern. Diese genetischen Unterschiede sind daher hinsichtlich
der Diagnose und antimikrobiellen Chemotherapie klinisch signifikant.
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Ein erfindungsgemäßer Gesichtspunkt betrifft die Bereitstellung von
Nucleinsäuresonden, die zwischen eubakteriellen, menschlichen (einschließlich
menschlichen mitochondrialen) und pilzlichen rRNA-Molekülen unterscheiden.
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Ein weiterer erfindungsgemäßer Gesichtspunkt betrifft die Bereitstellung von
Sonden und Sondensätzen, mit denen gram-positive und gram-negative Eubakterien
unterschieden werden können.
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Verfahren zum Nachweis, zur Identifizierung und zum Zählen von Bakterien
in normalerweise sterilen Körperflüssigkeiten variieren je nach Art der Probe und dem
vermuteten Pathogen. Mit keinem bisher verwendeten Verfahren können alle Pathogene
optimal nachgewiesen werden. Häufig müssen Verfahren kombiniert werden, um die
Wahrscheinlichkeit zu erhöhen, daß das Pathogen nachgewiesen werden kann. In allen
üblichen Verfahren beispielsweise zum Nachweis von Bakteriämie oder bakterieller
Septikämie, werden Mikroben aus klinischen Proben in vitro gezüchtet. Üblicherweise
wird von einem Patienten eine Blutprobe genommen, diese in einem nährstoffreichen
künstlichen Kulturmedium inkubiert und 1 bis 14 Tage überwacht. Während dieser Zeit
wird das Medium untersucht oder blind subkultiviert (auf Platten ausgestrichen) oder
chemisch oder über Isotopen getestet, um ein bakterielles Wachstum oder fermentative
Prozesse nachzuweisen. Zur klinischen Untersuchung werden üblicherweise zwei oder
drei Proben aus 10 ml Blut verwendet, die lediglich ein bis zehn koloniebildende
Bakterien-Einheiten für eine positive Diagnose liefern. Nach der Isolierung von
einzelnen Bakterienkolonien auffesten Diagnosemedien und/oder durch Gramfärbung erfolgt
eine erste vorläufige Identifizierung der Bakterien (oder Pilze).
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Alle Züchtungsverfahren weisen einige ernste Nachteile auf, beispielsweise
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- hohe Materialkosten,
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- Arbeitsintensität,
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- Häufiger Kontakt des Fachpersonals mit gefährlichen Körperflüssigkeiten,
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- Falsche positive Befunde aufgrund des Kontakts,
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- Falsche negative Befunde aufgrund einer geringen Zahl lebensfähiger
Zellen,
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- Falsche negative Befunde aufgrund hoher Medienansprüche von vielen
potentiellen Pathogenen und
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- Relativ lange Dauer für eine positive Diagnose und Identifizierung.
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Aufgrund der relativ langen Dauer bisheriger Diagnoseverfahren und der
potentiell lebensbedrohenden Natur derartiger Infektionen wird eine antimikrobielle
Therapie häufig empirisch begonnen, bevor die Ergebnisse derartiger Tests bekannt
sind.
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Ein weiterer erfindungsgemäßer Gesichtspunkt ist daher die Bereitstellung von
Nucleinsäuresonden, die für alle Eubakterien spezifisch sind und vorzugsweise nicht mit
anderen eukaryotischen Pathogenen, insbesondere Pilzen, die in den getesteten
Materialien vorhanden sein können, reagieren.
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Ein weiterer erfindungsgemäßer Gesichtspunkt ist daher die Bereitstellung von
Sonden, die in einer Reihe von Testsystemen verwendet werden können, ohne daß viele
der Nachteile, die mit traditionellen, viele Tage dauernden Züchtungsverfahren
verbunden sind, auftreten.
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Ein weiterer erfindungsgemäßer Gesichtspunkt ist daher die Bereitstellung von
Sonden, die an die ribosomalen Ribonucleinsäuren (rRNA) der eubakteriellen
Zielorganismen unter normalen Testbedingungen hybridisieren können.
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Obwohl Kohne et al. (Biophysical. Journal 8 (1968), 1104-1118) ein
Verfahren zur Herstellung von Sonden für rRNA-Sequenzen beschreiben, liefern sie
keine Lehre zur Herstellung von Sonden mit einem breiten eubakteriellen Spektrum.
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Pace und Campbell (Journal of Bacteriology 107 (1971), 543-547) diskutieren
die Homologie von ribosomalen Ribonucleinsäuren von unterschiedlichen Bakterienarten
und ein Hybridisierungsverfahren zur quantitativen Bestimmung des Grads der
Homologie. Sie beschreiben keine spezifischen Nucleinsäuresequenzen, die in Bakterien
enthalten sind, jedoch in Eukaryoten fehlen. Woese (Microbiological Reviews 51
(1987), 221-271) gibt einen Überblick über die Bandbreite der rRNA-Sequenzen von
Eubakterien, beschreibt jedoch keine Sequenzen, die eine vollständige bakterielle
Inklusivität aufweisen. Diese Publikationen können jedoch nicht die Nachteile der Lehre
Kohnes im Hinblick auf eubakterielle Sonden beseitigen, und sie liefern insbesondere
keine für Eubakterien spezifischen Sonden, die in Tests zum Nachweis von Eubakterien
in klinischen oder anderen Proben verwendet werden können.
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Giovannoni et al. (Journal of Bacteriology 170 (1988), 720-726) beschreiben
einige Sonden, für die eine Eignung zur Identifizierung eines breiten Spektrums von
Eubakterien, Archaebakterien und Eukaryoten beansprucht wird. Giovannoni et al.
beschreiben jedoch nicht die erfindungsgemäßen Sonden. Sie liefern auch keine Lehre zur
Entwicklung derartiger Sonden.
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Hogan et al. (Veröffentlichung der Patentanmeldung WO 88/03957)
offenbaren mehrere Sonden, für die eine Hybridisierung an ein breites Spektrum von
Eubakterien beansprucht wird. Hogan et al. beschreiben jedoch nicht die
erfindungsgemäßen Sonden und beseitigen auch nicht die Nachteile von Kohnes Lehre im Hinblick
auf diese Sonden.
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Ribosomen sind von großer Bedeutung für alle Organismen, da nur durch sie
genetische Information in Zellproteine translatiert werden kann. Ein klarer Hinweis auf
diese Bedeutung ist die Beobachtung, daß alle Zellen Ribosomen aufweisen. Aktiv
wachsende Bakterien können 20 000 oder mehr Ribosomen pro Zelle enthalten. Somit
sind Ribosomen die häufigsten makromolekularen Einheiten in einer Zelle und ein
attraktives diagnostisches Testziel.
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Ribosomen enthalten drei unterschiedliche RNA-Moleküle, die bei
Escherichia coli als 5S-, 16S- und 23S-rRNAs bezeichnet werden. Diese Bezeichnungen
stehen historisch mit der aus der Sedimentationsgeschwindigkeit ermittelten Größe der
RNA-Moleküle in Zusammenhang. Tatsächlich schwankt jedoch die bei verschiedenen
Organismen festgestellte Größe der ribosomalen RNA-Moleküle. Dennoch werden die
Bezeichnungen 5S-, 16S- und 23S-rRNA üblicherweise als Gattungsnamen für die
homologen RNA-Moleküle in allen Bakterien verwendet und diese Bezeichnungsweise
wird hier ebenfalls verwendet. Die Diskussion wird auf 16S- und 23S-rRNAs
beschränkt.
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Wie hier verwendet, bezeichnet der Begriff "Sonde(n)" synthetisch oder
biologisch erzeugte Nucleinsäuren (DNA oder RNA), die nach Konstruktion oder Selektion
spezifische Nucleotidsequenzen enthalten, so daß sie unter definierten Bedingungen mit
festgelegter Stringenz spezifisch (d. h., vorzugsweise, vgl.
nachstehend - Hybridisierung) an Zielnucleinsäuresequenzen hybridisieren können. Außer ihren
Hybridisierungseigenschaften können Sonden außerdem bestimmte Bestandteile
enthalten, die sich auf ihr richtiges oder optimales Funktionieren unter bestimmten
Testbedingungen beziehen. Sonden können beispielsweise modifiziert werden, um ihre
Resistenz gegen einen Nucleaseabbau zu verbessern (z. B. durch "Capping" der Enden),
nachweisbare Liganden (z. B. Fluorescein, ³²Phosphor, Biotin etc.) aufzunehmen oder
ihre Adsorption an einem festen Träger zu erleichtern (z. B. durch
Polydesoxyadenosin-"Schwänze"). Derartige Modifikationen werden unter Berücksichtigung der
Sondenfunktion ausgearbeitet, die eine Unterscheidung zwischen Ziel- und Nicht-
Zielorganismen in einem Hybridisierungstest ermöglicht.
