JP3343258B2 - プロスタグランジン受容体ｅｐ▲３▼及び該受容体をコードするｄｎａ - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

発明の背景 プロスタグランジン（PG）E₂の生理的作用は、プロス
タグランジンＥ受容体との相互作用を介して発揮され
る。EP受容体には３つのサブタイプ、EP₁、EP₂及びEP₃
がある（Colemanら,1989の総説参照）。これら３つのサ
ブタイプはいずれもPGE₂に対して大きな親和性を示す
が、種々のアゴニスト及びアンタゴニストに対する各サ
ブタイプの親和性には差異が見られ、その作用はそれぞ
れ異なる二次形質導入メカニズムを介して発揮される。
例えば、EP₁受容体の活性化はIP₃及び細胞内カルシウム
の増加に関連しており、EP₂受容体の活性化は細胞内環
状AMPを増加させ、EP₃受容体の活性化は細胞内環状AMP
を減少させ、次いで細胞内カルシウムを増加させる。こ
れまでにクローニングされたこの種のものは、マウスEP
₂（Hondaら、1993、J.Biol.Chem.268（11）:7759−776
2）並びにマウスEP_３α及びEP_３β（Sugimotoら、199
2、J.Biol.Chem.267（10）:6463−6466;Sugimotoら、19
93、J.Biol.Chem.268（４）:2712−2718）サブタイプだ
けである。EP₃受容体は通常、ヒト及び他の動物の小
腸、腎臓、胃、筋肉、目、子宮及び気管を含む広範な細
胞上に存在する。プロスタグランジンE₂がEP₃受容体タ
ンパク質と結合すると、細胞内カルシウムの濃度が増加
する。組織はこのシグナルに基づいて、例えば筋肉収縮
により応答する。 発明の概要 サブクラスEP₃のEP_３−α、EP_3-21及びEP_3-9と称する
新規のプロスタグランジン受容体タンパク質がヒト細胞
から同定された。完全長EP₃タンパク質をコードするDNA
分子を単離し、精製し、ヌクレオチド配列を決定した。
EP₃をコードするDNAを発現ベクター内にクローニング
し、これらの発現ベクターを組換え宿主細胞内に導入す
ると、組換え宿主細胞が機能的EP₃受容体タンパク質を
発現した。これらの新規のEP₃タンパク質、EP₃をコード
するDNA、発現ベクター、及び組換えEP₃受容体を発現す
る組換え宿主細胞は、EP₃受容体活性の調節因子の選定
に有用である。 組換えEP₃発現宿主細胞を使用するEP₃受容体調節因子
の同定方法も開示する。EP₃活性調節因子は、プロスタ
グランジン関連の疾患の治療及びEP₃受容体に対するプ
ロスタグランジンの作用の調節に有用である。 図面の簡単な説明 第１図ＡはEP_３−α受容体タンパク質をコードするDN
Aの完全配列を示し、第１図ＢはEP_3-21受容体タンパク
質をコードするDNAの完全配列を示し、第１図ＣはEP_3-9
受容体タンパク質をコードするDNAの完全配列を示して
いる。 第２図は、EP_３−α受容体タンパク質の推定アミノ酸
完全配列、EP_3-21受容体タンパク質の推定アミノ酸完全
配列、及びEP_3-9受容体タンパク質の推定アミノ酸完全
配列を示している。 第３図Ａは、0.03nM〜10μＭ PGE₂（△）、PGE
₁（■）、PGF_２α（□）及びPGD₂（●）の存在下のpcDN
A Iamp−hEP_３αトランスフェクションCOS−M6膜への［
³H］PGE₂特異的結合の競合を示し、第３図Ｂは、0.3nM
〜100μＭミソプロストル（□）、AH6809（△）及びブ
タプロスト（■）の存在下の前記競合を示している。 第４図Ａは、0.03nM〜10μＭ PGE₂（△）、PGE
₁（■）、PGF_２α（□）及びPGD₂（●）の存在下のpcDN
A Iamp−hEP_3-21トランスフェクションCOS−M6膜への［
³H］PGE₂特異的結合の競合を示し、第４図Ｂは、0.3nM
〜100μＭミソプロストル（□）、AH6809（△）及びブ
タプロスト（■）の存在下の前記競合を示している。 第５図Ａは、0.03nM〜10μＭ PGE₂（△）、PGE
₁（■）、PGF_２α（□）及びPGD₂（●）の存在下のpcDN
A−hEP_3-9トランスフェクションCOS−M6膜への［³H］PG
E₂特異的結合の競合を示し、第５図Ｂは、0.3nM〜100μ
Ｍミソプロストル（□）、AH6809（△）及びブタプロス
ト（■）の存在下の前記競合を示している。 発明の詳細な説明 本発明は、EP_３−α、EP_3-21及びEP_3-9と称する、サ
ブタイプEP₃の新規の三つのプロスタグランジン受容体
イソタイプをコードするcDNAに関する。本発明は、組換
え発現プラスミド内に含まれているクローン化EP₃コー
ディングDNAを発現する組換え宿主細胞にも関する。本
発明は、EP₃受容体活性を調節する物質のスクリーニン
グ方法にも関する。本発明のDNAは、EP₃産生細胞から単
離される。本明細書で使用するEP₃という用語は、プロ
スタグランジン分子に特異的に結合できるＧタンパク質
結合受容体を意味する。本発明は、EP₃産生細胞から単
離され、やはりEP₃と称する特定のプロスタグランジン
受容体タンパク質にも関する。本明細書で使用するEP₃
受容体タンパク質という用語は、前記三つのイソタイプ
に存在しプロスタグランジン分子に特異的に結合できる
Ｇタンパク質結合型受容体を意味する。 EP₃を産生することができる哺乳動物細胞の非限定的
具体例としては、小腸、腎臓、胃、筋肉、目、子宮及び
気管に由来する細胞が挙げられる。本発明のために好ま
しい細胞としてはヒト正常腎臓細胞又は子宮細胞が挙げ
られる。 他の細胞及び細胞系もEP₃cDNAの単離に使用するのに
適当であり得る。適当な細胞の選択は、細胞表面のEP₃
のスクリーニングによって実施し得る。EP₃活性検出方
法は当業者によく知られており、受容体に特異的な放射
性標識リガンドの結合を測定する。このアッセイでEP₃
活性を示す細胞は、EP₃cDNAの単離に適当であり得る。 EP₃cDNAのクローニングには、種々の方法のうち任意
のものを使用し得る。これらの方法の非限定的具体例と
しては、適当な発現ベクター系内でEP₃含有cDNAライブ
ラリーを構築した後、EP₃cDNAを直接機能発現させる方
法が挙げられる。別の方法として、バクテリオファージ
又はプラスミドシャトルベクター内で構築したEP₃含有c
DNAライブラリーを、EP₃タンパク質のアミノ酸配列から
設計した標識オリゴヌクレオチドプローブでスクリーニ
ングする方法もある。好ましい方法は、バクテリオファ
ージ又はプラスミドシャトルベクター内で構築したEP₃
含有cDNAライブラリーを、EP₃タンパク質をコードする
部分的cDNAでスクリーニングすることからなる。前記部
分的cDNAは、プロスタグランジンEP₃受容体と相関して
いる別のＧタンパク質結合受容体について知られている
アミノ酸配列から縮重オリゴヌクレオチドプライマーを
設計して、EP₃DNA断片の特異的PCR増幅を行うことによ
り得る。 当業者には容易に理解されるように、別の種類のライ
ブラリー、並びに別の細胞もしくは細胞種類から構築し
たライブラリーも、EP₃をコードするDNAの単離に有用で
あり得る。別の種類のライブラリーの非限定的具体例と
しては、ヒト腎臓細胞以外の細胞又は細胞系に由来する
cDNAライブラリー、及びゲノムDNAライブラリーが挙げ
られる。 当業者には明らかなように、適当なcDNAライブラリー
は、EP₃活性を有する細胞又は細胞系から製造し得る。E
P₃cDNAを単離するためのcDNAライブラリーの製造で使用
する細胞又は細胞系の選択は、本発明で使用する前述の
公知の標識リガンド結合アッセイを用いて、事前に細胞
結合EP₃活性を測定することにより実施し得る。 cDNAライブラリーの製造は、当業者によく知られてい
る標準的方法で実施できる。よく知られているcDNAライ
ブラリー構築方法は、例えばManiatis,T.,Fritsch,E.
