JPH07284400A - 赤痢菌検出のためのオリゴヌクレオチドおよびそれを用いた検出法 - Google Patents
赤痢菌検出のためのオリゴヌクレオチドおよびそれを用いた検出法Info
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- JPH07284400A JPH07284400A JP6048174A JP4817494A JPH07284400A JP H07284400 A JPH07284400 A JP H07284400A JP 6048174 A JP6048174 A JP 6048174A JP 4817494 A JP4817494 A JP 4817494A JP H07284400 A JPH07284400 A JP H07284400A
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Abstract
たはipaH遺伝子及びinvE遺伝子を検出すること
を目的とする。 【構成】 検体中に存在する赤痢菌の志賀毒素遺伝子ま
たはipaH遺伝子及びinvE遺伝子と選択的にハイ
ブリダイズするオリゴヌクレオチド(配列番号1〜6)
を作製し、このオリゴヌクレオチドをプライマーとして
遺伝子増幅に用い、食中毒症状を起こす赤痢菌の志賀毒
素遺伝子またはipaH遺伝子及びinvE遺伝子のみ
を選択的に検出することを特徴としている。
Description
に食中毒または細菌性下痢症にかかる検査、あるいは食
品検査での赤痢菌の検出に関するものである。
衛生に関して重要で、従来にあっては次の工程による検
出を行っていた。
DHL寒天、マッコンキー寒天等の培地を用いた分離培
養を行い、その後、TSI寒天、LIM寒天培地等を用
いた鑑別培養である。
においては各培養段階で要する時間は18〜24時間で
あり、総所要時間にすると3〜4日となり、迅速性に乏
しい。また、赤痢菌の志賀毒素に対する特異抗体を用い
た逆受身ラテックス粒子凝集法、赤痢菌および腸管侵入
性大腸菌の病原性に関与する140メガダルトンのプラ
スミド産物に対する特異抗体を用いたEIA法(伊藤健
一郎ら、日本細菌学雑誌 41,414(1986) )やipaB遺
伝子、ipaC遺伝子、またはipaD遺伝子を検出し
ようとするDNAプローブ法(U.S. patent Applicatio
n No. 888194)があるが、これらの試験法は、試薬およ
び検体の調製が複雑で面倒であり、しかも多大の時間を
要する。
な新規な検出法を検疫、臨床検査、および食品検査に提
供することにある。
決するため、オリゴヌクレオチドを核酸合成反応のプラ
イマーとして機能させた遺伝子増幅技術により赤痢菌の
志賀毒素遺伝子又は赤痢菌および腸管侵入性大腸菌のi
paH、invEを検出するものある。
賀毒素遺伝子をコードするヌクレオチド配列を標的とす
る場合は、そのヌクレオチド配列と相補的となるように
化学合成されたオリゴヌクレオチドであって、合成ヌク
レオチドが以下の配列群の少なくとも連続した10塩基
以上を含むオリゴヌクレオチド (5’)−CAACACTGGATGATCTCAG−(3’) ・・・・・(a;配列番号1) (5’)−CCCCCTCAACTGCTAATA−(3’) ・・・・・(b;配列番号2) または対応する相補的配列からなり、検体中に存在する
赤痢菌(Shigella dysenteriae, Shigella flexneri,Sh
igel la boydii および Shigella sonnei)および腸管侵
入性大腸菌(enteroinvasiveEscherichia coli)に選択
的に存在しているipaH遺伝子をコードするヌクレオ
チド配列を標的とする場合は、そのヌクレオチド配列と
相補的となるように化学合成されたオリゴヌクレオチド
であって、合成ヌクレオチドが以下の配列群の少なくと
も連続した10塩基以上を含むオリゴヌクレオチド (5’)−TGTATCACAGATATGGCATGC−(3’) ・・・・(c;配列番号3) (5’)−TCCGGAGATTGTTCCATGTG−(3’) ・・・・・(d;配列番号4) または対応する相補的配列からなり、検体中に存在する
赤痢菌(Shigella dysenteriae, Shigella flexneri, S
hige lla boydii, および Shigella sonnei)および腸管
侵入性大腸菌(enteroinvasiveEscherichia coli)に選
択的に存在しているinvE遺伝子をコードするヌクレ
オチド配列を標的とする場合は、そのヌクレオチド配列
と相補的となるように化学合成されたオリゴヌクレオチ
