JP3118460B2 - プロスタグランジンレセプターｅｐ▲下２▼をコードするｄｎａ - Google Patents
プロスタグランジンレセプターｅｐ▲下２▼をコードするｄｎａInfo
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Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
- C07K14/72—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for hormones
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
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- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】 発明の背景 プロスタグランジン（PG）E2の生理作用は、（１種ま
たは複数の）プロスタグランジンＥレセプターとの相互
作用を介して伝達される。EPレセプターにはEP1、EP2及
びEP3の３つのサブタイプが存在する（Colemanら,1989
の総説参照）。これらの３つのサブタイプの全部がPGE2
に対して高い親和性を示すが、種々のアゴニスト及びア
ンタゴニストに対する夫々の親和性は異なっており、異
なる二次形質導入メカニズムを介して夫々の作用を発揮
する。即ち、EP1レセプターの活性化はIP3及び細胞内カ
ルシウムの増加に関連し、EP2レセプターの活性化は細
胞内の環状AMPを増加させ、EP3レセプターの活性化は細
胞内の環状AMPを減少させる。この一群のうちで現在ま
でにマウスEP2（Hondaら,1993）、マウスEP３α及びEP
３β（Sugimotoら,1992;Sugimotoら,1993）だけがクロ
ーニングされている。EP2レセプターは、ヒト及び他の
動物の小腸、腎臓、胃、筋肉、眼、子宮、胸腺及び気管
のような多様な細胞中に普通に見出される。プロスタグ
ランジンEP2がEP2レセプタータンパク質に結合すると、
細胞内cAMPレベルの増加が誘発される。このシグナルに
対して組織は例えば平滑筋弛緩のような応答を生じる。
たは複数の）プロスタグランジンＥレセプターとの相互
作用を介して伝達される。EPレセプターにはEP1、EP2及
びEP3の３つのサブタイプが存在する（Colemanら,1989
の総説参照）。これらの３つのサブタイプの全部がPGE2
に対して高い親和性を示すが、種々のアゴニスト及びア
ンタゴニストに対する夫々の親和性は異なっており、異
なる二次形質導入メカニズムを介して夫々の作用を発揮
する。即ち、EP1レセプターの活性化はIP3及び細胞内カ
ルシウムの増加に関連し、EP2レセプターの活性化は細
胞内の環状AMPを増加させ、EP3レセプターの活性化は細
胞内の環状AMPを減少させる。この一群のうちで現在ま
でにマウスEP2（Hondaら,1993）、マウスEP３α及びEP
３β（Sugimotoら,1992;Sugimotoら,1993）だけがクロ
ーニングされている。EP2レセプターは、ヒト及び他の
動物の小腸、腎臓、胃、筋肉、眼、子宮、胸腺及び気管
のような多様な細胞中に普通に見出される。プロスタグ
ランジンEP2がEP2レセプタータンパク質に結合すると、
細胞内cAMPレベルの増加が誘発される。このシグナルに
対して組織は例えば平滑筋弛緩のような応答を生じる。
EP2レセプターの機能活性は、モルモット回腸の環状
筋、ネコ気管、モルモット気管のような組織調製物並び
にリンパ球及び砕骨細胞のような細胞調製物を用いて研
究されている。EP2レセプター活性の上記のような研究
方法にはいくつかの欠点があり、例えば、異なるリガン
ド結合特性を有する複数の異なっているが近縁のレセプ
ター集団を含む調製物が必要であり、このため、絶対力
価及び選択性の測定が極めて難しくなっている。更に、
組織に含まれるEP2レセプターが極めて低レベルであ
り、また、組織サンプルが必要なので化合物をヒトEP2
レベルのエフェクターとして十分に試験することができ
ない。
筋、ネコ気管、モルモット気管のような組織調製物並び
にリンパ球及び砕骨細胞のような細胞調製物を用いて研
究されている。EP2レセプター活性の上記のような研究
方法にはいくつかの欠点があり、例えば、異なるリガン
ド結合特性を有する複数の異なっているが近縁のレセプ
ター集団を含む調製物が必要であり、このため、絶対力
価及び選択性の測定が極めて難しくなっている。更に、
組織に含まれるEP2レセプターが極めて低レベルであ
り、また、組織サンプルが必要なので化合物をヒトEP2
レベルのエフェクターとして十分に試験することができ
ない。
発明の概要 EP2と呼ばれる新規なプロスタグランジンレセプター
タンパク質をヒト細胞から単離及び精製した。全長EP2
タンパク質をコードするDNA分子を単離及び精製し、ヌ
クレオチド配列を決定した。EP2をコードするDNAを発現
ベクターにクローニングした。これらの発現ベクターは
組換え宿主細胞に導入されると組換え宿主細胞に機能性
EP2レセプタータンパク質を発現させる。新規なEP2タン
パク質、EP2をコードするDNA、発現ベクター及び組換え
EP2を発現する組換え宿主細胞は、EP2レセプター活性調
節剤の選定に有用である。
タンパク質をヒト細胞から単離及び精製した。全長EP2
タンパク質をコードするDNA分子を単離及び精製し、ヌ
クレオチド配列を決定した。EP2をコードするDNAを発現
ベクターにクローニングした。これらの発現ベクターは
組換え宿主細胞に導入されると組換え宿主細胞に機能性
EP2レセプタータンパク質を発現させる。新規なEP2タン
パク質、EP2をコードするDNA、発現ベクター及び組換え
EP2を発現する組換え宿主細胞は、EP2レセプター活性調
節剤の選定に有用である。
EP2レセプター調節剤の選定のために、組換えEP2を発
現する宿主細胞を利用する方法も開示している。EP2活
性調節剤は、プロスタグランジン関連疾患の治療及びEP
2レセプターに対するプロスタグランジンの作用を調節
するために有用である。
現する宿主細胞を利用する方法も開示している。EP2活
性調節剤は、プロスタグランジン関連疾患の治療及びEP
2レセプターに対するプロスタグランジンの作用を調節
するために有用である。
図面の簡単な説明 図１は、EP2レセプタータンパク質の推定された完全
アミノ酸配列（1C）及びEP2レセプタータンパク質をコ
ードする完全DNA配列（1A及び1B）を示す。
アミノ酸配列（1C）及びEP2レセプタータンパク質をコ
ードする完全DNA配列（1A及び1B）を示す。
図２は、EP2cDNAを注入したアフリカツメガエル卵母
細胞中のプロスタグランジンE2レセプターの発現を、卵
母細胞に1.6ngのEP2cDNAと2.5ngのCFTR cDNAとを注入し
て−60mVの固定電圧をかけたときに1nMのPGE2の浴潅流
によって惹起された内向きのcAMP依存性Cl-電流（図で
下向きの移動）によって示す。
細胞中のプロスタグランジンE2レセプターの発現を、卵
母細胞に1.6ngのEP2cDNAと2.5ngのCFTR cDNAとを注入し
て−60mVの固定電圧をかけたときに1nMのPGE2の浴潅流
によって惹起された内向きのcAMP依存性Cl-電流（図で
下向きの移動）によって示す。
図３は、（CFTR＋アンチセンスhEP2）cDNAを注入した
卵母細胞中のIBMX誘発CFTR媒介Cl-電流を示しており、
１μＭ及び３μＭのPGE2に対する応答の欠如が認められ
る。
卵母細胞中のIBMX誘発CFTR媒介Cl-電流を示しており、
１μＭ及び３μＭのPGE2に対する応答の欠如が認められ
る。
図４では、PcDNAIamp−hEP2をトランスフェクトしたC
OS−M6膜に対する〔3H〕PGE2特異的結合の競合を、4Aで
は、10pM〜10mMのPGE2（●）、PGE1（○）、17−フェニ
ル−トリノールPGF2（■），イロプロスト（□）、PGD
２α（◆）、PGE2（◇）及びU46619（▲）の存在下、4B
では、100pM〜100μＭのMB28767（●）、ミソプロスト
ル（○）、ブタプロスト（■）、AH6809（□）及びSC19
220（◆）の存在下、に行った〔3H〕PGE2結合アッセイ
で示す。
OS−M6膜に対する〔3H〕PGE2特異的結合の競合を、4Aで
は、10pM〜10mMのPGE2（●）、PGE1（○）、17−フェニ
ル−トリノールPGF2（■），イロプロスト（□）、PGD
２α（◆）、PGE2（◇）及びU46619（▲）の存在下、4B
では、100pM〜100μＭのMB28767（●）、ミソプロスト
ル（○）、ブタプロスト（■）、AH6809（□）及びSC19
220（◆）の存在下、に行った〔3H〕PGE2結合アッセイ
で示す。
発明の詳細な説明 本発明は、EP2と呼ぶ新規なプロスタグランジンレセ
プターをコードするcDNAに関する。本発明はまた、組換
え発現プラスミド中でクローニングされたEP2コーディ
ングDNAを発現する組換え宿主細胞に関する。本発明は
また、EP2レセプター活性を調節する物質のスクリーニ
ング方法に関する。本発明のDNAはEP2産生細胞から単離
されるものである。本文中で使用されるEP2なる用語
は、プロスタグランジン分子に特異的に結合し得るＧタ
ンパク質結合レセプターを意味する。
プターをコードするcDNAに関する。本発明はまた、組換
え発現プラスミド中でクローニングされたEP2コーディ
ングDNAを発現する組換え宿主細胞に関する。本発明は
また、EP2レセプター活性を調節する物質のスクリーニ
ング方法に関する。本発明のDNAはEP2産生細胞から単離
されるものである。本文中で使用されるEP2なる用語
は、プロスタグランジン分子に特異的に結合し得るＧタ
ンパク質結合レセプターを意味する。
EP2を産生し得る哺乳類細胞の非限定例としては、小
腸、腎臓、胃、血管平滑筋、眼、胎盤、子宮、リンパ
球、破骨細胞及び気管気管支樹に由来の細胞がある。EP
2を産生する形質転換哺乳類細胞系の非限定例は、肥満
細胞腫Ｐ−815細胞である。本発明の好ましい細胞は、
正常なヒト腎臓及び肺細胞であり、最も好ましい細胞は
ヒト胸腺細胞である。
腸、腎臓、胃、血管平滑筋、眼、胎盤、子宮、リンパ
球、破骨細胞及び気管気管支樹に由来の細胞がある。EP
2を産生する形質転換哺乳類細胞系の非限定例は、肥満
細胞腫Ｐ−815細胞である。本発明の好ましい細胞は、
正常なヒト腎臓及び肺細胞であり、最も好ましい細胞は
ヒト胸腺細胞である。
EP2cDNAを単離するために他の細胞及び細胞系も適宜
使用し得る。適当な細胞は、細胞表面のEP2をスクリー
ニングすることによって選択し得る。EP2活性の検出方
法は当業者に公知であり、レセプターに特異的な放射性
標識リガンドの結合を測定する。このアッセイでEP2活
性を有している細胞はEP2cDNAの単離に適しているであ
ろう。
使用し得る。適当な細胞は、細胞表面のEP2をスクリー
ニングすることによって選択し得る。EP2活性の検出方
法は当業者に公知であり、レセプターに特異的な放射性
標識リガンドの結合を測定する。このアッセイでEP2活
性を有している細胞はEP2cDNAの単離に適しているであ
ろう。
EP2cDNAをクローニングするためには多様な方法があ
り、そのいずれも使用し得る。これらの方法の非限定例
としては、適当な発現ベクター系中でEP2含有cDNAライ
ブラリーを構築した後に行うEP2cDNAの直接機能的発現
がある。別の方法では、バクテリオファージまたはプラ
スミドシャトルベクター中で構築されたEP2含有cDNAラ
イブラリーをEP2タンパク質のアミノ酸配列から設計さ
れた標識オリゴヌクレオチドプローブによってスクリー
ニングする。好ましい方法は、バクテリオファージまた
はプラスミドシャトルベクター中で構築されたEP2含有c
DNAライブラリーをEP2タンパク質をコードする部分cDNA
によってスクリーニングする方法である。この部分cDNA
は、プロスタグランジンEP2レセプターに近縁の他のＧ
タンパク質結合レセプターの既知のアミノ酸配列から縮
重オリゴヌクレオチドプライマーを設計して行うEP2DNA
フラグメントの特異的PCR増幅によって得られる。
り、そのいずれも使用し得る。これらの方法の非限定例
としては、適当な発現ベクター系中でEP2含有cDNAライ
ブラリーを構築した後に行うEP2cDNAの直接機能的発現
がある。別の方法では、バクテリオファージまたはプラ
スミドシャトルベクター中で構築されたEP2含有cDNAラ
イブラリーをEP2タンパク質のアミノ酸配列から設計さ
れた標識オリゴヌクレオチドプローブによってスクリー
ニングする。好ましい方法は、バクテリオファージまた
はプラスミドシャトルベクター中で構築されたEP2含有c
DNAライブラリーをEP2タンパク質をコードする部分cDNA
によってスクリーニングする方法である。この部分cDNA
は、プロスタグランジンEP2レセプターに近縁の他のＧ
タンパク質結合レセプターの既知のアミノ酸配列から縮
重オリゴヌクレオチドプライマーを設計して行うEP2DNA
フラグメントの特異的PCR増幅によって得られる。
