JPH0740031B2 - 免疫学的測定方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、粒子凝集反応を利用した免疫学的測定方法に
関する。

〔従来の技術〕

現在、粒子凝集法を利用した試薬としては、Ｂ型肝炎ウ
イルス抗原及びその抗体、梅毒抗体、マイコプラズマ抗
体、RF等の特定試薬あるいはAFP、hCG、FDP等の判定試
薬が使用されている。なかでも、感作赤血球を利用した
間接凝集反応によるマイクロタイター法は、安価で簡便
なことから免疫学的検査の分野において広く使用されて
いる。

一般に、この測定法は赤血球もしくは人工担体の表面に
物理的あるいは化学的に結合した抗原または抗体と血清
等の体液中の抗体又は抗原との反応により起こる粒子間
凝集反応を利用し、その凝集パターンに基づいて測定す
るものである。〔G.Takatsy et al.,Acta Physiol Hun
g.,Vol.5,p.241,1954;J.L.Sever,J.Immunol.,Vol.88,p.
320,1962〕。この方法は微量試料で測定できるばかりで
なく、同時に多量の試料を処理しうる点で優れた方法と
いえる。

また、上記改良方法として、担体のみでなく測定容器の
内壁にも抗体又は抗原を固定化して使用する免疫学的測
定方法が提案されている。例えば特開昭56−130657号公
報、同56−142459号公報、同61−212763号公報、アメリ
カン・ジャーナル・オブ・クリニカル・パソロジー，87
No.2 267〜（'87）等に提案されている。これらの方法
はいずれの方法もその原理が放射免疫測定法や酵素免疫
測定法で利用されているサンドウィッチ法或いは二抗体
法と称される思想に由来する。即ち検体試料中の抗原又
は抗体に対応する抗体又は抗原を内壁に固定させた測定
容器に検体試料を加え、一定の時間内に該抗体又は抗原
と検体試料中の抗原又は抗体とを反応させ、その後未反
応の抗原又は抗体を含む検体試料を洗浄除去し、更に次
いで抗体又は抗原を固定させた担体を該反応容器に加え
て、反応容器の内壁に抗体又は抗原を介して結合した抗
原又は抗体と該担体に固定化された抗体又は抗原を反応
させることによって生ずる凝集状態を観察して判定する
測定方法である。

上記免疫学的測定方法は優れた方法であるが短時間によ
り測定感度をアップする要求を十分に満足する技術では
なかった。

〔発明が解決しようとする問題点〕

上記のような現状に鑑みて本発明者らは、粒子凝集反応
の感度を向上させることができ、体液中の試料の洗浄操
作を行わず、高濃度域においてもプロゾーン現象が発現
しにくく、短時間で測定でき、非特異反応性が少なく、
かつ測定対象が当分野で測定されている抗原もしくは抗
体ならばその種類に特に問うことなく測定可能にする方
法を提供することを目的に検討した結果、本発明を完成
するに至った。

〔問題点を解決するための手段〕

本発明は、検体試料中の抗原又は抗体に対応する抗体又
は抗原を内壁に固定させた測定容器に検体試料を加え、
同時に又は次いで未反応の抗原又は抗体を存在させた状
態で該測定容器に固定させた抗体又は抗原と同一の抗体
又は抗原或いは特異的結合の類縁体を固定させた不溶性
担体粒子を該測定容器に加え、発現する凝集反応の有無
により検体試料中の抗原又は抗体の有無を判定すること
を特徴とする免疫学的測定方法である。

即ち、本発明法によれば、測定容器上に、予め、検体試
料と特異的に反応する抗体もしくは抗原を物理的な吸着
か、あるいは化学的な結合かによって固定した測定容器
を準備する。一方、不溶性担体粒子、例えば赤血球粒子
の場合には化学的結合させることにより、またラテック
ス粒子の場合には物理的に吸着させることにより、その
表面に前記測定容器に固定させたものと同一の抗体もし
くは抗原或いは特異的結合の類縁体を固定させた不溶性
担体粒子を準備する。そして、当該測定容器中に希釈液
を一定量を加えるとともに、検体試料を添加し、続いて
当該不溶性担体粒子を加えて十分撹拌後、一定時間放置
して凝集像の判定を行なうものである。

