AT398973B - Verfahren zur trennung von nukleinsäuren - Google Patents

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Description

AT 398 973 B
Die Trennung von Nukleinsäuren ist ein Gebiet von großer wissenschaftlicher und technischer Bedeutung und Aktualität. Unter den hiebei eingesetzten chromatographischen Verfahren stehen sich vor allem die Anionenaustausch-Chromatographie und die lonenpaar-Umkehrphasen-Chromatographiegegenüber.
Bei der Trennung doppelsträngiger Nukleinsäuren ist ein wesentlicher Nachteil der Anionenaustausch-Chromatographie das unterschiedliche Retentionsverhalten von GC- und AT-Basenpaaren, wodurch eine Trennung nach Molekülgrößen nicht möglich ist. Dies schränkt die Anwendung der Anionenaustausch-Chromatographie in der Analyse von Nukleinsäuren erheblich ein, ganz abgesehen davon, daß die bei diesem Verfahren notwendige Elution in einem Salzgradienten weiterführende Untersuchungen der DNS-Moleküle erschwert.
Zwar zeigt W. Bloch in seiner europäischen Patentanmeldung (EP 0 507 591 A2), daß durch die Zugabe von Tetramethylammoniumchlorid (TMAC) zum Eluenten eine weitgehende Trennung von DNA-Fragmenten entsprechend ihrer Größe auch auf nicht porösen Anionenaustauschern möglich ist, jedoch kann man der Abb. 5 der Patentanmeldung entnehmen, daß die Fragmente mit 434 bzw. 458 Basenpaaren (34 Basenpaare Unterschied) eine unterschiedliche Retention aufweisen, daß jedoch die Fragmente mit 458 bzw. 504 Basenpaaren (46 Basenpaare Unterschied) zur gleichen Zeit eluieren, daß also auch hier keine strenge längenabhängige Trennung gegeben ist. Außerdem wird durch die Zugabe von TMAC eine signifikante Abnahme an Auflösung in Kauf genommen. Da es sich auch bei dieser Methode prinzipiell um eine Anionenaustausch-Chromatographie handelt, sind auch hier wegen der verwendeten Salzgradienten direkte weitere Untersuchungen durch die Anwesenheit nicht flüchtiger Salze erschwert.
Auch die lonenpaar-Umkehrphasen-Chromatographie hat in der von Eriksson et ai. beschriebenen Form für die praktische Anwendung auf die Trennung von doppelsträngigen DNS-Fragmenten noch erhebliche Nachteile. Diese liegen, abgesehen von der geringen Trennschärfe, vor allem darin, daß insbesondere kürzere Restriktionsfragmente nur sehr unvollständig wiedergefunden werden und daß außerdem die Analysenzeit im Stundenbereich liegt (vgl. Eriksson, S., Glad, G., Pernemalm, P-A., Westman, E., (1986) J. Chromatogr. 359, 265-274).
In bezug auf die von Y. Ohimya et al. (Y. Ohimia, Y. Kondo, T. Kondo, Anal. Biochem. 189 (1990) 126-130) publizierte Arbeit zur Trennung von DNA-Fragmenten durch lonenaustausch-Chromatographie auf einer mit Trimetylammonium-Gruppen funktionalisierten Säule gelten dieselben Einwände wie für die Trennung von DNA-Fragmenten auf einer mit Diethylaminoethyl-Gruppen modifizierten Säule (Y: Kato, Y. Yamaski, Akane Onaka, T. Kitamura, T. Hasimoto, T. Murotsu, S. Fukushige, K. Matsubara, J. Chromatogr., 478 (1989) 264-268): Eine strenge Trennung der DNA-Fragmente nach deren Größe ist in beiden Fällen nicht möglich (vgl. Kato et al., Abb. 1 und Ohimiya et al. Abb. 2), ferner werden weiterführende Untersuchungen durch den hohen Salzgehalt der eluierten Proben erschwert.
Unter der Annahme, daß die Nachteile des von Eriksson et al. beschriebenen Verfahrens auf die Verwendung poröser Silicagel-Teilchen in der stationären Phase zurückzuführen seien, wurde von Huber et al die Verwendung noch nicht-porösen Polystyrol-Teilchen in der lonenpaar-Umkehrphasen-Chromatograhie erstmals angeregt (Huber, C.G., Oefner, P.J. und Bonn, G.K. (1992) J. Chromatogr. 599,113-118). Es zeigte sich, daß mit der Verwendung derartigen Säulenmaterials die Trennung einzelsträngiger Nukleinsäuren wesentlich verbessert werden kann. Eine weitere Verbesserung ergab sich durch den Einbau von Polyvinylalkohol während der Synthese der Polymerteilchen.