他の種類のライブラリー、及び、他の細胞または細胞
種から構築されたライブラリーもEP2をコードするDNAの
単離に使用できることは容易に理解されよう。他の種類
のライブラリーの非限定例としては、他の細胞または細
胞系由来のcDNAライブラリー及びゲノムDNAライブラリ
ーがある。
種から構築されたライブラリーもEP2をコードするDNAの
単離に使用できることは容易に理解されよう。他の種類
のライブラリーの非限定例としては、他の細胞または細
胞系由来のcDNAライブラリー及びゲノムDNAライブラリ
ーがある。
適当なcDNAライブラリーがEP2活性を有する細胞また
は細胞系から調製され得ることは容易に理解されよう。
EP2cDNAの単離に用いるcDNAライブラリーの調製に使用
する細胞または細胞系を選択するためには、先ず、本発
明で使用する上述のごとき既知の標識リガンド結合アッ
セイを用いて細胞関連EP2活性を測定する。
は細胞系から調製され得ることは容易に理解されよう。
EP2cDNAの単離に用いるcDNAライブラリーの調製に使用
する細胞または細胞系を選択するためには、先ず、本発
明で使用する上述のごとき既知の標識リガンド結合アッ
セイを用いて細胞関連EP2活性を測定する。
cDNAライブラリーの調製は、当業界で公知の標準方法
で行う。公知のcDNAライブラリー構築方法は例えば、Ma
niatis,T.,Fritsch,E.F.,Sambrook,J.,Molecular Cloni
ng:A Laboratory Manual（Cold Spring Harbor Laborat
ory,Cold Spring Harbor,New York,1982）に記載されて
いる。
で行う。公知のcDNAライブラリー構築方法は例えば、Ma
niatis,T.,Fritsch,E.F.,Sambrook,J.,Molecular Cloni
ng:A Laboratory Manual（Cold Spring Harbor Laborat
ory,Cold Spring Harbor,New York,1982）に記載されて
いる。
また、EP2をコードするDNAが適当なゲノムDNAライブ
ラリーから単離できることも容易に理解されよう。ゲノ
ムDNAライブラリーの構築は、当業界で公知の標準方法
で行うことができる。公知のゲノムDNAライブラリーの
構築方法は、Maniatisらの前掲書に記載されている。
ラリーから単離できることも容易に理解されよう。ゲノ
ムDNAライブラリーの構築は、当業界で公知の標準方法
で行うことができる。公知のゲノムDNAライブラリーの
構築方法は、Maniatisらの前掲書に記載されている。
好ましい方法の１つによってEP2遺伝子をクローニン
グするためには、EP2または相同タンパク質のアミノ酸
配列またはDNA配列の情報が必要である。これを得るた
めに、EP2タンパク質または相同タンパク質を精製し、
自動配列分析装置によって部分的アミノ酸配列を決定す
る。全アミノ酸配列を決定する必要はなく、EP2DNAの部
分的フラグメントのPCR増幅用に６〜８個のアミノ酸の
２つの領域の直鎖状配列を決定すればよい。
グするためには、EP2または相同タンパク質のアミノ酸
配列またはDNA配列の情報が必要である。これを得るた
めに、EP2タンパク質または相同タンパク質を精製し、
自動配列分析装置によって部分的アミノ酸配列を決定す
る。全アミノ酸配列を決定する必要はなく、EP2DNAの部
分的フラグメントのPCR増幅用に６〜８個のアミノ酸の
２つの領域の直鎖状配列を決定すればよい。
適当なアミノ酸配列が同定されたら、これらをコード
し得るDNA配列を合成する。遺伝子コードは縮重性なの
で、特定アミノ酸をコードする２つ以上のコドンを使用
でき、従って、同様のDNAオリゴヌクレオチドのセット
のいずれか１つによってアミノ酸配列をコードし得る。
セットの１つの成員だけがEP2配列に等しいであろう
が、セットの他の成員も不適正対合のDNAオリゴヌクレ
オチドではあるがEP2DNAにハイブリダイズし得るかも知
れない。即ち、不適正対合のDNAオリゴヌクレオチドで
あっても、EP2をコードするDNAの同定及び単離ができる
ほど十分にEP2DNAにハイブリダイズできることがある。
し得るDNA配列を合成する。遺伝子コードは縮重性なの
で、特定アミノ酸をコードする２つ以上のコドンを使用
でき、従って、同様のDNAオリゴヌクレオチドのセット
のいずれか１つによってアミノ酸配列をコードし得る。
セットの１つの成員だけがEP2配列に等しいであろう
が、セットの他の成員も不適正対合のDNAオリゴヌクレ
オチドではあるがEP2DNAにハイブリダイズし得るかも知
れない。即ち、不適正対合のDNAオリゴヌクレオチドで
あっても、EP2をコードするDNAの同定及び単離ができる
ほど十分にEP2DNAにハイブリダイズできることがある。
好ましい方法の１つを用い、EP2をコードするcDNAク
ローンを、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）に基づく技術
とcDNAライブラリースクリーニングとを用いる２段階方
法で単離する。第一段階では、精製されたEP2または相
同タンパク質からのNH2末端及び内部のアミノ酸配列情
報を使用してEP2特異的DNAフラグメント増幅用の縮重オ
リゴヌクレオチドプライマーを設計する。第二段階で
は、cDNAライブラリーから全長cDNAを単離するプローブ
として使用するためにこれらのフラグメントをクローニ
ングする。
ローンを、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）に基づく技術
とcDNAライブラリースクリーニングとを用いる２段階方
法で単離する。第一段階では、精製されたEP2または相
同タンパク質からのNH2末端及び内部のアミノ酸配列情
報を使用してEP2特異的DNAフラグメント増幅用の縮重オ
リゴヌクレオチドプライマーを設計する。第二段階で
は、cDNAライブラリーから全長cDNAを単離するプローブ
として使用するためにこれらのフラグメントをクローニ
ングする。
EP2をコードするほぼ全長のcDNAの配列を表１に示
し、クローンEP2と命名した。クローン化cDNAから推定
されるEP2のアミノ酸配列を表２に示す。決定されたcDN
A配列を検討すると、約488個のアミノ酸から成るタンパ
ク質をコードする単一の大きい読み取り枠の存在が判明
する。
し、クローンEP2と命名した。クローン化cDNAから推定
されるEP2のアミノ酸配列を表２に示す。決定されたcDN
A配列を検討すると、約488個のアミノ酸から成るタンパ
ク質をコードする単一の大きい読み取り枠の存在が判明
する。
上述の方法によって得られたクローン化EP2cDNAを、
適当なプロモーターと他の適当な転写調節因子とを含む
発現ベクター中で分子クローニングによって組換え発現
させ、原核細胞または真核細胞から成る宿主細胞に移入
して組換えEP2を産生させる。このような操作に関する
方法は、Maniatisらの前掲書に記載されており、当業界
でよく知られている。
適当なプロモーターと他の適当な転写調節因子とを含む
発現ベクター中で分子クローニングによって組換え発現
させ、原核細胞または真核細胞から成る宿主細胞に移入
して組換えEP2を産生させる。このような操作に関する
方法は、Maniatisらの前掲書に記載されており、当業界
でよく知られている。
本文中の発現ベクターとは、適当な宿主中でのクロー
ン化DNAの転写及びそれらのmRNAの翻訳に必要なDNA配列
と定義される。このようなベクターは、細菌、藍藻類、
植物細胞、昆虫細胞及び動物細胞のような多様な宿主中
で真核細胞DNAを発現させるために使用できる。
ン化DNAの転写及びそれらのmRNAの翻訳に必要なDNA配列
と定義される。このようなベクターは、細菌、藍藻類、
植物細胞、昆虫細胞及び動物細胞のような多様な宿主中
で真核細胞DNAを発現させるために使用できる。
特殊設計のベクターにより、細菌−酵母または細菌−
動物細胞のような宿主間でDNAをシャトルさせ得る。適
正に構築された発現ベクターは、宿主細胞中で自律複製
するための複製起点と、選択可能マーカーと、限定数の
有用な制限酵素部位と、高コピー数能力と、活性プロモ
ーターとを含む必要がある。プロモーターなる用語は、
DNAに結合しRNA合成を開始することをRNAポリメラーゼ
に指令するDNA配列と定義される。mRNA合成を高頻度で
開始させるプロモーターを強力プロモーターと呼ぶ。発
現ベクターの非限定例としては、クローニングベクタ
ー、修飾されたクローニングベクター、特別に設計され
たプラスミドまたはウイルスがある。
動物細胞のような宿主間でDNAをシャトルさせ得る。適
正に構築された発現ベクターは、宿主細胞中で自律複製
するための複製起点と、選択可能マーカーと、限定数の
有用な制限酵素部位と、高コピー数能力と、活性プロモ
ーターとを含む必要がある。プロモーターなる用語は、
DNAに結合しRNA合成を開始することをRNAポリメラーゼ
に指令するDNA配列と定義される。mRNA合成を高頻度で
開始させるプロモーターを強力プロモーターと呼ぶ。発
現ベクターの非限定例としては、クローニングベクタ
ー、修飾されたクローニングベクター、特別に設計され
たプラスミドまたはウイルスがある。
組換えEP2を哺乳類細胞中で発現させるために種々の
哺乳類発現ベクターを使用し得る。組換えEP2発現に適
当な市販の哺乳類発現ベクターの非限定例は、pMC1neo
（Stratagene）、pXT1（Stratagene）、pSG5（Stratage
ne）、pcDNA I、pcDNA I amp（Invitrogen）、EBO−pSV
2−neo（ATCC37593）、pBPV−１（８−２）（ATCC3711
0）、pdBPV−MMTneo（342−12）（ATCC37224）、pRSVgp
t（ATCC37199）、pRSVneo（ATCC37198）、pSV2−dhfr
（ATCC37146）、pUCTag（ATCC37460）、IZD35（ATCC375
65）及びワクシニアウイルス転移ベクターpTM1である。
哺乳類発現ベクターを使用し得る。組換えEP2発現に適
当な市販の哺乳類発現ベクターの非限定例は、pMC1neo
（Stratagene）、pXT1（Stratagene）、pSG5（Stratage
ne）、pcDNA I、pcDNA I amp（Invitrogen）、EBO−pSV
2−neo（ATCC37593）、pBPV−１（８−２）（ATCC3711
0）、pdBPV−MMTneo（342−12）（ATCC37224）、pRSVgp
t（ATCC37199）、pRSVneo（ATCC37198）、pSV2−dhfr
（ATCC37146）、pUCTag（ATCC37460）、IZD35（ATCC375
65）及びワクシニアウイルス転移ベクターpTM1である。
また、宿主細胞中で発現するようにEP2をコードするD
NAを発現ベクター中でクローニングしてもよい。宿主細
胞は原核細胞または真核細胞のいずれでもよく、その非
限定例としては、細菌、酵母、並びに、ヒト、ウシ、ブ
タ、サル、齧歯類などに由来の細胞系を非限定例とする
哺乳類細胞、ショウジョウバエに由来の細胞系を非限定
例とする昆虫細胞がある。市販されている適当な哺乳類
種に由来の細胞系の非限定例としては、CV−１（ATCC C
CL70）、COS−１（ATCC CRL1650）、COS−７（ATCC CRL
1651）、CHO−K1（ATCC CCL61）、3T3（ATCC CCL92）、
NIH/3T3（ATCC CRL1658）、HeLa（ATCC CCL2）、C1271
（ATCC CRL1616）、BS−Ｃ−１（ATCC CCL26）及びMRC
−５（ATCC CCL171）がある。
NAを発現ベクター中でクローニングしてもよい。宿主細
胞は原核細胞または真核細胞のいずれでもよく、その非
限定例としては、細菌、酵母、並びに、ヒト、ウシ、ブ
タ、サル、齧歯類などに由来の細胞系を非限定例とする
哺乳類細胞、ショウジョウバエに由来の細胞系を非限定
例とする昆虫細胞がある。市販されている適当な哺乳類
種に由来の細胞系の非限定例としては、CV−１（ATCC C
CL70）、COS−１（ATCC CRL1650）、COS−７（ATCC CRL
1651）、CHO−K1（ATCC CCL61）、3T3（ATCC CCL92）、
NIH/3T3（ATCC CRL1658）、HeLa（ATCC CCL2）、C1271
（ATCC CRL1616）、BS−Ｃ−１（ATCC CCL26）及びMRC
−５（ATCC CCL171）がある。
形質転換、トランスフェクション、感染、プロトプラ
スト融合、電気穿孔法、などを非限定例とする多くの方
法のいずれかによって発現ベクターを宿主細胞に導入し
得る。発現ベクター含有細胞を個別に分析してEP2タン
パク質産生の有無を決定する。EP2を発現する細胞の同
定は、抗EP2抗体との免疫反応性、宿主細胞関連EP2活性
の存在、などを非限定例とする複数の手段によって行う
ことができる。
スト融合、電気穿孔法、などを非限定例とする多くの方
法のいずれかによって発現ベクターを宿主細胞に導入し
得る。発現ベクター含有細胞を個別に分析してEP2タン