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Unter einer Hybridisierung wird üblicherweise ein Verfahren verstanden, in
dem unter festgelegten Reaktionsbedingungen eine antiparallele Aneinanderlagerung von
zwei partiell oder vollständig komplementären Nucleinsäuresträngen (wobei einer eine
Orientierung von 5' nach 3' und der andere eine von 3' nach 5' aufweist) erfolgen kann,
wobei eine doppelsträngige Nucleinsäure mit spezifischen und stabilen
Wasserstoffbindungen gebildet wird. (Beachte, daß Nucleinsäuren eine Polarität aufweisen,
daß heißt, es gibt einen chemischen Unterschied zwischen den beiden Enden eines
Nucleinsäurestrangs. Dies wird durch die Polarität der chemischen Bindungen durch die
asymmetrische Zuckereinheit der Nucleotidbestandteile definiert. Die Bezeichnungen "5'
und 3'" bezeichnen spezifisch Ribosezucker-Kohlenstoffatome, die diese Bezeichnungen
tragen. Nur unter seltenen oder ungewöhnlichen Umständen assoziieren
Nucleinsäurestränge über Wasserstoffbindungen der Baseneinheiten parallel. Dieses Konzept
ist dem Fachmann vertraut.)
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Die Stringenz bestimmter Hybridisierungsbedingungen ist durch die
Basenzusammensetzung der Sonden/Ziel-Duplex sowie den Grad und die Geometrie der
Fehlpaarung zwischen den beiden Nucleinsäuren definiert.
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Die Stringenz kann ferner durch Reaktionsparameter wie der Konzentration
und Art der in der Hybridisierungslösung vorhandenen Ionen, der Art und den
Konzentrationen der vorhandenen Denaturierungsmittel und/oder der
Hybridisierungstemperatur reguliert werden. Für stringentere Hybridisierungsbedingungen
werden zur Bildung von stabilen Hybriden üblicherweise längere Sonden bevorzugt.
Daher wird die Stringenz der Bedingungen, unter denen eine Hybridisierung
durchgeführt wird, (die z. B. von der Art des durchzuführenden Tests abhängig ist), die
jeweiligen Eigenschaften der bevorzugt verwendeten Sonden bestimmen. Derartige
Zusammenhänge sind bekannt und können vom Fachmann leicht beeinflußt werden.
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Im allgemeinen versteht der Fachmann je nach der Länge der Sonde unter
stringenten Bedingungen etwa 35ºC bis 65ºC in einer Salzlösung mit etwa 0,9 mol.
Zusammenfassung der Erfindung
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In Übereinstimmung mit den unterschiedlichen erfindungsgemäßen Prinzipien
und Gesichtspunkten werden Nucleinsäuresonden und Sondensätze bereitgestellt, die
Desoxyribonucleinsäure (DNA)- oder Ribonucleinsäure (RNA)-Sequenzen umfassen und
unter spezifischen Bedingungen an ribosomale RNA-Moleküle (rRNA), rRNA-Gene
(rDNA) und bestimmte Amplifikations- und in vitro-Transkriptionsprodukte von
Eubakterien hybridisieren, wobei jedoch unter den gleichen Bedingungen keine
Hybridisierung an die in den Testproben vorhandene rRNA oder rDNA von
eukaryotischen
Zellen erfolgt. Einige hier beschriebene Sonden und Sondensätze können ferner
als Primer für die spezifische Amplifikation von eubakteriellen rRNA- oder rDNA-
Sequenzen in einer Probe durch Polymerase-Kettenreaktion (US 4,683,202) oder
transkriptionelle Amplifikationssysteme (z. B. TAS, Kwoh et al., Proceedings of the
National Academy of Science 86 (1989), 1173-1177) verwendet werden.
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Die erfindungsgemäßen Sonden können an rDNA und rRNA von
Eubakterien, jedoch nicht an rRNA oder rDNA von Maus-L-Zellen, Weizenkeimen,
menschlichem Blut oder Candida albicans hybridisieren und weisen eine Sequenz auf,
die mit mindestens 90 % der Sequenz komplementär oder homolog ist, die beliebige 10
aufeinanderfolgende Nucleotide innerhalb einer der 22 Sonden umfaßt (die eine
vierstellige Kennzahl tragen und deren Sequenzen nachstehend angegeben sind).
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Von den erfindungsgemäßen Sonden kann ausgegangen werden, um nützliche
Nucleinsäure-Hybridisierungstests zu entwickeln, mit denen Eubakterien in klinischen
Proben, beispielsweise Blut, Urin, zerebrospinale Flüssigkeit, Biopsie-Gewebe,
Synovialflüssigkeit oder andere Gewebe- oder Flüssigkeitsproben von Menschen oder
Tieren, spezifisch nachgewiesen werden können. Die Sonden können ferner verwendet
werden, um die Sterilität von Substanzen, z. B. von Arzneimitteln, beispielsweise zur
Qualitätskontrolle zu testen. Die hier beschriebenen Sonden sind spezifisch
komplementär zu bestimmten stark konservierten bakteriellen 23S- oder 16S-rRNA-Sequenzen.
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Der Nachweis von Bakterien durch Nucleinsäurehybridisierung stellt im
Vergleich zu den bisherigen kulturabhängigen Tests aus mehreren Gründen eine
Verbesserung dar, wozu beispielsweise gehört:
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a) Erhöhte Empfindlichkeit, d. h., Fähigkeit zum häufigeren Nachweis
derartiger Bakterien in einer bestimmten Probe.
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b) Potentiell erhebliche Reduktion der Testkosten aufgrund der Verwendung
von kostengünstigen Reagenzien und geringerem Arbeitaufwand.
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c) Genaue Identifizierung selbst von Bakterienstämmen mit hohen
Nährstoffansprüchen.
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d) Schnellere Ergebnisse, da vor derartigen Tests das Zielbakterium nicht aus
der Probe isoliert werden muß.
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e) Fähigkeit zum chargenweisen Absuchen einer großen Zahl
von Proben und ausschließliche Züchtung der Proben, die eine positive
Hybridisierung zeigen,
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f) Potentieller Nachweis von phagozytierten Organismen, womit die
Notwendigkeit entfällt, viele Blutproben in Abständen zu nehmen, um das zyklische
"Fenster" von lebensfähigen Organismen (das wahrscheinlich von immunologischen
Zyklen des Wirts abhängt) untersuchen zu können.
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g) Umgang des Fachpersonals mit potentiell infektiösen Körperflüssigkeiten in
verringertem Ausmaß.
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h) Fähigkeit zum Nachweis von Zielen in sehr geringer Zahl durch
Amplifikation entweder des bakteriellen Signals oder des Ziels unter Verwendung einer
in vitro-Nucleinsäure-Amplifikation.
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Es wurde festgestellt, daß weitere Vorteile der Verwendung der
erfindungsgemäßen Sonden zum rRNA-Nachweis auf der Tatsache beruhen, daß die
nachgewiesenen rRNAs einen signifikanten Bestandteil der Zellmasse darstellen. Die Schätzungen
des zellulären Ribosomengehalts schwanken zwar, jedoch können aktiv wachsende
Escherichia coli mehr als 50 000 Ribosomen pro Zelle und somit 50 000 Kopien jeder
der rRNAs (die in Ribosomen in einer Stöchiometrie von 1:1:1 vorhanden sind)
enthalten. Die Zahl der Ribosomen in anderen Bakterien kann insbesondere unter anderen,
weniger günstigen metabolischen Bedingungen erheblich geringer sein. Auf jeden Fall
gehören die rRNAs zu den in allen Zelltypen vorhandenen, häufigsten zellulären
Nucleinsäuren. Im Gegensatz dazu sind andere potentielle zelluläre Zielmoleküle,
beispielsweise Gene oder deren RNA-Transkripte, weniger ideal, da sie in viel geringerer
Zahl vorhanden sind.
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Ein weiterer überraschender Vorteil ist, daß die rRNAs (und die sie
codierenden Gene) anscheinend nicht an einem horizontalen Transfer zwischen heute
existierenden Organismen beteiligt sind. Somit liefert die Primärstruktur der rRNA ein
Organismus-spezifisches molekulares Ziel und kein Gen-spezifisches Ziel, wie es
beispielsweise ein Plasmid-ständiges Gen oder dessen Produkt ist, das an einer horizontalen
Transmission zwischen heute existierenden Organismen teilnimmt.
