JP2004510162A - 規定した化学量論の結合体 - Google Patents
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Abstract
本発明は、化学量論が均一である生体分子−リンカー結合体の生成プロセスに関する。特に、５ｋＤから５００ｋＤ の分子量の生体分子ならびに１から１５ｋＤの分子量および４から６０個の荷電した残基を有する親水性リンカー分子からなり、化学量論が均一である生体分子リンカー産物を少なくとも一つ予め選択された量で含むことを特徴とする結合体に関する。
Description
【０００１】
本発明は、化学量論が均一である生体分子リンカー結合体の生成プロセスに関する。特に、５ｋＤから５００ｋＤ の分子量の生体分子ならびに１から１５ｋＤの分子量および４から６０個の荷電した残基を有する親水性リンカー分子からなり、予め選択された量の化学量論が均一である生体分子リンカー産物を少なくとも一つ含むことを特徴とする結合体に関する。
【０００２】
結合アッセイは、現在では、研究環境ならびに臨床の日常的な業務、特に薬剤の感染モニターの診断または正常なもしくは異常な代謝を評価するための診断において広く使用されている。
【０００３】
結合アッセイの使用は、約３０年前にさかのぼる（Ｅｎｇｖａｌｌ， Ｅ． とＰｅｒｌｍａｎ， Ｐ．， Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ８ （１９７１） ８７１−４； ｖａｎ Ｗｅｅｍｅｎ， Ｂ．Ｋ． とＳｃｈｕｕｒｅｓ Ａ．Ｈ．Ｗ．Ｍ．（１９７１）， ＦＥＢＳ ｌｅｔｔｅｒｓ １５， ２３２）。その後、大きな発展がなされ、特定の結合アッセイならびにその実用的な適用を行う方法は、当業者にとって一般的な知識となっている。関連する教科書に要約されている方法や手法は、参照により本明細書に包含され、ほんの少しの例のみが、特に、「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ 」 （１９９２） Ａｃａｄｅｍｉｃ ＰｒｅｓｓのＴｉｊｓｓｅｎ による「Ｐｒａｃｔｉｃｅ ａｎｄ ｔｈｅｏｒｙ ｏｆ ｅｎｚｙｍｅ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ」；および免疫学的検出方法を取り扱った「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ 」，Ｃｏｌｏｗｉｃｋ Ｓ． Ｐ．， Ｃａｐｌａｎ Ｎ．Ｏ．，編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓの多くの版、特に第７０，７３，７４，８４，９２および１２１ 巻でのみ言及されているだろう。
【０００４】
非常にわずかな同種または沈降型アッセイを除いて、これら全てのアッセイは、生体分子（たとえば抗体）と、調査中の分析物の測定を促進するのに必要な第二の分子との間の結合体を必要としている。この第二の分子についての周知の例は、たとえば、酵素、放射性同位体、発光団、フルオロフォアなどのようなマーカー基または標識基、あるいはハプテンである。
【０００５】
生体分子と、たとえばマーカー基またはハプテン基との結合体は、２つの異なる分子実体の直接の化学的カップリングによってまたは現在の技術水準の手法に従って、リンカーまたは架橋分子を用いることによって合成され得る（たとえば、Ｔｉｊｓｓｅｎ またはＭｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ 、上記）。
【０００６】
しかしながら、従来の結合体は、はっきりした限定をもつ。かかる結合体のうち２または３成分、すなわち、生体分子、リンカー（もし、存在すれば）、およびマーカー基はお互いと相互にかつ逆に作用しうるという周知の問題がある。これは、頻繁に凝集またはバックグラウンドの問題を生じる。
【０００７】
選ばれたカップリング化学反応またはリンカー化学反応に依存して、多くの場合、たとえば、マーカー基を有するまで終了しないポリペプチドのアミノ酸基も修飾される。これは、再び、予測できない結果を生じ、たとえば、不安定性、凝集のような問題または免疫アッセイにおける非特異的結合に対する生体分子の物理化学的特性の変化を経る。
【０００８】
かかる結合体の種々の成分、たとえば、生体分子、リンカー分子およびマーカー分子ならびにこれら由来の異なるカップリング産物が統計的量で存在している。平均の標識化指標を有する純粋な統計的混合物が得られる。平均の標識化指標は、反応条件および選ばれた個々の分子の実体の割合を調整することによってある程度までコントロールされ得る。
【０００９】
かかる統計的混合物は、異なる化学量論の異なる結合体産物を多く含む。リンカー構造またはマーカー構造を完全に持たない生体分子、１：１の化学量論、１：２の化学量論（すなわち、２個のリンカー分子またはマーカー分子を有する生体分子）、１：３の化学量論およびさらにより高い化学量論の結合体は、かかる結合体中に存在し得る。かかる産物はすべてが所望されるわけではなく、たとえば、結合体の再現性に関して問題を引き起こすものではないことは明らかである。また、標識されていない生体分子は、標識された生体分子を妨げる。「過剰標識」、すなわち、多すぎるハプテン構造またはマーカー構造で標識された生体分子が非特異的な相互作用、たとえば、バックグラウンドの現象として知られた問題についての主要な理由であることも既知である。
【００１０】
米国特許第５，９５８，７８３ 号明細書は、親水性リンカーの実体を用いることにより、マーカー基として金属キレート複合体で引き起こされるバックグラウンドの問題を減少することができることを開示している。しかしながら、米国特許第５，９５８，７８３ 号明細書に記載の結合体は、種々の異なる生体分子−リンカー−マーカー産物の統計的混合物も示している。これらの統計的結合体の再現性にも問題が残っている。
【００１１】
ＷＯ９６／０３４２３およびＷＯ９６／０３６５１には、合成中に予め決定された位置にマーカー基を導入することができることが記載されている。この方法では、化学量論が均一であるペプチドリンカー（マーカー）産物を合成することができる。しかしながら、ペプチド合成の限界は、分子量５ｋＤ（ｋＤ＝キロダルトン）未満のペプチドに対応する４０〜５０個のアミノ酸の範囲である。５ｋＤを超えるポリペプチドは、通常、適切な宿主系における組み換え発現によって産生され、統計的組成物の結合体を生じるように、化学的にカップリングされる必要がある。ＷＯ９６／０３４２３およびＷＯ９６／０３６５７のリンカーは、１ｋＤ未満であり、荷電した残基を含まない。
【００１２】
大きな生体分子、たとえば、４０〜５０個のアミノ酸からなるポリペプチドは、通常、標準的なカップリング化学反応の一つに敏感に反応する反応基を一つより多く有する。
【００１３】
化学的カップリングの形態およびストラテジーは、必要な場合に選択され得る。生体分子がチロシンの−ＳＨ 、−ＮＨ２または−ＣＯＯ −残基ならびに−ＯＨ 基を標的とする化学反応をカップリングするポリペプチドである場合、ヒスチジンのイミダゾール基またはトリプトファンのヘテロ環イミノ基がすぐ近くにある。いくつかの適切なカップリング化学反応は、これらの官能基のそれぞれに関して当該分野から公知である（Ａｓｌａｍ， Ｍ． Ｄｅｎｔ， Ａ． Ｔｈｅ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ−ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ ｉｎ 「Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ」（１９９８）２１６−３６３， Ｌｏｎｄｏｎ， ＭｃＭｉｌｌａｎ）。
【００１４】
１より多くの反応基が生体分子化学製品に存在するときは必ず、リンカーまたはマーカーとのカップリングが、異なる生体分子−リンカー産物または生体分子−マーカー産物の統計的混合物を生じる。
【００１５】
もっとも発展したリンカーおよびカップリング化学反応についてでさえ、得られる結合体は多くの異なる結合体の統計的混合物であり、かつかかる結合体の全ての結果は、大いに変動して予期できない。結果として、数多くのものからかかる結合体の全ての特性を再生するのは非常に難しい。
【００１６】
したがって、本発明の課題は、生体分子およびリンカー分子との間の結合体がより再現可能でかつ規定された方法で得られるかどうかを調査することにあった。また、プロセスが発見され得るかどうかも調査され、化学量論が均一である予め選択された生体分子−リンカー産物の少なくとも一つを含む結合体を得る方法も記載された。
【００１７】
おどろくべきことに、当該分野で既知の問題が、本発明の結合体、それらの生成様式および適当な試薬、キットおよび手法におけるそれらの使用によって解決され得ることがわかった。
【００１８】
予め選択された量の化学量論が均一である生体分子−リンカー産物を少なくとも１つ含む結合体の生成プロセスであり、結合体が５ｋＤから５００ｋＤ の分子量の生体分子および１ｋＤから１５ｋＤの分子量かつ４から６０個の荷電した残基を有する親水性リンカー分子からなり、ａ）生体分子とリンカー分子とがお互いと共有結合され、ｂ）化学量論が均一である異なる生体分子−リンカー産物がクロマトグラフィーにより分画され、ならびにｃ）化学量論が均一であるカップリング産物を含む画分が集められることを特徴とする生成プロセスが開示されている。
【００１９】
本発明はまた、５ｋＤから５００ｋＤ の分子量の生体分子かつ１から１５ｋＤの分子量および４〜６０個の荷電した残基を有する親水性リンカー分子からなる結合体であり、該結合体が予め選択された量の化学量論が均一である生体分子−リンカー産物を少なくとも一つ含有することを特徴とする結合体に関する。
【００２０】
本発明の結合体は、サンプル中の分析物の検出のための生物学的または免疫学的アッセイを行うのに特に有用である。したがって、本発明は、前記結合体を含む試薬の組成物、試薬組成物の一部としてかかる結合体を含有する試験キットならびにかかる結合体に基づく免疫アッセイにも関する。
【００２１】
発明の詳細な説明
本発明の好ましい態様は、予め選択された量の化学量論が均一である生体分子−リンカー産物を少なくとも一つ含有する結合体の生成プロセスであり、該結合体が５ｋＤから５００ｋＤ の分子量の生体分子かつ、１ｋＤから１５ｋＤの分子量および４から６０個の荷電した残基を有する親水性リンカー分子からなり、
ａ）生体分子とリンカー分子とがお互いと共有結合され、
ｂ）化学量論が均一である異なる生体分子−リンカー産物がクロマトグラフィーにより分画され、ならびに
ｃ）化学量論が均一であるカップリング産物を含む画分が集められる
ことを特徴とする生成プロセスである。
【００２２】
「結合体」という用語は、生体分子とリンカー分子との間のカップリング産物を記載するのに使用される。本発明の結合体は、予め選択された量の化学量論が均一である生体分子−リンカー産物を少なくとも一つ含有する。
【００２３】
本発明の意味における生体分子とは、アミノ酸、ヌクレオチド、ヌクレオシド、脂質、および／または糖のような生物学的分子から構成される、５から５００ ｋＤの分子量を有する任意の天然分子または合成的に生成された分子であり得る。好ましくは、生体分子は、ポリペプチド、多糖、およびリポ多糖からなる群より選ばれる。好ましくは、生体分子は１０ｋＤ〜５００ ｋＤの範囲の分子量を有する。より好ましくは、生体分子は１５ｋＤ〜４００ｋＤ の範囲、最も好ましくは２０ｋＤ〜２００ｋＤ の範囲の分子量を有する。
【００２４】
生体分子は、好ましくは、標準的なカップリング化学反応に敏感に反応する基を少なくとも２つ有する。反応基、官能基、またはカップリング部位として当該分野で公知であるこれらの基の例は、さらに以下に記載される。
【００２５】
好ましい態様において、生体分子は、ポリペプチドである。好ましくはかかるポリペプチドは５０〜５０００個のアミノ酸、より好ましくは１００ 〜４０００個のアミノ酸を有する。
【００２６】
本発明のリンカーは、１ｋＤ〜１５ｋＤの分子量を持ちかつ少なくとも４つの荷電した残基を有する。所定の分子量の範囲は、活性基またはマーカー基を持たない塩基性リンカー分子に適用される。
【００２７】
前記リンカーの分子量は、少なくとも１０００Ｄ であるのは、該リンカーの利点が特に明らかとなるからである。リンカーの分子量は、１０００〜１５，０００Ｄ の範囲であるのが好ましく、１０００〜１２，０００Ｄ の範囲が特に好ましく、１０００〜１０，０００Ｄ の範囲であるのが最も好ましい。また、リンカー分子の分子量の範囲については、１５００から１５０００Ｄの間、また１５００から１００００Ｄの間であることが好ましい。
【００２８】
本発明の結合体を生成するのに使用されるリンカーは、好ましくはペプチド骨格を有する。
【００２９】
本発明の意味において「荷電キャリアー」という用語は、６〜８の範囲のｐＨ値でイオンの形で主に存在する基を意味する。リンカーは、好ましくは４〜６０個、特に好ましくは６〜５０個、最も好ましくは９〜４０個のかかる荷電キャリアーを含む。
【００３０】
すべての荷電キャリアーは正または負に荷電されることが好ましい。しかしながら、両方、すなわち正および負に荷電した残基を有するリンカー分子を使用することもできる。かかる場合において、正に荷電した残基の数は、負に荷電した残基の数に比べて少なくとも４つまで高いまたは低いのいずれかである。
【００３１】
リンカーは、好ましくは負の荷電キャリアーを少なくとも４つ含む。適当な負の荷電キャリアーの例には、ホスフェート基、ホスホネート基、スルフィネート基、スルホネート基、スルフェート基およびカルボシキレート基があり、カルボシキレート基およびホスフェート基が最も好ましい。
【００３２】
さらに好ましくは、リンカーが少なくとも４つの正に荷電した残基を有する。正電荷キャリアーの例としては、アルキルが１〜６個のＣ原子を有する直鎖または分枝アルキル残基あるいは３〜６個のＣ原子を有する環状アルキル残基、グアニジニル基（たとえば、アルギニンの）、もしくは正に荷電したヘテロ芳香族窒素基（たとえば、ヒスチジンに見られるような）を示す、モノ、ジまたはトリアルキルアミノ基等のアミノ基およびモノ置換化もしくはポリ置換化アミノ基がある。正の荷電キャリアーは、好ましくはリジンなどの塩基性アミノ酸またはジエチルリジンなどの置換化アミノ酸から選択される。
【００３３】
リンカーは、荷電キャリアーのかわりとしてまたは荷電キャリアーに加えて荷電していない親水性基も含み得る。荷電していない親水性基の好ましい例としては、好ましくは少なくとも３つのエチレンオキシド単位を有するエチレンオキシド基またはポリエチレンオキシド基、スルホキシド基、スルホン基、カルボン酸アミド基、カルボン酸エステル基、ホスホン酸アミド基、ホスホン酸エステル基、リン酸アミド基、リン酸エステル基、スルホン酸アミド基、スルホン酸エステル基、硫酸アミド基および硫酸エステル基である。アミド基は好ましくは一級アミド基、特に好ましくはアミノ酸側鎖基中のカルボン酸アミド残基（たとえば、アミノ酸であるアスパラギンおよびグルタミン）である。エステルは、親水性アルコール、特にＣ１ 〜Ｃ３ アルコールまたはジオールまたはトリオール由来のものが好ましい。
【００３４】
本発明のリンカーは、好ましくはさらなる化学構造を有するように修飾される。最も好ましくはかかる修飾リンカーは、式（Ｚ−Ｌ−Ｘｎ）で示されかつ１つのＺ基と１または数個のＸ基（ｎ＝１〜１０）を有する（式中、Ｌは該リンカーのコア構造である）。
【００３５】
反応基Ｚは、生体分子に対してリンカーを化学的に共有するのに用いられる。Ｚ基は、好ましくはカルボン酸ハロゲニド、カルボン酸無水物、カルボン酸ヒドラジド、カルボン酸アジドまたは活性エステル（たとえば、Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミド、ｐ−ニトロフェニル、ペンタフルオロフェニル、イミダゾリルまたはＮ−ヒドロキシベンゾトリアゾリルエステル）、アミン、マレイミド、チオール、パラアミノベンゾイル基または光活性基（たとえば、アジド）などの活性化カルボン酸基である。
【００３６】
いずれかのＸ基は、上記Ｚについて規定されたような反応基であるか、またはＸはマーカー基である。Ｘが反応基である場合、一倍だけ存在し、かつリンカーはヘテロ二機能性リンカーである。当業者が、ＸについておよびＺについての反応基の適切な組み合わせを選択することは何ら困難ではない。ヘテロ二機能性リンカーにおける適当な活性基の例としては、たとえば、Ａｓｌａｍ， Ｍ． Ｄｅｎｔ， Ａ．に挙げられる。タンパク質−タンパク質の調製は、「Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ」 （１９９８） ２１６−３６３， Ｌｏｎｄｏｎ， ＭｃＭｉｌｌａｎ または「Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅ ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ 」 （１９８５） ２５８−２６８ におけるＴｉｊｓｓｅｎ 研究所テクニックに活用される。Ｘがマーカー基である場合、１０倍まで、好ましくは４倍まで存在する。また、好ましいマーカー基は２倍または１倍存在する。
【００３７】
本発明に使用されるリンカーは、「直鎖」または「分枝」リンカーであってもよい。荷電した直鎖リンカーは、米国特許第５，９５８，７８３ 号明細書から公知である。かかる直鎖リンカーは、好ましくは１５〜３５０ 個の原子の鎖長を有し、アミド機能などのヘテロ原子の組み込みにより修飾されたアルキレン鎖である。遊離荷電キャリアーを含有する直鎖リンカーは、好ましくはアミノカルボン酸単位で少なくとも部分的に構成される。かかるアミノカルボン酸単位は、好ましくは、ペプチド結合を介して共に結合される。リンカーは、天然アミノ酸単位ならびに合成アミノ酸単位を含み得る。好ましくは、リンカーは、ジペプチドβ−アラニン−グルタミン酸を繰り返し含有する。好ましいリンカー構造は、５から７０倍、より好ましくは１０から６０倍、最も好ましくは１５から５０倍のジペプチドβ−アラニン−グルタミン酸を含む。
【００３８】
さらに好ましい態様におけるリンカーは、分枝リンカーである。
【００３９】
分枝リンカーは、好ましくは、上記のような、１または数個の荷電していない親水性基特にカルボン酸アミド基および／またはポリエチレングリコール基を含有する１つの主鎖を含み、一方、１つまたは数個の側鎖において少なくとも４つの荷電キャリアーがある。この場合、たとえば、側鎖あたり１〜１０個の荷電キャリアー、特に１〜５個の荷電キャリアーが存在し得る。
【００４０】
あるいは、また、分枝リンカーは、主鎖に荷電キャリアーおよび１つまたは数個の側鎖に荷電していない親水性基を含み得る。さらなる態様では、主鎖および側鎖は荷電していない親水性基ならびに荷電キャリアーを含むことも考えられる。
【００４１】
分枝リンカーは、いくつかのマーカー基を有するように合成され得るというさらなる利点を有する。かかるリンカー（マーカー）構造の共有的カップリングは、生体分子あたりおよびカップリング事象あたり数個のマーカー基の導入を引き起こす。好ましいリンカー（マーカー）構造は、２または４個のマーカー基を有する。
【００４２】
分枝リンカーの主鎖の長さは、好ましくは７〜２００ 原子、特に好ましくは７〜１００ 原子であり、その場合、主鎖は、ヘテロ原子（たとえば、Ｏ原子）またはアミド基の組み込みにより修飾されたアルキレン鎖であり、かつ少なくとも１つの分枝部位を含み、分枝部位で形成された側鎖は、好ましくは４〜１００ 原子の長さを有する。荷電キャリアーは、主鎖および／または側鎖のアルキレン単位のＨ原子が荷電キャリアー（たとえば、ＮＨ３ ＋ またはＣＯ２ − またはグアニジル基）を含む基で置換されるような様式でリンカーにあることが好ましい。
【００４３】
遊離荷電キャリアーまたは／および親水性基を含む分枝リンカーは、ペプチド結合により共に結合されるアミノカルボン酸単位で少なくとも部分的に構成されるのが好ましい。かかるリンカーにおいて、一つの官能基は側鎖合成のための開始点として使用され得る主鎖に組み込まれた後もなお存在するように、分枝点は、少なくとも３つの官能基（たとえば、アミノ基またはカルボキシレート基）を含む多機能性アミノカルボン酸から誘導され得る。分枝鎖は、特に好ましくはリジン、オルニチン、ヒドロキシリジン、α，β−ジアミノプロピオン酸などのジアミノカルボン酸で生じる。
【００４４】
分枝リンカーの荷電キャリアーは、好ましくは２つの荷電した基のリンカーへの組み込み、およびその付随反応の後、少なくとも１つの遊離荷電キャリアーがまだ存在するように、少なくとも３つの荷電した基（たとえば、アミノ基、カルボキシレート基またはホスフェート基）の全部を含む多機能性アミノカルボン酸の遊離した正および／または負に荷電した基から誘導され得る。たとえば、荷電キャリアーは、（ａ）アミノ基および２つのカルボキシレート基または（ｂ）２つのアミノ基および１つのカルボキシレート基を含む、三機能性アミノカルボン酸から誘導され得る。かかる三機能性アミノカルボン酸の例としては、リジン、オルニチン、ヒドロキシリジン、α，β−ジアミノプロピオン酸、アルギニン、アスパラギン酸およびグルタミン酸、カルボキシグルタミン酸および欧州特許第０ ６１８ １９２ 号明細書もしくは米国特許第５，５１９，１４２ 号明細書に記載のような対称三機能性カルボン酸がある。あるいは、三機能性アミノカルボン酸（ａ）中のカルボキシレート基の１つは、ホスフェート基、スルホネート基または硫酸基で置換され得る。かかる三機能性アミノ酸の例としては、ホスホセリンがある。
