JP2002512779A - 新規なg−タンパク質共役型受容体 - Google Patents
新規なg−タンパク質共役型受容体Info
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- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
- C07K14/70571—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for neuromediators, e.g. serotonin receptor, dopamine receptor
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Abstract
(57)【要約】
本発明はヒトの中枢神経系に発現する新規なニューロテンシン様受容体に関する。本発明は受容体タンパク質ならびにそのタンパク質をコードする核酸を包含する。さらに、本発明はその受容体を利用する方法および組成物を包含する。
Description
【0001】
本発明は生物学的受容体の一般分野であり、このような受容体の様々な利用に
関する。さらに詳しくは、本発明は新規なニューロテンシン様受容体(NLR)
をコードする核酸およびその受容体自体に関する。
関する。さらに詳しくは、本発明は新規なニューロテンシン様受容体(NLR)
をコードする核酸およびその受容体自体に関する。
【0002】
G−タンパク質共役型受容体(GPCR)は、細胞外N−末端、膜貫通ドメイ
ンを構成すると考えられる7個の疎水性αヘリックス、および細胞内C−末端ド
メインを特徴とする共通の構造機構を有するタンパク質のファミリーをを構成し
ている。GPCRは、形質導入G−タンパク質の活性化によって細胞内シグナル
を誘導する広範囲のリガンドに結合する(Caronら, Rec.Prog.Horm.Res. 48: 27
7-290, 1993; Freedmanら, Rec.Prog.Horm.Res. 51: 319-353, 1996)。
ンを構成すると考えられる7個の疎水性αヘリックス、および細胞内C−末端ド
メインを特徴とする共通の構造機構を有するタンパク質のファミリーをを構成し
ている。GPCRは、形質導入G−タンパク質の活性化によって細胞内シグナル
を誘導する広範囲のリガンドに結合する(Caronら, Rec.Prog.Horm.Res. 48: 27
7-290, 1993; Freedmanら, Rec.Prog.Horm.Res. 51: 319-353, 1996)。
【0003】 これまでに300以上のGPCRがクローン化されていて、優に1000種を
越えるこのような受容体が存在するものと一般に考えられている。機構的には臨
床的に関係のあるすべての薬物のほぼ50〜60%が各種のGPCRの機能を修
飾することによって作用する(Cudermannら, J. Mol. Med. 73: 51-63, 1995)
。中枢神経系に局在する受容体にはとくに興味がもたれる。この領域に局在する
G−タンパク質共役型受容体は痛みの伝達、調節および知覚に関与することが知
られている。したがって、脳および脊柱に見いだされる新しいG−タンパク質共
役型受容体は麻酔薬および鎮痛薬の製造のための新規な物質のアッセイに使用で
きる可能性がある。
越えるこのような受容体が存在するものと一般に考えられている。機構的には臨
床的に関係のあるすべての薬物のほぼ50〜60%が各種のGPCRの機能を修
飾することによって作用する(Cudermannら, J. Mol. Med. 73: 51-63, 1995)
。中枢神経系に局在する受容体にはとくに興味がもたれる。この領域に局在する
G−タンパク質共役型受容体は痛みの伝達、調節および知覚に関与することが知
られている。したがって、脳および脊柱に見いだされる新しいG−タンパク質共
役型受容体は麻酔薬および鎮痛薬の製造のための新規な物質のアッセイに使用で
きる可能性がある。
【0004】
本発明は、中枢神経系において発現し、これまでに報告されたすべての受容体
と別個の構造を有する新規なG−タンパク質共役型受容体の発見に基づくもので
ある。それはヒトニューロテンシン受容体とかなりのホモロジーを共有すること
から、以下「ニューロテンシン様受容体」と呼ぶ。
と別個の構造を有する新規なG−タンパク質共役型受容体の発見に基づくもので
ある。それはヒトニューロテンシン受容体とかなりのホモロジーを共有すること
から、以下「ニューロテンシン様受容体」と呼ぶ。
【0005】 その第一の態様においては、本発明は機能的に配列番号1と一致するアミノ酸
配列からなる天然に存在する以外のタンパク質に関する。「機能的に一致する」
の語は、配列番号1の配列がその受容体の機能的な特性を実質的に変えることの
ない付加、欠失または置換を受けたタンパク質を意味する。この語は配列番号1
と正確に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質ならびにニューロテンシン様受
容体の基本的、定性的リガンド結合性および生理学的性質の維持によって明らか
なように実質的ではない配列の違いを有するタンパク質を包含することを意図す
るものである。「天然に存在する以外」の語は組換え手段によって発現されたか
もしくは精製された(好ましくは実質的に精製された)状態にある化合物を意味
する。
配列からなる天然に存在する以外のタンパク質に関する。「機能的に一致する」