本発明の最大の特徴は抗原又は抗原を内壁に固定させた
測定容器に検体試料を加え、該検体試料中に含まれる抗
原又は抗体と該測定容器に固定化された抗体又は抗原と
を反応させ、未反応の抗原又は抗体を含む検体試料は洗
浄除去することなく測定容器に残存させた状態で、抗体
又は抗原或いは特異的結合の類縁体を固定させた不溶性
担体粒子を添加する点にある。

上記不溶性担体粒子の添加は、測定容器に検体試料を加
えると同時に、又は加えた後、任意の時間、例えば０秒
から１時間程度以内のうちに行なうことが出来る。

測定容器がマイクロプレートの場合には、測定容器に検
体試料を加え、次いで連続して不溶性担体粒子を添加す
るのが好ましい。この場合の連続してとは、測定容器中
に検体試料を加え、次いで不溶性担体粒子を加えるまで
の時間が、実質的に連続的と言い得る程度の可及的に短
い時間であることを意味するものである。また、当該不
溶性担体粒子の添加は、検体試料を加えた後、１時間程
度以内なら任意の時間に行なってもよい。

更に、測定容器が試験管の様なものであれば、不溶性担
体粒子に固定した抗体又は抗原を含有した試薬の一検体
分と検体試料とを混合することによって、同時に測定容
器に添加するか、もしくは測定容器に１検体分の該不溶
性担体粒子を含有した試薬を予め添加したものに検体試
料を添加することもできる。

放射免疫測定法や酵素免疫測定法で利用されるサンドウ
ィッイチ法あるいは二抗体法は検体試料中に含まれる被
検出抗原又は抗体以外の夾雑物の影響を除く目的で測定
容器に固定させた抗体又は抗原と検体試料中の抗原又は
抗体とを一定時間接触させた後に、未反応の抗原又は抗
体を含む検体試料を洗浄除去する手法が採用されてい
る。従来の不溶性担体粒子を使用する粒子凝集反応法に
あっても上記サンドウィッチ法あるいは二抗体性の技術
思想が踏襲されて来た。

本発明者等は長年粒子凝集反応を利用する種々の免疫学
的測定方法の研究を行って来たが粒子凝集反応を利用し
た免疫学測定方法にあっては前記放射免疫測定法や酵素
免疫測定法と全く異なる挙動が存在することを既に確認
している。かかる認識にたって種々の研究を重ねた結
果、意外にも、測定容器に固定された抗体又は抗原と検
体試料中に含まれる抗原又は抗体とを反応させた後に残
存する未反応の抗原又は抗体を含む検体試料はそのまま
の状態で即ち洗浄除去することなく、前記不溶性担体粒
子の抗体又は抗原或いは特異的結合の類縁体との反応に
供すると、極めて短時間にしかも従来法に比較すると更
に４〜８倍増の希釈検体試料に至るまで精度よく凝集反
応を判定出来ることを確認した。このような驚異的な効
果の発現は後術する実施例から明らかであるがどのよう
な作用によって発揮されるかその機構は明らかでない。

本発明者等は前記測定容器に抗体又は抗原を介して結合
した抗原又は抗体と不溶性担体粒子に固定化された抗体
又は抗原或いは特異的結合の類縁体との反応による凝集
反応及び前記未反応の抗原又は抗体に基因する不溶性担
体粒子間の凝集反応が同時に進行し、凝集像の判定を容
易にしているのではないかと考えている。

本発明の効果を発揮させるためには前記の通り、抗体又
は抗原或いは特異的結合の類縁体を固定化した不溶性担
体粒子を測定容器に加える際に、該測定容器中に未反応
の抗原又は抗体を存在させることが重要な要件である。