パク質産生の有無を決定する。EP2を発現する細胞の同
定は、抗EP2抗体との免疫反応性、宿主細胞関連EP2活性
の存在、などを非限定例とする複数の手段によって行う
ことができる。
また、in vitro産生した合成mRNAを用いてEP2DNAを発
現させてもよい。合成mRNAは、小麦胚芽エキス、網状赤
血球抽出物を非限定例とする種々の無細胞系に効率よく
翻訳され得、また、カエル卵母細胞へのマイクロインジ
ェクションなどを非限定例とする細胞ベースの系にも効
率よく翻訳され得る。カエル卵母細胞へのマイクロイン
ジェクションが好ましい。
現させてもよい。合成mRNAは、小麦胚芽エキス、網状赤
血球抽出物を非限定例とする種々の無細胞系に効率よく
翻訳され得、また、カエル卵母細胞へのマイクロインジ
ェクションなどを非限定例とする細胞ベースの系にも効
率よく翻訳され得る。カエル卵母細胞へのマイクロイン
ジェクションが好ましい。
最適レベルのレセプター活性及び／またはEP2タンパ
ク質を生じる（１つまたは複数の）EP2cDNA配列を決定
するために構築されるEP2cDNA分子の非限定例として
は、EP2cDNAの全長読み取り枠、及び、レセプタータン
パク質の特異的ドメインまたはタンパク質の転位ドメイ
ンだけをコードするcDNA部分を含む種々の構築物があ
る。すべての構築物は、EP2cDNAの５′及び／または
３′の非翻訳領域を全く含まないか、またはその全部も
しくは一部を含むように設計され得る。EP2活性及びタ
ンパク質発現のレベルは、これらの構築物を単独でまた
は組み合わせて適当な宿主細胞に導入した後で決定し得
る。一過性アッセイで最適発現を生じるEP2cDNAカセッ
トを決定した後、このEP2cDNA構築物を、哺乳類細胞、
植物細胞、昆虫細胞、卵母細胞、大腸菌及び酵母細胞な
どを非限定例とする多様な発現ベクター（組換えウイル
スも含む）に移入する。
ク質を生じる（１つまたは複数の）EP2cDNA配列を決定
するために構築されるEP2cDNA分子の非限定例として
は、EP2cDNAの全長読み取り枠、及び、レセプタータン
パク質の特異的ドメインまたはタンパク質の転位ドメイ
ンだけをコードするcDNA部分を含む種々の構築物があ
る。すべての構築物は、EP2cDNAの５′及び／または
３′の非翻訳領域を全く含まないか、またはその全部も
しくは一部を含むように設計され得る。EP2活性及びタ
ンパク質発現のレベルは、これらの構築物を単独でまた
は組み合わせて適当な宿主細胞に導入した後で決定し得
る。一過性アッセイで最適発現を生じるEP2cDNAカセッ
トを決定した後、このEP2cDNA構築物を、哺乳類細胞、
植物細胞、昆虫細胞、卵母細胞、大腸菌及び酵母細胞な
どを非限定例とする多様な発現ベクター（組換えウイル
スも含む）に移入する。
哺乳類細胞トランスフェクタントにおけるEP2レセプ
ター活性のレベル及びEP2タンパク質のレベルを以下の
方法で検定する。EP2レセプター活性を検定するために
は、標識リガンドを細胞に直接導入し、EP2発現細胞に
対するリガンドの特異的結合量を測定する。レセプター
活性に関する結合アッセイは、当業界で公知である（Fr
eyら,1993,Eur.J.Pharmacol.244,pp239−250）。
ター活性のレベル及びEP2タンパク質のレベルを以下の
方法で検定する。EP2レセプター活性を検定するために
は、標識リガンドを細胞に直接導入し、EP2発現細胞に
対するリガンドの特異的結合量を測定する。レセプター
活性に関する結合アッセイは、当業界で公知である（Fr
eyら,1993,Eur.J.Pharmacol.244,pp239−250）。
宿主細胞中のEP2タンパク質のレベルは、イムノアフ
ィニティ法及び／またはリガンドアフィニティ法を非限
定例とする種々の方法によって定量される。EP2特異的
アフィニティビーズまたはEP2特異的抗体を使用して、
35S−メチオニン標識または非標識EP2タンパク質を単離
する。標識したEP2タンパク質をSDS−PAGEによって分析
する。非標識EP2タンパク質はEP2特異的抗体を使用する
ウエスタンブロット、ELISAまたはRIAアッセイによって
検出する。
ィニティ法及び／またはリガンドアフィニティ法を非限
定例とする種々の方法によって定量される。EP2特異的
アフィニティビーズまたはEP2特異的抗体を使用して、
35S−メチオニン標識または非標識EP2タンパク質を単離
する。標識したEP2タンパク質をSDS−PAGEによって分析
する。非標識EP2タンパク質はEP2特異的抗体を使用する
ウエスタンブロット、ELISAまたはRIAアッセイによって
検出する。
宿主細胞中のEP2の発現後に、EP2タンパク質を回収し
て、EP2特異的リガンドに結合し得る活性形のEP2を得
る。複数のEP2精製手順を適宜利用できる。組換えEP
2は、界面活性剤可溶化、塩分画、イオン交換クロマト
グラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、ヒドロキ
シアパタイト吸着クロマトグラフィー及び疎水性相互作
用クロマトグラフィーなどを非限定例とする標準分離方
法の種々の併用または単独使用によって細胞膜から精製
され得る。
て、EP2特異的リガンドに結合し得る活性形のEP2を得
る。複数のEP2精製手順を適宜利用できる。組換えEP
2は、界面活性剤可溶化、塩分画、イオン交換クロマト
グラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、ヒドロキ
シアパタイト吸着クロマトグラフィー及び疎水性相互作
用クロマトグラフィーなどを非限定例とする標準分離方
法の種々の併用または単独使用によって細胞膜から精製
され得る。
更に、組換えEP2は全長新生EP2またはEP2のポリペプ
チドフラグメントに特異的なモノクローナル抗体または
ポリクローナル抗体によって作製されたイムノアフィニ
ティカラムの使用によって他の細胞性タンパク質から分
離され得る。
チドフラグメントに特異的なモノクローナル抗体または
ポリクローナル抗体によって作製されたイムノアフィニ
ティカラムの使用によって他の細胞性タンパク質から分
離され得る。
EP2に単一特異的な抗体は、EP2に反応性の抗体を含む
哺乳類抗血清から精製されるか、またはKohler ＆ Mils
tein,Nature 256:495−497（1975）の方法を用いてEP2
と反応性のモノクローナル抗体として調製される。本文
中で使用される単一特異的抗体なる用語は、EP2に対し
て均一な結合特性をもつ単一抗体種または多重抗体種を
意味する。本文中で使用される均一結合なる用語は、上
記のようなEP2関連の抗体種が特異的抗原またはエピト
ープに結合する能力を意味する。免疫アジュバントを任
意に併用した適当な濃度のEP2またはEP2タンパク質の配
列に由来のペプチドによってマウス、ラット、モルモッ
ト、ウサギ、ヤギ、ウマなどの動物を免疫感作してEP2
特異的抗体を増産させる。
哺乳類抗血清から精製されるか、またはKohler ＆ Mils
tein,Nature 256:495−497（1975）の方法を用いてEP2
と反応性のモノクローナル抗体として調製される。本文
中で使用される単一特異的抗体なる用語は、EP2に対し
て均一な結合特性をもつ単一抗体種または多重抗体種を
意味する。本文中で使用される均一結合なる用語は、上
記のようなEP2関連の抗体種が特異的抗原またはエピト
ープに結合する能力を意味する。免疫アジュバントを任
意に併用した適当な濃度のEP2またはEP2タンパク質の配
列に由来のペプチドによってマウス、ラット、モルモッ
ト、ウサギ、ヤギ、ウマなどの動物を免疫感作してEP2
特異的抗体を増産させる。
最初の免疫感作に先立ってプレ免疫血清を収集する。
各動物に、約0.1μｇ〜約1,000μｇのEP2またはEP2近縁
ペプチドを、許容される免疫アジュバントと共に投与す
る。このような許容されるアジュバントの非限定例は、
フロインド完全アジュバント、フロインド不完全アジュ
バント、ミョウバン沈降物、Corynebacterium parvumを
含む油中水エマルジョン及びtRNAである。初期免疫感作
では、好ましくはフロインド完全アジュバント中の酵素
を、皮下（SC）、腹膜組織（IP）または双方の経路で多
数部位に注射した。各動物を、定期的、好ましくは毎週
１回採血して抗体価を測定する。初期免疫感作後、動物
を任意に追加免疫し得る。追加免疫注射として通常は、
フロインド不完全アジュバント中のEP2またはEP2近縁ペ
プチドを同じ経路で動物に投与する。追加免疫注射は、
最大力価が得られるまで約３週毎に投与する。各追加免
疫のほぼ７日後毎または単一免疫感作後のほぼ毎週一回
ずつ動物を採血し、血清を収集し、アリコートを約−20
℃で保存する。
各動物に、約0.1μｇ〜約1,000μｇのEP2またはEP2近縁
ペプチドを、許容される免疫アジュバントと共に投与す
る。このような許容されるアジュバントの非限定例は、
フロインド完全アジュバント、フロインド不完全アジュ
バント、ミョウバン沈降物、Corynebacterium parvumを
含む油中水エマルジョン及びtRNAである。初期免疫感作
では、好ましくはフロインド完全アジュバント中の酵素
を、皮下（SC）、腹膜組織（IP）または双方の経路で多
数部位に注射した。各動物を、定期的、好ましくは毎週
１回採血して抗体価を測定する。初期免疫感作後、動物
を任意に追加免疫し得る。追加免疫注射として通常は、
フロインド不完全アジュバント中のEP2またはEP2近縁ペ
プチドを同じ経路で動物に投与する。追加免疫注射は、
最大力価が得られるまで約３週毎に投与する。各追加免
疫のほぼ７日後毎または単一免疫感作後のほぼ毎週一回
ずつ動物を採血し、血清を収集し、アリコートを約−20
℃で保存する。
EP2またはEP2タンパク質の配列に由来のペプチドと反
応性のモノクローナル抗体（mAb）は、近交系マウス、
好ましくはBalb/cをEP2またはEP2近縁ペプチドで免疫感
作することによって調製する。上記のような許容される
アジュバントを等容量で添加した約0.5mlのバッファま
たは生理食塩水中の約１μｇ〜約100μｇ、好ましくは
約10μｇのEP2またはEP2近縁ペプチドによってIPまたは
SC経路でマウスを免疫感作する。フロインド完全アジュ
バントが好ましい。マウスに対して、０日目に初期免疫
感作し、約３〜約30週維持する。免疫マウスに対して、
リン酸塩緩衝生理食塩水のようなバッファ溶液中の約１
μｇ〜約100μｇのEP2追加免疫を静脈内（IV）経路で１
回以上投与する。抗体陽性マウスのリンパ球、好ましく
は脾臓リンパ球を、当業界で公知の標準手順によって免
疫マウスの脾臓を摘出することによって採取する。脾臓
リンパ球と適当な融合相手好ましくは骨髄腫とを、安定
なハイブリドーマを形成し得る条件下に混合することに
よってハイブリドーマ細胞を産生する。融合相手の非限
定例としては、マウス骨髄腫P3/NS1/Ag4−1;MPC−11;S
−194及びSp2/0があり、Sp2/0が好ましい。抗体産生細
胞及び骨髄腫細胞を分子量約1,000のポリエチレングリ
コール中で約30％〜約50％の濃度で融合させる。融合し
たハイブリドーマ細胞を、ヒポキサンチン、チミジン及
びアミノプテリンを補充したダルベッコ改質イーグル培
地（DMEM）中で当業界で公知の手順で増殖させることに
よって選択する。第14日、18日及び21日目に増殖陽性ウ
エルから上清流体を収集し、EP2またはEP2近縁ペプチド
を抗原として用いる固相イムノラジオアッセイ（SPIR
A）のようなイムノアッセイによって抗体産生をスクリ
ーニングする。また、培養流体をオクタロニー沈降アッ
セイで試験してmAbのイソタイプを決定する。抗体陽性
ウエルからのハイブリドーマ細胞をMacPherson,Soft Ag
ar Techniques,Tissue culture Methods and Applicati
ons,Kruse ＆ Paterson編,Academic Press,1973の軟寒
天法のような方法によってクローニングする。
応性のモノクローナル抗体（mAb）は、近交系マウス、
好ましくはBalb/cをEP2またはEP2近縁ペプチドで免疫感
作することによって調製する。上記のような許容される
アジュバントを等容量で添加した約0.5mlのバッファま
たは生理食塩水中の約１μｇ〜約100μｇ、好ましくは
約10μｇのEP2またはEP2近縁ペプチドによってIPまたは
SC経路でマウスを免疫感作する。フロインド完全アジュ
バントが好ましい。マウスに対して、０日目に初期免疫
感作し、約３〜約30週維持する。免疫マウスに対して、
リン酸塩緩衝生理食塩水のようなバッファ溶液中の約１
μｇ〜約100μｇのEP2追加免疫を静脈内（IV）経路で１
回以上投与する。抗体陽性マウスのリンパ球、好ましく
は脾臓リンパ球を、当業界で公知の標準手順によって免
疫マウスの脾臓を摘出することによって採取する。脾臓
リンパ球と適当な融合相手好ましくは骨髄腫とを、安定
なハイブリドーマを形成し得る条件下に混合することに
よってハイブリドーマ細胞を産生する。融合相手の非限
定例としては、マウス骨髄腫P3/NS1/Ag4−1;MPC−11;S
−194及びSp2/0があり、Sp2/0が好ましい。抗体産生細
