JP3343258B2 - プロスタグランジン受容体ep▲3▼及び該受容体をコードするdna - Google Patents
プロスタグランジン受容体ep▲3▼及び該受容体をコードするdnaInfo
- Publication number
- JP3343258B2 JP3343258B2 JP50227095A JP50227095A JP3343258B2 JP 3343258 B2 JP3343258 B2 JP 3343258B2 JP 50227095 A JP50227095 A JP 50227095A JP 50227095 A JP50227095 A JP 50227095A JP 3343258 B2 JP3343258 B2 JP 3343258B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- receptor
- prostaglandin
- protein
- host cell
- cells
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
- C07K14/72—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for hormones
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
- C07K14/72—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for hormones
- C07K14/723—G protein coupled receptor, e.g. TSHR-thyrotropin-receptor, LH/hCG receptor, FSH receptor
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
タグランジンE受容体との相互作用を介して発揮され
る。EP受容体には3つのサブタイプ、EP1、EP2及びEP3
がある(Colemanら,1989の総説参照)。これら3つのサ
ブタイプはいずれもPGE2に対して大きな親和性を示す
が、種々のアゴニスト及びアンタゴニストに対する各サ
ブタイプの親和性には差異が見られ、その作用はそれぞ
れ異なる二次形質導入メカニズムを介して発揮される。
例えば、EP1受容体の活性化はIP3及び細胞内カルシウム
の増加に関連しており、EP2受容体の活性化は細胞内環
状AMPを増加させ、EP3受容体の活性化は細胞内環状AMP
を減少させ、次いで細胞内カルシウムを増加させる。こ
れまでにクローニングされたこの種のものは、マウスEP
2(Hondaら、1993、J.Biol.Chem.268(11):7759−776
2)並びにマウスEP3α及びEP3β(Sugimotoら、199
2、J.Biol.Chem.267(10):6463−6466;Sugimotoら、19
93、J.Biol.Chem.268(4):2712−2718)サブタイプだ
けである。EP3受容体は通常、ヒト及び他の動物の小
腸、腎臓、胃、筋肉、目、子宮及び気管を含む広範な細
胞上に存在する。プロスタグランジンE2がEP3受容体タ
ンパク質と結合すると、細胞内カルシウムの濃度が増加
する。組織はこのシグナルに基づいて、例えば筋肉収縮
により応答する。 発明の概要 サブクラスEP3のEP3−α、EP3-21及びEP3-9と称する
新規のプロスタグランジン受容体タンパク質がヒト細胞
から同定された。完全長EP3タンパク質をコードするDNA
分子を単離し、精製し、ヌクレオチド配列を決定した。
EP3をコードするDNAを発現ベクター内にクローニング
し、これらの発現ベクターを組換え宿主細胞内に導入す
ると、組換え宿主細胞が機能的EP3受容体タンパク質を
発現した。これらの新規のEP3タンパク質、EP3をコード
するDNA、発現ベクター、及び組換えEP3受容体を発現す
る組換え宿主細胞は、EP3受容体活性の調節因子の選定
に有用である。 組換えEP3発現宿主細胞を使用するEP3受容体調節因子
の同定方法も開示する。EP3活性調節因子は、プロスタ
グランジン関連の疾患の治療及びEP3受容体に対するプ
ロスタグランジンの作用の調節に有用である。 図面の簡単な説明 第1図AはEP3−α受容体タンパク質をコードするDN
Aの完全配列を示し、第1図BはEP3-21受容体タンパク
質をコードするDNAの完全配列を示し、第1図CはEP3-9
受容体タンパク質をコードするDNAの完全配列を示して
いる。 第2図は、EP3−α受容体タンパク質の推定アミノ酸
完全配列、EP3-21受容体タンパク質の推定アミノ酸完全
配列、及びEP3-9受容体タンパク質の推定アミノ酸完全
配列を示している。 第3図Aは、0.03nM〜10μM PGE2(△)、PGE
1(■)、PGF2α(□)及びPGD2(●)の存在下のpcDN
A Iamp−hEP3αトランスフェクションCOS−M6膜への[
3H]PGE2特異的結合の競合を示し、第3図Bは、0.3nM
〜100μMミソプロストル(□)、AH6809(△)及びブ
タプロスト(■)の存在下の前記競合を示している。 第4図Aは、0.03nM〜10μM PGE2(△)、PGE
1(■)、PGF2α(□)及びPGD2(●)の存在下のpcDN
A Iamp−hEP3-21トランスフェクションCOS−M6膜への[
3H]PGE2特異的結合の競合を示し、第4図Bは、0.3nM
〜100μMミソプロストル(□)、AH6809(△)及びブ
タプロスト(■)の存在下の前記競合を示している。 第5図Aは、0.03nM〜10μM PGE2(△)、PGE
1(■)、PGF2α(□)及びPGD2(●)の存在下のpcDN
A−hEP3-9トランスフェクションCOS−M6膜への[3H]PG
E2特異的結合の競合を示し、第5図Bは、0.3nM〜100μ
Mミソプロストル(□)、AH6809(△)及びブタプロス
ト(■)の存在下の前記競合を示している。 発明の詳細な説明 本発明は、EP3−α、EP3-21及びEP3-9と称する、サ
ブタイプEP3の新規の三つのプロスタグランジン受容体
イソタイプをコードするcDNAに関する。本発明は、組換
え発現プラスミド内に含まれているクローン化EP3コー
ディングDNAを発現する組換え宿主細胞にも関する。本
発明は、EP3受容体活性を調節する物質のスクリーニン
グ方法にも関する。本発明のDNAは、EP3産生細胞から単
離される。本明細書で使用するEP3という用語は、プロ
スタグランジン分子に特異的に結合できるGタンパク質
結合受容体を意味する。本発明は、EP3産生細胞から単
離され、やはりEP3と称する特定のプロスタグランジン
受容体タンパク質にも関する。本明細書で使用するEP3
受容体タンパク質という用語は、前記三つのイソタイプ
に存在しプロスタグランジン分子に特異的に結合できる
Gタンパク質結合型受容体を意味する。 EP3を産生することができる哺乳動物細胞の非限定的
具体例としては、小腸、腎臓、胃、筋肉、目、子宮及び
気管に由来する細胞が挙げられる。本発明のために好ま
しい細胞としてはヒト正常腎臓細胞又は子宮細胞が挙げ
られる。 他の細胞及び細胞系もEP3cDNAの単離に使用するのに
適当であり得る。適当な細胞の選択は、細胞表面のEP3
のスクリーニングによって実施し得る。EP3活性検出方
法は当業者によく知られており、受容体に特異的な放射
性標識リガンドの結合を測定する。このアッセイでEP3
活性を示す細胞は、EP3cDNAの単離に適当であり得る。 EP3cDNAのクローニングには、種々の方法のうち任意
のものを使用し得る。これらの方法の非限定的具体例と
しては、適当な発現ベクター系内でEP3含有cDNAライブ
ラリーを構築した後、EP3cDNAを直接機能発現させる方
法が挙げられる。別の方法として、バクテリオファージ
又はプラスミドシャトルベクター内で構築したEP3含有c
DNAライブラリーを、EP3タンパク質のアミノ酸配列から
設計した標識オリゴヌクレオチドプローブでスクリーニ
ングする方法もある。好ましい方法は、バクテリオファ
ージ又はプラスミドシャトルベクター内で構築したEP3
含有cDNAライブラリーを、EP3タンパク質をコードする
部分的cDNAでスクリーニングすることからなる。前記部
分的cDNAは、プロスタグランジンEP3受容体と相関して
いる別のGタンパク質結合受容体について知られている
アミノ酸配列から縮重オリゴヌクレオチドプライマーを
設計して、EP3DNA断片の特異的PCR増幅を行うことによ
り得る。 当業者には容易に理解されるように、別の種類のライ
ブラリー、並びに別の細胞もしくは細胞種類から構築し
たライブラリーも、EP3をコードするDNAの単離に有用で
あり得る。別の種類のライブラリーの非限定的具体例と
しては、ヒト腎臓細胞以外の細胞又は細胞系に由来する
cDNAライブラリー、及びゲノムDNAライブラリーが挙げ
られる。 当業者には明らかなように、適当なcDNAライブラリー
は、EP3活性を有する細胞又は細胞系から製造し得る。E
P3cDNAを単離するためのcDNAライブラリーの製造で使用
する細胞又は細胞系の選択は、本発明で使用する前述の
公知の標識リガンド結合アッセイを用いて、事前に細胞
結合EP3活性を測定することにより実施し得る。 cDNAライブラリーの製造は、当業者によく知られてい
る標準的方法で実施できる。よく知られているcDNAライ
ブラリー構築方法は、例えばManiatis,T.,Fritsch,E.