【００４５】
あるいは、分枝リンカーは、また、ホスフェート−糖単位（たとえば、核酸塩基を持たないＤＮＡ骨格）で少なくとも部分的に構成され得るかグリコペプチド構造で構成され得る。さらに、リンカーは、また、糖類単位で少なくとも部分的に構成され得る。任意の場合に、リンカーの側鎖は、三機能性単位で形成された主鎖の分枝鎖にあるのが好ましく、側鎖の長さは、合成に使用される基礎単位（たとえば、天然または合成アミノ酸あるいはエチレングリコールなどの他の成分）の少なくとも２つである。
【００４６】
本発明によれば、１〜１５ｋＤの分子量を有するリンカー分子を５〜５００ ｋＤの生体分子にカップリングし、化学量論が均一であるカップリング産物を単離または選択することができる。単離された画分は、次いで、第２の分子を第一の結合体にカップリングするのに最適に使用することができる。
【００４７】
本発明のプロセスのさらに好ましい態様において、生体分子への化学的カップリングに使用される荷電したリンカー分子は、１または数個のマーカー基をすでに有している。マーカー基の例としては、標識基およびエフェクター基がある。いくつかの場所では、マーカー基が既にリンカーに付着され得るという事実が、リンカー（マーカー）を書き込むこと（ｗｒｉｔｅ）によりさらに示されている。
【００４８】
マーカー基が小さくなればなるほど、現在の技術水準の手法による生体分子とマーカーとの間での化学量論が均一であるカップリング産物の分離はより難しくなる。
【００４９】
好ましくは、マーカー基（標識基またはエフェクター基）は、１５０００Ｄ未満、より好ましくは１００００Ｄ未満の分子量を有する。最も好ましくは、マーカー基は５０００Ｄ よりさらに小さい。好ましい態様において、リンカーに付着したマーカー基は、３０００Ｄ 以下の分子量を有する。
【００５０】
かかるリンカー（マーカー）、すなわち、１または数個のマーカー基をいっしょに持つリンカーの完全な分子量は、好ましくは２０ｋＤ以下、より好ましくは１５ｋＤ以下、最も好ましくは１０ｋＤ以下である。
【００５１】
標識基は、任意の検出可能な既知の基（たとえば、染料）、化学発光基などの発光標識基（たとえば、アクリジニウムエステルまたはジオキシエタン）、または蛍光染料（たとえば、フルオレセイン、クマリン、ローダミン、オキサジン、レゾルフィン、シアニン）およびそれらの誘導体から選択され得る。標識基の他の例には、ルテニウム複合体またはユーロピウム複合体などの発光金属複合体、ＣＥＤＩＡ（クローン化酵素ドナー免疫アッセイ、たとえば欧州特許第０ ０６１ ８８８ 号明細書）に使用される酵素、および放射性同位体がある。
【００５２】
エフェクター基は、たとえば、バイオアフィン（ｂｉｏａｆｆｉｎｅ） 結合対の１つのパートナーを含む。アッセイを行いながら、エフェクター基は、バイオアフィン結合対の他のパートナーと特異的に、かつ好ましくは非共有結合的に相互作用する。適当な結合パートナーの例には、ハプテンまたは抗原／抗体、ビオチンまたはアミノビオチンなどのビオチンアナログ、イミノビオチンまたはデスチオビオチン（ｄｅｓｔｈｅｉｏｂｉｏｔｉｎ）／アビジンまたはストレプトアビジン、糖／レクチン、核酸または核酸アナログ／相補的核酸、レセプター／リガンド（たとえば、ステロイドホルモンレセプター／ステロイドホルモン）がある。好ましくは、リンカー（マーカー）が生体分子にカップリングされる前、より低分子量の結合対メンバーが、そのリンカーにカップリングされる。標識基について記載したように、好ましい分子量の範囲は、エフェクター基にも適用される。
【００５３】
好ましい結合対メンバーは、ハプテン、抗原およびホルモンを含む。特に好ましくは、ジゴキシンおよびビオチンのようなハプテンならびにそれらのアナログである。
【００５４】
荷電した直鎖リンカー分子−またはマーカーをすでに有するリンカー構造−は、米国特許第５，９５８，７８３ 号明細書に記載のように本質的に合成される。
【００５５】
荷電した分枝リンカー分子またはリンカー（マーカー）分子は、たとえば、固相合成法により得られる。固相合成法の第一段階では、アミノ酸がそのカルボキシレート基を介して、固相支持体にカップリングされ、次いで所望のリンカーがさらなるアミノ酸を続けてカップリングすることにより合成される。このプロセスで、側鎖基（たとえば、アミノ基またはカルボキレート基）として荷電した基を含む少なくとも１つのアミノ酸と、分枝部位として作用し、任意に保護された形である少なくとも１つのアミノ酸とが、本発明のリンカーを調製するのに使用される。所望のリンカーシークエンスの完了後、リンカーを固相支持体からはずす（ｃｌｅａｖｅ ｏｆｆ）または活性化マーカー（たとえば、活性エステルを有するマーカー）を固相に結合したペプチドの遊離Ｎ末端アミノ基にカップリングすることができる。固相からはずした後、反応基Ｚをペプチドリンカーのカルボキシ末端にカップリングすることができるまたは、カルボキシ末端自体を反応基Ｚとして作用させるのに使用する。存在し得る保護基ははずす。
【００５６】
固相合成の別の形式において、保護されたアミノ基およびカルボキシル基（ 例えば、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ−（−Ｒｕ（ビピリジル）３−ＯＨ）を含むアミノ酸マーカー結合体は、遊離カルボキシル基によって固相へアンカーされ得、ペプチドリンカーが、ブロックされたアミノ基の解離後に合成され得る。所望のリンカー配列の完成後、この複合体は、固相から切断される。反応基Ｚは、生じたペプチドリンカーのアミノ末端にカップリングされ得るか、または自身のアミノ末端を使用して反応基Ｚとして機能する。
【００５７】
一方で生体分子と、他方ではリンカー分子との化学カップリングは、種々の生体分子−リンカー産物の統計的混合物を誘導する。言い換えれば、このような粗結合体は、多くの異なるカップリング産物（すなわち、全く結合体化されていない生体分子、１つのリンカー構造を含む生体分子、２つのリンカー構造を含む生体分子など）を統計的量で含む。これらの生体分子−リンカー産物サブグループのそれぞれは、均一な化学量論によって特徴付けられる。これは、例えば、１つの生体分子あたり１つのリンカー構造を含むこのサブグループが１：１の均一な化学量論を有することを意味する。
【００５８】
例えば、ハプテン−タンパク質−結合体は、予め規定したモル比で化学的に活性なハプテンをタンパク質とインキュベートすることによって合成され得る。特定のカップリング化学反応は、種々の機能のアミノ酸基（−ＳＨ ；−ＮＨ２；−ＣＯＯ− ；−ＯＨ ；チロシンのイミノ基、ヒスチジンのイミダゾール基）を標的とすることが公知である。通常、これらの基は、タンパク質に繰り返し存在する。結果として、このハプテンは、一様には分布されないが、むしろこのハプテンは、ポワソン分布でタンパク質に結合される。ポワソン分布は、以下のように表され得る：
【数１】
【００５９】
Ｐ（ｒ）は、１分子あたりに結合されたｒ（０、１、２、３など）個のハプテンを有するタンパク質分子の関数（ｆｒａｃｔｉｏｎ）であり；ｍは反応混合物におけるハプテンとタンパク質との間の平均モル比であり；ｅ＝Ｅｕｌｅｒ 数、かつｒ！はｒの階乗（ｆａｃｕｌｔｙ ）（例えば、ｒ＝３の場合、ｒ！ ＝３×２×１）を示す。これは、例えば、１つのタンパク質分子あたりに結合された平均１つのハプテン分子を含むカップリング産物の粗混合物について、統計的にかつおおよそ３６．７％のタンパク質分子は全く標識化されず、３６．７％は１つのハプテン分子を所有し、１８．３％は２つのハプテン分子を所有し、６．１ ％は３つのハプテン分子を所有し、残りはいっそう高く標識されていることを意味する。
【００６０】
ここで例えば、生体分子とリンカー分子によって一緒に連結された小さいマーカー基（さらにそれ自身が例えば、免疫学的（ｉｍｍｕｎｏｌｇｉｃａｌ）アッセイにおけるバックグランドの減少に有利な効果を有する）との間の結合体が、予め測定され、予め規定された組成物においてすぐに利用可能であることは、本発明のきわめて魅力的な特徴である。
【００６１】
当該分野から公知の結合体は、通常、標識化指標によって特徴付けられる。この標識化指標は、１生体分子あたりの標識（またはリンカー（マーカー）基）の平均量を示す。従って、２．３ の標識化指標は、生体分子−標識産物の全混合物において１つの生体分子あたり２．３ 個の標識が存在することを示す。複雑な手法（例えば、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ （マトリクス支援レーザー脱離イオン化−飛行時間）質量分光学）によって化学量論が均一であるカップリング産物の相対量を測定することは、方法を精巧にすることで可能である。しかし、このような方法は、化学量論が均一である画分を分離するのに適切ではない。本発明の手法は、化学量論が均一である少なくとも１つの予め選択された生体分子リンカー産物を非統計的量で含む結合体の生成を可能にする。
【００６２】
用語「予め選択された」は、本発明の結合体が生体分子とリンカー分子との間の化学的結合体化の単なる統計的な結果ではなく、むしろ適切な画分の予め選択された結果であることを示すように使用される。化学量論が均一である１つのカップリング産物、または所望の場合、数個のカップリング産物は、随意に（必要な場合）すぐに選択され得、この結合体が意図される適用のために適切に構成され得る。
【００６３】
化学カップリングの形式およびストラテジーは、要求されるように選択され得る。生体分子が官能基として−ＳＨ 、−ＮＨ２または−ＣＯＯ− 残基を含むポリペプチドである場合、いくつかの適切なカップリング化学反応は、これらの官能基のそれぞれについて当該分野から公知であり、いくつかのみが言及されるべきである。注意深い読み手は、Ａｓｌａｍ， Ｍ． Ｄｅｎｔ， Ａ． Ｔｈｅ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ−ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ， 「Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ」（１９９８）２１６ 〜３６３， Ｌｏｎｄｏｎ， ＭｃＭｉｌｌａｎ に必要な詳細の全てを見出す。
【００６４】
生体分子のアミノ基（リジン側鎖の末端−ＮＨ２基またはＮＨ２ 基およびジアミノカルボン酸のωアミノ基）は、「アミノ化学反応」に基づくそれらへのマーカー基の化学的カップリングのために使用され得る。アミノ化学反応の周知の例は、特に活性化基と呼ばれる、例えば、ＮＨＳ−エステル、他の活性化エステル、酸塩化物およびアジドとアミノ基との反応を含む。
【００６５】
生体分子上のカルボキシル基（末端ＣＯＯ − 基、グルタミン酸またはアスパラギン酸のカルボキシ官能基）は、「カルボキシ化学反応」に基づく化学的カップリングのために使用される。カルボキシ化学反応の周知の例は、特に上記の活性化基を所有するためにこれらのカルボキシ基の活性化を含む。次いで、例えば、マーカー上のアミノ基へのカップリングが容易に実施される。
【００６６】
あるいは、生体分子上のスルフヒドリル基（例えば、システインの遊離ＳＨ− 基またはジスルフヒドリル結合を還元することによって得られる−ＳＨ 基）は、「スルフヒドリル化学反応」に基づく化学的カップリングのために使用される。スルフヒドリル化学反応の周知の例は、特にマレイミド（ｍａｌｅｉｍｉｄｏ ）基と−ＳＨ 基の反応、またはαハロゲンカルボン酸またはチオエーテルを用いるアルキル化を含む。
【００６７】
チロシン残基のヒドロキシル基またはヒスチジンのイミダゾール基はまた、生体分子へマーカーを共有結合するために助け（例えば、ジアゾニウム基の）として使用される。
【００６８】
生体分子をリンカーまたはリンカー（マーカー）へカップリングするための化学的反応は、実行され、必要な場合、当該分野から公知のように停止される。一方、当該分野において、通常、結合体化されていない小さいリンカーまたはリンカー（マーカー）分子のみが、高分子量の生体分子−リンカー画分から分離されるが、結合体化生体分子からの遊離生体分子の分離は非常に困難であるか、または不可能である。この分離およびまたその化学量論に従うカップリング産物の分離選択は、現在可能であり、クロマトグラフィー手法によって実施される。結合体化産物は、リンカー構造に起因する特性に基づいて、化学量論が均一である画分へ分離される。
【００６９】
新規な生体分子−リンカー産物の特に魅力的な特徴は、見かけ分子量、疎水性、および電荷における違いである。異なる化学量論を有する種々のカップリング産物の違いは、単純に１つの生体分子あたりのリンカーの数に依存する。
【００７０】
好ましい態様において、クロマトグラフィー分画が、（見かけ）分子量に基づく分離手法によって実施される。特有であるが異なる化学量論を有する種々のカップリング産物の分画は、分子量に基づいて可能であり、よく言えば、この分離は見かけ分子量の差に基づく。分子量における絶対的な差が、異なる化学量論のカップリング産物間で比較的に小さいにもかかわらず、見かけ分子量の差は、事実上明白である。これは、本発明において使用されるリンカー分子によって引き起こされる。これらの分子は１〜１５ｋＤの分子量を有しているが、これらの分子は、非常に異常なかつ非常に高い見かけ分子量を有するように移動する。
【００７１】
本発明に従って、現在、例えば、リンカー（標識）分子を所有しない、２つ、３つ、またはそれより多いリンカー（標識）分子を所有するＦａｂ’フラグメント由来の１つのリンカー（標識）分子を所有する約５０ｋＤの分子量を有する抗体のＦａｂ’フラグメントを容易に分離し、所望の場合、分画することは可能である。これは、実施例４および実施例５にならびに図１０および１１に例示される。このような分離は可能である。なぜならば、本発明に従う生体分子−リンカー結合体のリンカー構造は、その実際の分子量よりずっと高い見かけ分子量を有することが見出されているからである。
【００７２】
より大きな生体分子（例えば、Ｆ（ａｂ’）２ フラグメント（約１００ｋＤ ）、ＢＳＡ または免疫グロブリンＧおよび一旦適切なリンカーもしくはリンカー（マーカー）にカップリングされたリンカーまたはリンカー（マーカー）分子）間で均一な化学量論のカップリング産物を分離することは可能である。
【００７３】
生体分子についての見かけ分子量は、当該分野で公知の手法に従って容易に測定され得る。慣用的に使用されるものは、例えば、分子篩クロマトグラフィーである。目的の分子は、クロマトグラフィーされ、見かけ分子量は、この分子に対する保持時間を１つまたはいくつかの分子量マーカーの保持時間と比較することによって測定される。
【００７４】
見かけ分子量は測定に使用された手法によって非常に影響を及ぼされるので、生体分子の見かけ分子量およびリンカーまたはリンカー（マーカー）構造の見かけ分子量は共に、同じ手法によって測定される。
【００７５】
分子量クロマトグラフィーによる容易な分離のために、生体分子の見かけ分子量にマッチするリンカーが選択される。好ましくは、リンカー（マーカー）の見かけ分子量は、生体分子の少なくとも２０％および多くとも５００ ％の分子量である。それによって、以下のような特徴を有する、化学量論が均一である少なくとも１つの生体分子−リンカー産物を予め選択された量で含む結合体（この結合体は５ｋＤ 〜５００ｋＤ の分子量の生体分子および疎水性リンカー分子からなり、このリンカーは１ｋＤ 〜１５ｋＤの分子量、４〜６０個の荷電した残基および上記生体分子の見かけ分子量の２０％〜５００ ％の見かけ分子量を有する）の生成のためのプロセスが、本発明の好ましい態様を表す。このプロセスは、
（ａ）この生体分子およびこのリンカー分子が互いに共有結合され、
（ｂ）化学量論が均一である異なる生体分子−リンカー産物がこの生体分子−リンカー産物の見かけ分子量の違いに基づいてクロマトグラフィーによって分画され、
（ｃ）化学量論が均一であるカップリング産物を含む画分が収集されることに特徴を有する、
ことに特徴を有する。より好ましくは、リンカーまたはリンカー（マーカー）の見かけ分子量は、生体分子の見かけ分子量の２５％〜４００ ％であり、最も好ましくは３０％〜３３０ ％である。
【００７６】
（見かけ）分子量による分離は、好ましくは、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｓ ２００ＨＲ（登録商標）のようなクロマトグラフィー材料を用いる分子篩クロマトグラフィーにより行われる。
【００７７】
本発明により使用されるリンカー構造のさらに著しく、かつ特徴的な特性は、それらが、１分子当たり少なくとも４つの荷電した残基を有するという事実である。リンカー内の多数の荷電した残基はまた、生体分子−リンカー産物の正味の荷電における差異を導き、これらの荷電の差異は、生体分子当たりのリンカーの数に依存する。例えば、生体分子当たり１つのリンカーを有する生体分子−リンカー産物（均一な１：１の化学量論）は、今や驚くべきことに、かつ容易に、異なる化学量論の生体分子−リンカー産物から、または荷電の差異に基づいて付着したいかなるリンカーをも必要とすることなく生体分子から分離されうる。
【００７８】
好ましい態様では、本発明は、予め選択された量の化学量論が均一である少なくとも１つの生体分子−リンカー産物を含む結合体の生成のためのプロセスに関し、該結合体は、５ｋＤ〜５００ｋＤ の分子量の生体分子および親水性リンカー分子からなり、該リンカーは１ｋＤ〜１５ｋＤの分子量、４〜６０個の荷電した残基を有し、
ａ）生体分子およびリンカー分子が、互いに共有結合する
ｂ）化学量論が均一である異なる生体分子−リンカー産物が、該生体分子−リンカー産物の荷電における差異に基づいて、クロマトグラフィーにより分画される、および
ｃ）化学量論が均一であるカップリング産物を含む画分が回収される
という特徴を有する。
【００７９】
好ましくは、イオン交換クロマトグラフィーのような標準的なクロマトグラフィー材料および手法（例えば、Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＢｉｏｅｔｃｈからのＭｏｎｏ Ｑ（登録商標）、Ｍｏｎｏ Ｓ（登録商標）、Ｓｏｕｒｃｅ Ｑ（登録商標）またはＳｏｕｒｃｅ Ｓ（登録商標）を使用すること）は、荷電の差異に基づく化学量論が均一である生体分子−リンカー産物を分離するために使用される。所望の産物を含む画分が回収される。予め選択された化学量論の個々の生体分子リンカー産物または予め選択された化学量論のいくつかの産物の混合物が予め選択された相対量で得られる。所望される場合、高純度レベルが再クロマトグラフィーによって得られる。結合体の任意の所望の予め選択された比は、適切な画分をプールすることにより得られる。
【００８０】
上記のように、異なる化学量論のカップリング産物はまた、それらの親水性に関して異なる。親水性リンカー構造は、カップリング産物の全体の親水性または疎水性に影響する。好ましい態様における異なる化学量論の産物はまた、Ｐｈｅｎｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＨＰ （登録商標）、Ｂｕｔｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４ ｆａｓｔ ｆｌｏｗ （登録商標）等の現在の技術水準の樹脂を用いて疎水性相互作用クロマトグラフィーにより分離される。必須の材料および手法は、Ａｓｌａｍ， Ｍ．Ｄｅｎｔ， Ａ． Ｔｈｅ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ−ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ 「Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ」（１９９８） ２１６−３６３， Ｌｏｎｄｏｎ， ＭｃＭｉｌｌａｎに記載されている。逆相クロマトグラフィーもまた使用されうる。
【００８１】
本明細書中に記載される手法に従って生成された結合体は、所望される量の生体分子とリンカー分子との間の少なくとも１つの均一なカップリング産物を含む。化学量論が均一である各々のカップリング産物の相対量は、必要とされる場合、予め選択されうる。化学量論が均一である個々のカップリング産物の予め決定した、所望の相対量は、正確に、かつ再現性よく調整されうる。
【００８２】
さらに好ましい態様では、予め選択された結合体は、非結合体生体分子を本質的に含まない。
【００８３】
現在可能である分画に基づいて、本発明の結合体は、１：５およびそれより多い化学量論で生体分子−リンカー産物を含まない。
【００８４】
好ましい態様では、本発明は、５ｋＤ〜５００ｋＤ の分子量の生体分子および親水性リンカー分子（該リンカーは分子量１〜１５ｋＤおよび４〜６０個の荷電した残基を有する）からなる結合体に関し、該結合体は予め選択された量の化学量論が均一である少なくとも１つの生体分子−リンカー産物を含むことを特徴とする。
【００８５】
化学量論が均一である任意の所望される純度の個々のカップリング産物は、今や生成され、再現されうる。必要とされる比（相対量）で化学量論が均一である種々のカップリング産物を含む混合物は、容易に生成され、再現されうる。それゆえ、本発明の結合体は、化学量論が均一である少なくとも１つの他の生体分子−リンカー産物と比べて予め選択された相対量で化学量論が均一である少なくとも１つの生体分子−リンカー産物を含む。