胞及び骨髄腫細胞を分子量約1,000のポリエチレングリ
コール中で約30％〜約50％の濃度で融合させる。融合し
たハイブリドーマ細胞を、ヒポキサンチン、チミジン及
びアミノプテリンを補充したダルベッコ改質イーグル培
地（DMEM）中で当業界で公知の手順で増殖させることに
よって選択する。第14日、18日及び21日目に増殖陽性ウ
エルから上清流体を収集し、EP2またはEP2近縁ペプチド
を抗原として用いる固相イムノラジオアッセイ（SPIR
A）のようなイムノアッセイによって抗体産生をスクリ
ーニングする。また、培養流体をオクタロニー沈降アッ
セイで試験してmAbのイソタイプを決定する。抗体陽性
ウエルからのハイブリドーマ細胞をMacPherson,Soft Ag
ar Techniques,Tissue culture Methods and Applicati
ons,Kruse ＆ Paterson編,Academic Press,1973の軟寒
天法のような方法によってクローニングする。
プリスチン感作したBalb/cマウスに対して、その約４
日後に約２×106〜約６×106ハイブリドーマ細胞をマウ
スあたり約0.5mlの量で注射することによってモノクロ
ーナル抗体をin vivoで産生させる。細胞移入の約８〜1
2日後に腹水を収集し、当業界で公知の方法でモノクロ
ーナル抗体を精製する。
日後に約２×106〜約６×106ハイブリドーマ細胞をマウ
スあたり約0.5mlの量で注射することによってモノクロ
ーナル抗体をin vivoで産生させる。細胞移入の約８〜1
2日後に腹水を収集し、当業界で公知の方法でモノクロ
ーナル抗体を精製する。
抗EP2mAbのin vitro産生では、十分な量の特異的mAb
を得るために約２％のウシ胎仔血清を含有するDMEM中で
ハイブリドーマを増殖させる。当業界で公知の方法でmA
bを精製する。
を得るために約２％のウシ胎仔血清を含有するDMEM中で
ハイブリドーマを増殖させる。当業界で公知の方法でmA
bを精製する。
腹水またはハイブリドーマ培養流体の抗体価は、沈
降、受動凝集、エンザイムリンクトイムノソルベント抗
体アッセイ法（ELISA）及びラジオイムノアッセイ法（R
IA）などを非限定例とする種々の血清学的または免疫学
的アッセイによって決定する。体液または組織及び細胞
抽出物中のEP2の存在を検出するためにも同様のアッセ
イを使用する。
降、受動凝集、エンザイムリンクトイムノソルベント抗
体アッセイ法（ELISA）及びラジオイムノアッセイ法（R
IA）などを非限定例とする種々の血清学的または免疫学
的アッセイによって決定する。体液または組織及び細胞
抽出物中のEP2の存在を検出するためにも同様のアッセ
イを使用する。
単一特異的抗体を産生するための上記の方法がEP2ポ
リペプチドフラグメントまたは全長EP2ポリペプチドに
特異的な抗体を産生するために使用できることは容易に
理解されよう。
リペプチドフラグメントまたは全長EP2ポリペプチドに
特異的な抗体を産生するために使用できることは容易に
理解されよう。
抗体をAffigel−10（Biorad）に添加することによっ
てEP2抗体精製カラムを作製し得る。Affigelは、抗体と
アガロースゲルビーズ支持体とが共有結合を形成するよ
うにＮ−ヒドロキシスクシンイミドでプレ活性化したゲ
ル支持体である。次に抗体をスペサーアームとのアミド
結合によってゲルに結合させる。次に1Mの塩酸エタノー
ルアミン（pH8）によって残りの活性化エステルの反応
を停止させる。カラムを水、0.23Mの塩酸グリシン（pH
2.6）で順次洗浄して、非結合抗体または不要タンパク
質を除去する。次に、界面活性剤のような適当な膜可溶
化剤を加えたリン酸塩緩衝生理食塩水（pH7.3）中でカ
ラムを平衡させ、EP2またはEP2フラグメントを含有する
細胞培養上清または細胞抽出物をゆっくりとカラムに通
す。次に、界面活性剤のような適当な膜可溶化剤を加え
たリン酸塩緩衝生理食塩水で、光学密度（A280）がバッ
クグラウンドに下がるまでカラムを洗浄し、界面活性剤
のような適当な膜可溶化剤を加えた0.23Mの塩酸グリシ
ン（pH2.6）を用いてタンパク質を溶出させる。精製し
たEP2タンパク質を次に、界面活性剤のような適当な膜
可溶化剤を加えたリン酸塩緩衝生理食塩水に対して透析
する。
てEP2抗体精製カラムを作製し得る。Affigelは、抗体と
アガロースゲルビーズ支持体とが共有結合を形成するよ
うにＮ−ヒドロキシスクシンイミドでプレ活性化したゲ
ル支持体である。次に抗体をスペサーアームとのアミド
結合によってゲルに結合させる。次に1Mの塩酸エタノー
ルアミン（pH8）によって残りの活性化エステルの反応
を停止させる。カラムを水、0.23Mの塩酸グリシン（pH
2.6）で順次洗浄して、非結合抗体または不要タンパク
質を除去する。次に、界面活性剤のような適当な膜可溶
化剤を加えたリン酸塩緩衝生理食塩水（pH7.3）中でカ
ラムを平衡させ、EP2またはEP2フラグメントを含有する
細胞培養上清または細胞抽出物をゆっくりとカラムに通
す。次に、界面活性剤のような適当な膜可溶化剤を加え
たリン酸塩緩衝生理食塩水で、光学密度（A280）がバッ
クグラウンドに下がるまでカラムを洗浄し、界面活性剤
のような適当な膜可溶化剤を加えた0.23Mの塩酸グリシ
ン（pH2.6）を用いてタンパク質を溶出させる。精製し
たEP2タンパク質を次に、界面活性剤のような適当な膜
可溶化剤を加えたリン酸塩緩衝生理食塩水に対して透析
する。
本発明のプロスタグランジンレセプターをコードする
DNAの適当な単離方法の１つでは、他のＧタンパク質結
合レセプターから得られたアミノ酸及び／またはDNA配
列情報を利用する。他のプロスタグランジンレセプター
はＧタンパク質に結合することが分かっているので、ト
ランスメンブラン及び／または細胞質ドメインのような
ある種の領域またはドメインは新規なレセプターの単離
プローブを産生するために十分なある程度の相同を有し
ていると予想される。
DNAの適当な単離方法の１つでは、他のＧタンパク質結
合レセプターから得られたアミノ酸及び／またはDNA配
列情報を利用する。他のプロスタグランジンレセプター
はＧタンパク質に結合することが分かっているので、ト
ランスメンブラン及び／または細胞質ドメインのような
ある種の領域またはドメインは新規なレセプターの単離
プローブを産生するために十分なある程度の相同を有し
ていると予想される。
プロスタグランジン及びロイコトリエンはＧタンパク
質結合したレセプターを介して夫々のシグナルを形質導
入することが分かっている。種々の組織中に存在するPG
H2/トロンボキサンA2、PGI2、PGE2、PGD2、PGF２α、LT
B4及びLTD4に対する種々のレセプターに関する記載が存
在する。いくつかのレセプターは可溶化され部分的に精
製されており（Dutta−Roy,A.K.ら，（1987）JBC,262,p
p.12685;Tsai,A.L.ら，（1989）,JBC,264,pp61;168−Wa
tanbe,T.ら，（1990）,JBc,265,pp.21237）、ヒト血小
板TXA2レセプターは見掛け均一まで精製された（Ushiku
bi,F.ら，（1989）,JBC,264,pp,16496）。精製されたト
ロンボキサンレセプターは、SDSポリアクリルアミドゲ
ル上で約57kDaを中心とする極めて広いバンドを示し
た。部分的配列情報のために十分なタンパク質が得られ
た。
質結合したレセプターを介して夫々のシグナルを形質導
入することが分かっている。種々の組織中に存在するPG
H2/トロンボキサンA2、PGI2、PGE2、PGD2、PGF２α、LT
B4及びLTD4に対する種々のレセプターに関する記載が存
在する。いくつかのレセプターは可溶化され部分的に精
製されており（Dutta−Roy,A.K.ら，（1987）JBC,262,p
p.12685;Tsai,A.L.ら，（1989）,JBC,264,pp61;168−Wa
tanbe,T.ら，（1990）,JBc,265,pp.21237）、ヒト血小
板TXA2レセプターは見掛け均一まで精製された（Ushiku
bi,F.ら，（1989）,JBC,264,pp,16496）。精製されたト
ロンボキサンレセプターは、SDSポリアクリルアミドゲ
ル上で約57kDaを中心とする極めて広いバンドを示し
た。部分的配列情報のために十分なタンパク質が得られ
た。
これらのレセプターが一次構造において近縁であると
いう仮定のもとに他のエイコサノイドレセプター遺伝子
を相同スクリーニングによって単離する方法を採用した
（Sugimoto,Y.ら，（1992）,JBC,267,pp.6463）。これ
らのレセプターはＧタンパク質結合レセプタースーパー
ファミリーに属するので、トランスメンブラン領域及び
細胞質ドメイン中に相同領域が存在する公算が大きい。
従って、プロスタグランジンレセプターに近縁の種々の
既知のＧタンパク質結合レセプターは、トランスメンブ
ラン領域のような、レセプタータンパク質をコードする
探索中のDNAの相同を有し易い領域に対するDNAプローブ
として使用し得る。
いう仮定のもとに他のエイコサノイドレセプター遺伝子
を相同スクリーニングによって単離する方法を採用した
（Sugimoto,Y.ら，（1992）,JBC,267,pp.6463）。これ
らのレセプターはＧタンパク質結合レセプタースーパー
ファミリーに属するので、トランスメンブラン領域及び
細胞質ドメイン中に相同領域が存在する公算が大きい。
従って、プロスタグランジンレセプターに近縁の種々の
既知のＧタンパク質結合レセプターは、トランスメンブ
ラン領域のような、レセプタータンパク質をコードする
探索中のDNAの相同を有し易い領域に対するDNAプローブ
として使用し得る。
このレセプターのＣ末端の165個のアミノ酸領域をコ
ードするマウスEP2レセプターcDNAの0.68kbのフラグメ
ントを使用して、ヒト肺ライブラリーをスクリーニング
し、このライブラリーから全長ヒトEP2cDNAを単離し
た。この1.958kbのcDNAクローンは488アミノ酸のタンパ
ク質をコードしている。このタンパク質をEP2レセプタ
ーと命名した。他の多くのＧタンパク質結合レセプター
と同様に、EP2レセプターはいくつかの特徴を共有して
いる。第一に、推定される細胞外アミノ末端のAsn7及び
Asn177に２つのＮ結合グリコシル化（糖付加）部位が存
在するという可能性を含む。第二に、細胞外ループ１及
び２に保存システイン残基が検出される。Ｃ末端全体及
び第三の細胞質ループに多数のセリン残基、タンパク質
キナーゼリン酸化可能部位が存在する。EP2レセプター
は、トランスメンブラン３にカチオン性アミノ含有リガ
ンドと結合するレセプターに特徴的なアスパラギン酸残
基を含んでいないが、トランスメンブラン７の内部には
既知のエイコサノイドレセプターのすべてにおいて検出
される保存アルギニン（315位）を含む。
ードするマウスEP2レセプターcDNAの0.68kbのフラグメ
ントを使用して、ヒト肺ライブラリーをスクリーニング
し、このライブラリーから全長ヒトEP2cDNAを単離し
た。この1.958kbのcDNAクローンは488アミノ酸のタンパ
ク質をコードしている。このタンパク質をEP2レセプタ
ーと命名した。他の多くのＧタンパク質結合レセプター
と同様に、EP2レセプターはいくつかの特徴を共有して
いる。第一に、推定される細胞外アミノ末端のAsn7及び
Asn177に２つのＮ結合グリコシル化（糖付加）部位が存
在するという可能性を含む。第二に、細胞外ループ１及
び２に保存システイン残基が検出される。Ｃ末端全体及
び第三の細胞質ループに多数のセリン残基、タンパク質
キナーゼリン酸化可能部位が存在する。EP2レセプター
は、トランスメンブラン３にカチオン性アミノ含有リガ
ンドと結合するレセプターに特徴的なアスパラギン酸残
基を含んでいないが、トランスメンブラン７の内部には
既知のエイコサノイドレセプターのすべてにおいて検出
される保存アルギニン（315位）を含む。
本発明の新規なプロスタグランジンレセプターは、レ
セプター活性調節化合物を選定するアッセイ手順で使用
するのに適している。本文中に記載されたレセプター活
性の調節は、レセプターの阻害または活性化を意味し、
また、レセプター活性の正常な調節に対する直接または
間接の影響を意味する。レセプター活性調節化合物とし
ては、アゴニスト、アンタゴニスト、及び、レセプター
活性の調節に直接または間接の影響を与える化合物があ
る。
セプター活性調節化合物を選定するアッセイ手順で使用
するのに適している。本文中に記載されたレセプター活
性の調節は、レセプターの阻害または活性化を意味し、
また、レセプター活性の正常な調節に対する直接または
間接の影響を意味する。レセプター活性調節化合物とし
ては、アゴニスト、アンタゴニスト、及び、レセプター
活性の調節に直接または間接の影響を与える化合物があ
る。
レセプターのモジュレーターを選定するアッセイ手順
で使用するための本発明のプロスタグランジンレセプタ
ーは、天然型ソース及び組換えソースのいずれから得ら
れてもよい。プロスタグランジンレセプターのモジュレ
ーターを選定するアッセイ手順は一般には、本発明のプ
ロスタグランジンレセプターと、プロスタグランジンレ
