JPH07284400A - 赤痢菌検出のためのオリゴヌクレオチドおよびそれを用いた検出法 - Google Patents
赤痢菌検出のためのオリゴヌクレオチドおよびそれを用いた検出法Info
- Publication number
- JPH07284400A JPH07284400A JP6048174A JP4817494A JPH07284400A JP H07284400 A JPH07284400 A JP H07284400A JP 6048174 A JP6048174 A JP 6048174A JP 4817494 A JP4817494 A JP 4817494A JP H07284400 A JPH07284400 A JP H07284400A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- shigella
- gene
- oligonucleotide
- sequence
- primer
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Classifications
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【目的】 検体中に存在する赤痢菌の志賀毒素遺伝子ま
たはｉｐａＨ遺伝子及びｉｎｖＥ遺伝子を検出すること
を目的とする。 【構成】 検体中に存在する赤痢菌の志賀毒素遺伝子ま
たはｉｐａＨ遺伝子及びｉｎｖＥ遺伝子と選択的にハイ
ブリダイズするオリゴヌクレオチド（配列番号１〜６）
を作製し、このオリゴヌクレオチドをプライマーとして
遺伝子増幅に用い、食中毒症状を起こす赤痢菌の志賀毒
素遺伝子またはｉｐａＨ遺伝子及びｉｎｖＥ遺伝子のみ
を選択的に検出することを特徴としている。
たはｉｐａＨ遺伝子及びｉｎｖＥ遺伝子を検出すること
を目的とする。 【構成】 検体中に存在する赤痢菌の志賀毒素遺伝子ま
たはｉｐａＨ遺伝子及びｉｎｖＥ遺伝子と選択的にハイ
ブリダイズするオリゴヌクレオチド（配列番号１〜６）
を作製し、このオリゴヌクレオチドをプライマーとして
遺伝子増幅に用い、食中毒症状を起こす赤痢菌の志賀毒
素遺伝子またはｉｐａＨ遺伝子及びｉｎｖＥ遺伝子のみ
を選択的に検出することを特徴としている。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、検疫、臨床検査、とく
に食中毒または細菌性下痢症にかかる検査、あるいは食
品検査での赤痢菌の検出に関するものである。
に食中毒または細菌性下痢症にかかる検査、あるいは食
品検査での赤痢菌の検出に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】赤痢菌の検出は、種々の医学および公衆
衛生に関して重要で、従来にあっては次の工程による検
出を行っていた。
衛生に関して重要で、従来にあっては次の工程による検
出を行っていた。
【０００３】先ず、検査材料の患者糞便および食品から
ＤＨＬ寒天、マッコンキー寒天等の培地を用いた分離培
養を行い、その後、ＴＳＩ寒天、ＬＩＭ寒天培地等を用
いた鑑別培養である。
ＤＨＬ寒天、マッコンキー寒天等の培地を用いた分離培
養を行い、その後、ＴＳＩ寒天、ＬＩＭ寒天培地等を用
いた鑑別培養である。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】しかしながら、従来法
においては各培養段階で要する時間は１８〜２４時間で
あり、総所要時間にすると３〜４日となり、迅速性に乏
しい。また、赤痢菌の志賀毒素に対する特異抗体を用い
た逆受身ラテックス粒子凝集法、赤痢菌および腸管侵入
性大腸菌の病原性に関与する１４０メガダルトンのプラ
スミド産物に対する特異抗体を用いたＥＩＡ法（伊藤健
一郎ら、日本細菌学雑誌 41,414(1986) ）やｉｐａＢ遺
伝子、ｉｐａＣ遺伝子、またはｉｐａＤ遺伝子を検出し
ようとするＤＮＡプローブ法（U.S. patent Applicatio
n No. 888194）があるが、これらの試験法は、試薬およ
び検体の調製が複雑で面倒であり、しかも多大の時間を
要する。
においては各培養段階で要する時間は１８〜２４時間で
あり、総所要時間にすると３〜４日となり、迅速性に乏
しい。また、赤痢菌の志賀毒素に対する特異抗体を用い
た逆受身ラテックス粒子凝集法、赤痢菌および腸管侵入
性大腸菌の病原性に関与する１４０メガダルトンのプラ
スミド産物に対する特異抗体を用いたＥＩＡ法（伊藤健
一郎ら、日本細菌学雑誌 41,414(1986) ）やｉｐａＢ遺
伝子、ｉｐａＣ遺伝子、またはｉｐａＤ遺伝子を検出し
ようとするＤＮＡプローブ法（U.S. patent Applicatio
n No. 888194）があるが、これらの試験法は、試薬およ
び検体の調製が複雑で面倒であり、しかも多大の時間を
要する。
【０００５】そこで、本発明は、簡便、迅速かつ高感度
な新規な検出法を検疫、臨床検査、および食品検査に提
供することにある。
な新規な検出法を検疫、臨床検査、および食品検査に提
供することにある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明は、上記課題を解
決するため、オリゴヌクレオチドを核酸合成反応のプラ
イマーとして機能させた遺伝子増幅技術により赤痢菌の
志賀毒素遺伝子又は赤痢菌および腸管侵入性大腸菌のｉ
ｐａＨ、ｉｎｖＥを検出するものある。
決するため、オリゴヌクレオチドを核酸合成反応のプラ
イマーとして機能させた遺伝子増幅技術により赤痢菌の
志賀毒素遺伝子又は赤痢菌および腸管侵入性大腸菌のｉ
ｐａＨ、ｉｎｖＥを検出するものある。
【０００７】本発明で用いるオリゴヌクレオチドは、志
賀毒素遺伝子をコードするヌクレオチド配列を標的とす
る場合は、そのヌクレオチド配列と相補的となるように
化学合成されたオリゴヌクレオチドであって、合成ヌク
レオチドが以下の配列群の少なくとも連続した１０塩基
以上を含むオリゴヌクレオチド （５’）−ＣＡＡＣＡＣＴＧＧＡＴＧＡＴＣＴＣＡＧ−（３’） ・・・・・(a；配列番号１) （５’）−ＣＣＣＣＣＴＣＡＡＣＴＧＣＴＡＡＴＡ−（３’） ・・・・・(b；配列番号２) または対応する相補的配列からなり、検体中に存在する
赤痢菌（Shigella dysenteriae, Shigella flexneri,Sh
igel la boydii および Shigella sonnei）および腸管侵
入性大腸菌（enteroinvasiveEscherichia coli）に選択
的に存在しているｉｐａＨ遺伝子をコードするヌクレオ
チド配列を標的とする場合は、そのヌクレオチド配列と
相補的となるように化学合成されたオリゴヌクレオチド
であって、合成ヌクレオチドが以下の配列群の少なくと
も連続した１０塩基以上を含むオリゴヌクレオチド （５’）−ＴＧＴＡＴＣＡＣＡＧＡＴＡＴＧＧＣＡＴＧＣ−（３’） ・・・・(c；配列番号３) （５’）−ＴＣＣＧＧＡＧＡＴＴＧＴＴＣＣＡＴＧＴＧ−（３’） ・・・・・(d；配列番号４) または対応する相補的配列からなり、検体中に存在する
赤痢菌（Shigella dysenteriae, Shigella flexneri, S
