AT398973B - Verfahren zur trennung von nukleinsäuren - Google Patents
Verfahren zur trennung von nukleinsäuren Download PDFInfo
- Publication number
- AT398973B AT398973B AT0228592A AT228592A AT398973B AT 398973 B AT398973 B AT 398973B AT 0228592 A AT0228592 A AT 0228592A AT 228592 A AT228592 A AT 228592A AT 398973 B AT398973 B AT 398973B
- Authority
- AT
- Austria
- Prior art keywords
- particles
- separation
- aromatics
- modified
- ethyl
- Prior art date
Links
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 title claims abstract description 14
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 title claims abstract description 14
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 title claims abstract description 14
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 27
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims abstract description 28
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 claims abstract description 12
- 238000004366 reverse phase liquid chromatography Methods 0.000 claims abstract description 6
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims description 51
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 25
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 16
- PPBRXRYQALVLMV-UHFFFAOYSA-N Styrene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1 PPBRXRYQALVLMV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- MYRTYDVEIRVNKP-UHFFFAOYSA-N 1,2-Divinylbenzene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1C=C MYRTYDVEIRVNKP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 238000004232 ion pair reversed phase chromatography Methods 0.000 claims description 9
- KAKZBPTYRLMSJV-UHFFFAOYSA-N Butadiene Chemical group C=CC=C KAKZBPTYRLMSJV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 claims description 7
- 108700020796 Oncogene Proteins 0.000 claims description 7
- 102000043276 Oncogene Human genes 0.000 claims description 7
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 7
- 239000004372 Polyvinyl alcohol Substances 0.000 claims description 6
- MPMBRWOOISTHJV-UHFFFAOYSA-N but-1-enylbenzene Chemical compound CCC=CC1=CC=CC=C1 MPMBRWOOISTHJV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 claims description 6
- 229920002451 polyvinyl alcohol Polymers 0.000 claims description 6
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 claims description 5
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 claims description 5
- 125000001495 ethyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 claims description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 claims description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 claims description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 claims description 3
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 claims description 2
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 claims description 2
- 238000002414 normal-phase solid-phase extraction Methods 0.000 claims description 2
- 125000000391 vinyl group Chemical group [H]C([*])=C([H])[H] 0.000 claims 3
- 229920002554 vinyl polymer Polymers 0.000 claims 3
- 229920001577 copolymer Polymers 0.000 claims 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 abstract description 6
- 238000013375 chromatographic separation Methods 0.000 abstract description 3
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 abstract description 2
- 239000011324 bead Substances 0.000 abstract 3
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 abstract 1
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 30
- 239000002585 base Substances 0.000 description 13
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 10
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 10
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 8
- 239000000047 product Substances 0.000 description 8
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 7
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 7
- IMNFDUFMRHMDMM-UHFFFAOYSA-N N-Heptane Chemical compound CCCCCCC IMNFDUFMRHMDMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 6
- 230000007023 DNA restriction-modification system Effects 0.000 description 5
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 description 5
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000029936 alkylation Effects 0.000 description 4
- 238000005804 alkylation reaction Methods 0.000 description 4
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 4
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 description 4
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- SFRUVBWDAJNXSB-UHFFFAOYSA-N 1,2-bis(ethenyl)benzene;but-1-enylbenzene Chemical compound CCC=CC1=CC=CC=C1.C=CC1=CC=CC=C1C=C SFRUVBWDAJNXSB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- VKIGAWAEXPTIOL-UHFFFAOYSA-N 2-hydroxyhexanenitrile Chemical compound CCCCC(O)C#N VKIGAWAEXPTIOL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000005526 G1 to G0 transition Effects 0.000 description 3
- OKIZCWYLBDKLSU-UHFFFAOYSA-M N,N,N-Trimethylmethanaminium chloride Chemical compound [Cl-].C[N+](C)(C)C OKIZCWYLBDKLSU-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 108700005077 Viral Genes Proteins 0.000 description 3
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- 238000007720 emulsion polymerization reaction Methods 0.000 description 3
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 3
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 3
- 125000004079 stearyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 3
- AVBGNFCMKJOFIN-UHFFFAOYSA-N triethylammonium acetate Chemical compound CC(O)=O.CCN(CC)CC AVBGNFCMKJOFIN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- YAYNEUUHHLGGAH-UHFFFAOYSA-N 1-chlorododecane Chemical compound CCCCCCCCCCCCCl YAYNEUUHHLGGAH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000005033 Fourier transform infrared spectroscopy Methods 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N Tetrahydrofuran Chemical compound C1CCOC1 WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VSCWAEJMTAWNJL-UHFFFAOYSA-K aluminium trichloride Chemical compound Cl[Al](Cl)Cl VSCWAEJMTAWNJL-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 239000000084 colloidal system Substances 0.000 description 2
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 2
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 2
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 2
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 2
- MURGITYSBWUQTI-UHFFFAOYSA-N fluorescin Chemical compound OC(=O)C1=CC=CC=C1C1C2=CC=C(O)C=C2OC2=CC(O)=CC=C21 MURGITYSBWUQTI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 2
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 239000003999 initiator Substances 0.000 description 2
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 2
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 238000012856 packing Methods 0.000 description 2
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 2
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 2
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 2
- 239000012798 spherical particle Substances 0.000 description 2
- CHRJZRDFSQHIFI-UHFFFAOYSA-N 1,2-bis(ethenyl)benzene;styrene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1.C=CC1=CC=CC=C1C=C CHRJZRDFSQHIFI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RYHBNJHYFVUHQT-UHFFFAOYSA-N 1,4-Dioxane Chemical compound C1COCCO1 RYHBNJHYFVUHQT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VUQPJRPDRDVQMN-UHFFFAOYSA-N 1-chlorooctadecane Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCCCl VUQPJRPDRDVQMN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LEELWLKZRKDMAS-UHFFFAOYSA-N 2-(2,4-dimethoxy-3-methylsulfanylphenyl)ethanamine Chemical compound COC1=CC=C(CCN)C(OC)=C1SC LEELWLKZRKDMAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OMPJBNCRMGITSC-UHFFFAOYSA-N Benzoylperoxide Chemical compound C=1C=CC=CC=1C(=O)OOC(=O)C1=CC=CC=C1 OMPJBNCRMGITSC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000167854 Bourreria succulenta Species 0.000 description 1
- 241000711549 Hepacivirus C Species 0.000 description 1
- 101001068640 Nicotiana tabacum Basic form of pathogenesis-related protein 1 Proteins 0.000 description 1
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000002152 alkylating effect Effects 0.000 description 1
- 150000001450 anions Chemical class 0.000 description 1
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 1
- 239000007900 aqueous suspension Substances 0.000 description 1
- 239000012300 argon atmosphere Substances 0.000 description 1
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 1
- 235000019400 benzoyl peroxide Nutrition 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 238000005251 capillar electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 235000019693 cherries Nutrition 0.000 description 1
- 238000003759 clinical diagnosis Methods 0.000 description 1
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 1
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- -1 diethylaminoethyl groups Chemical group 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 238000007345 electrophilic aromatic substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 1
- 238000007901 in situ hybridization Methods 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000004190 ion pair chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 1
- 239000012074 organic phase Substances 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- USHAGKDGDHPEEY-UHFFFAOYSA-L potassium persulfate Chemical compound [K+].[K+].[O-]S(=O)(=O)OOS([O-])(=O)=O USHAGKDGDHPEEY-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 150000003242 quaternary ammonium salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000000163 radioactive labelling Methods 0.000 description 1
- 238000010992 reflux Methods 0.000 description 1
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 1
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 1
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 1
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 230000008961 swelling Effects 0.000 description 1
- 150000003866 tertiary ammonium salts Chemical class 0.000 description 1
- YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N tetrahydrofuran Natural products C=1C=COC=1 YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004304 visual acuity Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01D—SEPARATION
- B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
- B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
- C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
- C12N15/1006—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by means of a solid support carrier, e.g. particles, polymers
- C12N15/101—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by means of a solid support carrier, e.g. particles, polymers by chromatography, e.g. electrophoresis, ion-exchange, reverse phase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/803—Physical recovery methods, e.g. chromatography, grinding
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Immunology (AREA)
- Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Treatment Of Liquids With Adsorbents In General (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Solid-Sorbent Or Filter-Aiding Compositions (AREA)
- Addition Polymer Or Copolymer, Post-Treatments, Or Chemical Modifications (AREA)
Description
AT 398 973 B
Die Trennung von Nukleinsäuren ist ein Gebiet von großer wissenschaftlicher und technischer Bedeutung und Aktualität. Unter den hiebei eingesetzten chromatographischen Verfahren stehen sich vor allem die Anionenaustausch-Chromatographie und die lonenpaar-Umkehrphasen-Chromatographiegegenüber.