の語は、配列番号1の配列がその受容体の機能的な特性を実質的に変えることの
ない付加、欠失または置換を受けたタンパク質を意味する。この語は配列番号1
と正確に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質ならびにニューロテンシン様受
容体の基本的、定性的リガンド結合性および生理学的性質の維持によって明らか
なように実質的ではない配列の違いを有するタンパク質を包含することを意図す
るものである。「天然に存在する以外」の語は組換え手段によって発現されたか
もしくは精製された(好ましくは実質的に精製された)状態にある化合物を意味
する。
【0006】 本発明はまた、配列番号1の配列と本質的に一致するアミノ酸配列を有する天
然に存在する以外のタンパク質、このようなタンパク質に優先的に結合する抗体
(すなわち、他のタンパク質よりNLRに対して少なくとも100倍以上の親和
性を有する抗体)、およびNLRの医薬的に許容される製剤の抗体産生可能な動
物への注射を含む方法により作成される抗体を包含する。
然に存在する以外のタンパク質、このようなタンパク質に優先的に結合する抗体
(すなわち、他のタンパク質よりNLRに対して少なくとも100倍以上の親和
性を有する抗体)、およびNLRの医薬的に許容される製剤の抗体産生可能な動
物への注射を含む方法により作成される抗体を包含する。
【0007】 好ましい実施態様においては、NLRをマウスに投与好ましくは注射し、その
マウスの脾臓細胞をついで骨髄腫細胞に融合させてNLRに対するモノクローナ
ル抗体が産生される。
マウスの脾臓細胞をついで骨髄腫細胞に融合させてNLRに対するモノクローナ
ル抗体が産生される。
【0008】 本発明はまた、機能的に配列番号1と一致するアミノ酸配列からなるタンパク
質をコードする天然に存在する以外のポリヌクレオチドに関する。本発明のこの
態様は、本質的に配列番号1のアミノ酸配列と一致するタンパク質をコードする
ポリヌクレオチド、このようなポリヌクレオチドからなる発現ベクター、および
このようなベクターによってトランスフォームされた宿主細胞を包含する。また
この方法により宿主細胞によって産生された組換えニューロテンシン様受容体も
本発明に包含される。
質をコードする天然に存在する以外のポリヌクレオチドに関する。本発明のこの
態様は、本質的に配列番号1のアミノ酸配列と一致するタンパク質をコードする
ポリヌクレオチド、このようなポリヌクレオチドからなる発現ベクター、および
このようなベクターによってトランスフォームされた宿主細胞を包含する。また
この方法により宿主細胞によって産生された組換えニューロテンシン様受容体も
本発明に包含される。
【0009】 好ましくは、ニューロテンシン様受容体をコードするポリヌクレオチドは配列
番号2に示すヌクレオチド配列を有し、この受容体の発現に使用されるベクター
および宿主細胞もこの特定のポリヌクレオチドを使用する。
番号2に示すヌクレオチド配列を有し、この受容体の発現に使用されるベクター
および宿主細胞もこの特定のポリヌクレオチドを使用する。
【0010】 他の態様においては、本発明は試験化合物のニューロテンシン様受容体に結合
する能力をアッセイする方法に関する。この方法は、NLRのソースを、受容体
に結合することが既知のリガンドおよび試験化合物とインキュベートすることに
よって実施される。受容体のソースは好ましくは、他のG−タンパク質共役型受
容体に比較して大量のNLRを発現しなければならない。インキュベーションが
完了したならば、NLRに結合する試験化合物の能力をリガンドの結合が置換さ
れる程度によって測定する。好ましくは存在する受容体は配列番号1に示す配列
をもたねばならない。本質的ではないが、結合アッセイは第二のメッセンジャー
経路、すなわちアデニルサイクラーゼ経路が活性化されるたかどうかを測定する
アッセイによって達成される。これはNLRに結合する特定の化合物がアゴニス
トまたはアンタゴニストとして作用するかを決定する助けになる。
する能力をアッセイする方法に関する。この方法は、NLRのソースを、受容体
に結合することが既知のリガンドおよび試験化合物とインキュベートすることに
よって実施される。受容体のソースは好ましくは、他のG−タンパク質共役型受
容体に比較して大量のNLRを発現しなければならない。インキュベーションが
完了したならば、NLRに結合する試験化合物の能力をリガンドの結合が置換さ
れる程度によって測定する。好ましくは存在する受容体は配列番号1に示す配列
をもたねばならない。本質的ではないが、結合アッセイは第二のメッセンジャー
経路、すなわちアデニルサイクラーゼ経路が活性化されるたかどうかを測定する
アッセイによって達成される。これはNLRに結合する特定の化合物がアゴニス
トまたはアンタゴニストとして作用するかを決定する助けになる。
【0011】 試験化合物がNLRのアゴニストであるかどうかを決定するための、リガンド
を必要としない別の方法は、細胞シグナリングアッセイすなわち細胞内アデニル
サイクラーゼ活性または細胞内カルシウム濃度のいずれかを測定するアッセイを
用いる。試験化合物は一般的に他のG−タンパク質共役型受容体に比較して大量
のNLRを発現する細胞、通常は配列番号1のNLRをコードする発現ベクター
でトランスフェクトされた細胞とインキュベートする。アゴニストである試験化
合物は、試験化合物に暴露されなかった対照に比較した場合、細胞シグナリング