【００８６】
より小さな化学量論が均一である生体分子−リンカー産物が結合体の一部を形成するほど、より容易に生成され、再現される。好ましい結合体は、本質的に、１〜３の化学量論が均一である個々の生体分子−リンカー産物を含む。より好ましい結合体は、本質的に、化学量論が均一である２つの異なるカップリング産物を含む。最も好ましい態様では、本発明の結合体は、１：１化学量論の生体分子−リンカー産物を本質的に含む。
【００８７】
さらに好ましい態様では、本発明の結合体は、化学量論が均一である唯一の生体分子リンカー産物を本質的に含む。
【００８８】
種々のカップリング産物の中で、１：１〜１：４の均一な化学量論を有するものが好ましい。特に好ましいものは、１：２および１：１の化学量論を有する生体分子リンカー産物であり、後者は、化学量論が均一である最も好ましいカップリング産物を表す。
【００８９】
用語「本質的に含む」は、他のカップリング産物の相対量と比べて、化学量論が均一である１つのカップリング産物（または３つまでのカップリング産物の混合物（各々））の相対量をいう。言い換えると、かかる結合体における全てのカップリング産物の少なくとも８０％が予め選択された化学量論である。好ましくは、本質的に、少なくとも８０％の均一なカップリング産物（またはカップリング産物の所望の混合物）を含む結合体に関する。９０％の予め選択されたカップリング産物またはカップリング産物の混合物を含む結合体がより好ましい。最も好ましいのは、他のカップリング産物と比べて、選択された結合体（単数または複数）について９５％の相対純度である。
【００９０】
別の好ましい態様では、本発明の結合体は、他のカップリング産物と比べた相対量において少なくとも８０％の化学量論が均一である２つの生体分子−リンカー産物を含み、最も好ましくは少なくとも８０％の化学量論が均一である１つのみの生体分子−リンカー産物を含む。
【００９１】
非常に好ましい結合体は、５ｋＤ〜５００ｋＤ の分子量を有する生体分子と親水性リンカー分子（該リンカーは１〜１５ｋＤの分子量および４〜６０個の荷電した残基を有する）との間の均一な１：１の化学量論のカップリング産物を相対純度８０％以上で含む。すなわち、この１：１結合体は、他の生体分子−リンカー産物の合計と比べて８０％またはそれより多くの相対量で存在する。
【００９２】
より好ましくは、９０％またはそれより多くの相対量で１：１の化学量論を有するカップリング産物を含む結合体であり、さらに好ましくは、異なる化学量論のカップリング産物と比べて、９５％またはそれより多くの相対量で１：１の化学量論のカップリング産物を含む結合体である。
【００９３】
今日、市販のアッセイは、可能な限り少ない取り扱いステップで済むように生成されている。これは、簡便であり、取り扱いのエラーの機会を減らす。もちろん、本発明の結合体を、例えば凍結、または凍結乾燥したものとしてカスタマーに提供することができる。
【００９４】
結合体が試薬組成物の一部であることが好ましい。多くの場合、結合体は、希釈形態および液体形態で存在し、それゆえ、安定化剤（例えば、ウシ血清アルブミンおよび／または種々の糖）、また任意に保存剤および／または界面活性剤等の試薬が存在する。さらに好ましい態様では、本発明は、緩衝液成分、安定化剤、および予め選択された量で化学量論が均一である少なくとも１つの生体分子−リンカー産物を含む結合体を含む試薬の組成物に関する。
【００９５】
好ましくは、本発明により生成された結合体は、試験片タイプの免疫学的デバイスにおいて使用される。
【００９６】
通常、単一試薬ではなく、むしろ少なくとも分析物特異的アッセイ試薬を含む完全なキットがカスタマーに提供される。好ましい態様では、本発明は、サンプル中の分析物の生化学的または免疫学的検出のための試験キットに関し、該キットは適切な緩衝液および試薬ならびに本発明の結合体を含む試薬の少なくとも１つの組成物を含む。
【００９７】
新規結合体に基づく免疫アッセイは、従来技術の方法で産生される結合体に基づくアッセイと比べて優位な特徴を有する。アッセイ自身におけるこのポジティブな効果は、実施例のセクションに示される。新規結合体が、別の比較可能なアッセイ条件化で使用される場合、著しく、バックグラウンドの問題は有意に低減される。免疫アッセイにおいて本発明に記載されるような特異的結合対のメンバーを生体分子として含む結合体の使用は、それゆえ、本発明の別の好ましい態様を表す。
【００９８】
好ましくは、新規結合体は、分析物特異的結合パートナーと分析物との間の反応に基づく分析物の検出、および得られる分析物結合パートナー複合体の測定に使用される。特異的結合アッセイの最も知られている例は免疫アッセイである。生体分子−リンカー（マーカー）結合体に基づく免疫アッセイにおいて、新規プロセスおよび試薬は、結合体の再現性に貢献する。より再現性の高い結合体であるほど、それに基づくアッセイはより良好な再現性を有する。
【００９９】
考察されるように、結合体の質および現在の技術水準の手法による再現性の両方は、限られた程度までだけ影響しうる。例えば、最終結合体から凝集体または沈殿物を除去することができる。生体分子とリンカー分子との間の異なる化学量論のカップリング産物の相対量を調整することは現在の技術水準の手法では不可能である。意図される適用に最も適した化学量論が均一であるカップリング産物を含む画分を選択することは非常に困難であるかまたは不可能である。これらの欠点は、本発明により解消された。
【０１００】
以下の実施例、参考文献、および図は、本発明、添付の特許請求の範囲に示される真の範囲の理解を補助するために提供される。本発明の意図を逸脱することなく示される手法に修飾が行われうることが理解される。
【０１０１】
実施例１：現在の技術水準に従うウシ血清アルブミンのルテニウム化（ｒｕｔｈｅｎｙｌａｔｉｏｎ ）
当該分野で公知のウシ血清アルブミンおよびリンカー（図１を参照のこと）を、５つの結合体混合物を提供するために使用している。ロットサイズ、試薬濃度、緩衝組成物、反応時間、試薬温度およびクロマトグラフ分離手法などの全ての変数を、一定に保っている。
【０１０２】
ＢＳＡ を、２０ｍｇ／ｍｌ の濃度で１００ｍＭ のリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ ８．０）に溶解した。ｈｙ−ＢＰＲｕ リンカー（標識；ｃｆ． 図１、上）を４７ｍｇ／ｍｌ の濃度でＤＭＳＯに溶解した。５倍モルを超過するｈｙ−ＢＰＲｕ をＢＳＡ 溶液に添加し、試薬を入念に混合し、反応を２５℃にて７５分間実施した。反応を、１０ｍＭの最終濃度までのリジンの添加および２５℃にてさらに３０分間攪拌下でのインキュベートによって停止した。
【０１０３】
遊離未結合誘導試薬を、ｐＨ ７．５にて５０ｍＭリン酸、１５０ｍＭ 塩化ナトリウムを含むリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ ）（５００ 倍過剰で使用されている）に対する透析（２０時間、４℃で）によって完全に除去した。
【０１０４】
図１におけるＯ−ヒドロキシスクシニミドエステルの活性基は、統計的にＢＳＡ の異なるＮＨ２−基と反応する。生じた粗結合体を、ｐＨ６．５ にて０．０５ｍｍｏｌ／ｌリン酸ナトリウム、０．０５ｍｍｏｌ／ｌ塩化ナトリウムおよび５％メタノールの緩衝条件を使用してＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００ ＨＲ （登録商標）クロマトグラフィーによってクロマトグラフィーしている。溶出をモニタリングする。適切な画分をプールする。産物ピークをエレクトロスプレーイオン化質量分光学（ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ−ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ ｍａｓｓ−ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ ）（ＥＳＩ−ＭＳ）によって分析した。このような分析の結果を、表１および２に要約する。
【０１０５】
【表１】
【０１０６】
【表２】
【０１０７】
同一の条件下で生成されたにもかかわらず、５ロット全てが明らかに互いに異なることが、表１および２から明らかである。ロット１および２は、２．３ の同じ全標識化指標（これは、１つのＢＳＡ 分子あたりに見出される平均２．３ 個のルテニウム標識を意味する）を有する。それにもかかわらず、両調製物は、表２から明らかなように個々の結合体化産物の相対量において有意に異なる。全標識化指標はまた、かなり有意に変わる。Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ ＨＲ （登録商標）カラムを使用する標準的なクロマトグラフ手法によって、全ての反応産物が同質のピークとして溶出することは図２から明らかである。例えば、１：１結合体を均等に含む画分へのカップリング産物の分別は、不可能である。
【０１０８】
実施例２：リンカー構造の合成
分枝リンカー構造の合成
固相ペプチド合成による分枝リンカーの調製
分枝リンカーを、バッチペプチドシンセサイザー（例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製Ａ４３３）でのフルオレニルメチルオキシカルボニル−（Ｆｍｏｃ）−固相ペプチド合成によって合成した。各場合において、表３に示すアミノ酸誘導体の４．０ 当量を使用した。
【０１０９】
【表３】
【０１１０】
アミノ酸およびアミノ酸誘導体を、Ｎ−メチル−ピロリドンに溶解した。ペプチドを、Ｗａｎｇ樹脂上で合成する（Ｓ．−Ｓ．Ｗａｎｇ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．９５（１９７３）１３２８）。この樹脂を、０．２ 〜０．４ｍＭｏｌ／ｇ で充填する。カップリング反応を、反応培地としてのジメチルホルムアミド中のＦｍｏｃ− アミノ酸誘導体に対して４当量のジシクロヘキシルカルボジイミドおよび４当量のＮ−ヒドロキシベンゾトリアゾールを用いてジメチルホルムアミド中で２０分間実行した。Ｆｍｏｃ基を、２０分間ジメチルホルムアミド中で２０％ピペリジンを用いた合成の各工程の後、切断した。樹脂の量を選択し、その結果、最終分枝の後、アミノ基に対して４当量のＦｍｏｃ− アミノ酸を使用する。Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｆｍｏｃ）−ＯＨ を、２つの同一アームの分枝および続く合成のために使用する。非対称の分枝を、直交する側鎖保護基（例えば、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｄｄｅ） またはＦｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ａｌｌｏｃ） ）を有するアミノ酸誘導体によって達成する。これらの直交する保護基を、文献において公知の方法によって樹脂上で切断する（Ｂ．Ｗ．Ｂｙｃｒｏｆｔ ら（１９９３），Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．，７７８ ；Ａ．Ｍｅｒｚｏｕｋ ら（１９９２）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．３３，４７７ ）。固相上の末端アミノ基を、任意に、無水酢酸または無水コハク酸を用いてアセチル化するかまたはスクシニル化する。
【０１１１】
誘導体が固相合成の間に安定である場合、ハプテン、標識または官能基は、すでに樹脂上（例えば、ペプチドのＮ−末端アミノ酸上）に導入されている。
【０１１２】
例えば、金属キレート標識の導入を、キャリア結合ペプチドの遊離Ｎ−末端アミノ基で適切な活性エステル誘導体を介して実施した。この遊離１級アミノ官能基あたり４当量のルテニウム（ビピリジル）３複合体（ＢＰＲｕ）に対して、Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾール／ジシクロヘキシル−カルボジイミドを用いて活性化し、少量のＤＭＳＯに溶解し、これを滴状添加し、室温にて２時間攪拌した。
【０１１３】
マーカーはまた、例えば、金属キレートまたはビオチンカップリングアミノ酸誘導体の直接組み込みによってすでに固相合成の間にＣ−末端で導入され得る（ＷＯ９６／０３４０９に記載される）。
【０１１４】
ペプチドを支持体から解離し、酸不安定な保護基を、２０ｍｌのトリフルオロ酢酸、０．５ｍｌ のエタンジオール、１ｍｌ のチオアニゾール、１．５ｇのフェノールおよび１ｍｌ の水を用いて室温にて４０分以内に切断する。使用するアミノ酸誘導体に依存して、ラジカル捕獲をほとんど含まないカクテルをまた使用し得る。３００ｍｌ の冷却ジイソプロピルエーテルを、反応溶液に引き続き添加し、この混合物をペプチドを完全に沈殿するために４０分間０℃にて維持した。沈殿物を濾過し、ジイソプロピルエーテルを用いて洗浄し、少量の５０％酢酸に溶解し、凍結乾燥した。得られた粗物質を、適切な勾配（溶出液Ａ：水、０．１ ％トリフルオロ酢酸、溶出液Ｂ：アセトニトリル、０．１ ％トリフルオロ酢酸）にわたってＤｅｌｔａ−ＰＡＫ ＰＲ Ｃ１８カラム（５０×３００ｍｍ 、１００ Å；１５μ）上で分離用ＨＰＬＣによって約１２０ 分以内に精製した。溶出された物質を質量分光測定法によって同定した。
【０１１５】
あるいは、マーカー基をまた、樹脂からの切断後に導入し得る。このために、固相ペプチド合成の間および切断の間、安定な保護基で誘導されるべきでない他の基をブロックする必要があり得る。例えば、フェニルアセチル（Ｐｈａｃ）を、使用し、保護基をＰｅｎＧアミダーゼを用いて酵素的に除去し得る（ＰＣＴ／ＥＰ９５／０２９２１に記載される）。
【０１１６】
ｂ）荷電した直鎖リンカー構造の合成
荷電した直鎖リンカー構造を、米国特許第５，９５８，７８３ 号に記載されるように本質的に合成している。
【０１１７】
ｃ）研究したリンカー構造の例
表４は、使用したいくつかのリンカー構造に関する概略を提供する。構造１および１０は、当該分野で既知の構造であり、一方、他の全ての構造は、さらなる特徴（例えば、著しく高い見かけ分子量）を含む。
【０１１８】
利用可能なように、研究室名をまた提供している。これらの構造（またはＭＨ活性化またはＤＳＳ 活性化のために使用する基本構造）を提供する図を参考にする。
【０１１９】
【表４】
【０１２０】
図９は、ＢＳＡ と比較したリンカー（マーカー）構造のＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００ ＨＲ （登録商標）クロマトグラフを示す。荷電した残基の劇的な影響が、上パネルから明らかになり、荷電していないリンカーは、約３，５００Ｄの分子量で移動するが、荷電したリンカーは、約１８，０００Ｄ の見かけ分子量で見出される。図９下パネルは、長い荷電した骨格のリンカー分子が見かけ分子量に差を有するという顕著な効果を示す。５，８０２ の分子量を有する構造２（ＢＰＲｕ−（ＵＥ）２５ ）は、例えば、約５０，０００Ｄ の見かけ分子量で移動する。
【０１２１】
表４にすでに示されたように、リンカー分子は活性化され得る。活性化のための例は、マレインイミド官能基の導入である。マレインイミド官能基を導入するために、リンカー（例えば、実施例２に従って生成される）を、０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液ｐＨ７．０ に溶解し、１当量のマレインイミドヘキサン酸 Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＤＭＳＯに溶解される）と混合し、２５℃にて１６時間攪拌する。この調製物を、ＲＰＣ１８ カラム（上記参照）を使用して分離用ＨＰＬＣによって精製する。溶出された物質の同一性を質量分光測定法によってチェックする。
【０１２２】
実施例３：新規ウシアルブミンリンカー結合体
ＷＯ９６／０３６５２に記載されるように、多重結合抗原を含むキャリア分子は、抗ウイルス抗体の検出において顕著に有益である。ポリハプテンの生成のために、キャリア分子のアミノ基を、活性エステル基を用いて最初に活性化する。この活性エステル基を、使用するマーカー基上の対応する活性基とマッチするように選択する。好ましい活性基は、マレインイミドヘキシル（ＭＨＳ ）またはマレインイミドプロピル−Ｎ− ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＰＳ ）である。結果として、キャリア中の１級アミノ基（例えば、リジン残基のε− アミノ側鎖）を、所望のマレインイミド基を所有するように部分的に誘導体化する。マーカー基を活性化キャリアにカップリングした後、このキャリアのＮＨ２ 基は、修飾されていないか、またはＭＨＳ 基を所有するか、またはＭＨＳ リンカーを介する標識を所有するかのいずれかで存在する。
【０１２３】
図３（ＤＳＳ 活性化）および８に模式的に示されるリンカー（マーカー）構造を、同一条件下でＢＳＡ にカップリングさせている。
【０１２４】
ＢＳＡ を、０．１ｍｍｏｌ／ｌ のリン酸カリウム緩衝液ｐＨ７．５ に１０ｍｇ／ｍｌ の濃度で溶解する。リンカー（マーカー）を、１モルのＢＳＡ あたり４．５ のモル比で添加する。反応を室温にて３時間実施する。反応産物をイオン交換クロマトグラフィーに供する。均一な化学量論を有するカップリング産物の分離を、Ｓｏｕｒｃｅ１５Ｑ （登録商標）またはＭｏｎｏＱ （登録商標）カラムを使用することによって達成する。
【０１２５】
多様に分枝したリンカーの粗結合体（図８および表１の構造１３を参照）を、ＭｏｎｏＱ （登録商標）クロマトグラフィーを用いて分画した。溶出を、２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．５ ）（＝溶出液Ａ）から２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．５ ）中に１Ｍ塩化ナトリウム（＝溶出液Ｂ）への塩勾配を使用して実施した。溶出を２８０ｎｍ でモニタリングする。図１０に示す勾配は、２５〜５４％の溶出液Ｂの範囲にわたり、３０分の溶出に相当する。適切な画分をプールする。画分をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳによって分析する。ＭＳデータは、３つのピークそれぞれが純粋な形態のＢＳＡ （図１０中の１）および１または２個のリンカー（マーカー）基を所有するＢＳＡ 分子（それぞれ図１０中の２および３）を含むことを確認した。
【０１２６】
長く、かつ強力に負に荷電した直鎖リンカーを用いて得られた粗結合体（表４の構造１２および図３）を、Ｓｏｕｒｃｅ１５Ｑ （登録商標）クロマトグラフィーによって分離している。溶出を、２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．５ ）（＝溶出液Ａ）から２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．５ ）中に１Ｍ塩化ナトリウム（＝溶出液Ｂ）への塩勾配を使用して実施した。溶出を２８０ｎｍ でモニタリングする。図１０に示す勾配は、３０〜４０％の溶出液Ｂの範囲にわたり、３０分の溶出に相当する。適切な画分をプールする。画分をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳによって分析する。ＭＳデータは、４つのピークそれぞれが純粋な形態のＢＳＡ （図１１中の１）および１、２または３個のリンカー（マーカー）基を所有するＢＳＡ 分子（それぞれ図１１中の２、３および４）を含むことを確認した。
【０１２７】
実施例４：第一の新規Ｆａｂ’− リンカー− 結合体の生成
１．手法の説明
１．１．ＩｇＧ 由来のＦａｂ’の調製
ジゴキシンに対するモノクローナル抗体（抗Ｄｉｇ ）をペプシンによって切断して、Ｆ（ａｂ’）２ を形成した。定量的切断後、このペプシンを、ｐＨを増加してペプスタチンを添加して不活化した。このＦ（ａｂ’）２ を前精製なしにシステアミンによってＦａｂ’へ還元した。システアミンは、ほとんど選択的にヒンジ領域におけるジスルフィド結合を切断する。その後、透析する。これは、ペプシンによって生成されたほとんどのＦｃ切断産物を除去する。なぜならば、Ｆｃ切断産物は、透析チューブの細孔を通るのに十分小さい（＞１０，０００ダルトン）からである。
【０１２８】
１．２．Ｆａｂ’−ＢＰＲＵ リンカー結合体
結合体合成を、過剰なＢＰＲｕ− リンカー−ＭＨ とＦａｂ’を反応させることによる−ＳＨ 基化学的反応を介して実施した。このプロセスにおいて、ヒンジ領域におけるＳＨ基を主に変換した。少量のポリルテニウム化Ｆａｂ’を、軽鎖およびＦｄ鎖における分子内ジスルフィド結合を還元した結果として副反応として形成した。
【０１２９】
１．３．粗結合体の精製
粗結合体を分子篩によって精製した。このプロセスにおいて、モノルテニウム化物質をポリルテニウム化物質から分離した。
【０１３０】
２．手法
２．１．Ｆ（ａｂ’）２ を形成するための抗体の切断