Bei der Trennung doppelsträngiger Nukleinsäuren ist ein wesentlicher Nachteil der Anionenaustausch-Chromatographie das unterschiedliche Retentionsverhalten von GC- und AT-Basenpaaren, wodurch eine Trennung nach Molekülgrößen nicht möglich ist. Dies schränkt die Anwendung der Anionenaustausch-Chromatographie in der Analyse von Nukleinsäuren erheblich ein, ganz abgesehen davon, daß die bei diesem Verfahren notwendige Elution in einem Salzgradienten weiterführende Untersuchungen der DNS-Moleküle erschwert.
Zwar zeigt W. Bloch in seiner europäischen Patentanmeldung (EP 0 507 591 A2), daß durch die Zugabe von Tetramethylammoniumchlorid (TMAC) zum Eluenten eine weitgehende Trennung von DNA-Fragmenten entsprechend ihrer Größe auch auf nicht porösen Anionenaustauschern möglich ist, jedoch kann man der Abb. 5 der Patentanmeldung entnehmen, daß die Fragmente mit 434 bzw. 458 Basenpaaren (34 Basenpaare Unterschied) eine unterschiedliche Retention aufweisen, daß jedoch die Fragmente mit 458 bzw. 504 Basenpaaren (46 Basenpaare Unterschied) zur gleichen Zeit eluieren, daß also auch hier keine strenge längenabhängige Trennung gegeben ist. Außerdem wird durch die Zugabe von TMAC eine signifikante Abnahme an Auflösung in Kauf genommen. Da es sich auch bei dieser Methode prinzipiell um eine Anionenaustausch-Chromatographie handelt, sind auch hier wegen der verwendeten Salzgradienten direkte weitere Untersuchungen durch die Anwesenheit nicht flüchtiger Salze erschwert.
Auch die lonenpaar-Umkehrphasen-Chromatographie hat in der von Eriksson et ai. beschriebenen Form für die praktische Anwendung auf die Trennung von doppelsträngigen DNS-Fragmenten noch erhebliche Nachteile. Diese liegen, abgesehen von der geringen Trennschärfe, vor allem darin, daß insbesondere kürzere Restriktionsfragmente nur sehr unvollständig wiedergefunden werden und daß außerdem die Analysenzeit im Stundenbereich liegt (vgl. Eriksson, S., Glad, G., Pernemalm, P-A., Westman, E., (1986) J. Chromatogr. 359, 265-274).
In bezug auf die von Y. Ohimya et al. (Y. Ohimia, Y. Kondo, T. Kondo, Anal. Biochem. 189 (1990) 126-130) publizierte Arbeit zur Trennung von DNA-Fragmenten durch lonenaustausch-Chromatographie auf einer mit Trimetylammonium-Gruppen funktionalisierten Säule gelten dieselben Einwände wie für die Trennung von DNA-Fragmenten auf einer mit Diethylaminoethyl-Gruppen modifizierten Säule (Y: Kato, Y. Yamaski, Akane Onaka, T. Kitamura, T. Hasimoto, T. Murotsu, S. Fukushige, K. Matsubara, J. Chromatogr., 478 (1989) 264-268): Eine strenge Trennung der DNA-Fragmente nach deren Größe ist in beiden Fällen nicht möglich (vgl. Kato et al., Abb. 1 und Ohimiya et al. Abb. 2), ferner werden weiterführende Untersuchungen durch den hohen Salzgehalt der eluierten Proben erschwert.
Unter der Annahme, daß die Nachteile des von Eriksson et al. beschriebenen Verfahrens auf die Verwendung poröser Silicagel-Teilchen in der stationären Phase zurückzuführen seien, wurde von Huber et al die Verwendung noch nicht-porösen Polystyrol-Teilchen in der lonenpaar-Umkehrphasen-Chromatograhie erstmals angeregt (Huber, C.G., Oefner, P.J. und Bonn, G.K. (1992) J. Chromatogr. 599,113-118). Es zeigte sich, daß mit der Verwendung derartigen Säulenmaterials die Trennung einzelsträngiger Nukleinsäuren wesentlich verbessert werden kann. Eine weitere Verbesserung ergab sich durch den Einbau von Polyvinylalkohol während der Synthese der Polymerteilchen.
Versuche, das von Huber et al. vorgeschlagene Verfahren auf doppelsträngige Nukleinsäuren anzuwenden, blieben erfolglos, bis sich zeigte, daß die zunächst festgestellte schlechte Auflösung nur bei Nukleinsäuren mit mehr als 150 Basenpaaren auftritt. In ihrer allgemeinsten Form besteht die Erfindung somit darin, die Trennung von doppelsträngigen DNS-Fragmenten mittels lonenpaar-Umkehrphasen-Chro-matographie unter Verwendung einer Säule von nicht-porösen polymeren Teilchen mit einem Durchmesser zwischen 1 und 100 um, vorzugsweise 2 und 3 um, vorzunehmen.
Relevant für die chromatographische Wirksamkeit der Teilchen ist jeweils deren oberflächennaher Bereich, weshalb Materialangaben im Text und in den Ansprüchen jeweils auf diesen Bereich der Teilchen zu beziehen sind, deren Kern aus verschiedenen Materialien bestehen kann.
Allgemein, also ohne die Beschränkung auf kurze Fragmente, wird das von Huber et al. angegebene Säulenmaterial zur Analyse von doppelsträngiger DNS mittels lonenpaar-Umkehrphasen-Chromatographie verwendbar, wenn die Oberfläche der polymeren Teilchen im Sinne einer Verminderung ihres polaren Charakters insbesondere durch eine Alkylierung mit Alkylresten länger als Ethyl modifiziert wird.
Diese Wirkung einer Alkylierung war für den Fachmann durchaus überraschend. Die Verwendung von (allerdings porösen) alkylierten Polystyrol-Teilchen war zwar von Morgan und Celebuski (Morgan, R. L. und Celebuski, J. E. (1991), J. Chromatogr. 536, 84-93) bereits beschrieben worden. In dieser Arbeit wurde gezeigt, daß mit Fluorescin oder Biotin markierte Oligonukieotide auf unmodifizierten porösen Poly-(Styrol-Divinyl-benzo!)-Teilchen (PRP-1-Säule, Firma Hamilton, Reno, NV, USA) hängenbleiben und erst in nachfol- 2
AT 398 973 B genden Laufen als sogenannte "Geisterbanden" eluiert werden. Dieser unerwünschte Effekt konnte nach Modifikation der porösen Poly-(Styrol-Divinylbenzol)-Teilchen mit Octadecylresten (Polyspher RP-18, EM Science, Cherry Hill, NJ, USA) eliminiert werden. Eine verbesserte Auflösung trat jedoch nicht ein.