ドであって、合成ヌクレオチドが以下の配列群の少なく
とも連続した10塩基以上を含むオリゴヌクレオチド、 (5’)−CAAGATTTAACCTTCGTCAACC−(3’) ・・・・・(e;配列番号5) (5’)−AGTTCTCGGATGCTATGCTC−(3’) ・・・・・(f;配列番号6) または対応する相補的配列からなる。
rase Chain Reaction 法(以下、略してPCR法とい
う;Science 230, 1350(1985) )をもとに行っている。
この方法は、ある特定のヌクレオチド配列領域(本発明
の場合は、赤痢菌の志賀毒素遺伝子又は赤痢菌および腸
管侵入性大腸菌のipaH、invE)を検出する場
合、その領域の両端の一方は+鎖を、他方は−鎖をそれ
ぞれ認識してハイブリダイゼーションするようなオリゴ
ヌクレオチドを用意し、それを熱変性により1本鎖状態
にした試料核酸に対し鋳型依存性ヌクレオチド重合反応
のプライマーとして機能させ、生成した2本鎖核酸を再
び1本鎖に分離し、再び同様な反応を起こさせる。この
一連の操作を繰り返すことで2つのプライマーに挟まれ
た領域は検出できるまでにコピー数が増大してくる。
便、尿、血液、組織ホモジェネートなど、また、食品材
料でもよい。これら材料をPCRの試料として用いるに
は、材料中に存在する菌体から核酸成分を遊離させる操
作が前処理として必要となる。しかし、プライマーがハ
イブリダイズできる核酸が数分子から数十分子以上存在
すればPCRは進むので、検査材料を溶菌酵素、界面活
性剤、アルカリ等で短時間処理するだけでPCRを進行
させるに十分な核酸量を持った試料液が調製できる。
ゴヌクレオチドは、選択性や検出感度および再現性から
考えて、10塩基以上、望ましくは15塩基以上の長さ
を持ったヌクレオチド断片で、化学合成あるいは天然の
どちらでもよい。また、プライマーは、特に検出用とし
て標識されていなくてもよい。
管侵入性大腸菌の遺伝子のヌクレオチド配列における増
幅領域は、50塩基から2、000塩基、望ましくは、
100塩基から1、000塩基となればよい。鋳型依存
性ヌクレオチド重合反応には、耐熱性DNAポリメラー
ゼを用いているが、この酵素の起源については90〜9
5℃、プライマーをハイブリダイズさせるアニーリング
操作の温度は37〜65℃、重合反応は50〜75℃
で、これを1サイクルとしたPCRを20から42サイ
クル行って増幅させる。
ガロースゲル電気泳動にかけることで、増幅されたヌク
レオチド断片の存在、およびその長さが確認できる。そ
の結果から、検体中にプライマーが認識すべき配列を持
ったヌクレオチドが存在しているかどうか判定すること
ができる。この判定は、そのまま志賀毒素遺伝子又は赤
痢菌および腸管侵入性大腸菌のipaH、invEをも
つ赤痢菌の有無を判定するものとなる。増幅されたヌク
レオチド断片の検出には、その他の電気泳動やクロマト
グラフィーも有効である。
および腸管侵入性大腸菌のipaH、invEと選択的
にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを作製し、こ
のオリゴヌクレオチドをプライマーとして遺伝子増幅に
用い、赤痢菌および腸管侵入性大腸菌のみを選択的に検
出する。
者等から由来したもので、表1の総計42株を用いた。
各菌株をLB培地(1%トリプトン、0. 5%イースト
エクストラクト、および1%塩化ナトリウムに接種し、
37℃、好気的条件下で、終夜振とう培養を行った。各
菌株培養液を10mMトリス−塩酸緩衝液pH7. 5
(以下TE緩衝液)で10倍に希釈し、95℃で10分
間の加熱処理を行った後、これらを遠心し、その上清を
検体とした。
hemorrhagic Escherichia coli;EHEC )またはベロ毒素
産生性大腸菌(Verocytotoxin-producing Escherichia
coli; VTEC)の有するVT1遺伝子とわずか数塩基が異
なるだけであり、同一の遺伝子とみなされている。そこ
で、文献(Takao, T et al., Microb. Pathog.,5:357-3
69 (1988))の中から請求項第1項に示した各配列を選
び、それと同じ配列を持つオリゴヌクレオチドを化学合
成した。化学合成は、サイクロンプラスDNA合成装置
(ミリジェン/バイオリサーチ社製)を用い、β−シア
ノエチルフォスホアミダイト法により行った。合成した
オリゴヌクレオチドの精製はC18逆相カラムを用いた高
速液体クロマトグラフィーで行った。
μl、10x反応用緩衝液3μl,dNTP溶液4. 8
μl、プライマー(1) 1. 0μl、プライマー(2) 1.