アッセイから得られた結果に統計学的に有意な変化を生じることによって同定さ
れる。対照細胞はトランスフェクトされなかった細胞または活性な受容体を産生
しないベクターでモックトランスフェクトされた細胞のいずれでもよい。アゴニ
ストである試験化合物に暴露されたNLR−発現細胞は通常、対照細胞に比べて
アデニルサイクラーゼ活性または細胞内カルシウム濃度に有意な増加を示すこと
が期待される。
を必要としない別の方法は、細胞シグナリングアッセイすなわち細胞内アデニル
サイクラーゼ活性または細胞内カルシウム濃度のいずれかを測定するアッセイを
用いる。試験化合物は一般的に他のG−タンパク質共役型受容体に比較して大量
のNLRを発現する細胞、通常は配列番号1のNLRをコードする発現ベクター
でトランスフェクトされた細胞とインキュベートする。アゴニストである試験化
合物は、試験化合物に暴露されなかった対照に比較した場合、細胞シグナリング
アッセイから得られた結果に統計学的に有意な変化を生じることによって同定さ
れる。対照細胞はトランスフェクトされなかった細胞または活性な受容体を産生
しないベクターでモックトランスフェクトされた細胞のいずれでもよい。アゴニ
ストである試験化合物に暴露されたNLR−発現細胞は通常、対照細胞に比べて
アデニルサイクラーゼ活性または細胞内カルシウム濃度に有意な増加を示すこと
が期待される。
【0012】 本発明はまた、試験化合物がNLRのアンタゴニストであるかどうかを決定す
る方法を包含する。これはこのような受容体が大量に発現した場合に起こるG−
タンパク質共役型受容体の既知の構成的活性化によるものである。この方法は、
受容体をコードするDNAが、プロモーターに作動的に連結する発現ベクター中
に導入され、ついでこのベクターが適当な宿主のトランスフェクトに使用される
ことを要求する。構成的受容体活性化(すなわち、天然のリガンドの不存在下に
おける活性化)を生じるのに十分な受容体を産生させるためには、大量のタンパ
ク質を産生できる発現系が好ましい。たとえばNLR DNAをCMVプロモー
ターに操作性に連結し、COSまたはHEK293細胞内で発現させる。トランス
フェクション後、活性化された受容体を有する細胞が、トランスフェクトされな
かった細胞または機能性NLRを発現できないベクターでトランスフェクトされ
た相当する細胞に比較して細胞シグナリングアッセイにおける活性の増大を示す
ことに基づいて選択される。通常、細胞内アデニルサイクラーゼ活性または細胞
内カルシウム濃度の統計学的に有意な変化を示す細胞が選択されることになる。
選択された細胞を試験化合物と接触させ、これが試験化合物と接触させなかった
細胞に比べ選択されたで活性の低下を生じるかどうかを決定する細胞シグナリン
グアッセイを反復する。たとえば対照細胞に比較してアデニルサイクラーゼ活性
またはカルシウム濃度のいずれかの統計学的に有意な低下は試験化合物がNLR
のアンタゴニストであることを指示する。アッセイに使用するNLRは好ましく
は配列番号1の配列を有する。
る方法を包含する。これはこのような受容体が大量に発現した場合に起こるG−
タンパク質共役型受容体の既知の構成的活性化によるものである。この方法は、
受容体をコードするDNAが、プロモーターに作動的に連結する発現ベクター中
に導入され、ついでこのベクターが適当な宿主のトランスフェクトに使用される
ことを要求する。構成的受容体活性化(すなわち、天然のリガンドの不存在下に
おける活性化)を生じるのに十分な受容体を産生させるためには、大量のタンパ
ク質を産生できる発現系が好ましい。たとえばNLR DNAをCMVプロモー
ターに操作性に連結し、COSまたはHEK293細胞内で発現させる。トランス
フェクション後、活性化された受容体を有する細胞が、トランスフェクトされな
かった細胞または機能性NLRを発現できないベクターでトランスフェクトされ
た相当する細胞に比較して細胞シグナリングアッセイにおける活性の増大を示す
ことに基づいて選択される。通常、細胞内アデニルサイクラーゼ活性または細胞
内カルシウム濃度の統計学的に有意な変化を示す細胞が選択されることになる。
選択された細胞を試験化合物と接触させ、これが試験化合物と接触させなかった
細胞に比べ選択されたで活性の低下を生じるかどうかを決定する細胞シグナリン
グアッセイを反復する。たとえば対照細胞に比較してアデニルサイクラーゼ活性
またはカルシウム濃度のいずれかの統計学的に有意な低下は試験化合物がNLR
のアンタゴニストであることを指示する。アッセイに使用するNLRは好ましく
は配列番号1の配列を有する。
【0013】 NLRと相互作用する化合物のアッセイは、受容体を含むソース(たとえば、
安定にトランスフォームされた細胞)をNLRに特異的なリガンドと、試験化合
物の存在下および不存在下の両者でインキュベートし、細胞内カルシウム濃度の
修飾を測定する。試験化合物に応答したリガンド刺激カルシウムシグナリングに
おける有意な増加または低下はニューロテンシン様受容体で起こる相互作用を指
示する。好ましい受容体は配列番号1のアミノ酸配列を有する受容体である。
安定にトランスフォームされた細胞)をNLRに特異的なリガンドと、試験化合
物の存在下および不存在下の両者でインキュベートし、細胞内カルシウム濃度の
修飾を測定する。試験化合物に応答したリガンド刺激カルシウムシグナリングに
おける有意な増加または低下はニューロテンシン様受容体で起こる相互作用を指
示する。好ましい受容体は配列番号1のアミノ酸配列を有する受容体である。