Die erwähnte Arbeit von Huber et al. deutete noch keineswegs auf die durch die Alkylierung des Polystyrols erzielbare Verbesserung. Die durch den Einbau des Polyvinylalkohols in die Polymerteilchen erzielte Verbesserung der Auflösung von Oligonukleotiden war nämlich aufgrund der Anwesenheit von Hydroxylgruppen u.a. auf deren polaren Charakter zurückgeführt worden. Es war daher völlig überraschend, daß eine Alkylierung mit völlig apolaren Gruppen wie Octadecylresten eine noch deutlichere Verbesserung der Auflösung von Oligonukleotiden zur Folge hat und sogar die Trennung von doppelsträngigen DNS-Fragmenten erlaubt.
Bei Anwendung der Erfindung ist selbst bei einem Unterschied von nur einem Basenpaar eine Trennung nach Fragmentlänge durch lonenpaar-Chromatographie möglich. Der Vorteil der Methode liegt daher in der Verwendung eines flüchtigen lonenpaarreagenzes in Verbindung mit dem hohen Auflösungsvermögen zur Trennung von DNA-Fragmenten und PCR-Produkten. Isolierte Fraktionen sind nach Entfernung des flüchtigen Eluenten durch einfache Gefriertrocknung direkt weiteren Experimenten zugänglich.
Die durch die Erfindung erzielte Verbesserung der lonenpaar-Umkehrphasen-Chromatographie erweitert den Einsatzbereich dieses Analyseverfahrens auf die klinische Diagnose von Erkrankungen durch den Nachweis von Onkogenen bzw. von viralen Genen.
Der Nachweis von Onkogenen bzw. viralen Genen erfolgt heute derart, daß Polymerase-Kettenreaktionsprodukte dieser Gene gelelektrophöretisch getrennt werden. Die Gelelektrophorese stellt jedoch eine Ansammlung von arbeitsintensiven und nicht automatisierbaren Techniken dar.
Von Katz et al. (Katz, E.D., Haff, L.A., Eksteen, R. (1990) J. Chromatogr. 512, 433-444) ist bereits die chromatographische Trennung von Polymerase-Kettenreaktionsprodukten beschrieben worden. Das angewendete Verfahren, nämlich die Anionenaustausch-HPLC, führt jedoch nicht nur zu den eingangs grundsätzlich dargelegten Nachteilen, sondern auch zu einem allmählichen Anstieg des Hintergrundsignals, welcher zusammen mit den relativ langen Analysenzeiten die klinische Anwendung erschwert. In der Arbeit von Katz wird die Möglichkeit der Detektion von Onkogenen bzw. viralen Genen, obwohl sie theoretisch besteht, nicht erwähnt.
Die Erfindung liefert also auch ein Diagnostikverfahren zur Erkennung von malignen Tumoren und/oder viralen Erkrankungen im menschlichen oder tierischen Organismus, wobei Onkogene bzw. virale Genome insbesondere durch eine Polymerase-Kettenreaktion vermehrt und in einem chromatographischen Verfahren von anderen Produkten getrennt werden, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß als chromatographisches Verfahren die ionenpaar-Umkehrphasen-Chromatographie eingesetzt wird.
Die Anwendung erfindungsgemäß modifizierter Polymerteilchen ist nicht auf die Trennung doppelsträn-giger DNS-Fragmente beschränkt. Auch eine Beschränkung auf die lonenpaar-Umkehrphase-Chromatogra-phie ist nicht gegeben, vielmehr ist ein Einsatz in verschiedenen Chromatographieverfahren und insbesondere auch für die Festphasenextraktion möglich.
Anschließend wird die Herstellung der erfindungsgemäßen Polymerteilchen anhand eines Ausführungsbeispieles beschrieben und deren Wirksamkeit im Zusammenhang mit drei Chromatogrammen erläutert. Dabei zeigt
Fig. 1 die Trennung von DNS-Restriktionsfragmenten durch unmodifizierte und modifizierte nicht-poröse Polystyrol-Teilchen, Fig. 2 ein Demonstrationsbeispiel für die hochauflösende Trennung von DNS-Restriktionsfragmenten, und Fig. 3 ein Beispiel für die Hochgeschwindigkeitsanalyse von PCR-Produkten mittels einer aus den erfindungsgemäßen Teilchen hergestellten Chromatographiesäule.
Die Herstellung nicht poröser, sphärischer Poly-(Ethylvinylbenzol-Divinylbenzol)-Teilchen erfolgte in einem zweistufigen Prozeß, der eine sehr enge Größenverteilung garantiert. Im ersten Schritt werden hierbei mittels Emulsionspolymerisation von Styrol Polystyrol-Keime mit einem mittleren Durchmesser von 0.8 - 1 um synthetisiert. Im zweiten Schritt werden dann diese Keime mit einer Mischung aus Mono- und Divinylmonomeren (z. B. Ethylvinylbenzol und Divinylbenzol) auf eine Größe von 1 - 10 um angeschwollen und schließlich durch stufenweise Temperaturerhöhung, die ein Verklumpen der Teilchen verhindern soll, polymerisiert.
Die Emulsionspolymerisation würde in Anlehnung an eine Publikation von Goodwin et al. (Goodwin, J.W., Hearn, J., Ho, C.C. und Ottewill, R.H. (1974) Colloid & Polymer Sei. 252, 464-471) aus dem Jahre 1974 nach folgendem Protokoll durchgeführt: 0,236 g Natriumchlorid wurde in 354 ml entionisiertem Wasser in einem Reaktionsgefäß mit einem Fassungsvolumen von 1 Liter, das ferner über Rückflußkühler, Rührer und Gaseinleiterohr verfügte, unter einer Argonatmosphäre gelöst, und auf 87 · C temperiert (Rührerdrehzahl: 350 rpm). Dann wurden 33,7 g frisch destillierten Styrols und nach einer Minute 0,2184 g Kaliumper-oxodisuifat, gelöst in 50 ml entionisiertem Wasser, hinzugegeben. Nach Zugabe der Reagentien wurde das 3
AT 398 973 B
Ende des Gaseinleiterohrs über den Flüssigkeitsspiegel zurückgezogen. Das Reaktionsgemisch wurde für 6.5 Stunden bei 87 ’C gerührt und anschließend auf Raumtemperatur abgekühlt und unter Berücksichtigung der am Rührer haftenden Menge an Polystyrol (im allgemeinen zwischen 5 und 10 g) so verdünnt, daß die Konzentration an polymerisiertem Styrol ca. 54,6 g pro 1000 ml Suspension betrug. Der Durchmes- 5 ser der sphärischen Partikel wurde mittels Lichtmikroskopie bestimmt und betrug etwa 1 um.