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Die vorliegende Erfindung stellt ferner Sonden für eubakterielle rRNA-
Zielsequenzen bereit, die in den meisten oder allen getesteten Eubakterien ausreichend
ähnlich sind, so daß die Sonden an den Zielbereich derartiger Eubakterien hybridisieren
können. Diese ähnlichen rRNA-Zielsequenzen unterscheiden sich vorteilhafterweise von
den meisten nicht-eubakteriellen rRNAs, so daß die Sonden unter bestimmten
Bedingungen zwar an eubakterielle rRNAs, jedoch nicht an die meisten
nicht-eubakteriellen rRNAs hybridisieren. Diese Sondeneigenschaften sind als Inklusivität bzw.
Exklusivität definiert.
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Die Möglichkeit der Herstellung der erfindungsgemäßen Sonden mit den
außergewöhnlichen Inklusivitäts- und Exklusivitätseigenschaften für Eubakterien war
unvorhersehbar und überraschend.
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Die unterschiedlichen erfindungsgemäßen Gesichtspunkte, die geschützt
werden sollen, sind in den beigefügten Ansprüchen beschrieben.
Kurze Beschreibung der Figuren
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Ein genaueres Verständnis der erfindungsgemäßen Prinzipien und
Gesichtspunkte ergibt sich aus den Tabellen erlangt werden.
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Figur 1 zeigt einen evolutionären Stammbaum der genetischen
Haupt-"Reiche" des Lebens (Woese, Microbiological Reviews 51 (1987), 221-271). Die
Verzweigungsmuster zeigen den Grad der durch Mutation entstandenen Unterschiede
der 16S-rRNA-Sequenzen der dargestellten Organismen. Durch derartige Vergleiche
können die Eubakterien von Archaebakterien und Eukaryoten leicht unterschieden
werden.
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Figur 2 zeigt einen detaillierteren evolutionären Stammbaum des
eubakteriellen Reichs (ebenda). Bisher wurden auf der Basis eines Vergleichs der 16S-rRNA-
Sequenzen etwa 10 Hauptabteilungen/Stämme definiert. Bestimmte Unterschiede der
eubakteriellen Abteilungen können im klinischen Zusammenhang wichtig sein, und
bestimmte erfindungsgemäße Sonden zeigen eine bevorzugte Hybridisierung an eine oder
mehrere eubakterielle Abteilungen. Daher werden die in den Tabellen 3, 4 und 5
aufgeführten Testorganismen gemäß den in Figur 2 dargestellten Abteilungen eingeteilt, so
daß signifikante Hybridisierungsmuster leicht unterschieden werden können.
Kurze Beschreibung der Tabellen
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Tabelle 1 zeigt die Ausrichtung der Nucleotidsequenzen der bevorzugten
erfindungsgemäßen 16S-rRNA-Sonden auf ihre Zielnucleotidsequenzen in 16S-rRNA von
E. coli. Ein sehr umfangreicher Sequenzvergleich von etwa 350 ausgerichteten 16S- und
18S-rRNA-Sequenzen wurde während der Entwicklung der erfindungsgemäßen Sonden
durchgeführt. Es ist aus praktischen Gründen nicht möglich, diese Analyse im Detail zu
zeigen. Eine Konsensussequenz (CONS-90 %) für stark konservierte 16S-rRNA-
Nucleotidpositionen wird jedoch als Zusammenfassung der
Nucleotidsequenzvariationsmuster, die bei repräsentativen Eubakterien gefunden wurden, dargestellt. Ein
Nucleotid auf der CONS-90 %-Linie zeigt, daß das Nucleotid an der homologen
Position in 90 % oder mehr der untersuchten eubakteriellen Sequenzen gefunden wird.
Beachte, daß alle Zielbereiche der Sonde den Clustern der starken
Sequenzkonservierung der eubakteriellen 16S- und 23S-rRNA-Moleküle entsprechen.
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Da die 16S- und 23S-rRNA-Sequenzen von E. coli zu den ersten vollständig
erhaltenen rRNA-Sequenzen gehörten, wurden die zugewiesenen Positionsnummern zu
einem praktischen und allgemein üblichen Standard zur eindeutigen Identifizierung der
homologen Bereiche in anderen untersuchten rRNA-Sequenzen. In Tabelle 1 wird die E.
coli-RNA (Ziel)-Sequenz vom 5'- zum 3'-Ende geschrieben. Sondensequenzen bestehen
aus DNA und werden vom 3'- zum 5'-Ende geschrieben, ausgenommen die Sonden
1638, 1642 und 1643, die nicht an die rRNA selbst, sondern an die
rRNA-komplementäre Sequenz hybridisieren. Die letzten Sonden weisen den gleichen "Sinn" (d. h.,
Polarität) wie die rRNA auf und werden vom 5'- zum 3'-Ende geschrieben.
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Tabelle 2 zeigt die Ausrichtung der Nucleotidsequenzen der bevorzugten
erfindungsgemäßen 23S-rRNA-Sonden auf ihre Zielnucleotidsequenzen in der 23S-rRNA
von E. coli. Wie in Tabelle 1 wird die E. coli-Sequenznummerierung als Standard
verwendet, um die homologen Zielsequenzen der Sonden in allen 23S-rRNAs zu
identizieren. CONS-90 % hat die gleiche Bedeutung wie in Tabelle 1. Für die 23S-rRNA-
Analysen waren nur etwa 30 Sequenzen verfügbar. Diese repräsentieren jedoch den
größten Teil der in Figur 2 dargestellten eubakteriellen Abteilungen. In der Sequenz von
Sonde 1730 ist "R" ein 1:1 Gemisch von A und G in dieser Position.
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Tabelle 3 erläutert das Inklusivitäts- und Exkluvitätsverhalten einiger
bevorzugter 16S-rRNA-Sonden in einem repräsentativen Dot-Blot-Hybridisierungstest mit
eubakteriellen und nicht-eubakteriellen rRNA-Präparaten.
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Tabelle 4 erläutert das Inklusivitäts- und Exkluvitätsverhalten einiger
bevorzugter 23S-rRNA-Sonden in einem repräsentativen Dot-Blot-Hybridisierungstest mit
eubakteriellen und nicht-eubakteriellen rRNA-Präparaten.
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Tabelle 5 erläutert das Inklusivitäts- und Exkluvitätsverhalten einiger weiterer
bevorzugter 16S- und 23S-rRNA-Sonden in einem repräsentativen Dot-Blot-
Hybridisierungstest mit eubakteriellen und nicht-eubakteriellen rRNA-Präparaten. Diese
Sonden zeigen nützliche Hybridisierungsmuster mit spezifischen Untergruppen von
Eubakterien - besonders gram-positiven und gram-negativen Bakterien.
Genaue Beschreibung und beste Ausführungsform der Erfindung
Strategie zur Entwicklung der Sonden
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Der erste Schritt zur Entwicklung der erfindungsgemäßen Sonden war die
Identifizierung von Bereichen der 16S- und 23S-rRNA, die potentiell als Zielstellen für
Eubakterien-spezifische Nucleinsäuresonden geeignet sind. Dazu sind Zielstellen
erforderlich, die
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1) unter eubakteriellen rRNA-Sequenzen stark konserviert sind (geringe
Nucleotidaustausche, Deletionen oder Insertionen) und
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2) sich wesentlich von nicht-eubakteriellen rRNA-Sequenzen unterscheiden.
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Dazu wurden genaue Sequenzvergleiche der verfügbaren 16S- und 23S-
rRNA-Sequenzen durchgeführt. Einige 16S- und 23S-rRNA-Sequenzen wurden als Teil
dieser Arbeiten ermittelt. Die Ermittlung derartiger Nucleotidsequenzen erfolgte durch
Standardlaborprotokolle, entweder durch Clonierung (Maniatis et al., 1982, Molecular
Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, S. 545)
und Sequenzierung (Maxam und Gilbert, Proceedings of the National Academy of
Science USA 74 (1977), 560-564, Sanger et al., Proceedings of the National Academy
of Science USA 74 (1977), 5463-5467) der die rRNAs codierenden Gene und/oder
durch direkte Sequenzierung der rRNAs selbst unter Verwendung von Reverser
Transkriptase (Lene et al., Proceedings of the National Academy of Science USA 82
(1985), 6955-6959, Lene, Manuskript in Vorbereitung).
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Ein Computeralgorithmus, der auf der Basis der Ausrichtung des Satzes der
16S- und 23S-rRNA-Sequenzen arbeitet, wurde zur Identifizierung von Bereichen, die
innerhalb der Eubakterien die größte Homologie aufweisen, verwendet.
Nucleinsäuresonden für derartige Bereiche hybridisieren an ein breites Spektrum
unterschiedlicher Eubakterien.