hige lla boydii, および Shigella sonnei）および腸管
侵入性大腸菌（enteroinvasiveEscherichia coli）に選
択的に存在しているｉｎｖＥ遺伝子をコードするヌクレ
オチド配列を標的とする場合は、そのヌクレオチド配列
と相補的となるように化学合成されたオリゴヌクレオチ
ドであって、合成ヌクレオチドが以下の配列群の少なく
とも連続した１０塩基以上を含むオリゴヌクレオチド、 （５’）−ＣＡＡＧＡＴＴＴＡＡＣＣＴＴＣＧＴＣＡＡＣＣ−（３’） ・・・・・(e；配列番号５) （５’）−ＡＧＴＴＣＴＣＧＧＡＴＧＣＴＡＴＧＣＴＣ−（３’） ・・・・・(f；配列番号６) または対応する相補的配列からなる。
賀毒素遺伝子をコードするヌクレオチド配列を標的とす
る場合は、そのヌクレオチド配列と相補的となるように
化学合成されたオリゴヌクレオチドであって、合成ヌク
レオチドが以下の配列群の少なくとも連続した１０塩基
以上を含むオリゴヌクレオチド （５’）−ＣＡＡＣＡＣＴＧＧＡＴＧＡＴＣＴＣＡＧ−（３’） ・・・・・(a；配列番号１) （５’）−ＣＣＣＣＣＴＣＡＡＣＴＧＣＴＡＡＴＡ−（３’） ・・・・・(b；配列番号２) または対応する相補的配列からなり、検体中に存在する
赤痢菌（Shigella dysenteriae, Shigella flexneri,Sh
igel la boydii および Shigella sonnei）および腸管侵
入性大腸菌（enteroinvasiveEscherichia coli）に選択
的に存在しているｉｐａＨ遺伝子をコードするヌクレオ
チド配列を標的とする場合は、そのヌクレオチド配列と
相補的となるように化学合成されたオリゴヌクレオチド
であって、合成ヌクレオチドが以下の配列群の少なくと
も連続した１０塩基以上を含むオリゴヌクレオチド （５’）−ＴＧＴＡＴＣＡＣＡＧＡＴＡＴＧＧＣＡＴＧＣ−（３’） ・・・・(c；配列番号３) （５’）−ＴＣＣＧＧＡＧＡＴＴＧＴＴＣＣＡＴＧＴＧ−（３’） ・・・・・(d；配列番号４) または対応する相補的配列からなり、検体中に存在する
赤痢菌（Shigella dysenteriae, Shigella flexneri, S
hige lla boydii, および Shigella sonnei）および腸管
侵入性大腸菌（enteroinvasiveEscherichia coli）に選
択的に存在しているｉｎｖＥ遺伝子をコードするヌクレ
オチド配列を標的とする場合は、そのヌクレオチド配列
と相補的となるように化学合成されたオリゴヌクレオチ
ドであって、合成ヌクレオチドが以下の配列群の少なく
とも連続した１０塩基以上を含むオリゴヌクレオチド、 （５’）−ＣＡＡＧＡＴＴＴＡＡＣＣＴＴＣＧＴＣＡＡＣＣ−（３’） ・・・・・(e；配列番号５) （５’）−ＡＧＴＴＣＴＣＧＧＡＴＧＣＴＡＴＧＣＴＣ−（３’） ・・・・・(f；配列番号６) または対応する相補的配列からなる。
【０００８】遺伝子増幅は、Saiki らが開発したPolyme
rase Chain Reaction 法（以下、略してＰＣＲ法とい
う；Science 230, 1350(1985) ）をもとに行っている。
この方法は、ある特定のヌクレオチド配列領域（本発明
の場合は、赤痢菌の志賀毒素遺伝子又は赤痢菌および腸
管侵入性大腸菌のｉｐａＨ、ｉｎｖＥ）を検出する場
合、その領域の両端の一方は＋鎖を、他方は−鎖をそれ
ぞれ認識してハイブリダイゼーションするようなオリゴ
ヌクレオチドを用意し、それを熱変性により１本鎖状態
にした試料核酸に対し鋳型依存性ヌクレオチド重合反応
のプライマーとして機能させ、生成した２本鎖核酸を再
び１本鎖に分離し、再び同様な反応を起こさせる。この
一連の操作を繰り返すことで２つのプライマーに挟まれ
た領域は検出できるまでにコピー数が増大してくる。
rase Chain Reaction 法（以下、略してＰＣＲ法とい
う；Science 230, 1350(1985) ）をもとに行っている。
この方法は、ある特定のヌクレオチド配列領域（本発明
の場合は、赤痢菌の志賀毒素遺伝子又は赤痢菌および腸
管侵入性大腸菌のｉｐａＨ、ｉｎｖＥ）を検出する場
合、その領域の両端の一方は＋鎖を、他方は−鎖をそれ
ぞれ認識してハイブリダイゼーションするようなオリゴ
ヌクレオチドを用意し、それを熱変性により１本鎖状態
にした試料核酸に対し鋳型依存性ヌクレオチド重合反応
のプライマーとして機能させ、生成した２本鎖核酸を再
び１本鎖に分離し、再び同様な反応を起こさせる。この
一連の操作を繰り返すことで２つのプライマーに挟まれ
た領域は検出できるまでにコピー数が増大してくる。
【０００９】検体としては、臨床検査材料、例えば、糞
便、尿、血液、組織ホモジェネートなど、また、食品材
料でもよい。これら材料をＰＣＲの試料として用いるに
は、材料中に存在する菌体から核酸成分を遊離させる操
作が前処理として必要となる。しかし、プライマーがハ
イブリダイズできる核酸が数分子から数十分子以上存在
すればＰＣＲは進むので、検査材料を溶菌酵素、界面活
性剤、アルカリ等で短時間処理するだけでＰＣＲを進行
させるに十分な核酸量を持った試料液が調製できる。
便、尿、血液、組織ホモジェネートなど、また、食品材
料でもよい。これら材料をＰＣＲの試料として用いるに
は、材料中に存在する菌体から核酸成分を遊離させる操
作が前処理として必要となる。しかし、プライマーがハ
イブリダイズできる核酸が数分子から数十分子以上存在
すればＰＣＲは進むので、検査材料を溶菌酵素、界面活
性剤、アルカリ等で短時間処理するだけでＰＣＲを進行
させるに十分な核酸量を持った試料液が調製できる。
【００１０】本発明でプライマーとして用いられるオリ
ゴヌクレオチドは、選択性や検出感度および再現性から
考えて、１０塩基以上、望ましくは１５塩基以上の長さ
を持ったヌクレオチド断片で、化学合成あるいは天然の
どちらでもよい。また、プライマーは、特に検出用とし
て標識されていなくてもよい。
ゴヌクレオチドは、選択性や検出感度および再現性から
考えて、１０塩基以上、望ましくは１５塩基以上の長さ
を持ったヌクレオチド断片で、化学合成あるいは天然の
どちらでもよい。また、プライマーは、特に検出用とし
て標識されていなくてもよい。
【００１１】プライマーが規定している赤痢菌および腸
管侵入性大腸菌の遺伝子のヌクレオチド配列における増
幅領域は、５０塩基から２、０００塩基、望ましくは、
１００塩基から１、０００塩基となればよい。鋳型依存
性ヌクレオチド重合反応には、耐熱性ＤＮＡポリメラー
ゼを用いているが、この酵素の起源については９０〜９
５℃、プライマーをハイブリダイズさせるアニーリング
操作の温度は３７〜６５℃、重合反応は５０〜７５℃
で、これを１サイクルとしたＰＣＲを２０から４２サイ
クル行って増幅させる。
管侵入性大腸菌の遺伝子のヌクレオチド配列における増
幅領域は、５０塩基から２、０００塩基、望ましくは、
１００塩基から１、０００塩基となればよい。鋳型依存
性ヌクレオチド重合反応には、耐熱性ＤＮＡポリメラー
ゼを用いているが、この酵素の起源については９０〜９
５℃、プライマーをハイブリダイズさせるアニーリング
操作の温度は３７〜６５℃、重合反応は５０〜７５℃