Da die mittels Emulsionspoiymerisation hergestellten Teilchen für chromatographische Zwecke einerseits zu klein und andererseits aufgrund der fehlenden Quervernetzung nicht druckstabil sind, wurden in einem zweiten Schritt die Polymerkeime in Anlehnung an der von Ugelstad et al. (Ugelstad, J., Mork, P.C., Herder Kaggerud, K., Ellingsen, T. und Berge, A. (1980) Adv. Colloid Interface Sei. 13, 101-140) im Jahre 10 1980 beschriebenen aktivierten Schwellungsmethode auf einen Teilchendurchmesser von 1 - 10 um gebracht. Die wäßrige Suspension der Polystyrolkeime (200 ml) wurde hiezu zuerst mit 60 ml Aceton versetzt und dann mit 60 ml einer 1-Chlordodecan enthaltenden Emulsion (0.206 g Natriumdodecylsulfat, 49.5 ml entionisiertes Wasser und 10,5 ml 1-Chlordodecan wurden ca. 4 Stunden bei 0 · C im Ultraschallbad gerührt, bis eine feine Emulsion <0,3 tim erhalten wurde) während ca. 12 Stunden bei Raumtemperatur 15 angeschwollen. In der Folge wurde das Aceton bei 80 *C für 30 Minuten abgedampft. Dann wurden 310 g einer aus Ethylvinylbenzol und Divinylbenzol im Verhältnis von 1:1,71 bestehenden Mischung, die ferner 2,5 g Dibenzoylperoxid als Initiator enthielt, zugegeben und so lange unter wiederholter lichtmikroskopischer Kontrolle gerührt bis der gewünschte Teilchendurchmesser erreicht war (im Durchschnitt 4 bis 8 Stunden). Das Verhältnis von Monomer zu Initiator betrug zumindest 100:1, um einen Polymerisationsgrad >200 zu 20 realisieren, der den Teilchen die nötige Druckstabilität für die Hochdruckflüssigkeitschromatographie verlieh. Anschließend wurde der gesamte Ansatz in einen Scheidetrichter überführt, wobei sich unverbrauchtes Monomer, das verworfen wurde, von den angeschwollenen Teilchen trennte. Abschließend wurde durch stufenweise Temperaturerhöhung (63 *C für ca. 7 Stunden, 73 *C für ca. 2 Stunden und 83 ”C für ca. 12 Stunden) polymerisiert (Polymerisationsgrad >500). Derart hergestellte Teilchen weisen, wie die Quecksil-25 berporosimetrie bestätigte, keine Poren >30 Ä auf, wodurch Größenausschlußeffekte bei der Chromatographie vermieden werden können.
Die auf diese oder eine andere Art und Weise hergestellten nicht porösen einheitlich sphärischen Partikel können zwar wie bereits oben erwähnt direkt zur umkehrphasenchromatographischen Trennung von Nukleinsäuren verwendet werden, aber die Auflösung ließ, vermutlich aufgrund der unerwünschten Adsorp-30 tion der aromatischen Basen der Nukleinsäuren an die Partikeloberfläche, zu wünschen übrig. Um diesen Effekt zu minimieren, wurden nun in einem weiteren Schritt die Aromaten der stationären Phase durch elektrophile aromatische Substitution alkyliert. In einem typischen Ansatz wurden 10 g der getrockneten Teilchen in 100 ml 1-Chloroctadecan suspendiert und nach Zugabe von 1 g Aluminiumchiorid für 12 Stunden bei 100 *C gerührt (370 rpm). Im Anschluß wurde der Reaktionsansatz auf 80 *C abgekühlt, 150 35 ml einer 4 M Salzsäure hinzugefügt, für ca. 2 Minuten gerührt, in einen Scheidetrichter überführt, mit 300 mi n-Heptan versetzt, die Phasen gut durchmischt und nach anschließender Trennung der Phasen die wäßrige Phase verworfen. Die organische Phase wurde noch zweimal mit 200 ml einer 1 M Salzsäure gewaschen und anschließend bei 5000 rpm abzentrifugiert. Die abgeschiedenen Teilchen wurden viermal mit 100 ml n-Heptan, und dann je zweimal mit 100 ml Diethylether, 100 ml Dioxan und 100 ml Methanol 40 gewaschen und abschließend getrocknet.
Mit Hilfe der Fourier-Transform-Infrarotspektroskopie (FTIR) konnte schließlich die tatsächlich erfolgte Alkylierung der Aromaten nachgewiesen werden. Die erzeugten Teilchen wichen in ihrer Größe nur wenig voneinander ab. Als Mittelwert für den Durchmesser wurde 2,10 um festgestellt, mit einer Standardabweichung von 0,12 um. 45 Ein Kriterium für das Erreichen hochauflösender chromatographischer Trennungen von Nukleinsäuren ist das für das Packen der Säule verwendete Protokoll. Für eine 50 x 4,6 mm I.D. Säule wurden 1,4 g der alkyiierten Teilchen in 15 ml Tetrahydrofuran im Ultraschallbad suspendiert und mit 50 ml Methanol bei einem Druck von 70 MPa in die Säule gefüllt. In der Folge wurde mit 50 ml entionisiertem Wasser ebenfalls bei 70 MPa nachgespült, um die Teilchen zu entquellen und so eine noch höhere Packungsdichte zu so erzielen.
Die eigentliche Trennung der einzel- und doppelsträngigen Nukleinsäuren erfolgte nach dem Prinzip der lonenpaar-Umkehrphasen-Flüssigkeitschromatographie. Als lonenpaarreagenz wurde zumeist Trieth-ylammoniumacetat verwendet, es kommen jedoch auch andere tertiäre und quartäre Ammoniumsalze in Frage. Die Elution erfolgte mit Hilfe eines linearen organischen Lösungsmittelgradienten wie zum Beispiel 55 Acetonitril oder Methanol.
Fig. 1 zeigt die Trennung von DNS-Restriktionsfragmenten durch die beschriebenen nicht-porösen Polystyrol-Teilchen unter folgenden Versuchsbedingungen: Säule: 50 x 4,6 mm I.D. Mobile Phase: 0,1 M TEAA, pH 7,0. Gradient: 7,5-13,75 % Acetonitril in 4 Minuten, gefolgt von 13,75 - 16,25 % Acetonitril in 6 4
AT 398 973 B
Minuten. Flußrate: 1 ml/min. Säulentemperatur: 50 'C. Detektion: UV, 254 nm. Probe: 0,5 ug pBR322 DNS-Haeill Restriktionsverdau.
Die Kurve a bezieht sich auf unmodifizierte Teilchen, die Kurve b auf Teilchen, welche, wie von Huber et al beschrieben, durch den Einbau von Polyvinylalkohol modifiziert worden sind, die Kurve c auf alkylierte 5 Teilchen. Eine saubere Trennung der durch die Zahl der Basenpaare charakterisierten Fragmente ergibt sich über einen weiten Bereich von Fragmentlängen nur im Fall c, bei geringeren Fragmentlängen sind jedoch auch unmodifizierte Teilchen nicht ganz unbrauchbar, und schon eine geringfügige Abschirmung der Aromaten durch Polyvinylalkohol führt gemäß Kurve b zu verbesserter Auflösung.