モノクローナル抗体抗ＤＩＧ−Ｍ１９．１１ ＩｇＧの凍結乾燥品（ｌｙｏｐｈｉｌｉｓａｔｅ）を、２０ｍｇ／ｍｌ の濃度を得るようにＨ２Ｏ を用いて還元した。２０μｌ の１Ｍクエン酸塩ｐＨ３．５ を溶液１ｍｌ あたりに添加した（クエン酸塩の最終濃度＝２０ｍＭ）。ｐＨをＨＣｌ を用いて３．６０に調節した。０．４５μｍ フィルターを通して濾過した。この濃度をＯＤ２８０ｎｍ で測定した（１ＯＤ２８０ｎｍ＝１．４ｍｇ／ｍｌ）。２０ｍＭクエン酸塩ｐＨ３．６０を用いて１０ｍｇ／ｍｌ に調整した。この溶液を３７℃まで水浴で加熱した。１００ μｌ のペプシン溶液（３ｍｇ／ｍｌ）を抗体溶液１ｍｌ あたりに添加し、３７℃にて水浴中でインキュベートした。完全な切断後、反応を、ｐＨ値を増加させてペプスタチンを添加することで停止した。
【０１３１】
２．２．Ｆａｂ’への還元
５２．６μｌ の０．１Ｍジチオトレイトール（ＤＴＴ ）を切断混合物１ｍｌ あたりに添加し、２５℃にて水浴中で３０分間インキュベートした。Ｆａｂ’を、０．１ＭのＮａＨ２ＰＯ４／ＮａＯＨ ｐＨ６．５、３０ｍＭのＮａＣｌ、２ｍＭ のＥＤＴＡに対して透析した。
【０１３２】
２．３．Ｆａｂ’−ＢＰＲｕ−リンカー結合体の合成
ＢＰＲｕ− リンカー−ＭＨ （図８の分枝リンカーであるが、ＭＨ基の代わりにＤＳＳ を所有する）をＤＭＳＯに溶解した。化学量論Ｆａｂ’： ＢＰＲｕ−リンカー−ＭＨ は、１：３（モル／モル）であった。混合物中のＦａｂ’の最終濃度は、３．９ｍｇ／ｍｌであった。混合物中のＤＭＳＯの最大濃度は、１０％であった。反応時間は、室温にて１時間であった。
【０１３３】
２．４．精製
粗結合体をＡｍｉｃｏｎ ＰＭ １０を使用して２〜３倍に濃縮し、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ ＨＲ （登録商標）（緩衝液：２５ｍＭのＭＯＰＳ／ＮａＯＨ ｐＨ６．５ 、５０ｍＭのＮａＣｌ、１０％のＤＭＳＯ；適用量：ゲル層の最大１．５ ％、画分：ゲル層の０．５ ％）によって精製した。Ｆａｂ’−ＢＰＲｕ−リンカー結合体を含む画分をプールした。必要な場合、再クロマトグラフィーを実施し得る。
【０１３４】
粗結合体は、主に、ヒンジ領域における−ＳＨ 基の１つでリンカーが結合されるＦａｂ’− フラグメントからなるカップリング産物を含む。より低い程度（ｅｘｔｅｎｄ）まで多様に標識されたＦａｂ’− フラグメントがまた存在する（図１２において、それぞれピークＩＩＩ 、ＩＩ、およびＩを参照）。
【０１３５】
実施例５：第二の新規Ｆａｂ’−ＢＰＲｕ（ＵＥ）２５ 結合体の生成
１．Ｆ（ａｂ’）２ およびＦａｂ’− フラグメントを抗ＨＩＶ ｐ２４ モノクローナルから調製した切断を実施例４に記載されるように本質的に実施する。Ｆ（ａｂ’）２−溶液を、ｐＨ７．５ の５０ｍＭのリン酸カリウム、１５０ｍＭ の塩化ナトリウム緩衝液に対して透析する。
【０１３６】
５ｍｇ／ｍｌのＦ（ａｂ’）２−フラグメントを含むＦ（ａｂ’）２−溶液にシステアミンを最終濃度２５ｍＭで添加する。この溶液を３７℃にて６０分間インキュベートする。反応を、５０ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ 塩化ナトリウム緩衝液を含むｐＨ６．０ までのＰＤ１０− カラム緩衝液を用いる緩衝液変更を介して停止する。
【０１３７】
２．Ｆａｂ’− フラグメントのルテニウム化
リンカーＢＰＲｕ−（ＵＥ）２５−ＭＨを、２５ｍｇ／ｍｌ の濃度でＤＭＳＯに溶解する。Ｆａｂ’− フラグメント対 ＢＰＲｕ−（ＵＥ）２５−ＭＨ リンカー（マーカー）のモル比を１：２に設定する。反応混合物を、５０ｍＭリン酸カリウム、１５０ｍＭ 塩化ナトリウム溶液（ｐＨ７．１ ）中で２５℃にて９０分間インキュベートする。この反応を、２ｍＭ システインの添加および２５℃にて３０分間のこの溶液のインキュベーションによって停止する。Ｎ−メチル− マレインイミドを５ｍＭ で添加し、５５℃にて６０分間インキュベートする。
【０１３８】
３．精製
粗結合体をＣＥＮＴＲＩＣＯＮ１０ を用いて約３倍に濃縮し、５０ｍＭリン酸カリウム、１５０ｍＭ 塩化ナトリウムでｐＨ７．５ に緩衝化したＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００ ＨＲ （登録商標）カラムによって精製した。図１１に示し得るように、粗混合物は非結合体化Ｆａｂ’− フラグメント、非結合体化リンカー（マーカー）および１：１、１：２および１：３の化学量論が均一である結合体を含むことが見出されている（それぞれ、図１３のピーク５および４、３、２、および１を参照）。
【０１３９】
実施例６：Ｆ（ａｂ’）２−フラグメントのルテニウム化
１．手法の説明
１．１．ＩｇＧ のＦ（ａｂ’）２ フラグメントの生成
実施例５から既知の同じモノクローナル抗体をＦ（ａｂ’）２ フラグメントの生成のために使用する。ペプシンによるＩｇＧ の消化を実施例５に記載されるように実施する。定量的切断の後、ペプシンをｐＨを増加することによっておよびペプスタチンを添加することによって不活化する。Ｆ（ａｂ’）２−フラグメントをＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００ ＨＲ （登録商標）カラムクロマトグラフィーを使用して精製する。
【０１４０】
１．２．Ｆ（ａｂ’）２−ＢＰＲｕ−（ＵＥ）２５−ＤＳＳ の合成
結合体化を、ＢＰＲｕ−（ＵＥ）２５−ＤＳＳ の活性基（ＤＳＳ 基を所有する図３のリンカー）をＦ（ａｂ’）２−フラグメントのアミノ基にカップリングすることによって実施する。試薬の初期濃度およびＦ（ａｂ’）２−フラグメントとリンカー（マーカー）分子との間で選択される化学量論に依存して、より高いまたはより低い平均標識化指標で粗結合体を得る。言い換えると、種々の量のリンカー構造を所有するＦａｂ’− 分子のランダムポアソン分布を得る。
【０１４１】
１．３．粗結合体の精製
粗結合体を濃縮して慣用的な分子篩クロマトグラフィーを用いて精製する。
【０１４２】
異常な高い見かけ分子量に起因して、各個体のリンカー分子によって寄与されるように、異なる化学量論のカップリング産物を互いに分離し得る。
【０１４３】
２．手法
２．１．ＩｇＧ のＦ（ａｂ’）２ への切断
Ｍａｂ＜ｐ２４＞Ｍ−６Ｄ９− Ｆ（ａｂ’）２へのＭａｂ＜ｐ２４＞Ｍ−６Ｄ９−ＩｇＧ の切断。ＨＩＶ のｐ２４ に対するモノクローナル抗体の凍結乾燥ＩｇＧ を、最終濃度２０ｍｇ／ｍｌ までＨ２Ｏ を用いて還元する。切断を実施例５に記載するように実施する。
【０１４４】
２．２．Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ ＨＲ （登録商標）クロマトグラフィーによるＦ（ａｂ’）２−フラグメントの精製
記載するように生成したＦ（ａｂ’）２−フラグメントを、以下の緩衝液および条件を用いて精製する：
カラム物質 Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ ＨＲ （登録商標）
緩衝液 １０ｍＭリン酸ナトリウム
（ｐＨ７．５ に調整した緩衝液）
３０ｍＭ塩化ナトリウム
フッ化物 １０ｍｌ／ｃｍ２／ｈ
サンプル体積 カラム体積の１．５ ％
サンプル濃度 ２０ｍｇ／ｍｌ
溶出液光度計のモニタリング ２８０ｎｍ
Ｆ（ａｂ’）２−フラグメントを含む画分をプールして、濃縮して、同一条件下で再度クロマトグラフィーする。
【０１４５】
２．３．ＢＰＲｕ−（ＵＥ）２５−ＤＳＳ を用いるＦ（ａｂ’）２−フラグメントの標識化
ＢＰＲｕ−（ＵＥ）２５−ＤＳＳ を、５ｍｇ／ｍｌでＤＭＳＯに溶解する。カップリング化学量論を、
１：５（ｍｏｌ／ｍｏｌ ）＝Ｆ（ａｂ’）２−フラグメント：リンカー
で選択する。
【０１４６】
この反応混合物を、室温にて１時間インキュベートする。反応を１０ｍＭの最終濃度でリジンを添加して停止する。
【０１４７】
２．４．ＢＰＲｕ−ＵＥＥＫ−ＤＳＳ を用いるＦ（ａｂ’）２−フラグメントのカップリング
リンカー（標識）ＢＰＲｕ−ＵＥＥＫ−ＤＳＳ を５ｍｇ／ｍｌの濃度でＤＭＳＯに溶解する。カップリングについて選択した化学量論は、
１：５（ｍｏｌ／ｍｏｌ ）＝Ｆ（ａｂ’）２−フラグメント：ＢＰＲｕ−ＵＥＥＫ−ＤＳＳ
である。
【０１４８】
この反応混合物を、室温にて１時間インキュベートする。反応を１０ｍＭの最終濃度でリジンを添加して停止する。
【０１４９】
２．５．粗カップリング産物の精製
精製をＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００ ＨＲ （登録商標）クロマトグラフィーによって実施する。両方のＦ（ａｂ’）２ 結合体のクロマトグラフィーを、ｐＨ７．５ に調整した１００ｍＭ Ｈｅｐｅｓ 緩衝液（１ｍＭ ＥＤＴＡおよび５ ％ ＤＭＳＯ を含む）中で実施する。流速を、５ｍｌ／ｃｍ２／ｈ に設定する。検出を２８０ｎｍ で実施する。サンプル体積は、カラム体積の１．５ ％である。
【０１５０】
図１４および１５から明らかなように、強力に負に荷電したリンカーｈｙ−ＢＰＲｕ−（ＵＥ）２５−ＤＳＳで生成されるカップリング産物（図１４）のみを、同一の化学量論のカップリング産物を含む画分に分離し得、一方従来のリンカーを用いたカップリング産物（図１５）は全て、１つのピークとして溶出する。１：１化学量論を有する主要なカップリング産物を含むプールされた画分（おおよそ１０７ 分〜１２５ 分；図１４では１１１ 分のピーク）を、一度、再クロマトグラフィーし、純度および分子量をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳで確認している。
【０１５１】
実施例７：異なる抗体−リンカー結合体を用いる免疫学的検定
例えば、ＨＩＶ に対する特異的抗体の検出において使用される二重抗体試験を、モデル系として使用している。このサンプル（ＨＩＶ に対する抗体を含むと推測される）を、ストレプトアビジンコート固相の存在下でのビオチン化抗原およびジゴキシゲニン標識抗原ならびにジゴキシンに対するＢＰＲｕ標識抗体と共にインキュベートする。サンプル中の抗ＨＩＶ 抗体の存在下で、ストレプトアビジンコート固相、ビオチン化抗原、検出対象の抗体、ジゴキシン化（ｄｉｇｏｘｉｎｙｌａｔｅｄ ）抗原およびジゴキシンと反応するルテニウム標識抗体を含む検出複合体を形成する。抗ＨＩＶ 抗体の検出を、標準的な電気化学発光手法に従って固相に結合された電気化学発光シグナルを測定することによって実施する。
【０１５２】
このモデル系において、ＨＩＶ１のｇｐ４１領域由来のＮ末端標識ＨＩＶ ペプチドを使用している。このペプチドおよびこのペプチドの標識化に関する詳細は、ＷＯ９６／０３４２３に記載される。両抗原を２０ｎｇ／ｍｌ の濃度で使用している。
【０１５３】
この系の全ての成分を、一定に維持し、検出系のみ（すなわち、ルテニウム標識抗ジゴキシン試薬）を変更している。表５および６に列挙した全ての結合体について、抗ＤＩＧ のＦａｂ’− フラグメントを同じ濃度のルテニウム標識で使用している。
【０１５４】
【表５】
【０１５５】
【表６】
【０１５６】
結合体ＥおよびＦを、それぞれ１：２および１：６（Ｆａｂ’対リンカー）のモル比を使用して欧州特許第７２０ ６１４ 号に従って生成している。使用したリンカーは、ＫＥＥＵ−ＢＰＲｕ であった。
【０１５７】
結合体ＧおよびＨは、本発明に従って生成し、精製した精製１：１カップリング産物（それぞれ、図３（（ＵＥ）２５および活性化ＭＨ）および４に示すリンカー（マーカー）構造を含む）を含んでいた。
【０１５８】
新規な１：１結合体は、陰性サンプルからの陽性サンプルのより良い分離を可能にする。これは、陽性血清について得たシグナルを、陰性血清に対して標準化した表６から最も容易に見出される。
【０１５９】
実施例８：ビオチン化リンカー（Ｂｉ−（ＵＥ）２５−ＤＳＳ ）へのモノクローナル抗体（ＭＡＢ ）＜フェリチン＞Ｍ−４．１８４ の結合体化
この実施例において、ＩｇＧ クラスの完全なＭＡＢ （約１５０ｋＤ のＭＷ）を、結合体化のために使用している。（Ｂｉ−（ＵＥ）２５−ＤＳＳ ）を使用するリンカー（マーカー）の基本構造体を図３に与える。ルテニウムキレート複合体の代わりに、このリンカーはビオチン化基（Ｂｉ− ）を所有し、そのＣ末端でＤＳＳ 基を所有するように修飾されている。
【０１６０】
結合体化の方式
ＤＭＳＯに１５ｍｇ／ｍｌ の濃度で溶解したＢｉ−（ＵＥ）２５−ＤＳＳ を、ＭＡＢ ＜フェリチン＞Ｍ−４．１８４ の精製ＩｇＧ （ｐＨ８．５ の１００ｍＭ リン酸カリウム緩衝液中１０ｍｇ／ｍｌ ）へ添加し、１：１ （ＩｇＧ 対リンカー）の最終モル比を生じる。この反応混合物を２５℃にて６０分間インキュベートし、その後、結合体化を１０ｍＭの最終濃度までリジンを添加して停止する。
【０１６１】
反応産物を、ｐＨ７．５ の２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液に対して透析する。
【０１６２】
ＭＡＢ ＜フェリチン＞Ｍ−４．１８４−ＩｇＧ− Ｂｉ（（ＵＥ）２５−ＤＳＳ） の精製
精製をＳｏｕｒｃｅ ３０ Ｑ （登録商標）クロマトグラフィーによって実施している。溶出を、緩衝液（Ａ）として２０ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ６．５ ）、緩衝液（Ｂ）として１Ｍ ＮａＣｌ を含む２０ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ６．５ ）を使用する塩勾配を適用することによって実施している。得られる結果を、図１６に示す。この手法によっておよび適切なプールによって、たった１つのリンカー（マーカー）を所有する免疫グロブリン（モノビオチン化ＩｇＧ ）を容易に得ることができることが明らかである。
【０１６３】
参考文献の一覧
Ａｓｌａｍ， Ｍ． Ｄｅｎｔ， Ａ． Ｔｈｅ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ−ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ， 「Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ」（１９９８）２１６−３６３， Ｌｏｎｄｏｎ， ＭｃＭｉｌｌａｎ
Ｂ．Ｗ．Ｂｙｃｒｏｆｔ ら（１９９３）， Ｊ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ．， Ｃｈｅｍ． Ｃｏｍｍｕｎ．， ７７８
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Ｔｉｊｓｓｅｎ 「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ 」（１９９２） Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ
Ｔｉｊｓｓｅｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ 「Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅ ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ 」（１９８５）２５８−２６８
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ｖａｎ Ｗｅｅｍｅｎ， Ｂ． Ｋ． およびＳｃｈｕｕｒｅｓ Ａ．Ｈ．Ｗ．Ｈ．（１９７１）， ＦＥＢＳ ｌｅｔｔｅｒｓ １５， ２３２
ＰＣＴ／ＥＰ９５／０２９２１
欧州特許第０ ０６１ ８８８ 号
米国特許第５，９５８，７８３ 号
ＷＯ ９６／０３４０９
ＷＯ ９６／０３４２３
ＷＯ ９６／０３６５１
ＷＯ ９６／０３６５２
ＷＯ ９６／０３６５７
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、カップリングＢＳＡ およびｈｙ−ＢＰＲｕ−リンカーの模式図である。ＢＳＡ に関する模式図は、いくつかの−ＮＨ２ 基がｈｙ ＢＰＲｕ−リンカー（マーカー）への結合に利用可能である事実を示す。
【図２】
図２は、ＢＳＡ−ｈｙ−ＢＰＲｕ−結合体のＳｕｐｅｒｄｅｘ２００ ＨＲ（登録商標）クロマトグラフを示す。このクロマトグラフは、異なる化学量論を有するカップリング産物が単一の均一なピークとして移動することを示す。この単一のピークは、カップリング産物の統計的混合物を表す。
【図３】
図３は、ＢＰＲｕ− （ＵＥ）２５Ｋ およびＢＰＲｕ− （ＵＥ）５０Ｋ の模式図である。これらのリンカー構造は、ジ− ペプチドβ− アラニン− グルタミン酸（ＵＥ）をしばしば含む。
【図４】
図４は、短い骨格鎖を有する分枝リンカーを示す図である。この分枝リンカーは、短い骨格、および側鎖の両方で荷電した残基を含む。
【図５】
図５は、長い骨格鎖を有する分枝リンカーを示す図である。この分枝リンカーは、長い骨格、および側鎖の両方で荷電した残基を含む。
【図６】
図６は、荷電した残基を有さない分枝リンカーを示す図である。このリンカーは、図４のリンカーに非常に類似しているが、グルタミン酸の荷電した残基を有さず、代わりにグルタミンが使用されている。見かけ分子量は、図４のリンカーに関する１８ｋＤと比べて約３，５ｋＤ であることが見出された。
【図７】
図７は、ビオチン化リンカー分子の模式図である。これらのＮ−末端のビオチン化（Ｂｉ− ）リンカー分子がＣ−末端に−ＭＨ および−ＤＳＳ基をそれぞれ有し、これらは生体分子へのカップリングのために使用される。
【図８】
図８は、多数分枝リンカーを示す図である。この模式図は、２つのルテニウム標識（ＢＰＲｕ）を保有する分枝側鎖を有する多数分枝リンカーを示す。
【図９】
図９は、種々のリンカー分子のＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００ ＨＲ （登録商標）クロマトグラフィーを示す図である。ＢＳＡ および異なるリンカー分子は、同一の条件下でクロマトグラフィーされている。上パネルは、図４および６に従うリンカー構造を示す。下パネルは、図３に従うリンカー構造を示す。
【図１０】
図１０は、粗ＢＳＡ−Ｒｕ（ＳＫ）４−ＭＨ結合体のＭｏｎｏＱ （登録商標）クロマトグラフである。クロマトグラフは、ＢＳＡ （１）ならびにそれぞれ均一な１：１（２）および１：２（３）化学量論の結合体産物のベースライン分離を示す。
【図１１】
図１１は、粗ＢＳＡ−Ｒｕ（ＵＥ）２５−ＭＨ 結合体のＳｏｕｒｃｅ１５Ｑ （登録商標）クロマトグラフである。均一な化学量論１：１、１：２および１：３の３つの結合体（それぞれ、２、３および４）は、互いにおよび非結合体化ＢＳＡ （１）とはっきり分離される。
【図１２】
図１２は、第一のＦａｂ’−Ｒｕ（ＵＥ）２５−ＭＨカップリング産物のＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００ ＨＲ （登録商標）クロマトグラフである。粗結合体は、３つの主なピークに分離される。５０ｋＤの見かけ分子量で移動するピークＩＩＩ は、未反応Ｆａｂ’および未反応リンカー（Ｒｕ−（ＵＥ）２５−ＭＨ）の両方を含む。１００ｋＤ の見かけ分子量で移動するピークＩＩは、Ｆａｂ’とリンカー（マーカー）との間の１：１カップリング産物を本質的に純粋な形態で含む。ピークＩは、１：２カップリング産物（１５０ｋＤ の見かけ分子量）を含む。各プールの組成物は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳによって確認されている。
【図１３】
図１３は、第二のＦａｂ’−Ｒｕ（ＵＥ）２５−ＭＨカップリング産物のＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００ ＨＲ （登録商標）クロマトグラフである。ピーク１、２および３は、それぞれ１：３、１：２および１：１の化学量論の結合体を含む画分に対応する。ピーク４および５は、未結合体化開始物質（リンカーおよびＦａｂ’− フラグメント）を含む。全ての構造は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳによって確認されている。
【図１４】
図１４は、Ｆ（ａｂ’）２−ＢＰＲｕ−（ＵＥ）２５−ＤＳＳ カップリング産物の精製を示す図である。粗結合体は、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ ＨＲ （登録商標）クロマトグラフィーによって分離される。１：２および１：１カップリング産物を含むピークは、別々にプールされ、再クロマトグラフィーされる。これらのカップリング産物の組成物は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳによって確認されている。
【図１５】
図１５は、Ｆ（ａｂ’）２−ＢＰＲｕ−ＵＥＥＫ−ＤＳＳ カップリング産物の精製を示す図である。粗結合体は、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ ＨＲ （登録商標）クロマトグラフィーによって分離される。異なる化学量論を有するカップリング産物の統計的混合物を含むたった１つの対称「産物ピーク」がみられる。
【図１６】
図１６は、ＩｇＧ−（Ｂｉ−（ＵＥ）２５−ＤＳＳ） カップリング産物の精製を示す図である。粗結合体は、Ｓｏｕｒｃｅ３０（登録商標）クロマトグラフィーによって分離される。未結合体化ＩｇＧ （プール１）は、カラムから容易に溶出される。モノ−ビオチン化ＩｇＧ はプールされ（プール２）、ジ−ビオチン化ＩｇＧ （プール３）と明らかに分離される。