0μl、および耐熱性DNAポリメラーゼ0. 15μl
を加えて、全量30μlの反応液を調製した。この反応
液の入った容器にミネラルオイル(SIGMA 社製)を50
μl加え、反応液上に重層した。各使用した溶液の内
容、およびプライマー(1) と(2) の組合せは、次のとお
りである。
s-HCl pH8.3, 15mM MgCl2 ,0.1%(w/V) ゼラチン dNTP溶液: dATP, dCTP, dGTP, dTTPを混合させたも
ので各終濃度が1.25mM プライマー(1) および(2): 前述した化学合成精製品の
水溶液(濃度3.75 OD/ml) プライマーの組合せ: 前述の化学合成精製品を下記のと
おりに組合せて使用した。
(5 unit/ml; PerkinElmer cetus 社製) 反応条件は、次のとおりである。
1サイクル(所要時間5.7 分)とし、これを35サイク
ル(総所要時間約3時間)行った。これらの操作は、D
NAサーマルサイクラー(Perkin Elmer Cetus社製)に
上記反応条件をプログラムして行った。
め、アガロースゲル電気泳動を以下のように行った。
し、臭化エチジウム(0.5 μl/ml)を含むものを用い
た。泳動の条件は定電圧100V、30分で行った。操
作方法ならびに他の条件は、Maniatis等著 Molecular C
loning 第2版(1989)に記載されている技法で行っ
た。反応液の他に分子量マーカーの泳動も同時に行い、
相対移動度の比較によりヌクレオチド断片の長さを算出
した。
sive Latex Agglutination;RPLA)試験 市販の大腸菌ベロトキシン検出用RPLAキット(デン
カ生研製)を購入し、付属の使用説明書に従い検体を調
製して、試験を行った。
配列が決定されており、本発明のオリゴヌクレオチド、
すなわち、プライマーがPCRにより増幅させるヌクレ
オチドの大きさは容易に推定できる。それによるとプラ
イマー(a) と(b) の組合せでは、349塩基(または3
49塩基対)の長さのヌクレオチドが増幅されてくるは
ずである。これらの推定値と増幅されたヌクレオチドの
長さが一致した場合、このプライマーの組合せは、志賀
毒素遺伝子中の標的としている領域を正しく増幅してお
り、かつ、当該菌株は志賀毒素遺伝子を有していると判
断した。被験菌株34株で調べた結果を表1に示す。本
発明のプライマーは、RPLA試験で、ベロ毒素すなわ
ち志賀毒素陽性と判断された菌株のDNAのみを増幅
し、志賀毒素遺伝子陰性の菌株DNAとは全く反応しな
かった。すなわち、志賀毒素遺伝子を正しく増幅し、志
賀毒素遺伝子をもつ赤痢菌を正確に検出していることを
示している。
に対して、選択的なものかどうかを確かめるため、臨床
検査において検査対象となる、赤痢菌以外の下痢症菌等
の遺伝子について本発明のプライマーが反応するかどう
かを調べた。方法は検体の調製法を除いて、実験例1で
示したものと同じである。
し、37℃、好気的、または嫌気的条件下で終夜培養を
行った(このうち嫌気的条件下で培養した菌株は、Clos
tridium perfringens 、Campylobacter jejuni、Campyl
obacter coli、Bacteroides flagilis、Bacteroides vu
lgatus、Lactobacillus acidophilus 、Bifidobacteriu
m adolescentisである)。各菌株培養液0. 5mlから
遠心操作により、菌体を回収し、TE緩衝液で菌体を1
回洗浄した。この菌体に50mMリン酸緩衝液pH7.