F.,Sambroock,J.,Molecular Cloning:A Laboratory
Manual(Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spr
ing Harbor,New York,1982)に記載されている。 これも当業者には明らかであろうが、EP3をコードす
るDNAは適当なゲノムDNAライブラリーからも単離し得
る。 ゲノムDNAライブラリーの構築は、当業者によく知ら
れている標準的方法で実施できる。よく知られているゲ
ノムDNAライブラリー構築方法は、例えばManiatisら,
前出文献に記載されている。 好ましい方法のいずれかによってEP3遺伝子をクロー
ニングするためには、EP3又は相同タンパク質のアミノ
酸配列又はDNA配列が必要である。そのためには、EP3タ
ンパク質又は相同タンパク質を精製し、自動配列決定器
で部分的アミノ酸配列を決定し得る。完全なアミノ酸配
列を決定する必要はないが、部分的EP3DNA断片のPCR増
幅のためには、アミノ酸6〜8個分の二つの領域の直鎖
配列を決定するとよい。 適当なアミノ酸配列が同定されたら、これらをコード
することができるDNA配列を合成する。遺伝子コードは
縮重であるため、特定のアミノ酸をコードする2個以上
のコドンを使用し得ることがあり、従ってアミノ酸配列
は、一組の類似のDNAオリゴヌクレオチドのいずれかの
ものでコードできる。前記一組のDNAオリゴヌクレオチ
ドのうち一つだけがEP3配列と同じであるが、その組の
残りも不適正状態を伴うものの、かかるDNAオリゴヌク
レオチドもEP3DNAにハイブリダイズすることができる。
不適正DNAオリゴヌクレオチドでも、EP3をコードするDN
Aの同定及び単離を可能にするのに十分な程度にEP3DNA
にハイブリダイズし得る。 好ましい方法のいずれかを用いて、ポリメラーゼ連鎖
反応(PCR)ベースの技術及びcDNAライブラリースクリ
ーニングを使用する2段階方法で、EP3をコードするcDN
Aクローンを単離する。第1段階では、精製EP3又は相同
タンパク質からのNH2末端及び内部アミノ酸配列情報を
用いて、EP3特異的DNA断片の増幅のための縮重オリゴヌ
クレオチドプライマーを設計する。第2段階では、前記
断片をクローニングして、ヒト腎臓細胞由来のcDNAライ
ブラリーから完全長cDNAを単離するためのプローブとし
て使用する。 EP3をコードする三つのほぼ完全長のcDNAの配列を表
1に示し、これらをクローンEP3−α、EP3-21及びEP
3-9と名付けた。三つのクローン化cDNAに基づくEP3の推
定アミノ酸配列を表2に示す。決定されたcDNA配列を調
べると、それぞれアミノ酸390個、388個及び365個のタ
ンパク質をコードする単一の大きな読取り枠(複数)の
存在が明らかになる。 前述の方法で得たクローン化EP3cDNAは、組換えEP3を
産生するために、適当なプロモーターと他の適当な転写
調節エレメントとを含む発現ベクター内への分子クロー
ニングにより組換え的に発現し、原核又は真核宿主細胞
内にトランスファーし得る。この種の操作の方法は、前
出のManiatisらの文献に記載されており、当業者によく
知られている。 本明細書では、発現ベクターは、クローン化DNAの転
写と、適当な宿主内で対応するmRNAの翻訳とに必要なDN
A配列であると定義される。この種のベクターは、種々
の宿主、例えば細菌、藍藻、植物細胞、昆虫細胞及び動
物細胞内で真核生物DNAを発現させるのに使用し得る。 特別に設計したベクターは、細菌−酵母間又は細菌−
動物細胞間のような宿主間のDNAシャトリングを可能に
する。適当に構築した発現ベクターは、宿主細胞内での
自律複製のための複製起点と、選択可能マーカーと、限
定数の有用な制限酵素部位と、高コピー数の可能性と、
活性プロモーターとを含んでいなければならない。プロ
モーターは、RNAポリメラーゼをDNAに結合させてRNA合
成を開始させるDNA配列であると定義される。強力なプ
ロモーターは、mRNAを高頻度で開始させるプロモーター
である。発現ベクターの非限定的具体例としては、クロ
ーニングベクター、修飾クローニングベクター、特別に
設計したプラスミド又はウイルスが挙げられる。 哺乳動物細胞内で組換えEP3を発現するためには種々
の哺乳動物発現ベクターを使用し得る。組換えEP3の発
現に適当であり得る市販の哺乳動物発現ベクターの非限
定的具体例としては、pMC1neo(Stratagene)、pXT1(S
tratagene)、pSG5(Stratagene)、pcDNA I、pcDNA Ia
mp(Invitrogen)、EBO−pSV2−neo(ATCC 37593)、p
BPV−1(8−2)(ATCC 37110)、pdBPV−MMTneo(3
42−12)(ATCC 37224)、pRSVgpt(ATCC 37199)、p
RSVneo(ATCC 37198)、pSV2−dhfr(ATCC 37146)、
pUCTag(ATCC 37460)及びIZD35(ATCC 37565)が挙
げられる。 EP3をコードするDNAは、宿主細胞内での発現のために
発現ベクター内にクローニングしてもよい。宿主細胞は
原核細胞又は真核細胞であり得、非限定的具体例として
は細菌、酵母、哺乳動物細胞、例えばヒト、ウシ、ブ
タ、サル及び齧歯類の細胞系、並びに昆虫細胞、例えば
ショウジョウバエ由来細胞系が挙げられる。適当であり
得る市販の哺乳動物由来細胞系の非限定的具体例として
は、CV−1(ATCC CCL 70)、COS−1(ATCC CRL 1
650)、COS−7(ATCC CRL 1651)、CHO−K1(ATCC
CCL 61)、3T3(ATCC CCL 92)、NIH/3T3(ATCC CR
L 1658)、HeLa(ATCC CCL 2)、C127I(ATCC CRL
1616)、BS−C−1(ATCC CCL 26)及びMRC−5
(ATCC CCL 171)が挙げられる。 発現ベクターは、非限定的具体例として例えば形質転
換、トランスフェクション、プロトプラスト融合法及び
電気穿孔法のような種々の方法のいずれかを用いて、宿
主細胞内に導入し得る。発現ベクター含有細胞を個々に
分析して、その細胞がEP3タンパク質を産生するか否か
を決定する。EP3発現細胞の同定は、幾つかの方法、例
えば非限定的具体例として抗EP3抗体に対する免疫学的
反応性、及び宿主細胞結合EP3活性の存在等により実施
し得る。 EP3DNAの発現は、in vitroで製造した合成mRNAを用
いて実施してもよい。合成mRNAは、種々の無細胞系、非
限定的具体例として例えばコムギ胚芽抽出物及び網状赤
血球抽出物中で効率的に翻訳できると共に、細胞ベース
の系、非限定的具体例として例えばカエル卵母細胞内へ
のマイクロインジェクションでも効率的に翻訳できる。
好ましいのはカエル卵母細胞へのマイクロインジェクシ
ョンである。 受容体活性及び/又はEP3タンパク質を最適レベルに
するEP3cDNA配列を決定するために、例えば下記のよう
なEP3cDNA分子を構築し得る:EP3cDNAの完全長読取り
枠、並びに受容体タンパク質の特定ドメインのみもしく
は該タンパク質の再構成ドメイン(rearranged domai
n)をコードするcDNAの一部を含む種々の構築物。総て
の構築物は、EP3cDNAの5'及び/又は3'非翻訳領域を全
く含まないか、総て含むか、又は一部含むように設計し
得る。EP3活性及びタンパク質発現レベルは、これらの
構築物を単独で又は組合わせて適当な宿主細胞内に導入
した後で決定し得る。過渡アッセイ(transient assa
y)での最適発現を生起させるEP3cDNAカセットの決定に
次いで、このEP3cDNA構築物を種々の発現ベクター(組
換えウイルスを含む)、例えば哺乳動物細胞、植物細
胞、昆虫細胞、卵母細胞、大腸菌及び酵母細胞用の発現
ベクターにトランスファーする。 哺乳動物細胞トランスフェクタントを、EP3受容体活
性レベル及びEP3タンパク質濃度の両方について、下記
の方法でアッセイする。EP3受容体活性の測定では、標
識リガンドを細胞に直接導入し、EP3発現細胞へのリガ
ンドの特異的結合の量を決定する。受容体活性に関する
結合アッセイは当業者に公知である(Freyら,1993,Eur.