セプターのモジュレーターを含むと推定される被検化合
物またはサンプルを用いる。被検化合物またはサンプル
を、例えば天然型または組換え型の精製レセプタータン
パク質、天然型または組換え型のレセプター産生細胞の
継代細胞画分、及び／または天然型または組換え型のレ
セプターを発現する全細胞に対して直接試験し得る。試
験化合物またはサンプルは既知の標識または非標識のレ
セプターリガンドの存在または非存在下にレセプターに
添加され得る。被検化合物またはサンプルの調節活性
は、レセプターに対する結合、レセプターの活性化、レ
セプター活性の阻害、レセプターに対する他の化合物の
結合の阻害もしくは増進、レセプター調節の修飾または
細胞内活性の修飾に関する被検化合物またはサンプルの
能力を分析することによって決定され得る。
で使用するための本発明のプロスタグランジンレセプタ
ーは、天然型ソース及び組換えソースのいずれから得ら
れてもよい。プロスタグランジンレセプターのモジュレ
ーターを選定するアッセイ手順は一般には、本発明のプ
ロスタグランジンレセプターと、プロスタグランジンレ
セプターのモジュレーターを含むと推定される被検化合
物またはサンプルを用いる。被検化合物またはサンプル
を、例えば天然型または組換え型の精製レセプタータン
パク質、天然型または組換え型のレセプター産生細胞の
継代細胞画分、及び／または天然型または組換え型のレ
セプターを発現する全細胞に対して直接試験し得る。試
験化合物またはサンプルは既知の標識または非標識のレ
セプターリガンドの存在または非存在下にレセプターに
添加され得る。被検化合物またはサンプルの調節活性
は、レセプターに対する結合、レセプターの活性化、レ
セプター活性の阻害、レセプターに対する他の化合物の
結合の阻害もしくは増進、レセプター調節の修飾または
細胞内活性の修飾に関する被検化合物またはサンプルの
能力を分析することによって決定され得る。
EP2レセプター活性のモジュレーターの選定は、EP2レ
セプター活性が関与する疾患状態の治療に有用である。
他の化合物は、レセプターの活性を刺激または阻害する
ために有用であろう。EP2レセプターの選択的アゴニス
トまたはアンタゴニストは、炎症、疼痛反応及び発熱に
伴う浮腫の治療に有用であろう。また砕骨機能、従って
骨吸収、Ｔ及びＢ−リンパ球機能、従って免疫反応、血
管網、気管気管支網のような平滑筋弛緩、新生及び転移
性腫瘍増殖、などのモジュレーターとして有用であろ
う。EP2をコードするDNA分子の単離及び精製は、EP2レ
セプターの組織分布の確定、疾患状態におけるEP2レセ
プター発現の変化の研究、EP2レセプター活性を調節す
る化合物の選定方法の確立に有用であろう。
セプター活性が関与する疾患状態の治療に有用である。
他の化合物は、レセプターの活性を刺激または阻害する
ために有用であろう。EP2レセプターの選択的アゴニス
トまたはアンタゴニストは、炎症、疼痛反応及び発熱に
伴う浮腫の治療に有用であろう。また砕骨機能、従って
骨吸収、Ｔ及びＢ−リンパ球機能、従って免疫反応、血
管網、気管気管支網のような平滑筋弛緩、新生及び転移
性腫瘍増殖、などのモジュレーターとして有用であろ
う。EP2をコードするDNA分子の単離及び精製は、EP2レ
セプターの組織分布の確定、疾患状態におけるEP2レセ
プター発現の変化の研究、EP2レセプター活性を調節す
る化合物の選定方法の確立に有用であろう。
以下の実施例は本発明の例示であり、本発明はこれら
の実施例に限定されない。
の実施例に限定されない。
実施例１ EP2cDNAのクローニング マウス肥満細胞腫Ｐ−815細胞の全RNAからRT−PCRに
よってマウスEP2の部分cDNA（680bp）を採取し、クロー
ニングした。このマウスEP2フラグメントを使用して、
標準方法（Sambrookら,1989,Molecular cloning:A Labo
ratory Manual,2nd Ed.,Cold Spring Harbor Laborator
y,Cold Spring Harbor,N.Y.）を用いてヒト肺λgt10ラ
イブラリー（Clontech,Palo Alto,CA）をスクリーニン
グするための32P標識cDNAプローブを作製した。
よってマウスEP2の部分cDNA（680bp）を採取し、クロー
ニングした。このマウスEP2フラグメントを使用して、
標準方法（Sambrookら,1989,Molecular cloning:A Labo
ratory Manual,2nd Ed.,Cold Spring Harbor Laborator
y,Cold Spring Harbor,N.Y.）を用いてヒト肺λgt10ラ
イブラリー（Clontech,Palo Alto,CA）をスクリーニン
グするための32P標識cDNAプローブを作製した。
このスクリーニングから1.958kbのcDNAクローンをプ
ラーク精製し、プレート溶菌法（Sambrookら，前掲書）
によってDNAを調製した。
ラーク精製し、プレート溶菌法（Sambrookら，前掲書）
によってDNAを調製した。
cDNAのサブクローニング及び配列決定 T7 DNAポリメラーゼ配列決定キット（Pharmacia）を
用いて配列決定を行うために、1.958kbのEcoR Iフラグ
メント（EP2）をpSKベクター（Stratagene,La Jolla,C
A）にサブクローニングした。KS及びSKプライマー（Str
atagene,La Jolla,CA）または決定された配列から生成
したプライマーを用いて双方の鎖を完全に配列決定し
た。EP2のヌクレオチド配列を表１に示す。コードされ
たタンパク質のアミノ酸配列を表２に示す。配列決定さ
れた1.958kbのフラグメント（EP2;図１）はヒトEP1、EP
3及びトロンボキサンレセプターcDNAとの配列相同を含
み、Ｇタンパク質結合レセプターに特有の推定ヘプタヘ
リカル構成が明らかであった。長い読み取り枠（1464b
p）を決定すると、これは、予測された相対分子量53,11
5を有する488アミノ酸のポリペプチドであった。開始コ
ドンとなるATGは、翻訳開始用のKozakコンセンサス配列
に適正対合する（Kozak,1989,J.Cell.Biol.108,pp229−
241）。予測された開始コドンの86bp上流に枠に合致す
るTGA終止コドンを含む、388bpの５′−非翻訳配列が存
在する。
用いて配列決定を行うために、1.958kbのEcoR Iフラグ
メント（EP2）をpSKベクター（Stratagene,La Jolla,C
A）にサブクローニングした。KS及びSKプライマー（Str
atagene,La Jolla,CA）または決定された配列から生成
したプライマーを用いて双方の鎖を完全に配列決定し
た。EP2のヌクレオチド配列を表１に示す。コードされ
たタンパク質のアミノ酸配列を表２に示す。配列決定さ
れた1.958kbのフラグメント（EP2;図１）はヒトEP1、EP
3及びトロンボキサンレセプターcDNAとの配列相同を含
み、Ｇタンパク質結合レセプターに特有の推定ヘプタヘ
リカル構成が明らかであった。長い読み取り枠（1464b
p）を決定すると、これは、予測された相対分子量53,11
5を有する488アミノ酸のポリペプチドであった。開始コ
ドンとなるATGは、翻訳開始用のKozakコンセンサス配列
に適正対合する（Kozak,1989,J.Cell.Biol.108,pp229−
241）。予測された開始コドンの86bp上流に枠に合致す
るTGA終止コドンを含む、388bpの５′−非翻訳配列が存
在する。
実施例２ pcDNA I amp−EP2発現ベクターの構築 1.507KbのFsp1−ScalヒトEP2cDNAフラグメントをpcDN
A I ampのEcoR V部位にサブクローニングし、PSt I消化
によって正しい配向を確認した。
A I ampのEcoR V部位にサブクローニングし、PSt I消化
によって正しい配向を確認した。
実施例３ 大腸菌発現ベクター中のEP2cDNAのクローニング pETシリーズ（Novagen）を非限定例とする大腸菌発現
ベクターにEP2発現カセットを移入し、組換えEP2を大腸
菌中で産生させる。pETベクターは、厳密に調節された
バクテリオファージT7プロモーターの調節下にEP2発現
を維持する。誘導性lacプロモーターによって駆動され
るT7 RNAポリメラーゼ遺伝子の染色体コピーを含む大腸
菌宿主にこの構築物を移入した後、適正なlac基質（IPT
G）を培養物に添加すると、EP2の発現が誘導される。発
現したEP2のレベルを前述のアッセイによって決定す
る。
ベクターにEP2発現カセットを移入し、組換えEP2を大腸
菌中で産生させる。pETベクターは、厳密に調節された
バクテリオファージT7プロモーターの調節下にEP2発現
を維持する。誘導性lacプロモーターによって駆動され
るT7 RNAポリメラーゼ遺伝子の染色体コピーを含む大腸
菌宿主にこの構築物を移入した後、適正なlac基質（IPT
G）を培養物に添加すると、EP2の発現が誘導される。発
現したEP2のレベルを前述のアッセイによって決定す
る。
EP2の完全読み取り枠をコードしているcDNAをpET 11a
のNde I部位に挿入する。正の配向の構築物を配列解析
によって同定し、これを用いて発現宿主菌株BL21を形質
転換させる。次に、形質転換体をEP2タンパク質産生用
培養物に接種する。培養物はM9またはZB培地中で増殖し
得る。これらの培地の配合組成は当業界で公知である。
ほぼOD600＝1.5になるまで増殖させた後、1mMのIPTGに
よってEP2の発現を37℃で３時間誘発する。EP2レセプタ
ー結合活性はこれらの細胞からの膜画分中で検出される
であろう。
のNde I部位に挿入する。正の配向の構築物を配列解析
によって同定し、これを用いて発現宿主菌株BL21を形質
転換させる。次に、形質転換体をEP2タンパク質産生用
培養物に接種する。培養物はM9またはZB培地中で増殖し
得る。これらの培地の配合組成は当業界で公知である。
ほぼOD600＝1.5になるまで増殖させた後、1mMのIPTGに
よってEP2の発現を37℃で３時間誘発する。EP2レセプタ
ー結合活性はこれらの細胞からの膜画分中で検出される
であろう。
実施例４ アフリカツメガエル卵母細胞マイクロインジェクション
による合成EP2mRNAのin vitro翻訳及び哺乳類細胞中で
の発現 合成mRNA産生用のin vitro転写ベクター（pGEMシリー
ズ、Promega）にEP2cDNA構築物を結合させる。
による合成EP2mRNAのin vitro翻訳及び哺乳類細胞中で
の発現 合成mRNA産生用のin vitro転写ベクター（pGEMシリー
ズ、Promega）にEP2cDNA構築物を結合させる。
EP2mRNAをコードしている二重鎖DNAを、バクテリオフ
ァージプロモーターを含むプラスミドベクターにクロー
ニングし、EP2をコードするクローン化DNAを含むプラス
ミドベクターを直鎖化し、プラスミドベクターのバクテ
リオファージプロモーターを特異的に認識するバクテリ
オファージ由来のDNA依存性RNAポリメラーゼを用いてク
ローン化DNAをin vitro転写することによって、十分な
量の合成mRNAをin vitro産生させる。
ァージプロモーターを含むプラスミドベクターにクロー
ニングし、EP2をコードするクローン化DNAを含むプラス
ミドベクターを直鎖化し、プラスミドベクターのバクテ
リオファージプロモーターを特異的に認識するバクテリ
オファージ由来のDNA依存性RNAポリメラーゼを用いてク
ローン化DNAをin vitro転写することによって、十分な
量の合成mRNAをin vitro産生させる。
バクテリオファージのDNA依存性RNAポリメラーゼによ
って認識されるバクテリオファージプロモーターを含む
種々のプラスミドベクターが入手可能であり、その非限
定例としては、pSP64、pSP65、pSP70、pSP71、pSP72、p
SP73、pGEM−3Z、pGEM−4Z、pGEM−3Zf、pGEM−5Zf、pG
EM−7Zf、pGEM−9Zf及びpGEM−11Zfがあり、これらのプ
ラスミドの全シリーズはPromegaから市販されている。
って認識されるバクテリオファージプロモーターを含む
種々のプラスミドベクターが入手可能であり、その非限
定例としては、pSP64、pSP65、pSP70、pSP71、pSP72、p
SP73、pGEM−3Z、pGEM−4Z、pGEM−3Zf、pGEM−5Zf、pG
EM−7Zf、pGEM−9Zf及びpGEM−11Zfがあり、これらのプ
ラスミドの全シリーズはPromegaから市販されている。
EP2DNAのクローニングに好都合な好適なベクターの１
つ以上の利用可能な制限エンドヌクレアーゼクローニン
グ部位を利用し、EP2をコードする二重鎖DNAを適正な配
向でバクテリオファージプロモーター含有ベクターにク
ローニングする。EP2DNAを結合したベクターを使用して
細菌を形質転換させ、クローナル単離物について適正配
向のEP2DNAを含むベクターの存在を分析する。
つ以上の利用可能な制限エンドヌクレアーゼクローニン
グ部位を利用し、EP2をコードする二重鎖DNAを適正な配
向でバクテリオファージプロモーター含有ベクターにク