5に溶解したN- アセチルムラミニダーゼ溶液、および
アクロモペプチダーゼ溶液を各終濃度が50μg/m
l、および1mg/mlとなるように加え、37℃で1
0分間処理し、溶菌した。TE緩衝液飽和でさせたフェ
ノールおよびクロロフォルムからなる混合液(混合比
1:1)を溶菌液に加えて、よく撹拌した。遠心後、上
層液を回収し、エタノール処理を行って、核酸成分を沈
澱させた。この沈澱物を1mlのTE緩衝液に溶かして
検体とした。また、ヒト胎盤由来DNA(Human placen
ta DNA)は、1μg/mlの濃度のものを調製し、これ
も同様にPCRを行わせた。
発明のプライマーの組合せは、志賀毒素産生性赤痢菌お
よびベロ毒素1型産生性大腸菌のDNAを除いて、下痢
症菌DNAをはじめとする種々のDNAについて、それ
らのDNAを増幅することはなかった。したがって、本
発明のオリゴヌクレオチド、すなわちプライマーは、志
賀毒素遺伝子を有する菌にのみ、選択的に反応するもの
と断言できる。なお、本発明の実施例で用いているアガ
ロースゲル電気泳動法を前述の条件で行えば、100塩
基(または100塩基対)以下の長さのヌクレオチドで
あれば、5から10塩基(塩基対)、また、100から
500塩基(塩基対)の範囲のヌクレオチドであれば、
10から20塩基(塩基対)のヌクレオチドの長さの違
いを区別可能である。さらに、アクリルアミドなどをゲ
ル材に用いることで、ヌクレオチドの長さの測定精度を
向上させることができ、志賀毒素遺伝子の選択的検出に
おける信頼度は、さらに高まるものと考えられる。
遺伝子の検出) [実験例1]検体の調整 赤痢菌および腸管侵入性大腸菌の菌株として表3の34
1株を用いた以外は、実施例1と同様の手法で検体を調
整した。
1905-1915, 1990 、Venkatesan, M. M.,et al., Mol. M
icrobiol. 5, 2435-2446 1991 )に記載された赤痢菌お
よび腸管侵入性大腸菌のipaH遺伝子の塩基配列か
ら、請求項第2項に示した各配列を選び、それと同じ配
列を持つオリゴヌクレオチドを化学合成した。化学合成
は、サイクロンプラスDNA合成装置(ミリジェン/バ
イオリサーチ社製)を用い、β−シアノエチルフォスホ
アミダイト法により行った。合成したオリゴヌクレオチ
ドの精製はC18逆相カラムを用いた高速液体クロマトグ
ラフィーで行った。
は、実施例1と同様の反応条件でPCRを行った。
を用いて、Grunsteinの方法(Grunstein, M. and Hogne
ss, D., Proc. Natl. Acad. Sci. 72, 3961 (1975) )
にしたがって行った。
H遺伝子は、すでに塩基配列が決定されており、本発明
のオリゴヌクレオチド、すなわち、プライマーがPCR
により増幅させるヌクレオチドの大きさは容易に推定で
きる。それによるとプライマー(c) と(d) の組合せで
は、242塩基(または242塩基対)の長さのヌクレ
オチドが増幅されてくるはずである。これらの推定値と
増幅されたヌクレオチドの長さが一致した場合、このプ
ライマーの組合せは、ipaH遺伝子中の標的としてい
る領域を正しく増幅しており、かつ、当該菌株はipa
H遺伝子を有していると判断した。被験菌株347株で
調べた結果を表3に示す。本発明のプライマーは、コロ
ニーハイブリダイゼーション試験で、ipaH遺伝子陽
性と判断された菌株のDNAのみを増幅し、ipaH遺
伝子陰性の菌株DNAとは全く反応しなかった。すなわ
ち、ipaH遺伝子を正しく増幅し、ipaH遺伝子を
もつ赤痢菌および腸管侵入性大腸菌を正確に検出してい
ることを示している。
に対して、選択的なものかどうかを確かめるため、臨床
検査において検査対象となる、赤痢菌および腸管侵入性
大腸菌以外の下痢症菌等の遺伝子について本発明のプラ
イマーが反応するかどうかを調べた。方法は検体の調製
法を除いて、実験例1で示したものと同じである。
法で行った。
発明のプライマーの組合せは、赤痢菌および腸管侵入性