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Derartige, innerhalb der Eubakterien homologe Bereiche wurden anschließend
auf Unterschiede im Vergleich zu nicht-eubakteriellen rRNA-Sequenzen untersucht.
Insbesondere wurden Unterschiede in den Sequenzen zwischen Eubakterien und
Menschen, Pilzen und Mitochondrien gesucht.
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Einundvierzig Sonden wurden auf der Basis dieser Analysen entwickelt: 22
23S-rRNA- und 19 16S-rRNA-Sonden.
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Das Hybridisierungsverhalten dieser Sonden im Bezug auf ein breites
Spektrum von Eubakterien wurde durch Hybridisierungsanalyse in einem Dot-Blot-
Format ermittelt.
Physikalische Beschreibung der Sonden
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Die vorstehend beschriebene Selektionsstrategie lieferte eine Reihe von
Sonden, die zur Identifizierung von Eubakterien in Proben verwendet werden können,
und die die nachstehend beschriebenen bevorzugten Oligonucleotidsonden einschließen.
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Die erfindungsgemäßen Sonden sind in den beigefügten Ansprüchen
beschrieben und weisen folgende Nrn. auf: 1661, 1739, 1746, 1743, 1639, 1640, 1641, 1656,
1657, 1653, 1654, 1655, 1651, 1652, 1595, 1600, 1601, 1602, 1598, 1599, 1596 oder
1597. Alle anderen Sonden werden zu Vergleichszwecken bereitgestellt.
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16S-rRNA-Sonden:
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* Bezugnahme darauf in Anspruch 1.
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23S-rRNA-Sonden:
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* Bezugnahme darauf in Anspruch 1.
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* Bezugnahme darauf in Anspruch 1.
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Das spezifische Verhalten der vorstehend beschriebenen Sonden hängt in
einem erheblichen Maß vom verwendeten Testformat ab. Umgekehrt diktiert das
Testformat bestimmte optimale Eigenschaften der jeweiligen Sonden. Das "Wesen" der
erfindungsgemäßen Sonden soll nicht so ausgelegt werden, daß es auf die spezifische
Nucleotidfolge in den aufgeführten Sonden beschränkt ist. Die Länge dieser spezifischen
Oligonucleotide wurde beispielsweise zur Verwendung im nachstehend beschriebenen
Dot-Blot-Verfahren (und bestimmten anderen vorgesehenen Tests) optimiert. Es ist dem
Fachmann bekannt, daß die optimale Sondenlänge eine Funktion der Stringenz der
gewählten Hybridisierungsbedingungen ist und die Länge der jeweiligen Sonden daher in
Übereinstimmung damit geändert werden kann. Es ist ferner im Hinblick auf Sätze von
mehr als einer Sonde wünschenswert, daß alle Sonden sich in einem bestimmten
verwendeten Format kompatibel verhalten. Daher gibt die genaue Länge einer bestimmten
Sonde in gewissen Ausmaß ihre beabsichtigte spezifische Verwendung wieder. Auch im
Hinblick auf die erfindungsgemäßen Sonden ist sich der Fachmann dessen bewußt.
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Das "Wesen" der hier beschriebenen Sonden beruht auf der Entwicklung und
Verwendung der vorstehend beschriebenen und in Tabelle 1 und Tabelle 2 dargestellten
Sequenzen.
Hybridisierungsanalyse des Sondenverhaltens
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Die Sequenzvergleiche, mit denen die beschriebenen Zielsequenzen gefunden
wurden, ließen den Schluß zu, daß viele der Sonden mit einer erheblichen Zahl von
Eubakterien hybridisieren. Für die 16S-rRNA-Analysen wurden bei der Entwicklung der
Sonden etwa 350 Sequenzen berücksichtigt. Für die 23S-rRNA-Analysen waren nur
etwa 30 eubakterielle Sequenzen verfügbar. Da nicht jeder eubakterielle Stamm getestet
werden kann, können in anderen, nicht durch Sequenzanalyse getesteten eubakteriellen
Stämmen die Sequenzen stark variieren, wodurch eine Hybridisierung der gewünschten
Sonden an derartige nicht-getestete Eubakterien verringert oder verhindert werden kann.
Wie die Tabellen 3, 4 und 5 zeigen, hybridisieren einige Sonden von äußerst breiter
Inklusivität trotzdem nicht an bestimmte Bakterien. Daher ist die genaue Aufklärung des
Hybridisierungsverhaltens gegen eine große und repräsentative Zahl von Eubakterien ein
wichtiges Element für den Nachweis, daß alle Eubakterien durch derartige Sonden
nachgewiesen werden können, oder umgekehrt für den Nachweis, welche Eubakterien
nicht nachgewiesen werden können. Letzteres muß nicht klinisch signifikant sein oder
kann alternativ durch eine entsprechende Verwendung anderer erfindungsgemäßer
Sonden kompensiert werden.
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Ebenso wichtig wie das Inklusivitätsverhalten der Sonden ist ihr
Exklusivitätsverhalten, d. h. ihr Reaktionsvermögen mit Nicht-Eubakterien. Wie bereits
erwähnt ist der Nachweis einer fehlenden Hybridisierung an Mensch- und Pilz-rRNAs
von überragender Bedeutung für die klinischen Verwendungsmöglichkeiten dieser
Sonden. Daher wurde das Sondenverhalten gegen repräsentative Eubakterien-,
Mensch- und Pilz-rRNAs durch Dot-Blot-Hybridisierungsanalyse ermittelt.
Beispiel 1: Dot-Blot-Analyse des Sonden-Hybridisierungsverhaltens
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In einer üblichen Dot-Blot-Analyse wird eine Nucleinsäure oder eine
Population von Nucleinsäuren auf einem Filter, beispielsweise Nitrozellulose, Nylon
oder andere, speziell für diesen Zweck im Handel erhältliche derivatisierte Membranen,
immobilisiert. DNA oder RNA kann auf einem derartigen Filter leicht immobilisiert und
anschließend mit Sonden untersucht oder bei unterschiedlichen Bedingungen (d. h.,
unterschiedlich stringenten Bedingungen) mit den jeweiligen Nucleotidsequenzen oder
Sonden auf eine Hybridisierung getestet werden. Unter stringenten Bedingungen zeigen
Sonden, deren Nucleotidsequenzen eine größere Komplementarität zur Zielsequenz
aufweisen, ein höheres Hybridisierungsniveau als weniger komplementäre Sonden. Für die
meisten hier beschriebenen Oligonucleotidsonden ist eine Hybridisierung an rRNA-Ziele
über einen Zeitraum von 14 bis 16 Stunden bei 60ºC (in einer Hybridisierungslösung,
die 0,9 M NaCl, 0,12 M Tris-HCl, pH-Wert 7,8, 6 mM EDTA, 0,1 M K&sub3;PO&sub4;, 0,1 %
SDS, 0,1 % Pyrophosphat, 0,002 % Ficoll, 0,02 % BSA und 0,002 %
Polyvinylpyrrolidon) mit anschließenden Standard-Nachhybridisierungswaschschritten
zur Entfernung der ungebundenen und nicht-spezifisch hybridisierenden Sonde (bei
60ºC in 0,03 M NaCl, 0,004 M Tris-HCl, pH-Wert 7,8, 0,2 mM EDTA und 0,1 %
SDS) zum Erhalt der in den Tabellen 3, 4 und 5 dargestellten Spezifität ausreichend
stringent. Diese Bedingungen gelten nicht für die Sonden 1738 (die bei 37ºC
hybridisiert wurde) und 1746 (die bei 37ºC hybridisiert und bei 50ºC gewaschen wurde).
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Es sind ferner Verfahren bekannt, in denen DNA oder RNA, die in
(ungereinigten) Rohlysaten von Zellen vorhanden ist, ohne vorherige Reinigung der
jeweiligen Nucleinsäure immobilisiert werden kann (z. B. T. Maniatis, E. F. Fritsch und
J. Sambrook, 1982, Molecular Cloning: A Laboratory Manual).
-
Die in den Tabellen 3, 4 und 5 dargestellten Ergebnisse der Dot-Blot-
Hybridisierung wurden durch Hybridisierung der angegebenen Sonden an gereinigte
RNA-Präparate erhalten, die von den angegebenen individuellen Eubakterien, Pilzen
und Menschen stammten. Bakterien- und Pilz-RNAs wurden aus Reinkulturen der
angegebenen Organismen gewonnen. Maus-RNA wurde aus L-Zellen (einer Zellinie einer
Gewebekultur) gereinigt. Weizenkeim-RNA wurde aus einem kommerziellen Präparat
dieses Getreideprodukts gereinigt. Von menschlichem Blut und Stuhl stammende RNAs
wurden aus Proben gereinigt, die von normalen, gesunden Individuen erhalten wurden.