Versuche, das von Huber et al. vorgeschlagene Verfahren auf doppelsträngige Nukleinsäuren anzuwenden, blieben erfolglos, bis sich zeigte, daß die zunächst festgestellte schlechte Auflösung nur bei Nukleinsäuren mit mehr als 150 Basenpaaren auftritt. In ihrer allgemeinsten Form besteht die Erfindung somit darin, die Trennung von doppelsträngigen DNS-Fragmenten mittels lonenpaar-Umkehrphasen-Chro-matographie unter Verwendung einer Säule von nicht-porösen polymeren Teilchen mit einem Durchmesser zwischen 1 und 100 um, vorzugsweise 2 und 3 um, vorzunehmen.
Relevant für die chromatographische Wirksamkeit der Teilchen ist jeweils deren oberflächennaher Bereich, weshalb Materialangaben im Text und in den Ansprüchen jeweils auf diesen Bereich der Teilchen zu beziehen sind, deren Kern aus verschiedenen Materialien bestehen kann.
Allgemein, also ohne die Beschränkung auf kurze Fragmente, wird das von Huber et al. angegebene Säulenmaterial zur Analyse von doppelsträngiger DNS mittels lonenpaar-Umkehrphasen-Chromatographie verwendbar, wenn die Oberfläche der polymeren Teilchen im Sinne einer Verminderung ihres polaren Charakters insbesondere durch eine Alkylierung mit Alkylresten länger als Ethyl modifiziert wird.
Diese Wirkung einer Alkylierung war für den Fachmann durchaus überraschend. Die Verwendung von (allerdings porösen) alkylierten Polystyrol-Teilchen war zwar von Morgan und Celebuski (Morgan, R. L. und Celebuski, J. E. (1991), J. Chromatogr. 536, 84-93) bereits beschrieben worden. In dieser Arbeit wurde gezeigt, daß mit Fluorescin oder Biotin markierte Oligonukieotide auf unmodifizierten porösen Poly-(Styrol-Divinyl-benzo!)-Teilchen (PRP-1-Säule, Firma Hamilton, Reno, NV, USA) hängenbleiben und erst in nachfol- 2
AT 398 973 B genden Laufen als sogenannte "Geisterbanden" eluiert werden. Dieser unerwünschte Effekt konnte nach Modifikation der porösen Poly-(Styrol-Divinylbenzol)-Teilchen mit Octadecylresten (Polyspher RP-18, EM Science, Cherry Hill, NJ, USA) eliminiert werden. Eine verbesserte Auflösung trat jedoch nicht ein.
Die erwähnte Arbeit von Huber et al. deutete noch keineswegs auf die durch die Alkylierung des Polystyrols erzielbare Verbesserung. Die durch den Einbau des Polyvinylalkohols in die Polymerteilchen erzielte Verbesserung der Auflösung von Oligonukleotiden war nämlich aufgrund der Anwesenheit von Hydroxylgruppen u.a. auf deren polaren Charakter zurückgeführt worden. Es war daher völlig überraschend, daß eine Alkylierung mit völlig apolaren Gruppen wie Octadecylresten eine noch deutlichere Verbesserung der Auflösung von Oligonukleotiden zur Folge hat und sogar die Trennung von doppelsträngigen DNS-Fragmenten erlaubt.
Bei Anwendung der Erfindung ist selbst bei einem Unterschied von nur einem Basenpaar eine Trennung nach Fragmentlänge durch lonenpaar-Chromatographie möglich. Der Vorteil der Methode liegt daher in der Verwendung eines flüchtigen lonenpaarreagenzes in Verbindung mit dem hohen Auflösungsvermögen zur Trennung von DNA-Fragmenten und PCR-Produkten. Isolierte Fraktionen sind nach Entfernung des flüchtigen Eluenten durch einfache Gefriertrocknung direkt weiteren Experimenten zugänglich.
Die durch die Erfindung erzielte Verbesserung der lonenpaar-Umkehrphasen-Chromatographie erweitert den Einsatzbereich dieses Analyseverfahrens auf die klinische Diagnose von Erkrankungen durch den Nachweis von Onkogenen bzw. von viralen Genen.