F.,Sambroock,J.,Molecular Cloning:A Laboratory
Manual（Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spr
ing Harbor,New York,1982）に記載されている。 これも当業者には明らかであろうが、EP₃をコードす
るDNAは適当なゲノムDNAライブラリーからも単離し得
る。 ゲノムDNAライブラリーの構築は、当業者によく知ら
れている標準的方法で実施できる。よく知られているゲ
ノムDNAライブラリー構築方法は、例えばManiatisら，
前出文献に記載されている。 好ましい方法のいずれかによってEP₃遺伝子をクロー
ニングするためには、EP₃又は相同タンパク質のアミノ
酸配列又はDNA配列が必要である。そのためには、EP₃タ
ンパク質又は相同タンパク質を精製し、自動配列決定器
で部分的アミノ酸配列を決定し得る。完全なアミノ酸配
列を決定する必要はないが、部分的EP₃DNA断片のPCR増
幅のためには、アミノ酸６〜８個分の二つの領域の直鎖
配列を決定するとよい。 適当なアミノ酸配列が同定されたら、これらをコード
することができるDNA配列を合成する。遺伝子コードは
縮重であるため、特定のアミノ酸をコードする２個以上
のコドンを使用し得ることがあり、従ってアミノ酸配列
は、一組の類似のDNAオリゴヌクレオチドのいずれかの
ものでコードできる。前記一組のDNAオリゴヌクレオチ
ドのうち一つだけがEP₃配列と同じであるが、その組の
残りも不適正状態を伴うものの、かかるDNAオリゴヌク
レオチドもEP₃DNAにハイブリダイズすることができる。
不適正DNAオリゴヌクレオチドでも、EP₃をコードするDN
Aの同定及び単離を可能にするのに十分な程度にEP₃DNA
にハイブリダイズし得る。 好ましい方法のいずれかを用いて、ポリメラーゼ連鎖
反応（PCR）ベースの技術及びcDNAライブラリースクリ
ーニングを使用する２段階方法で、EP₃をコードするcDN
Aクローンを単離する。第１段階では、精製EP₃又は相同
タンパク質からのNH₂末端及び内部アミノ酸配列情報を
用いて、EP₃特異的DNA断片の増幅のための縮重オリゴヌ
クレオチドプライマーを設計する。第２段階では、前記
断片をクローニングして、ヒト腎臓細胞由来のcDNAライ
ブラリーから完全長cDNAを単離するためのプローブとし
て使用する。 EP₃をコードする三つのほぼ完全長のcDNAの配列を表
１に示し、これらをクローンEP_３−α、EP_3-21及びEP
_3-9と名付けた。三つのクローン化cDNAに基づくEP₃の推
定アミノ酸配列を表２に示す。決定されたcDNA配列を調
べると、それぞれアミノ酸390個、388個及び365個のタ
ンパク質をコードする単一の大きな読取り枠（複数）の
存在が明らかになる。 前述の方法で得たクローン化EP₃cDNAは、組換えEP₃を
産生するために、適当なプロモーターと他の適当な転写
調節エレメントとを含む発現ベクター内への分子クロー
ニングにより組換え的に発現し、原核又は真核宿主細胞
内にトランスファーし得る。この種の操作の方法は、前
出のManiatisらの文献に記載されており、当業者によく
知られている。 本明細書では、発現ベクターは、クローン化DNAの転
写と、適当な宿主内で対応するmRNAの翻訳とに必要なDN
A配列であると定義される。この種のベクターは、種々
の宿主、例えば細菌、藍藻、植物細胞、昆虫細胞及び動
物細胞内で真核生物DNAを発現させるのに使用し得る。 特別に設計したベクターは、細菌−酵母間又は細菌−
動物細胞間のような宿主間のDNAシャトリングを可能に
する。適当に構築した発現ベクターは、宿主細胞内での
自律複製のための複製起点と、選択可能マーカーと、限
定数の有用な制限酵素部位と、高コピー数の可能性と、
活性プロモーターとを含んでいなければならない。プロ
モーターは、RNAポリメラーゼをDNAに結合させてRNA合
成を開始させるDNA配列であると定義される。強力なプ
ロモーターは、mRNAを高頻度で開始させるプロモーター
である。発現ベクターの非限定的具体例としては、クロ
ーニングベクター、修飾クローニングベクター、特別に
設計したプラスミド又はウイルスが挙げられる。 哺乳動物細胞内で組換えEP₃を発現するためには種々
の哺乳動物発現ベクターを使用し得る。組換えEP₃の発
現に適当であり得る市販の哺乳動物発現ベクターの非限
定的具体例としては、pMC1neo（Stratagene）、pXT1（S
tratagene）、pSG5（Stratagene）、pcDNA I、pcDNA Ia
mp（Invitrogen）、EBO−pSV2−neo（ATCC 37593）、p
BPV−１（８−２）（ATCC 37110）、pdBPV−MMTneo（3
42−12）（ATCC 37224）、pRSVgpt（ATCC 37199）、p
RSVneo（ATCC 37198）、pSV2−dhfr（ATCC 37146）、
pUCTag（ATCC 37460）及びIZD35（ATCC 37565）が挙
げられる。 EP₃をコードするDNAは、宿主細胞内での発現のために
発現ベクター内にクローニングしてもよい。宿主細胞は
原核細胞又は真核細胞であり得、非限定的具体例として
は細菌、酵母、哺乳動物細胞、例えばヒト、ウシ、ブ
タ、サル及び齧歯類の細胞系、並びに昆虫細胞、例えば
ショウジョウバエ由来細胞系が挙げられる。適当であり
得る市販の哺乳動物由来細胞系の非限定的具体例として
は、CV−１（ATCC CCL 70）、COS−１（ATCC CRL 1
650）、COS−７（ATCC CRL 1651）、CHO−K1（ATCC
CCL 61）、3T3（ATCC CCL 92）、NIH/3T3（ATCC CR
L 1658）、HeLa（ATCC CCL ２）、C127I（ATCC CRL
1616）、BS−Ｃ−１（ATCC CCL 26）及びMRC−５
（ATCC CCL 171）が挙げられる。 発現ベクターは、非限定的具体例として例えば形質転
換、トランスフェクション、プロトプラスト融合法及び
電気穿孔法のような種々の方法のいずれかを用いて、宿
主細胞内に導入し得る。発現ベクター含有細胞を個々に
分析して、その細胞がEP₃タンパク質を産生するか否か
を決定する。EP₃発現細胞の同定は、幾つかの方法、例
えば非限定的具体例として抗EP₃抗体に対する免疫学的
反応性、及び宿主細胞結合EP₃活性の存在等により実施
し得る。 EP₃DNAの発現は、in vitroで製造した合成mRNAを用
いて実施してもよい。合成mRNAは、種々の無細胞系、非
限定的具体例として例えばコムギ胚芽抽出物及び網状赤
血球抽出物中で効率的に翻訳できると共に、細胞ベース
の系、非限定的具体例として例えばカエル卵母細胞内へ
のマイクロインジェクションでも効率的に翻訳できる。
好ましいのはカエル卵母細胞へのマイクロインジェクシ
ョンである。 受容体活性及び／又はEP₃タンパク質を最適レベルに
するEP₃cDNA配列を決定するために、例えば下記のよう
なEP₃cDNA分子を構築し得る:EP₃cDNAの完全長読取り
枠、並びに受容体タンパク質の特定ドメインのみもしく
は該タンパク質の再構成ドメイン（rearranged domai
n）をコードするcDNAの一部を含む種々の構築物。総て
の構築物は、EP₃cDNAの5'及び／又は3'非翻訳領域を全
く含まないか、総て含むか、又は一部含むように設計し
得る。EP₃活性及びタンパク質発現レベルは、これらの
構築物を単独で又は組合わせて適当な宿主細胞内に導入
した後で決定し得る。過渡アッセイ（transient assa
y）での最適発現を生起させるEP₃cDNAカセットの決定に
次いで、このEP₃cDNA構築物を種々の発現ベクター（組
換えウイルスを含む）、例えば哺乳動物細胞、植物細
胞、昆虫細胞、卵母細胞、大腸菌及び酵母細胞用の発現
ベクターにトランスファーする。 哺乳動物細胞トランスフェクタントを、EP₃受容体活
性レベル及びEP₃タンパク質濃度の両方について、下記
の方法でアッセイする。EP₃受容体活性の測定では、標
識リガンドを細胞に直接導入し、EP₃発現細胞へのリガ
ンドの特異的結合の量を決定する。受容体活性に関する
結合アッセイは当業者に公知である（Freyら,1993,Eur.