Die erfindungsgemäßen nicht-porösen Polystyrol-Teilchen sind für eine Reihe von Chromatographien io und verwandte Anwendungen hervorragend geeignet, wofür anschließend einige Beispiele gegeben werden: 1. Beispiel Für gewisse molekularbiologische Experimente wie die in situ Hybridisierung ist eine radioaktive 75 Markierung der Oligonukleotide mit Isotopen wie 32P oder 33P notwendig. Um in der Folge eine kompetitive Hybridisierung mit unmarkiertem Oligonukleotid zu vermeiden, ist eine Reinigung der radioaktiv markierten Oligonukleotide erforderlich. Dies kann mittels lonenpaar-Umkehrphasen-Chromatographie auf alkyliertem nicht porösem Poly-(Ethylvinylbenzol-Divinyibenzol) schnell und einfach erfolgen. Die Wiederfindungsrate für Oligonukleotide betrug zumindest 96%. 20 2. Beispiel
Fig. 2 zeigt die hochauflösende Trennung von DNS-Restriktionsfragmenten auf mit Octadecylresten modifizierten nicht porösen Poly-(Ethylvinylbenzol-Divinylbenzol)-Tei!chen. Der Versuch wurde unter folgen-25 den Bedingungen durchgeführt: Säule: 50 x 4,6 mm I.D. Mobile Phase: 0,1 Μ TEAA, pH 7,0. Gradient: 8,75 - 11,25 % Acetonitril In 2 Minuten, gefolgt von 11,25 - 14,5 % Acetonitril in 10 Minuten, 14,5 - 15,25 % Acetonitril in 4 Minuten, sowie 15,25 - 16,25 % Acetonitril in 4 Minuten. Flußrate: 1 ml/min. Säulentemperatur: 50 · C. Detektion: UV, 254 nm. Probe: eine Mischung aus 0,75 mg pBR3|2 DNS-Haelll Restriktionsverdau und 0,65 ug ΦΧ 174 DNS-Hincll Restriktionsverdau. Entscheidend für das gezeigte Auflösungsvermö-30 gen sind neben der stationären Phase, die Konzentration von Triethylammoniumacetat, die Steilheit des Lösungsmittelgradienten, die Säulentemperatur, sowie die Flußrate. In bezug auf die Konzentration von Triethylammoniumacetat in der mobilen Phase läßt sich feststellen, daß in einem Bereich von 25 bis zumindest 125 mM eine kontinuierliche Zunahme an Auflösung erfolgt. Betreff der Steilheit des Lösungsmittelgradienten gilt, daß mit zunehmender Fragmentlänge ein flacherer Gradient zur Auflösung der DNS-35 Moleküle notwendig ist. Die Trennung der DNS-Moleküle zeigt in Abhängigkeit von der Säulentemperatur ein Maximum an Auflösung bei 50 ’C. Bei noch höheren Temperaturen ist eine Denaturierung der doppelsträngigen DNS-Moleküle zu beobachten. 3. Beispiel 40
Durch Minimierung des Gradientenvolumens in Verbindung mit der alkylierten nicht porösen Poly-(Ethylvinylbenzol-Divinylbenzol)-Phase konnten Polymerase-Kettenreaktionsprodukte inkl. der für die Regenerierung der Säule benötigten Zeit innerhalb von 2 Minuten analysiert werden. Da bei der Polymerase-Kettenreaktion zumeist nur ein oder zwei Produkte bekannter Länge anfallen, werden an die Auflösung 45 etwas geringere Anforderungen gestellt als bei Trennung von DNS-Restriktionsfragmenten. Dies gestattet daher die Verwendung steiler Lösungsmittelgradienten und somit kurzer Analysenzeiten. Die Wiederfindung eines 404 Basenpaare langen DNS-Fragmentes betrug 97,5%. Ein im Vergleich zur Kapillarelektrophorese entscheidender Vorteil der lonenpaar-Umkehrphasen-Chromatographie besteht im Entfallen der Notwendigkeit, die PCR-Proben vor ihrer Analyse entsalzen zu müssen. Daher ist in Kombination mit einem 50 Autosampler eine vollautomatische Analyse von PCR-Proben möglich. So konnten Onkogene und virale Genome (Hepatitis C-Virus, HIV) nachgewiesen werden.
Die Eignung der erfindungsgemäß modifizierten Polystyrol-Teilchen für die klinische Praxis ergibt sich aus Fig. 3. Diese bezieht sich auf einen Versuch, der unter folgenden Bedingungen durchgeführt wurde: Säule: 50 x 4,6 mm l.D. Mobile Phase: 0,1 M TEAA, pH 7,0. Gradient: 11,25 - 13,75 % Acetonitril in 1 55 Minute, gefolgt von 22,5 % Acetonitril für 6 Sekunden und 11,25 % Acetonitril für 54 Sekunden. Flußrate: 3 ml/min. Säulentemperatur: 50 ° C. Detektion: UV, 256 nm. Probe: 20 ul einer PCR-Probe, 1 = unspezifisches Produkt, 2 = 120 Basenpaare langes PCR-Produkt, 3 = 132 Basenpaare langes PCR-Produkt, und 4 = 167 Basenpaare langes PCR-Produkt. 5
Claims (16)
- AT 398 973 B Der mehrfach mit den PCR-Produkten der gleichen Onkogene wiederholte Versuch erbrachte, wie man sieht, hervorragend reproduzierbare Ergebnisse. Besonders wichtig war zudem die Feststellung, daß das Ergebnis der einzelnen Versuche durch vorhergehende Beladungen der Säule nicht beeinflußt wird, was eine weitere unabdingbare Voraussetzung für den klinischen Einsatz des Verfahrens darstellt. 5 Patentansprüche 1. Verfahren zur Trennung von doppelsträngigen DNS-Fragmenten mittels lonenpaar-Umkehrphasen-Chromatographie, dadurch gekennzeichnet, daß die Trennung unter Verwendung einer Säule von io nicht-porösen Teilchen aus einem Polymeren mit einem Durchmesser zwischen 1 und 100 um, vorzugsweise zwischen 2 und 3 um, erfolgt.
- 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Teilchen im wesentlichen aus einem Copolymerisat von Vinylaromaten, insbesondere des Styrols oder Ethylvinylbenzols mit Divinylaroma- 15 ten, insbesondere des Divinylbenzols bestehen.
- 3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Oberfläche der Teilchen im Sinne einer Abschirmung der Aromaten modifiziert ist.
- 4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Modifizierung der Teilchen im Einbau von Polyvinylalkohol in diese während der Synthese besteht.
- 5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Oberfläche der Teilchen im Sinne einer Verminderung ihres polaren Charakters modifiziert ist. 25
- 6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Teilchen mit Alkylresten länger als Ethyl alkyliert sind.
- 7. Diagnostizierverfahren zur Erkennung von malignen Tumoren und/oder viralen Erkrankungen bei dem 30 aus dem menschlichen oder tierischen Organismus entnommene Onkogene bzw. virale Genome insbesondere durch eine Polymerase-Kettenreaktion vermehrt und aufgrund unterschiedlicher Verweilzeit auf einer Trennstrecke identifiziert werden, dadurch gekennzeichnet, daß die Trennung durch lonenpaar-Umkehrphasen-Chromatographie erfolgt.
- 8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Trennung unter Verwendung einer Säule von nicht-porösen Teilchen aus einem Polymeren mit einem Durchmesser zwischen 1 und 100 um, vorzugsweise zwischen 2 und 3 um, erfolgt.
- 9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Teilchen im wesentlichen aus einem 40 Copolymerisat von Vinylaromaten, insbesondere des Styrols oder Ethylvinylbenzols mit Divinylaroma- ten, insbesondere des Divinylbenzols bestehen.
- 10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß die Oberfläche der Teilchen im Sinne einer Abschirmung der Aromaten modifiziert ist. 45
- 11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß die Modifizierung der Teilchen im Einbau von Polyvinylalkohol in diese während der Synthese besteht.
- 12. Verfahren nach einem der Ansprüche 8 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß die Oberfläche der so Teilchen im Sinne einer Verminderung ihres polaren Charakters modifiziert ist.
- 13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß die Teilchen mit Alkylresten länger als Ethyl alkyliert sind.
- 14. Nicht-poröse Teilchen aus einem Polymeren mit einem Durchmesser von 1 - 100 um zur Trennung von einzel- und/oder doppelsträngigen Nukleinsäuren in einem chromatographischen Verfahren, insbesondere nach einem der Ansprüche 1 bis 7, oder durch Festphasenextraktion, dadurch gekennzeichnet, daß die Oberfläche der Teilchen im Sinne einer Verminderung ihres polaren Charakters modifiziert 6 AT 398 973 B ist.
- 15. Teilchen nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß sie im wesentlichen aus einem Copolyme-risat von Vinylaromaten, insbesondere des Styrols oder Ethylvinylbenzols und Divinylaromaten, insbesondere des Divinylbenzols bestehen.