上記未反応の抗原又は抗体を存在させるための手段は特
に限定されないが、最も簡単な手段は測定容器に加えた
検体試料を洗浄除去することなく残存させた状態に保つ
ことである。

本発明の効果を更に発揮させるためには検体試料を希釈
するために使用する希釈液として特に界面活性剤及び／
又はタンパク質を含む溶液を使用する。特にタンパク質
として脱脂粉乳またはカゼインを選ぶときは最良の効果
を期待出来る。上記界面活性剤又はタンパク質の含有濃
度は特に限定的ではないが一般には0.001〜10％（W/
V）、好ましくは0.1〜１％（W/V）の範囲から選べば好
適である。

本発明に用いられる不溶性担体粒子としては、一般に間
接凝集反応に用いられる粒子でよい。例えば、動物赤血
球、リポゾーム、ラテックス粒子、マイクロカプセル、
エマルジョン等の有機高分子担体粒子、ガラスビーズ、
シリカビーズ、ベントナイト等の無機高分子担体粒子並
びにその他の人工担体を挙げることができる。

それらの粒子径は、0.1〜50.0μｍの範囲で使用でき、
好ましくは、0.5〜10.0μｍの範囲がよい。

また、本発明で用いられる測定容器としては、粒子凝集
反応に用いられる容器であれば、その種類、材質等は特
に問わない。例えば、ポリスチレン、塩化ビニル、ポリ
メタアクリレート等のプラスチックあるいはガラスから
なる試験管、Ｕ型又はＶ型のマイクロプレート等を用い
ることができる。

測定容器や不溶性担体粒子への抗原もしくは抗体の固定
法については、公知の化学的結合法や物理的吸着法を用
いることができる。例えば、化学的結合法としてはアミ
ノ基、カルボキシル基、水酸基、アルデヒド基等の官能
基を介してグルタルアルデヒド、マレイミド等の酵素免
疫測定法に用いられている二価性試薬とで結合させる方
法等を挙げることができる。

希釈液としては、0.001〜10％（W/V）、好ましくは0.1
〜１％（W/V）の脱脂粉乳、カゼイン、BSAまたは正常ウ
サギ血清等の各種動物血清を含む緩衝液、あるいは、0.
001〜10％（W/V）、好ましくは0.1〜１％（W/V）の非イ
オン性、両性もしくは、陰イオン性の界面活性剤を含む
前記緩衝液を用いることができる。緩衝液については、
pH4.0〜9.0であればよく、当分野で一般に使用されてい
るものを用いることができる。界面活性剤としては、ソ
ルビタン脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステル、
デカグリセリン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソ
ルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレングリセリ
ン脂肪酸エステル、ポリエチレングリコール脂肪酸エス
テル、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキ
シエチレンフィトステロール、フィトスタノール、ポリ
オキシエチレンポリオキシプロピレンアルキルエーテ
ル、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル、ポ
リオキシエチレンヒマシ油、硬化ヒマシ油、ポリオキシ
エチレンラノリンなどの非イオン性界面活性剤や酢酸ベ
タインなどの両性界面活性剤、あるいは、ポリオキシエ
チレンアルキルエーテル硫酸塩、ポリオキシエチレンア
ルキルエーテル酢酸塩などの陰イオン性界面活性剤を用
いることができる。

更に、不溶性担体と測定容器に固定させる抗原或いは抗
体については、同一のものを用いればよいが、抗体につ
いては、同じ抗原を認識しているという点で同一であれ
ばよく、例えば、ポリクローナル抗体の場合は由来が異
なってもよく、モノクローナル抗体の場合は、抗原上の
エピトープが同一もしくは異なる２種類以上の抗体を用
いてもよい。

また、特異的結合の類縁体とは、抗原或いは抗体の特異
的結合の対応体としての結合親和力に関して実質的に同
一の挙動を示す物質をいい、この類縁体も、抗原或いは
抗体と同様に不溶性担体と測定容器に固定させて用いる
ことができる。