J.Pharmacol.,244,pp239−250）。 宿主細胞内のEP₃タンパク質濃度は、種々の方法、例
えば非限定的具体例としてイムノアフィニティ及び／又
はリガンドアフィニティ法で定量する。EP₃特異的アフ
ィニティビーズ又はEP₃特異的抗体を用いて、³⁵S−メチ
オニン標識又は非標識EP₃タンパク質を単離する。標識E
P₃タンパク質はSDS−PAGEで分析する。非標識EP₃タンパ
ク質は、EP₃特異的抗体を用いて、ウエスタンブロッテ
ィング、ELISA又はRIAアッセイで検出する。 宿主細胞内でのEP₃の発現後、EP₃特異的リガンドに結
合することができる活性形態のEP₃を得るべく、EP₃タン
パク質を回収し得る。使用し得るEP₃精製操作は幾つか
存在する。組換えEP₃は、標準的分離方法、例えば非限
定的具体例として洗剤可溶化、塩分別、イオン交換クロ
マトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、ヒド
ロキシルアパタイト吸収クロマトグラフィー及び疎水性
相互作用クロマトグラフィーを単独で又は様々に組合わ
せて使用することにより、細胞膜から精製し得る。 また、組換えEP₃は、完全長発生期EP₃又はEP₃のポリ
ペプチド断片に特異的なモノクローナル又はポリクロー
ナル抗体を用いて形成したイムノアフィニティカラムの
使用により、別の細胞タンパク質と分離できる。 EP₃に対する単一特異性抗体は、EP₃と反応する抗体を
含む哺乳動物抗血清から精製するか、又はKohler及びMi
lstein,Nature 256:495−497（1975）に記載の方法を
用いて、EP₃と反応するモノクローナル抗体として製造
する。本明細書中の単一特異性抗体は、EP₃に対して均
一結合特性を示す単一抗体種又は多重抗体種であると定
義される。本明細書で使用する均一結合という用語は、
抗体種が特定の抗原又はエピトープ、例えば前述のよう
にEP₃と結合した抗原又はエピトープに結合する能力を
意味する。EP₃特異的抗体は、マウス、ラット、テンジ
クネズミ、ウサギ、ヤギ、ウマ等のような動物を、免疫
アジュバントを用いて又は用いずに、適当な濃度のEP₃
又はEP₃配列由来ペプチドで免疫感作することにより形
成する。 最初の免疫感作の前に免疫前血清を採取する。各動物
に、約0.1μｇ〜約1000μｇのEP₃又はEP₃関連ペプチド
を、許容し得る免疫アジュバントと組合わせて投与す
る。許容し得るアジュバントの非限定的具体例として
は、フロイント完全アジュバント、フロイント不完全ア
ジュバント、ミョウバン沈降物、Corynebacterium par
vum含有油中水滴エマルション及びtRNAが挙げられる。
最初の免疫感作は、好ましくはフロイント完全アジュバ
ント中の酵素を皮下（SC）、腹腔内（IP）又はこれら両
方の経路で複数の部位に投与することによって実施し
た。各動物の採血を一定の時間間隔、好ましくは１週間
おきに行い、抗体力価を測定する。動物には、最初の免
疫感作後にブースター注射をしてもよく、又はしなくて
もよい。ブースター注射をする動物には通常、フロイン
ト不完全アジュバント中の同量のEP₃又はEP₃関連ペプチ
ドを同一経路で投与する。ブースター注射は、最大力価
が得られるまで約３週間の間隔で行う。各ブースター免
疫感作から約７日後、又は単一免疫感作から約１週間後
に動物の採血を行い、血清を回収し、アリコートを約−
20℃で貯蔵する。 近交系マウス、好ましくはBalb/cを、EP₃か又はEP₃タ
ンパク質の配列に由来するペプチドで免疫感作すること
により、EP₃又はEP₃配列由来ペプチドに反応するモノク
ローナル抗体（mAb）を製造する。マウスは、IP又はSC
経路により、同量の前述のような許容し得るアジュバン
トに混入した約0.5mlの緩衝液又は食塩水中の約１μｇ
〜約100μｇ、好ましくは約10μｇのEP₃で免疫感作す
る。好ましいアジュバントはフロイント完全アジュバン
トである。マウスは０日目に最初の免疫感作を行い、約
３〜約30週間休息させる。免疫マウスに、リン酸塩緩衝
食塩水のような緩衝溶液中約１〜約100μｇのEP₃のブー
スター追加免疫を静脈内（IV）経路で一回以上行う。抗
体陽性マウスのリンパ球、好ましくは脾臓リンパ球を、
当業者に公知の標準的方法で免疫マウスから脾臓を除去
することによって得る。脾臓リンパ球を、安定なハイブ
リドーマを形成させる条件下で、適当な融合相手、好ま
しくは骨髄腫細胞と混合して、ハイブリドーマ細胞を形
成する。融合相手の非限定的具体例としては、マウス骨
髄腫P3/NS1/Ag4−1;MPC−11;S−194及びSp 2/0が挙げ
られる。好ましいのはSp 2/0である。抗体産生細胞及
び骨髄腫細胞を分子量約1000のポリエチレングリコール
中約30％〜約50％の濃度で融合させる。融合したハイブ
リドーマ細胞を、当業者に公知の方法で、ヒポキサンチ
ン、チミジン及びアミノプテリン添加ダルベッコ改質イ
ーグル培地（DMEM）中で増殖させることにより選択す
る。約14日目、18日目及び21日目に増殖陽性ウェルから
上清を回収し、EP₃又はEP₃配列由来ペプチドを抗原とし
て用いて、固相イムノラジオアッセイ（SPIRA）のよう
なイムノアッセイで抗体産生に関してスクリーニングす
る。培養液をOuchterlony沈降アッセイでも検査して、m
Abのイソタイプを調べる。抗体陽性ウェル由来のハイブ
リドーマ細胞を、Soft Agar Techniques,Tissue Cul
ture Methods and Applications,Kruse及びPaterson
編,Academic Press,1973に記載のMacPhersonの軟寒天
法のような方法によってクローニングする。 マウス当たり約0.5mlのプリスチンで感作したBalb/c
マウスに、約２×10⁶〜約６×10⁶のハイブリドーマ細胞
を感作処理の約４日後に注入することにより、モノクロ
ーナル抗体をin vivoで産生する。細胞トランスファー
の約８〜12日後に腹水を採取し、モノクローナル抗体を
当業者に公知の方法で精製する。 十分な量の特異的mAbを得るために、ハイブリドーマ
を約２％のウシ胎児血清を含むDMEM培地で増殖させるこ
とにより、抗EP₃mAbをin vitroで製造する。mAbは当業
者に公知の方法で精製する。 腹水又はハイブリドーマ培養液の抗体力価を、種々の
血清学的又は免疫学的アッセイ、例えば非限定的具体例
として、沈降、受動凝集、酵素結合イムノソルベント抗
体（ELISA）法及びラジオイムノアッセイ（RIA）法で測
定する。類似のアッセイを使用して、体液又は組織及び
細胞抽出物中のEP₃の存在を検出する。 当業者には明らかなように、単一特異性抗体を産生す
るための前述の方法は、EP₃ポリペプチド断片又は完全
長EP₃ポリペプチドに特異的な抗体の産生に使用し得
る。 抗体がアガロースゲルビーズ支持体との間で共有結合
を形成するようにＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステ
ルで予備活性化したゲル支持体であるAffigel−10（Bio
rad）に抗体を加えることによりEP₃抗体アフィニティカ
ラムを形成する。抗体はスペーサーアームのアミド結合
を介してゲルに結合する。次いで、残りの活性化エステ
ルを1MエタノールアミンHCl（pH8）で失活させる。カラ
ムを水及び0.23MグリシンHCl（pH2.6）で順次洗浄し
て、非結合抗体又は外来タンパク質を除去する。次いで
カラムを、リン酸塩緩衝食塩水（pH7.3）と洗剤のよう
な適当な膜可溶化剤との中で平衡化し、EP₃又はEP₃断片
を含む細胞膜抽出物をゆっくりとカラムに通す。次いで
カラムを、光学密度（A₂₈₀）がバックグラウンドに低下
するまで、リン酸塩緩衝食塩水及び洗剤で洗浄し、その
後タンパク質を0.23Mグリシン−HCl（pH2.6）及び洗剤
で溶離する。次いで精製EP₃タンパク質をリン酸塩緩衝
食塩水及び洗剤に対して透析する。 本発明のプロスタグランジン受容体をコードするDNA
の単離に適した方法の一つは、別のＧタンパク質結合受
容体から得たアミノ酸及び／又はDNA配列情報を使用す
ることからなる。別のプロスタグランジン受容体はＧタ
ンパク質結合であることがわかっているため、トランス
メンブラン及び／又は細胞質ドメインといったような特
定の領域又はドメインは、新規の受容体を単離するため
のプローブを形成するのに十分な程度の相同を有すると
予想される。 プロスタグランジン及びロイコトリエンは、Ｇタンパ
ク質結合受容体を介して自己のシグナルを形質導入する
ことが知られている。種々の組織中に存在する異なるPG
H₂/トロンボキサンA₂、PGI₂、PGE₂、PGD₂、PGF_２α、LT
B₄及びLTD₄受容体は文献に記述されている。これらの受
容体のうちの一部は可溶化され、部分的に精製され（Du
tta−Roy,A.K.ら，（1987）JBC,262,pp.12685;Tsai,A.