で、これを１サイクルとしたＰＣＲを２０から４２サイ
クル行って増幅させる。
【００１２】検出はＰＣＲを終えた反応液をそのままア
ガロースゲル電気泳動にかけることで、増幅されたヌク
レオチド断片の存在、およびその長さが確認できる。そ
の結果から、検体中にプライマーが認識すべき配列を持
ったヌクレオチドが存在しているかどうか判定すること
ができる。この判定は、そのまま志賀毒素遺伝子又は赤
痢菌および腸管侵入性大腸菌のｉｐａＨ、ｉｎｖＥをも
つ赤痢菌の有無を判定するものとなる。増幅されたヌク
レオチド断片の検出には、その他の電気泳動やクロマト
グラフィーも有効である。
ガロースゲル電気泳動にかけることで、増幅されたヌク
レオチド断片の存在、およびその長さが確認できる。そ
の結果から、検体中にプライマーが認識すべき配列を持
ったヌクレオチドが存在しているかどうか判定すること
ができる。この判定は、そのまま志賀毒素遺伝子又は赤
痢菌および腸管侵入性大腸菌のｉｐａＨ、ｉｎｖＥをも
つ赤痢菌の有無を判定するものとなる。増幅されたヌク
レオチド断片の検出には、その他の電気泳動やクロマト
グラフィーも有効である。
【００１３】
【作用】本発明は、赤痢菌の志賀毒素遺伝子又は赤痢菌
および腸管侵入性大腸菌のｉｐａＨ、ｉｎｖＥと選択的
にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを作製し、こ
のオリゴヌクレオチドをプライマーとして遺伝子増幅に
用い、赤痢菌および腸管侵入性大腸菌のみを選択的に検
出する。
および腸管侵入性大腸菌のｉｐａＨ、ｉｎｖＥと選択的
にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを作製し、こ
のオリゴヌクレオチドをプライマーとして遺伝子増幅に
用い、赤痢菌および腸管侵入性大腸菌のみを選択的に検
出する。
【００１４】
（実施例１：赤痢菌の志賀毒素遺伝子の検出） ［実験例１］検体の調製 使用した赤痢菌（Shigella dysenteriae）の菌株は、患
者等から由来したもので、表１の総計４２株を用いた。
各菌株をＬＢ培地（１％トリプトン、０. ５％イースト
エクストラクト、および１％塩化ナトリウムに接種し、
３７℃、好気的条件下で、終夜振とう培養を行った。各
菌株培養液を１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液ｐＨ７. ５
（以下ＴＥ緩衝液）で１０倍に希釈し、９５℃で１０分
間の加熱処理を行った後、これらを遠心し、その上清を
検体とした。
者等から由来したもので、表１の総計４２株を用いた。
各菌株をＬＢ培地（１％トリプトン、０. ５％イースト
エクストラクト、および１％塩化ナトリウムに接種し、
３７℃、好気的条件下で、終夜振とう培養を行った。各
菌株培養液を１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液ｐＨ７. ５
（以下ＴＥ緩衝液）で１０倍に希釈し、９５℃で１０分
間の加熱処理を行った後、これらを遠心し、その上清を
検体とした。
【００１５】プライマーの合成 赤痢菌の志賀毒素遺伝子は、腸管出血性大腸菌（entero
hemorrhagic Escherichia coli;EHEC ）またはベロ毒素
産生性大腸菌（Verocytotoxin-producing Escherichia
coli; VTEC）の有するＶＴ１遺伝子とわずか数塩基が異
なるだけであり、同一の遺伝子とみなされている。そこ
で、文献（Takao, T et al., Microb. Pathog.,5:357-3
69 (1988））の中から請求項第１項に示した各配列を選
び、それと同じ配列を持つオリゴヌクレオチドを化学合
成した。化学合成は、サイクロンプラスＤＮＡ合成装置
（ミリジェン／バイオリサーチ社製）を用い、β−シア
ノエチルフォスホアミダイト法により行った。合成した
オリゴヌクレオチドの精製はＣ18逆相カラムを用いた高
速液体クロマトグラフィーで行った。
hemorrhagic Escherichia coli;EHEC ）またはベロ毒素
産生性大腸菌（Verocytotoxin-producing Escherichia
coli; VTEC）の有するＶＴ１遺伝子とわずか数塩基が異
なるだけであり、同一の遺伝子とみなされている。そこ
で、文献（Takao, T et al., Microb. Pathog.,5:357-3
69 (1988））の中から請求項第１項に示した各配列を選
び、それと同じ配列を持つオリゴヌクレオチドを化学合
成した。化学合成は、サイクロンプラスＤＮＡ合成装置
（ミリジェン／バイオリサーチ社製）を用い、β−シア
ノエチルフォスホアミダイト法により行った。合成した
オリゴヌクレオチドの精製はＣ18逆相カラムを用いた高
速液体クロマトグラフィーで行った。
【００１６】ＰＣＲ 前記検体液３μｌを用い、それに滅菌蒸留水１７. ０５
μｌ、１０ｘ反応用緩衝液３μｌ，ｄＮＴＰ溶液４. ８
μｌ、プライマー(1) １. ０μｌ、プライマー(2) １.
０μｌ、および耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ０. １５μｌ
を加えて、全量３０μｌの反応液を調製した。この反応
液の入った容器にミネラルオイル（SIGMA 社製）を５０
μｌ加え、反応液上に重層した。各使用した溶液の内
容、およびプライマー(1) と(2) の組合せは、次のとお
りである。
μｌ、１０ｘ反応用緩衝液３μｌ，ｄＮＴＰ溶液４. ８
μｌ、プライマー(1) １. ０μｌ、プライマー(2) １.
０μｌ、および耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ０. １５μｌ
を加えて、全量３０μｌの反応液を調製した。この反応
液の入った容器にミネラルオイル（SIGMA 社製）を５０
μｌ加え、反応液上に重層した。各使用した溶液の内
容、およびプライマー(1) と(2) の組合せは、次のとお
りである。
【００１７】10x 反応用緩衝液: 500mM KCl, 100mM Tri
s-HCl pH8.3, 15mM MgCl2 ,0.1%(w/V) ゼラチン ｄＮＴＰ溶液: dATP, dCTP, dGTP, dTTPを混合させたも
ので各終濃度が1.25mM プライマー(1) および(2): 前述した化学合成精製品の
水溶液（濃度3.75 OD/ml） プライマーの組合せ: 前述の化学合成精製品を下記のと
おりに組合せて使用した。
s-HCl pH8.3, 15mM MgCl2 ,0.1%(w/V) ゼラチン ｄＮＴＰ溶液: dATP, dCTP, dGTP, dTTPを混合させたも
ので各終濃度が1.25mM プライマー(1) および(2): 前述した化学合成精製品の
水溶液（濃度3.75 OD/ml） プライマーの組合せ: 前述の化学合成精製品を下記のと
おりに組合せて使用した。
【００１８】 プライマー(1) ＋ プライマー(2) (a) ＋ (b) 耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ: ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ
（5 unit/ml; PerkinElmer cetus 社製） 反応条件は、次のとおりである。
（5 unit/ml; PerkinElmer cetus 社製） 反応条件は、次のとおりである。
【００１９】熱変性：９４℃、１分 アニーリング：５５℃、１分 重合反応：７２℃、１分 熱変性からアニーリングを経て、重合反応に至る過程を
１サイクル（所要時間5.7 分）とし、これを３５サイク
ル（総所要時間約３時間）行った。これらの操作は、Ｄ
ＮＡサーマルサイクラー（Perkin Elmer Cetus社製）に
上記反応条件をプログラムして行った。
１サイクル（所要時間5.7 分）とし、これを３５サイク
ル（総所要時間約３時間）行った。これらの操作は、Ｄ
ＮＡサーマルサイクラー（Perkin Elmer Cetus社製）に
上記反応条件をプログラムして行った。
【００２０】検出 反応液から増幅されたヌクレオチド断片を検出するた
め、アガロースゲル電気泳動を以下のように行った。
め、アガロースゲル電気泳動を以下のように行った。
【００２１】アガロースゲルはゲル濃度３％（W/V ）と
し、臭化エチジウム（0.5 μl/ml）を含むものを用い
た。泳動の条件は定電圧１００Ｖ、３０分で行った。操
作方法ならびに他の条件は、Maniatis等著 Molecular C
loning 第２版（1989）に記載されている技法で行っ
た。反応液の他に分子量マーカーの泳動も同時に行い、
相対移動度の比較によりヌクレオチド断片の長さを算出
した。
し、臭化エチジウム（0.5 μl/ml）を含むものを用い
た。泳動の条件は定電圧１００Ｖ、３０分で行った。操
作方法ならびに他の条件は、Maniatis等著 Molecular C
loning 第２版（1989）に記載されている技法で行っ
た。反応液の他に分子量マーカーの泳動も同時に行い、
相対移動度の比較によりヌクレオチド断片の長さを算出
した。
【００２２】逆受身ラテックス凝集反応（Reversed Pas
sive Latex Agglutination；RPLA）試験 市販の大腸菌ベロトキシン検出用ＲＰＬＡキット（デン
カ生研製）を購入し、付属の使用説明書に従い検体を調
製して、試験を行った。
sive Latex Agglutination；RPLA）試験 市販の大腸菌ベロトキシン検出用ＲＰＬＡキット（デン
カ生研製）を購入し、付属の使用説明書に従い検体を調
製して、試験を行った。
【００２３】結果 前述したように赤痢菌の志賀毒素遺伝子は、すでに塩基
配列が決定されており、本発明のオリゴヌクレオチド、
すなわち、プライマーがＰＣＲにより増幅させるヌクレ
オチドの大きさは容易に推定できる。それによるとプラ
イマー(a) と(b) の組合せでは、３４９塩基（または３
４９塩基対）の長さのヌクレオチドが増幅されてくるは
ずである。これらの推定値と増幅されたヌクレオチドの
長さが一致した場合、このプライマーの組合せは、志賀
毒素遺伝子中の標的としている領域を正しく増幅してお
り、かつ、当該菌株は志賀毒素遺伝子を有していると判
断した。被験菌株３４株で調べた結果を表１に示す。本
発明のプライマーは、ＲＰＬＡ試験で、ベロ毒素すなわ
ち志賀毒素陽性と判断された菌株のＤＮＡのみを増幅
し、志賀毒素遺伝子陰性の菌株ＤＮＡとは全く反応しな
かった。すなわち、志賀毒素遺伝子を正しく増幅し、志
賀毒素遺伝子をもつ赤痢菌を正確に検出していることを
示している。
配列が決定されており、本発明のオリゴヌクレオチド、
すなわち、プライマーがＰＣＲにより増幅させるヌクレ
オチドの大きさは容易に推定できる。それによるとプラ
イマー(a) と(b) の組合せでは、３４９塩基（または３
４９塩基対）の長さのヌクレオチドが増幅されてくるは
ずである。これらの推定値と増幅されたヌクレオチドの
長さが一致した場合、このプライマーの組合せは、志賀
毒素遺伝子中の標的としている領域を正しく増幅してお
り、かつ、当該菌株は志賀毒素遺伝子を有していると判
断した。被験菌株３４株で調べた結果を表１に示す。本
発明のプライマーは、ＲＰＬＡ試験で、ベロ毒素すなわ
ち志賀毒素陽性と判断された菌株のＤＮＡのみを増幅
し、志賀毒素遺伝子陰性の菌株ＤＮＡとは全く反応しな
かった。すなわち、志賀毒素遺伝子を正しく増幅し、志
賀毒素遺伝子をもつ赤痢菌を正確に検出していることを
示している。
【００２４】
【表１】 ［実験例２］実験例１で得られた結果が志賀毒素遺伝子
に対して、選択的なものかどうかを確かめるため、臨床
検査において検査対象となる、赤痢菌以外の下痢症菌等
の遺伝子について本発明のプライマーが反応するかどう
かを調べた。方法は検体の調製法を除いて、実験例１で
示したものと同じである。
に対して、選択的なものかどうかを確かめるため、臨床
検査において検査対象となる、赤痢菌以外の下痢症菌等
の遺伝子について本発明のプライマーが反応するかどう
かを調べた。方法は検体の調製法を除いて、実験例１で
示したものと同じである。
【００２５】検体の調製 表２中に示した各菌株をそれぞれ適当な増菌培地に接種
し、３７℃、好気的、または嫌気的条件下で終夜培養を
行った（このうち嫌気的条件下で培養した菌株は、Clos
tridium perfringens 、Campylobacter jejuni、Campyl
obacter coli、Bacteroides flagilis、Bacteroides vu
lgatus、Lactobacillus acidophilus 、Bifidobacteriu
m adolescentisである）。各菌株培養液０. ５ｍｌから
遠心操作により、菌体を回収し、ＴＥ緩衝液で菌体を１
回洗浄した。この菌体に５０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７.
５に溶解したＮ- アセチルムラミニダーゼ溶液、および
アクロモペプチダーゼ溶液を各終濃度が５０μｇ／ｍ
ｌ、および１ｍｇ／ｍｌとなるように加え、３７℃で１
０分間処理し、溶菌した。ＴＥ緩衝液飽和でさせたフェ
ノールおよびクロロフォルムからなる混合液（混合比
１：１）を溶菌液に加えて、よく撹拌した。遠心後、上
層液を回収し、エタノール処理を行って、核酸成分を沈
澱させた。この沈澱物を１ｍｌのＴＥ緩衝液に溶かして
検体とした。また、ヒト胎盤由来ＤＮＡ（Human placen
ta DNA）は、１μｇ／ｍｌの濃度のものを調製し、これ
も同様にＰＣＲを行わせた。
し、３７℃、好気的、または嫌気的条件下で終夜培養を
行った（このうち嫌気的条件下で培養した菌株は、Clos
tridium perfringens 、Campylobacter jejuni、Campyl
obacter coli、Bacteroides flagilis、Bacteroides vu
lgatus、Lactobacillus acidophilus 、Bifidobacteriu
m adolescentisである）。各菌株培養液０. ５ｍｌから
遠心操作により、菌体を回収し、ＴＥ緩衝液で菌体を１
回洗浄した。この菌体に５０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７.