- 16. Teilchen nach Anspruch 14 oder 15, dadurch gekennzeichnet, daß sie mit Alkylresten länger als Ethyl alkyliert sind. Hiezu 3 Blatt Zeichnungen 7
Priority Applications (11)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
AT0228592A AT398973B (de) | 1992-11-18 | 1992-11-18 | Verfahren zur trennung von nukleinsäuren |
ES94902238T ES2130396T3 (es) | 1992-11-18 | 1993-11-17 | Separacion de fragmentos de acido nucleico. |
DK94902238T DK0669897T3 (da) | 1992-11-18 | 1993-11-17 | Adskillelse af nucleinsyrefragmenter |
DE69323435T DE69323435T2 (de) | 1992-11-18 | 1993-11-17 | Trennung von nukleinsäurefragmenten |
PCT/US1993/010975 WO1994011305A1 (en) | 1992-11-18 | 1993-11-17 | Separation of nucleic acid fragments |
AU56678/94A AU5667894A (en) | 1992-11-18 | 1993-11-17 | Separation of nucleic acid fragments |
AT94902238T ATE176454T1 (de) | 1992-11-18 | 1993-11-17 | Trennung von nukleinsäurefragmenten |
US08/153,046 US5585236A (en) | 1992-11-18 | 1993-11-17 | Nucleic acid separation on alkylated nonporous polymer beads |
EP94902238A EP0669897B1 (de) | 1992-11-18 | 1993-11-17 | Trennung von nukleinsäurefragmenten |
JP51239094A JP3395906B2 (ja) | 1992-11-18 | 1993-11-17 | 核酸断片の分離法 |
GR990400952T GR3029863T3 (en) | 1992-11-18 | 1999-04-05 | Separation of nucleic acid fragments. |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
AT0228592A AT398973B (de) | 1992-11-18 | 1992-11-18 | Verfahren zur trennung von nukleinsäuren |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
ATA228592A ATA228592A (de) | 1994-07-15 |
AT398973B true AT398973B (de) | 1995-02-27 |
Family
ID=3531515
Family Applications (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
AT0228592A AT398973B (de) | 1992-11-18 | 1992-11-18 | Verfahren zur trennung von nukleinsäuren |
AT94902238T ATE176454T1 (de) | 1992-11-18 | 1993-11-17 | Trennung von nukleinsäurefragmenten |
Family Applications After (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
AT94902238T ATE176454T1 (de) | 1992-11-18 | 1993-11-17 | Trennung von nukleinsäurefragmenten |
Country Status (10)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US5585236A (de) |
EP (1) | EP0669897B1 (de) |
JP (1) | JP3395906B2 (de) |
AT (2) | AT398973B (de) |
AU (1) | AU5667894A (de) |
DE (1) | DE69323435T2 (de) |
DK (1) | DK0669897T3 (de) |
ES (1) | ES2130396T3 (de) |
GR (1) | GR3029863T3 (de) |
WO (1) | WO1994011305A1 (de) |
Families Citing this family (91)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5635349A (en) * | 1994-12-02 | 1997-06-03 | Tularik, Inc. | High-throughput screening assay for inhibitors of nucleic acid polymerases |
JP2965131B2 (ja) | 1995-07-07 | 1999-10-18 | 東洋紡績株式会社 | 核酸結合用磁性担体およびそれを用いる核酸単離方法 |
US5795976A (en) * | 1995-08-08 | 1998-08-18 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Detection of nucleic acid heteroduplex molecules by denaturing high-performance liquid chromatography and methods for comparative sequencing |
US6355791B1 (en) * | 1995-11-13 | 2002-03-12 | Transgenomic, Inc. | Polynucleotide separations on polymeric separation media |
US5772889A (en) * | 1995-11-13 | 1998-06-30 | Transgenomic, Inc. | System and method for performing nucleic acid separations using liquid chromatography |
US6066258A (en) * | 1997-12-05 | 2000-05-23 | Transgenomic, Inc. | Polynucleotide separations on polymeric separation media |
US6720186B1 (en) * | 1998-04-03 | 2004-04-13 | Symyx Technologies, Inc. | Method of research for creating and testing novel catalysts, reactions and polymers |
JPH10142172A (ja) * | 1996-11-06 | 1998-05-29 | Jeol Ltd | 分析プロファイル上のマーカ表示方法 |
US6287822B1 (en) | 1997-08-05 | 2001-09-11 | Transgenomic, Inc. | Mutation detection method |
US6576133B2 (en) | 1996-11-13 | 2003-06-10 | Transgenomic, Inc | Method and system for RNA analysis by matched ion polynucleotide chromatography |
US5972222A (en) * | 1996-11-13 | 1999-10-26 | Transgenomic, Inc. | Process for performing polynucleotide separations |
US6372142B1 (en) | 1996-11-13 | 2002-04-16 | Transgenomic, Inc. | Column for DNA separation by matched ion polynucleotide chromatography |
US6471866B1 (en) | 1996-11-13 | 2002-10-29 | Transgenomic, Inc. | Process for performing polynucleotide separations |
US6475388B1 (en) | 1996-11-13 | 2002-11-05 | Transgenomic, Inc. | Method and system for RNA analysis by matched ion polynucleotide chromatography |
US6482317B2 (en) | 1996-11-13 | 2002-11-19 | Transgenomic, Inc. | Polynucleotide separations on polymeric separation media |
US7138518B1 (en) * | 1996-11-13 | 2006-11-21 | Transgenomic, Inc. | Liquid chromatographic separation of polynucleotides |
US6174441B1 (en) | 1996-11-13 | 2001-01-16 | Transgenomic, Inc. | Method for performing polynucleotide separations using liquid chromatography |
US6030527A (en) * | 1996-11-13 | 2000-02-29 | Transgenomic, Inc. | Apparatus for performing polynucleotide separations using liquid chromatography |
US6017457A (en) * | 1996-11-13 | 2000-01-25 | Transgenomic, Inc. | Method for performing polynucleotide separations using liquid chromatography |
US6103112A (en) * | 1996-11-13 | 2000-08-15 | Transgenomic, Inc. | MIPC chromatographic apparatus with improved temperature control |
US5997742A (en) * | 1996-11-13 | 1999-12-07 | Transgenomic, Inc. | Method for performing polynucleotide separations using liquid chromatography |
JP3552871B2 (ja) * | 1997-02-28 | 2004-08-11 | 独立行政法人 科学技術振興機構 | 全自動遺伝子解析システム |
US6355417B2 (en) | 1997-03-14 | 2002-03-12 | Transgenomic, Inc. | Band array display of polynucleotide separations |
JP2002506426A (ja) * | 1997-04-25 | 2002-02-26 | トランスジエノミツク・インコーポレーテツド | 非多孔質ポリマービーズ上でのポリヌクレオチド分離 |
US5986085A (en) * | 1997-04-25 | 1999-11-16 | Transgenomic, Inc. | Matched ion polynucleotide chromatography (MIPC) process for separation of polynucleotide fragments |
AU725928B2 (en) * | 1997-04-25 | 2000-10-26 | Transgenomic, Inc. | Improved liquid chromatographic media for polynucleotide separation |
US6177559B1 (en) * | 1998-04-24 | 2001-01-23 | Transgenomic, Inc. | Process for separation of polynucleotide fragments |
US6056877A (en) * | 1997-12-05 | 2000-05-02 | Transgenomic, Inc. | Non-polar media for polynucleotide separations |
JP2001524133A (ja) * | 1997-06-10 | 2001-11-27 | トランスジエノミツク・インコーポレーテツド | ポリヌクレオチド分離を実施するための改良された方法 |
AU731812B2 (en) * | 1997-06-10 | 2001-04-05 | Transgenomic, Inc. | System and method for performing polynucleotide separations using liquid chromatography |
WO1999007899A1 (en) * | 1997-08-05 | 1999-02-18 | Transgenomic, Inc. | Denaturing multi ion polynucleotide chromatography for detecting mutations |