Der Nachweis von Onkogenen bzw. viralen Genen erfolgt heute derart, daß Polymerase-Kettenreaktionsprodukte dieser Gene gelelektrophöretisch getrennt werden. Die Gelelektrophorese stellt jedoch eine Ansammlung von arbeitsintensiven und nicht automatisierbaren Techniken dar.
Von Katz et al. (Katz, E.D., Haff, L.A., Eksteen, R. (1990) J. Chromatogr. 512, 433-444) ist bereits die chromatographische Trennung von Polymerase-Kettenreaktionsprodukten beschrieben worden. Das angewendete Verfahren, nämlich die Anionenaustausch-HPLC, führt jedoch nicht nur zu den eingangs grundsätzlich dargelegten Nachteilen, sondern auch zu einem allmählichen Anstieg des Hintergrundsignals, welcher zusammen mit den relativ langen Analysenzeiten die klinische Anwendung erschwert. In der Arbeit von Katz wird die Möglichkeit der Detektion von Onkogenen bzw. viralen Genen, obwohl sie theoretisch besteht, nicht erwähnt.
Die Erfindung liefert also auch ein Diagnostikverfahren zur Erkennung von malignen Tumoren und/oder viralen Erkrankungen im menschlichen oder tierischen Organismus, wobei Onkogene bzw. virale Genome insbesondere durch eine Polymerase-Kettenreaktion vermehrt und in einem chromatographischen Verfahren von anderen Produkten getrennt werden, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß als chromatographisches Verfahren die ionenpaar-Umkehrphasen-Chromatographie eingesetzt wird.
Die Anwendung erfindungsgemäß modifizierter Polymerteilchen ist nicht auf die Trennung doppelsträn-giger DNS-Fragmente beschränkt. Auch eine Beschränkung auf die lonenpaar-Umkehrphase-Chromatogra-phie ist nicht gegeben, vielmehr ist ein Einsatz in verschiedenen Chromatographieverfahren und insbesondere auch für die Festphasenextraktion möglich.
Anschließend wird die Herstellung der erfindungsgemäßen Polymerteilchen anhand eines Ausführungsbeispieles beschrieben und deren Wirksamkeit im Zusammenhang mit drei Chromatogrammen erläutert. Dabei zeigt
Fig. 1 die Trennung von DNS-Restriktionsfragmenten durch unmodifizierte und modifizierte nicht-poröse Polystyrol-Teilchen, Fig. 2 ein Demonstrationsbeispiel für die hochauflösende Trennung von DNS-Restriktionsfragmenten, und Fig. 3 ein Beispiel für die Hochgeschwindigkeitsanalyse von PCR-Produkten mittels einer aus den erfindungsgemäßen Teilchen hergestellten Chromatographiesäule.
Die Herstellung nicht poröser, sphärischer Poly-(Ethylvinylbenzol-Divinylbenzol)-Teilchen erfolgte in einem zweistufigen Prozeß, der eine sehr enge Größenverteilung garantiert. Im ersten Schritt werden hierbei mittels Emulsionspolymerisation von Styrol Polystyrol-Keime mit einem mittleren Durchmesser von 0.8 - 1 um synthetisiert. Im zweiten Schritt werden dann diese Keime mit einer Mischung aus Mono- und Divinylmonomeren (z. B. Ethylvinylbenzol und Divinylbenzol) auf eine Größe von 1 - 10 um angeschwollen und schließlich durch stufenweise Temperaturerhöhung, die ein Verklumpen der Teilchen verhindern soll, polymerisiert.