本発明は、化学量論が均一である生体分子リンカー結合体の生成プロセスに関する。特に、５ｋＤから５００ｋＤ の分子量の生体分子ならびに１から１５ｋＤの分子量および４から６０個の荷電した残基を有する親水性リンカー分子からなり、予め選択された量の化学量論が均一である生体分子リンカー産物を少なくとも一つ含むことを特徴とする結合体に関する。
【０００２】
結合アッセイは、現在では、研究環境ならびに臨床の日常的な業務、特に薬剤の感染モニターの診断または正常なもしくは異常な代謝を評価するための診断において広く使用されている。
【０００３】
結合アッセイの使用は、約３０年前にさかのぼる（Ｅｎｇｖａｌｌ， Ｅ． とＰｅｒｌｍａｎ， Ｐ．， Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ８ （１９７１） ８７１−４； ｖａｎ Ｗｅｅｍｅｎ， Ｂ．Ｋ． とＳｃｈｕｕｒｅｓ Ａ．Ｈ．Ｗ．Ｍ．（１９７１）， ＦＥＢＳ ｌｅｔｔｅｒｓ １５， ２３２）。その後、大きな発展がなされ、特定の結合アッセイならびにその実用的な適用を行う方法は、当業者にとって一般的な知識となっている。関連する教科書に要約されている方法や手法は、参照により本明細書に包含され、ほんの少しの例のみが、特に、「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ 」 （１９９２） Ａｃａｄｅｍｉｃ ＰｒｅｓｓのＴｉｊｓｓｅｎ による「Ｐｒａｃｔｉｃｅ ａｎｄ ｔｈｅｏｒｙ ｏｆ ｅｎｚｙｍｅ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ」；および免疫学的検出方法を取り扱った「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ 」，Ｃｏｌｏｗｉｃｋ Ｓ． Ｐ．， Ｃａｐｌａｎ Ｎ．Ｏ．，編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓの多くの版、特に第７０，７３，７４，８４，９２および１２１ 巻でのみ言及されているだろう。
【０００４】
非常にわずかな同種または沈降型アッセイを除いて、これら全てのアッセイは、生体分子（たとえば抗体）と、調査中の分析物の測定を促進するのに必要な第二の分子との間の結合体を必要としている。この第二の分子についての周知の例は、たとえば、酵素、放射性同位体、発光団、フルオロフォアなどのようなマーカー基または標識基、あるいはハプテンである。
【０００５】
生体分子と、たとえばマーカー基またはハプテン基との結合体は、２つの異なる分子実体の直接の化学的カップリングによってまたは現在の技術水準の手法に従って、リンカーまたは架橋分子を用いることによって合成され得る（たとえば、Ｔｉｊｓｓｅｎ またはＭｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ 、上記）。
【０００６】
しかしながら、従来の結合体は、はっきりした限定をもつ。かかる結合体のうち２または３成分、すなわち、生体分子、リンカー（もし、存在すれば）、およびマーカー基はお互いと相互にかつ逆に作用しうるという周知の問題がある。これは、頻繁に凝集またはバックグラウンドの問題を生じる。
【０００７】
選ばれたカップリング化学反応またはリンカー化学反応に依存して、多くの場合、たとえば、マーカー基を有するまで終了しないポリペプチドのアミノ酸基も修飾される。これは、再び、予測できない結果を生じ、たとえば、不安定性、凝集のような問題または免疫アッセイにおける非特異的結合に対する生体分子の物理化学的特性の変化を経る。
【０００８】
かかる結合体の種々の成分、たとえば、生体分子、リンカー分子およびマーカー分子ならびにこれら由来の異なるカップリング産物が統計的量で存在している。平均の標識化指標を有する純粋な統計的混合物が得られる。平均の標識化指標は、反応条件および選ばれた個々の分子の実体の割合を調整することによってある程度までコントロールされ得る。
【０００９】
かかる統計的混合物は、異なる化学量論の異なる結合体産物を多く含む。リンカー構造またはマーカー構造を完全に持たない生体分子、１：１の化学量論、１：２の化学量論（すなわち、２個のリンカー分子またはマーカー分子を有する生体分子）、１：３の化学量論およびさらにより高い化学量論の結合体は、かかる結合体中に存在し得る。かかる産物はすべてが所望されるわけではなく、たとえば、結合体の再現性に関して問題を引き起こすものではないことは明らかである。また、標識されていない生体分子は、標識された生体分子を妨げる。「過剰標識」、すなわち、多すぎるハプテン構造またはマーカー構造で標識された生体分子が非特異的な相互作用、たとえば、バックグラウンドの現象として知られた問題についての主要な理由であることも既知である。
【００１０】
米国特許第５，９５８，７８３ 号明細書は、親水性リンカーの実体を用いることにより、マーカー基として金属キレート複合体で引き起こされるバックグラウンドの問題を減少することができることを開示している。しかしながら、米国特許第５，９５８，７８３ 号明細書に記載の結合体は、種々の異なる生体分子−リンカー−マーカー産物の統計的混合物も示している。これらの統計的結合体の再現性にも問題が残っている。
【００１１】
ＷＯ９６／０３４２３およびＷＯ９６／０３６５１には、合成中に予め決定された位置にマーカー基を導入することができることが記載されている。この方法では、化学量論が均一であるペプチドリンカー（マーカー）産物を合成することができる。しかしながら、ペプチド合成の限界は、分子量５ｋＤ（ｋＤ＝キロダルトン）未満のペプチドに対応する４０〜５０個のアミノ酸の範囲である。５ｋＤを超えるポリペプチドは、通常、適切な宿主系における組み換え発現によって産生され、統計的組成物の結合体を生じるように、化学的にカップリングされる必要がある。ＷＯ９６／０３４２３およびＷＯ９６／０３６５７のリンカーは、１ｋＤ未満であり、荷電した残基を含まない。
【００１２】
大きな生体分子、たとえば、４０〜５０個のアミノ酸からなるポリペプチドは、通常、標準的なカップリング化学反応の一つに敏感に反応する反応基を一つより多く有する。
【００１３】
化学的カップリングの形態およびストラテジーは、必要な場合に選択され得る。生体分子がチロシンの−ＳＨ 、−ＮＨ２または−ＣＯＯ −残基ならびに−ＯＨ 基を標的とする化学反応をカップリングするポリペプチドである場合、ヒスチジンのイミダゾール基またはトリプトファンのヘテロ環イミノ基がすぐ近くにある。いくつかの適切なカップリング化学反応は、これらの官能基のそれぞれに関して当該分野から公知である（Ａｓｌａｍ， Ｍ． Ｄｅｎｔ， Ａ． Ｔｈｅ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ−ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ ｉｎ 「Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ」（１９９８）２１６−３６３， Ｌｏｎｄｏｎ， ＭｃＭｉｌｌａｎ）。
【００１４】
１より多くの反応基が生体分子化学製品に存在するときは必ず、リンカーまたはマーカーとのカップリングが、異なる生体分子−リンカー産物または生体分子−マーカー産物の統計的混合物を生じる。
【００１５】
もっとも発展したリンカーおよびカップリング化学反応についてでさえ、得られる結合体は多くの異なる結合体の統計的混合物であり、かつかかる結合体の全ての結果は、大いに変動して予期できない。結果として、数多くのものからかかる結合体の全ての特性を再生するのは非常に難しい。
【００１６】
したがって、本発明の課題は、生体分子およびリンカー分子との間の結合体がより再現可能でかつ規定された方法で得られるかどうかを調査することにあった。また、プロセスが発見され得るかどうかも調査され、化学量論が均一である予め選択された生体分子−リンカー産物の少なくとも一つを含む結合体を得る方法も記載された。
【００１７】
おどろくべきことに、当該分野で既知の問題が、本発明の結合体、それらの生成様式および適当な試薬、キットおよび手法におけるそれらの使用によって解決され得ることがわかった。
【００１８】
予め選択された量の化学量論が均一である生体分子−リンカー産物を少なくとも１つ含む結合体の生成プロセスであり、結合体が５ｋＤから５００ｋＤ の分子量の生体分子および１ｋＤから１５ｋＤの分子量かつ４から６０個の荷電した残基を有する親水性リンカー分子からなり、ａ）生体分子とリンカー分子とがお互いと共有結合され、ｂ）化学量論が均一である異なる生体分子−リンカー産物がクロマトグラフィーにより分画され、ならびにｃ）化学量論が均一であるカップリング産物を含む画分が集められることを特徴とする生成プロセスが開示されている。
【００１９】
本発明はまた、５ｋＤから５００ｋＤ の分子量の生体分子かつ１から１５ｋＤの分子量および４〜６０個の荷電した残基を有する親水性リンカー分子からなる結合体であり、該結合体が予め選択された量の化学量論が均一である生体分子−リンカー産物を少なくとも一つ含有することを特徴とする結合体に関する。
【００２０】
本発明の結合体は、サンプル中の分析物の検出のための生物学的または免疫学的アッセイを行うのに特に有用である。したがって、本発明は、前記結合体を含む試薬の組成物、試薬組成物の一部としてかかる結合体を含有する試験キットならびにかかる結合体に基づく免疫アッセイにも関する。
【００２１】
発明の詳細な説明
本発明の好ましい態様は、予め選択された量の化学量論が均一である生体分子−リンカー産物を少なくとも一つ含有する結合体の生成プロセスであり、該結合体が５ｋＤから５００ｋＤ の分子量の生体分子かつ、１ｋＤから１５ｋＤの分子量および４から６０個の荷電した残基を有する親水性リンカー分子からなり、
ａ）生体分子とリンカー分子とがお互いと共有結合され、
ｂ）化学量論が均一である異なる生体分子−リンカー産物がクロマトグラフィーにより分画され、ならびに
ｃ）化学量論が均一であるカップリング産物を含む画分が集められる
ことを特徴とする生成プロセスである。
【００２２】
「結合体」という用語は、生体分子とリンカー分子との間のカップリング産物を記載するのに使用される。本発明の結合体は、予め選択された量の化学量論が均一である生体分子−リンカー産物を少なくとも一つ含有する。
【００２３】
本発明の意味における生体分子とは、アミノ酸、ヌクレオチド、ヌクレオシド、脂質、および／または糖のような生物学的分子から構成される、５から５００ ｋＤの分子量を有する任意の天然分子または合成的に生成された分子であり得る。好ましくは、生体分子は、ポリペプチド、多糖、およびリポ多糖からなる群より選ばれる。好ましくは、生体分子は１０ｋＤ〜５００ ｋＤの範囲の分子量を有する。より好ましくは、生体分子は１５ｋＤ〜４００ｋＤ の範囲、最も好ましくは２０ｋＤ〜２００ｋＤ の範囲の分子量を有する。
【００２４】
生体分子は、好ましくは、標準的なカップリング化学反応に敏感に反応する基を少なくとも２つ有する。反応基、官能基、またはカップリング部位として当該分野で公知であるこれらの基の例は、さらに以下に記載される。
【００２５】
好ましい態様において、生体分子は、ポリペプチドである。好ましくはかかるポリペプチドは５０〜５０００個のアミノ酸、より好ましくは１００ 〜４０００個のアミノ酸を有する。
【００２６】
本発明のリンカーは、１ｋＤ〜１５ｋＤの分子量を持ちかつ少なくとも４つの荷電した残基を有する。所定の分子量の範囲は、活性基またはマーカー基を持たない塩基性リンカー分子に適用される。
【００２７】
前記リンカーの分子量は、少なくとも１０００Ｄ であるのは、該リンカーの利点が特に明らかとなるからである。リンカーの分子量は、１０００〜１５，０００Ｄ の範囲であるのが好ましく、１０００〜１２，０００Ｄ の範囲が特に好ましく、１０００〜１０，０００Ｄ の範囲であるのが最も好ましい。また、リンカー分子の分子量の範囲については、１５００から１５０００Ｄの間、また１５００から１００００Ｄの間であることが好ましい。
【００２８】
本発明の結合体を生成するのに使用されるリンカーは、好ましくはペプチド骨格を有する。
【００２９】
本発明の意味において「荷電キャリアー」という用語は、６〜８の範囲のｐＨ値でイオンの形で主に存在する基を意味する。リンカーは、好ましくは４〜６０個、特に好ましくは６〜５０個、最も好ましくは９〜４０個のかかる荷電キャリアーを含む。
【００３０】
すべての荷電キャリアーは正または負に荷電されることが好ましい。しかしながら、両方、すなわち正および負に荷電した残基を有するリンカー分子を使用することもできる。かかる場合において、正に荷電した残基の数は、負に荷電した残基の数に比べて少なくとも４つまで高いまたは低いのいずれかである。
【００３１】
リンカーは、好ましくは負の荷電キャリアーを少なくとも４つ含む。適当な負の荷電キャリアーの例には、ホスフェート基、ホスホネート基、スルフィネート基、スルホネート基、スルフェート基およびカルボシキレート基があり、カルボシキレート基およびホスフェート基が最も好ましい。
【００３２】
さらに好ましくは、リンカーが少なくとも４つの正に荷電した残基を有する。正電荷キャリアーの例としては、アルキルが１〜６個のＣ原子を有する直鎖または分枝アルキル残基あるいは３〜６個のＣ原子を有する環状アルキル残基、グアニジニル基（たとえば、アルギニンの）、もしくは正に荷電したヘテロ芳香族窒素基（たとえば、ヒスチジンに見られるような）を示す、モノ、ジまたはトリアルキルアミノ基等のアミノ基およびモノ置換化もしくはポリ置換化アミノ基がある。正の荷電キャリアーは、好ましくはリジンなどの塩基性アミノ酸またはジエチルリジンなどの置換化アミノ酸から選択される。
【００３３】
リンカーは、荷電キャリアーのかわりとしてまたは荷電キャリアーに加えて荷電していない親水性基も含み得る。荷電していない親水性基の好ましい例としては、好ましくは少なくとも３つのエチレンオキシド単位を有するエチレンオキシド基またはポリエチレンオキシド基、スルホキシド基、スルホン基、カルボン酸アミド基、カルボン酸エステル基、ホスホン酸アミド基、ホスホン酸エステル基、リン酸アミド基、リン酸エステル基、スルホン酸アミド基、スルホン酸エステル基、硫酸アミド基および硫酸エステル基である。アミド基は好ましくは一級アミド基、特に好ましくはアミノ酸側鎖基中のカルボン酸アミド残基（たとえば、アミノ酸であるアスパラギンおよびグルタミン）である。エステルは、親水性アルコール、特にＣ１ 〜Ｃ３ アルコールまたはジオールまたはトリオール由来のものが好ましい。
【００３４】
本発明のリンカーは、好ましくはさらなる化学構造を有するように修飾される。最も好ましくはかかる修飾リンカーは、式（Ｚ−Ｌ−Ｘｎ）で示されかつ１つのＺ基と１または数個のＸ基（ｎ＝１〜１０）を有する（式中、Ｌは該リンカーのコア構造である）。
【００３５】
反応基Ｚは、生体分子に対してリンカーを化学的に共有するのに用いられる。Ｚ基は、好ましくはカルボン酸ハロゲニド、カルボン酸無水物、カルボン酸ヒドラジド、カルボン酸アジドまたは活性エステル（たとえば、Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミド、ｐ−ニトロフェニル、ペンタフルオロフェニル、イミダゾリルまたはＮ−ヒドロキシベンゾトリアゾリルエステル）、アミン、マレイミド、チオール、パラアミノベンゾイル基または光活性基（たとえば、アジド）などの活性化カルボン酸基である。
【００３６】
いずれかのＸ基は、上記Ｚについて規定されたような反応基であるか、またはＸはマーカー基である。Ｘが反応基である場合、一倍だけ存在し、かつリンカーはヘテロ二機能性リンカーである。当業者が、ＸについておよびＺについての反応基の適切な組み合わせを選択することは何ら困難ではない。ヘテロ二機能性リンカーにおける適当な活性基の例としては、たとえば、Ａｓｌａｍ， Ｍ． Ｄｅｎｔ， Ａ．に挙げられる。タンパク質−タンパク質の調製は、「Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ」 （１９９８） ２１６−３６３， Ｌｏｎｄｏｎ， ＭｃＭｉｌｌａｎ または「Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅ ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ 」 （１９８５） ２５８−２６８ におけるＴｉｊｓｓｅｎ 研究所テクニックに活用される。Ｘがマーカー基である場合、１０倍まで、好ましくは４倍まで存在する。また、好ましいマーカー基は２倍または１倍存在する。
【００３７】
本発明に使用されるリンカーは、「直鎖」または「分枝」リンカーであってもよい。荷電した直鎖リンカーは、米国特許第５，９５８，７８３ 号明細書から公知である。かかる直鎖リンカーは、好ましくは１５〜３５０ 個の原子の鎖長を有し、アミド機能などのヘテロ原子の組み込みにより修飾されたアルキレン鎖である。遊離荷電キャリアーを含有する直鎖リンカーは、好ましくはアミノカルボン酸単位で少なくとも部分的に構成される。かかるアミノカルボン酸単位は、好ましくは、ペプチド結合を介して共に結合される。リンカーは、天然アミノ酸単位ならびに合成アミノ酸単位を含み得る。好ましくは、リンカーは、ジペプチドβ−アラニン−グルタミン酸を繰り返し含有する。好ましいリンカー構造は、５から７０倍、より好ましくは１０から６０倍、最も好ましくは１５から５０倍のジペプチドβ−アラニン−グルタミン酸を含む。
【００３８】
さらに好ましい態様におけるリンカーは、分枝リンカーである。
【００３９】
分枝リンカーは、好ましくは、上記のような、１または数個の荷電していない親水性基特にカルボン酸アミド基および／またはポリエチレングリコール基を含有する１つの主鎖を含み、一方、１つまたは数個の側鎖において少なくとも４つの荷電キャリアーがある。この場合、たとえば、側鎖あたり１〜１０個の荷電キャリアー、特に１〜５個の荷電キャリアーが存在し得る。
【００４０】
あるいは、また、分枝リンカーは、主鎖に荷電キャリアーおよび１つまたは数個の側鎖に荷電していない親水性基を含み得る。さらなる態様では、主鎖および側鎖は荷電していない親水性基ならびに荷電キャリアーを含むことも考えられる。
【００４１】
分枝リンカーは、いくつかのマーカー基を有するように合成され得るというさらなる利点を有する。かかるリンカー（マーカー）構造の共有的カップリングは、生体分子あたりおよびカップリング事象あたり数個のマーカー基の導入を引き起こす。好ましいリンカー（マーカー）構造は、２または４個のマーカー基を有する。
【００４２】
分枝リンカーの主鎖の長さは、好ましくは７〜２００ 原子、特に好ましくは７〜１００ 原子であり、その場合、主鎖は、ヘテロ原子（たとえば、Ｏ原子）またはアミド基の組み込みにより修飾されたアルキレン鎖であり、かつ少なくとも１つの分枝部位を含み、分枝部位で形成された側鎖は、好ましくは４〜１００ 原子の長さを有する。荷電キャリアーは、主鎖および／または側鎖のアルキレン単位のＨ原子が荷電キャリアー（たとえば、ＮＨ３ ＋ またはＣＯ２ − またはグアニジル基）を含む基で置換されるような様式でリンカーにあることが好ましい。
【００４３】
遊離荷電キャリアーまたは／および親水性基を含む分枝リンカーは、ペプチド結合により共に結合されるアミノカルボン酸単位で少なくとも部分的に構成されるのが好ましい。かかるリンカーにおいて、一つの官能基は側鎖合成のための開始点として使用され得る主鎖に組み込まれた後もなお存在するように、分枝点は、少なくとも３つの官能基（たとえば、アミノ基またはカルボキシレート基）を含む多機能性アミノカルボン酸から誘導され得る。分枝鎖は、特に好ましくはリジン、オルニチン、ヒドロキシリジン、α，β−ジアミノプロピオン酸などのジアミノカルボン酸で生じる。
【００４４】
分枝リンカーの荷電キャリアーは、好ましくは２つの荷電した基のリンカーへの組み込み、およびその付随反応の後、少なくとも１つの遊離荷電キャリアーがまだ存在するように、少なくとも３つの荷電した基（たとえば、アミノ基、カルボキシレート基またはホスフェート基）の全部を含む多機能性アミノカルボン酸の遊離した正および／または負に荷電した基から誘導され得る。たとえば、荷電キャリアーは、（ａ）アミノ基および２つのカルボキシレート基または（ｂ）２つのアミノ基および１つのカルボキシレート基を含む、三機能性アミノカルボン酸から誘導され得る。かかる三機能性アミノカルボン酸の例としては、リジン、オルニチン、ヒドロキシリジン、α，β−ジアミノプロピオン酸、アルギニン、アスパラギン酸およびグルタミン酸、カルボキシグルタミン酸および欧州特許第０ ６１８ １９２ 号明細書もしくは米国特許第５，５１９，１４２ 号明細書に記載のような対称三機能性カルボン酸がある。あるいは、三機能性アミノカルボン酸（ａ）中のカルボキシレート基の１つは、ホスフェート基、スルホネート基または硫酸基で置換され得る。かかる三機能性アミノ酸の例としては、ホスホセリンがある。
【００４５】
あるいは、分枝リンカーは、また、ホスフェート−糖単位（たとえば、核酸塩基を持たないＤＮＡ骨格）で少なくとも部分的に構成され得るかグリコペプチド構造で構成され得る。さらに、リンカーは、また、糖類単位で少なくとも部分的に構成され得る。任意の場合に、リンカーの側鎖は、三機能性単位で形成された主鎖の分枝鎖にあるのが好ましく、側鎖の長さは、合成に使用される基礎単位（たとえば、天然または合成アミノ酸あるいはエチレングリコールなどの他の成分）の少なくとも２つである。