J.Pharmacol.,244,pp239−250)。 宿主細胞内のEP3タンパク質濃度は、種々の方法、例
えば非限定的具体例としてイムノアフィニティ及び/又
はリガンドアフィニティ法で定量する。EP3特異的アフ
ィニティビーズ又はEP3特異的抗体を用いて、35S−メチ
オニン標識又は非標識EP3タンパク質を単離する。標識E
P3タンパク質はSDS−PAGEで分析する。非標識EP3タンパ
ク質は、EP3特異的抗体を用いて、ウエスタンブロッテ
ィング、ELISA又はRIAアッセイで検出する。 宿主細胞内でのEP3の発現後、EP3特異的リガンドに結
合することができる活性形態のEP3を得るべく、EP3タン
パク質を回収し得る。使用し得るEP3精製操作は幾つか
存在する。組換えEP3は、標準的分離方法、例えば非限
定的具体例として洗剤可溶化、塩分別、イオン交換クロ
マトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、ヒド
ロキシルアパタイト吸収クロマトグラフィー及び疎水性
相互作用クロマトグラフィーを単独で又は様々に組合わ
せて使用することにより、細胞膜から精製し得る。 また、組換えEP3は、完全長発生期EP3又はEP3のポリ
ペプチド断片に特異的なモノクローナル又はポリクロー
ナル抗体を用いて形成したイムノアフィニティカラムの
使用により、別の細胞タンパク質と分離できる。 EP3に対する単一特異性抗体は、EP3と反応する抗体を
含む哺乳動物抗血清から精製するか、又はKohler及びMi
lstein,Nature 256:495−497(1975)に記載の方法を
用いて、EP3と反応するモノクローナル抗体として製造
する。本明細書中の単一特異性抗体は、EP3に対して均
一結合特性を示す単一抗体種又は多重抗体種であると定
義される。本明細書で使用する均一結合という用語は、
抗体種が特定の抗原又はエピトープ、例えば前述のよう
にEP3と結合した抗原又はエピトープに結合する能力を
意味する。EP3特異的抗体は、マウス、ラット、テンジ
クネズミ、ウサギ、ヤギ、ウマ等のような動物を、免疫
アジュバントを用いて又は用いずに、適当な濃度のEP3
又はEP3配列由来ペプチドで免疫感作することにより形
成する。 最初の免疫感作の前に免疫前血清を採取する。各動物
に、約0.1μg〜約1000μgのEP3又はEP3関連ペプチド
を、許容し得る免疫アジュバントと組合わせて投与す
る。許容し得るアジュバントの非限定的具体例として
は、フロイント完全アジュバント、フロイント不完全ア
ジュバント、ミョウバン沈降物、Corynebacterium par
vum含有油中水滴エマルション及びtRNAが挙げられる。
最初の免疫感作は、好ましくはフロイント完全アジュバ
ント中の酵素を皮下(SC)、腹腔内(IP)又はこれら両
方の経路で複数の部位に投与することによって実施し
た。各動物の採血を一定の時間間隔、好ましくは1週間
おきに行い、抗体力価を測定する。動物には、最初の免
疫感作後にブースター注射をしてもよく、又はしなくて
もよい。ブースター注射をする動物には通常、フロイン
ト不完全アジュバント中の同量のEP3又はEP3関連ペプチ
ドを同一経路で投与する。ブースター注射は、最大力価
が得られるまで約3週間の間隔で行う。各ブースター免
疫感作から約7日後、又は単一免疫感作から約1週間後
に動物の採血を行い、血清を回収し、アリコートを約−
20℃で貯蔵する。 近交系マウス、好ましくはBalb/cを、EP3か又はEP3タ
ンパク質の配列に由来するペプチドで免疫感作すること
により、EP3又はEP3配列由来ペプチドに反応するモノク
ローナル抗体(mAb)を製造する。マウスは、IP又はSC
経路により、同量の前述のような許容し得るアジュバン
トに混入した約0.5mlの緩衝液又は食塩水中の約1μg
〜約100μg、好ましくは約10μgのEP3で免疫感作す
る。好ましいアジュバントはフロイント完全アジュバン
トである。マウスは0日目に最初の免疫感作を行い、約
3〜約30週間休息させる。免疫マウスに、リン酸塩緩衝
食塩水のような緩衝溶液中約1〜約100μgのEP3のブー
スター追加免疫を静脈内(IV)経路で一回以上行う。抗
体陽性マウスのリンパ球、好ましくは脾臓リンパ球を、
当業者に公知の標準的方法で免疫マウスから脾臓を除去
することによって得る。脾臓リンパ球を、安定なハイブ
リドーマを形成させる条件下で、適当な融合相手、好ま
しくは骨髄腫細胞と混合して、ハイブリドーマ細胞を形
成する。融合相手の非限定的具体例としては、マウス骨
髄腫P3/NS1/Ag4−1;MPC−11;S−194及びSp 2/0が挙げ
られる。好ましいのはSp 2/0である。抗体産生細胞及
び骨髄腫細胞を分子量約1000のポリエチレングリコール
中約30%〜約50%の濃度で融合させる。融合したハイブ
リドーマ細胞を、当業者に公知の方法で、ヒポキサンチ
ン、チミジン及びアミノプテリン添加ダルベッコ改質イ
ーグル培地(DMEM)中で増殖させることにより選択す
る。約14日目、18日目及び21日目に増殖陽性ウェルから
上清を回収し、EP3又はEP3配列由来ペプチドを抗原とし
て用いて、固相イムノラジオアッセイ(SPIRA)のよう
なイムノアッセイで抗体産生に関してスクリーニングす
る。培養液をOuchterlony沈降アッセイでも検査して、m
Abのイソタイプを調べる。抗体陽性ウェル由来のハイブ
リドーマ細胞を、Soft Agar Techniques,Tissue Cul
ture Methods and Applications,Kruse及びPaterson
編,Academic Press,1973に記載のMacPhersonの軟寒天
法のような方法によってクローニングする。 マウス当たり約0.5mlのプリスチンで感作したBalb/c
マウスに、約2×106〜約6×106のハイブリドーマ細胞
を感作処理の約4日後に注入することにより、モノクロ
ーナル抗体をin vivoで産生する。細胞トランスファー
の約8〜12日後に腹水を採取し、モノクローナル抗体を
当業者に公知の方法で精製する。 十分な量の特異的mAbを得るために、ハイブリドーマ
を約2%のウシ胎児血清を含むDMEM培地で増殖させるこ
とにより、抗EP3mAbをin vitroで製造する。mAbは当業
者に公知の方法で精製する。 腹水又はハイブリドーマ培養液の抗体力価を、種々の
血清学的又は免疫学的アッセイ、例えば非限定的具体例
として、沈降、受動凝集、酵素結合イムノソルベント抗
体(ELISA)法及びラジオイムノアッセイ(RIA)法で測
定する。類似のアッセイを使用して、体液又は組織及び
細胞抽出物中のEP3の存在を検出する。 当業者には明らかなように、単一特異性抗体を産生す
るための前述の方法は、EP3ポリペプチド断片又は完全
長EP3ポリペプチドに特異的な抗体の産生に使用し得
る。 抗体がアガロースゲルビーズ支持体との間で共有結合
を形成するようにN−ヒドロキシスクシンイミドエステ
ルで予備活性化したゲル支持体であるAffigel−10(Bio
rad)に抗体を加えることによりEP3抗体アフィニティカ
ラムを形成する。抗体はスペーサーアームのアミド結合
を介してゲルに結合する。次いで、残りの活性化エステ
ルを1MエタノールアミンHCl(pH8)で失活させる。カラ
ムを水及び0.23MグリシンHCl(pH2.6)で順次洗浄し
て、非結合抗体又は外来タンパク質を除去する。次いで
カラムを、リン酸塩緩衝食塩水(pH7.3)と洗剤のよう
な適当な膜可溶化剤との中で平衡化し、EP3又はEP3断片
を含む細胞膜抽出物をゆっくりとカラムに通す。次いで
カラムを、光学密度(A280)がバックグラウンドに低下
するまで、リン酸塩緩衝食塩水及び洗剤で洗浄し、その
後タンパク質を0.23Mグリシン−HCl(pH2.6)及び洗剤
で溶離する。次いで精製EP3タンパク質をリン酸塩緩衝
食塩水及び洗剤に対して透析する。 本発明のプロスタグランジン受容体をコードするDNA
の単離に適した方法の一つは、別のGタンパク質結合受
容体から得たアミノ酸及び/又はDNA配列情報を使用す
ることからなる。別のプロスタグランジン受容体はGタ
ンパク質結合であることがわかっているため、トランス
メンブラン及び/又は細胞質ドメインといったような特
定の領域又はドメインは、新規の受容体を単離するため
のプローブを形成するのに十分な程度の相同を有すると
予想される。 プロスタグランジン及びロイコトリエンは、Gタンパ
ク質結合受容体を介して自己のシグナルを形質導入する
ことが知られている。種々の組織中に存在する異なるPG
H2/トロンボキサンA2、PGI2、PGE2、PGD2、PGF2α、LT
B4及びLTD4受容体は文献に記述されている。これらの受
容体のうちの一部は可溶化され、部分的に精製され(Du
tta−Roy,A.K.ら,(1987)JBC,262,pp.12685;Tsai,A.
L.ら,(1989),JBC,264,pp61;168−Watawabe,T.ら,
(1990),JBC,265,pp.21237)、ヒト血小板TXA2受容体
は明らかな均質性を示すまで精製された(Ushikubi,F.