Die Emulsionspolymerisation würde in Anlehnung an eine Publikation von Goodwin et al. (Goodwin, J.W., Hearn, J., Ho, C.C. und Ottewill, R.H. (1974) Colloid & Polymer Sei. 252, 464-471) aus dem Jahre 1974 nach folgendem Protokoll durchgeführt: 0,236 g Natriumchlorid wurde in 354 ml entionisiertem Wasser in einem Reaktionsgefäß mit einem Fassungsvolumen von 1 Liter, das ferner über Rückflußkühler, Rührer und Gaseinleiterohr verfügte, unter einer Argonatmosphäre gelöst, und auf 87 · C temperiert (Rührerdrehzahl: 350 rpm). Dann wurden 33,7 g frisch destillierten Styrols und nach einer Minute 0,2184 g Kaliumper-oxodisuifat, gelöst in 50 ml entionisiertem Wasser, hinzugegeben. Nach Zugabe der Reagentien wurde das 3
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Ende des Gaseinleiterohrs über den Flüssigkeitsspiegel zurückgezogen. Das Reaktionsgemisch wurde für 6.5 Stunden bei 87 ’C gerührt und anschließend auf Raumtemperatur abgekühlt und unter Berücksichtigung der am Rührer haftenden Menge an Polystyrol (im allgemeinen zwischen 5 und 10 g) so verdünnt, daß die Konzentration an polymerisiertem Styrol ca. 54,6 g pro 1000 ml Suspension betrug. Der Durchmes- 5 ser der sphärischen Partikel wurde mittels Lichtmikroskopie bestimmt und betrug etwa 1 um.
Da die mittels Emulsionspoiymerisation hergestellten Teilchen für chromatographische Zwecke einerseits zu klein und andererseits aufgrund der fehlenden Quervernetzung nicht druckstabil sind, wurden in einem zweiten Schritt die Polymerkeime in Anlehnung an der von Ugelstad et al. (Ugelstad, J., Mork, P.C., Herder Kaggerud, K., Ellingsen, T. und Berge, A. (1980) Adv. Colloid Interface Sei. 13, 101-140) im Jahre 10 1980 beschriebenen aktivierten Schwellungsmethode auf einen Teilchendurchmesser von 1 - 10 um gebracht. Die wäßrige Suspension der Polystyrolkeime (200 ml) wurde hiezu zuerst mit 60 ml Aceton versetzt und dann mit 60 ml einer 1-Chlordodecan enthaltenden Emulsion (0.206 g Natriumdodecylsulfat, 49.5 ml entionisiertes Wasser und 10,5 ml 1-Chlordodecan wurden ca. 4 Stunden bei 0 · C im Ultraschallbad gerührt, bis eine feine Emulsion <0,3 tim erhalten wurde) während ca. 12 Stunden bei Raumtemperatur 15 angeschwollen. In der Folge wurde das Aceton bei 80 *C für 30 Minuten abgedampft. Dann wurden 310 g einer aus Ethylvinylbenzol und Divinylbenzol im Verhältnis von 1:1,71 bestehenden Mischung, die ferner 2,5 g Dibenzoylperoxid als Initiator enthielt, zugegeben und so lange unter wiederholter lichtmikroskopischer Kontrolle gerührt bis der gewünschte Teilchendurchmesser erreicht war (im Durchschnitt 4 bis 8 Stunden). Das Verhältnis von Monomer zu Initiator betrug zumindest 100:1, um einen Polymerisationsgrad >200 zu 20 realisieren, der den Teilchen die nötige Druckstabilität für die Hochdruckflüssigkeitschromatographie verlieh. Anschließend wurde der gesamte Ansatz in einen Scheidetrichter überführt, wobei sich unverbrauchtes Monomer, das verworfen wurde, von den angeschwollenen Teilchen trennte. Abschließend wurde durch stufenweise Temperaturerhöhung (63 *C für ca. 7 Stunden, 73 *C für ca. 2 Stunden und 83 ”C für ca. 12 Stunden) polymerisiert (Polymerisationsgrad >500). Derart hergestellte Teilchen weisen, wie die Quecksil-25 berporosimetrie bestätigte, keine Poren >30 Ä auf, wodurch Größenausschlußeffekte bei der Chromatographie vermieden werden können.
Die auf diese oder eine andere Art und Weise hergestellten nicht porösen einheitlich sphärischen Partikel können zwar wie bereits oben erwähnt direkt zur umkehrphasenchromatographischen Trennung von Nukleinsäuren verwendet werden, aber die Auflösung ließ, vermutlich aufgrund der unerwünschten Adsorp-30 tion der aromatischen Basen der Nukleinsäuren an die Partikeloberfläche, zu wünschen übrig. Um diesen Effekt zu minimieren, wurden nun in einem weiteren Schritt die Aromaten der stationären Phase durch elektrophile aromatische Substitution alkyliert. In einem typischen Ansatz wurden 10 g der getrockneten Teilchen in 100 ml 1-Chloroctadecan suspendiert und nach Zugabe von 1 g Aluminiumchiorid für 12 Stunden bei 100 *C gerührt (370 rpm). Im Anschluß wurde der Reaktionsansatz auf 80 *C abgekühlt, 150 35 ml einer 4 M Salzsäure hinzugefügt, für ca. 2 Minuten gerührt, in einen Scheidetrichter überführt, mit 300 mi n-Heptan versetzt, die Phasen gut durchmischt und nach anschließender Trennung der Phasen die wäßrige Phase verworfen. Die organische Phase wurde noch zweimal mit 200 ml einer 1 M Salzsäure gewaschen und anschließend bei 5000 rpm abzentrifugiert. Die abgeschiedenen Teilchen wurden viermal mit 100 ml n-Heptan, und dann je zweimal mit 100 ml Diethylether, 100 ml Dioxan und 100 ml Methanol 40 gewaschen und abschließend getrocknet.