５に溶解したＮ- アセチルムラミニダーゼ溶液、および
アクロモペプチダーゼ溶液を各終濃度が５０μｇ／ｍ
ｌ、および１ｍｇ／ｍｌとなるように加え、３７℃で１
０分間処理し、溶菌した。ＴＥ緩衝液飽和でさせたフェ
ノールおよびクロロフォルムからなる混合液（混合比
１：１）を溶菌液に加えて、よく撹拌した。遠心後、上
層液を回収し、エタノール処理を行って、核酸成分を沈
澱させた。この沈澱物を１ｍｌのＴＥ緩衝液に溶かして
検体とした。また、ヒト胎盤由来ＤＮＡ（Human placen
ta DNA）は、１μｇ／ｍｌの濃度のものを調製し、これ
も同様にＰＣＲを行わせた。
【００２６】結果 表２にプライマーの組合せにおける試験結果を示す。本
発明のプライマーの組合せは、志賀毒素産生性赤痢菌お
よびベロ毒素１型産生性大腸菌のＤＮＡを除いて、下痢
症菌ＤＮＡをはじめとする種々のＤＮＡについて、それ
らのＤＮＡを増幅することはなかった。したがって、本
発明のオリゴヌクレオチド、すなわちプライマーは、志
賀毒素遺伝子を有する菌にのみ、選択的に反応するもの
と断言できる。なお、本発明の実施例で用いているアガ
ロースゲル電気泳動法を前述の条件で行えば、１００塩
基（または１００塩基対）以下の長さのヌクレオチドで
あれば、５から１０塩基（塩基対）、また、１００から
５００塩基（塩基対）の範囲のヌクレオチドであれば、
１０から２０塩基（塩基対）のヌクレオチドの長さの違
いを区別可能である。さらに、アクリルアミドなどをゲ
ル材に用いることで、ヌクレオチドの長さの測定精度を
向上させることができ、志賀毒素遺伝子の選択的検出に
おける信頼度は、さらに高まるものと考えられる。
発明のプライマーの組合せは、志賀毒素産生性赤痢菌お
よびベロ毒素１型産生性大腸菌のＤＮＡを除いて、下痢
症菌ＤＮＡをはじめとする種々のＤＮＡについて、それ
らのＤＮＡを増幅することはなかった。したがって、本
発明のオリゴヌクレオチド、すなわちプライマーは、志
賀毒素遺伝子を有する菌にのみ、選択的に反応するもの
と断言できる。なお、本発明の実施例で用いているアガ
ロースゲル電気泳動法を前述の条件で行えば、１００塩
基（または１００塩基対）以下の長さのヌクレオチドで
あれば、５から１０塩基（塩基対）、また、１００から
５００塩基（塩基対）の範囲のヌクレオチドであれば、
１０から２０塩基（塩基対）のヌクレオチドの長さの違
いを区別可能である。さらに、アクリルアミドなどをゲ
ル材に用いることで、ヌクレオチドの長さの測定精度を
向上させることができ、志賀毒素遺伝子の選択的検出に
おける信頼度は、さらに高まるものと考えられる。
【００２７】
【表２】 （実施例２：赤痢菌および腸管侵入性大腸菌のｉｐａＨ
遺伝子の検出） ［実験例１］検体の調整 赤痢菌および腸管侵入性大腸菌の菌株として表３の３４
１株を用いた以外は、実施例１と同様の手法で検体を調
整した。
遺伝子の検出） ［実験例１］検体の調整 赤痢菌および腸管侵入性大腸菌の菌株として表３の３４
１株を用いた以外は、実施例１と同様の手法で検体を調
整した。
【００２８】プライマーの合成 文献（Hartman, A. B., et al., J. Bacteriol., 172,
1905-1915, 1990 、Venkatesan, M. M.,et al., Mol. M
icrobiol. 5, 2435-2446 1991 ）に記載された赤痢菌お
よび腸管侵入性大腸菌のｉｐａＨ遺伝子の塩基配列か
ら、請求項第２項に示した各配列を選び、それと同じ配
列を持つオリゴヌクレオチドを化学合成した。化学合成
は、サイクロンプラスＤＮＡ合成装置（ミリジェン／バ
イオリサーチ社製）を用い、β−シアノエチルフォスホ
アミダイト法により行った。合成したオリゴヌクレオチ
ドの精製はＣ18逆相カラムを用いた高速液体クロマトグ
ラフィーで行った。
1905-1915, 1990 、Venkatesan, M. M.,et al., Mol. M
icrobiol. 5, 2435-2446 1991 ）に記載された赤痢菌お
よび腸管侵入性大腸菌のｉｐａＨ遺伝子の塩基配列か
ら、請求項第２項に示した各配列を選び、それと同じ配
列を持つオリゴヌクレオチドを化学合成した。化学合成
は、サイクロンプラスＤＮＡ合成装置（ミリジェン／バ
イオリサーチ社製）を用い、β−シアノエチルフォスホ
アミダイト法により行った。合成したオリゴヌクレオチ
ドの精製はＣ18逆相カラムを用いた高速液体クロマトグ
ラフィーで行った。
【００２９】ＰＣＲ プライマーの組合せとして、下記の組合せを用いた以外
は、実施例１と同様の反応条件でＰＣＲを行った。
は、実施例１と同様の反応条件でＰＣＲを行った。
【００３０】 プライマー(1) ＋ プライマー(2) (c) ＋ (d) 検出 実施例１と同様の方法で行った。
【００３１】コロニーハイブリダイゼーション試験 ｉｐａＨ 遺伝子に特異的なオリゴヌクレオチドプローブ
を用いて、Grunsteinの方法（Grunstein, M. and Hogne
ss, D., Proc. Natl. Acad. Sci. 72, 3961 (1975) ）
にしたがって行った。
を用いて、Grunsteinの方法（Grunstein, M. and Hogne
ss, D., Proc. Natl. Acad. Sci. 72, 3961 (1975) ）
にしたがって行った。
【００３２】結果 前述したように赤痢菌および腸管侵入性大腸菌のｉｐａ
Ｈ遺伝子は、すでに塩基配列が決定されており、本発明
のオリゴヌクレオチド、すなわち、プライマーがＰＣＲ
により増幅させるヌクレオチドの大きさは容易に推定で
きる。それによるとプライマー(c) と(d) の組合せで
は、２４２塩基（または２４２塩基対）の長さのヌクレ
オチドが増幅されてくるはずである。これらの推定値と
増幅されたヌクレオチドの長さが一致した場合、このプ
ライマーの組合せは、ｉｐａＨ遺伝子中の標的としてい
る領域を正しく増幅しており、かつ、当該菌株はｉｐａ
Ｈ遺伝子を有していると判断した。被験菌株３４７株で
調べた結果を表３に示す。本発明のプライマーは、コロ
ニーハイブリダイゼーション試験で、ｉｐａＨ遺伝子陽
性と判断された菌株のＤＮＡのみを増幅し、ｉｐａＨ遺
伝子陰性の菌株ＤＮＡとは全く反応しなかった。すなわ
ち、ｉｐａＨ遺伝子を正しく増幅し、ｉｐａＨ遺伝子を
もつ赤痢菌および腸管侵入性大腸菌を正確に検出してい
ることを示している。
Ｈ遺伝子は、すでに塩基配列が決定されており、本発明
のオリゴヌクレオチド、すなわち、プライマーがＰＣＲ
により増幅させるヌクレオチドの大きさは容易に推定で
きる。それによるとプライマー(c) と(d) の組合せで
は、２４２塩基（または２４２塩基対）の長さのヌクレ
オチドが増幅されてくるはずである。これらの推定値と
増幅されたヌクレオチドの長さが一致した場合、このプ
ライマーの組合せは、ｉｐａＨ遺伝子中の標的としてい
る領域を正しく増幅しており、かつ、当該菌株はｉｐａ
Ｈ遺伝子を有していると判断した。被験菌株３４７株で
調べた結果を表３に示す。本発明のプライマーは、コロ
ニーハイブリダイゼーション試験で、ｉｐａＨ遺伝子陽
性と判断された菌株のＤＮＡのみを増幅し、ｉｐａＨ遺
伝子陰性の菌株ＤＮＡとは全く反応しなかった。すなわ
ち、ｉｐａＨ遺伝子を正しく増幅し、ｉｐａＨ遺伝子を
もつ赤痢菌および腸管侵入性大腸菌を正確に検出してい
ることを示している。
【００３３】
【表３−１】
【００３４】
【表３−２】
【００３５】
【表３−３】
【００３６】
【表３−４】
【００３７】
【表３−５】
【００３８】
【表３−６】
【００３９】
【表３−７】 ［実験例２］実験例１で得られた結果がｉｐａＨ遺伝子
に対して、選択的なものかどうかを確かめるため、臨床
検査において検査対象となる、赤痢菌および腸管侵入性
大腸菌以外の下痢症菌等の遺伝子について本発明のプラ
イマーが反応するかどうかを調べた。方法は検体の調製
法を除いて、実験例１で示したものと同じである。
に対して、選択的なものかどうかを確かめるため、臨床
検査において検査対象となる、赤痢菌および腸管侵入性
大腸菌以外の下痢症菌等の遺伝子について本発明のプラ
イマーが反応するかどうかを調べた。方法は検体の調製
法を除いて、実験例１で示したものと同じである。
【００４０】検体の調製 表４中に示した各菌株を実施例１の実験例２と同様の手
法で行った。
法で行った。
【００４１】結果 表４にプライマーの組合せにおける試験結果を示す。本
発明のプライマーの組合せは、赤痢菌および腸管侵入性
大腸菌のＤＮＡを除いて、下痢症菌ＤＮＡをはじめとす
る種々のＤＮＡについて、それらのＤＮＡを増幅するこ
とはなかった。したがって、本発明のオリゴヌクレオチ
ド、すなわちプライマーは、ｉｐａＨ遺伝子を有する菌
にのみ、選択的に反応するものと断言できる。
発明のプライマーの組合せは、赤痢菌および腸管侵入性
大腸菌のＤＮＡを除いて、下痢症菌ＤＮＡをはじめとす
る種々のＤＮＡについて、それらのＤＮＡを増幅するこ
とはなかった。したがって、本発明のオリゴヌクレオチ