L.ら，（1989）,JBC,264,pp61;168−Watawabe,T.ら，
（1990）,JBC,265,pp.21237）、ヒト血小板TXA₂受容体
は明らかな均質性を示すまで精製された（Ushikubi,F.
ら，（1989）,JBC,264,pp.16496）。精製トロンボキサ
ン受容体は、SDS−ポリアクリルアミドゲル上で約57kDa
を中心とする極めて広いバンドを示した。部分的配列情
報を得るのに十分なタンパク質が得られた。 オリゴヌクレオチドプローブを用いて、ヒト巨核球細
胞系（MEG−01）cDNAライブラリーがスクリーニングさ
れた（Hirata,M.ら，（1991）,Nature,349,pp.617）。
部分長cDNAクローンが得られた。配列決定の結果、該cD
NAクローンは、推定上のＧタンパク質結合受容体のＣ末
端側の半分をコードすることが判明した。このクローン
を標識し、ヒト胎盤ライブラリーのスクリーニングに使
用した。一つの完全長（約2.9kb）クローンは、5'及び
3'側にそれぞれ広い非コーディング領域と、M_r約37000
の343アミノ酸タンパク質をコードする1029塩基対の読
取り枠とを含んでいた。予測された配列は、推定上の細
胞外アミノ末端テール（29残基）内の二つのＮ結合グリ
コシル化部位（Asn−４及びAsn−16）と、細胞外ループ
１及び２内の保存Cys残基（Cys−105及びCys−183）
と、小さいアミン含有リガンドを有する受容体にとって
必須であることが知られているトランスメンブラン３内
に存在するAsp残基（Strosberg,A.D.（1991）,EJB,196,
pp.1）を除く、トランスメンブラン領域内の他の幾つか
の保存残基とを含む７個のトランスメンブランＧ結合受
容体の特性を示す。この配列は極めて短い予測された第
三の細胞内ループ（27残基）を有する。分子のこの部分
はおそらく、ホスホリパーゼＣとの相互作用に関与し、
その結果カルシウムイオン流束を変化させるＧタンパク
質（G_q又はより大きいＧタンパク質）に結合し得る（Sh
enker,A.ら，（1991）,JBC,266,pp.9309.173−Moran,N.
ら，（1990）,Circulation,Suppl.82,抄録1830）。 トロンボキサン受容体はアフリカツメガエル卵母細胞
内で発現された。該受容体は、内在性シグナルトランス
ダクション成分と結合して、カルシウム活性化Cl^-流を
発生させることができる。該Cl^-流は、Hirata,M.らによ
りNature,349,pp.617（1991）に記載の方法を用いて、
電気生理学的測定により記録される。リガンドＳ−145
を用いてトロンボキサン受容体cDNAでトランスフェクシ
ョンしたCOS−１細胞膜について結合検査が実施された
（Hirata,M.ら，前出）。我々は、トロンボキサン受容
体cDNAでトランスフェクションしたヒト初期腎臓293細
胞及び膜におけるトロンボキサンアンタゴニストSQ−29
548のアフィニティ結合が大きく、最大結合が２〜3pmol
/mgタンパク質であることも明らかにした。この発現レ
ベルは、血小板膜におけるレベルの少なくとも５〜10倍
に相当する。トランスフェクション効率を10％とみなし
て細胞当たりのベースで推算すると、約10⁶結合部位／
トランスフェクション細胞となった。これに対し、血小
板上に存在する部位は約1300である（Hourani,S.M.O.
ら，（1991）,Pharmacol.Rev.,43,pp.243）。 ノーザンブロット分析で、MEG−01細胞系、胎盤及び
肺内の2.8kbバンドの存在が明らかにされた。報告され
ている長い暴露時間（12日）及び検出可能シグナルを見
るために導入されたポリ（Ａ）⁺RNAの量（20μｇ）に基
づいて推定すると、mRNAはおそらくあまり多くない部類
に入る。 相同スクリーニングによる別のエイコサノイド受容体
遺伝子の単離へのアプローチが、これらの受容体が一次
構造で相関しているという想定のもとに行われた（Sugi
moto,Y.ら，（1992）,JBC,267,pp.6463）。これらの受
容体はＧタンパク質結合受容体スーパーファミリーであ
るため、トランスメンブラン領域及び細胞質ドメインに
存在すると考えられる相同領域が存在する。従って、プ
ロスタグランジン受容体と相関している種々の既知のＧ
タンパク質結合受容体は、相同を有すると思われる所期
の受容体タンパク質コーディングDNAの領域、例えばト
ランスメンブラン領域に対するDNAプローブを得るため
に使用し得る。 両方でマウスEP₃α読取り枠の全長をコードする0.4kb
及び0.7kbマウスEP_３αcDNAを用いて、390アミノ酸受容
体をコードする、以後EP_３αと称する1.9kb cDNAクロ
ーン（EP₃）を、ヒト腎臓cDNAライブラリーから単離し
た。マウスEP₃のトランスメンブランドメインVII内の９
個のアミノ酸及びヒトTP受容体に基づく16倍縮重の27量
体オリゴヌクレオチドを用いて、ヒト子宮cDNAライブラ
リーをスクリーニングした。それぞれ365及び388アミノ
酸受容体タンパク質をコードする、以後EP_3-9（1.4kb）
及びEP_3-21（1.7kb）と称する別の二つのcDNAをクロー
ニングした。他の多くのＧタンパク質結合受容体と同様
に、EP₃受容体は幾つかの共通の特徴を有する。第一
に、推定上の細胞外領域に４個の潜在的Ｎ結合グリコシ
ル化部位（Asn−18、Asn−36、Asn−217及びAsn−308）
が存在する。第二に、エキソフェイシャル（exofacia
l）ループ１及び２内に保存システイン残基が存在す
る。EP₃受容体は、カチオンアミノ含有リガンドに結合
する受容体の特徴であるトランスメンブラン３内のアス
パラギン酸残基を含んでいないが、トランスメンブラン
７内の総てのエイコサノイド受容体内に存在する保存ア
ルギニンを有する。この領域は、エイコサノイド受容体
の間で最も高度に保存されている。EP₃受容体はヒトト
ロンボキサン受容体に最も近い。 本発明の新規のプロスタグランジン受容体は、受容体
活性を調節する化合物を選定するためのアッセイ操作で
使用するのに適している。本明細書中の受容体活性の調
節には受容体の阻害又は活性化が含まれ、また、受容体
活性の正常な調整に対する直接的又は間接的作用も含ま
れる。受容体活性を調節する化合物としては、アゴニス
ト、アンタゴニスト、及び受容体活性の調整に直接又は
間接に作用する化合物が挙げられる。 本発明のプロスタグランジン受容体は、受容体調節因
子を選定するためのアッセイ操作で使用すべく、野生供
給源及び組換え供給源の両方から得られる。プロスタグ
ランジン受容体調節因子を選定するためのアッセイ操作
は通常、本発明のプロスタグランジン受容体と、推定上
のプロスタグランジン受容体調節因子を含む検査化合物
又は試料とを含む。検査化合物又は試料は、例えば、野
生もしくは組換え型の精製受容体タンパク質、野生もし
くは組換え型の受容体産生細胞の継代細胞フラクショ
ン、及び／又は野生もしくは組換え型の受容体発現完全
細胞上で直接検査し得る。検査化合物又は試料は、既知
の標識又は非標識受容体リガンドの存在下又は不在下で
受容体に加え得る。検査化合物又は試料の調節活性は、
例えば、検査化合物又は試料が受容体に結合する能力、
受容体を活性化する能力、受容体活性を阻害する能力、
受容体への別の化合物の結合を阻害する又は促進する能
力を分析し、受容体の調整を修飾し、又は細胞内活性を
修飾することによって測定し得る。 EP₃受容体活性の調節因子の選定は、EP₃受容体活性が
関与する疾患状態の治療に有用である。別の化合物が、
受容体の活性を刺激又は阻害するために有用であり得
る。EP₃受容体の選択性アゴニストは、眼圧を低下させ
ることができるため緑内障の治療に有用であり得、非ス
テロイド性抗炎症剤の投与に伴う副作用を治療するため
の物質としても有用であり得る。EP₃受容体に拮抗する
化合物は、EP₃受容体の活性化が、細胞増殖、細胞悪性
形質転換の誘起又は転移性腫瘍成長を引き起こす疾病の
治療、又はEP₃受容体の活性化が、腎臓血管収縮時に観
察されるような平滑筋収縮を引き起こす病理状態の治療
に有用であり得る。EP₃をコードするDNA分子の単離及び
精製は、疾患状態におけるEP₃受容体発現の変化を調べ
るためのEP₃受容体の組織分布の確立、並びにEP₃受容体
活性を調節する化合物の選定方法の確立に有用と思われ
る。 以下の実施例は本発明を明らかにするためのものであ
り、本発明の範囲を限定するためのものではない。 実施例１ EP_３α、EP_3-9及びEP_3-21受容体cDNAのクローニング Perkin Elmer社（Branchburg,N.J.）のRT−PCRキッ
トを用いてマウス腎臓ポリA⁺RNAを逆転写し、次いで二
組の異なるPCRプライマーでPCRを実施した。第一組のプ
ライマーは、5'センス25量体オリゴヌクレオチド［5'−
CCACCATGGCTAGCATGTGGGCGCC−3'］（配列番号:1）及び