【００４６】
本発明によれば、１〜１５ｋＤの分子量を有するリンカー分子を５〜５００ ｋＤの生体分子にカップリングし、化学量論が均一であるカップリング産物を単離または選択することができる。単離された画分は、次いで、第２の分子を第一の結合体にカップリングするのに最適に使用することができる。
【００４７】
本発明のプロセスのさらに好ましい態様において、生体分子への化学的カップリングに使用される荷電したリンカー分子は、１または数個のマーカー基をすでに有している。マーカー基の例としては、標識基およびエフェクター基がある。いくつかの場所では、マーカー基が既にリンカーに付着され得るという事実が、リンカー（マーカー）を書き込むこと（ｗｒｉｔｅ）によりさらに示されている。
【００４８】
マーカー基が小さくなればなるほど、現在の技術水準の手法による生体分子とマーカーとの間での化学量論が均一であるカップリング産物の分離はより難しくなる。
【００４９】
好ましくは、マーカー基（標識基またはエフェクター基）は、１５０００Ｄ未満、より好ましくは１００００Ｄ未満の分子量を有する。最も好ましくは、マーカー基は５０００Ｄ よりさらに小さい。好ましい態様において、リンカーに付着したマーカー基は、３０００Ｄ 以下の分子量を有する。
【００５０】
かかるリンカー（マーカー）、すなわち、１または数個のマーカー基をいっしょに持つリンカーの完全な分子量は、好ましくは２０ｋＤ以下、より好ましくは１５ｋＤ以下、最も好ましくは１０ｋＤ以下である。
【００５１】
標識基は、任意の検出可能な既知の基（たとえば、染料）、化学発光基などの発光標識基（たとえば、アクリジニウムエステルまたはジオキシエタン）、または蛍光染料（たとえば、フルオレセイン、クマリン、ローダミン、オキサジン、レゾルフィン、シアニン）およびそれらの誘導体から選択され得る。標識基の他の例には、ルテニウム複合体またはユーロピウム複合体などの発光金属複合体、ＣＥＤＩＡ（クローン化酵素ドナー免疫アッセイ、たとえば欧州特許第０ ０６１ ８８８ 号明細書）に使用される酵素、および放射性同位体がある。
【００５２】
エフェクター基は、たとえば、バイオアフィン（ｂｉｏａｆｆｉｎｅ） 結合対の１つのパートナーを含む。アッセイを行いながら、エフェクター基は、バイオアフィン結合対の他のパートナーと特異的に、かつ好ましくは非共有結合的に相互作用する。適当な結合パートナーの例には、ハプテンまたは抗原／抗体、ビオチンまたはアミノビオチンなどのビオチンアナログ、イミノビオチンまたはデスチオビオチン（ｄｅｓｔｈｅｉｏｂｉｏｔｉｎ）／アビジンまたはストレプトアビジン、糖／レクチン、核酸または核酸アナログ／相補的核酸、レセプター／リガンド（たとえば、ステロイドホルモンレセプター／ステロイドホルモン）がある。好ましくは、リンカー（マーカー）が生体分子にカップリングされる前、より低分子量の結合対メンバーが、そのリンカーにカップリングされる。標識基について記載したように、好ましい分子量の範囲は、エフェクター基にも適用される。
【００５３】
好ましい結合対メンバーは、ハプテン、抗原およびホルモンを含む。特に好ましくは、ジゴキシンおよびビオチンのようなハプテンならびにそれらのアナログである。
【００５４】
荷電した直鎖リンカー分子−またはマーカーをすでに有するリンカー構造−は、米国特許第５，９５８，７８３ 号明細書に記載のように本質的に合成される。
【００５５】
荷電した分枝リンカー分子またはリンカー（マーカー）分子は、たとえば、固相合成法により得られる。固相合成法の第一段階では、アミノ酸がそのカルボキシレート基を介して、固相支持体にカップリングされ、次いで所望のリンカーがさらなるアミノ酸を続けてカップリングすることにより合成される。このプロセスで、側鎖基（たとえば、アミノ基またはカルボキレート基）として荷電した基を含む少なくとも１つのアミノ酸と、分枝部位として作用し、任意に保護された形である少なくとも１つのアミノ酸とが、本発明のリンカーを調製するのに使用される。所望のリンカーシークエンスの完了後、リンカーを固相支持体からはずす（ｃｌｅａｖｅ ｏｆｆ）または活性化マーカー（たとえば、活性エステルを有するマーカー）を固相に結合したペプチドの遊離Ｎ末端アミノ基にカップリングすることができる。固相からはずした後、反応基Ｚをペプチドリンカーのカルボキシ末端にカップリングすることができるまたは、カルボキシ末端自体を反応基Ｚとして作用させるのに使用する。存在し得る保護基ははずす。
【００５６】
固相合成の別の形式において、保護されたアミノ基およびカルボキシル基（ 例えば、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ−（−Ｒｕ（ビピリジル）３−ＯＨ）を含むアミノ酸マーカー結合体は、遊離カルボキシル基によって固相へアンカーされ得、ペプチドリンカーが、ブロックされたアミノ基の解離後に合成され得る。所望のリンカー配列の完成後、この複合体は、固相から切断される。反応基Ｚは、生じたペプチドリンカーのアミノ末端にカップリングされ得るか、または自身のアミノ末端を使用して反応基Ｚとして機能する。
【００５７】
一方で生体分子と、他方ではリンカー分子との化学カップリングは、種々の生体分子−リンカー産物の統計的混合物を誘導する。言い換えれば、このような粗結合体は、多くの異なるカップリング産物（すなわち、全く結合体化されていない生体分子、１つのリンカー構造を含む生体分子、２つのリンカー構造を含む生体分子など）を統計的量で含む。これらの生体分子−リンカー産物サブグループのそれぞれは、均一な化学量論によって特徴付けられる。これは、例えば、１つの生体分子あたり１つのリンカー構造を含むこのサブグループが１：１の均一な化学量論を有することを意味する。
【００５８】
例えば、ハプテン−タンパク質−結合体は、予め規定したモル比で化学的に活性なハプテンをタンパク質とインキュベートすることによって合成され得る。特定のカップリング化学反応は、種々の機能のアミノ酸基（−ＳＨ ；−ＮＨ２；−ＣＯＯ− ；−ＯＨ ；チロシンのイミノ基、ヒスチジンのイミダゾール基）を標的とすることが公知である。通常、これらの基は、タンパク質に繰り返し存在する。結果として、このハプテンは、一様には分布されないが、むしろこのハプテンは、ポワソン分布でタンパク質に結合される。ポワソン分布は、以下のように表され得る：
【数１】
Ｐ（ｒ）は、１分子あたりに結合されたｒ（０、１、２、３など）個のハプテンを有するタンパク質分子の関数（ｆｒａｃｔｉｏｎ）であり；ｍは反応混合物におけるハプテンとタンパク質との間の平均モル比であり；ｅ＝Ｅｕｌｅｒ 数、かつｒ！はｒの階乗（ｆａｃｕｌｔｙ ）（例えば、ｒ＝３の場合、ｒ！ ＝３×２×１）を示す。これは、例えば、１つのタンパク質分子あたりに結合された平均１つのハプテン分子を含むカップリング産物の粗混合物について、統計的にかつおおよそ３６．７％のタンパク質分子は全く標識化されず、３６．７％は１つのハプテン分子を所有し、１８．３％は２つのハプテン分子を所有し、６．１ ％は３つのハプテン分子を所有し、残りはいっそう高く標識されていることを意味する。
【００６０】
ここで例えば、生体分子とリンカー分子によって一緒に連結された小さいマーカー基（さらにそれ自身が例えば、免疫学的（ｉｍｍｕｎｏｌｇｉｃａｌ）アッセイにおけるバックグランドの減少に有利な効果を有する）との間の結合体が、予め測定され、予め規定された組成物においてすぐに利用可能であることは、本発明のきわめて魅力的な特徴である。
【００６１】
当該分野から公知の結合体は、通常、標識化指標によって特徴付けられる。この標識化指標は、１生体分子あたりの標識（またはリンカー（マーカー）基）の平均量を示す。従って、２．３ の標識化指標は、生体分子−標識産物の全混合物において１つの生体分子あたり２．３ 個の標識が存在することを示す。複雑な手法（例えば、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ （マトリクス支援レーザー脱離イオン化−飛行時間）質量分光学）によって化学量論が均一であるカップリング産物の相対量を測定することは、方法を精巧にすることで可能である。しかし、このような方法は、化学量論が均一である画分を分離するのに適切ではない。本発明の手法は、化学量論が均一である少なくとも１つの予め選択された生体分子リンカー産物を非統計的量で含む結合体の生成を可能にする。
【００６２】
用語「予め選択された」は、本発明の結合体が生体分子とリンカー分子との間の化学的結合体化の単なる統計的な結果ではなく、むしろ適切な画分の予め選択された結果であることを示すように使用される。化学量論が均一である１つのカップリング産物、または所望の場合、数個のカップリング産物は、随意に（必要な場合）すぐに選択され得、この結合体が意図される適用のために適切に構成され得る。
【００６３】
化学カップリングの形式およびストラテジーは、要求されるように選択され得る。生体分子が官能基として−ＳＨ 、−ＮＨ２または−ＣＯＯ− 残基を含むポリペプチドである場合、いくつかの適切なカップリング化学反応は、これらの官能基のそれぞれについて当該分野から公知であり、いくつかのみが言及されるべきである。注意深い読み手は、Ａｓｌａｍ， Ｍ． Ｄｅｎｔ， Ａ． Ｔｈｅ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ−ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ， 「Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ」（１９９８）２１６ 〜３６３， Ｌｏｎｄｏｎ， ＭｃＭｉｌｌａｎ に必要な詳細の全てを見出す。
【００６４】
生体分子のアミノ基（リジン側鎖の末端−ＮＨ２基またはＮＨ２ 基およびジアミノカルボン酸のωアミノ基）は、「アミノ化学反応」に基づくそれらへのマーカー基の化学的カップリングのために使用され得る。アミノ化学反応の周知の例は、特に活性化基と呼ばれる、例えば、ＮＨＳ−エステル、他の活性化エステル、酸塩化物およびアジドとアミノ基との反応を含む。
【００６５】
生体分子上のカルボキシル基（末端ＣＯＯ − 基、グルタミン酸またはアスパラギン酸のカルボキシ官能基）は、「カルボキシ化学反応」に基づく化学的カップリングのために使用される。カルボキシ化学反応の周知の例は、特に上記の活性化基を所有するためにこれらのカルボキシ基の活性化を含む。次いで、例えば、マーカー上のアミノ基へのカップリングが容易に実施される。
【００６６】
あるいは、生体分子上のスルフヒドリル基（例えば、システインの遊離ＳＨ− 基またはジスルフヒドリル結合を還元することによって得られる−ＳＨ 基）は、「スルフヒドリル化学反応」に基づく化学的カップリングのために使用される。スルフヒドリル化学反応の周知の例は、特にマレイミド（ｍａｌｅｉｍｉｄｏ ）基と−ＳＨ 基の反応、またはαハロゲンカルボン酸またはチオエーテルを用いるアルキル化を含む。
【００６７】
チロシン残基のヒドロキシル基またはヒスチジンのイミダゾール基はまた、生体分子へマーカーを共有結合するために助け（例えば、ジアゾニウム基の）として使用される。
【００６８】
生体分子をリンカーまたはリンカー（マーカー）へカップリングするための化学的反応は、実行され、必要な場合、当該分野から公知のように停止される。一方、当該分野において、通常、結合体化されていない小さいリンカーまたはリンカー（マーカー）分子のみが、高分子量の生体分子−リンカー画分から分離されるが、結合体化生体分子からの遊離生体分子の分離は非常に困難であるか、または不可能である。この分離およびまたその化学量論に従うカップリング産物の分離選択は、現在可能であり、クロマトグラフィー手法によって実施される。結合体化産物は、リンカー構造に起因する特性に基づいて、化学量論が均一である画分へ分離される。
【００６９】
新規な生体分子−リンカー産物の特に魅力的な特徴は、見かけ分子量、疎水性、および電荷における違いである。異なる化学量論を有する種々のカップリング産物の違いは、単純に１つの生体分子あたりのリンカーの数に依存する。
【００７０】
好ましい態様において、クロマトグラフィー分画が、（見かけ）分子量に基づく分離手法によって実施される。特有であるが異なる化学量論を有する種々のカップリング産物の分画は、分子量に基づいて可能であり、よく言えば、この分離は見かけ分子量の差に基づく。分子量における絶対的な差が、異なる化学量論のカップリング産物間で比較的に小さいにもかかわらず、見かけ分子量の差は、事実上明白である。これは、本発明において使用されるリンカー分子によって引き起こされる。これらの分子は１〜１５ｋＤの分子量を有しているが、これらの分子は、非常に異常なかつ非常に高い見かけ分子量を有するように移動する。
【００７１】
本発明に従って、現在、例えば、リンカー（標識）分子を所有しない、２つ、３つ、またはそれより多いリンカー（標識）分子を所有するＦａｂ’フラグメント由来の１つのリンカー（標識）分子を所有する約５０ｋＤの分子量を有する抗体のＦａｂ’フラグメントを容易に分離し、所望の場合、分画することは可能である。これは、実施例４および実施例５にならびに図１０および１１に例示される。このような分離は可能である。なぜならば、本発明に従う生体分子−リンカー結合体のリンカー構造は、その実際の分子量よりずっと高い見かけ分子量を有することが見出されているからである。
【００７２】
より大きな生体分子（例えば、Ｆ（ａｂ’）２ フラグメント（約１００ｋＤ ）、ＢＳＡ または免疫グロブリンＧおよび一旦適切なリンカーもしくはリンカー（マーカー）にカップリングされたリンカーまたはリンカー（マーカー）分子）間で均一な化学量論のカップリング産物を分離することは可能である。
【００７３】
生体分子についての見かけ分子量は、当該分野で公知の手法に従って容易に測定され得る。慣用的に使用されるものは、例えば、分子篩クロマトグラフィーである。目的の分子は、クロマトグラフィーされ、見かけ分子量は、この分子に対する保持時間を１つまたはいくつかの分子量マーカーの保持時間と比較することによって測定される。
【００７４】
見かけ分子量は測定に使用された手法によって非常に影響を及ぼされるので、生体分子の見かけ分子量およびリンカーまたはリンカー（マーカー）構造の見かけ分子量は共に、同じ手法によって測定される。
【００７５】
分子量クロマトグラフィーによる容易な分離のために、生体分子の見かけ分子量にマッチするリンカーが選択される。好ましくは、リンカー（マーカー）の見かけ分子量は、生体分子の少なくとも２０％および多くとも５００ ％の分子量である。それによって、以下のような特徴を有する、化学量論が均一である少なくとも１つの生体分子−リンカー産物を予め選択された量で含む結合体（この結合体は５ｋＤ 〜５００ｋＤ の分子量の生体分子および疎水性リンカー分子からなり、このリンカーは１ｋＤ 〜１５ｋＤの分子量、４〜６０個の荷電した残基および上記生体分子の見かけ分子量の２０％〜５００ ％の見かけ分子量を有する）の生成のためのプロセスが、本発明の好ましい態様を表す。このプロセスは、
（ａ）この生体分子およびこのリンカー分子が互いに共有結合され、
（ｂ）化学量論が均一である異なる生体分子−リンカー産物がこの生体分子−リンカー産物の見かけ分子量の違いに基づいてクロマトグラフィーによって分画され、
（ｃ）化学量論が均一であるカップリング産物を含む画分が収集されることに特徴を有する、
ことに特徴を有する。より好ましくは、リンカーまたはリンカー（マーカー）の見かけ分子量は、生体分子の見かけ分子量の２５％〜４００ ％であり、最も好ましくは３０％〜３３０ ％である。
【００７６】
（見かけ）分子量による分離は、好ましくは、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｓ ２００ＨＲ（登録商標）のようなクロマトグラフィー材料を用いる分子篩クロマトグラフィーにより行われる。
【００７７】
本発明により使用されるリンカー構造のさらに著しく、かつ特徴的な特性は、それらが、１分子当たり少なくとも４つの荷電した残基を有するという事実である。リンカー内の多数の荷電した残基はまた、生体分子−リンカー産物の正味の荷電における差異を導き、これらの荷電の差異は、生体分子当たりのリンカーの数に依存する。例えば、生体分子当たり１つのリンカーを有する生体分子−リンカー産物（均一な１：１の化学量論）は、今や驚くべきことに、かつ容易に、異なる化学量論の生体分子−リンカー産物から、または荷電の差異に基づいて付着したいかなるリンカーをも必要とすることなく生体分子から分離されうる。
【００７８】
好ましい態様では、本発明は、予め選択された量の化学量論が均一である少なくとも１つの生体分子−リンカー産物を含む結合体の生成のためのプロセスに関し、該結合体は、５ｋＤ〜５００ｋＤ の分子量の生体分子および親水性リンカー分子からなり、該リンカーは１ｋＤ〜１５ｋＤの分子量、４〜６０個の荷電した残基を有し、
ａ）生体分子およびリンカー分子が、互いに共有結合する
ｂ）化学量論が均一である異なる生体分子−リンカー産物が、該生体分子−リンカー産物の荷電における差異に基づいて、クロマトグラフィーにより分画される、および
ｃ）化学量論が均一であるカップリング産物を含む画分が回収される
という特徴を有する。
【００７９】
好ましくは、イオン交換クロマトグラフィーのような標準的なクロマトグラフィー材料および手法（例えば、Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＢｉｏｅｔｃｈからのＭｏｎｏ Ｑ（登録商標）、Ｍｏｎｏ Ｓ（登録商標）、Ｓｏｕｒｃｅ Ｑ（登録商標）またはＳｏｕｒｃｅ Ｓ（登録商標）を使用すること）は、荷電の差異に基づく化学量論が均一である生体分子−リンカー産物を分離するために使用される。所望の産物を含む画分が回収される。予め選択された化学量論の個々の生体分子リンカー産物または予め選択された化学量論のいくつかの産物の混合物が予め選択された相対量で得られる。所望される場合、高純度レベルが再クロマトグラフィーによって得られる。結合体の任意の所望の予め選択された比は、適切な画分をプールすることにより得られる。
【００８０】
上記のように、異なる化学量論のカップリング産物はまた、それらの親水性に関して異なる。親水性リンカー構造は、カップリング産物の全体の親水性または疎水性に影響する。好ましい態様における異なる化学量論の産物はまた、Ｐｈｅｎｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＨＰ （登録商標）、Ｂｕｔｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４ ｆａｓｔ ｆｌｏｗ （登録商標）等の現在の技術水準の樹脂を用いて疎水性相互作用クロマトグラフィーにより分離される。必須の材料および手法は、Ａｓｌａｍ， Ｍ．Ｄｅｎｔ， Ａ． Ｔｈｅ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ−ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ 「Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ」（１９９８） ２１６−３６３， Ｌｏｎｄｏｎ， ＭｃＭｉｌｌａｎに記載されている。逆相クロマトグラフィーもまた使用されうる。
【００８１】
本明細書中に記載される手法に従って生成された結合体は、所望される量の生体分子とリンカー分子との間の少なくとも１つの均一なカップリング産物を含む。化学量論が均一である各々のカップリング産物の相対量は、必要とされる場合、予め選択されうる。化学量論が均一である個々のカップリング産物の予め決定した、所望の相対量は、正確に、かつ再現性よく調整されうる。
【００８２】
さらに好ましい態様では、予め選択された結合体は、非結合体生体分子を本質的に含まない。
【００８３】
現在可能である分画に基づいて、本発明の結合体は、１：５およびそれより多い化学量論で生体分子−リンカー産物を含まない。
【００８４】
好ましい態様では、本発明は、５ｋＤ〜５００ｋＤ の分子量の生体分子および親水性リンカー分子（該リンカーは分子量１〜１５ｋＤおよび４〜６０個の荷電した残基を有する）からなる結合体に関し、該結合体は予め選択された量の化学量論が均一である少なくとも１つの生体分子−リンカー産物を含むことを特徴とする。
【００８５】
化学量論が均一である任意の所望される純度の個々のカップリング産物は、今や生成され、再現されうる。必要とされる比（相対量）で化学量論が均一である種々のカップリング産物を含む混合物は、容易に生成され、再現されうる。それゆえ、本発明の結合体は、化学量論が均一である少なくとも１つの他の生体分子−リンカー産物と比べて予め選択された相対量で化学量論が均一である少なくとも１つの生体分子−リンカー産物を含む。
【００８６】
より小さな化学量論が均一である生体分子−リンカー産物が結合体の一部を形成するほど、より容易に生成され、再現される。好ましい結合体は、本質的に、１〜３の化学量論が均一である個々の生体分子−リンカー産物を含む。より好ましい結合体は、本質的に、化学量論が均一である２つの異なるカップリング産物を含む。最も好ましい態様では、本発明の結合体は、１：１化学量論の生体分子−リンカー産物を本質的に含む。