Mit Hilfe der Fourier-Transform-Infrarotspektroskopie (FTIR) konnte schließlich die tatsächlich erfolgte Alkylierung der Aromaten nachgewiesen werden. Die erzeugten Teilchen wichen in ihrer Größe nur wenig voneinander ab. Als Mittelwert für den Durchmesser wurde 2,10 um festgestellt, mit einer Standardabweichung von 0,12 um. 45 Ein Kriterium für das Erreichen hochauflösender chromatographischer Trennungen von Nukleinsäuren ist das für das Packen der Säule verwendete Protokoll. Für eine 50 x 4,6 mm I.D. Säule wurden 1,4 g der alkyiierten Teilchen in 15 ml Tetrahydrofuran im Ultraschallbad suspendiert und mit 50 ml Methanol bei einem Druck von 70 MPa in die Säule gefüllt. In der Folge wurde mit 50 ml entionisiertem Wasser ebenfalls bei 70 MPa nachgespült, um die Teilchen zu entquellen und so eine noch höhere Packungsdichte zu so erzielen.
Die eigentliche Trennung der einzel- und doppelsträngigen Nukleinsäuren erfolgte nach dem Prinzip der lonenpaar-Umkehrphasen-Flüssigkeitschromatographie. Als lonenpaarreagenz wurde zumeist Trieth-ylammoniumacetat verwendet, es kommen jedoch auch andere tertiäre und quartäre Ammoniumsalze in Frage. Die Elution erfolgte mit Hilfe eines linearen organischen Lösungsmittelgradienten wie zum Beispiel 55 Acetonitril oder Methanol.
Fig. 1 zeigt die Trennung von DNS-Restriktionsfragmenten durch die beschriebenen nicht-porösen Polystyrol-Teilchen unter folgenden Versuchsbedingungen: Säule: 50 x 4,6 mm I.D. Mobile Phase: 0,1 M TEAA, pH 7,0. Gradient: 7,5-13,75 % Acetonitril in 4 Minuten, gefolgt von 13,75 - 16,25 % Acetonitril in 6 4
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Minuten. Flußrate: 1 ml/min. Säulentemperatur: 50 'C. Detektion: UV, 254 nm. Probe: 0,5 ug pBR322 DNS-Haeill Restriktionsverdau.
Die Kurve a bezieht sich auf unmodifizierte Teilchen, die Kurve b auf Teilchen, welche, wie von Huber et al beschrieben, durch den Einbau von Polyvinylalkohol modifiziert worden sind, die Kurve c auf alkylierte 5 Teilchen. Eine saubere Trennung der durch die Zahl der Basenpaare charakterisierten Fragmente ergibt sich über einen weiten Bereich von Fragmentlängen nur im Fall c, bei geringeren Fragmentlängen sind jedoch auch unmodifizierte Teilchen nicht ganz unbrauchbar, und schon eine geringfügige Abschirmung der Aromaten durch Polyvinylalkohol führt gemäß Kurve b zu verbesserter Auflösung.