3'アンチセンス25量体オリゴヌクレオチド［5'−CTCCAC
GGCCATGGCGCTGGCCACC−3'］（配列番号:2）を含んでい
た。この一組は、マウスEP_３α受容体の398塩基対5'cDN
A断片を形成した。第二組のプライマーは、5'センス８
倍縮重27量体オリゴヌクレオチド［CTGCC（G,C）（G,
C）TGCTGGGCGTGGG（C,T）CGCTAC−3'］（配列番号:3）
及び3'アンチセンス16倍縮重27量体オリゴヌクレオチド
［5'−ATA（A,C）ACCCAGGG（A,G）TCCA（A,G）GATCTG
（G,A）TT−3'］（配列番号:4）を含んでおり、マウス
_３α受容体の468塩基対3'cDNA断片を形成した。これら
のcDNA断片を³²P標識し、標準的方法（Sambrookら,198
9,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第２版,
Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Har
bor,N.Y.）に従ってヒト腎臓cDNA λgtl1ライブラリー
（Clontech,Palo Alto,CA）をプローブするのに使用し
た。このスクリーニングから、1.9kb完全長ヒトEP_３αc
DNAクローンをプラーク精製し、プレート溶解物法（Sam
brookら，前出）によってDNAを製造した。 トランスメンブランドメインVII内の９個の保存アミ
ノ酸（NQILDPWVY）（配列番号:6）に基づいて、アンチ
センス16倍縮重27量体オリゴヌクレオチド［5'−ATA
（A,C）ACCCAGGG（A,G）TCCA（A,G）GATCTG（C,A）TT−
3'］（配列番号:5）を合成した。³²P標識オリゴプロー
ブを用いて、標準的方法（Sambrookら，前出）でヒト子
宮λgtl0ライブラリー（Clontech,Palo Alto,CA）をス
クリーニングした。このスクリーニングから1.7kb完全
長ヒトEP_3-21cDNAクローン及び1.4kb完全長ヒトEP_3-9cD
NAクローンの両方をプラーク精製し、プレート溶解物法
（Sambrookら，前出）によってDNAを製造した。 cDNAのサブクローニング及び配列決定 ３個の陽性クローンをEcoR Iで消化した結果、大きさ
が約1.9kb、1.7kb及び1.4kbの挿入物を含んでいること
が判明した。これらの挿入物は、サザンブロット分析
で、マウスEP₃受容体cDNAプローブのフラグメントとハ
イブリダイズすることが明らかになった。T7 DNAポリ
メラーゼ配列決定キット（Pharmacia）を用いて配列決
定すべく、３個のEcoR Iフラグメント（EP_３α、EP_3-21
及びEP_3-9と称するEP₃クローン）及び種々の制限酵素断
片をpKSベクター（Stratagene,La Jolla,CA）内にサブ
クローニングした。DNAは、KSもしくはSKプライマー、
又は所定の配列から形成したプライマーを用いて、２本
鎖とも完全に配列決定された。３個のEP₃クローンのヌ
クレオチド配列を表１のＡ、Ｂ及びＣに示す。コードさ
れたタンパク質のアミノ酸配列を表２に示す。各DNAク
ローンは、配列決定の結果、ヒトトロンボキサン受容体
cDNAに対して大きな配列相同を有することが判明し、Ｇ
タンパク質結合受容体の特徴と推測されているヘプタヘ
リカル構造が明らかにされた。EP_３α、EP_3-21及びEP
_3-9の読取り枠は、予想された相対分子量43,315、42,68
8及び40,507をそれぞれ有するタンパク質をコードする1
170塩基対、1164塩基対及び1095塩基対であった。開始
コドンとされるATGは、翻訳開始のためのKozak共通配列
（Kozak,1989,J.Cell.Biol.,108,pp229−241）に適合す
る。EP₃cDNAクローン、即ちEP_３α、EP_3-21及びEP
_3-9は、それぞれ約502塩基対、298塩基対及び64塩基対
の3'非翻訳配列を含む。 実施例２ 発現ベクターの構築 EP_３α、EP_3-21及びEP_3-9をコードするcDNAを、pcDNA
1amp（Invitrogen）のHind III部位にそれぞれサブクロ
ーニングし、方向が正しいことをBamH I消化及び配列決
定によって確認した。 実施例３ 大腸菌発現ベクター内へのEP₃cDNAのクローニング 非限定的具体例としてpETシリーズ（Novagen）のよう
な大腸菌発現ベクター内にEP₃発現カセットをトランス
ファーして、大腸菌内で組換えEP₃を産生する。pETベク
ターはEP₃を、厳密に調節されたバクテリオファージT7
プロモーターの制御下におく。誘導lacプロモーターに
よって制御されるT7 RNAポリメラーゼ遺伝子の染色体
コピーを含む大腸菌宿主内への該構築物のトランスファ
ーに次いで、適当なlac基質（IPTG）を培養物に加える
と、EP₃の発現が誘発される。発現EP₃のレベルを前述の
アッセイで測定する。 PE₃に関する読取り枠全体をコードするcDNAを、pET
11aのNde I部位に挿入する。正の方向の構築物を配列解
析によって同定し、発現宿主株BL21の形質転換に使用す
る。次いで、形質転換体を用いて、EP₃タンパク質を製
造するための培養物に接種する。培養物は、当業者に組
成が知られているM9又はZB培地で増殖させ得る。約OD
₆₀₀＝1.5まで増殖した後、1mM IPTGを用いて37℃で３
時間にわたりEP₃の発現を誘発する。これらの細胞に由
来する膜フラクション中に、EP₃受容体結合活性が発見
される。 実施例４ アフリカツメガエル卵母細胞マイクロインジェクション
によるEP₃mRNAのin vitro翻訳及び哺乳動物細胞内での
発現 EP₃cDNA構築物をin vitro転写ベクター（pGEMシリー
ズ、Promega）に連結して、合成mRNAを製造する。 合成mRNAは、EP₃mRNAをコードする二本鎖DNAをバクテ
リオファージプロモーター含有プラスミドベクター内に
クローニングし、クローン化EP₃コーディングDNAを含む
プラスミドベクターを線状化し、プラスミドベクター上
のバクテリオファージプロモーターを特異的に認識する
バクテリオファージからDNA依存性RNAポリメラーゼを用
いてクローン化DNAをin vitro転写するとにより、十分
な量で製造される。 バクテリオファージDNA依存性RNAポリメラーゼによっ
て認識されるバクテリオファージプロモーターを含むプ
ラスミドベクターは様々なものが存在し、非限定的具体
例としては、プラスミドpSP64、pSP65、pSP70、pSP71、
pSP72、pSP73、pGEM−3Z、pGEM−4Z、pGEM−3Zf、pGEM
−5Zf、pGEM−7Zf、pGEM−9Zf及びpGEM−11Zfが挙げら
れる。これら一連のプラスミドは総てPromegaから市販
されている。 EP₃DNAのクローニングに適している、ベクター上の使
用可能な制限エンドヌクレアーゼクローニング部位のう
ちの一つ以上を使用して、EP₃をコードする二本鎖DNAを
ベクター含有バクテリオファージプロモーター内に正確
な向きでクローニングする。連結したEP₃DNAを有するベ
クターを用いて細菌を形質転換し、正確な向きのEP₃DNA
を有するベクターの存在についてクローン単離体を分析
する。 正確な向きのEP₃コーディングDNAを含むベクターが同
定され単離されたら、これをEP₃転写単位よりも下流の
部位において、該単位を破損しないように制限エンドヌ
クレアーゼで開裂することにより線状化する。線状化プ
ラスミドを単離し、精製し、EP₃mRNAのin vitro転写の
鋳型として使用する。 次いで鋳型DNAを、EP₃mRNA形成DNA鋳型の転写を可能
にする反応混合物中で、バクテリオファージ特異的DNA
依存性RNAポリメラーゼと混合する。使用可能なバクテ
リオファージ特異的DNA依存性RNAポリメラーゼは幾つか
存在し、非限定的具体例としてT3、T7及びSP6 RNAポリ
メラーゼが挙げられる。次いで、合成EP₃mRNAを単離
し、精製する。 mRNAの安定性を改善するために、5'末端キャップ構造
及び3'ポリＡテールを含むmRNAを合成すると有利であり
得る。キャップ構造、すなわち７−メチルグアノシン
は、DNA鋳型との反応混合物に７−メチルグアノシンを
加えるだけでmRNAの5'末端に組込み得る。DNA依存性RNA
ポリメラーゼは、mRNAの合成中にキャップ構造を5'末端
に組み込む。ポリＡテールは多くのcDNA中に天然に存在
するが、ポリＡテールをコードするDNA配列をDNA鋳型の
3'末端に挿入することにより、mRNAの3'末端に簡単に付
加できる。 単離し精製したEP₃mRNAは、無細胞系、例えば非限定
的具体例としてウサギ網状赤血球溶解物及びコムギ胚芽
抽出物（どちらもPromega及びNew England Nuclearか
ら市販されている）を用いて、又は細胞ベースの系、例
えば非限定的具体例としてアフリカツメガエル卵母細胞