-
Gereinigte RNA wurde aus einer Reihe einfacher technlscher Gründe anstelle
von Zellysaten verwendet. Der wichtigste Grund betrifft die richtige Interpretation des
relativen Signals, das nach der Hybridisierung der jeweiligen Sonde an die einzelnen
Organismen erhalten wird. Es ist bekannt, daß der RNA-Gehalt pro Zelle zwischen
unterschiedlichen Bakterien stark und zwischen Bakterien und eukaryotischen Zellen noch
stärker schwankt. Der spezifische metabolische Status von Zellen zur Zeit der Ernte
kann außerdem auch einen starken Einfluß auf die Menge und Integrität der gewonnenen
RNA haben. Einige Bakterien beginnen beispielsweise mit dem Abbau ihrer RNA sehr
schnell nach dem Erreichen der stationären Wachstumsphase. Die in den Tabellen 3, 4
und 5 dargestellten Organismen stellen in jeder Hinsicht eine äußerst unterschiedliche
Ansammlung dar. Die Tabellen zeigen gram-positive und gram-negative,
photosynthetische und chemosynthetische, heterotrophe und lithotrophe und anaerobe und aerobe
Bakterien. Wenn jeweils bekannte, äquivalente Mengen an gereinigter RNA zum
Auftupfen verwendet werden, ist ein aussagekräftiger Vergleich des relativen
Hybridisierungsniveaus jeder Sonde an jeden Organismus möglich, ohne daß die
Eigenarten der aus den einzelnen dargestellten Bakterientypen hergestellten
Nucleinsäurepräparation berücksichtigt werden müssen.
-
RNA wurde durch ein veröffentlichtes Standardverfahren hergestellt, das
modifiziert wurde (W. Weisburg, unveröffentlicht). Durch das Verfahren werden schnell
große Mengen an RNA mit hohem Molekulargewicht in hochreiner, jedoch relativ
unfraktionierter Form erhalten. In so hergestellter RNA wird nur wenig bzw. keine DNA
oder niedermolekulare RNA gefunden.
-
Ein großer Teil der RNA in intakten Zeilen ist 16S- und 23S-rRNA (18S- und
28S-rRNA in Eukaryoten). Das Verfahren ist schnell und kaum arbeitsaufwendig,
jedoch nicht für eine Interpretation der in den Tabellen 3, 4 und 5 dargestellten Dot-Blot-
Ergebnisse geeignet. Durch die meisten anderen in der Literatur beschriebenen üblichen
Verfahren zur Gewinnung von ausreichend intakter RNA werden äquivalente
Hybridisierungsergebnisse erhalten.
-
Für die in den Tabellen 3, 4 und 5 dargestellten Hybridisierungsexperimente
wurden die Sonden unter Verwendung von Standardverfahren mit radioaktivem
Phosphor (³²P) endmarkiert. Nach der vorstehend beschriebenen Hybridisierung und
dem Waschen wurden die Hybridisierungsfilter einem Röntgenfiim ausgesetzt und die
Intensität des Signals im Hinblick auf die Spots der Kontroll-RNA, die eine bekannte
Menge von Ziel-RNA von bekannter Sequenz enthielten, bewertet.
-
Eine Skala der Hybridisierungsintensität, die von + + + +
(Hybridisierungssignal, das den Kontroll-Spots äquivalent ist) bis + (selbst nach langer
Belichtung des Röntgenfilms kaum nachweisbar) reichte, wurde zum Vergleich von
Hybridisierungssignalen zwischen Organismen und Sonden verwendet. Das Signal
+ + + zeigt ein sehr starkes Signal an, das nur wenig schwächer als das der Kontroll-
Spots ist. + + zeigt ein deutlich unterscheidbares Hybridisierungssignal an, das jedoch
deutlich schwächer als das der Kontroll-Spots ist. Beachte, daß zwar mehr "quantitative"
Wege zur Aufzeichnung von Hybridisierungssignalen verfügbar sind, diese jedoch
mühsamer anzuwenden sind und erfahrungsmäßig auch nicht wirklich nützlicher zur
Bewertung von Proben als das in den Tabellen 3, 4 und 5 verwendete Verfahren.
Aufgrund von bestimmten unkontrollierbaren Variablen beim Auftupfen von genau
äquivalenten Mengen an (äquivalent intakter) Ziel-RNA von so unterschiedlichen
Organismen sind numerisch genauere Zählverfahren nur scheinbar quantitativer.
Erfahrungsgemäß kann ein Organismus, der ein + + oder größeres Signal mit einer
bestimmten Sonde erzeugt leicht von einem Organismus unterschieden werden, der ein
"-"-Signal erzeugt. Dies gilt für verschiedene getestete Testformate.
-
Wie den Tabellen 3 und 4 entnommen werden kann, hybridisieren die 23S-
rRNA-Sonden 1600, 1602, 1596, 1256 und 1512 und 16S-rRNA-Sonden 1738, 1660,
1639, 1739, 1740, 1741 und 1743 am besten an Eubakterien und werden daher am
meisten bevorzugt. Andere Sonden hybridisieren in unterschiedlichen Mustern an
Untergruppen von Eubakterien und werden für den Nachweis der Untergruppen oder als
Bestandteile von Sondensätzen mit einer breiteren Inklusivität bevorzugt. Die Sonden
1599, 1656, 1744, 1745 und 1746 hybridisieren beispielsweise bevorzugt an
gram-positive Bakterien. Die Sonden 1657, 1598 und 1595 hybridisieren bevorzugt an
gram-negative Bakterien, besonders an Mitglieder der Abteilung der sogenannten
Purpurbakterien (Figur 2 und Tabelle 5).
-
Andere Sonden zeigen andere nützliche Hybridisierungsmuster, wie es die
Daten in den Tabellen 3, 4 und 5 zeigen. Diese Sonden können auf vielfache Weise
kombiniert werden, um Sondensätze herzustellen, die die kombinierten
Hybridisierungseigenschaften der enthaltenen Sonden zeigen. Ein Beispiel eines derartigen
Hybridisierungsformats wird nachstehend beschrieben (Beispiel 2).
-
In einer anderen Ausführungsform können die Sonden in einer Reihe von
subtraktiven Hybridisierungsschemata verwendet werden, in denen spezifische rRNA-
Moleküle, die in einer gemischten Population von Organismen vorhanden sind, vor oder
gleichzeitig mit den Zielorganismus-spezifischen Sonden, aus dem Pool entfernt werden
(z. B. Collins, europäische Patentanmeldung 87309308.2, EP-A-0 265 244).
Beispiel 2: Doppelsonde in einem Sandwich-Hybridisierungstest
-
Die erfindungsgemäßen Sonden oder deren Derivate können in einer Reihe
anderer Hybridisierungsformate vorteilhaft verwendet werden. Ein derartiges Format ist
eine Doppelsonde in einem, beispielsweise in USSN 277,579, USSN 169,646 oder
USSN 233,683 beschriebenen Sandwich-Hybridisierungstest. Bei der Verwendung einer
derartigen Doppelsonde wird im Idealfall eine Sonde (beispielsweise die Sonde 1602
oder ein Derivat davon) an ihrem 3'-Terminus so modifiziert, daß sie einen Bereich von
etwa 20 bis 200 Desoxyadenosin (dA)-Resten enthält. Mit diesem Abschnltt wird die
Ziel-rRNA (nach der Flüssighybridisierung) aus der Testprobe auf einem dazu in
geeigneter Weise mit Polydesoxythymidin (dT) derivatisierten festen Träger (z. B. Perlen,
Plastikoberfläche, Filter, etc.) "eingefangen". Eine zweite Sonde (beispielsweise Sonde
1596 oder ein Derivat davon) wird anschließend vorteilhaft als Nachweissonde
verwendet und in geeigneter Weise mit einem nachweisbaren Ligand (z. B. ³²P, Fluorescein,
Biotin etc.) derivatisiert. Das Vorhandensein der Zielnucleinsäure in einer Testprobe
wird anschließend durch Einfangen des Nachweisliganden auf der festen Oberfläche
durch mehrere Hybridisierungsinteraktionen nachgewiesen:
Fester Träger
(Zielnucleinsäure)
(Einfangsonde)
(Nachweissonde)
Ligan
-
Dies kann nur erfolgen, wenn die Zielnukleinsäure in der Testprobe
vorhanden ist. Grundsätzlich kann das vorstehend beschriebene Schema mit mehreren
Einfangund Nachweissonden (Sondensätzen), beispielsweise zur Förderung der Inklusivität oder
Empfindlichkeit des Tests, verweitet werden.