又、測定容器に抗原或いは抗体を固定させた後吸引除去
し、必要であれば公知のブロッキング剤、例えば、牛血
清アルブミン等のブロッキング処理してもよい。このよ
うに抗原もしくは抗体を固定させた測定容器は、酵素免
疫測定法で一般に使用されている公知の方法、例えば、
0.1％NaN₃を含む１％BSA溶液を添加したり、或いは、凍
結乾燥することにより長期間保存することができる。

本発明の測定対象は、当分野で測定されている抗原もし
くは抗体ならば、特に限定的である必要はなく、公知の
ものを測定することができる。代表的なものを例示すれ
ば、例えば、Ｂ型肝炎ウイルス抗原及びその抗体、梅毒
抗体、マイコプラズマ抗体、Ｃ−反応性蛋白、α−フェ
トプロテイン、癌胎児性抗原、各種イムノグロブリン、
補体、ストレプトリジンＯ、リウマチ様因子等が挙げら
れる。

〔作 用〕

本発明は上記のように、検体試料中に含まれる抗原又は
抗体に対する抗体又は抗原を担体粒子と測定容器の両方
に固定させ、しかも、測定容器に固定された抗体又は抗
原と検体試料中に含まれる抗原又は抗体とを反応させた
後に残存する未反応の抗原又は抗体を含む検体試料はそ
のままの状態で即ち洗浄除去することなく、前記不溶性
担体粒子の抗体又は抗原或いは特異的結合の類縁体との
反応に供することにより、極めて短時間にしかも従来法
に比較すると更に４〜８倍増の希釈検体試料に至るまで
精度よく凝集反応を判定出来て、凝集反応の感度を著し
く高めるとともに、測定感度がマイクロプレートの型状
や界面活性剤の添加等により影響されにくいことから短
時間で明瞭な凝集パターンが得られ、プロゾーン現象が
一般に認められるような高濃度域での測定も可能になっ
たものである。

以下、本発明を実施例によって説明する。本発明はこれ
ら実施例によって限定されるものではない。

実施例１ HBs抗原の測定 1.抗体固定担体粒子の調製 PBS（pH7.6）に２％（W/V）に浮遊させた高比重複合体
粒子（徳山曹達製）１容に対し、マウスを用い常法に従
って得た抗HBsモノクローン抗体の陰イオン交換カラム
クロマトグラフィー精製分画１容（1mg/ml）を加え、37
℃で３時間反応させた。その後、PBSで洗浄し、非特異
吸着を抑えるために１％（W/V）カゼイン（メルク社
製）で４℃で一晩処理した。これを0.1％（W/V）ツイー
ン20、１％（W/V）カゼインを含む100mMのMc Ilvaine緩
衝液で洗浄し、0.3％（W/V）となるように同緩衝液に浮
遊させ、抗HBs抗体固体粒子とした。

2.抗体固定測定容器の調製 96穴マイクロプレート（住友ベークライト社製）の各穴
にPBSで希釈した前記抗HBsモノクローン抗体（10μg/m
l）を50μずつ分注した。これを37℃で２時間放置後P
BSで洗浄し、１％BSA−PBS溶液を200μ加え、37℃で
１時間放置し、精製水で洗浄することで抗体固定測定容
器を調製した。但し、直ちに使用しない場合は、アジ化
ナトリウム等の防腐剤を含む前記BSA−PBS溶液で各穴を
満たし、２〜４℃に保存するかグルコース等の賦形剤を
添加し凍結乾燥したものを用いた。