WO1999009203A1 (en) * | 1997-08-18 | 1999-02-25 | Transgenomic, Inc. | Chromatographic method for mutation detection using mutation site specifically acting enzymes |
US6027898A (en) * | 1997-08-18 | 2000-02-22 | Transgenomic, Inc. | Chromatographic method for mutation detection using mutation site specifically acting enzymes and chemicals |
CA2309760A1 (en) * | 1997-10-09 | 1999-04-22 | Robert M. Haefele | Modifying double stranded dna to enhance separations by matched ion polynucleotide chromatography |
WO1999019517A1 (en) * | 1997-10-14 | 1999-04-22 | Transgenomic, Inc. | Analysis of nicked dna by matched ion polynucleotide chromatography |
WO1999022839A1 (en) * | 1997-10-30 | 1999-05-14 | Transgenomic, Inc. | Method for high resolution liquid chromatographic separation of polynucleotides |
EP1042503A4 (de) * | 1997-10-31 | 2002-01-16 | Transgenomic Inc | Methode zur detektion mutanter dna durch mipc und pcr |
US6372130B1 (en) | 1997-12-05 | 2002-04-16 | Transgenomic, Inc. | Non-polar media for polynucleotide separations |
US6503397B2 (en) * | 1997-12-05 | 2003-01-07 | Transgenomic, Inc. | Non-polar media for polynucleotide separations |
US6258264B1 (en) | 1998-04-10 | 2001-07-10 | Transgenomic, Inc. | Non-polar media for polynucleotide separations |
CA2318143A1 (en) * | 1998-02-03 | 1999-08-05 | Arqule, Inc. | Rapid method for separation of small molecules using reverse phase high performance liquid chromatography |
US6265168B1 (en) | 1998-10-06 | 2001-07-24 | Transgenomic, Inc. | Apparatus and method for separating and purifying polynucleotides |
US6866786B2 (en) * | 1998-04-03 | 2005-03-15 | Symyx Technologies, Inc. | Rapid characterization of polymers |
US6406632B1 (en) | 1998-04-03 | 2002-06-18 | Symyx Technologies, Inc. | Rapid characterization of polymers |
US6416663B1 (en) | 1998-04-03 | 2002-07-09 | Symyx Technologies, Inc. | Chromatographic column for rapid characterizations of polymers |
US6136195A (en) * | 1998-04-10 | 2000-10-24 | Transgenomic, Inc. | MIPC column cleaning system and process |
US7078224B1 (en) * | 1999-05-14 | 2006-07-18 | Promega Corporation | Cell concentration and lysate clearance using paramagnetic particles |
US6197516B1 (en) | 1998-05-12 | 2001-03-06 | Whitehead Institute For Biomedical Research | Computer method and apparatus for analyzing mutations in DNA |
US6485648B1 (en) | 1998-05-18 | 2002-11-26 | Transgenomic, Inc. | MIPC column cleaning system and process |
US7225079B2 (en) * | 1998-08-04 | 2007-05-29 | Transgenomic, Inc. | System and method for automated matched ion polynucleotide chromatography |
US20070161010A1 (en) * | 1998-08-04 | 2007-07-12 | Gjerde Douglas T | Methods and compositions for mutation analysis |
US20030175723A1 (en) * | 1998-08-04 | 2003-09-18 | Gjerde Douglas T. | Methods and compositions for mutation analysis |
US6455692B1 (en) | 1998-08-04 | 2002-09-24 | Transgenomic, Inc. | Method of concentrating polynucleotides using MIPC |
US6074880A (en) * | 1998-08-28 | 2000-06-13 | Transgenomic, Inc. | Sample analyte containing solution fraction collection system, and method of use |
US6355165B1 (en) | 1998-09-10 | 2002-03-12 | Transgenomic, Inc. | MIPC chromatographic apparatus with improved temperature control |
US6238565B1 (en) * | 1998-09-16 | 2001-05-29 | Varian, Inc. | Monolithic matrix for separating bio-organic molecules |
EP1001037A3 (de) * | 1998-09-28 | 2003-10-01 | Whitehead Institute For Biomedical Research | Vorselektion und Isolierung eines Einzelnukleotidpolymorphismus |
US20050136458A1 (en) * | 1998-12-31 | 2005-06-23 | Oligos, Etc, Inc. | Method for nucleic acid preparation |
US6855258B2 (en) * | 1999-04-02 | 2005-02-15 | Symyx Technologies, Inc. | Methods for characterization of polymers using multi-dimensional liquid chromatography with parallel second-dimension sampling |
US6270970B1 (en) | 1999-05-14 | 2001-08-07 | Promega Corporation | Mixed-bed solid phase and its use in the isolation of nucleic acids |
US6310199B1 (en) | 1999-05-14 | 2001-10-30 | Promega Corporation | pH dependent ion exchange matrix and method of use in the isolation of nucleic acids |
US6319674B1 (en) | 1999-09-16 | 2001-11-20 | Agilent Technologies, Inc. | Methods for attaching substances to surfaces |
US6383783B1 (en) | 1999-09-21 | 2002-05-07 | 3M Innovative Properties Company | Nucleic acid isolation by adhering to hydrophobic solid phase and removing with nonionic surfactant |
US7741028B2 (en) * | 1999-11-12 | 2010-06-22 | Ambry Genetics | Methods of identifying genetic markers in the human cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) gene |
RU2163911C1 (ru) * | 1999-12-14 | 2001-03-10 | Пьюролайт Интернэшнл Лимитед | Способ получения сорбентов для хроматографии |
ATE512975T1 (de) * | 2000-01-26 | 2011-07-15 | Transgenomic Inc | Verfahren zur trennung von polynukleotidionen mittels monolithischer kapillarsäulen |
WO2001066216A1 (en) * | 2000-03-09 | 2001-09-13 | Transgenomic, Inc. | Method and system for rna analysis by matched ion polynucleotide chromatography |
US6969587B2 (en) * | 2000-04-04 | 2005-11-29 | Taylor Paul D | Detection of nucleic acid heteroduplex molecules by anion-exchange chromatography |
JP2003534798A (ja) * | 2000-05-26 | 2003-11-25 | トランスジエノミツク・インコーポレーテツド | ポリヌクレオチドを分離しそして精製するための装置及び方法 |
US6521411B2 (en) | 2000-09-28 | 2003-02-18 | Transgenomic, Inc. | Method and system for the preparation of cDNA |
US20020086291A1 (en) * | 2000-11-29 | 2002-07-04 | Hornby David P. | Methods and reagents for analysis of rna structure and function |
US6730228B2 (en) * | 2001-08-28 | 2004-05-04 | Symyx Technologies, Inc. | Methods and apparatus for characterization of polymers using multi-dimensional liquid chromatography with regular second-dimension sampling |
US7135289B2 (en) * | 2001-10-05 | 2006-11-14 | Transgenomic, Inc. | Methods and compositions for mutation analysis of polynucleotides by liquid chromatography |
EP1451350A4 (de) * | 2001-11-05 | 2006-05-10 | Transgenomic Inc | Verfahren, systeme und kits zur analyse von polynukleotiden |
AU2002364894A1 (en) * | 2001-11-09 | 2003-06-30 | Neurogenetics, Inc. | Single nucleotide polymorphisms and mutations on alpha-2-macroglobulin |
US20040067512A1 (en) * | 2001-11-09 | 2004-04-08 | Neurogenetics, Inc. | Single nucleotide polymorphisms and mutations on Alpha-2-Macroglobulin |
WO2003087123A2 (en) * | 2002-04-08 | 2003-10-23 | Transgenomic Inc. | Methods and kits for testing mutagenicity |
US7125492B2 (en) * | 2003-07-17 | 2006-10-24 | Agilent Technologies, Inc. | Additives for reversed-phase HPLC mobile phases |