ら,(1989),JBC,264,pp.16496)。精製トロンボキサ
ン受容体は、SDS−ポリアクリルアミドゲル上で約57kDa
を中心とする極めて広いバンドを示した。部分的配列情
報を得るのに十分なタンパク質が得られた。 オリゴヌクレオチドプローブを用いて、ヒト巨核球細
胞系(MEG−01)cDNAライブラリーがスクリーニングさ
れた(Hirata,M.ら,(1991),Nature,349,pp.617)。
部分長cDNAクローンが得られた。配列決定の結果、該cD
NAクローンは、推定上のGタンパク質結合受容体のC末
端側の半分をコードすることが判明した。このクローン
を標識し、ヒト胎盤ライブラリーのスクリーニングに使
用した。一つの完全長(約2.9kb)クローンは、5'及び
3'側にそれぞれ広い非コーディング領域と、Mr約37000
の343アミノ酸タンパク質をコードする1029塩基対の読
取り枠とを含んでいた。予測された配列は、推定上の細
胞外アミノ末端テール(29残基)内の二つのN結合グリ
コシル化部位(Asn−4及びAsn−16)と、細胞外ループ
1及び2内の保存Cys残基(Cys−105及びCys−183)
と、小さいアミン含有リガンドを有する受容体にとって
必須であることが知られているトランスメンブラン3内
に存在するAsp残基(Strosberg,A.D.(1991),EJB,196,
pp.1)を除く、トランスメンブラン領域内の他の幾つか
の保存残基とを含む7個のトランスメンブランG結合受
容体の特性を示す。この配列は極めて短い予測された第
三の細胞内ループ(27残基)を有する。分子のこの部分
はおそらく、ホスホリパーゼCとの相互作用に関与し、
その結果カルシウムイオン流束を変化させるGタンパク
質(Gq又はより大きいGタンパク質)に結合し得る(Sh
enker,A.ら,(1991),JBC,266,pp.9309.173−Moran,N.
ら,(1990),Circulation,Suppl.82,抄録1830)。 トロンボキサン受容体はアフリカツメガエル卵母細胞
内で発現された。該受容体は、内在性シグナルトランス
ダクション成分と結合して、カルシウム活性化Cl-流を
発生させることができる。該Cl-流は、Hirata,M.らによ
りNature,349,pp.617(1991)に記載の方法を用いて、
電気生理学的測定により記録される。リガンドS−145
を用いてトロンボキサン受容体cDNAでトランスフェクシ
ョンしたCOS−1細胞膜について結合検査が実施された
(Hirata,M.ら,前出)。我々は、トロンボキサン受容
体cDNAでトランスフェクションしたヒト初期腎臓293細
胞及び膜におけるトロンボキサンアンタゴニストSQ−29
548のアフィニティ結合が大きく、最大結合が2〜3pmol
/mgタンパク質であることも明らかにした。この発現レ
ベルは、血小板膜におけるレベルの少なくとも5〜10倍
に相当する。トランスフェクション効率を10%とみなし
て細胞当たりのベースで推算すると、約106結合部位/
トランスフェクション細胞となった。これに対し、血小
板上に存在する部位は約1300である(Hourani,S.M.O.
ら,(1991),Pharmacol.Rev.,43,pp.243)。 ノーザンブロット分析で、MEG−01細胞系、胎盤及び
肺内の2.8kbバンドの存在が明らかにされた。報告され
ている長い暴露時間(12日)及び検出可能シグナルを見
るために導入されたポリ(A)+RNAの量(20μg)に基
づいて推定すると、mRNAはおそらくあまり多くない部類
に入る。 相同スクリーニングによる別のエイコサノイド受容体
遺伝子の単離へのアプローチが、これらの受容体が一次
構造で相関しているという想定のもとに行われた(Sugi
moto,Y.ら,(1992),JBC,267,pp.6463)。これらの受
容体はGタンパク質結合受容体スーパーファミリーであ
るため、トランスメンブラン領域及び細胞質ドメインに
存在すると考えられる相同領域が存在する。従って、プ
ロスタグランジン受容体と相関している種々の既知のG
タンパク質結合受容体は、相同を有すると思われる所期
の受容体タンパク質コーディングDNAの領域、例えばト
ランスメンブラン領域に対するDNAプローブを得るため
に使用し得る。 両方でマウスEP3α読取り枠の全長をコードする0.4kb
及び0.7kbマウスEP3αcDNAを用いて、390アミノ酸受容
体をコードする、以後EP3αと称する1.9kb cDNAクロ
ーン(EP3)を、ヒト腎臓cDNAライブラリーから単離し
た。マウスEP3のトランスメンブランドメインVII内の9
個のアミノ酸及びヒトTP受容体に基づく16倍縮重の27量
体オリゴヌクレオチドを用いて、ヒト子宮cDNAライブラ
リーをスクリーニングした。それぞれ365及び388アミノ
酸受容体タンパク質をコードする、以後EP3-9(1.4kb)
及びEP3-21(1.7kb)と称する別の二つのcDNAをクロー
ニングした。他の多くのGタンパク質結合受容体と同様
に、EP3受容体は幾つかの共通の特徴を有する。第一
に、推定上の細胞外領域に4個の潜在的N結合グリコシ
ル化部位(Asn−18、Asn−36、Asn−217及びAsn−308)
が存在する。第二に、エキソフェイシャル(exofacia
l)ループ1及び2内に保存システイン残基が存在す
る。EP3受容体は、カチオンアミノ含有リガンドに結合
する受容体の特徴であるトランスメンブラン3内のアス
パラギン酸残基を含んでいないが、トランスメンブラン
7内の総てのエイコサノイド受容体内に存在する保存ア
ルギニンを有する。この領域は、エイコサノイド受容体
の間で最も高度に保存されている。EP3受容体はヒトト
ロンボキサン受容体に最も近い。 本発明の新規のプロスタグランジン受容体は、受容体
活性を調節する化合物を選定するためのアッセイ操作で
使用するのに適している。本明細書中の受容体活性の調
節には受容体の阻害又は活性化が含まれ、また、受容体
活性の正常な調整に対する直接的又は間接的作用も含ま
れる。受容体活性を調節する化合物としては、アゴニス
ト、アンタゴニスト、及び受容体活性の調整に直接又は
間接に作用する化合物が挙げられる。 本発明のプロスタグランジン受容体は、受容体調節因
子を選定するためのアッセイ操作で使用すべく、野生供
給源及び組換え供給源の両方から得られる。プロスタグ
ランジン受容体調節因子を選定するためのアッセイ操作
は通常、本発明のプロスタグランジン受容体と、推定上
のプロスタグランジン受容体調節因子を含む検査化合物
又は試料とを含む。検査化合物又は試料は、例えば、野
生もしくは組換え型の精製受容体タンパク質、野生もし
くは組換え型の受容体産生細胞の継代細胞フラクショ
ン、及び/又は野生もしくは組換え型の受容体発現完全
細胞上で直接検査し得る。検査化合物又は試料は、既知
の標識又は非標識受容体リガンドの存在下又は不在下で
受容体に加え得る。検査化合物又は試料の調節活性は、
例えば、検査化合物又は試料が受容体に結合する能力、
受容体を活性化する能力、受容体活性を阻害する能力、
受容体への別の化合物の結合を阻害する又は促進する能
力を分析し、受容体の調整を修飾し、又は細胞内活性を
修飾することによって測定し得る。 EP3受容体活性の調節因子の選定は、EP3受容体活性が
関与する疾患状態の治療に有用である。別の化合物が、
受容体の活性を刺激又は阻害するために有用であり得
る。EP3受容体の選択性アゴニストは、眼圧を低下させ
ることができるため緑内障の治療に有用であり得、非ス
テロイド性抗炎症剤の投与に伴う副作用を治療するため
の物質としても有用であり得る。EP3受容体に拮抗する
化合物は、EP3受容体の活性化が、細胞増殖、細胞悪性
形質転換の誘起又は転移性腫瘍成長を引き起こす疾病の
治療、又はEP3受容体の活性化が、腎臓血管収縮時に観
察されるような平滑筋収縮を引き起こす病理状態の治療
に有用であり得る。EP3をコードするDNA分子の単離及び
精製は、疾患状態におけるEP3受容体発現の変化を調べ
るためのEP3受容体の組織分布の確立、並びにEP3受容体
活性を調節する化合物の選定方法の確立に有用と思われ
る。 以下の実施例は本発明を明らかにするためのものであ
り、本発明の範囲を限定するためのものではない。 実施例1 EP3α、EP3-9及びEP3-21受容体cDNAのクローニング Perkin Elmer社(Branchburg,N.J.)のRT−PCRキッ
トを用いてマウス腎臓ポリA+RNAを逆転写し、次いで二
組の異なるPCRプライマーでPCRを実施した。第一組のプ
ライマーは、5'センス25量体オリゴヌクレオチド[5'−
CCACCATGGCTAGCATGTGGGCGCC−3'](配列番号:1)及び
3'アンチセンス25量体オリゴヌクレオチド[5'−CTCCAC
GGCCATGGCGCTGGCCACC−3'](配列番号:2)を含んでい
た。この一組は、マウスEP3α受容体の398塩基対5'cDN
A断片を形成した。第二組のプライマーは、5'センス8
倍縮重27量体オリゴヌクレオチド[CTGCC(G,C)(G,
C)TGCTGGGCGTGGG(C,T)CGCTAC−3'](配列番号:3)
及び3'アンチセンス16倍縮重27量体オリゴヌクレオチド
[5'−ATA(A,C)ACCCAGGG(A,G)TCCA(A,G)GATCTG
(G,A)TT−3'](配列番号:4)を含んでおり、マウス
3α受容体の468塩基対3'cDNA断片を形成した。これら
のcDNA断片を32P標識し、標準的方法(Sambrookら,198
9,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第2版,
Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Har
bor,N.Y.)に従ってヒト腎臓cDNA λgtl1ライブラリー
(Clontech,Palo Alto,CA)をプローブするのに使用し
た。このスクリーニングから、1.9kb完全長ヒトEP3αc