ローニングする。EP2DNAを結合したベクターを使用して
細菌を形質転換させ、クローナル単離物について適正配
向のEP2DNAを含むベクターの存在を分析する。
EP2をコードするDNAを適正配向で含むベクターを同定
し単離した後、EP2転写ユニットよりも下流の部位の制
限エンドヌクレアーゼによってそれを破壊することなく
このベクターを開裂して直鎖化する。直鎖化したプラス
ミドを単離及び精製し、EP2mRNAのin vitro転写用鋳型
として使用する。
し単離した後、EP2転写ユニットよりも下流の部位の制
限エンドヌクレアーゼによってそれを破壊することなく
このベクターを開裂して直鎖化する。直鎖化したプラス
ミドを単離及び精製し、EP2mRNAのin vitro転写用鋳型
として使用する。
次に、鋳型DNAを、DNA鋳型を転写してEP2mRNAを形成
させる反応混合物中のバクテリオファージ特異的DNA依
存性RNAポリメラーゼと混合する。バクテリオファージ
特異的DNA依存性RNAポリメラーゼとしては数種類が入手
可能であり、その非限定例としては、T3、T7及びSP6 RN
Aポリメラーゼがある。次に、合成EP2mRNAを単離し精製
する。
させる反応混合物中のバクテリオファージ特異的DNA依
存性RNAポリメラーゼと混合する。バクテリオファージ
特異的DNA依存性RNAポリメラーゼとしては数種類が入手
可能であり、その非限定例としては、T3、T7及びSP6 RN
Aポリメラーゼがある。次に、合成EP2mRNAを単離し精製
する。
mRNAの安定性を改良するためには、５′末端キャップ
構造と３′ポリＡテールとを含有するmRNAを合成するの
が有利であろう。キャップ構造、すなわち７−メチルグ
アノシンは、DNA鋳型を含む反応混合物に７−メチルグ
アノシンを添加するだけでmRNAの５′末端に組込むこと
ができる。DNA依存性RNAポリメラーゼはmRNAを合成する
ときに５′末端にキャップ構造を取込む。ポリＡテール
は多くのcDNA中で天然に発生することが知られている
が、DNA鋳型の３′端にポリＡテールをコードするDNA配
列を挿入するだけでmRNAの３′末端に付加できる。
構造と３′ポリＡテールとを含有するmRNAを合成するの
が有利であろう。キャップ構造、すなわち７−メチルグ
アノシンは、DNA鋳型を含む反応混合物に７−メチルグ
アノシンを添加するだけでmRNAの５′末端に組込むこと
ができる。DNA依存性RNAポリメラーゼはmRNAを合成する
ときに５′末端にキャップ構造を取込む。ポリＡテール
は多くのcDNA中で天然に発生することが知られている
が、DNA鋳型の３′端にポリＡテールをコードするDNA配
列を挿入するだけでmRNAの３′末端に付加できる。
単離し精製したEP2mRNAを無細胞系または細胞ベース
系を用いて翻訳する。無細胞系の非限定例としては、ウ
サギ網状赤血球溶解物及び小麦胚芽エキス（双方ともPr
omega及びNew England Nuclearから市販されている）が
あり、細胞ベース系の非限定例としては、アフリカツメ
ガエル卵母細胞へのマイクロインジェクションがある。
アフリカツメガエル卵母細胞へのマイクロインジェクシ
ョンが好ましい。
系を用いて翻訳する。無細胞系の非限定例としては、ウ
サギ網状赤血球溶解物及び小麦胚芽エキス（双方ともPr
omega及びNew England Nuclearから市販されている）が
あり、細胞ベース系の非限定例としては、アフリカツメ
ガエル卵母細胞へのマイクロインジェクションがある。
アフリカツメガエル卵母細胞へのマイクロインジェクシ
ョンが好ましい。
アフリカツメガエル卵母細胞に十分な量の合成EP2mRN
Aを微量注入してEP2タンパク質を産生させる。微量注入
した卵母細胞をインキュベートしてEP2mRNAを翻訳さ
せ、EP2タンパク質を形成する。
Aを微量注入してEP2タンパク質を産生させる。微量注入
した卵母細胞をインキュベートしてEP2mRNAを翻訳さ
せ、EP2タンパク質を形成する。
これらの合成mRNAを標準手順〔Gurdon,J.B.and Wicke
ns,M.D.Methods in Enzymol.101:370−386,（1983）〕
によってアフリカツメガエル卵母細胞（５〜６期）に注
入する。卵母細胞を回収し、以下のようにしてEP2発現
の有無を分析する。
ns,M.D.Methods in Enzymol.101:370−386,（1983）〕
によってアフリカツメガエル卵母細胞（５〜６期）に注
入する。卵母細胞を回収し、以下のようにしてEP2発現
の有無を分析する。
実施例５ アフリカツメガエル卵母細胞中のpcDNA I amp−EP2発現 標準外科手順（Colman,A.,1984:Transcription and T
ranslation−A Practical Approach,IRL Press）を用い
て雌アフリカツメガエル成体から卵母細胞を採取した。
卵胞細胞を除去するために、Ca2+非含有のND96溶液（96
mMのNaCl、2mMのKCl、1mMのMgCl2、5mMのHEPES、2.5mM
のピルビン酸ナトリウム、0.5mMのテオフィリン、50mg/
mlのゲンタマイシン＋1.8mMのCaCl2を含むpH7.6のND9
6）中で、新しく調製したコラゲナーゼ（2mg/ml、２
型、Worthington Biochemical Corp.,Freehold,NJ）に
よって卵母細胞を２〜３時間処理した。卵胞を除去した
５〜６期の卵母細胞を選択し、ND96溶液に維持した。卵
母細胞の核に1.6ngのpcDNA I amp−EP2と2.5ngのpcDNA
I amp−CFTRとを注入し、次いでアゴニストで攻撃する
前に18℃で48時間インキュベートした。CFTR（嚢胞性線
維症トランスメンブラン調節物質、cAMP依存性Cl-チャ
ンネル）はこれらの卵母細胞中のEP2レセプターと同時
発現し、細胞内cAMPのレベル変化の指標となる。機能性
活性をPGE2−誘導CFTR媒介Cl-電流の測定値から決定し
た。卵母細胞を0.5mlの潅流室に入れ、Turbo TEC 01C増
幅器（NPI Instruments,Germany）を使用し、−60mVの
固定電圧をかけた（3MのKClを充填した0.5〜2.0MW抵抗
のマイクロ電極を用いる）。リガンド含有溶液を潅流さ
せ、電流応答を記録した。
ranslation−A Practical Approach,IRL Press）を用い
て雌アフリカツメガエル成体から卵母細胞を採取した。
卵胞細胞を除去するために、Ca2+非含有のND96溶液（96
mMのNaCl、2mMのKCl、1mMのMgCl2、5mMのHEPES、2.5mM
のピルビン酸ナトリウム、0.5mMのテオフィリン、50mg/
mlのゲンタマイシン＋1.8mMのCaCl2を含むpH7.6のND9
6）中で、新しく調製したコラゲナーゼ（2mg/ml、２
型、Worthington Biochemical Corp.,Freehold,NJ）に
よって卵母細胞を２〜３時間処理した。卵胞を除去した
５〜６期の卵母細胞を選択し、ND96溶液に維持した。卵
母細胞の核に1.6ngのpcDNA I amp−EP2と2.5ngのpcDNA
I amp−CFTRとを注入し、次いでアゴニストで攻撃する
前に18℃で48時間インキュベートした。CFTR（嚢胞性線
維症トランスメンブラン調節物質、cAMP依存性Cl-チャ
ンネル）はこれらの卵母細胞中のEP2レセプターと同時
発現し、細胞内cAMPのレベル変化の指標となる。機能性
活性をPGE2−誘導CFTR媒介Cl-電流の測定値から決定し
た。卵母細胞を0.5mlの潅流室に入れ、Turbo TEC 01C増
幅器（NPI Instruments,Germany）を使用し、−60mVの
固定電圧をかけた（3MのKClを充填した0.5〜2.0MW抵抗
のマイクロ電極を用いる）。リガンド含有溶液を潅流さ
せ、電流応答を記録した。
1nMのPGE2アゴニストの潅流は、pcDNA I amp−EP2とp
cDNA I amp−CFTRとを注入した卵母細胞中で顕著な電流
応答を生じ、これは、このクローンがcAMPシグナル発生
経路に結合する機能性EP2レセプターをコードしている
ことを証明する（図３）。１μＭのPGF２αに対する応
答は、EP2レセプターサブタイプについて予想されたよ
うにはるかに微弱であった。対照卵母細胞（CFTR単独注
入またはCFTRとアンチセンスEP2cDNAの併用注入）では
このような応答は観察されなかった（図４）。この力価
の順位は、EP2レセプターに関して報告されている順位
と一致している〔Colemanら,1991〕。
cDNA I amp−CFTRとを注入した卵母細胞中で顕著な電流
応答を生じ、これは、このクローンがcAMPシグナル発生
経路に結合する機能性EP2レセプターをコードしている
ことを証明する（図３）。１μＭのPGF２αに対する応
答は、EP2レセプターサブタイプについて予想されたよ
うにはるかに微弱であった。対照卵母細胞（CFTR単独注
入またはCFTRとアンチセンスEP2cDNAの併用注入）では
このような応答は観察されなかった（図４）。この力価
の順位は、EP2レセプターに関して報告されている順位
と一致している〔Colemanら,1991〕。
実施例６ 哺乳類発現ベクター中のEP2cDNAのクローニング 強力な汎用哺乳類プロモーター類を含む以下のベクタ
ー:pBC12BI〔Cullen,B.R.Methods in Enzymol.152:684
−704 1988〕、pEE12（CellTech EP0 338 841）、並び
に、その誘導体pSZ9016−１及びp9019に、EP2cDNA発現
カセットを適切な制限エンドヌクレアーゼ部位で結合さ
せる。p9019は、hCMVIEプロモーター、ポリリンカー及
びSV40ポリＡ因子を、SV40初期プロモーターによって駆
動されるジヒドロ葉酸レダクターゼの突然変異遺伝子
（mDHFR）（Simonsen,C.C. ＆ Levinson,A.D.,Proc.Nat
l.Acad.Sci USA 80:2495−2499〔1983〕）から成る選択
可能マーカー／増幅系と共に含む哺乳類発現ベクターの
構築物である。SV40ポリアデニル化配列は、pD5（Berke
r ＆ Sharp,Nucl.Acid Res.13:841−857〔1985〕）を鋳
型として用いるプライマー13978−120及び139778−121
によって定められるPCR反応によって生じる。得られた
0.25KbのPCR産物をCla I及びSpe Iによって消化し、同
様に消化しておいたpEE12の6.7Kbのフラグメントに結合
させる。得られたプラスミドをBgl II及びSfi Iによっ
て消化してSV40初期プロモーターの３′部分とGScDNAと
をベクターから遊離させる。プラスミドpFR400（Simons
enら，前出）から単離した0.73kBのSfi I−Xho IIのフ
ラグメントを上記の5.6Kbのベクターに結合させてSV40
初期プロモーターを再構成し、mdHFR遺伝子を挿入す
る。このプラスミドをp9019と命名する。pSZ9016−１は
huCMVIEプロモーターがHIV LTRで置換されている以外は
p9019に等しい。このベクターは、p9019をXba I及びMlu
Iで消化してhuCMVIEプロモーターを除去することによ
って構築される。HIV−1 LTR（Cullen,Cell 46:973〔19
86〕）の一部を含むベクターpCD23に見出される残基−1
17〜＋80からのHIV LTRプロモーターを、オリゴヌクレ
オチドプライマーを用いてプラスミドpCD23からPCR増幅
する。用いられるオリゴヌクレオチドプライマーは、産
生物の５′側の末端にMlu I及びSpe I制限部位を付加す
る。他方、３′側にはHind III及びXba I部位が付加さ
れている。得られた0.2KbのPCR産生物を酵素Mlu I及びX
ba Iによって消化した後、フラグメントをアガロースゲ
ル精製し、4.3Kbのプロモーター非含有DNAフラグメント
に結合させてベクターpSZ9016−１を作製する。
ー:pBC12BI〔Cullen,B.R.Methods in Enzymol.152:684
−704 1988〕、pEE12（CellTech EP0 338 841）、並び
に、その誘導体pSZ9016−１及びp9019に、EP2cDNA発現
カセットを適切な制限エンドヌクレアーゼ部位で結合さ
せる。p9019は、hCMVIEプロモーター、ポリリンカー及
びSV40ポリＡ因子を、SV40初期プロモーターによって駆
動されるジヒドロ葉酸レダクターゼの突然変異遺伝子
（mDHFR）（Simonsen,C.C. ＆ Levinson,A.D.,Proc.Nat
l.Acad.Sci USA 80:2495−2499〔1983〕）から成る選択
可能マーカー／増幅系と共に含む哺乳類発現ベクターの
構築物である。SV40ポリアデニル化配列は、pD5（Berke
r ＆ Sharp,Nucl.Acid Res.13:841−857〔1985〕）を鋳
型として用いるプライマー13978−120及び139778−121
によって定められるPCR反応によって生じる。得られた
0.25KbのPCR産物をCla I及びSpe Iによって消化し、同