US7125945B2 (en) * | 2003-09-19 | 2006-10-24 | Varian, Inc. | Functionalized polymer for oligonucleotide purification |
US20050130177A1 (en) | 2003-12-12 | 2005-06-16 | 3M Innovative Properties Company | Variable valve apparatus and methods |
US7727710B2 (en) | 2003-12-24 | 2010-06-01 | 3M Innovative Properties Company | Materials, methods, and kits for reducing nonspecific binding of molecules to a surface |
US7939249B2 (en) | 2003-12-24 | 2011-05-10 | 3M Innovative Properties Company | Methods for nucleic acid isolation and kits using a microfluidic device and concentration step |
US8030034B2 (en) | 2005-12-09 | 2011-10-04 | Promega Corporation | Nucleic acid purification with a binding matrix |
EP2132217A2 (de) * | 2007-02-26 | 2009-12-16 | Alltech Associates Inc. | Ultraschnelle chromatografie |
JP5386805B2 (ja) * | 2007-08-10 | 2014-01-15 | 三菱化学株式会社 | 多孔質架橋重合体の製造方法、多孔質架橋重合体、多孔質架橋重合体粒子および吸着剤 |
US8222397B2 (en) | 2009-08-28 | 2012-07-17 | Promega Corporation | Methods of optimal purification of nucleic acids and kit for use in performing such methods |
US8039613B2 (en) | 2009-08-28 | 2011-10-18 | Promega Corporation | Methods of purifying a nucleic acid and formulation and kit for use in performing such methods |
EP2840136B1 (de) | 2012-03-22 | 2017-02-08 | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | Verfahren zum nachweis von dna mit mikrosatellitenregion |
CN104220597A (zh) | 2012-03-22 | 2014-12-17 | 和光纯药工业株式会社 | 使用了嵌入剂的变异基因的识别检测方法 |
TW201726917A (zh) * | 2015-12-28 | 2017-08-01 | 昭和電工股份有限公司 | 分離分析方法 |
JP6805095B2 (ja) * | 2017-08-01 | 2020-12-23 | 株式会社日清製粉グループ本社 | 食品中の物質が受けた加熱処理の強度の判定方法 |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP0507591A2 (de) * | 1991-04-03 | 1992-10-07 | The Perkin-Elmer Corporation | Anionenaustauschtrennung von Nukleinsäuren |
Family Cites Families (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
NO145164C (no) * | 1978-11-06 | 1982-01-27 | Sintef | Fremgangsmaate for fremstilling av polymerlateks. |
-
1992
- 1992-11-18 AT AT0228592A patent/AT398973B/de not_active IP Right Cessation
-
1993
- 1993-11-17 WO PCT/US1993/010975 patent/WO1994011305A1/en active IP Right Grant
- 1993-11-17 EP EP94902238A patent/EP0669897B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1993-11-17 JP JP51239094A patent/JP3395906B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1993-11-17 AT AT94902238T patent/ATE176454T1/de not_active IP Right Cessation
- 1993-11-17 DK DK94902238T patent/DK0669897T3/da active
- 1993-11-17 DE DE69323435T patent/DE69323435T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1993-11-17 AU AU56678/94A patent/AU5667894A/en not_active Abandoned
- 1993-11-17 ES ES94902238T patent/ES2130396T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1993-11-17 US US08/153,046 patent/US5585236A/en not_active Expired - Lifetime
-
1999
- 1999-04-05 GR GR990400952T patent/GR3029863T3/el unknown
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP0507591A2 (de) * | 1991-04-03 | 1992-10-07 | The Perkin-Elmer Corporation | Anionenaustauschtrennung von Nukleinsäuren |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
C.A. 113(25), 1990; 227352S, * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JP3395906B2 (ja) | 2003-04-14 |
DE69323435D1 (de) | 1999-03-18 |
EP0669897A1 (de) | 1995-09-06 |
DK0669897T3 (da) | 1999-09-20 |
EP0669897A4 (de) | 1996-01-24 |
EP0669897B1 (de) | 1999-02-03 |
GR3029863T3 (en) | 1999-07-30 |
ATE176454T1 (de) | 1999-02-15 |
ATA228592A (de) | 1994-07-15 |
DE69323435T2 (de) | 1999-07-01 |
JPH08505700A (ja) | 1996-06-18 |
ES2130396T3 (es) | 1999-07-01 |
WO1994011305A1 (en) | 1994-05-26 |
US5585236A (en) | 1996-12-17 |
AU5667894A (en) | 1994-06-08 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
AT398973B (de) | Verfahren zur trennung von nukleinsäuren | |
DE69930757T2 (de) | Monolithische matrix zur trennung von nukleinsäuren durch ionenpaar-hochleistungsflüssigkeitschromatographie mit umgekehrten phasen | |
DE69026090T2 (de) | Fraktionierung nukleider säuren mit hilfe von kapillarer elektrophorese in gegenmigration | |
DE60012318T2 (de) | pH ABHÄNGIGE IONTAUSCHERMATRIX UND ANWENDUNGSVERFAHREN IN DER ISOLIERUNG VON NUKLEINSÄUREN | |
DE1598354C3 (de) | Verfahren zur chromatographischen Auftrennung von Gas- und/oder Dampfgemischen durch Kontaktieren derselben mit einem festen synthetischen polymeren Adsorbens mit einer großen Oberfläche | |
DE69922740T2 (de) | Methode zur Trennung von Nucleinsäuren mittels Flüssigchromatographie | |
EP0154246B1 (de) | Phasenträger für die Verteilungschromatographie von Makromolekülen, Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung | |
EP2128169A1 (de) | Verfahren zur Isolierung von kurzkettigen Nukleinsäuren | |
EP1005477A2 (de) | Verfahren zur isolierung von anionischen organischen substanzen aus wässrigen systemen mit kationischen polymernanopartikeln | |
DE69817207T2 (de) | System und verfahren zur durchführung von polynukleotid-trennungen mit hilfe von flüssigchromatographie | |
DE3236776A1 (de) | Substrat fuer die fluessigkeits-chromatographie und verfahren zur reinigung einer fettloeslichen substanz unter dessen verwendung | |
CH619246A5 (de) | ||
EP0744025B1 (de) | Chromatographiematerial | |
EP2411811B1 (de) | Überschichtung zur partikelabtrennung | |
DE19731670C2 (de) | Verfahren zur Reinigung und gegebenenfalls Analyse von Nukleinsäuren aus biologischen Proben | |
EP1242816A2 (de) | Chromatographiematerial und verfahren unter verwendung desselben | |
EP2115137A1 (de) | Vorrichtung und verfahren zur aufreinigung von nukleinsäuren | |
DE102019118332B4 (de) | Verfahren und testkit zur bisulfitmodifizierung von dna | |
DE1694660A1 (de) | Verfahren zur Gewinnung von Polymerisaten aus Suspensionen | |
EP1278834B1 (de) | Verfahren für die komplexe nukleinsäureanalytik | |
DE19638362C1 (de) | Verfahren zur Reinigung von Nukleinsäuren oder zur Isolierung von Nukleinsäuren aus körperzellenhaltigen Proben unter gleichzeitiger Abreinigung von PCR-Inhibitoren | |
DE102007051578B3 (de) | Verfahren zur parallelen Amplifikation von wenigstens zwei verschiedenen Nukleinsäureabschnitten | |
DE3903983A1 (de) | Neues, doppelt derivatisiertes polymer fuer die umkehrphasen-fluessigkeitschromatographie | |
EP1234056A2 (de) | Dynamische bestimmung von analyten | |
DE102006032610C5 (de) | Verfahren zur parallelen Isolierung viraler Nukleinsäuren |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
MK07 | Expiry |
Effective date: 20121118 |