【0014】 他の態様においては、本発明は試験化合物がNLRの発現を変化させる能力を
アッセイする方法に関する。この方法は、NLRを発現する細胞を試験化合物の
存在下に増殖させることによって実施される。ついで細胞を集め、NLRの発現
を、本質的に同一であるが試験化合物の不存在下に増殖させた対照細胞における
発現と比較する。好ましい受容体は配列番号1のアミノ酸配列を有する受容体で
ある。好ましい試験化合物は長さ少なくとも15ヌクレオチドの、アッセイに使用
されたNLR mRNAの配列に対して相補性の配列からなるオリゴヌクレオチ
ドである。
アッセイする方法に関する。この方法は、NLRを発現する細胞を試験化合物の
存在下に増殖させることによって実施される。ついで細胞を集め、NLRの発現
を、本質的に同一であるが試験化合物の不存在下に増殖させた対照細胞における
発現と比較する。好ましい受容体は配列番号1のアミノ酸配列を有する受容体で
ある。好ましい試験化合物は長さ少なくとも15ヌクレオチドの、アッセイに使用
されたNLR mRNAの配列に対して相補性の配列からなるオリゴヌクレオチ
ドである。
【0015】定 義 以下の説明では組換えDNA技術に関する多くの用語を使用する。このような
用語で与えられる範囲を含む明細書および特許請求の範囲の明確な一致した理解
を実現するため、以下の定義を提供する。
用語で与えられる範囲を含む明細書および特許請求の範囲の明確な一致した理解
を実現するため、以下の定義を提供する。
【0016】 クローニングベクター:宿主細胞内で自動的に複製することが可能で、1個ま
たは少数個の制限エンドヌクレアーゼ認識部位によって特徴づけられるプラスミ
ドもしくはファージDNAまたは他のDNA配列。外来DNAフラグメントは、
そのフラグメントの複製およびクローニングをもたらすために、これらの部位で
ベクター中にスプライスされる。ベクターには、トランスフォームされた細胞の
同定に使用するのに適当なマーカーを含有していてもよい。たとえば、マーカー
はテトラサイクリン抵抗性またはアンピシリン抵抗性を提供する。
たは少数個の制限エンドヌクレアーゼ認識部位によって特徴づけられるプラスミ
ドもしくはファージDNAまたは他のDNA配列。外来DNAフラグメントは、
そのフラグメントの複製およびクローニングをもたらすために、これらの部位で
ベクター中にスプライスされる。ベクターには、トランスフォームされた細胞の
同定に使用するのに適当なマーカーを含有していてもよい。たとえば、マーカー
はテトラサイクリン抵抗性またはアンピシリン抵抗性を提供する。
【0017】 発現ベクター:クローニングベクターに類似するがそれにクローニングされた
DNAの発現を宿主細胞にトランスフォーメーション後に誘導できるベクター。
クローニングされたDNAは通常プロモーターまたはエンハンサーのようなある
種の調節配列の制御下に置かれる(すなわち、それに操作性に連結される)。プ
ロモーター配列は構成的、誘導的または抑制的である。
DNAの発現を宿主細胞にトランスフォーメーション後に誘導できるベクター。
クローニングされたDNAは通常プロモーターまたはエンハンサーのようなある
種の調節配列の制御下に置かれる(すなわち、それに操作性に連結される)。プ
ロモーター配列は構成的、誘導的または抑制的である。
【0018】 実質的に純粋:本明細書で用いられる「実質的に純粋」とは、所望の生成物が
夾雑する細胞成分を本質的に含まないことを意味する。「実質的に純粋」なタン
パク質または核酸は通常、サンプルの少なくとも85%を構成し、この百分率が
大きいほど好ましい。夾雑物質には、タンパク質、炭水化物および脂質が包含さ
れる。タンパク質または核酸の純度を決定する一方法には、ポリアクリルアミド
またはアガロースのようなマトリックス中におけるプレパレーションの電気泳動
がある。純度は、染色後、単一バンドの出現によって証明される。純度を評価す
る他の方法にはクロマトグラフィーおよび分析的遠心分離が包含される。
夾雑する細胞成分を本質的に含まないことを意味する。「実質的に純粋」なタン
パク質または核酸は通常、サンプルの少なくとも85%を構成し、この百分率が
大きいほど好ましい。夾雑物質には、タンパク質、炭水化物および脂質が包含さ
れる。タンパク質または核酸の純度を決定する一方法には、ポリアクリルアミド
またはアガロースのようなマトリックス中におけるプレパレーションの電気泳動
がある。純度は、染色後、単一バンドの出現によって証明される。純度を評価す
る他の方法にはクロマトグラフィーおよび分析的遠心分離が包含される。
【0019】 組換えタンパク質:組換えタンパク質または組換え受容体は、発現ベクターの
宿主細胞への導入によって産生される非内因性タンパク質である。
宿主細胞への導入によって産生される非内因性タンパク質である。
【0020】 宿主:複製可能な発現ベクターまたはクローニングベクターのレシピエントで
ある任意の原核または真核細胞がそのベクターの「宿主」である。この語は染色
体上またはゲノム内の所望の遺伝子が導入されるように操作された原核または真
核細胞を包含する。宿主として有用な細胞の例は細胞のトランスフォーメーショ
ンの技術分野において周知である(たとえば Sambrookら, Molecular Cloning:
A Laboratory Manual, 2nd ed. Cold Spring Harbor, 1989 参照)。
ある任意の原核または真核細胞がそのベクターの「宿主」である。この語は染色
体上またはゲノム内の所望の遺伝子が導入されるように操作された原核または真