Die erfindungsgemäßen nicht-porösen Polystyrol-Teilchen sind für eine Reihe von Chromatographien io und verwandte Anwendungen hervorragend geeignet, wofür anschließend einige Beispiele gegeben werden: 1. Beispiel Für gewisse molekularbiologische Experimente wie die in situ Hybridisierung ist eine radioaktive 75 Markierung der Oligonukleotide mit Isotopen wie 32P oder 33P notwendig. Um in der Folge eine kompetitive Hybridisierung mit unmarkiertem Oligonukleotid zu vermeiden, ist eine Reinigung der radioaktiv markierten Oligonukleotide erforderlich. Dies kann mittels lonenpaar-Umkehrphasen-Chromatographie auf alkyliertem nicht porösem Poly-(Ethylvinylbenzol-Divinyibenzol) schnell und einfach erfolgen. Die Wiederfindungsrate für Oligonukleotide betrug zumindest 96%. 20 2. Beispiel
Fig. 2 zeigt die hochauflösende Trennung von DNS-Restriktionsfragmenten auf mit Octadecylresten modifizierten nicht porösen Poly-(Ethylvinylbenzol-Divinylbenzol)-Tei!chen. Der Versuch wurde unter folgen-25 den Bedingungen durchgeführt: Säule: 50 x 4,6 mm I.D. Mobile Phase: 0,1 Μ TEAA, pH 7,0. Gradient: 8,75 - 11,25 % Acetonitril In 2 Minuten, gefolgt von 11,25 - 14,5 % Acetonitril in 10 Minuten, 14,5 - 15,25 % Acetonitril in 4 Minuten, sowie 15,25 - 16,25 % Acetonitril in 4 Minuten. Flußrate: 1 ml/min. Säulentemperatur: 50 · C. Detektion: UV, 254 nm. Probe: eine Mischung aus 0,75 mg pBR3|2 DNS-Haelll Restriktionsverdau und 0,65 ug ΦΧ 174 DNS-Hincll Restriktionsverdau. Entscheidend für das gezeigte Auflösungsvermö-30 gen sind neben der stationären Phase, die Konzentration von Triethylammoniumacetat, die Steilheit des Lösungsmittelgradienten, die Säulentemperatur, sowie die Flußrate. In bezug auf die Konzentration von Triethylammoniumacetat in der mobilen Phase läßt sich feststellen, daß in einem Bereich von 25 bis zumindest 125 mM eine kontinuierliche Zunahme an Auflösung erfolgt. Betreff der Steilheit des Lösungsmittelgradienten gilt, daß mit zunehmender Fragmentlänge ein flacherer Gradient zur Auflösung der DNS-35 Moleküle notwendig ist. Die Trennung der DNS-Moleküle zeigt in Abhängigkeit von der Säulentemperatur ein Maximum an Auflösung bei 50 ’C. Bei noch höheren Temperaturen ist eine Denaturierung der doppelsträngigen DNS-Moleküle zu beobachten. 3. Beispiel 40
Durch Minimierung des Gradientenvolumens in Verbindung mit der alkylierten nicht porösen Poly-(Ethylvinylbenzol-Divinylbenzol)-Phase konnten Polymerase-Kettenreaktionsprodukte inkl. der für die Regenerierung der Säule benötigten Zeit innerhalb von 2 Minuten analysiert werden. Da bei der Polymerase-Kettenreaktion zumeist nur ein oder zwei Produkte bekannter Länge anfallen, werden an die Auflösung 45 etwas geringere Anforderungen gestellt als bei Trennung von DNS-Restriktionsfragmenten. Dies gestattet daher die Verwendung steiler Lösungsmittelgradienten und somit kurzer Analysenzeiten. Die Wiederfindung eines 404 Basenpaare langen DNS-Fragmentes betrug 97,5%. Ein im Vergleich zur Kapillarelektrophorese entscheidender Vorteil der lonenpaar-Umkehrphasen-Chromatographie besteht im Entfallen der Notwendigkeit, die PCR-Proben vor ihrer Analyse entsalzen zu müssen. Daher ist in Kombination mit einem 50 Autosampler eine vollautomatische Analyse von PCR-Proben möglich. So konnten Onkogene und virale Genome (Hepatitis C-Virus, HIV) nachgewiesen werden.