3.抗原の測定 精製HBs抗原を添加した正常ヒト血清（1000ng/ml）を精
製水で2.5倍に希釈した。この希釈血清25μを、0.1％
（W/V）ツイーン20、１％（W/V）カゼインを含む100mM
のMc Ilvaine緩衝液25μを用い、抗体固定マイクロプ
レートの各穴中にて倍々希釈した。次に、各穴に前記抗
HBs抗体固定粒子の浮遊液を25μずつ加え、プレート
を１分間マイクロミキサーで振盪後、室温にて20分静置
し、凝集パターンを判定した。尚、陰性検体としては、
HBs抗原を添加していない正常ヒト血清を用いた。又、
対照実験としては、精製HBs抗原を添加した前記希釈血
清を抗体固定マイクロプレートの各穴中にて同様に倍々
希釈したのち、室温にて１時間放置後、0.1％（W/V）ツ
イーン20、１％（W/V）カゼインを含む100mMのMc Ilvai
ne緩衝液で十分に洗浄した。この各穴に上記緩衝液もし
くは、この緩衝液で倍々希釈した正常ヒト血清を25μ
ずつ添加した。さらに各穴に前記抗体HBs抗体固定粒子
の浮遊液を25μずつ加え、プレートを１分間マイクロ
ミキサーで振盪後、室温にて20分静置し、凝集パターン
を判定した。その結果を表１に示した。

表１に示す血液凝集パターンの判定結果から明らかなよ
うに、本法では、非特異反応は全く認められず、また、
洗浄操作を行った従来法に比較して、著しい感度の増幅
が認められた。

実施例２ HBs抗体の測定 1.HBs抗原固定担体粒子の調製 PBS（pH7.6）に２％（W/V）に浮遊させた高比重複合体
粒子（徳山曹達製）１容に対し、精製HBs抗原（20μg/m
l）１容を加え、４℃で１時間反応させた。その後、PBS
で洗浄し、非特異吸着を抑えるために１％（W/V）BSA−
PBSで４℃で一晩処理した。これを100mMのMc Ilvaine緩
衝液で洗浄し、0.3％（W/V）となるように同緩衝液に浮
遊させ、抗HBs抗体固定粒子とした。

2.抗原固定測定容器の調製 96穴マイクロプレート（住友ベークライト社製）の各穴
にPBSで１μg/mlに希釈した精製HBs抗原を50μずつ分
注した。これを４℃で一晩放置後PBSで洗浄し、１％BSA
−PBS溶液を200μ加え、４℃で２時間放置し、精製水
で洗浄することで抗体固定測定容器を調製した。

3.抗体の測定 抗HBsモノクローン抗体を500ng/ml濃度に添加した正常
ヒト血清を精製水で2.5倍に希釈した。この希釈血清25
μを、0.5％（W/V）BT−９、２％（W/V）BSAを含む10
0mMトリス塩酸緩衝液25μを用い、抗原固定マイクロ
プレートの各穴中にで倍々希釈した。次に、各穴に前記
HBs抗原固定粒子の浮遊液を25μずつ加え、プレート
を１分間マイクロミキサーで振盪後、室温にて20分静置
し、判定した。尚、対照実験としては、実施例１と同様
に洗浄操作を行ったマイクロプレートと比較した。その
結果を表２に示した。

実施例３ HBs抗原の測定 1.抗体固定固定化ヒツジ赤血球の調製 PBS（pH7.6）に５％（V/V）に浮遊させたヒツジ赤血球
４容に対し、2.5％（W/V）グルタルアルデヒドのPBS溶
液１容を加え、室温で２時間反応させた。その後、PBS
で洗浄し、固定化ヒツジ赤血球を調製した。この固定化
ヒツジ赤血球の５％浮遊液１容に0.005％（W/V）タンニ
ン酸PBS溶液１容を加え室温で30分反応後、PBSで洗浄
し、タンニン酸処理固定化ヒツジ赤血球を得た。この赤
血球の５％PBS浮遊液１容に抗HBsモノクローン抗体（2.
5mg/ml）１容を加え、室温で３時間反応させた。その
後、PBSで洗浄し、0.5％（W/V）となるように１％（V/
V）正常ウサギ血清を含むPBSに浮遊させ抗体固定固定化
ヒツジ赤血球とした。