核細胞を包含する。宿主として有用な細胞の例は細胞のトランスフォーメーショ
ンの技術分野において周知である(たとえば Sambrookら, Molecular Cloning:
A Laboratory Manual, 2nd ed. Cold Spring Harbor, 1989 参照)。
【0021】 プロモーター:通常、遺伝子の5′領域に見いだされ、開始コドン近くに位置
するDNA配列。転写はプロモーターにおいて開始される。プロモーターが誘導
型の場合には、転写の速度は誘発剤に応答して増加する。
するDNA配列。転写はプロモーターにおいて開始される。プロモーターが誘導
型の場合には、転写の速度は誘発剤に応答して増加する。
【0022】 相補性ヌクレオチド配列:本明細書で使用される相補性ヌクレオチド配列とは
正常な塩基の対合によって起こる配列を意味する。たとえば、ヌクレオチド配列
5′−AGAC−3′は相補性の配列5′−GTCT−3′を有する。
正常な塩基の対合によって起こる配列を意味する。たとえば、ヌクレオチド配列
5′−AGAC−3′は相補性の配列5′−GTCT−3′を有する。
【0023】 発現:発現とは、ポリヌクレオチドがDNAから産生される過程である。その
過程は遺伝子のmRNAへの転写およびこのmRNAのポリペプチドへの翻訳を
包含する。
過程は遺伝子のmRNAへの転写およびこのmRNAのポリペプチドへの翻訳を
包含する。
【0024】
本発明はニューロテンシン様受容体タンパク質、そのタンパク質をコードする
遺伝子配列、ニューロテンシン様受容体に結合する化合物をアッセイする方法、
ならびに化合物について受容体の発現を変化させるそれらの能力をアッセイする
方法に関する。
遺伝子配列、ニューロテンシン様受容体に結合する化合物をアッセイする方法、
ならびに化合物について受容体の発現を変化させるそれらの能力をアッセイする
方法に関する。
【0025】 その受容体およびその核酸は図1および2に示す構造ならびに配列番号1およ
び2によって定義される。しかしながら、本発明は図および配列表に示す配列と
同一の配列のみでなく、本質的に同一な配列および実質的に同一であり、NLR
の基本的な結合特性を維持した受容体を生じる配列も包含する。たとえば、部位
特異的突然変異誘発のような技術がタンパク質の構造に変動を導入するため使用
できることは周知である。この方法またはある種の類似方法によって導入される
ニューロテンシン様受容体における変動は、得られた受容体が不変のNLRの基
本的な定性的結合特性および生理学的特性を維持している限り、本発明に包含さ
れる。すなわち、本発明は配列番号1と機能的に一致するアミノ酸配列からなる
タンパク質に関する。
び2によって定義される。しかしながら、本発明は図および配列表に示す配列と
同一の配列のみでなく、本質的に同一な配列および実質的に同一であり、NLR
の基本的な結合特性を維持した受容体を生じる配列も包含する。たとえば、部位
特異的突然変異誘発のような技術がタンパク質の構造に変動を導入するため使用
できることは周知である。この方法またはある種の類似方法によって導入される
ニューロテンシン様受容体における変動は、得られた受容体が不変のNLRの基
本的な定性的結合特性および生理学的特性を維持している限り、本発明に包含さ
れる。すなわち、本発明は配列番号1と機能的に一致するアミノ酸配列からなる
タンパク質に関する。
【0026】I.NLRをコードする核酸配列 ヒトニューロテンシン様受容体をコードするDNA配列は中枢神経系、胎盤お
よび骨格筋で発現し、これらのいずれもその受容体をコードする核酸の単離に有
用である。さらに、ヒトNLRを発現する細胞および細胞系も使用することがで
きる。これらはトランスフォーメーションを受けていない培養細胞または組換え
NLRを発現するように特異的に操作された細胞系のいずれでもよい。いずれの
場合も、組織または細胞からポリA+mRNAを単離し、逆転写し、クローン化
する。このようにして形成されたcDNAライブラリーをついで配列番号2から
誘導されたプローブを用いてスクリーニングする。プローブは通常、長さが少な
くとも14塩基であり、好ましくはNLRの高度に保存された膜貫通ドメインに
相当するDNAの領域から得られるものであってはならない。
よび骨格筋で発現し、これらのいずれもその受容体をコードする核酸の単離に有
用である。さらに、ヒトNLRを発現する細胞および細胞系も使用することがで
きる。これらはトランスフォーメーションを受けていない培養細胞または組換え
NLRを発現するように特異的に操作された細胞系のいずれでもよい。いずれの
場合も、組織または細胞からポリA+mRNAを単離し、逆転写し、クローン化
する。このようにして形成されたcDNAライブラリーをついで配列番号2から
誘導されたプローブを用いてスクリーニングする。プローブは通常、長さが少な
くとも14塩基であり、好ましくはNLRの高度に保存された膜貫通ドメインに
相当するDNAの領域から得られるものであってはならない。
【0027】 別法として、ヒトニューロテンシン様受容体は、完全長のNLR配列を含有す
る組換え細胞、またはcDNAライブラリーからNLR遺伝子のいずれかの側に
位置するプライマーでPCR増幅を実施することにより得ることができる。これ
らのプライマーは配列番号2に示す配列から選択することができる。実施例の項
には、胎児脊髄cDNAからニューロテンシン様受容体を得るためにPCR増幅
に使用する操作を記載する。