DNAクローンをプラーク精製し、プレート溶解物法(Sam
brookら,前出)によってDNAを製造した。 トランスメンブランドメインVII内の9個の保存アミ
ノ酸(NQILDPWVY)(配列番号:6)に基づいて、アンチ
センス16倍縮重27量体オリゴヌクレオチド[5'−ATA
(A,C)ACCCAGGG(A,G)TCCA(A,G)GATCTG(C,A)TT−
3'](配列番号:5)を合成した。32P標識オリゴプロー
ブを用いて、標準的方法(Sambrookら,前出)でヒト子
宮λgtl0ライブラリー(Clontech,Palo Alto,CA)をス
クリーニングした。このスクリーニングから1.7kb完全
長ヒトEP3-21cDNAクローン及び1.4kb完全長ヒトEP3-9cD
NAクローンの両方をプラーク精製し、プレート溶解物法
(Sambrookら,前出)によってDNAを製造した。 cDNAのサブクローニング及び配列決定 3個の陽性クローンをEcoR Iで消化した結果、大きさ
が約1.9kb、1.7kb及び1.4kbの挿入物を含んでいること
が判明した。これらの挿入物は、サザンブロット分析
で、マウスEP3受容体cDNAプローブのフラグメントとハ
イブリダイズすることが明らかになった。T7 DNAポリ
メラーゼ配列決定キット(Pharmacia)を用いて配列決
定すべく、3個のEcoR Iフラグメント(EP3α、EP3-21
及びEP3-9と称するEP3クローン)及び種々の制限酵素断
片をpKSベクター(Stratagene,La Jolla,CA)内にサブ
クローニングした。DNAは、KSもしくはSKプライマー、
又は所定の配列から形成したプライマーを用いて、2本
鎖とも完全に配列決定された。3個のEP3クローンのヌ
クレオチド配列を表1のA、B及びCに示す。コードさ
れたタンパク質のアミノ酸配列を表2に示す。各DNAク
ローンは、配列決定の結果、ヒトトロンボキサン受容体
cDNAに対して大きな配列相同を有することが判明し、G
タンパク質結合受容体の特徴と推測されているヘプタヘ
リカル構造が明らかにされた。EP3α、EP3-21及びEP
3-9の読取り枠は、予想された相対分子量43,315、42,68
8及び40,507をそれぞれ有するタンパク質をコードする1
170塩基対、1164塩基対及び1095塩基対であった。開始
コドンとされるATGは、翻訳開始のためのKozak共通配列
(Kozak,1989,J.Cell.Biol.,108,pp229−241)に適合す
る。EP3cDNAクローン、即ちEP3α、EP3-21及びEP
3-9は、それぞれ約502塩基対、298塩基対及び64塩基対
の3'非翻訳配列を含む。 実施例2 発現ベクターの構築 EP3α、EP3-21及びEP3-9をコードするcDNAを、pcDNA
1amp(Invitrogen)のHind III部位にそれぞれサブクロ
ーニングし、方向が正しいことをBamH I消化及び配列決
定によって確認した。 実施例3 大腸菌発現ベクター内へのEP3cDNAのクローニング 非限定的具体例としてpETシリーズ(Novagen)のよう
な大腸菌発現ベクター内にEP3発現カセットをトランス
ファーして、大腸菌内で組換えEP3を産生する。pETベク
ターはEP3を、厳密に調節されたバクテリオファージT7
プロモーターの制御下におく。誘導lacプロモーターに
よって制御されるT7 RNAポリメラーゼ遺伝子の染色体
コピーを含む大腸菌宿主内への該構築物のトランスファ
ーに次いで、適当なlac基質(IPTG)を培養物に加える
と、EP3の発現が誘発される。発現EP3のレベルを前述の
アッセイで測定する。 PE3に関する読取り枠全体をコードするcDNAを、pET
11aのNde I部位に挿入する。正の方向の構築物を配列解
析によって同定し、発現宿主株BL21の形質転換に使用す
る。次いで、形質転換体を用いて、EP3タンパク質を製
造するための培養物に接種する。培養物は、当業者に組
成が知られているM9又はZB培地で増殖させ得る。約OD
600=1.5まで増殖した後、1mM IPTGを用いて37℃で3
時間にわたりEP3の発現を誘発する。これらの細胞に由
来する膜フラクション中に、EP3受容体結合活性が発見
される。 実施例4 アフリカツメガエル卵母細胞マイクロインジェクション
によるEP3mRNAのin vitro翻訳及び哺乳動物細胞内での
発現 EP3cDNA構築物をin vitro転写ベクター(pGEMシリー
ズ、Promega)に連結して、合成mRNAを製造する。 合成mRNAは、EP3mRNAをコードする二本鎖DNAをバクテ
リオファージプロモーター含有プラスミドベクター内に
クローニングし、クローン化EP3コーディングDNAを含む
プラスミドベクターを線状化し、プラスミドベクター上
のバクテリオファージプロモーターを特異的に認識する
バクテリオファージからDNA依存性RNAポリメラーゼを用
いてクローン化DNAをin vitro転写するとにより、十分
な量で製造される。 バクテリオファージDNA依存性RNAポリメラーゼによっ
て認識されるバクテリオファージプロモーターを含むプ
ラスミドベクターは様々なものが存在し、非限定的具体
例としては、プラスミドpSP64、pSP65、pSP70、pSP71、
pSP72、pSP73、pGEM−3Z、pGEM−4Z、pGEM−3Zf、pGEM
−5Zf、pGEM−7Zf、pGEM−9Zf及びpGEM−11Zfが挙げら
れる。これら一連のプラスミドは総てPromegaから市販
されている。 EP3DNAのクローニングに適している、ベクター上の使
用可能な制限エンドヌクレアーゼクローニング部位のう
ちの一つ以上を使用して、EP3をコードする二本鎖DNAを
ベクター含有バクテリオファージプロモーター内に正確
な向きでクローニングする。連結したEP3DNAを有するベ
クターを用いて細菌を形質転換し、正確な向きのEP3DNA
を有するベクターの存在についてクローン単離体を分析
する。 正確な向きのEP3コーディングDNAを含むベクターが同
定され単離されたら、これをEP3転写単位よりも下流の
部位において、該単位を破損しないように制限エンドヌ
クレアーゼで開裂することにより線状化する。線状化プ
ラスミドを単離し、精製し、EP3mRNAのin vitro転写の
鋳型として使用する。 次いで鋳型DNAを、EP3mRNA形成DNA鋳型の転写を可能
にする反応混合物中で、バクテリオファージ特異的DNA
依存性RNAポリメラーゼと混合する。使用可能なバクテ
リオファージ特異的DNA依存性RNAポリメラーゼは幾つか
存在し、非限定的具体例としてT3、T7及びSP6 RNAポリ
メラーゼが挙げられる。次いで、合成EP3mRNAを単離
し、精製する。 mRNAの安定性を改善するために、5'末端キャップ構造
及び3'ポリAテールを含むmRNAを合成すると有利であり
得る。キャップ構造、すなわち7−メチルグアノシン
は、DNA鋳型との反応混合物に7−メチルグアノシンを
加えるだけでmRNAの5'末端に組込み得る。DNA依存性RNA
ポリメラーゼは、mRNAの合成中にキャップ構造を5'末端
に組み込む。ポリAテールは多くのcDNA中に天然に存在
するが、ポリAテールをコードするDNA配列をDNA鋳型の
3'末端に挿入することにより、mRNAの3'末端に簡単に付
加できる。 単離し精製したEP3mRNAは、無細胞系、例えば非限定
的具体例としてウサギ網状赤血球溶解物及びコムギ胚芽
抽出物(どちらもPromega及びNew England Nuclearか
ら市販されている)を用いて、又は細胞ベースの系、例
えば非限定的具体例としてアフリカツメガエル卵母細胞
へのマイクロインジェクションを用いて翻訳する。好ま
しいのはアフリカツメガエル卵母細胞へのマイクロイン
ジェクションである。 アフリカツメガエル卵母細胞に、EP3タンパク質の産
生に十分な量の合成EP3mRNAをマイクロインジェクショ
ンする。マイクロインジェクションにかけた卵母細胞を
インキュベートしてEP3mRNAの翻訳を生起させ、EP3タン
パク質を産生させる。 前記合成mRNAは標準的方法[Gurdon,J.B.及びWicken
s,M.D.,Methods in Enzymol.101:370−386(1983)]
でアフリカツメガエル卵母細胞(段階5〜6)内に注入
する。卵母細胞を採取し、後述のようにEP3発現につい
て分析する。 実施例5 哺乳動物発現ベクター内へのEP3cDNAのクローニング EP3cDNA発現カセットを、適当な制限エンドヌクレア
ーゼ部位で、強力な普遍的哺乳動物プロモーターを含む
下記のベクターに連結する:pBC12BI[Cullen,B.R.,Meth
ods in Enzymol.152:684−704,1988]、並びにpEE12
(CellTech EP 338,841号)及びその誘導体pSZ9016−
1及びp9019。p9019は、hCMVIEプロモーターと、ポリリ
ンカーと、SV40ポリAエレメントとを含み、SV40初期プ
ロモーターによって操作されるジヒドロ葉酸レダクター
ゼの突然変異遺伝子(mDHFR)(Simonsen,C.C.及びLevi
nson,A.D.Proc.Natl.Acad.Sci USA 80:2495−2499[1
983])からなる選択可能マーカー/増幅システムを有
する哺乳動物発現ベクターの構築物を表す。SV40ポリア
デニル化配列を、pD5(Berker及びSharp,Nucl.Acid Re
s.13:841−857[1985])を鋳型として用いて、プライ
マー13978−120及び139778−121により決定されるPCR反
応で形成する。得られた0.25Kb PCR生成物をCla I及び
Spe Iで消化し、同様に消化したpEE12の6.7Kb断片に連
結する。得られたプラスミドをBgl II及びSfi Iで消化
して、SV40初期プロモーターの3'部分とGScDNAとをベク
ターから切り離す。プラスミドpFR400(Simonsen,C.C.