ド、すなわちプライマーは、ｉｐａＨ遺伝子を有する菌
にのみ、選択的に反応するものと断言できる。
【００４２】
【表４−１】 （実施例３：赤痢菌および腸管侵入性大腸菌のｉｎｖＥ
遺伝子の検出） ［実験例１］検体の調整 赤痢菌および腸管侵入性大腸菌の菌株として表３の３４
１株を用いた以外は、実施例１と同様の手法で検体を調
整した。
遺伝子の検出） ［実験例１］検体の調整 赤痢菌および腸管侵入性大腸菌の菌株として表３の３４
１株を用いた以外は、実施例１と同様の手法で検体を調
整した。
【００４３】プライマーの合成 文献（Watanabe, H. et al., J. Bacteriol., 172, 619
-629, 1990）に記載された赤痢菌および腸管侵入性大腸
菌のｉｎｖＥ遺伝子の塩基配列から、請求項第３項に示
した各配列を選び、それと同じ配列を持つオリゴヌクレ
オチドを化学合成した。化学合成は、サイクロンプラス
ＤＮＡ合成装置（ミリジェン／バイオリサーチ社製）を
用い、β−シアノエチルフォスホアミダイト法により行
った。合成したオリゴヌクレオチドの精製はＣ18逆相カ
ラムを用いた高速液体クロマトグラフィーで行った。
-629, 1990）に記載された赤痢菌および腸管侵入性大腸
菌のｉｎｖＥ遺伝子の塩基配列から、請求項第３項に示
した各配列を選び、それと同じ配列を持つオリゴヌクレ
オチドを化学合成した。化学合成は、サイクロンプラス
ＤＮＡ合成装置（ミリジェン／バイオリサーチ社製）を
用い、β−シアノエチルフォスホアミダイト法により行
った。合成したオリゴヌクレオチドの精製はＣ18逆相カ
ラムを用いた高速液体クロマトグラフィーで行った。
【００４４】ＰＣＲ プライマーの組合せとして、下記の組合せを用いた以外
は、実施例１と同様の反応条件でＰＣＲを行った。
は、実施例１と同様の反応条件でＰＣＲを行った。
【００４５】 プライマー(1) ＋ プライマー(2) (e) ＋ (f) 検出 実施例１と同様の方法で行った。
【００４６】コロニーハイブリダイゼーション試験 ｉｎｖＥ 遺伝子に特異的なオリゴヌクレオチドプローブ
を用いて、Grunsteinの方法（Grunstein, M. and Hogne
ss, D., Proc. Natl. Acad. Sci. 72, 3961 (1975) ）
にしたがって行った。
を用いて、Grunsteinの方法（Grunstein, M. and Hogne
ss, D., Proc. Natl. Acad. Sci. 72, 3961 (1975) ）
にしたがって行った。
【００４７】結果 前述したように赤痢菌および腸管侵入性大腸菌のｉｎｖ
Ｅ遺伝子は、すでに塩基配列が決定されており、本発明
のオリゴヌクレオチド、すなわち、プライマーがＰＣＲ
により増幅させるヌクレオチドの大きさは容易に推定で
きる。それによるとプライマー(e) と(f) の組合せで
は、２９３塩基（または２９３塩基対）の長さのヌクレ
オチドが増幅されてくるはずである。これらの推定値と
増幅されたヌクレオチドの長さが一致した場合、このプ
ライマーの組合せは、ｉｎｖＥ遺伝子中の標的としてい
る領域を正しく増幅しており、かつ、当該菌株はｉｎｖ
Ｅ遺伝子を有していると判断した。被験菌株３４７株で
調べた結果を表５に示す。本発明のプライマーは、コロ
ニーハイブリダイゼーション試験で、ｉｎｖＥ遺伝子陽
性と判断された菌株のＤＮＡのみを増幅し、ｉｎｖＥ遺
伝子陰性の菌株ＤＮＡとは全く反応しなかった。すなわ
ち、ｉｎｖＥ遺伝子を正しく増幅し、ｉｎｖＥ遺伝子を
もつ赤痢菌および腸管侵入性大腸菌を正確に検出してい
ることを示している。
Ｅ遺伝子は、すでに塩基配列が決定されており、本発明
のオリゴヌクレオチド、すなわち、プライマーがＰＣＲ
により増幅させるヌクレオチドの大きさは容易に推定で
きる。それによるとプライマー(e) と(f) の組合せで
は、２９３塩基（または２９３塩基対）の長さのヌクレ
オチドが増幅されてくるはずである。これらの推定値と
増幅されたヌクレオチドの長さが一致した場合、このプ
ライマーの組合せは、ｉｎｖＥ遺伝子中の標的としてい
る領域を正しく増幅しており、かつ、当該菌株はｉｎｖ
Ｅ遺伝子を有していると判断した。被験菌株３４７株で
調べた結果を表５に示す。本発明のプライマーは、コロ
ニーハイブリダイゼーション試験で、ｉｎｖＥ遺伝子陽
性と判断された菌株のＤＮＡのみを増幅し、ｉｎｖＥ遺
伝子陰性の菌株ＤＮＡとは全く反応しなかった。すなわ
ち、ｉｎｖＥ遺伝子を正しく増幅し、ｉｎｖＥ遺伝子を
もつ赤痢菌および腸管侵入性大腸菌を正確に検出してい
ることを示している。
【００４８】
【表５−１】
【００４９】
【表５−２】
【００５０】
【表５−３】
【００５１】
【表５−４】
【００５２】
【表５−５】
【００５３】
【表５−６】
【００５４】
【表５−７】 ［実験例２］実験例１で得られた結果がｉｎｖＥ遺伝子
に対して、選択的なものかどうかを確かめるため、臨床
検査において検査対象となる、赤痢菌および腸管侵入性
大腸菌以外の下痢症菌等の遺伝子について本発明のプラ
イマーが反応するかどうかを調べた。方法は検体の調製
法を除いて、実験例１で示したものと同じである。
に対して、選択的なものかどうかを確かめるため、臨床
検査において検査対象となる、赤痢菌および腸管侵入性
大腸菌以外の下痢症菌等の遺伝子について本発明のプラ
イマーが反応するかどうかを調べた。方法は検体の調製
法を除いて、実験例１で示したものと同じである。
【００５５】検体の調製 表６中に示した各菌株を実施例１の実験例２と同様の手
法で行った。
法で行った。
【００５６】結果 表６にプライマーの組合せにおける試験結果を示す。本
発明のプライマーの組合せは、赤痢菌および腸管侵入性
大腸菌のＤＮＡを除いて、下痢症菌ＤＮＡをはじめとす
る種々のＤＮＡについて、それらのＤＮＡを増幅するこ
とはなかった。したがって、本発明のオリゴヌクレオチ
ド、すなわちプライマーは、ｉｎｖＥ遺伝子を有する菌
にのみ、選択的に反応するものと断言できる。
発明のプライマーの組合せは、赤痢菌および腸管侵入性
大腸菌のＤＮＡを除いて、下痢症菌ＤＮＡをはじめとす
る種々のＤＮＡについて、それらのＤＮＡを増幅するこ
とはなかった。したがって、本発明のオリゴヌクレオチ
ド、すなわちプライマーは、ｉｎｖＥ遺伝子を有する菌
にのみ、選択的に反応するものと断言できる。
【００５７】
【表６−１】
【００５８】
【発明の効果】本発明では、ＰＣＲ法を用いたこと、お
よび赤痢菌の一病原因子である志賀毒素の遺伝子又はｉ
ｐａＨ、ｉｎｖＥ遺伝子を標的とするプライマーを用い
たことにより、志賀毒素遺伝子を有する菌の検出におい
て、遺伝子増幅作用による高い検出感度と、２つ、ある
いは、それ以上の数のプライマーで反応が規定されるこ
とによる高い選択性とが得られる。また、検出感度が高
いので、多量の検体を必要とせず、検体の前処理も簡便
で済む。本発明における実施例では、反応時間３時間、
検出にかかる操作が３０分であった。そのうえ、検出に
アガロースゲル電気泳動法と臭化エチジウムによる核酸
染色法を用いることで、プライマー等を標識せずに検出
が行える。しかも増幅されたヌクレオチドの長さを確認
できるので、試験結果の信頼性は高いものとなる。
よび赤痢菌の一病原因子である志賀毒素の遺伝子又はｉ
ｐａＨ、ｉｎｖＥ遺伝子を標的とするプライマーを用い
たことにより、志賀毒素遺伝子を有する菌の検出におい
て、遺伝子増幅作用による高い検出感度と、２つ、ある
いは、それ以上の数のプライマーで反応が規定されるこ
とによる高い選択性とが得られる。また、検出感度が高
いので、多量の検体を必要とせず、検体の前処理も簡便
で済む。本発明における実施例では、反応時間３時間、
検出にかかる操作が３０分であった。そのうえ、検出に
アガロースゲル電気泳動法と臭化エチジウムによる核酸
染色法を用いることで、プライマー等を標識せずに検出
が行える。しかも増幅されたヌクレオチドの長さを確認
できるので、試験結果の信頼性は高いものとなる。
【００５９】赤痢菌の検査には、発見患者の迅速・適切
な治療および防疫措置のために、遅滞のない正確な結果
が要求される。また、本発明は、赤痢菌の病原因子の一
つである志賀毒素の遺伝子又はｉｐａＨ、ｉｎｖＥ遺伝
子を選択的に検出するものである。したがって、本発明
により、起因菌としての赤痢菌の検出を正確に行うこと
が可能となる。
な治療および防疫措置のために、遅滞のない正確な結果
が要求される。また、本発明は、赤痢菌の病原因子の一
つである志賀毒素の遺伝子又はｉｐａＨ、ｉｎｖＥ遺伝
子を選択的に検出するものである。したがって、本発明
により、起因菌としての赤痢菌の検出を正確に行うこと
が可能となる。
【００６０】
配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）；１ 配列の長さ １９塩基 配列の型 核酸 鎖の数 一本鎖 トポロジー 直鎖状 配列の種類 Genomic DNA ハイポセティカル配列 ＮＯ アンチセンス ＮＯ 起源 Shigella dysenteriae type 1 配列の特徴 特徴を決定した方法 Ｓ 配列 ＣＡＡＣＡＣＴＧＧＡＴＧＡＴＣＴＣＡＧ