様に消化しておいたpEE12の6.7Kbのフラグメントに結合
させる。得られたプラスミドをBgl II及びSfi Iによっ
て消化してSV40初期プロモーターの３′部分とGScDNAと
をベクターから遊離させる。プラスミドpFR400（Simons
enら，前出）から単離した0.73kBのSfi I−Xho IIのフ
ラグメントを上記の5.6Kbのベクターに結合させてSV40
初期プロモーターを再構成し、mdHFR遺伝子を挿入す
る。このプラスミドをp9019と命名する。pSZ9016−１は
huCMVIEプロモーターがHIV LTRで置換されている以外は
p9019に等しい。このベクターは、p9019をXba I及びMlu
Iで消化してhuCMVIEプロモーターを除去することによ
って構築される。HIV−1 LTR（Cullen,Cell 46:973〔19
86〕）の一部を含むベクターpCD23に見出される残基−1
17〜＋80からのHIV LTRプロモーターを、オリゴヌクレ
オチドプライマーを用いてプラスミドpCD23からPCR増幅
する。用いられるオリゴヌクレオチドプライマーは、産
生物の５′側の末端にMlu I及びSpe I制限部位を付加す
る。他方、３′側にはHind III及びXba I部位が付加さ
れている。得られた0.2KbのPCR産生物を酵素Mlu I及びX
ba Iによって消化した後、フラグメントをアガロースゲ
ル精製し、4.3Kbのプロモーター非含有DNAフラグメント
に結合させてベクターpSZ9016−１を作製する。
EP2cDNAをプロモーターに対して正の配向で含むカセ
ットをプロモーターの３′の適切な制限部位に結合さ
せ、制限部位マッピング及び／または配列決定によって
同定する。これらのcDNA発現ベクターを、COS−７（ATC
C＃CRL1651）、CV−１〔Sackevitzら,Science 238:1575
（1987）〕、293L細胞（ATCC＃CRL6362）を非限定例と
する種々の宿主細胞に、電気穿孔または化学的手順（カ
チオン性リポソーム、DEAEデキストラン、リン酸カルシ
ウム）を非限定例とする標準法によって導入する。トラ
ンスフェクト細胞及び細胞培養抽出物を採取し、上記の
方法でEP2発現を分析し得る。
ットをプロモーターの３′の適切な制限部位に結合さ
せ、制限部位マッピング及び／または配列決定によって
同定する。これらのcDNA発現ベクターを、COS−７（ATC
C＃CRL1651）、CV−１〔Sackevitzら,Science 238:1575
（1987）〕、293L細胞（ATCC＃CRL6362）を非限定例と
する種々の宿主細胞に、電気穿孔または化学的手順（カ
チオン性リポソーム、DEAEデキストラン、リン酸カルシ
ウム）を非限定例とする標準法によって導入する。トラ
ンスフェクト細胞及び細胞培養抽出物を採取し、上記の
方法でEP2発現を分析し得る。
哺乳類の一過性発現に使用されるすべてのベクター
は、EP2を発現する安定な細胞系を樹立するために使用
できる。発現ベクターにクローニングされた非改変EP2c
DNA構築物は、細胞内EP2タンパク質を産生するように宿
主細胞をプログラムすると予期される。トランスフェク
ション宿主細胞の非限定例としては、CV−１〔Sackevit
zら，前出〕、tk−Ｌ〔Wiglerら,Cell 11:223（197
7）〕、NS/O及びdHFr−CHO〔Kaufman ＆ Sharp,J.Mol.B
iol.159:601,（1982）〕がある。
は、EP2を発現する安定な細胞系を樹立するために使用
できる。発現ベクターにクローニングされた非改変EP2c
DNA構築物は、細胞内EP2タンパク質を産生するように宿
主細胞をプログラムすると予期される。トランスフェク
ション宿主細胞の非限定例としては、CV−１〔Sackevit
zら，前出〕、tk−Ｌ〔Wiglerら,Cell 11:223（197
7）〕、NS/O及びdHFr−CHO〔Kaufman ＆ Sharp,J.Mol.B
iol.159:601,（1982）〕がある。
EP2cDNA含有ベクターと、G418、アミノグリコシドホ
スホトランスフェラーゼ、pLNCX〔Miller,A.D.＆ Rosma
n G.J.,Biotech News 7:980−990（1989）〕、ヒグロマ
イシン、ヒグロマイシン−Ｂホスホトランスフェラー
ゼ、pLG90〔Gritz,L.＆ Davies,J.,GENE 25:179（198
3）〕;APRT、キサンチン−グアニンホスホリボシル−ト
ランスフェラーゼ、pMAM（Clontech）〔Murrayら,Gene
31:233（1984）〕を非限定例とする薬剤選択プラスミド
とのコトランスフェクションによって、安定にトランス
フェクトされたクローンを選択し得る。EP2のレベルを
前述のアッセイによって定量する。
スホトランスフェラーゼ、pLNCX〔Miller,A.D.＆ Rosma
n G.J.,Biotech News 7:980−990（1989）〕、ヒグロマ
イシン、ヒグロマイシン−Ｂホスホトランスフェラー
ゼ、pLG90〔Gritz,L.＆ Davies,J.,GENE 25:179（198
3）〕;APRT、キサンチン−グアニンホスホリボシル−ト
ランスフェラーゼ、pMAM（Clontech）〔Murrayら,Gene
31:233（1984）〕を非限定例とする薬剤選択プラスミド
とのコトランスフェクションによって、安定にトランス
フェクトされたクローンを選択し得る。EP2のレベルを
前述のアッセイによって定量する。
できるだけ大量のEP2を合成する哺乳類細胞クローン
を産生するために、EP2cDNA構築物を、増幅可能な薬剤
耐性マーカーを含有するベクターに結合させる。これら
の構築物を細胞に導入した後、プラスミド含有クローン
を適当な作用剤で選択し、漸増用量の作用剤中で選択す
ることによって高コピー数プラスミドの超発現クローン
を単離する。以下の系を使用する:DHFR−CHO細胞にトラ
ンスフェクトされメトトレキセート中で選択された突然
変位DHFR遺伝子を含む9016または9019プラスミド〔Simo
nsonら，前出〕;NS/O細胞にトランスフェクトされメチ
オニンスルホキシミン中で選択されたグルタミンシンテ
ターゼ遺伝子を含むpEE12プラスミド（Cell Tech Inter
national特許出願2089/10404）；及びAPRT及びTK欠失Ｌ
細胞中でチミジンキナーゼ遺伝子〔Colbere ＆ Garopi
n,F.,Proc.Natl.Acad.Sci.76:3755（1979）〕を含むpDL
AT−３とコトランスフェクトされ、APRT（0.05mMのアザ
セリン、0.1mMのアデニン、４μg/mlのアデノシン）中
で選択され、HAT（100μＭのヒポキサンチン、0.4μＭ
のアミノプテリン、16μＭのチミジン）中で選択された
9016または他のCMVプロモーターベクター。
を産生するために、EP2cDNA構築物を、増幅可能な薬剤
耐性マーカーを含有するベクターに結合させる。これら
の構築物を細胞に導入した後、プラスミド含有クローン
を適当な作用剤で選択し、漸増用量の作用剤中で選択す
ることによって高コピー数プラスミドの超発現クローン
を単離する。以下の系を使用する:DHFR−CHO細胞にトラ
ンスフェクトされメトトレキセート中で選択された突然
変位DHFR遺伝子を含む9016または9019プラスミド〔Simo
nsonら，前出〕;NS/O細胞にトランスフェクトされメチ
オニンスルホキシミン中で選択されたグルタミンシンテ
ターゼ遺伝子を含むpEE12プラスミド（Cell Tech Inter
national特許出願2089/10404）；及びAPRT及びTK欠失Ｌ
細胞中でチミジンキナーゼ遺伝子〔Colbere ＆ Garopi
n,F.,Proc.Natl.Acad.Sci.76:3755（1979）〕を含むpDL
AT−３とコトランスフェクトされ、APRT（0.05mMのアザ
セリン、0.1mMのアデニン、４μg/mlのアデノシン）中
で選択され、HAT（100μＭのヒポキサンチン、0.4μＭ
のアミノプテリン、16μＭのチミジン）中で選択された
9016または他のCMVプロモーターベクター。
実施例７ COS−M6細胞中のEP2レセプターの発現及び〔3H〕PGE2結
合アッセイ 最近クローン化されたヒトプロスタグランジンE2（EP
2）レセプターをpcDNA I ampプラスミド（Invitrogen）
にサブクローニングし、DEAE−デキストラン法を用いて
COS−M6細胞にトランスフェクトした。細胞を72時間培
養し、次いで採取し、窒素キャビテーションによる細胞
の溶解後に分画遠心法（1,000×ｇで10分間、次いで10
0,000×ｇで30分間）によって膜を調製した。1.0mMのED
TA、10mMのMnC12、0.3nMの〔3H〕PGE2及び100,000×ｇ
膜画分からの12〜15μｇのタンパク質を含む10mMのMES/
KOH pH6.0中で、〔3H〕プロスタグランジンE2（〔3H〕P
GE2）結合アッセイを実施した。30℃で45分間のインキ
ュベート後、４℃で洗浄バッファ（0.01％のウシ血清ア
ルブミン含有の10μＭのMES/KOH（pH6.0））に予浸した
Whatman GF/Bフィルターを通す高速濾過によって結合放
射性リガンドと遊離放射性リガンドとを分離した。フィ
ルターを約16mlの洗浄バッファで洗浄し、フィルターに
結合した残留〔3H〕PGE2を液体シンチレーションカウン
ティングによって定量した。２μＭのPGE2の存在下で測
定した全結合と非特異的結合との差を特異的結合と定義
した。
合アッセイ 最近クローン化されたヒトプロスタグランジンE2（EP
2）レセプターをpcDNA I ampプラスミド（Invitrogen）
にサブクローニングし、DEAE−デキストラン法を用いて
COS−M6細胞にトランスフェクトした。細胞を72時間培
養し、次いで採取し、窒素キャビテーションによる細胞
の溶解後に分画遠心法（1,000×ｇで10分間、次いで10
0,000×ｇで30分間）によって膜を調製した。1.0mMのED
TA、10mMのMnC12、0.3nMの〔3H〕PGE2及び100,000×ｇ
膜画分からの12〜15μｇのタンパク質を含む10mMのMES/
KOH pH6.0中で、〔3H〕プロスタグランジンE2（〔3H〕P
GE2）結合アッセイを実施した。30℃で45分間のインキ
ュベート後、４℃で洗浄バッファ（0.01％のウシ血清ア
ルブミン含有の10μＭのMES/KOH（pH6.0））に予浸した
Whatman GF/Bフィルターを通す高速濾過によって結合放
射性リガンドと遊離放射性リガンドとを分離した。フィ
ルターを約16mlの洗浄バッファで洗浄し、フィルターに
結合した残留〔3H〕PGE2を液体シンチレーションカウン
ティングによって定量した。２μＭのPGE2の存在下で測
定した全結合と非特異的結合との差を特異的結合と定義
した。
クローン化したヒトEP2レセプターをCOS−M6細胞にト
ランスフェクトし、トランスフェクト細胞から調製した
膜に〔3H〕PGE2結合アッセイを実施した。競合アッセイ
では、PGE2とPGE1とが最も有効な競合リガンドであり、
IC50の値が1nMであった（図４）。プロスタグランジン
及び近縁類似体の力価の順位は、PGE2＝PGE1＞＞フェニ
ル−トリノールPGF2＞イロプロスト＞PGE２α＞PGD2＝U
46619であった。U46619及びイロプロストはトロンボキ
サン及びプロスタサイクリンの安定な類似体であり、夫
々TP及びIPレセプターに同等の力価を示す。更に、EP3
アゴニストMB28767のEP2に対する力価はEP3に対する力
価の約1/30であり、EP1アンタゴニストAH6809及びSC192
20はEP2に対して実質的に不活性であり、EP2アゴニスト
であるブタプロストは比較的不活性であり、IC50は30μ
Ｍであった。胃腸保護物質であるミソプロストールのIC
50は6.03μＭであった。EP2レセプターに関する力価の
この順位は従来の薬理試験で予測されていた。
ランスフェクトし、トランスフェクト細胞から調製した
膜に〔3H〕PGE2結合アッセイを実施した。競合アッセイ
では、PGE2とPGE1とが最も有効な競合リガンドであり、
IC50の値が1nMであった（図４）。プロスタグランジン
及び近縁類似体の力価の順位は、PGE2＝PGE1＞＞フェニ
ル−トリノールPGF2＞イロプロスト＞PGE２α＞PGD2＝U
46619であった。U46619及びイロプロストはトロンボキ
サン及びプロスタサイクリンの安定な類似体であり、夫
々TP及びIPレセプターに同等の力価を示す。更に、EP3
アゴニストMB28767のEP2に対する力価はEP3に対する力
価の約1/30であり、EP1アンタゴニストAH6809及びSC192
20はEP2に対して実質的に不活性であり、EP2アゴニスト
であるブタプロストは比較的不活性であり、IC50は30μ
Ｍであった。胃腸保護物質であるミソプロストールのIC
50は6.03μＭであった。EP2レセプターに関する力価の
この順位は従来の薬理試験で予測されていた。
実施例８ 昆虫細胞中の発現用のバキュロウイルス発現ベクター中
のEP2cDNAクローニング AcNPVウイルスのゲノムに由来のバキュロウイルスベ