ら,前出)から分離した0.73Kb Sfi I−Xho II断片を
前述の5.6Kbベクターに連結し、SV40初期プロモーター
を再構築し、mDHFR遺伝子を挿入する。このプラスミド
をp9019と名付ける。pSZ9016−1は、HIV LTRがhuCMVI
Eプロモーターにとって代わっている以外は、p9019と同
じである。このベクターは、p9019をXba I及びMlu Iで
消化してhuCMVIEプロモーターを除去することにより構
築される。残基−117〜+80(HIV−1 LTRの部分を含
むベクターpCD23内に存在する(Cullen,Cell 46:973
[1986])のHIV LTRプロモーターを、生成物の末端に
5'側のMlu I及びSpe I制限部位を付加したオリゴヌクレ
オチドプライマーを用いて、プラスミドpCD23からPCR増
幅する。Hind III及びXba I部位は3'側に付加されてい
る。得られた0.2kb PCR生成物を酵素Mlu I及びXba Iで
消化した後、断片をアガロースゲルで精製し、プロモー
ターを含まない4.3Kb DNA断片に連結して、ベクターpS
Z9016−1を形成する。 プロモーターに対して正の向きにあるEP3cDNAを含む
カセットをプロモーターの適当な制限部位3'に連結し、
制限部位マッピング及び/又は配列決定によって同定す
る。これらのcDNA発現ベクターを種々の宿主細胞、例え
ば非限定的具体例としてCOS−7(ATCC#CRL1651)、CV
−1[Sackevitzら,Science 238:1575(1987)],293,
L細胞(ATCC#CRL6362)に、標準的方法、例えば非限定
的具体例として電気穿孔法又は化学的処理(カチオンリ
ポソーム、DEAEデキストリン、リン酸カルシウム)によ
って導入する。トランスフェクションした細胞及び細胞
培養抽出物を回収して、後述のようにEP3発現について
分析し得る。 哺乳動物過渡的発現に使用した総てのベクターは、EP
3を発現する安定な細胞系の確立に使用できる。発現ベ
クター内にクローニングした変更していないEP3cDNA構
築物は、宿主細胞を細胞内EP3タンパク質を作るように
プログラムすると推測される。トランスフェクション宿
主細胞の非限定的具体例としては、CV−1[Sackevitz
ら,前出]、tk−L[Wiglerら,Cell 11:223(197
7)]、NS/0及びDHFR−CHO[Kaufman及びSharp,J.Mol.B
iol.159:601(1982)]が挙げられる。 EP3cDNAを含む任意のベクターと、薬剤選択性プラス
ミド、例えば非限定的具体例としてG418、アミノグリコ
シドホスホトランスフェラーゼ、pLNCX[Miller,A.D.及
びRosman,G.J.,Biotech News 7:980−990(198
9)];ハイグロマイシン、ハイグロマイシン−Bホス
ホトランスフェラーゼ,pLG90[Gritz,L.及びDavies,J.,
GENE 25:179(1983)]、APRT、キサンチン−グアニ
ン、ホスホリボシル−トランスフェラーゼ、pMAM(Clon
tech)[Murrayら,Gene 31:233(1984)]との同時ト
ランスフェクションは、安定にトランスフェクションし
たクローンの選択を可能にする。EP3レベルは前述のア
ッセイによって定量する。 可能な限り高いレベルのEP3を合成する哺乳動物細胞
クローンを製造するために、増幅可能薬剤耐性マーカー
を含むベクター内にEP3cDNA構築物を連結する。これら
の構築物を細胞内に導入した後、プラスミドを含むクロ
ーンを適当な物質を用いて選択し、プラスミドのコピー
数が多い過剰発現クローンの単離を、前記物質の用量増
加の選択によって実施する。下記のシステムを使用す
る:突然変異DHFR遺伝子を含む9016又は9019プラスミド
[Simonsonら,前出]、DHFR−CHO細胞内にトランスフ
ェクションし、メトトレキサート中で選択;グルタミン
シンセターゼ遺伝子を含むpEE12プラスミド、NS/O細胞
内にトランスフェクションし、メチオニンスルホキシミ
ン中で選択(CellTeck国際特許出願WO89/10404号);及
びAPRT及びTK欠失L細胞内のチミジンキナーゼ遺伝子
[Colbere及びGaropin,F.,Proc.Natl.Acad.Sci.76:3755
(1979)]を含むpDLAT−3と同時トランスフェクショ
ンした9016又は他のCMVプロモーターベクター、APRT
(0.05mMアザセリン、0.1mMアデニン、4μg/mlアデノ
シン)中で選択し、HAT(100μMヒポキサンチン、0.4
μMアミノプテリン、16μMチミジン)で増幅。 実施例6 COS−M6細胞内でのpcDNA Iamp−EP3発現及び[3H]PGE2
結合アッセイ コードされたタンパク質のカルボキシル末端が異なる
ヒトプロスタグランジンE受容体EP3サブタイプ(hEP
3α、hEP3-21及びhEP3-9)の3個のクローン化形態
を、pcDNA1ampプラスミド(Invitrogen)内に個々にサ
ブクローニングし、DEAE−デキストラン方法を用いてCO
S−M6細胞内にトランスフェクションした。細胞を72時
間培地に維持し、次いで回収し、窒素キャビテーション
による細胞溶解後に、示差的遠心分離(1000×gで10分
間、次いで100,000×gで30分間)にかけて膜を製造し
た。1mM EDTA、10mM MgCl2、0.5nM[3H]PGE2、及び1
00,000×g膜フラクション由来タンパク質0.5〜3μg
を含む10mMリン酸カリウム(pH6.0)中で、[3H]プロ
スタグランジンE2([3H]PGE2)結合アッセイを行っ
た。前述のように高速濾過で結合及び遊離放射性リガン
ドを分離する前に、室温で1時間インキュベーションを
実施した(Freyら,1993)。フィルターに結合している
残りの[3H]PGE2を液体シンチレーション計数で定量し
た。特異的結合は、1μM PGE2の存在下で測定した総
ての結合と非特異的結合との間の差として定義した。 [3H]PGE2の特異的結合はいずれの場合も親和性が高
く飽和する傾向にあった。平衡解離係数(KD)はhEP
3α、hEP3-21及びhEP3-9を通して大差なく、それぞれ
0.75nM、0.83nM及び0.95nMであった。いずれの場合も大
きな発現レベルが達成され、特異的[3H]PGE2結合部位
の最大数(Bmax)の推算値は、hEP3α、hEP3-21及びhE
P3-9についてそれぞれ13.6、5.3及び19.8pmol/mg膜タン
パク質であった。競合アッセイでは、PGE2及びPGE1がこ
れら3種類のイソフォーム(isoform)での[3H]PGE2
特異的結合の阻止に関して同等の力を示し、IC50値は約
1nMであった(第3図A、第4図A及び第5図B)。PGF
2α及びPGD2の活性は、hEP3α及びhEP3-21ではPGE2の
約200〜2000分の1であったが、hEP3-9では65〜500分の
1にすぎなかった(第3図A、第4図A及び第5図
A)。また、EP1選択性アンタゴニストAH6809は一般
に、hEP3サブタイプでの活性がhEP1サブタイプでの活性
の5〜10分の1であり、IC50値はhEP3の場合が2〜7μ
M、hEP1の場合が0.5μMであった。更に、EP2選択性ア
ゴニストであるブタプロストは、30μM以下では不活性
であった。また、胃細胞保護物質(gastric cytoprote
ctive agent)であるPGE2類似体ミソプロストルは、EP
3サブタイプで、前記イソフォームへの[3H]PGE2特異
的結合に関する競合において親和性が0.3〜1.2μMに及
ぶ活性を示すと考えられた(第1図B、第2図B及び第
3図B)。これらの放射性リガンド結合データは、hEP
3α、hEP3-21及びhEP3-9イソフォームがいずれも、EP3
サブタイプに関して予測されたリガンド結合特性を有す
ることを示している。 実施例7 昆虫細胞内発現のためのバキュロウイルス発現ベクター
内へのEP3cDNAのクローニング AcNPVウイルスのゲノムに由来するバキュロウイルス
ベクターを、Sf9系昆虫細胞(ATCC CRL#1711)内でcD
NAを高レベル発現させるように設計する。EP3cDNAを発
現する組換えバキュロウイルスを以下の標準的方法で製
造する(In Vitrogen Maxbac Manual):EP3cDNA構築
物を種々のバキュロウイルストランスファーベクター、
例えばpAC360及びpBlueBacベクター(In Vitrogen)内
のポリヘドリンプロモーターの下流に連結する。バキュ
ロウイルストランスファーベクター及び線状化AcNPVゲ
ノムDNA[Kitts,P.A.,Nuc.Acid Res.18:5667(199
0)]のSf9細胞内への同時トランスフェクションに次ぐ
相同組換えによって、組換えバキュロウイルスを形成す
る。組換えpAC360ウイルスは感染細胞内の封入体の不在
によって同定され(Summers,M.D.及びSmith,G.E.,Texas
Agriculture Exp.Station Bulletin No.1555)、
組換えpBlueBacウイルスはβ−ガラクトシダーゼ発現に
基づいて同定される(Vialardら,1990,J.Virol.,64,pp3
7−50)。プラーク精製及びEP3組換えバキュロウイルス
でのsf9細胞の感染後に、前述のアッセイでEP3発現を測
定する。 EP3に関する読取り枠全体をコードするcDNAをpBlueBa
c IIのBamH I部位に挿入する。ポリヘドリンプロモータ
ーに対して正の向きにある構築物を配列解析によって同
定し、線状AcNPVマイルドタイプDNAの存在下でSf9細胞
をトランスフェクションするために使用する。 真正の活性EP3は感染細胞の膜に結合している。膜調
製物を標準的方法で感染細胞から製造する。 実施例8 酵母発現ベクター内へのEP3cDNAのクローニング 外来性タンパク質の細胞内発現を制御するように設計
した発現ベクター内に最適EP3cDNA構築物を挿入した
後、酵母S.cerevisiae内で組換えEP3を産生する。細胞
内発現のために、EmBLyex4等のようなベクターをEP3シ
ストロンに連結する[Rinas,U.ら,Biotechnology 8:54
3−545(1990);Horowitz B.ら,J.Biol.Chem.265:4189
−4192(1989)]。発現されたEP3のレベルは前述のア
ッセイで測定する。 実施例9 組換えEP3の精製 組換え技術によって製造したEP3は、抗体アフィニテ
ィクロマトグラフィーによって精製し得る。 抗体がアガロースゲルビーズ支持体との間で共有結合
を形成するようにN−ヒドロキシスクシンイミドエステ
ルで予め活性化したゲル支持体であるAffigel−10(Bio
rad)に抗EP3抗体を加えることによって、EP3抗体アフ
ィニティカラムを形成する。抗体はスペーサーアームの
アミド結合を介してゲルに結合する。次いで、残りの活