【００６１】配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）；２ 配列の長さ １８塩基 配列の型 核酸 鎖の数 一本鎖 トポロジー 直鎖状 配列の種類 Genomic DNA ハイポセティカル配列 ＮＯ アンチセンス ＮＯ 起源 Shigella dysenteriae type 1 配列の特徴 特徴を決定した方法 Ｓ 配列 ＣＣＣＣＣＴＣＡＡＣＴＧＣＴＡＡＴＡ
【００６２】配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）；３ 配列の長さ ２１塩基 配列の型 核酸 鎖の数 一本鎖 トポロジー 直鎖状 配列の種類 Genomic DNA ハイポセティカル配列 ＮＯ アンチセンス ＮＯ 起源 Shigella dysenteriae, Shigella flexneri,
Shigella boydiiおよび Shigella sonnei 配列の特徴 特徴を決定した方法 Ｓ 配列 ＴＧＴＡＴＣＡＣＡＧＡＴＡＴＧＧＣＡＴＧＣ
Shigella boydiiおよび Shigella sonnei 配列の特徴 特徴を決定した方法 Ｓ 配列 ＴＧＴＡＴＣＡＣＡＧＡＴＡＴＧＧＣＡＴＧＣ
【００６３】配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）；４ 配列の長さ ２０塩基 配列の型 核酸 鎖の数 一本鎖 トポロジー 直鎖状 配列の種類 Genomic DNA ハイポセティカル配列 ＮＯ アンチセンス ＮＯ 起源 Shigella dysenteriae, Shigella flexneri,
Shigella boydiiおよび Shigella sonnei 配列の特徴 特徴を決定した方法 Ｓ 配列 ＴＣＣＧＧＡＧＡＴＴＧＴＴＣＣＡＴＧＴＧ
Shigella boydiiおよび Shigella sonnei 配列の特徴 特徴を決定した方法 Ｓ 配列 ＴＣＣＧＧＡＧＡＴＴＧＴＴＣＣＡＴＧＴＧ
【００６４】配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）；５ 配列の長さ ２２塩基 配列の型 核酸 鎖の数 一本鎖 トポロジー 直鎖状 配列の種類 Genomic DNA ハイポセティカル配列 ＮＯ アンチセンス ＮＯ 起源 Shigella dysenteriae, Shigella flexneri,
Shigella boydiiおよび Shigella sonnei 配列の特徴 特徴を決定した方法 Ｓ 配列 ＣＡＡＧＡＴＴＴＡＡＣＣＴＴＣＧＴＣＡＡＣＣ
Shigella boydiiおよび Shigella sonnei 配列の特徴 特徴を決定した方法 Ｓ 配列 ＣＡＡＧＡＴＴＴＡＡＣＣＴＴＣＧＴＣＡＡＣＣ
【００６５】配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）；６ 配列の長さ ２０塩基 配列の型 核酸 鎖の数 一本鎖 トポロジー 直鎖状 配列の種類 Genomic DNA ハイポセティカル配列 ＮＯ アンチセンス ＮＯ 起源 Shigella dysenteriae, Shigella flexneri,
Shigella boydiiおよび Shigella sonnei 配列の特徴 特徴を決定した方法 Ｓ 配列 ＡＧＴＴＣＴＣＧＧＡＴＧＣＴＡＴＧＣＴＣ
Shigella boydiiおよび Shigella sonnei 配列の特徴 特徴を決定した方法 Ｓ 配列 ＡＧＴＴＣＴＣＧＧＡＴＧＣＴＡＴＧＣＴＣ
Claims (4)
- 【請求項１】 検体中に存在するＡ亜群赤痢菌血清型１
（Shigella dysente riae type 1）の菌株が産生する毒
素の遺伝子（志賀毒素遺伝子）をコードするヌクレオチ
ド配列を標的とし、そのヌクレオチド配列と相補的とな
るように化学合成されたオリゴヌクレオチドであって、
合成ヌクレオチドが以下の配列群の少なくとも連続した
１０塩基以上を含むオリゴヌクレオチド （５’）−ＣＡＡＣＡＣＴＧＧＡＴＧＡＴＣＴＣＡＧ−（３’）・・・・(a) （５’）−ＣＣＣＣＣＴＣＡＡＣＴＧＣＴＡＡＴＡ−（３’）・・・・・(b) または対応する相補的配列からなることを特徴とするオ
リゴヌクレオチド。 - 【請求項２】 検体中に存在する赤痢菌（Shigella dys
enteriae, Shigella flexneri,Shigella boydii および
Shigella sonnei）および腸管侵入性大腸菌（enteroinv
asive Escherichia coli）に選択的に存在しているｉ
ｐａＨ遺伝子をコードするヌクレオチド配列を標的と
し、そのヌクレオチド配列と相補的となるように化学合
成されたオリゴヌクレオチドであって、合成ヌクレオチ
ドが以下の配列群の少なくとも連続した１０塩基以上を
含むオリゴヌクレオチド （５’）−ＴＧＴＡＴＣＡＣＡＧＡＴＡＴＧＧＣＡＴＧＣ−（３’）・・(c) （５’）−ＴＣＣＧＧＡＧＡＴＴＧＴＴＣＣＡＴＧＴＧ−（３’）・・・(d) または対応する相補的配列からなることを特徴とするオ
リゴヌクレオチド。 - 【請求項３】 検体中に存在する赤痢菌（Shigella dys
enteriae, Shigella flexneri, Shigella boydii, およ
び Shigella sonnei）および腸管侵入性大腸菌（entero
invasiveEscherichia coli）に選択的に存在しているｉ
ｎｖＥ遺伝子をコードするヌクレオチド配列を標的と
し、そのヌクレオチド配列と相補的となるように化学合
成されたオリゴヌクレオチドであって、合成ヌクレオチ
ドが以下の配列群の少なくとも連続した１０塩基以上を
含むオリゴヌクレオチド （５’）−ＣＡＡＧＡＴＴＴＡＡＣＣＴＴＣＧＴＣＡＡＣＣ−（３’） ・・・・(e) （５’）−ＡＧＴＴＣＴＣＧＧＡＴＧＣＴＡＴＧＣＴＣ−（３’） ・・・・・・(f) または対応する相補的配列からなることを特徴とするオ
リゴヌクレオチド。 - 【請求項４】 請求項第１項〜第３項に記載されたオリ
ゴヌクレオチドの配列のうちの一つを有するオリゴヌク
レオチドの配列を選択的に増幅させることを特徴とする
方法であって、 (a)検体中の１本の鎖状態の標的ヌクレオチド配列にプ
ライマーをハイブリダイズさせ、４種のヌクレオチドの
重合反応により鎖長反応を行わせ、 (b)得られた２本鎖ヌクレオチド配列を１本鎖に分離し
た場合、その相補鎖は他方のプライマーによる鎖長反応
の鋳型として機能し、 (c)これら２種のプライマーによる同時鎖長反応、鎖長
生成物の鋳型からの分離、そして新たなプライマーによ
るハイブリダイゼーションを繰り返すことにより、特定
のヌクレオチド配列を増幅させ、検出し、 (d)その結果、前記検体中に認識されるべき配列が存在
しているか否かを判定することで、赤痢菌の検出を行う
ことを特徴とする方法。
Priority Applications (7)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP06048174A JP3141976B2 (ja) | 1994-02-28 | 1994-03-18 | 赤痢菌検出のためのオリゴヌクレオチドおよびそれを用いた検出法 |
| EP94116416A EP0669399B1 (en) | 1994-02-28 | 1994-10-18 | Oligonucleotides and method for detecting bacteria |
| DE69433201T DE69433201T2 (de) | 1994-02-28 | 1994-10-18 | Oligonukleotide und Verfahren zum Nachweis von Bakterien |
| EP00111578A EP1036846A3 (en) | 1994-02-28 | 1994-10-18 | Oligonucleotides for detecting bacteria and detection process |
| US08/328,710 US5795717A (en) | 1994-02-28 | 1994-10-25 | Oligonucleotides for detecting bacteria and detection process |
| US08/968,046 US6218110B1 (en) | 1994-02-28 | 1997-11-12 | Oligonucleotides for detecting verotoxin-producing E. coli and detection process |