る組換え細胞、またはcDNAライブラリーからNLR遺伝子のいずれかの側に
位置するプライマーでPCR増幅を実施することにより得ることができる。これ
らのプライマーは配列番号2に示す配列から選択することができる。実施例の項
には、胎児脊髄cDNAからニューロテンシン様受容体を得るためにPCR増幅
に使用する操作を記載する。
【0028】II.NLRに対する抗体 本発明はまた、ヒトニューロテンシン様受容体に特異的に結合する抗体および
このような抗体を産生させる方法に関する。「特異的に結合する」抗体は、他の
任意のタンパク質より少なくとも100倍大きな親和性を有するものと定義される
。このような抗体を産生させる方法は、NLRタンパク質それ自身を適当な動物
に注射するか、または別法として受容体の異なる領域に相当するように作成され
た短いペプチドを注射することを包含する。ペプチドは長さ少なくとも5アミノ
酸でなければならず、NLRにユニークであると考えられる領域から選択されな
ければならない。
このような抗体を産生させる方法に関する。「特異的に結合する」抗体は、他の
任意のタンパク質より少なくとも100倍大きな親和性を有するものと定義される
。このような抗体を産生させる方法は、NLRタンパク質それ自身を適当な動物
に注射するか、または別法として受容体の異なる領域に相当するように作成され
た短いペプチドを注射することを包含する。ペプチドは長さ少なくとも5アミノ
酸でなければならず、NLRにユニークであると考えられる領域から選択されな
ければならない。
【0029】 すなわち、抗体の発生のためのペプチドの選択には、高度に保存された膜貫通
ドメインは一般に避けるべきである。抗体の作成および検出方法は標準参考書た
とえば Harlowら, Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, N.
Y. (1988); Klein, Immunology: The Science of Self-Nonself Discrimination
(1982); Kennettら, Monoclonal Antibodies and Hybridomas: A New Dimension
in Biological Analyses (1980); Campbell, Monoclonal Antibody Technology,
in Biochemistry and Molecular Biology (1984) によって明らかなように本技
術分野の熟練者には周知である。
ドメインは一般に避けるべきである。抗体の作成および検出方法は標準参考書た
とえば Harlowら, Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, N.
Y. (1988); Klein, Immunology: The Science of Self-Nonself Discrimination
(1982); Kennettら, Monoclonal Antibodies and Hybridomas: A New Dimension
in Biological Analyses (1980); Campbell, Monoclonal Antibody Technology,
in Biochemistry and Molecular Biology (1984) によって明らかなように本技
術分野の熟練者には周知である。
【0030】 本明細書で用いられる「抗体」は無傷の分子、および抗原への結合能力を維持
しているフラグメント(たとえば、FabおよびF(ab)2フラグメント)を包含す
ることを意味する。これらのフラグメントは通常、無傷の抗体を酵素たとえばパ
パイン(Fab フラグメントの製造)またはペプシン(F(ab)2 フラグメントの
製造)を使用して蛋白分解的に切断することによって製造することができる。「
抗体」の語はまたモノクローナル抗体およびポリクローナル抗体の両者を意味す
る。ポリクローナル抗体は抗原で免疫処置した動物の血清から誘導される。モノ
クローナル抗体はハイブリドーマ技術を用いて調製できる(Hammeringら, in Mo
noclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas, Elsevier, N.Y., pp. 563-681,1
981)。一般に、この技術は、動物、通常はマウスを無傷なNLRまたはNLR
から誘導されたフラグメントにより免疫処置することを包含する。免疫処置動物
の脾臓細胞を抽出し、適当な骨髄腫細胞、たとえばSP2O細胞と融合させる。
融合後、得られたハイブリドーマ細胞をHATメジウムに選択的に維持し、つい
で限界希釈によってクローン化する(Wandsら, Gastroenterology 80: 225-232,
1981)。このような選択によって得られた細胞をついでアッセイに付し、NLR
に結合できる抗体を分泌するクローンを同定する。
しているフラグメント(たとえば、FabおよびF(ab)2フラグメント)を包含す
ることを意味する。これらのフラグメントは通常、無傷の抗体を酵素たとえばパ
パイン(Fab フラグメントの製造)またはペプシン(F(ab)2 フラグメントの
製造)を使用して蛋白分解的に切断することによって製造することができる。「
抗体」の語はまたモノクローナル抗体およびポリクローナル抗体の両者を意味す
る。ポリクローナル抗体は抗原で免疫処置した動物の血清から誘導される。モノ