Die Eignung der erfindungsgemäß modifizierten Polystyrol-Teilchen für die klinische Praxis ergibt sich aus Fig. 3. Diese bezieht sich auf einen Versuch, der unter folgenden Bedingungen durchgeführt wurde: Säule: 50 x 4,6 mm l.D. Mobile Phase: 0,1 M TEAA, pH 7,0. Gradient: 11,25 - 13,75 % Acetonitril in 1 55 Minute, gefolgt von 22,5 % Acetonitril für 6 Sekunden und 11,25 % Acetonitril für 54 Sekunden. Flußrate: 3 ml/min. Säulentemperatur: 50 ° C. Detektion: UV, 256 nm. Probe: 20 ul einer PCR-Probe, 1 = unspezifisches Produkt, 2 = 120 Basenpaare langes PCR-Produkt, 3 = 132 Basenpaare langes PCR-Produkt, und 4 = 167 Basenpaare langes PCR-Produkt. 5

Claims (16)

  1. AT 398 973 B Der mehrfach mit den PCR-Produkten der gleichen Onkogene wiederholte Versuch erbrachte, wie man sieht, hervorragend reproduzierbare Ergebnisse. Besonders wichtig war zudem die Feststellung, daß das Ergebnis der einzelnen Versuche durch vorhergehende Beladungen der Säule nicht beeinflußt wird, was eine weitere unabdingbare Voraussetzung für den klinischen Einsatz des Verfahrens darstellt. 5 Patentansprüche 1. Verfahren zur Trennung von doppelsträngigen DNS-Fragmenten mittels lonenpaar-Umkehrphasen-Chromatographie, dadurch gekennzeichnet, daß die Trennung unter Verwendung einer Säule von io nicht-porösen Teilchen aus einem Polymeren mit einem Durchmesser zwischen 1 und 100 um, vorzugsweise zwischen 2 und 3 um, erfolgt.
  2. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Teilchen im wesentlichen aus einem Copolymerisat von Vinylaromaten, insbesondere des Styrols oder Ethylvinylbenzols mit Divinylaroma- 15 ten, insbesondere des Divinylbenzols bestehen.
  3. 3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Oberfläche der Teilchen im Sinne einer Abschirmung der Aromaten modifiziert ist.
  4. 4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Modifizierung der Teilchen im Einbau von Polyvinylalkohol in diese während der Synthese besteht.
  5. 5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Oberfläche der Teilchen im Sinne einer Verminderung ihres polaren Charakters modifiziert ist. 25
  6. 6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Teilchen mit Alkylresten länger als Ethyl alkyliert sind.
  7. 7. Diagnostizierverfahren zur Erkennung von malignen Tumoren und/oder viralen Erkrankungen bei dem 30 aus dem menschlichen oder tierischen Organismus entnommene Onkogene bzw. virale Genome insbesondere durch eine Polymerase-Kettenreaktion vermehrt und aufgrund unterschiedlicher Verweilzeit auf einer Trennstrecke identifiziert werden, dadurch gekennzeichnet, daß die Trennung durch lonenpaar-Umkehrphasen-Chromatographie erfolgt.
  8. 8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Trennung unter Verwendung einer Säule von nicht-porösen Teilchen aus einem Polymeren mit einem Durchmesser zwischen 1 und 100 um, vorzugsweise zwischen 2 und 3 um, erfolgt.
  9. 9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Teilchen im wesentlichen aus einem 40 Copolymerisat von Vinylaromaten, insbesondere des Styrols oder Ethylvinylbenzols mit Divinylaroma- ten, insbesondere des Divinylbenzols bestehen.
  10. 10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß die Oberfläche der Teilchen im Sinne einer Abschirmung der Aromaten modifiziert ist. 45
  11. 11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß die Modifizierung der Teilchen im Einbau von Polyvinylalkohol in diese während der Synthese besteht.
  12. 12. Verfahren nach einem der Ansprüche 8 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß die Oberfläche der so Teilchen im Sinne einer Verminderung ihres polaren Charakters modifiziert ist.
  13. 13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß die Teilchen mit Alkylresten länger als Ethyl alkyliert sind.
  14. 14. Nicht-poröse Teilchen aus einem Polymeren mit einem Durchmesser von 1 - 100 um zur Trennung von einzel- und/oder doppelsträngigen Nukleinsäuren in einem chromatographischen Verfahren, insbesondere nach einem der Ansprüche 1 bis 7, oder durch Festphasenextraktion, dadurch gekennzeichnet, daß die Oberfläche der Teilchen im Sinne einer Verminderung ihres polaren Charakters modifiziert 6 AT 398 973 B ist.
  15. 15. Teilchen nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß sie im wesentlichen aus einem Copolyme-risat von Vinylaromaten, insbesondere des Styrols oder Ethylvinylbenzols und Divinylaromaten, insbesondere des Divinylbenzols bestehen.
  16. 16. Teilchen nach Anspruch 14 oder 15, dadurch gekennzeichnet, daß sie mit Alkylresten länger als Ethyl alkyliert sind. Hiezu 3 Blatt Zeichnungen 7
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