へのマイクロインジェクションを用いて翻訳する。好ま
しいのはアフリカツメガエル卵母細胞へのマイクロイン
ジェクションである。 アフリカツメガエル卵母細胞に、EP₃タンパク質の産
生に十分な量の合成EP₃mRNAをマイクロインジェクショ
ンする。マイクロインジェクションにかけた卵母細胞を
インキュベートしてEP₃mRNAの翻訳を生起させ、EP₃タン
パク質を産生させる。 前記合成mRNAは標準的方法［Gurdon,J.B.及びWicken
s,M.D.,Methods in Enzymol.101:370−386（1983）］
でアフリカツメガエル卵母細胞（段階５〜６）内に注入
する。卵母細胞を採取し、後述のようにEP₃発現につい
て分析する。 実施例５ 哺乳動物発現ベクター内へのEP₃cDNAのクローニング EP₃cDNA発現カセットを、適当な制限エンドヌクレア
ーゼ部位で、強力な普遍的哺乳動物プロモーターを含む
下記のベクターに連結する:pBC12BI［Cullen,B.R.,Meth
ods in Enzymol.152:684−704,1988］、並びにpEE12
（CellTech EP 338,841号）及びその誘導体pSZ9016−
１及びp9019。p9019は、hCMVIEプロモーターと、ポリリ
ンカーと、SV40ポリＡエレメントとを含み、SV40初期プ
ロモーターによって操作されるジヒドロ葉酸レダクター
ゼの突然変異遺伝子（mDHFR）（Simonsen,C.C.及びLevi
nson,A.D.Proc.Natl.Acad.Sci USA 80:2495−2499［1
983］）からなる選択可能マーカー／増幅システムを有
する哺乳動物発現ベクターの構築物を表す。SV40ポリア
デニル化配列を、pD5（Berker及びSharp,Nucl.Acid Re
s.13:841−857［1985］）を鋳型として用いて、プライ
マー13978−120及び139778−121により決定されるPCR反
応で形成する。得られた0.25Kb PCR生成物をCla I及び
Spe Iで消化し、同様に消化したpEE12の6.7Kb断片に連
結する。得られたプラスミドをBgl II及びSfi Iで消化
して、SV40初期プロモーターの3'部分とGScDNAとをベク
ターから切り離す。プラスミドpFR400（Simonsen,C.C.
ら，前出）から分離した0.73Kb Sfi I−Xho II断片を
前述の5.6Kbベクターに連結し、SV40初期プロモーター
を再構築し、mDHFR遺伝子を挿入する。このプラスミド
をp9019と名付ける。pSZ9016−１は、HIV LTRがhuCMVI
Eプロモーターにとって代わっている以外は、p9019と同
じである。このベクターは、p9019をXba I及びMlu Iで
消化してhuCMVIEプロモーターを除去することにより構
築される。残基−117〜＋80（HIV−１ LTRの部分を含
むベクターpCD23内に存在する（Cullen,Cell 46:973
［1986］）のHIV LTRプロモーターを、生成物の末端に
5'側のMlu I及びSpe I制限部位を付加したオリゴヌクレ
オチドプライマーを用いて、プラスミドpCD23からPCR増
幅する。Hind III及びXba I部位は3'側に付加されてい
る。得られた0.2kb PCR生成物を酵素Mlu I及びXba Iで
消化した後、断片をアガロースゲルで精製し、プロモー
ターを含まない4.3Kb DNA断片に連結して、ベクターpS
Z9016−１を形成する。 プロモーターに対して正の向きにあるEP₃cDNAを含む
カセットをプロモーターの適当な制限部位3'に連結し、
制限部位マッピング及び／又は配列決定によって同定す
る。これらのcDNA発現ベクターを種々の宿主細胞、例え
ば非限定的具体例としてCOS−７（ATCC＃CRL1651）、CV
−１［Sackevitzら,Science 238:1575（1987）］,293,
L細胞（ATCC＃CRL6362）に、標準的方法、例えば非限定
的具体例として電気穿孔法又は化学的処理（カチオンリ
ポソーム、DEAEデキストリン、リン酸カルシウム）によ
って導入する。トランスフェクションした細胞及び細胞
培養抽出物を回収して、後述のようにEP₃発現について
分析し得る。 哺乳動物過渡的発現に使用した総てのベクターは、EP
₃を発現する安定な細胞系の確立に使用できる。発現ベ
クター内にクローニングした変更していないEP₃cDNA構
築物は、宿主細胞を細胞内EP₃タンパク質を作るように
プログラムすると推測される。トランスフェクション宿
主細胞の非限定的具体例としては、CV−１［Sackevitz
ら，前出］、tk−Ｌ［Wiglerら,Cell 11:223（197
7）］、NS/0及びDHFR−CHO［Kaufman及びSharp,J.Mol.B
iol.159:601（1982）］が挙げられる。 EP₃cDNAを含む任意のベクターと、薬剤選択性プラス
ミド、例えば非限定的具体例としてG418、アミノグリコ
シドホスホトランスフェラーゼ、pLNCX［Miller,A.D.及
びRosman,G.J.,Biotech News 7:980−990（198
9）］；ハイグロマイシン、ハイグロマイシン−Ｂホス
ホトランスフェラーゼ,pLG90［Gritz,L.及びDavies,J.,
GENE 25:179（1983）］、APRT、キサンチン−グアニ
ン、ホスホリボシル−トランスフェラーゼ、pMAM（Clon
tech）［Murrayら,Gene 31:233（1984）］との同時ト
ランスフェクションは、安定にトランスフェクションし
たクローンの選択を可能にする。EP₃レベルは前述のア
ッセイによって定量する。 可能な限り高いレベルのEP₃を合成する哺乳動物細胞
クローンを製造するために、増幅可能薬剤耐性マーカー
を含むベクター内にEP₃cDNA構築物を連結する。これら
の構築物を細胞内に導入した後、プラスミドを含むクロ
ーンを適当な物質を用いて選択し、プラスミドのコピー
数が多い過剰発現クローンの単離を、前記物質の用量増
加の選択によって実施する。下記のシステムを使用す
る：突然変異DHFR遺伝子を含む9016又は9019プラスミド
［Simonsonら，前出］、DHFR−CHO細胞内にトランスフ
ェクションし、メトトレキサート中で選択；グルタミン
シンセターゼ遺伝子を含むpEE12プラスミド、NS/O細胞
内にトランスフェクションし、メチオニンスルホキシミ
ン中で選択（CellTeck国際特許出願WO89/10404号）；及
びAPRT及びTK欠失Ｌ細胞内のチミジンキナーゼ遺伝子
［Colbere及びGaropin,F.,Proc.Natl.Acad.Sci.76:3755
（1979）］を含むpDLAT−３と同時トランスフェクショ
ンした9016又は他のCMVプロモーターベクター、APRT
（0.05mMアザセリン、0.1mMアデニン、４μg/mlアデノ
シン）中で選択し、HAT（100μＭヒポキサンチン、0.4
μＭアミノプテリン、16μＭチミジン）で増幅。 実施例６ COS−M6細胞内でのpcDNA Iamp−EP₃発現及び［³H］PGE₂
結合アッセイ コードされたタンパク質のカルボキシル末端が異なる
ヒトプロスタグランジンＥ受容体EP₃サブタイプ（hEP
_３α、hEP_3-21及びhEP_3-9）の３個のクローン化形態
を、pcDNA1ampプラスミド（Invitrogen）内に個々にサ
ブクローニングし、DEAE−デキストラン方法を用いてCO
S−M6細胞内にトランスフェクションした。細胞を72時
間培地に維持し、次いで回収し、窒素キャビテーション
による細胞溶解後に、示差的遠心分離（1000×ｇで10分
間、次いで100,000×ｇで30分間）にかけて膜を製造し
た。1mM EDTA、10mM MgCl₂、0.5nM［³H］PGE₂、及び1
00,000×ｇ膜フラクション由来タンパク質0.5〜３μｇ
を含む10mMリン酸カリウム（pH6.0）中で、［³H］プロ
スタグランジンE₂（［³H］PGE₂）結合アッセイを行っ
た。前述のように高速濾過で結合及び遊離放射性リガン
ドを分離する前に、室温で１時間インキュベーションを
実施した（Freyら,1993）。フィルターに結合している
残りの［³H］PGE₂を液体シンチレーション計数で定量し
た。特異的結合は、１μＭ PGE₂の存在下で測定した総
ての結合と非特異的結合との間の差として定義した。 ［³H］PGE₂の特異的結合はいずれの場合も親和性が高
く飽和する傾向にあった。平衡解離係数（K_D）はhEP
_３α、hEP_3-21及びhEP_3-9を通して大差なく、それぞれ
0.75nM、0.83nM及び0.95nMであった。いずれの場合も大
きな発現レベルが達成され、特異的［³H］PGE₂結合部位
の最大数（B_max）の推算値は、hEP_３α、hEP_3-21及びhE
P_3-9についてそれぞれ13.6、5.3及び19.8pmol/mg膜タン
パク質であった。競合アッセイでは、PGE₂及びPGE₁がこ