2.抗原の測定 1000ng/ml濃度に精製HBs抗原を添加した正常ヒト血清
（1000ng/ml）を精製水で2.5倍に希釈した。この希釈血
清25μを、１％（V/V）正常ウサギ血清と、１％（W/
V）トリトンＸ−100を含むPBSを用い、実施例１に記載
した方法により調製した抗体固定マイクロプレートの各
穴中にて倍々希釈した。次に、前記抗HBs抗体固定固定
化ヒツジ赤血球の浮遊液を25μずつ加え、プレートを
１分間マイクロミキサーで振盪後、室温にて１時間静置
し、凝集パターンを判定した。尚、陰性検体として、正
常ヒト血清を用い、対照実験として抗体を結合しないマ
イクロプレートを用いた。その結果を表３に示した。

実施例4. Ｃ反応性タンパク質（CRP）の測定 1.抗体固定担体粒子の調製 PBS（pH7.6）に２％（W/V）に浮遊させた高比重複合体
粒子（徳山曹達製）１容に対し、抗CRPヤギ血清（バイ
オテスト社製）より塩析及びDEAE−セルロースカラムク
ロマトグラフィーで得たイムノグロブリン分画１容（1n
g/ml）を加え、37℃で３時間反応させた。その後、PBS
で洗浄し、非特異吸着を抑えるために１％（W/V）BSAで
４℃で一晩処理した。これを0.5％（W/V）トリトンＸ−
100、１％（W/V）BSAを含む250mMのMc Ilvaine緩衝液で
洗浄し、0.3％（W/V）となるように同緩衝液に浮遊さ
せ、抗CRP抗体固定粒子とした。

2.抗体固定測定容器の調製 96穴マイクロプレート（住友ベークライト社製）の各穴
にPBSで希釈した前記抗CRPヤギ抗体を10μg/mlの濃度で
50μずつ分注した。これを37℃で２時間放置後PBSで
洗浄し、１％BSA−PBS溶液を200μ加え、37℃で１時
間ブロッキングし、抗CRP抗体固定マイクロプレートを
調製した。

3.抗原の測定 精製CRP抗原（実験生物医学研究所社製）を1mM塩化カル
シウム、１％（W/V）BSAを含む100mMトリス塩酸緩衝液
（pH8.0）で300μg/mlの濃度に調製した。このCRP標準
液25μを、１％（W/V）トリトンＸ−100、１％BSAを
含む250mMのMc Ilvaine緩衝液25μを用い、抗体固定
マイクロプレートの各穴中にて倍々希釈した。次に、各
穴に前記抗CRP抗体固定粒子の浮遊液を25μずつ加
え、プレートを１分間マイクロミキサーで振盪後、室温
にて20分静置し、凝集パターンを判定した。対照実験と
して抗体を結合していないマイクロプレートを用いた。
尚、CRP抗原を希釈するのに用いた1mM塩化カルシウム、
１％（W/V）BSAを含む100mMトリス塩酸緩衝液（pH8.0）
をCRP陰性溶液として用いた。その結果を表４に示し
た。

表４に示したように、従来の方法では、CRPが高濃度域
では、凝集反応が認められないのに対し、本法において
は、プロゾーン現象が一般に認められるような高濃度域
においても強い凝集性を示すことが判明した。

〔発明の効果〕

本発明の免疫学的測定方法によれば、従来法に比較して
凝集反応の感度を著しく高めるとともに、短時間で明瞭
な凝集パターンが得られ、プロゾーン現象が一般に認め
られるような高濃度域での測定も可能になった。しか
も、従来法において行われていた洗浄操作が不要である
ため、操作自体もより簡便であるという利点もある。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 高橋 直文 神奈川県相模原市相模原５―５―８ ガー デンハウス501号 (56)参考文献 特開 昭56−142459（ＪＰ，Ａ)

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】検体試料中の抗原又は抗体に対応する抗体
   又は抗原を内壁に固定させた測定容器に検体試料を加
   え、同時に又は次いで未反応の抗原又は抗体を存在させ
   た状態で該測定容器に固定させた抗体又は抗原と同一の
   抗体又は抗原或いは特異的結合の類縁体を固定させた不
   溶性担体粒子を該測定容器に加え、発現する凝集反応の
   有無により検体試料中の抗原又は抗体の有無を判定する
   ことを特徴とする免疫学的測定方法。