性化エステルを1MエタノールアミンHCl(pH8)で失活す
る。カラムを水及び0.23MグリシンHCl(pH2.6)で順次
洗浄して、非結合抗体又は外来タンパク質を除去する。
次いでカラムを、リン酸塩緩衝食塩水(pH7.3)及び適
当な膜可溶化剤、例えば洗剤の中で平衡化し、可溶化EP
3もしくはEP3サブユニットを含む細胞培養上清又は細胞
抽出物をカラムにゆっくり通す。次いでカラムを、光学
密度(A280)がバックグラウンドに低下するまで、リン
酸塩緩衝食塩水及び洗剤で洗浄し、その後タンパク質を
0.23Mグリシン−HCl(pH2.6)及び洗剤で溶離する。次
いで、精製したEP3タンパク質をリン酸塩緩衝食塩水及
び洗剤に対して透析する。
Claims (23)
- 【請求項1】下記の群: 【化1】 から選択されるアミノ酸配列を有することを特徴とす
る、プロスタグランジンに特異的に結合する、単離し精
製されたプロスタグランジン受容体タンパク質。 - 【請求項2】EP3プロスタグランジン受容体タンパク質
をコードする単離し精製されたDNA分子であって、前記
タンパク質が請求項1に記載のアミノ酸配列を有する前
記DNA分子。 - 【請求項3】プロスタグランジン受容体タンパク質をコ
ードする単離し精製されたDNA分子であって、下記の
群: 【化2】 から選択されるヌクレオチド配列を有することを特徴と
する、前記DNA分子。 - 【請求項4】組換え宿主細胞内でプロスタグランジンEP
3受容体タンパク質を発現させるための発現ベクターで
あって、請求項3に記載のDNA分子を含む前記発現ベク
ター。 - 【請求項5】組換えプロスタグランジンEP3受容体タン
パク質を発現する宿主細胞であって、請求項4に記載の
発現ベクターを含む前記宿主細胞。 - 【請求項6】組換え宿主細胞内でプロスタグランジンEP
3受容体タンパク質を発現させる方法であって、(a)
請求項4に記載の発現ベクターを適当な宿主細胞内にト
ランスファーし、(b)前記宿主細胞を発現ベクターか
らのプロスタグランジン受容体タンパク質の発現を可能
にする条件下で培養する操作を含む前記方法。 - 【請求項7】プロスタグランジンEP3受容体活性の調節
因子を選定する方法であって、(a)プロスタグランジ
ン受容体活性の推定調節因子を、請求項1に記載のアミ
ノ酸配列を有することを特徴とするプロスタグランジン
受容体と混合し、(b)プロスタグランジン受容体に対
する推定調節因子の作用を測定する操作を含む前記方
法。 - 【請求項8】プロスタグランジンEP3受容体タンパク質
に特異的に結合する抗体であって、前記タンパク質が請
求項1に記載のアミノ酸配列を有することを特徴とする
前記抗体。 - 【請求項9】組換え宿主細胞内でのプロスタグランジン
EP3受容体タンパク質の発現のための発現ベクターであ
って、請求項2に記載のDNA分子を含む前記発現ベクタ
ー。 - 【請求項10】組換えプロスタグランジンEP3受容体タ
ンパク質を発現する宿主細胞であって、請求項9に記載
の発現ベクターを含む前記宿主細胞。 - 【請求項11】組換え宿主細胞中でプロスタグランジン
EP3受容体タンパク質を発現させる方法であって、 (a) 請求項9に記載の発現ベクターを適切な宿主細
胞へトランスファーし、 (b) 宿主細胞を発現ベクターからのプロスタグラン
ジン受容体タンパク質の発現を可能にする条件下で培養
することを含む方法。 - 【請求項12】化合物がプロスタグランジン受容体EP3
の活性を調節するかどうかを測定する方法であって、 a) 請求項1に記載のアミノ酸配列を含むプロスタグ
ランジンEP3受容体タンパク質を発現する核酸分子で宿
主細胞をトランスフェクトするかまたはトランスフォー
ムして、組換えEP3受容体発現細胞を得て、 b) EP3受容体発現細胞を化合物にさらし、 c) 組換えプロスタグランジンEP3受容体を発現しな
い対照宿主細胞を工程b)の化合物にさらし、 d) EP3受容体発現細胞内でのプロスタグランジンEP3
受容体タンパク質に対する化合物の調節効果及び対照宿
主細胞での化合物の調節効果を測定し、 e) EP3受容体発現細胞内でのプロスタグランジンEP3
受容体タンパク質に対する化合物の効果を対照宿主細胞
と比較することを含む方法。 - 【請求項13】工程a)の宿主細胞がアフリカツメガエ
ル卵母細胞である請求項12に記載の方法。 - 【請求項14】化合物がプロスタグランジンEP3受容体
タンパク質への結合に関して公知のプロスタグランジン
EP3受容体リガンドと競合するかどうかを測定する方法
であって、 a) 請求項1に記載のアミノ酸配列を含むプロスタグ
ランジンEP3受容体タンパク質を発現する核酸分子発現
ベクターで宿主細胞をトランスフェクトするかまたはト
ランスフォームして、EP3受容体発現細胞を得て、 b) EP3受容体発現細胞から実質的に精製された細胞
膜調製物を単離し、 c) 組換えプロスタグランジンEP3受容体タンパク質
を発現しない対照宿主細胞から実質的に精製された細胞
膜調製物を単離し、 d) 工程b)と工程c)の膜調製物を化合物と公知の
プロスタグランジンEP3受容体リガンドにさらし、 e) 工程b)の膜調製物内でプロスタグランジンEP3
受容体タンパク質に対する化合物の結合を測定し、 f) 工程c)の膜調製物に対する化合物の結合を測定
し、 g) 工程b)の膜調製物中のプロスタグランジンEP3
受容体タンパク質と工程c)の膜調製物に対する化合物
の結合を比較することを含む方法。 - 【請求項15】プロスタグランジンEP3受容体リガンド
が、プロスタグランジン受容体タンパク質に対する結合
に関してPGE2と競合させたときに、少なくとも約7μM
までのリガンド濃度でプロスタグランジンEP3受容体タ
ンパク質に対して50%最大特異的結合を示す請求項14に
記載の方法。 - 【請求項16】プロスタグランジンEP3受容体リガンド
がPGE2、PGE1、ミソプロストル、PGF2α、PGD2及びAH6
809からなる群から選択される請求項15に記載の方法。 - 【請求項17】ヒトプロスタグランジン受容体EP3タン
パク質をコードするDNA分子でトランスフェクトされる
かトランスフォームされた組換え宿主細胞から得られた
請求項1に記載のヒトプロスタグランジン受容体EP3タ
ンパク質。 - 【請求項18】請求項17に記載のヒトプロスタグランジ
ン受容体EP3タンパク質を含む膜調製物であって、ヒト
プロスタグランジン受容体EP3タンパク質をコードするD
NA分子でトランスフォームされるかトランスフェクトさ
れた組換え宿主細胞から得られた前記膜調製物。 - 【請求項19】ヒトプロスタグランジン受容体EP3タン
パク質をコードするDNA分子でトランスフェクトされる
かトランスフォームされた組換え宿主細胞から得られる
請求項1に記載のヒトプロスタグランジン受容体EP3タ
ンパク質。 - 【請求項20】請求項19に記載のヒトプロスタグランジ
ン受容体EP3タンパク質を含む膜調製物であって、ヒト
プロスタグランジン受容体EP3タンパク質をコードするD
NA分子でトランスフォームされるかトランスフェクトさ
れた組換え宿主細胞から得られる前記膜調製物。 - 【請求項21】他のヒトタンパク質を含まず、配列番号
10、配列番号11及び配列番号12からなる群から選択され
るアミノ酸配列からなるヒトプロスタグランジン受容体
EP3タンパク質。 - 【請求項22】ヒトプロスタグランジン受容体EP3タン
パク質をコードするDNA分子でトランスフェクトされる
かトランスフォームされた組換え宿主細胞から得られた
請求項21に記載のヒトプロスタグランジン受容体EP3タ
ンパク質。 - 【請求項23】請求項22に記載のヒトプロスタグランジ
ン受容体EP3タンパク質を含む膜調製物であって、ヒト
プロスタグランジン受容体EP3タンパク質をコードするD
NA分子でトランスフォームされるかトランスフェクトさ
れた組換え宿主細胞から得られた前記膜調製物。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US8374693A | 1993-06-25 | 1993-06-25 | |
US083,746 | 1993-06-25 | ||
PCT/CA1994/000320 WO1995000552A1 (en) | 1993-06-25 | 1994-06-09 | Prostaglandin receptor ep3 and dna encoding it |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH09500527A JPH09500527A (ja) | 1997-01-21 |
JP3343258B2 true JP3343258B2 (ja) | 2002-11-11 |
Family
ID=22180426
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP50227095A Expired - Lifetime JP3343258B2 (ja) | 1993-06-25 | 1994-06-09 | プロスタグランジン受容体ep▲3▼及び該受容体をコードするdna |
Country Status (9)
Country | Link |
---|---|
EP (1) | EP0705277B1 (ja) |
JP (1) | JP3343258B2 (ja) |
AT (1) | ATE172471T1 (ja) |
AU (1) | AU6991994A (ja) |
CA (1) | CA2165953C (ja) |
DE (1) | DE69414109T2 (ja) |
DK (1) | DK0705277T3 (ja) |
ES (1) | ES2122291T3 (ja) |
WO (1) | WO1995000552A1 (ja) |
Families Citing this family (10)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US6670134B1 (en) | 1993-11-19 | 2003-12-30 | Allergan, Inc. | Human EP3 prostaglandin receptor |
US6057433A (en) * | 1993-11-19 | 2000-05-02 | Allergan Sales, Inc. | Nucleic acid encoding human EP3 prostaglandin receptor |
WO1996023066A2 (en) * | 1995-01-26 | 1996-08-01 | Merck Frosst Canada Inc. | Prostaglandin receptor, dp |
WO2000051980A1 (en) | 1999-03-05 | 2000-09-08 | The Procter & Gamble Company | C16 unsaturated fp-selective prostaglandins analogs |