Beispiel 3: PCR-Amplifikation der 16S-rRNAs
-
Die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) ist ein allgemein bekanntes Verfahren
zur Amplifikation einer Zielnukleinsäure durch "Kopieren" der zwischen zwei
Zielsequenzen liegenden Nucleinsäuresequenzen (US 4,683,202). Das PCR-Verfahren
kann in einem Test zur Diagnose, beispielsweise eines nicht-viralen Pathogens, durch
Amplifikation der die rRNA des Pathogens codierenden Gene oder der rRNA-Gene und
anschließenden Nachweis des Produkts verwendet werden. Zur Durchführung dieser
Diagnosestrategie müssen Primer, die die rRNA des (der) Zielorganismus(en)
amplifizieren können, entwickelt werden. Eine zweite wichtige Anwendung derartiger Primer
ist die Clonierung von amplifizierten rRNA-Genen, und eine dritte Anwendung ist die
direkte Sequenzierung der amplifizierten rRNA-Gene.
-
Die Sonden 1638, 1642, 1643, 1637, 1639*, 1640* und 1641* können ideal
als Primer zur enzymatischen Kopierung und/oder Amplifikation eubakterieller 16S-rR-
NAs oder der sie codierenden Gene verwendet werden. Das PCR-Verfahren variiert
geringfügig im Detail, je nachdem, ob die Zielnucleinsäure einzel- oder doppelsträngig ist
* in Anspruch 1 aufgelistet
-
und ob es sich um DNA oder RNA handelt. Das Prinzip bleibt jedoch immer gleich.
Die durchzuführenden Schritte sind nachstehend kurz beschrieben:
-
1) Doppelsträngige DNA wird denaturiert.
-
2) Oligonucleotid-Primer lagern sich an beide Schwester-DNA-Stränge, zu
denen sie komplementär sind, an und
-
3) Desoxynucleotidtriphosphat-Vorläufer werden durch Verlängerung der
Primer von den 3'-Termini unter Verwendung der DNA-Polymerase und/oder Reversen
Transkriptase in die neu synthetisierten Schwester-DNA-Stränge eingebaut.
-
Somit ist für die PCR-Reaktion ein Paar von Oligonucleotid-Primern
erforderlich, von denen zu jedem Strang innerhalb des Zielgens jeweils einer komplementär
ist. Sie werden so positioniert, daß das neu synthetisierte Produkt eines Primers auch ein
Ziel/Matrize für den anderen Primer ist. So kann die zwischen den beiden Primer-
Anlagerungsstellen liegende Zielnucleotidsequenz durch 20 bis 30 Wiederholungen der
vorstehend beschriebenen Schritte vielfach amplifiziert werden.
-
Die Sonden 1638, 1642, 1643, 1637, 1639*, 1640* und 1641* können als
Primer zur enzymatischen Kopierung und/oder Amplifikation eubakterieller 16S-rRNAs
oder der sie codierenden Gene verwendet werden. Das heißt, als Sondensatz lagern sie
sich an ein breites Spektrum von eubakteriellen rRNAs und rRNA-Genen an und
amplifizieren daher alle in einer Probe vorhandenen eubakteriellen rRNA-Sequenzen.
-
Die Sonden 1637, 1639*, 1640* und 1641* hybridisieren etwa am 3'-Ende an
die 16S-rRNA (oder den der rRNA-entsprechenden Strang des ribosomalen RNA-Gens)
(Tabelle 1). Der Matrizenstrang wird von 3'- in 5'-Richtung gelesen, wobei ein rRNA-
komplementärer Strang erhalten wird, der den Primer an seinem 5'-Terminus enthält.
-
Die Sonden 1638, 1642 und 1643 hybridisieren etwa am 5'-Ende des rRNA-
komplementären Strangs des rRNA-Gens oder an einen komplementären Strang, der wie
unmittelbar vorstehend beschrieben erzeugt wird.
-
Im einzelnen weisen die vorstehend beschriebenen 16S-rRNA-Amplifikations-
Primer etwa die nachstehend beschriebenen Eigenschaften auf:
-
5 '-Primer:
-
Sonde 1638: die meisten Eubakterien
* in Anspruch 1 aufgelistet
-
Sonde 1642: Darmbakterien und Verwandte
-
Sonde 1643: Borrelia spirochetes
-
3'-Primer:
-
Sonde 1637: die meisten Eubakterien
-
*Sonde 1639: Darmbakterien, Deinococcus und Campylobacter
-
*Sonde 1640: die meisten Eubakterien
-
*Sonde 1641: Fusobakterien und mehrere Bacillus-Arten
-
In Testproben, in denen das Zielbakterium bekannt ist, können spezifische
Primer verwendet werden. Wenn der Zielorganismus nicht genau bekannt ist
(beispielsweise ein beliebiges Eubakterium) können alle vorstehend beschriebenen
Primer als Satz verwendet werden.
-
Die vorstehend beschriebenen Primer sind zur Amplifikation beinahe der
vollständigen 16S-rRNA-Sequenz entwickelt worden. Alle anderen erfindungsgemäßen
Sonden oder Derivate davon können zur Amplifikation von Teilsegmenten der 16S- und
23S-rRNAs oder Gene in der vorstehend beschriebenen Weise verwendet werden.
-
Alle Primer können vielfältig modifiziert werden, um beispielsweise RNA-
Polymerase-Promotoren, Clonierstellen, etc. in die amplifizierten Transkripte
einzubauen.
-
Obwohl die Erfindung im Bezug auf den Nachweis von rRNA beschrieben
wurde, ist es leicht verständlich, daß die hier beschriebenen Sonden und die zu den hier
beschriebenen Sonden komplementären Sonden auch zum Nachweis der die rRNA
codierenden Gene (DNA) verwendet werden können, und somit liegen derartige Sonden
im Schutzbereich der Erfindung.
* in Anspruch 1 aufgelistet
Tabelle 1: 16S-rRNA-Sonden und Zielsequenzen
Sonde
Tabelle 1 (Fortsetzung): 16S-rRNA-Sonden und Zielsequenzen
Sonde
Tabelle 2: 23S-rRNA-Sonden und Zielsequenzen
Sonde
Tabelle 2: (Fortsetzung): 23S-rRNA-Sonden und Zielsequenzen
Sonde
Tabelle 3: Dot-Blot-Hybridisierung der 16S-rRNA-Sonden
Sonden-Hybridisierung
Gattung Art
Stamm
div
Acinetobacter calcoaceticus
Aeromonas sobria
Alteromonas putrefaciens
Citrobacter amalonaticus
Citrobacter diversus
Citrobacter freundii
Edwardsiella tarda
Enterobacter agglomerans
Enterobacter cloacae
Enterobacter sakazakii
Escherichia coli
Haemophilus influenza
Haemophilus ducreyi
Hafnia alvei
Morgenella morganii
Klebsiella pneumoniae
Proteus mirabilis
Providencia alcalifaciens
Pseudomonas aeruginosa
Salmonella arizona
Salmonella typhimurium
Serratia marcescens
Shigella flexneri
Vibrio parahaemolyticus
Xanthomonas maltophilia
Yersinia enterocolitica
Alcaligenes faecalis
Branhamella catarrhalis
Chromobacterium violaceum
Kingella indologenes
Moraxella osloensis
Moraxella phenylpyruvica
Purpur
gamma
beta
Tabelle 3 (Fortsetzung): Dot-Blot-Hybridisierung der 16S-rRNA-Sonden
Sonden-Hybridisierung
Gattung Art
Stamm
div
Borrelia burgdorferi
Borrelia turicatae
Leptospira interrogans-pomona
Leptospira biflexa (Patoc-Patoc)
Leptospira biflexa (CDC)
Spirochaeta aurantia
Bacteroides fragilis
Bacteroides thetaiotaomicron
Bacteroides melaninogenicus
Flavobacterium meningosepticum
Chlamydia psittaci
Chlamydia trachomatis
Chlorobium limicola
Chloroflexus aurantiacus
Deinococcus radiodurans
Planctomyces maris
RNA aus normalem Stuhl
Maus L-Zellen
Weizenkeim
normales menschliches Blut
Candida lusitaniae
Candida parapsilosis
Canida tropicalis
Candida albicans
Spiro
Bact
Chlam
Misc
A Inklusivitäts und Exklusivitätsdaten wurden nach
Expositionen über Nacht ermittelt.
AA Von jedem Organismus wurden 100 ng CsTFA-gereinigte RNA verwendet.