れら３種類のイソフォーム（isoform）での［³H］PGE₂
特異的結合の阻止に関して同等の力を示し、IC₅₀値は約
1nMであった（第３図Ａ、第４図Ａ及び第５図Ｂ）。PGF
_２α及びPGD₂の活性は、hEP_３α及びhEP_3-21ではPGE₂の
約200〜2000分の１であったが、hEP_3-9では65〜500分の
１にすぎなかった（第３図Ａ、第４図Ａ及び第５図
Ａ）。また、EP₁選択性アンタゴニストAH6809は一般
に、hEP₃サブタイプでの活性がhEP₁サブタイプでの活性
の５〜10分の１であり、IC₅₀値はhEP₃の場合が２〜７μ
Ｍ、hEP₁の場合が0.5μＭであった。更に、EP₂選択性ア
ゴニストであるブタプロストは、30μＭ以下では不活性
であった。また、胃細胞保護物質（gastric cytoprote
ctive agent）であるPGE₂類似体ミソプロストルは、EP
₃サブタイプで、前記イソフォームへの［³H］PGE₂特異
的結合に関する競合において親和性が0.3〜1.2μＭに及
ぶ活性を示すと考えられた（第１図Ｂ、第２図Ｂ及び第
３図Ｂ）。これらの放射性リガンド結合データは、hEP
_３α、hEP_3-21及びhEP_3-9イソフォームがいずれも、EP₃
サブタイプに関して予測されたリガンド結合特性を有す
ることを示している。 実施例７ 昆虫細胞内発現のためのバキュロウイルス発現ベクター
内へのEP₃cDNAのクローニング AcNPVウイルスのゲノムに由来するバキュロウイルス
ベクターを、Sf9系昆虫細胞（ATCC CRL＃1711）内でcD
NAを高レベル発現させるように設計する。EP₃cDNAを発
現する組換えバキュロウイルスを以下の標準的方法で製
造する（In Vitrogen Maxbac Manual）:EP₃cDNA構築
物を種々のバキュロウイルストランスファーベクター、
例えばpAC360及びpBlueBacベクター（In Vitrogen）内
のポリヘドリンプロモーターの下流に連結する。バキュ
ロウイルストランスファーベクター及び線状化AcNPVゲ
ノムDNA［Kitts,P.A.,Nuc.Acid Res.18:5667（199
0）］のSf9細胞内への同時トランスフェクションに次ぐ
相同組換えによって、組換えバキュロウイルスを形成す
る。組換えpAC360ウイルスは感染細胞内の封入体の不在
によって同定され（Summers,M.D.及びSmith,G.E.,Texas
Agriculture Exp.Station Bulletin No.1555）、
組換えpBlueBacウイルスはβ−ガラクトシダーゼ発現に
基づいて同定される（Vialardら,1990,J.Virol.,64,pp3
7−50）。プラーク精製及びEP₃組換えバキュロウイルス
でのsf9細胞の感染後に、前述のアッセイでEP₃発現を測
定する。 EP₃に関する読取り枠全体をコードするcDNAをpBlueBa
c IIのBamH I部位に挿入する。ポリヘドリンプロモータ
ーに対して正の向きにある構築物を配列解析によって同
定し、線状AcNPVマイルドタイプDNAの存在下でSf9細胞
をトランスフェクションするために使用する。 真正の活性EP₃は感染細胞の膜に結合している。膜調
製物を標準的方法で感染細胞から製造する。 実施例８ 酵母発現ベクター内へのEP₃cDNAのクローニング 外来性タンパク質の細胞内発現を制御するように設計
した発現ベクター内に最適EP₃cDNA構築物を挿入した
後、酵母S.cerevisiae内で組換えEP₃を産生する。細胞
内発現のために、EmBLyex4等のようなベクターをEP₃シ
ストロンに連結する［Rinas,U.ら,Biotechnology 8:54
3−545（1990）;Horowitz B.ら,J.Biol.Chem.265:4189
−4192（1989）］。発現されたEP₃のレベルは前述のア
ッセイで測定する。 実施例９ 組換えEP₃の精製 組換え技術によって製造したEP₃は、抗体アフィニテ
ィクロマトグラフィーによって精製し得る。 抗体がアガロースゲルビーズ支持体との間で共有結合
を形成するようにＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステ
ルで予め活性化したゲル支持体であるAffigel−10（Bio
rad）に抗EP₃抗体を加えることによって、EP₃抗体アフ
ィニティカラムを形成する。抗体はスペーサーアームの
アミド結合を介してゲルに結合する。次いで、残りの活
性化エステルを1MエタノールアミンHCl（pH8）で失活す
る。カラムを水及び0.23MグリシンHCl（pH2.6）で順次
洗浄して、非結合抗体又は外来タンパク質を除去する。
次いでカラムを、リン酸塩緩衝食塩水（pH7.3）及び適
当な膜可溶化剤、例えば洗剤の中で平衡化し、可溶化EP
₃もしくはEP₃サブユニットを含む細胞培養上清又は細胞
抽出物をカラムにゆっくり通す。次いでカラムを、光学
密度（A₂₈₀）がバックグラウンドに低下するまで、リン
酸塩緩衝食塩水及び洗剤で洗浄し、その後タンパク質を
0.23Mグリシン−HCl（pH2.6）及び洗剤で溶離する。次
いで、精製したEP₃タンパク質をリン酸塩緩衝食塩水及
び洗剤に対して透析する。

【配列表】

配列番号:1 配列の長さ:25 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類:cDNA アンチセンス:No 配列 配列番号:2 配列の長さ:25 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類:cDNA アンチセンス:Yes 配列 配列番号:3 配列の長さ:27 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類:cDNA アンチセンス:No 配列 配列番号:4 配列の長さ:27 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類:cDNA アンチセンス:Yes 配列 配列番号:5 配列の長さ:27 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類:cDNA アンチセンス:Yes 配列 配列番号:6 配列の長さ:9 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 配列番号:7 配列の長さ:1869 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類:cDNA 配列 配列番号:8 配列の長さ:1690 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類:cDNA 配列 配列番号:9 配列の長さ:1387 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類:cDNA 配列 配列番号:10 配列の長さ:390 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列 配列番号:11 配列の長さ:388 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列 配列番号:12 配列の長さ:365 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｎ 5/10 Ａ６１Ｋ 39/395 Ｄ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｆ // Ａ６１Ｋ 39/395 33/566 Ｇ０１Ｎ 33/53 33/577 Ｂ 33/566 Ｃ１２Ｒ 1:865 33/577 1:19 (Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:865） Ｃ１２Ｒ 1:91 (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ１２Ｒ 1:19） 5/00 Ｂ (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:865） (72)発明者 ボーイー，イブ カナダ国、ケベツク・アシユ・２・ブ イ・１・ダブリユ・５ アウターモン ト、バーナード・アベニユー・1465、ア パートメント・９ (72)発明者 メターズ，キヤスリーン カナダ国、アシユ・２・エクス・１・ダ ブリユ・４、モントリオール、ミルト ン・570、アパートメント・18 (72)発明者 ラシユモア，トマス・アシユ カナダ国、ケベツク・アシユ・９・ビ ー・２・アール・９、ダラード・デ・オ ーミユー、ドンナコナ・プレイス・38 (72)発明者 アダム，モハメド カナダ国、ケベツク・アシユ・９・ジエ イ・２・エクス・２、カークランド、リ バーウツド・グローブ・18 (56)参考文献 Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ（1992）Ｖｏ ｌ．267，Ｎｏ．10，ｐ．6463−6466 Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ（1993）Ｖｏ ｌ．268，Ｎｏ．４，ｐ．2712−2718 (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12N 15/00 - 15/90 C07K 14/705 C07K 16/28 C12P 21/00 - 21/02 G01N 33/53 G01N 33/566 G01N 33/577 ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ／ＰＩＲ／ＧｅｎｅＳ ｅｑ ＥＵＲＯＰＡＴ（ＱＵＥＳＴＥＬ)