クローナル抗体はハイブリドーマ技術を用いて調製できる(Hammeringら, in Mo
noclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas, Elsevier, N.Y., pp. 563-681,1
981)。一般に、この技術は、動物、通常はマウスを無傷なNLRまたはNLR
から誘導されたフラグメントにより免疫処置することを包含する。免疫処置動物
の脾臓細胞を抽出し、適当な骨髄腫細胞、たとえばSP2O細胞と融合させる。
融合後、得られたハイブリドーマ細胞をHATメジウムに選択的に維持し、つい
で限界希釈によってクローン化する(Wandsら, Gastroenterology 80: 225-232,
1981)。このような選択によって得られた細胞をついでアッセイに付し、NLR
に結合できる抗体を分泌するクローンを同定する。
【0031】 本発明の抗体または抗体のフラグメントは、任意の様々なイムノアッセイを用
いてNLRの存在の検出に使用できる。たとえば、抗体はラジオイムノアッセイ
または、「2部位」もしくは「サンドイッチ」アッセイとして知られた免疫測定
アッセイに使用できる(Chard,T.,"An Introduction to Radioimmune Assay and
Related Techniques." in Laboratory Techniques in Biochemistry and Molec
ular Biology, North Holland Publishing Co., N.Y,, 1978 参照)。典型的な
免疫測定アッセイにおいては、一定量の非標識抗体を試験液体たとえば血液、リ
ンパ液、細胞抽出物等に不溶性の固体支持体に結合させる。固定化した抗体への
抗原の初期の結合後に、一定量の検出可能に標識された第二の抗体(これは第一
の抗体と同一でも同一でなくてもよい)を添加すると結合した抗原の検出および
/または定量が可能になる(たとえば Radioimmune Assay Method, Kirkhamら編
, pp. 196-206, E & S Livingstone, Edinburgh, 1970 参照)。これらのアッセ
イタイプの多くの変法が本技術分野においては周知であり、NLRの検出に採用
することができる。
いてNLRの存在の検出に使用できる。たとえば、抗体はラジオイムノアッセイ
または、「2部位」もしくは「サンドイッチ」アッセイとして知られた免疫測定
アッセイに使用できる(Chard,T.,"An Introduction to Radioimmune Assay and
Related Techniques." in Laboratory Techniques in Biochemistry and Molec
ular Biology, North Holland Publishing Co., N.Y,, 1978 参照)。典型的な
免疫測定アッセイにおいては、一定量の非標識抗体を試験液体たとえば血液、リ
ンパ液、細胞抽出物等に不溶性の固体支持体に結合させる。固定化した抗体への
抗原の初期の結合後に、一定量の検出可能に標識された第二の抗体(これは第一
の抗体と同一でも同一でなくてもよい)を添加すると結合した抗原の検出および
/または定量が可能になる(たとえば Radioimmune Assay Method, Kirkhamら編
, pp. 196-206, E & S Livingstone, Edinburgh, 1970 参照)。これらのアッセ
イタイプの多くの変法が本技術分野においては周知であり、NLRの検出に採用
することができる。
【0032】 ヒトNLRに対する抗体は、無傷の受容体または受容体のフラグメントいずれ
の精製にも使用できる(一般的には Deanら, Affinity Chromatography. A Prac
tical Approach, IRL Press, 1986 参照)。通常、抗体はクロマトグラフィーマ
トリックスたとえば Sepharose 4B に固定化する。このマトリックスをついでカ
ラムに充填し、NLRを含有するプレパレーションを、結合を促進する条件下、
たとえば低塩条件下に通過させる。カラムをついで洗浄し、結合したNLRを、
抗体からの解離を促進する緩衝液、たとえば変化したpHまたは塩濃度を有する
緩衝液を用いて溶出する。溶出したNLRを所望の緩衝液にたとえば透析により
移し、保存するかまたはそのまま使用する。
の精製にも使用できる(一般的には Deanら, Affinity Chromatography. A Prac
tical Approach, IRL Press, 1986 参照)。通常、抗体はクロマトグラフィーマ
トリックスたとえば Sepharose 4B に固定化する。このマトリックスをついでカ
ラムに充填し、NLRを含有するプレパレーションを、結合を促進する条件下、
たとえば低塩条件下に通過させる。カラムをついで洗浄し、結合したNLRを、
抗体からの解離を促進する緩衝液、たとえば変化したpHまたは塩濃度を有する
緩衝液を用いて溶出する。溶出したNLRを所望の緩衝液にたとえば透析により
移し、保存するかまたはそのまま使用する。
【0033】III.受容体結合の放射リガンドアッセイ NLR核酸および組換えタンパク質の主要な用途の一つは、その受容体に結合
できる物質を同定するために設計されるアッセイにおいてである。このような物
質は、受容体結合の正常な作用を模倣するアゴニスト、または受容体結合の正常