AAA Sonde 1738 - Hybridisierung und Waschen wurden bei 37ºC
durchgeführt. ++++ = positives Kontrollergebnis für eine
Hybridisierung + + kaum nachweisbar und
- = nicht nachweisbar, ND = nicht ermittelt.
Tabelle 3 (Fortsetzung): Dot-Blot-Hybridisierung der 16S-rRNA-Sonden
Sonden-Hybridisierung
Gattung Art
Stamm
div
Mycoplasma pneumoniae
Mycoplasma putrefaciens
Peptostreptococcus productus
Planococcus citreus
Staphlyococcus aureus
Staphylococcus epidermidis
Staphylococcus haemolyticus
Streptococcus agalactiae
Streptococcus bovis
Streptococcus faecalis
Streptococcus morbillorum
Streptococcus mutans
Streptococcus pneumoniae
Streptococcus salivarius
Streptococcus sanguis
Bifidobacterium dentium
Corynebacterium genitalium
Corynebacterium glutamicum
Corynebacter. pseudodiphtheriticum
Corynebacterium pseudotuberculosis
Corynebacterium pyogenes
Corynebacterium xerosis
Mycobacterium bovis
Mycobacterium kansasii
Nocardia asteroides
Rhodococcus rhodochrous
Aerococcus viridans
Fusobacterium necrophorum
Fusobacterium prausnitzii
Gemella haemolysans
Heliobacillus mobilis
Phormidium ectocarpi
Plectonema boryanum
Misc
Cyano
Tabelle 3 (Fortsetzung): Dot-Blot-Hybridisierung der 16S-rRNA-Sonden
Sonden-Hybridisierung
Gattung Art
Stamm
div
Neisseria gonorrhoeae
Neisseria meningitidis
Pseudomonas acidovorans
Pseudomonas cepacia
Rhodocyclus gelatinosa
Vitreoscilla stercoraria
Achromobacter xerosis
Acidiphilium cryptum
Agrobacterium tumefaciens
Brucella abortus
Flavobacterium capsulatum
Mycoplana bullata
Pseudomonas diminuta
Rhodobacter sphaeroides
Rhodospirillum rubrum
Thiobacillus versutus
Desulfovibrio desulfuricans
Cardiobacterium hominis
Francisella tularensis
Campylobacter jejuni
Campylobacter pylori
Campylobacter sputorum
Bacillus brevis
Bacillus subtilis
Clostridium clostridioforme
Clostridium sordellii
Clostridium sporogenes
Clostridium histolyticum
Clostridium perfringens
Clostridium ramosum
Kurthia zopfii
Lactobacillus acidophilus
Lactobacillus plantarum
Listeria monocytogenes
Purpur
alpha
delta
Campy
wenig
Tabelle 4: Dot-Blot-Hybridisierung der 23S-rRNA-Sonden
Sonden-Hybridisierung
Gattung Art
Stamm
div
Acinetobacter calcoaceticus
Aeromonas sobria
Alteromonas putrefaciens
Citrobacter amalonaticus
Citrobacter diversus
Citrobacter freundii
Edwardsiella tarda
Enterobacter agglomerans
Enterobacter cloacae
Enterobacter sakazakii
Escherichia coli
Haemophilus influenza
Haemophilus ducreyi
Hafnia alvei
Morganella morganii
Klebsiella pneumoniae
Proteus mirabilis
Providencia alcalifaciens
Pseudomonas aeruginosa
Salmonella arizona
Salmonella typhimurium
Serratia marcescens
Shigella flexneri
Vibrio parahaemolyticus
Xanthomonas maltophilia
Yersinia enterocolitica
Alcaligines faecalis
Branhamella catarrhalis
Chromobacterium violaceum
Kingella indologenes
Moraxella osloensis
Purpur
gamma
beta
Tabelle 4 (Fortsetzung): Dot-Blot-Hybridisierung der 23S-rRNA-Sonden
Sonden-Hybridisierung
Gattung Art
Stamm
div
Morexella phenylpyruvica
Neisseria gonorrhoeae
Neisseria meningitidis
Pseudomonas acidovorans
Pseudomonas cepacia
Rhodocyclus gelatinosa
Vitreoscilla stercoraria
Achromobacter xerosis
Acidiphilium cryptus
Agrobacterium tumefaciens
Brucella abortus
Flavobacterium capsulatm
Mycoplana bullata
Pseudomonas diminuta
Rhodobacter sphaeroides
Rhodospirillum rubrum
Thiobacillus versutus
Desulfovibrio desulfuricans
Cardiobacterium hominis
Francisella tularensis
Campylobacter jejuni
Campylobacter pylori
Campylobacter sputorum
Bacillus brevis
Bacillus subtilis
Clostridum clostridioforme
Clostridium sordellii
Clostridium sporogenes
Clostridium histolyticum
Clostridium perfringens
Clostridium ramosum
Kurthia zopfii
Lactobacillus acidophilus
Lactobacillus plantarum
Purpur
alpha
delta
Campy
wenig
Tabelle 4 (Fortsetzung): Dot-Blot-Hybridisierung der 23S-rRNA-Sonden
Sonden-Hybridisierung
Gattung Art
Stamm
div
Listeria monocytogenes
Mycoplasma pneumoniae
Mycoplasma putrefaciens
Peptostreptococcus productus
Planoccus citreus
Staphylococcus aureus
Staphylococcus epidermidis
Staphylococcus haemolyticus
Streptococcus agalactiae
Streptococcus bovis
Streptococcus faecalis
Streptococcus morbillorum
Streptococcus mutans
Streptococcus pneumoniae
Streptococcus salivarius
Streptococcus sanguis
Bifidobacterium dentium
Corynebacterium genitalium
Crynebacterium glutanicum
Corynebacterium pseudodiphtheriticum
Corynebacterium pseudotuberculosis
Cornebacterium pyogenes
Corynebacterium xerosis
Mycobacterium bovis
Mycobacterium kansasii
Nocardis asteroides
Rhodococcus rhodochrous
Aerococcus viridans
Fusobacterium necrophorum
Fusobacterium prausnitzii
Gemella haemolysans
Heliobacillus mobilis
Phormidium ectocarpi
viel
Misc
Cyano
Tabelle 4 (Fortsetzung): Dot-Blot-Hybridisierung der 23S-rRNA-Sonden
Sonden-Hybridisierung
Gattung Art
Stamm
div
Plectonema boryanum
Borrelia burgdorferi
Borrelia turicatae
Leptospira interrogans-pomona
Leptospira biflexa (Patoc-Patoc)
Leptospira biflexa (CDC)
Spirochaeta aurantia
Bacteroides fragilis
Bacteroides thetaiotaomicron
Bacteroides melaninogenicus
Flavobacterium meningosepticum
Chlamydia psittaci
Chlamydia trachomatis
Chlorobium limicola
Chloroflexus aurantiacus
Deinococcus radiodurans
Planctomyces maris
RNA von normalen Stuhlproben
Maus-L-Zelle
Weizenkeim
Normales menschliches Blut
Canida lusitaniae
Canida parpsilosis
Candida tropicalis
Canida albicans
Spiro
Bact
Chlam
Misc.
A Inklusivitäts und Exklusivitätsdaten wurden nach
Expositionen über Nacht ermittelt.
AA Von jedem Organismus wurden 100 ng CsTFA-gereinigte RNA
verwendet. ++++ = positiver Hybridisierungsgrad, + = kaum
nachweisbar und - = nicht nachweisbar,
ND = nicht ermittelt.