クターが昆虫細胞のSf9系（ATCC CRL＃1711）中でcDNA
の高レベル発現を与えるように設計した。EP2cDNAを発
現する組換えバキュロウイルスを以下の標準法で産生す
る（InVitrogen Maxbac Manual）。EP2cDNA構築物を、p
AC360及びpBlueBacベクター（InVitrogen）のような種
々のバキュロウイルス転移ベクター中の多面性プロモー
ターの下流に結合させる。バキュロウイルス転移ベクタ
ーとのコトランスフェクション後に相同組換えによって
組換えバキュロウイルスを作製し、Sf9細胞中でAcNPVゲ
ノムDNAを直鎖化する〔Kitts,P.A.,Nuc.Acid.Res.18:56
67（1990）〕。感染細胞中に封入体が存在しないことに
よって組換えpAC360ウイルスを確認し（Summers,M.D.＆
Smith,G.E.,Texas Agriculture Exp.Station Bulletin
No.1555）、組換えpBlueBacウイルスをβ−ガラクトシ
ダーゼ発現に基づい同定する（Vialardら,1990,J.Viro
l.,64,PP37−50）。sf9細胞のプラーク精製及びEP2組換
えバキュロウイルス感染後に、EP2発現を上述のアッセ
イによって測定する。
のEP2cDNAクローニング AcNPVウイルスのゲノムに由来のバキュロウイルスベ
クターが昆虫細胞のSf9系（ATCC CRL＃1711）中でcDNA
の高レベル発現を与えるように設計した。EP2cDNAを発
現する組換えバキュロウイルスを以下の標準法で産生す
る（InVitrogen Maxbac Manual）。EP2cDNA構築物を、p
AC360及びpBlueBacベクター（InVitrogen）のような種
々のバキュロウイルス転移ベクター中の多面性プロモー
ターの下流に結合させる。バキュロウイルス転移ベクタ
ーとのコトランスフェクション後に相同組換えによって
組換えバキュロウイルスを作製し、Sf9細胞中でAcNPVゲ
ノムDNAを直鎖化する〔Kitts,P.A.,Nuc.Acid.Res.18:56
67（1990）〕。感染細胞中に封入体が存在しないことに
よって組換えpAC360ウイルスを確認し（Summers,M.D.＆
Smith,G.E.,Texas Agriculture Exp.Station Bulletin
No.1555）、組換えpBlueBacウイルスをβ−ガラクトシ
ダーゼ発現に基づい同定する（Vialardら,1990,J.Viro
l.,64,PP37−50）。sf9細胞のプラーク精製及びEP2組換
えバキュロウイルス感染後に、EP2発現を上述のアッセ
イによって測定する。
EP2の全読み取り枠をコードするcDNAをpBlueBac IIの
BamH I部位に挿入する。多面性プロモーターに対して正
の配向の構築物を配列解析によって同定し、直鎖状AcNP
Vの野生型DNAの存在下にSf9細胞のトランスフェクトに
使用する。
BamH I部位に挿入する。多面性プロモーターに対して正
の配向の構築物を配列解析によって同定し、直鎖状AcNP
Vの野生型DNAの存在下にSf9細胞のトランスフェクトに
使用する。
活性EP2の標品は感染細胞の膜と結合して検出され
る。膜調製物は感染細胞から標準手順で調製される。
る。膜調製物は感染細胞から標準手順で調製される。
実施例９ 酵母発現ベクター中のEP2cDNAのクローニング 異種タンパク質の細胞内発現を指令するように設計さ
れた発現ベクターに最適EP2cDNA構築物を挿入した後、
酵母S.cerevisiae中で組換えEP2を産生させる。細胞内
発現のためには、EmBLyex4などのベクターをEP2シスト
ロンに結合させる〔Rinas U.ら,Biotechnology 8:543−
545（1990）;Horowitz B.ら,Biol.Chem.265:4189−4192
（1989）〕。発現されたEP2のレベルを前述のアッセイ
で決定する。
れた発現ベクターに最適EP2cDNA構築物を挿入した後、
酵母S.cerevisiae中で組換えEP2を産生させる。細胞内
発現のためには、EmBLyex4などのベクターをEP2シスト
ロンに結合させる〔Rinas U.ら,Biotechnology 8:543−
545（1990）;Horowitz B.ら,Biol.Chem.265:4189−4192
（1989）〕。発現されたEP2のレベルを前述のアッセイ
で決定する。
実施例10 組換えEP2の精製 組換えによって産生したEP2を抗体アフィニティクロ
マトグラフィーによって精製し得る。
マトグラフィーによって精製し得る。
Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルによって予め
活性化したゲル支持体であるAffigel−10（Biorad）
に、抗体とアガロースゲルビーズ支持体との共有結合が
形成されるように抗EP2抗体を添加することによってEP2
抗体アフィニティカラムを作製する。次にスペーサーア
ームを介したアミド結合によって抗体をゲルに結合させ
る。次に、1Mの塩酸エタノールアミン（pH8）によって
残りの活性化エステルの反応を停止させる。カラムを
水、0.23Mの塩酸グリシン（pH2.6）によって順次洗浄し
て非結合抗体または不要タンパク質を完全に除去する。
次に、界面活性剤のような適当な膜可溶化剤を加えたリ
ン酸塩緩衝生理食塩水（pH7.3）中でカラムを平衡さ
せ、可溶化EP2を含有する細胞培養上清または細胞抽出
物をゆっくりとカラムに通す。次に、界面活性剤を加え
たリン酸塩緩衝生理食塩水によって光学密度（A280）が
バックグラウンドに下がるまでカラムを洗浄し、界面活
性剤を加えた0.23Mの塩酸グリシン（pH2.6）でタンパク
質を溶出させる。精製されたEP2タンパク質を次に、界
面活性剤を加えたリン酸塩緩衝生理食塩水に対して透析
する。
活性化したゲル支持体であるAffigel−10（Biorad）
に、抗体とアガロースゲルビーズ支持体との共有結合が
形成されるように抗EP2抗体を添加することによってEP2
抗体アフィニティカラムを作製する。次にスペーサーア
ームを介したアミド結合によって抗体をゲルに結合させ
る。次に、1Mの塩酸エタノールアミン（pH8）によって
残りの活性化エステルの反応を停止させる。カラムを
水、0.23Mの塩酸グリシン（pH2.6）によって順次洗浄し
て非結合抗体または不要タンパク質を完全に除去する。
次に、界面活性剤のような適当な膜可溶化剤を加えたリ
ン酸塩緩衝生理食塩水（pH7.3）中でカラムを平衡さ
せ、可溶化EP2を含有する細胞培養上清または細胞抽出
物をゆっくりとカラムに通す。次に、界面活性剤を加え
たリン酸塩緩衝生理食塩水によって光学密度（A280）が
バックグラウンドに下がるまでカラムを洗浄し、界面活
性剤を加えた0.23Mの塩酸グリシン（pH2.6）でタンパク
質を溶出させる。精製されたEP2タンパク質を次に、界
面活性剤を加えたリン酸塩緩衝生理食塩水に対して透析
する。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｇ０１Ｎ 33/566 Ｃ１２Ｑ 1/02 Ａ６１Ｋ 39/395 Ｄ Ｇ０１Ｎ 33/566 Ｃ１２Ｐ 21/08 // Ａ６１Ｋ 39/395 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ Ｃ１２Ｐ 21/08 5/00 Ｂ (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:865） (72)発明者 アダム，モハメツド カナダ国、ケベツク・アシユ・９・ジ エ・２・イクス・２、カークランド、リ バーウツド・グルーブ・18 (72)発明者 バステイーン，リソン カナダ国、ケベツク・ジエ・０・ペー・ １・ベ・０、セイント・ラザレ、ラデイ ソン・ストリート・931 (72)発明者 グレゴリツク，リチヤード カナダ国、ケベツク・アシユ・９・ア ー・２・ペー・８、ドラール・デ・オル モー、ブレントウツド・27 (72)発明者 ミーターズ，キヤサリン カナダ国、ケベツク・アシユ・２・イク ス・１・ドウブルベー・４、モントリオ ール、ミルトン・570、アパートメン ト・18 (72)発明者 ラツシユモア，トーマス・エイチ アメリカ合衆国、ペンシルベニア・ 19440、ハツトフイールド、デイーア・ ラン・ロード・1400 (72)発明者 ソウヤー，ニコル カナダ国、ケベツク・ジエ・７・ベ・ ８・ウー・９、ピンコート、レイシン・ ストリート・65 (56)参考文献 ＴＨＥ ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＢＩ ＯＬＯＧＩＣＡＬ ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ （1993）Ｖｏｌ．268，Ｎｏ．11，ｐ. 7759−7762 Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏ ｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ（1993）Ｖｏ ｌ．1177，ｐ．43−48 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C07K 14/72 C07K 16/28 C12N 15/12 C12P 21/00 - 21/08 C12Q 1/02 G01N 33/566 ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／Ｇ ｅｎｅＳｅｑ ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ／ＰＩＲ／ＧｅｎｅＳ ｅｑ ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (11)
- 【請求項１】アミノ酸配列 を含む単離及び精製されたプロスタグランジンレセプタ
ータンパク質。 - 【請求項２】請求項１に記載のアミノ酸配列よりなる請
求項１に記載の単離及び精製されたプロスタグランジン
レセプタータンパク質。 - 【請求項３】請求項１に記載のプロスタグランジンレセ
プタータンパク質をコードしている核酸配列を含む単離
及び精製されたDNA分子。 - 【請求項４】請求項３に記載の単離及び精製されたDNA
分子であって、前記DNA分子がヌクレオチド配列 を含むDNA分子。 - 【請求項５】組換え宿主細胞中でプロスタグランジンレ
セプタータンパク質を発現させるための請求項３又は４
のDNA分子を含む発現ベクター。 - 【請求項６】組換えプロスタグランジンレセプタータン
パク質を発現させるための請求項５に記載の発現ベクタ
ーを含む宿主細胞。 - 【請求項７】組換え宿主細胞中でプロスタグランジンレ
セプタータンパク質を発現させる方法であって、 （ａ）請求項５に記載の発現ベクターを適当な宿主細胞
に移入し、 （ｂ）プロスタグランジンレセプタータンパク質が発現
ベクターから発現し得る条件下に段階（ａ）の宿主細胞
を培養する方法。 - 【請求項８】プロスタグランジンレセプター活性のモジ
ュレーターを選定する方法であって、 （ａ）プロスタグランジンレセプター活性のモジュレー
ターを、請求項１に記載のアミノ酸配列を含むプロスタ
グランジンレセプターと組み合わせ、 （ｂ）プロスタグランジンレセプターに対するモジュレ
ーターの効果を測定する方法。 - 【請求項９】請求項１に記載のアミノ酸配列よりなるプ
ロスタグランジンレセプタータンパク質に特異的に結合
する抗体。 - 【請求項１０】被検化合物がプロスタグランジンレセプ
ターに結合するかどうか決定する方法であって、 （ａ）請求項１に記載のアミノ酸配列を含むプロスタグ
ランジンレセプターをコードする核酸を用いて形質転換
された哺乳類宿主細胞を供給する段階、 （ｂ）前記レセプターが表現されるような条件下で、前
記哺乳類宿主細胞を培養する段階、 （ｃ）前記被検化合物を前記哺乳類宿主細胞又は前記哺
乳類宿主細胞から調製された前記プロスタグランジンレ
セプターを有する膜と結合させる段階、及び （ｄ）前記被検化合物が前記プロスタグランジンレセプ
ターと結合するかを決定する段階、 からなる方法。 - 【請求項１１】被検化合物がプロスタグランジンレセプ
ターのアゴニストかどうかを決定する方法であって、 （ａ）請求項１に記載のアミノ酸配列を含むプロスタグ
ランジンレセプターをコードする核酸及び嚢胞性繊維症
トランスメンブラン調節物質をアフリカツメガエル卵母
細胞に導入する段階、 （ｂ）プロスタグランジンレセプター及び嚢胞性繊維症
トランスメンブラン調節物質が発現されるような条件下
で前記卵母細胞を培養する段階、 （ｃ）被検化合物を段階（ｂ）の卵母細胞と結合させる
段階、及び （ｄ）被検物質と混ぜた後に、卵母細胞中のCl-電流を
測定する段階、ここで被検物質と混ぜた後の卵母細胞に
おけるCl-電流の増加は被検物質がプロスタグランジン
レセプターのアゴニストであることを示す、 からなる方法。
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