| US10/138,381 US20030064388A1 (en) | 1994-02-28 | 2002-05-06 | Oligonucleotides for detecting bacteria and detection process |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3027694 | 1994-02-28 | ||
| JP6-30276 | 1994-02-28 | ||
| JP06048174A JP3141976B2 (ja) | 1994-02-28 | 1994-03-18 | 赤痢菌検出のためのオリゴヌクレオチドおよびそれを用いた検出法 |
Related Child Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP22499998A Division JP3331977B2 (ja) | 1994-02-28 | 1998-08-07 | 赤痢菌検出のためのオリゴヌクレオチドおよびそれを用いた検出法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH07284400A true JPH07284400A (ja) | 1995-10-31 |
| JP3141976B2 JP3141976B2 (ja) | 2001-03-07 |
Family
ID=26368602
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP06048174A Expired - Lifetime JP3141976B2 (ja) | 1994-02-28 | 1994-03-18 | 赤痢菌検出のためのオリゴヌクレオチドおよびそれを用いた検出法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3141976B2 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111662994A (zh) * | 2020-07-20 | 2020-09-15 | 嘉兴市疾病预防控制中心 | 一种基于荧光pcr技术的志贺氏菌检测和分型用引物组、试剂盒及其应用 |
-
1994
- 1994-03-18 JP JP06048174A patent/JP3141976B2/ja not_active Expired - Lifetime
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111662994A (zh) * | 2020-07-20 | 2020-09-15 | 嘉兴市疾病预防控制中心 | 一种基于荧光pcr技术的志贺氏菌检测和分型用引物组、试剂盒及其应用 |
| CN111662994B (zh) * | 2020-07-20 | 2023-06-02 | 嘉兴市疾病预防控制中心 | 一种基于荧光pcr技术的志贺氏菌检测和分型用引物组、试剂盒及其应用 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP3141976B2 (ja) | 2001-03-07 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Olive | Detection of enterotoxigenic Escherichia coli after polymerase chain reaction amplification with a thermostable DNA polymerase | |
| US5795717A (en) | Oligonucleotides for detecting bacteria and detection process | |
| EP0556504B1 (en) | Oligonucleotides for detecting Vibrio parahaemolyticus | |
| Watterworth et al. | Multiplex PCR-DNA probe assay for the detection of pathogenic Escherichia coli | |
| JP2792462B2 (ja) | サルモネラ属菌検出のためのオリゴヌクレオチドおよびそれを用いた検出法 | |
| JP2775663B2 (ja) | 細菌検出のためのオリゴヌクレオチドおよびそれを用いた検出法 | |
| US6165724A (en) | Oligonucleotides for detecting enteric hemorrhagic E.coli and detection method using the same | |
| WO2021201091A1 (ja) | クレブシエラ属細菌の検出のためのプライマーセット及びプローブ | |
| JP3141976B2 (ja) | 赤痢菌検出のためのオリゴヌクレオチドおよびそれを用いた検出法 | |
| JP3134907B2 (ja) | コレラ菌検出用オリゴヌクレオチドおよびそれを用いた検出法 | |
| JP3414261B2 (ja) | 病原性大腸菌ｏ１５７検出のためのオリゴヌクレオチドおよびそれを用いた検出法 | |
| JP3331977B2 (ja) | 赤痢菌検出のためのオリゴヌクレオチドおよびそれを用いた検出法 | |
| WO2005028679A2 (en) | Method and kit for identifying vancomycin-resistant enterococcus | |
| JP2885081B2 (ja) | エンテロトキシン産生性のウェルシュ菌を検出するためのオリゴヌクレオチドおよびそれを用いた検出法 | |
| JP3419299B2 (ja) | ウエルシュ菌検出用オリゴヌクレオチドおよびそれを用いた検出法 | |
| JPH119281A (ja) | 細菌検出のためのオリゴヌクレオチドおよびそれを用いた検出法 | |
| JPH04293486A (ja) | 細菌検出のためのオリゴヌクレオチドおよびそれを用いた検出法 | |
| JPH03112498A (ja) | カンピロバクター検出のためのオリゴヌクレオチドおよびそれを用いた検出方法 | |
| JP2993314B2 (ja) | 黄色ブドウ球菌検出のためのオリゴヌクレオチドおよびそれを用いた検出法 | |
| JPH11332598A (ja) | ベロ毒素産生性大腸菌検出のためのオリゴヌクレオチドおよびそれを用いた検出法 | |
| JPH07114720B2 (ja) | 毒素原性大腸菌検出のためのオリゴヌクレオチドおよびそれを用いた検出法 | |
| JPH05317098A (ja) | 黄色ブドウ球菌検出のためのオリゴヌクレオチドおよびそれを用いた検出法 | |
| JPH05227999A (ja) | 毒素原性大腸菌検出のためのオリゴヌクレオチドおよびそれを用いた検出法 | |
| JPH07236500A (ja) | サルモネラ属菌検出のためのオリゴヌクレオチドおよびそれを用いた検出法 | |
| JPH0789957B2 (ja) | 腸炎ビブリオ菌検出のためのオリゴヌクレオチドおよびそれを用いた検出法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20071222 Year of fee payment: 7 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20081222 Year of fee payment: 8 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20091222 Year of fee payment: 9 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20091222 Year of fee payment: 9 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20101222 Year of fee payment: 10 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20111222 Year of fee payment: 11 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20121222 Year of fee payment: 12 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20121222 Year of fee payment: 12 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20131222 Year of fee payment: 13 |
|
| EXPY | Cancellation because of completion of term |