大腸菌のDNAを除いて、下痢症菌DNAをはじめとす
る種々のDNAについて、それらのDNAを増幅するこ
とはなかった。したがって、本発明のオリゴヌクレオチ
ド、すなわちプライマーは、ipaH遺伝子を有する菌
にのみ、選択的に反応するものと断言できる。
遺伝子の検出) [実験例1]検体の調整 赤痢菌および腸管侵入性大腸菌の菌株として表3の34
1株を用いた以外は、実施例1と同様の手法で検体を調
整した。
-629, 1990)に記載された赤痢菌および腸管侵入性大腸
菌のinvE遺伝子の塩基配列から、請求項第3項に示
した各配列を選び、それと同じ配列を持つオリゴヌクレ
オチドを化学合成した。化学合成は、サイクロンプラス
DNA合成装置(ミリジェン/バイオリサーチ社製)を
用い、β−シアノエチルフォスホアミダイト法により行
った。合成したオリゴヌクレオチドの精製はC18逆相カ
ラムを用いた高速液体クロマトグラフィーで行った。
は、実施例1と同様の反応条件でPCRを行った。
を用いて、Grunsteinの方法(Grunstein, M. and Hogne
ss, D., Proc. Natl. Acad. Sci. 72, 3961 (1975) )
にしたがって行った。
E遺伝子は、すでに塩基配列が決定されており、本発明
のオリゴヌクレオチド、すなわち、プライマーがPCR
により増幅させるヌクレオチドの大きさは容易に推定で
きる。それによるとプライマー(e) と(f) の組合せで
は、293塩基(または293塩基対)の長さのヌクレ
オチドが増幅されてくるはずである。これらの推定値と
増幅されたヌクレオチドの長さが一致した場合、このプ
ライマーの組合せは、invE遺伝子中の標的としてい
る領域を正しく増幅しており、かつ、当該菌株はinv
E遺伝子を有していると判断した。被験菌株347株で
調べた結果を表5に示す。本発明のプライマーは、コロ
ニーハイブリダイゼーション試験で、invE遺伝子陽
性と判断された菌株のDNAのみを増幅し、invE遺
伝子陰性の菌株DNAとは全く反応しなかった。すなわ
ち、invE遺伝子を正しく増幅し、invE遺伝子を
もつ赤痢菌および腸管侵入性大腸菌を正確に検出してい
ることを示している。
に対して、選択的なものかどうかを確かめるため、臨床
検査において検査対象となる、赤痢菌および腸管侵入性
大腸菌以外の下痢症菌等の遺伝子について本発明のプラ
イマーが反応するかどうかを調べた。方法は検体の調製
法を除いて、実験例1で示したものと同じである。
法で行った。
発明のプライマーの組合せは、赤痢菌および腸管侵入性
大腸菌のDNAを除いて、下痢症菌DNAをはじめとす
る種々のDNAについて、それらのDNAを増幅するこ
とはなかった。したがって、本発明のオリゴヌクレオチ
ド、すなわちプライマーは、invE遺伝子を有する菌
にのみ、選択的に反応するものと断言できる。
よび赤痢菌の一病原因子である志賀毒素の遺伝子又はi
paH、invE遺伝子を標的とするプライマーを用い
たことにより、志賀毒素遺伝子を有する菌の検出におい
て、遺伝子増幅作用による高い検出感度と、2つ、ある
いは、それ以上の数のプライマーで反応が規定されるこ
とによる高い選択性とが得られる。また、検出感度が高
いので、多量の検体を必要とせず、検体の前処理も簡便
で済む。本発明における実施例では、反応時間3時間、
検出にかかる操作が30分であった。そのうえ、検出に
アガロースゲル電気泳動法と臭化エチジウムによる核酸
染色法を用いることで、プライマー等を標識せずに検出
が行える。しかも増幅されたヌクレオチドの長さを確認
できるので、試験結果の信頼性は高いものとなる。
な治療および防疫措置のために、遅滞のない正確な結果
が要求される。また、本発明は、赤痢菌の病原因子の一
つである志賀毒素の遺伝子又はipaH、invE遺伝
子を選択的に検出するものである。したがって、本発明
により、起因菌としての赤痢菌の検出を正確に行うこと
が可能となる。
Shigella boydiiおよび Shigella sonnei 配列の特徴 特徴を決定した方法 S 配列 TGTATCACAGATATGGCATGC