Tabelle 4 (Fortsetzung): Dot-Blot-Hybridisierung der 23S-rRNA-Sonden
Sonden-Hybridisierung
Gattung Art
Stamm
div
Acinetobacter calcoaceticus
Aeromonas sobria
Alteromonas putrefaciens
Citrobacter amalonaticus
Citrobacter diversus
Citrobacter freundii
Edwardsiella tarda
Enterobacter agglomerans
Enterobacter cloacae
Enterobacter sakazakii
Escherichia coli
Haeomphilus influenza
Haemophilus ducreyi
Hafnia alvei
Morganella morganii
Klebsiella pneumoniae
Proteus mirabilis
Providencia alcalifaciens
Pseudomonas aeruginosa
Salmonella arizona
Salmonella typhimurium
Serratia marcescens
Shigella flexneri
Vibro parahaemolyticus
Xanthomonas maltophilia
Yersinia enterocolitica
Alcaligenes faecalis
Branhamella catarrhalis
Chromobacterium violaceum
Kingella indologenes
M oraxella osloensis
Purpur
gamma
beta
Tabelle 4 (Fortsetzung): Dot-Blot-Hybridisierung der 23S-rRNA-Sonden
Sonden-Hybridisierung
Gattung Art
Stamm
div
Morexella phbenylpyruvica
Neisseria gonorrhoeae
Neisseria meningitidis
Pseudomonas acidovorans
Pseudomonas cepacia
Rhodocyclus gelatinosa
Vitrreoscilla stercoraria
Achromobacter xerosis
Acidiphilium cryptus
Agrobacterium tumefaciens
Brucella abortus
Flavobacterium capsulatm
Mycoplana bullata
Pseudomonas diminuta
Rhodobacter sphaeroides
Rhodospirillum rubrum
Thiobacillus versutus
Desulfovibrio desulfuricans
Cardiobacterium hominis
Francisella tularensis
Campylobacter jejuni
Campylobacter pylori
Campylobacter sputorum
Bacillus brevis
Bacillus subtilis
Clostridum clostridioforme
Clostridum sordellii
Clostridum sporogenes
Clostridum histolyticum
Clostridum perfringens
Clostridum ramosum
Kurthia zopfii
Lactobacillus acidophilus
Lactobacillus plantarum
Purpur
alpha
delta
Campy
wenig
Tabelle 4 (Fortsetzung): Dot-Blot-Hybridisierung der 23S-rRNA-Sonden
Sonden-Hybridisierung
Gattung Art
Stamm
div
Listeria monocytogenes
Mycoplasma pneumoniae
Mycoplasma putrefaciens
Peptostreptococcus productus
Planococcus citreus
Staphylococcus aureus
Staphylococcus epidermidis
Staphylococcus haemolyticus
Streptococcus agalactiae
Streptococcus bovis
Streptococcus faecalis
Streptococcus morbillorum
Streptococcus mutans
Streptococcus pneumoniae
Streptococcus salivarius
Streptococcus sanguis
Bifidobacterium dentium
Corynebacterium genitalium
Crynebacterium glutamicum
Corynebacterium pseudodiphtheriticum
Corynebacterium pseudotuberculosis
Corynebacterium pyogenes
Corynebacterium xerosis
Mycobacterium bovis
Mycobacterium kansasii
Nocardis asteroides
Rhodococcus rhodochrous
Aerococcus viridans
Fusobacterium necrophorum
Fusobacterium prausnitzii
Gemella haemolysans
Heliobacillus mobilis
Phormidium ectocarpi
viel
Misc
Cyano
Tabelle 4 (Fortsetzung): Dot-Blot-Hybridisierung der 23S-rRNA-Sonden
Sonden-Hybridisierung
Gattung Art
Stamm
div
Plectonema boryanum
Borrelia burgdorferi
Borrelia turicatae
Leptospira interrogans-pomona
Leptospira biflexa (Patoc-Patoc)
Leptospira biflexa (CDC)
Spirochaeta aurantia
Bacteroides fragilis
Bacteroides thetaiotaomicron
Bacteroides melaninogenicus
Flavobacterium meningosepticum
Chlamydia psittaci
Chlamydia trachomatis
Chlorobium limicola
Chloroflexus aurantiacus
Deinococcus radiodurans
Planctomyces maris
Normal Stool RNA
Mouse L-Cell
Wheat Germ
Normal Human Blood
Candida lusitaniae
Candida parapsilosis
Candida tropicalis
Candida albicans
Spiro
Bact
Chlam
Misc.
A Inklusivitäts und Exklusivitätsdaten wurden nach
Expositionen über Nacht ermittelt.
AA Von jedem Organismus wurden 100 ng CsTFA-gereinigte RNA
verwendet. ++++ = positiver Hybridisierungsgrad, + = kaum
nachweisbar und - = nicht nachweisbar,
ND = nicht ermittelt.
Tabelle 5: Dot-Blot-Hybridisierung - grampositive + gramnegative Sonden
Sonden-Hybridisierung
RNA-Ziel
Gattung Art
Stamm
div
Acinetobacter calcoaceticus
Aeromonas sobria
Alteromonas putrefaciens
Citrobacter amalonaticus
Citrobacter diversus
Citrobacter freundii
Edwardsiella tarda
Enterobacter agglomerans
Enterobacter cloacae
Enterobacter sakazakii
Escherichia coli
Haemophilus influenza
Haemophilus ducreyi
Hafnia alvei
Morganella morganii
Klebsiella pneumoniae
Proteus mirabilis
Providencia alcalifaciens
Pseudomonas aeruginosa
Salmonella arizona
Salmonella typhimurium
Serratia marcescens
Shigella flexneri
Vibrio parahaemolyticus
Xanthomonas maltophilia
Yersinia enterocolitica
Alcaligines faecalis
Branhamella catarrhalis
Chromobacterium violaceum
Kingella indologenes
Moraxella osloensis
Morexella phenylpyruvia
Purpur
gamma
beta
Tabelle 5 (Fortsetzung): Dot-Blot-Hybridisierung - grampositive + gramnegative
Sonden
Sonden-Hybridisierung
RNA-Ziel
Gattung Art
Stamm
div
Borrelia burgdorferi
Borrelia turicatae
Leptospira interrogans-pomona
Leptospira biflexa (Patoc-Patoc)
Leptospira biflexa (CDC)
Spirochaeta aurantia
Bacteroides fragilis
Bacteroides thetaiotaomicron
Bacteroides melaninogenicus
Flavobacterium meningosepticum
Chlamydia psittaci
Chlamydia trachomatis
Chlorobium limicola
Chloroflexus aurantiacus
Deinococcus radiodurans
Planctomyces maris
RNA von normalen Stuhlproben
Maus-L-Zelle
Weizenkeim
Normales menschliches Blut
Candida lusitaniae
Candida parapsilosis
Candida tropicalis
Candida albicans
Spiro
Bact
Chlamy
Misc
A Inklusivitäts und Exklusivitätsdaten wurden nach
Expositionen über Nacht ermittelt.
AA Von jedem Organismus wurden 100 ng CsTFA-gereinigte RNA
verwendet.
AAA ++++ = positiver Hybridiserungsgrad, + = kaum
nachweisbar und - = nicht nachweisbar. Sonde 1746 wurde bei
37ºC hybridisiert und bei 50ºC gewaschen.
Tabelle 5 (Fortsetzung): Dot-Blot-Hybridiserung - grampositive + gramnegative
Sonden
Sonden-Hybridisierung
RNA-Ziel
Gattung Art
Stamm
div
Mycoplasma pneumoniae
Mycoplasma putrefaciens
Peptostreptococcus productus
Planococcus citreus
Staphylococcus aureus
Staphylococcus epidermidis
Staphylococcus haemolyticus
Streptococcus agalactiae
Streptococcus bovis
Streptococcus faecalis
Streptococcus morbillorum
Streptococcus mutans
Streptococcus pneumoniae
Streptococcus salivarius
Streptococcus sanguis
Bifidobacterium dentium
Corynebacterium genitalium
Crynebacterium glutamicum
Corynbacterium pseudodiphtheriticum
Corynebacterium pseudotuberculosis
Corynebacterium pyogenes
Corynebacterium xerosis
Mycobacterium bovis
Mycobacterium kansasii
Nocardia asteroides
Rhodococcus rhodochrous
Aerococcus viridans
Fusobacterium necrophorum
Fusobacterium prausnitzii
Gemella haemolysans
Heliobacillus mobilis
Phormidium ectocarpi
Plectonema boryanum
viel
Misc
Cyano
Tabelle 5 (Fortsetzung): Dot-Blot-Hybridisierung - grampositive & gramnegative
Sonden
Sonden-Hybridisierung
RNA-Ziel
Gattung Art
Stamm
divNeisseria gonorrhoeae
Neisseria meningitidis
Pseudomonas acidovorans
Pseudomonas capacia
Rhodocyclus gelatinosa
Vitreoscilla stercoraria
Achromobacter xerosis
Acidiphilium cryptum
Agrobacterium tumefaciens
Brucella abortus
Flavobacterium capsulatum
Mycoplana bullata
Pseudomonas diminuta
Rhodobacter sphaeroides
Rhodospirillum rubrum
Thiobacillus versutus
Desulfovibrio desulfuricans
Cardiobacterium hominis
Francisella tularensis
Campylobacter jejuni
Campylobacter pylori
Campylobacter sputorum
Bacillus brevis
Bacillus subtilis
Clostridium clostridioforme
Clostridum sordellii
Clostridium sporogenes
Clotridium histolyticum
Clostridum perfringens
Clostridum ramosum
Kurthia zopfii
Lactobacillus acidophilus
Lactobacillus plantarum
Listeria monocytogenes
Purpur
alpha
delta
Misc
Campy
wenig