Claims (23)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】下記の群： 【化１】 から選択されるアミノ酸配列を有することを特徴とす
   る、プロスタグランジンに特異的に結合する、単離し精
   製されたプロスタグランジン受容体タンパク質。
2. 【請求項２】EP₃プロスタグランジン受容体タンパク質
   をコードする単離し精製されたDNA分子であって、前記
   タンパク質が請求項１に記載のアミノ酸配列を有する前
   記DNA分子。
3. 【請求項３】プロスタグランジン受容体タンパク質をコ
   ードする単離し精製されたDNA分子であって、下記の
   群： 【化２】 から選択されるヌクレオチド配列を有することを特徴と
   する、前記DNA分子。
4. 【請求項４】組換え宿主細胞内でプロスタグランジンEP
   3受容体タンパク質を発現させるための発現ベクターで
   あって、請求項３に記載のDNA分子を含む前記発現ベク
   ター。
5. 【請求項５】組換えプロスタグランジンEP₃受容体タン
   パク質を発現する宿主細胞であって、請求項４に記載の
   発現ベクターを含む前記宿主細胞。
6. 【請求項６】組換え宿主細胞内でプロスタグランジンEP
   ₃受容体タンパク質を発現させる方法であって、（ａ）
   請求項４に記載の発現ベクターを適当な宿主細胞内にト
   ランスファーし、（ｂ）前記宿主細胞を発現ベクターか
   らのプロスタグランジン受容体タンパク質の発現を可能
   にする条件下で培養する操作を含む前記方法。
7. 【請求項７】プロスタグランジンEP₃受容体活性の調節
   因子を選定する方法であって、（ａ）プロスタグランジ
   ン受容体活性の推定調節因子を、請求項１に記載のアミ
   ノ酸配列を有することを特徴とするプロスタグランジン
   受容体と混合し、（ｂ）プロスタグランジン受容体に対
   する推定調節因子の作用を測定する操作を含む前記方
   法。
8. 【請求項８】プロスタグランジンEP₃受容体タンパク質
   に特異的に結合する抗体であって、前記タンパク質が請
   求項１に記載のアミノ酸配列を有することを特徴とする
   前記抗体。
9. 【請求項９】組換え宿主細胞内でのプロスタグランジン
   EP₃受容体タンパク質の発現のための発現ベクターであ
   って、請求項２に記載のDNA分子を含む前記発現ベクタ
   ー。
10. 【請求項１０】組換えプロスタグランジンEP₃受容体タ
    ンパク質を発現する宿主細胞であって、請求項９に記載
    の発現ベクターを含む前記宿主細胞。
11. 【請求項１１】組換え宿主細胞中でプロスタグランジン
    EP₃受容体タンパク質を発現させる方法であって、 （ａ） 請求項９に記載の発現ベクターを適切な宿主細
    胞へトランスファーし、 （ｂ） 宿主細胞を発現ベクターからのプロスタグラン
    ジン受容体タンパク質の発現を可能にする条件下で培養
    することを含む方法。
12. 【請求項１２】化合物がプロスタグランジン受容体EP₃
    の活性を調節するかどうかを測定する方法であって、 ａ） 請求項１に記載のアミノ酸配列を含むプロスタグ
    ランジンEP₃受容体タンパク質を発現する核酸分子で宿
    主細胞をトランスフェクトするかまたはトランスフォー
    ムして、組換えEP₃受容体発現細胞を得て、 ｂ） EP₃受容体発現細胞を化合物にさらし、 ｃ） 組換えプロスタグランジンEP₃受容体を発現しな
    い対照宿主細胞を工程ｂ）の化合物にさらし、 ｄ） EP₃受容体発現細胞内でのプロスタグランジンEP₃
    受容体タンパク質に対する化合物の調節効果及び対照宿
    主細胞での化合物の調節効果を測定し、 ｅ） EP₃受容体発現細胞内でのプロスタグランジンEP₃
    受容体タンパク質に対する化合物の効果を対照宿主細胞
    と比較することを含む方法。
13. 【請求項１３】工程ａ）の宿主細胞がアフリカツメガエ
    ル卵母細胞である請求項12に記載の方法。
14. 【請求項１４】化合物がプロスタグランジンEP₃受容体
    タンパク質への結合に関して公知のプロスタグランジン
    EP₃受容体リガンドと競合するかどうかを測定する方法
    であって、 ａ） 請求項１に記載のアミノ酸配列を含むプロスタグ
    ランジンEP₃受容体タンパク質を発現する核酸分子発現
    ベクターで宿主細胞をトランスフェクトするかまたはト
    ランスフォームして、EP₃受容体発現細胞を得て、 ｂ） EP₃受容体発現細胞から実質的に精製された細胞
    膜調製物を単離し、 ｃ） 組換えプロスタグランジンEP₃受容体タンパク質
    を発現しない対照宿主細胞から実質的に精製された細胞
    膜調製物を単離し、 ｄ） 工程ｂ）と工程ｃ）の膜調製物を化合物と公知の
    プロスタグランジンEP₃受容体リガンドにさらし、 ｅ） 工程ｂ）の膜調製物内でプロスタグランジンEP₃
    受容体タンパク質に対する化合物の結合を測定し、 ｆ） 工程ｃ）の膜調製物に対する化合物の結合を測定
    し、 ｇ） 工程ｂ）の膜調製物中のプロスタグランジンEP₃
    受容体タンパク質と工程ｃ）の膜調製物に対する化合物
    の結合を比較することを含む方法。
15. 【請求項１５】プロスタグランジンEP₃受容体リガンド
    が、プロスタグランジン受容体タンパク質に対する結合
    に関してPGE₂と競合させたときに、少なくとも約７μＭ
    までのリガンド濃度でプロスタグランジンEP₃受容体タ
    ンパク質に対して50％最大特異的結合を示す請求項14に
    記載の方法。
16. 【請求項１６】プロスタグランジンEP₃受容体リガンド
    がPGE₂、PGE₁、ミソプロストル、PGF_２α、PGD₂及びAH6
    809からなる群から選択される請求項15に記載の方法。
17. 【請求項１７】ヒトプロスタグランジン受容体EP₃タン
    パク質をコードするDNA分子でトランスフェクトされる
    かトランスフォームされた組換え宿主細胞から得られた
    請求項１に記載のヒトプロスタグランジン受容体EP₃タ
    ンパク質。
18. 【請求項１８】請求項17に記載のヒトプロスタグランジ
    ン受容体EP₃タンパク質を含む膜調製物であって、ヒト
    プロスタグランジン受容体EP₃タンパク質をコードするD
    NA分子でトランスフォームされるかトランスフェクトさ
    れた組換え宿主細胞から得られた前記膜調製物。
19. 【請求項１９】ヒトプロスタグランジン受容体EP₃タン
    パク質をコードするDNA分子でトランスフェクトされる
    かトランスフォームされた組換え宿主細胞から得られる
    請求項１に記載のヒトプロスタグランジン受容体EP₃タ
    ンパク質。
20. 【請求項２０】請求項19に記載のヒトプロスタグランジ
    ン受容体EP₃タンパク質を含む膜調製物であって、ヒト
    プロスタグランジン受容体EP₃タンパク質をコードするD
    NA分子でトランスフォームされるかトランスフェクトさ
    れた組換え宿主細胞から得られる前記膜調製物。
21. 【請求項２１】他のヒトタンパク質を含まず、配列番号
    10、配列番号11及び配列番号12からなる群から選択され
    るアミノ酸配列からなるヒトプロスタグランジン受容体
    EP₃タンパク質。
22. 【請求項２２】ヒトプロスタグランジン受容体EP₃タン
    パク質をコードするDNA分子でトランスフェクトされる
    かトランスフォームされた組換え宿主細胞から得られた
    請求項21に記載のヒトプロスタグランジン受容体EP₃タ
    ンパク質。
23. 【請求項２３】請求項22に記載のヒトプロスタグランジ
    ン受容体EP₃タンパク質を含む膜調製物であって、ヒト
    プロスタグランジン受容体EP₃タンパク質をコードするD
    NA分子でトランスフォームされるかトランスフェクトさ
    れた組換え宿主細胞から得られた前記膜調製物。