Shigella boydiiおよび Shigella sonnei 配列の特徴 特徴を決定した方法 S 配列 TCCGGAGATTGTTCCATGTG
Shigella boydiiおよび Shigella sonnei 配列の特徴 特徴を決定した方法 S 配列 CAAGATTTAACCTTCGTCAACC
Shigella boydiiおよび Shigella sonnei 配列の特徴 特徴を決定した方法 S 配列 AGTTCTCGGATGCTATGCTC
Claims (4)
- 【請求項1】 検体中に存在するA亜群赤痢菌血清型1
(Shigella dysente riae type 1)の菌株が産生する毒
素の遺伝子(志賀毒素遺伝子)をコードするヌクレオチ
ド配列を標的とし、そのヌクレオチド配列と相補的とな
るように化学合成されたオリゴヌクレオチドであって、
合成ヌクレオチドが以下の配列群の少なくとも連続した
10塩基以上を含むオリゴヌクレオチド (5’)−CAACACTGGATGATCTCAG−(3’)・・・・(a) (5’)−CCCCCTCAACTGCTAATA−(3’)・・・・・(b) または対応する相補的配列からなることを特徴とするオ
リゴヌクレオチド。 - 【請求項2】 検体中に存在する赤痢菌(Shigella dys
enteriae, Shigella flexneri,Shigella boydii および
Shigella sonnei)および腸管侵入性大腸菌(enteroinv
asive Escherichia coli)に選択的に存在しているi
paH遺伝子をコードするヌクレオチド配列を標的と
し、そのヌクレオチド配列と相補的となるように化学合
成されたオリゴヌクレオチドであって、合成ヌクレオチ
ドが以下の配列群の少なくとも連続した10塩基以上を
含むオリゴヌクレオチド (5’)−TGTATCACAGATATGGCATGC−(3’)・・(c) (5’)−TCCGGAGATTGTTCCATGTG−(3’)・・・(d) または対応する相補的配列からなることを特徴とするオ
リゴヌクレオチド。 - 【請求項3】 検体中に存在する赤痢菌(Shigella dys
enteriae, Shigella flexneri, Shigella boydii, およ
び Shigella sonnei)および腸管侵入性大腸菌(entero
invasiveEscherichia coli)に選択的に存在しているi
nvE遺伝子をコードするヌクレオチド配列を標的と
し、そのヌクレオチド配列と相補的となるように化学合
成されたオリゴヌクレオチドであって、合成ヌクレオチ
ドが以下の配列群の少なくとも連続した10塩基以上を
含むオリゴヌクレオチド (5’)−CAAGATTTAACCTTCGTCAACC−(3’) ・・・・(e) (5’)−AGTTCTCGGATGCTATGCTC−(3’) ・・・・・・(f) または対応する相補的配列からなることを特徴とするオ
リゴヌクレオチド。 - 【請求項4】 請求項第1項〜第3項に記載されたオリ
ゴヌクレオチドの配列のうちの一つを有するオリゴヌク
レオチドの配列を選択的に増幅させることを特徴とする
方法であって、 (a)検体中の1本の鎖状態の標的ヌクレオチド配列にプ
ライマーをハイブリダイズさせ、4種のヌクレオチドの
重合反応により鎖長反応を行わせ、 (b)得られた2本鎖ヌクレオチド配列を1本鎖に分離し
た場合、その相補鎖は他方のプライマーによる鎖長反応
の鋳型として機能し、 (c)これら2種のプライマーによる同時鎖長反応、鎖長
生成物の鋳型からの分離、そして新たなプライマーによ
るハイブリダイゼーションを繰り返すことにより、特定
のヌクレオチド配列を増幅させ、検出し、 (d)その結果、前記検体中に認識されるべき配列が存在
しているか否かを判定することで、赤痢菌の検出を行う
ことを特徴とする方法。
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