【００８７】
さらに好ましい態様では、本発明の結合体は、化学量論が均一である唯一の生体分子リンカー産物を本質的に含む。
【００８８】
種々のカップリング産物の中で、１：１〜１：４の均一な化学量論を有するものが好ましい。特に好ましいものは、１：２および１：１の化学量論を有する生体分子リンカー産物であり、後者は、化学量論が均一である最も好ましいカップリング産物を表す。
【００８９】
用語「本質的に含む」は、他のカップリング産物の相対量と比べて、化学量論が均一である１つのカップリング産物（または３つまでのカップリング産物の混合物（各々））の相対量をいう。言い換えると、かかる結合体における全てのカップリング産物の少なくとも８０％が予め選択された化学量論である。好ましくは、本質的に、少なくとも８０％の均一なカップリング産物（またはカップリング産物の所望の混合物）を含む結合体に関する。９０％の予め選択されたカップリング産物またはカップリング産物の混合物を含む結合体がより好ましい。最も好ましいのは、他のカップリング産物と比べて、選択された結合体（単数または複数）について９５％の相対純度である。
【００９０】
別の好ましい態様では、本発明の結合体は、他のカップリング産物と比べた相対量において少なくとも８０％の化学量論が均一である２つの生体分子−リンカー産物を含み、最も好ましくは少なくとも８０％の化学量論が均一である１つのみの生体分子−リンカー産物を含む。
【００９１】
非常に好ましい結合体は、５ｋＤ〜５００ｋＤ の分子量を有する生体分子と親水性リンカー分子（該リンカーは１〜１５ｋＤの分子量および４〜６０個の荷電した残基を有する）との間の均一な１：１の化学量論のカップリング産物を相対純度８０％以上で含む。すなわち、この１：１結合体は、他の生体分子−リンカー産物の合計と比べて８０％またはそれより多くの相対量で存在する。
【００９２】
より好ましくは、９０％またはそれより多くの相対量で１：１の化学量論を有するカップリング産物を含む結合体であり、さらに好ましくは、異なる化学量論のカップリング産物と比べて、９５％またはそれより多くの相対量で１：１の化学量論のカップリング産物を含む結合体である。
【００９３】
今日、市販のアッセイは、可能な限り少ない取り扱いステップで済むように生成されている。これは、簡便であり、取り扱いのエラーの機会を減らす。もちろん、本発明の結合体を、例えば凍結、または凍結乾燥したものとしてカスタマーに提供することができる。
【００９４】
結合体が試薬組成物の一部であることが好ましい。多くの場合、結合体は、希釈形態および液体形態で存在し、それゆえ、安定化剤（例えば、ウシ血清アルブミンおよび／または種々の糖）、また任意に保存剤および／または界面活性剤等の試薬が存在する。さらに好ましい態様では、本発明は、緩衝液成分、安定化剤、および予め選択された量で化学量論が均一である少なくとも１つの生体分子−リンカー産物を含む結合体を含む試薬の組成物に関する。
【００９５】
好ましくは、本発明により生成された結合体は、試験片タイプの免疫学的デバイスにおいて使用される。
【００９６】
通常、単一試薬ではなく、むしろ少なくとも分析物特異的アッセイ試薬を含む完全なキットがカスタマーに提供される。好ましい態様では、本発明は、サンプル中の分析物の生化学的または免疫学的検出のための試験キットに関し、該キットは適切な緩衝液および試薬ならびに本発明の結合体を含む試薬の少なくとも１つの組成物を含む。
【００９７】
新規結合体に基づく免疫アッセイは、従来技術の方法で産生される結合体に基づくアッセイと比べて優位な特徴を有する。アッセイ自身におけるこのポジティブな効果は、実施例のセクションに示される。新規結合体が、別の比較可能なアッセイ条件化で使用される場合、著しく、バックグラウンドの問題は有意に低減される。免疫アッセイにおいて本発明に記載されるような特異的結合対のメンバーを生体分子として含む結合体の使用は、それゆえ、本発明の別の好ましい態様を表す。
【００９８】
好ましくは、新規結合体は、分析物特異的結合パートナーと分析物との間の反応に基づく分析物の検出、および得られる分析物結合パートナー複合体の測定に使用される。特異的結合アッセイの最も知られている例は免疫アッセイである。生体分子−リンカー（マーカー）結合体に基づく免疫アッセイにおいて、新規プロセスおよび試薬は、結合体の再現性に貢献する。より再現性の高い結合体であるほど、それに基づくアッセイはより良好な再現性を有する。
【００９９】
考察されるように、結合体の質および現在の技術水準の手法による再現性の両方は、限られた程度までだけ影響しうる。例えば、最終結合体から凝集体または沈殿物を除去することができる。生体分子とリンカー分子との間の異なる化学量論のカップリング産物の相対量を調整することは現在の技術水準の手法では不可能である。意図される適用に最も適した化学量論が均一であるカップリング産物を含む画分を選択することは非常に困難であるかまたは不可能である。これらの欠点は、本発明により解消された。
【０１００】
以下の実施例、参考文献、および図は、本発明、添付の特許請求の範囲に示される真の範囲の理解を補助するために提供される。本発明の意図を逸脱することなく示される手法に修飾が行われうることが理解される。
【０１０１】
実施例１：現在の技術水準に従うウシ血清アルブミンのルテニウム化（ｒｕｔｈｅｎｙｌａｔｉｏｎ ）
当該分野で公知のウシ血清アルブミンおよびリンカー（図１を参照のこと）を、５つの結合体混合物を提供するために使用している。ロットサイズ、試薬濃度、緩衝組成物、反応時間、試薬温度およびクロマトグラフ分離手法などの全ての変数を、一定に保っている。
【０１０２】
ＢＳＡ を、２０ｍｇ／ｍｌ の濃度で１００ｍＭ のリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ ８．０）に溶解した。ｈｙ−ＢＰＲｕ リンカー（標識；ｃｆ． 図１、上）を４７ｍｇ／ｍｌ の濃度でＤＭＳＯに溶解した。５倍モルを超過するｈｙ−ＢＰＲｕ をＢＳＡ 溶液に添加し、試薬を入念に混合し、反応を２５℃にて７５分間実施した。反応を、１０ｍＭの最終濃度までのリジンの添加および２５℃にてさらに３０分間攪拌下でのインキュベートによって停止した。
【０１０３】
遊離未結合誘導試薬を、ｐＨ ７．５にて５０ｍＭリン酸、１５０ｍＭ 塩化ナトリウムを含むリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ ）（５００ 倍過剰で使用されている）に対する透析（２０時間、４℃で）によって完全に除去した。
【０１０４】
図１におけるＯ−ヒドロキシスクシニミドエステルの活性基は、統計的にＢＳＡ の異なるＮＨ２−基と反応する。生じた粗結合体を、ｐＨ６．５ にて０．０５ｍｍｏｌ／ｌリン酸ナトリウム、０．０５ｍｍｏｌ／ｌ塩化ナトリウムおよび５％メタノールの緩衝条件を使用してＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００ ＨＲ （登録商標）クロマトグラフィーによってクロマトグラフィーしている。溶出をモニタリングする。適切な画分をプールする。産物ピークをエレクトロスプレーイオン化質量分光学（ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ−ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ ｍａｓｓ−ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ ）（ＥＳＩ−ＭＳ）によって分析した。このような分析の結果を、表１および２に要約する。
【０１０５】
【表１】
【表２】
同一の条件下で生成されたにもかかわらず、５ロット全てが明らかに互いに異なることが、表１および２から明らかである。ロット１および２は、２．３ の同じ全標識化指標（これは、１つのＢＳＡ 分子あたりに見出される平均２．３ 個のルテニウム標識を意味する）を有する。それにもかかわらず、両調製物は、表２から明らかなように個々の結合体化産物の相対量において有意に異なる。全標識化指標はまた、かなり有意に変わる。Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ ＨＲ （登録商標）カラムを使用する標準的なクロマトグラフ手法によって、全ての反応産物が同質のピークとして溶出することは図２から明らかである。例えば、１：１結合体を均等に含む画分へのカップリング産物の分別は、不可能である。
【０１０８】
実施例２：リンカー構造の合成
分枝リンカー構造の合成
固相ペプチド合成による分枝リンカーの調製
分枝リンカーを、バッチペプチドシンセサイザー（例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製Ａ４３３）でのフルオレニルメチルオキシカルボニル−（Ｆｍｏｃ）−固相ペプチド合成によって合成した。各場合において、表３に示すアミノ酸誘導体の４．０ 当量を使用した。
【０１０９】
【表３】
アミノ酸およびアミノ酸誘導体を、Ｎ−メチル−ピロリドンに溶解した。ペプチドを、Ｗａｎｇ樹脂上で合成する（Ｓ．−Ｓ．Ｗａｎｇ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．９５（１９７３）１３２８）。この樹脂を、０．２ 〜０．４ｍＭｏｌ／ｇ で充填する。カップリング反応を、反応培地としてのジメチルホルムアミド中のＦｍｏｃ− アミノ酸誘導体に対して４当量のジシクロヘキシルカルボジイミドおよび４当量のＮ−ヒドロキシベンゾトリアゾールを用いてジメチルホルムアミド中で２０分間実行した。Ｆｍｏｃ基を、２０分間ジメチルホルムアミド中で２０％ピペリジンを用いた合成の各工程の後、切断した。樹脂の量を選択し、その結果、最終分枝の後、アミノ基に対して４当量のＦｍｏｃ− アミノ酸を使用する。Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｆｍｏｃ）−ＯＨ を、２つの同一アームの分枝および続く合成のために使用する。非対称の分枝を、直交する側鎖保護基（例えば、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｄｄｅ） またはＦｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ａｌｌｏｃ） ）を有するアミノ酸誘導体によって達成する。これらの直交する保護基を、文献において公知の方法によって樹脂上で切断する（Ｂ．Ｗ．Ｂｙｃｒｏｆｔ ら（１９９３），Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．，７７８ ；Ａ．Ｍｅｒｚｏｕｋ ら（１９９２）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．３３，４７７ ）。固相上の末端アミノ基を、任意に、無水酢酸または無水コハク酸を用いてアセチル化するかまたはスクシニル化する。
【０１１１】
誘導体が固相合成の間に安定である場合、ハプテン、標識または官能基は、すでに樹脂上（例えば、ペプチドのＮ−末端アミノ酸上）に導入されている。
【０１１２】
例えば、金属キレート標識の導入を、キャリア結合ペプチドの遊離Ｎ−末端アミノ基で適切な活性エステル誘導体を介して実施した。この遊離１級アミノ官能基あたり４当量のルテニウム（ビピリジル）３複合体（ＢＰＲｕ）に対して、Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾール／ジシクロヘキシル−カルボジイミドを用いて活性化し、少量のＤＭＳＯに溶解し、これを滴状添加し、室温にて２時間攪拌した。
【０１１３】
マーカーはまた、例えば、金属キレートまたはビオチンカップリングアミノ酸誘導体の直接組み込みによってすでに固相合成の間にＣ−末端で導入され得る（ＷＯ９６／０３４０９に記載される）。
【０１１４】
ペプチドを支持体から解離し、酸不安定な保護基を、２０ｍｌのトリフルオロ酢酸、０．５ｍｌ のエタンジオール、１ｍｌ のチオアニゾール、１．５ｇのフェノールおよび１ｍｌ の水を用いて室温にて４０分以内に切断する。使用するアミノ酸誘導体に依存して、ラジカル捕獲をほとんど含まないカクテルをまた使用し得る。３００ｍｌ の冷却ジイソプロピルエーテルを、反応溶液に引き続き添加し、この混合物をペプチドを完全に沈殿するために４０分間０℃にて維持した。沈殿物を濾過し、ジイソプロピルエーテルを用いて洗浄し、少量の５０％酢酸に溶解し、凍結乾燥した。得られた粗物質を、適切な勾配（溶出液Ａ：水、０．１ ％トリフルオロ酢酸、溶出液Ｂ：アセトニトリル、０．１ ％トリフルオロ酢酸）にわたってＤｅｌｔａ−ＰＡＫ ＰＲ Ｃ１８カラム（５０×３００ｍｍ 、１００ Å；１５μ）上で分離用ＨＰＬＣによって約１２０ 分以内に精製した。溶出された物質を質量分光測定法によって同定した。
【０１１５】
あるいは、マーカー基をまた、樹脂からの切断後に導入し得る。このために、固相ペプチド合成の間および切断の間、安定な保護基で誘導されるべきでない他の基をブロックする必要があり得る。例えば、フェニルアセチル（Ｐｈａｃ）を、使用し、保護基をＰｅｎＧアミダーゼを用いて酵素的に除去し得る（ＰＣＴ／ＥＰ９５／０２９２１に記載される）。
【０１１６】
ｂ）荷電した直鎖リンカー構造の合成
荷電した直鎖リンカー構造を、米国特許第５，９５８，７８３ 号に記載されるように本質的に合成している。
【０１１７】
ｃ）研究したリンカー構造の例
表４は、使用したいくつかのリンカー構造に関する概略を提供する。構造１および１０は、当該分野で既知の構造であり、一方、他の全ての構造は、さらなる特徴（例えば、著しく高い見かけ分子量）を含む。
【０１１８】
利用可能なように、研究室名をまた提供している。これらの構造（またはＭＨ活性化またはＤＳＳ 活性化のために使用する基本構造）を提供する図を参考にする。
【０１１９】
【表４】
図９は、ＢＳＡ と比較したリンカー（マーカー）構造のＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００ ＨＲ （登録商標）クロマトグラフを示す。荷電した残基の劇的な影響が、上パネルから明らかになり、荷電していないリンカーは、約３，５００Ｄの分子量で移動するが、荷電したリンカーは、約１８，０００Ｄ の見かけ分子量で見出される。図９下パネルは、長い荷電した骨格のリンカー分子が見かけ分子量に差を有するという顕著な効果を示す。５，８０２ の分子量を有する構造２（ＢＰＲｕ−（ＵＥ）２５ ）は、例えば、約５０，０００Ｄ の見かけ分子量で移動する。
【０１２１】
表４にすでに示されたように、リンカー分子は活性化され得る。活性化のための例は、マレインイミド官能基の導入である。マレインイミド官能基を導入するために、リンカー（例えば、実施例２に従って生成される）を、０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液ｐＨ７．０ に溶解し、１当量のマレインイミドヘキサン酸 Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＤＭＳＯに溶解される）と混合し、２５℃にて１６時間攪拌する。この調製物を、ＲＰＣ１８ カラム（上記参照）を使用して分離用ＨＰＬＣによって精製する。溶出された物質の同一性を質量分光測定法によってチェックする。
【０１２２】
実施例３：新規ウシアルブミンリンカー結合体
ＷＯ９６／０３６５２に記載されるように、多重結合抗原を含むキャリア分子は、抗ウイルス抗体の検出において顕著に有益である。ポリハプテンの生成のために、キャリア分子のアミノ基を、活性エステル基を用いて最初に活性化する。この活性エステル基を、使用するマーカー基上の対応する活性基とマッチするように選択する。好ましい活性基は、マレインイミドヘキシル（ＭＨＳ ）またはマレインイミドプロピル−Ｎ− ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＰＳ ）である。結果として、キャリア中の１級アミノ基（例えば、リジン残基のε− アミノ側鎖）を、所望のマレインイミド基を所有するように部分的に誘導体化する。マーカー基を活性化キャリアにカップリングした後、このキャリアのＮＨ２ 基は、修飾されていないか、またはＭＨＳ 基を所有するか、またはＭＨＳ リンカーを介する標識を所有するかのいずれかで存在する。
【０１２３】
図３（ＤＳＳ 活性化）および８に模式的に示されるリンカー（マーカー）構造を、同一条件下でＢＳＡ にカップリングさせている。
【０１２４】
ＢＳＡ を、０．１ｍｍｏｌ／ｌ のリン酸カリウム緩衝液ｐＨ７．５ に１０ｍｇ／ｍｌ の濃度で溶解する。リンカー（マーカー）を、１モルのＢＳＡ あたり４．５ のモル比で添加する。反応を室温にて３時間実施する。反応産物をイオン交換クロマトグラフィーに供する。均一な化学量論を有するカップリング産物の分離を、Ｓｏｕｒｃｅ１５Ｑ （登録商標）またはＭｏｎｏＱ （登録商標）カラムを使用することによって達成する。
【０１２５】
多様に分枝したリンカーの粗結合体（図８および表１の構造１３を参照）を、ＭｏｎｏＱ （登録商標）クロマトグラフィーを用いて分画した。溶出を、２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．５ ）（＝溶出液Ａ）から２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．５ ）中に１Ｍ塩化ナトリウム（＝溶出液Ｂ）への塩勾配を使用して実施した。溶出を２８０ｎｍ でモニタリングする。図１０に示す勾配は、２５〜５４％の溶出液Ｂの範囲にわたり、３０分の溶出に相当する。適切な画分をプールする。画分をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳによって分析する。ＭＳデータは、３つのピークそれぞれが純粋な形態のＢＳＡ （図１０中の１）および１または２個のリンカー（マーカー）基を所有するＢＳＡ 分子（それぞれ図１０中の２および３）を含むことを確認した。
【０１２６】
長く、かつ強力に負に荷電した直鎖リンカーを用いて得られた粗結合体（表４の構造１２および図３）を、Ｓｏｕｒｃｅ１５Ｑ （登録商標）クロマトグラフィーによって分離している。溶出を、２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．５ ）（＝溶出液Ａ）から２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．５ ）中に１Ｍ塩化ナトリウム（＝溶出液Ｂ）への塩勾配を使用して実施した。溶出を２８０ｎｍ でモニタリングする。図１０に示す勾配は、３０〜４０％の溶出液Ｂの範囲にわたり、３０分の溶出に相当する。適切な画分をプールする。画分をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳによって分析する。ＭＳデータは、４つのピークそれぞれが純粋な形態のＢＳＡ （図１１中の１）および１、２または３個のリンカー（マーカー）基を所有するＢＳＡ 分子（それぞれ図１１中の２、３および４）を含むことを確認した。
【０１２７】
実施例４：第一の新規Ｆａｂ’− リンカー− 結合体の生成
１．手法の説明
１．１．ＩｇＧ 由来のＦａｂ’の調製
ジゴキシンに対するモノクローナル抗体（抗Ｄｉｇ ）をペプシンによって切断して、Ｆ（ａｂ’）２ を形成した。定量的切断後、このペプシンを、ｐＨを増加してペプスタチンを添加して不活化した。このＦ（ａｂ’）２ を前精製なしにシステアミンによってＦａｂ’へ還元した。システアミンは、ほとんど選択的にヒンジ領域におけるジスルフィド結合を切断する。その後、透析する。これは、ペプシンによって生成されたほとんどのＦｃ切断産物を除去する。なぜならば、Ｆｃ切断産物は、透析チューブの細孔を通るのに十分小さい（＞１０，０００ダルトン）からである。
【０１２８】
１．２．Ｆａｂ’−ＢＰＲＵ リンカー結合体
結合体合成を、過剰なＢＰＲｕ− リンカー−ＭＨ とＦａｂ’を反応させることによる−ＳＨ 基化学的反応を介して実施した。このプロセスにおいて、ヒンジ領域におけるＳＨ基を主に変換した。少量のポリルテニウム化Ｆａｂ’を、軽鎖およびＦｄ鎖における分子内ジスルフィド結合を還元した結果として副反応として形成した。
【０１２９】
１．３．粗結合体の精製
粗結合体を分子篩によって精製した。このプロセスにおいて、モノルテニウム化物質をポリルテニウム化物質から分離した。
【０１３０】
２．手法
２．１．Ｆ（ａｂ’）２ を形成するための抗体の切断
モノクローナル抗体抗ＤＩＧ−Ｍ１９．１１ ＩｇＧの凍結乾燥品（ｌｙｏｐｈｉｌｉｓａｔｅ）を、２０ｍｇ／ｍｌ の濃度を得るようにＨ２Ｏ を用いて還元した。２０μｌ の１Ｍクエン酸塩ｐＨ３．５ を溶液１ｍｌ あたりに添加した（クエン酸塩の最終濃度＝２０ｍＭ）。ｐＨをＨＣｌ を用いて３．６０に調節した。０．４５μｍ フィルターを通して濾過した。この濃度をＯＤ２８０ｎｍ で測定した（１ＯＤ２８０ｎｍ＝１．４ｍｇ／ｍｌ）。２０ｍＭクエン酸塩ｐＨ３．６０を用いて１０ｍｇ／ｍｌ に調整した。この溶液を３７℃まで水浴で加熱した。１００ μｌ のペプシン溶液（３ｍｇ／ｍｌ）を抗体溶液１ｍｌ あたりに添加し、３７℃にて水浴中でインキュベートした。完全な切断後、反応を、ｐＨ値を増加させてペプスタチンを添加することで停止した。