US20020172693A1 (en) | 2000-03-31 | 2002-11-21 | Delong Michell Anthony | Compositions and methods for treating hair loss using non-naturally occurring prostaglandins |
US20020013294A1 (en) | 2000-03-31 | 2002-01-31 | Delong Mitchell Anthony | Cosmetic and pharmaceutical compositions and methods using 2-decarboxy-2-phosphinico derivatives |
US20030157599A1 (en) * | 2002-01-30 | 2003-08-21 | Decode Genetics Ehf | Gene for peripheral arterial occlusive disease |
WO2004074830A2 (en) * | 2003-02-24 | 2004-09-02 | Bayer Healthcare Ag | Diagnostics and therapeutics for diseases associated with g-protein coupled receptor prostaglandin e2 ep3 iii (prostaglandin e2 ep3 iii) |
WO2004075813A2 (en) * | 2003-02-26 | 2004-09-10 | Bayer Healthcare Ag | Diagnostics and therapeutics for diseases associated with g-protein coupled receptor prostaglandin e2 ep3 ii (prostaglandin e2 ep3 ii) |
WO2004075814A2 (en) * | 2003-02-26 | 2004-09-10 | Bayer Healthcare Ag | Diagnostics and therapeutics for diseases associated with g-protein coupled receptor prostaglandin e2 ep3 i (prostaglandin e2 ep3 i) |
Family Cites Families (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP3508865B2 (ja) * | 1992-02-24 | 2004-03-22 | 周 成宮 | プロスタグランジンe受容蛋白質、それをコードするdnaおよびその製造法 |
-
1994
- 1994-06-09 DK DK94918700T patent/DK0705277T3/da active
- 1994-06-09 CA CA002165953A patent/CA2165953C/en not_active Expired - Lifetime
- 1994-06-09 AT AT94918700T patent/ATE172471T1/de not_active IP Right Cessation
- 1994-06-09 JP JP50227095A patent/JP3343258B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1994-06-09 DE DE69414109T patent/DE69414109T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1994-06-09 AU AU69919/94A patent/AU6991994A/en not_active Abandoned
- 1994-06-09 ES ES94918700T patent/ES2122291T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1994-06-09 EP EP94918700A patent/EP0705277B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1994-06-09 WO PCT/CA1994/000320 patent/WO1995000552A1/en active IP Right Grant
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
J.Biol.Chem(1992)Vol.267,No.10,p.6463−6466 |
J.Biol.Chem(1993)Vol.268,No.4,p.2712−2718 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
DE69414109D1 (de) | 1998-11-26 |
AU6991994A (en) | 1995-01-17 |
DK0705277T3 (da) | 1999-06-28 |
ES2122291T3 (es) | 1998-12-16 |
CA2165953C (en) | 2003-08-19 |
EP0705277A1 (en) | 1996-04-10 |
CA2165953A1 (en) | 1995-01-05 |
ATE172471T1 (de) | 1998-11-15 |
EP0705277B1 (en) | 1998-10-21 |
DE69414109T2 (de) | 1999-05-27 |
WO1995000552A1 (en) | 1995-01-05 |
JPH09500527A (ja) | 1997-01-21 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP3029125B2 (ja) | プロスタグランジンレセプターipをコードするdna | |
JP3118460B2 (ja) | プロスタグランジンレセプターep▲下2▼をコードするdna | |
JP3228751B2 (ja) | プロスタグランジン受容体fp及び該受容体をコードするdna | |
JP3064015B2 (ja) | プロスタグランジンレセプターdp | |
WO1999046378A1 (fr) | Nouvelles proteines receptrices couplees aux proteines g | |
JP3343258B2 (ja) | プロスタグランジン受容体ep▲3▼及び該受容体をコードするdna | |
EP0700437B1 (en) | Dna encoding prostaglandin receptor ep1 | |
JPH09506251A (ja) | Bmpレセプターをコードするdna配列 | |
WO2002077230A1 (fr) | Variants d'epissage nr10 | |
CA2304828A1 (en) | G-protein coupled glycoprotein hormone receptor hg38 | |
US7528229B2 (en) | Isolated human and rat GAL-R2 galanin receptors | |
JP2001506481A (ja) | ブラジキニンb▲下1▼レセプターをコードするdna | |
JP3090472B2 (ja) | プロスタグランジン受容体ep▲下1▼をコードするdna | |
JP2001517421A (ja) | Gタンパク質共役糖タンパク質ホルモン受容体aomf05 | |
JP2003265188A (ja) | チンパンジープロスタグランジンe2受容体ep4サブタイプをコードするdna |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
S111 | Request for change of ownership or part of ownership |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313113 |
|
R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20070823 Year of fee payment: 5 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20080823 Year of fee payment: 6 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20080823 Year of fee payment: 6 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20090823 Year of fee payment: 7 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20090823 Year of fee payment: 7 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20100823 Year of fee payment: 8 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20110823 Year of fee payment: 9 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20110823 Year of fee payment: 9 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20120823 Year of fee payment: 10 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130823 Year of fee payment: 11 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
S533 | Written request for registration of change of name |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313533 |
|
R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
EXPY | Cancellation because of completion of term |