【０１３１】
２．２．Ｆａｂ’への還元
５２．６μｌ の０．１Ｍジチオトレイトール（ＤＴＴ ）を切断混合物１ｍｌ あたりに添加し、２５℃にて水浴中で３０分間インキュベートした。Ｆａｂ’を、０．１ＭのＮａＨ２ＰＯ４／ＮａＯＨ ｐＨ６．５、３０ｍＭのＮａＣｌ、２ｍＭ のＥＤＴＡに対して透析した。
【０１３２】
２．３．Ｆａｂ’−ＢＰＲｕ−リンカー結合体の合成
ＢＰＲｕ− リンカー−ＭＨ （図８の分枝リンカーであるが、ＭＨ基の代わりにＤＳＳ を所有する）をＤＭＳＯに溶解した。化学量論Ｆａｂ’： ＢＰＲｕ−リンカー−ＭＨ は、１：３（モル／モル）であった。混合物中のＦａｂ’の最終濃度は、３．９ｍｇ／ｍｌであった。混合物中のＤＭＳＯの最大濃度は、１０％であった。反応時間は、室温にて１時間であった。
【０１３３】
２．４．精製
粗結合体をＡｍｉｃｏｎ ＰＭ １０を使用して２〜３倍に濃縮し、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ ＨＲ （登録商標）（緩衝液：２５ｍＭのＭＯＰＳ／ＮａＯＨ ｐＨ６．５ 、５０ｍＭのＮａＣｌ、１０％のＤＭＳＯ；適用量：ゲル層の最大１．５ ％、画分：ゲル層の０．５ ％）によって精製した。Ｆａｂ’−ＢＰＲｕ−リンカー結合体を含む画分をプールした。必要な場合、再クロマトグラフィーを実施し得る。
【０１３４】
粗結合体は、主に、ヒンジ領域における−ＳＨ 基の１つでリンカーが結合されるＦａｂ’− フラグメントからなるカップリング産物を含む。より低い程度（ｅｘｔｅｎｄ）まで多様に標識されたＦａｂ’− フラグメントがまた存在する（図１２において、それぞれピークＩＩＩ 、ＩＩ、およびＩを参照）。
【０１３５】
実施例５：第二の新規Ｆａｂ’−ＢＰＲｕ（ＵＥ）２５ 結合体の生成
１．Ｆ（ａｂ’）２ およびＦａｂ’− フラグメントを抗ＨＩＶ ｐ２４ モノクローナルから調製した切断を実施例４に記載されるように本質的に実施する。Ｆ（ａｂ’）２−溶液を、ｐＨ７．５ の５０ｍＭのリン酸カリウム、１５０ｍＭ の塩化ナトリウム緩衝液に対して透析する。
【０１３６】
５ｍｇ／ｍｌのＦ（ａｂ’）２−フラグメントを含むＦ（ａｂ’）２−溶液にシステアミンを最終濃度２５ｍＭで添加する。この溶液を３７℃にて６０分間インキュベートする。反応を、５０ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ 塩化ナトリウム緩衝液を含むｐＨ６．０ までのＰＤ１０− カラム緩衝液を用いる緩衝液変更を介して停止する。
【０１３７】
２．Ｆａｂ’− フラグメントのルテニウム化
リンカーＢＰＲｕ−（ＵＥ）２５−ＭＨを、２５ｍｇ／ｍｌ の濃度でＤＭＳＯに溶解する。Ｆａｂ’− フラグメント対 ＢＰＲｕ−（ＵＥ）２５−ＭＨ リンカー（マーカー）のモル比を１：２に設定する。反応混合物を、５０ｍＭリン酸カリウム、１５０ｍＭ 塩化ナトリウム溶液（ｐＨ７．１ ）中で２５℃にて９０分間インキュベートする。この反応を、２ｍＭ システインの添加および２５℃にて３０分間のこの溶液のインキュベーションによって停止する。Ｎ−メチル− マレインイミドを５ｍＭ で添加し、５５℃にて６０分間インキュベートする。
【０１３８】
３．精製
粗結合体をＣＥＮＴＲＩＣＯＮ１０ を用いて約３倍に濃縮し、５０ｍＭリン酸カリウム、１５０ｍＭ 塩化ナトリウムでｐＨ７．５ に緩衝化したＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００ ＨＲ （登録商標）カラムによって精製した。図１１に示し得るように、粗混合物は非結合体化Ｆａｂ’− フラグメント、非結合体化リンカー（マーカー）および１：１、１：２および１：３の化学量論が均一である結合体を含むことが見出されている（それぞれ、図１３のピーク５および４、３、２、および１を参照）。
【０１３９】
実施例６：Ｆ（ａｂ’）２−フラグメントのルテニウム化
１．手法の説明
１．１．ＩｇＧ のＦ（ａｂ’）２ フラグメントの生成
実施例５から既知の同じモノクローナル抗体をＦ（ａｂ’）２ フラグメントの生成のために使用する。ペプシンによるＩｇＧ の消化を実施例５に記載されるように実施する。定量的切断の後、ペプシンをｐＨを増加することによっておよびペプスタチンを添加することによって不活化する。Ｆ（ａｂ’）２−フラグメントをＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００ ＨＲ （登録商標）カラムクロマトグラフィーを使用して精製する。
【０１４０】
１．２．Ｆ（ａｂ’）２−ＢＰＲｕ−（ＵＥ）２５−ＤＳＳ の合成
結合体化を、ＢＰＲｕ−（ＵＥ）２５−ＤＳＳ の活性基（ＤＳＳ 基を所有する図３のリンカー）をＦ（ａｂ’）２−フラグメントのアミノ基にカップリングすることによって実施する。試薬の初期濃度およびＦ（ａｂ’）２−フラグメントとリンカー（マーカー）分子との間で選択される化学量論に依存して、より高いまたはより低い平均標識化指標で粗結合体を得る。言い換えると、種々の量のリンカー構造を所有するＦａｂ’− 分子のランダムポアソン分布を得る。
【０１４１】
１．３．粗結合体の精製
粗結合体を濃縮して慣用的な分子篩クロマトグラフィーを用いて精製する。
【０１４２】
異常な高い見かけ分子量に起因して、各個体のリンカー分子によって寄与されるように、異なる化学量論のカップリング産物を互いに分離し得る。
【０１４３】
２．手法
２．１．ＩｇＧ のＦ（ａｂ’）２ への切断
Ｍａｂ＜ｐ２４＞Ｍ−６Ｄ９− Ｆ（ａｂ’）２へのＭａｂ＜ｐ２４＞Ｍ−６Ｄ９−ＩｇＧ の切断。ＨＩＶ のｐ２４ に対するモノクローナル抗体の凍結乾燥ＩｇＧ を、最終濃度２０ｍｇ／ｍｌ までＨ２Ｏ を用いて還元する。切断を実施例５に記載するように実施する。
【０１４４】
２．２．Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ ＨＲ （登録商標）クロマトグラフィーによるＦ（ａｂ’）２−フラグメントの精製
記載するように生成したＦ（ａｂ’）２−フラグメントを、以下の緩衝液および条件を用いて精製する：
カラム物質 Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ ＨＲ （登録商標）
緩衝液 １０ｍＭリン酸ナトリウム
（ｐＨ７．５ に調整した緩衝液）
３０ｍＭ塩化ナトリウム
フッ化物 １０ｍｌ／ｃｍ２／ｈ
サンプル体積 カラム体積の１．５ ％
サンプル濃度 ２０ｍｇ／ｍｌ
溶出液光度計のモニタリング ２８０ｎｍ
Ｆ（ａｂ’）２−フラグメントを含む画分をプールして、濃縮して、同一条件下で再度クロマトグラフィーする。
【０１４５】
２．３．ＢＰＲｕ−（ＵＥ）２５−ＤＳＳ を用いるＦ（ａｂ’）２−フラグメントの標識化
ＢＰＲｕ−（ＵＥ）２５−ＤＳＳ を、５ｍｇ／ｍｌでＤＭＳＯに溶解する。カップリング化学量論を、
１：５（ｍｏｌ／ｍｏｌ ）＝Ｆ（ａｂ’）２−フラグメント：リンカー
で選択する。
【０１４６】
この反応混合物を、室温にて１時間インキュベートする。反応を１０ｍＭの最終濃度でリジンを添加して停止する。
【０１４７】
２．４．ＢＰＲｕ−ＵＥＥＫ−ＤＳＳ を用いるＦ（ａｂ’）２−フラグメントのカップリング
リンカー（標識）ＢＰＲｕ−ＵＥＥＫ−ＤＳＳ を５ｍｇ／ｍｌの濃度でＤＭＳＯに溶解する。カップリングについて選択した化学量論は、
１：５（ｍｏｌ／ｍｏｌ ）＝Ｆ（ａｂ’）２−フラグメント：ＢＰＲｕ−ＵＥＥＫ−ＤＳＳ
である。
【０１４８】
この反応混合物を、室温にて１時間インキュベートする。反応を１０ｍＭの最終濃度でリジンを添加して停止する。
【０１４９】
２．５．粗カップリング産物の精製
精製をＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００ ＨＲ （登録商標）クロマトグラフィーによって実施する。両方のＦ（ａｂ’）２ 結合体のクロマトグラフィーを、ｐＨ７．５ に調整した１００ｍＭ Ｈｅｐｅｓ 緩衝液（１ｍＭ ＥＤＴＡおよび５ ％ ＤＭＳＯ を含む）中で実施する。流速を、５ｍｌ／ｃｍ２／ｈ に設定する。検出を２８０ｎｍ で実施する。サンプル体積は、カラム体積の１．５ ％である。
【０１５０】
図１４および１５から明らかなように、強力に負に荷電したリンカーｈｙ−ＢＰＲｕ−（ＵＥ）２５−ＤＳＳで生成されるカップリング産物（図１４）のみを、同一の化学量論のカップリング産物を含む画分に分離し得、一方従来のリンカーを用いたカップリング産物（図１５）は全て、１つのピークとして溶出する。１：１化学量論を有する主要なカップリング産物を含むプールされた画分（おおよそ１０７ 分〜１２５ 分；図１４では１１１ 分のピーク）を、一度、再クロマトグラフィーし、純度および分子量をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳで確認している。
【０１５１】
実施例７：異なる抗体−リンカー結合体を用いる免疫学的検定
例えば、ＨＩＶ に対する特異的抗体の検出において使用される二重抗体試験を、モデル系として使用している。このサンプル（ＨＩＶ に対する抗体を含むと推測される）を、ストレプトアビジンコート固相の存在下でのビオチン化抗原およびジゴキシゲニン標識抗原ならびにジゴキシンに対するＢＰＲｕ標識抗体と共にインキュベートする。サンプル中の抗ＨＩＶ 抗体の存在下で、ストレプトアビジンコート固相、ビオチン化抗原、検出対象の抗体、ジゴキシン化（ｄｉｇｏｘｉｎｙｌａｔｅｄ ）抗原およびジゴキシンと反応するルテニウム標識抗体を含む検出複合体を形成する。抗ＨＩＶ 抗体の検出を、標準的な電気化学発光手法に従って固相に結合された電気化学発光シグナルを測定することによって実施する。
【０１５２】
このモデル系において、ＨＩＶ１のｇｐ４１領域由来のＮ末端標識ＨＩＶ ペプチドを使用している。このペプチドおよびこのペプチドの標識化に関する詳細は、ＷＯ９６／０３４２３に記載される。両抗原を２０ｎｇ／ｍｌ の濃度で使用している。
【０１５３】
この系の全ての成分を、一定に維持し、検出系のみ（すなわち、ルテニウム標識抗ジゴキシン試薬）を変更している。表５および６に列挙した全ての結合体について、抗ＤＩＧ のＦａｂ’− フラグメントを同じ濃度のルテニウム標識で使用している。
【０１５４】
【表５】
【表６】
結合体ＥおよびＦを、それぞれ１：２および１：６（Ｆａｂ’対リンカー）のモル比を使用して欧州特許第７２０ ６１４ 号に従って生成している。使用したリンカーは、ＫＥＥＵ−ＢＰＲｕ であった。
【０１５７】
結合体ＧおよびＨは、本発明に従って生成し、精製した精製１：１カップリング産物（それぞれ、図３（（ＵＥ）２５および活性化ＭＨ）および４に示すリンカー（マーカー）構造を含む）を含んでいた。
【０１５８】
新規な１：１結合体は、陰性サンプルからの陽性サンプルのより良い分離を可能にする。これは、陽性血清について得たシグナルを、陰性血清に対して標準化した表６から最も容易に見出される。
【０１５９】
実施例８：ビオチン化リンカー（Ｂｉ−（ＵＥ）２５−ＤＳＳ ）へのモノクローナル抗体（ＭＡＢ ）＜フェリチン＞Ｍ−４．１８４ の結合体化
この実施例において、ＩｇＧ クラスの完全なＭＡＢ （約１５０ｋＤ のＭＷ）を、結合体化のために使用している。（Ｂｉ−（ＵＥ）２５−ＤＳＳ ）を使用するリンカー（マーカー）の基本構造体を図３に与える。ルテニウムキレート複合体の代わりに、このリンカーはビオチン化基（Ｂｉ− ）を所有し、そのＣ末端でＤＳＳ 基を所有するように修飾されている。
【０１６０】
結合体化の方式
ＤＭＳＯに１５ｍｇ／ｍｌ の濃度で溶解したＢｉ−（ＵＥ）２５−ＤＳＳ を、ＭＡＢ ＜フェリチン＞Ｍ−４．１８４ の精製ＩｇＧ （ｐＨ８．５ の１００ｍＭ リン酸カリウム緩衝液中１０ｍｇ／ｍｌ ）へ添加し、１：１ （ＩｇＧ 対リンカー）の最終モル比を生じる。この反応混合物を２５℃にて６０分間インキュベートし、その後、結合体化を１０ｍＭの最終濃度までリジンを添加して停止する。
【０１６１】
反応産物を、ｐＨ７．５ の２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液に対して透析する。
【０１６２】
ＭＡＢ ＜フェリチン＞Ｍ−４．１８４−ＩｇＧ− Ｂｉ（（ＵＥ）２５−ＤＳＳ） の精製
精製をＳｏｕｒｃｅ ３０ Ｑ （登録商標）クロマトグラフィーによって実施している。溶出を、緩衝液（Ａ）として２０ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ６．５ ）、緩衝液（Ｂ）として１Ｍ ＮａＣｌ を含む２０ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ６．５ ）を使用する塩勾配を適用することによって実施している。得られる結果を、図１６に示す。この手法によっておよび適切なプールによって、たった１つのリンカー（マーカー）を所有する免疫グロブリン（モノビオチン化ＩｇＧ ）を容易に得ることができることが明らかである。
【０１６３】
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ＰＣＴ／ＥＰ９５／０２９２１
欧州特許第０ ０６１ ８８８ 号
米国特許第５，９５８，７８３ 号
ＷＯ ９６／０３４０９
ＷＯ ９６／０３４２３
ＷＯ ９６／０３６５１
ＷＯ ９６／０３６５２
ＷＯ ９６／０３６５７
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、カップリングＢＳＡ およびｈｙ−ＢＰＲｕ−リンカーの模式図である。ＢＳＡ に関する模式図は、いくつかの−ＮＨ２ 基がｈｙ ＢＰＲｕ−リンカー（マーカー）への結合に利用可能である事実を示す。
【図２】
図２は、ＢＳＡ−ｈｙ−ＢＰＲｕ−結合体のＳｕｐｅｒｄｅｘ２００ ＨＲ（登録商標）クロマトグラフを示す。このクロマトグラフは、異なる化学量論を有するカップリング産物が単一の均一なピークとして移動することを示す。この単一のピークは、カップリング産物の統計的混合物を表す。
【図３】
図３は、ＢＰＲｕ− （ＵＥ）２５Ｋ およびＢＰＲｕ− （ＵＥ）５０Ｋ の模式図である。これらのリンカー構造は、ジ− ペプチドβ− アラニン− グルタミン酸（ＵＥ）をしばしば含む。
【図４】
図４は、短い骨格鎖を有する分枝リンカーを示す図である。この分枝リンカーは、短い骨格、および側鎖の両方で荷電した残基を含む。
【図５】
図５は、長い骨格鎖を有する分枝リンカーを示す図である。この分枝リンカーは、長い骨格、および側鎖の両方で荷電した残基を含む。
【図６】
図６は、荷電した残基を有さない分枝リンカーを示す図である。このリンカーは、図４のリンカーに非常に類似しているが、グルタミン酸の荷電した残基を有さず、代わりにグルタミンが使用されている。見かけ分子量は、図４のリンカーに関する１８ｋＤと比べて約３，５ｋＤ であることが見出された。
【図７】
図７は、ビオチン化リンカー分子の模式図である。これらのＮ−末端のビオチン化（Ｂｉ− ）リンカー分子がＣ−末端に−ＭＨ および−ＤＳＳ基をそれぞれ有し、これらは生体分子へのカップリングのために使用される。
【図８】
図８は、多数分枝リンカーを示す図である。この模式図は、２つのルテニウム標識（ＢＰＲｕ）を保有する分枝側鎖を有する多数分枝リンカーを示す。
【図９】
図９は、種々のリンカー分子のＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００ ＨＲ （登録商標）クロマトグラフィーを示す図である。ＢＳＡ および異なるリンカー分子は、同一の条件下でクロマトグラフィーされている。上パネルは、図４および６に従うリンカー構造を示す。下パネルは、図３に従うリンカー構造を示す。
【図１０】
図１０は、粗ＢＳＡ−Ｒｕ（ＳＫ）４−ＭＨ結合体のＭｏｎｏＱ （登録商標）クロマトグラフである。クロマトグラフは、ＢＳＡ （１）ならびにそれぞれ均一な１：１（２）および１：２（３）化学量論の結合体産物のベースライン分離を示す。
【図１１】
図１１は、粗ＢＳＡ−Ｒｕ（ＵＥ）２５−ＭＨ 結合体のＳｏｕｒｃｅ１５Ｑ （登録商標）クロマトグラフである。均一な化学量論１：１、１：２および１：３の３つの結合体（それぞれ、２、３および４）は、互いにおよび非結合体化ＢＳＡ （１）とはっきり分離される。
【図１２】
図１２は、第一のＦａｂ’−Ｒｕ（ＵＥ）２５−ＭＨカップリング産物のＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００ ＨＲ （登録商標）クロマトグラフである。粗結合体は、３つの主なピークに分離される。５０ｋＤの見かけ分子量で移動するピークＩＩＩ は、未反応Ｆａｂ’および未反応リンカー（Ｒｕ−（ＵＥ）２５−ＭＨ）の両方を含む。１００ｋＤ の見かけ分子量で移動するピークＩＩは、Ｆａｂ’とリンカー（マーカー）との間の１：１カップリング産物を本質的に純粋な形態で含む。ピークＩは、１：２カップリング産物（１５０ｋＤ の見かけ分子量）を含む。各プールの組成物は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳによって確認されている。
【図１３】
図１３は、第二のＦａｂ’−Ｒｕ（ＵＥ）２５−ＭＨカップリング産物のＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００ ＨＲ （登録商標）クロマトグラフである。ピーク１、２および３は、それぞれ１：３、１：２および１：１の化学量論の結合体を含む画分に対応する。ピーク４および５は、未結合体化開始物質（リンカーおよびＦａｂ’− フラグメント）を含む。全ての構造は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳによって確認されている。
【図１４】
図１４は、Ｆ（ａｂ’）２−ＢＰＲｕ−（ＵＥ）２５−ＤＳＳ カップリング産物の精製を示す図である。粗結合体は、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ ＨＲ （登録商標）クロマトグラフィーによって分離される。１：２および１：１カップリング産物を含むピークは、別々にプールされ、再クロマトグラフィーされる。これらのカップリング産物の組成物は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳによって確認されている。
【図１５】
図１５は、Ｆ（ａｂ’）２−ＢＰＲｕ−ＵＥＥＫ−ＤＳＳ カップリング産物の精製を示す図である。粗結合体は、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ ＨＲ （登録商標）クロマトグラフィーによって分離される。異なる化学量論を有するカップリング産物の統計的混合物を含むたった１つの対称「産物ピーク」がみられる。
【図１６】
図１６は、ＩｇＧ−（Ｂｉ−（ＵＥ）２５−ＤＳＳ） カップリング産物の精製を示す図である。粗結合体は、Ｓｏｕｒｃｅ３０（登録商標）クロマトグラフィーによって分離される。未結合体化ＩｇＧ （プール１）は、カラムから容易に溶出される。モノ−ビオチン化ＩｇＧ はプールされ（プール２）、ジ−ビオチン化ＩｇＧ （プール３）と明らかに分離される。
Claims (13)
- 結合体が５ｋＤ〜５００ ｋＤの分子量の生体分子および親水性リンカー分子からなり、リンカーが１ｋＤ〜１５ｋＤの分子量、４〜６０個の荷電した残基を有してなり、
ａ）生体分子およびリンカー分子が互いに共有結合され、
ｂ）化学量論が均一である異なる生体分子−リンカー産物がクロマトグラフィーによって分画され、
ｃ）化学量論が均一であるカップリング産物を含んでなる画分が収集される、
ことに特徴を有する、化学量論が均一である少なくとも１つの生体分子−リンカー産物を予め選択された量で含んでなる結合体の生成のためのプロセス。 - 親水性リンカーが４〜６０個の負に荷電した残基を含んでなることにさらに特徴を有する請求項１記載のプロセス。
- 親水性リンカーが４〜６０個の正に荷電した残基を含んでなることにさらに特徴を有する請求項１記載のプロセス。
- 親水性リンカーが６〜５０個の荷電した残基を含んでなることにさらに特徴を有する請求項１〜３いずれか記載のプロセス。
- リンカーがペプチド骨格を含んでなることにさらに特徴を有する請求項１〜４いずれか記載のプロセス。
- 生体分子がポリペプチドであることにさらに特徴を有する請求項１〜５いずれか記載のプロセス。
- クロマトグラフィー分離が生体分子リンカー産物の見かけ分子量の差に基づくことにさらに特徴を有する請求項１〜６いずれか記載のプロセス。
- 親水性リンカーが生体分子の見かけ分子量の＞２０％かつ＜５００ ％の見かけ分子量を有してなることにさらに特徴を有する請求項１または７記載のプロセス。
- クロマトグラフィー分離が生体分子−リンカー産物の電荷の差に基づくことにさらに特徴を有する請求項１〜６いずれか記載のプロセス。
- 請求項１〜９いずれかに従って生成された結合体。
- 緩衝成分、安定化剤、および請求項１〜９いずれかに従って生成された結合体を含んでなる試薬組成物。
- 適切な緩衝剤および試薬および少なくとも１つの請求項１１記載の試薬組成物を含んでなる、サンプル中の被検体の生化学的または免疫学的検出用のテストキット。
- 免疫アッセイにおける請求項１〜９いずれか記載の結合体または請求項１１記載の試薬組成物の使用。
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