な作用を阻害するアンタゴニストのいずれでもよい。ニューロテンシン様受容体
に結合し、細胞内シグナリングたとえばアデニルサイクラーゼ活性または細胞内
カルシウム濃度を修飾する物質の同定はとくに興味がもたれる。これらの物質は
鎮痛薬または麻酔薬のいずれかとして治療的応用の可能性を有する。
できる物質を同定するために設計されるアッセイにおいてである。このような物
質は、受容体結合の正常な作用を模倣するアゴニスト、または受容体結合の正常
な作用を阻害するアンタゴニストのいずれでもよい。ニューロテンシン様受容体
に結合し、細胞内シグナリングたとえばアデニルサイクラーゼ活性または細胞内
カルシウム濃度を修飾する物質の同定はとくに興味がもたれる。これらの物質は
鎮痛薬または麻酔薬のいずれかとして治療的応用の可能性を有する。
【0034】 放射リガンド結合アッセイにおいては、NLRのソースを、受容体に結合する
ことが既知のリガンドおよび結合活性を試験する化合物とともにインキュベート
する。NLRの好ましいソースは、受容体を組換えにより発現するようにトラン
スフォームされた細胞好ましくは哺乳動物細胞である。選択された細胞はリガン
ドに結合して結果を歪める恐れのある他のG−タンパク質共役型受容体を実質的
な量発現してはならない。これは、NLRを組換えによって発現するがトランス
フォーメーションを受けていない同じ組織または細胞系から誘導された細胞上で
結合アッセイを実施することにより容易に決定することができる。
ことが既知のリガンドおよび結合活性を試験する化合物とともにインキュベート
する。NLRの好ましいソースは、受容体を組換えにより発現するようにトラン
スフォームされた細胞好ましくは哺乳動物細胞である。選択された細胞はリガン
ドに結合して結果を歪める恐れのある他のG−タンパク質共役型受容体を実質的
な量発現してはならない。これは、NLRを組換えによって発現するがトランス
フォーメーションを受けていない同じ組織または細胞系から誘導された細胞上で
結合アッセイを実施することにより容易に決定することができる。
【0035】 アッセイは無傷の細胞または細胞から調製された膜のいずれかによって実施す
ることができる(たとえば Wangら, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90: 10230-10234,
1993 参照)。膜または細胞をNLR受容体に特異的なリガンドおよび試験され
る化合物のプレパレーションとインキュベートする。結合が完了したのち、リガ
ンドおよび試験化合物を含有する溶液からたとえばろ過により受容体を分離し、
生じた結合量を測定する。使用するリガンドは好ましくは、放射性同位元素たと
えば125Iにより検出可能に標識する。しかしながら、所望により代わりに蛍光
もしくは化学ルミネセンス標識を使用することができる。最も一般に用いられる
蛍光標識化合物は、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、フィコエ
リトリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、o−フタルアルデヒドおよび
フルオレサミンである。有用な化学ルミネセンス化合物には、ルミノール、イソ
ルミノール、微生物発育抑制性のアクリジニウムエステル、イミダゾール、アク
リジニウム塩、およびシュウ酸エステルが包含される。任意のこれらの物質がア
ッセイにおける使用に適当なリガンドの製造に使用することができる。
ることができる(たとえば Wangら, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90: 10230-10234,
1993 参照)。膜または細胞をNLR受容体に特異的なリガンドおよび試験され
る化合物のプレパレーションとインキュベートする。結合が完了したのち、リガ
ンドおよび試験化合物を含有する溶液からたとえばろ過により受容体を分離し、
生じた結合量を測定する。使用するリガンドは好ましくは、放射性同位元素たと
えば125Iにより検出可能に標識する。しかしながら、所望により代わりに蛍光
もしくは化学ルミネセンス標識を使用することができる。最も一般に用いられる
蛍光標識化合物は、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、フィコエ
リトリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、o−フタルアルデヒドおよび
フルオレサミンである。有用な化学ルミネセンス化合物には、ルミノール、イソ
ルミノール、微生物発育抑制性のアクリジニウムエステル、イミダゾール、アク
リジニウム塩、およびシュウ酸エステルが包含される。任意のこれらの物質がア
ッセイにおける使用に適当なリガンドの製造に使用することができる。
【0036】 非特異的結合は、大過剰の非標識リガンドの存在下に結合反応を実施すること
によって測定できる。たとえば標識リガンドを受容体および試験化合物と、10
00倍過剰の非標識リガンドの存在下にインキュベートする。
によって測定できる。たとえば標識リガンドを受容体および試験化合物と、10
00倍過剰の非標識リガンドの存在下にインキュベートする。
【0037】 総結合すなわち非標識リガンドの不存在下における結合から試験した各サンプ
ルについての特異的な結合に到達させるため、非特異的結合を差し引かなければ
ならない。他の工程たとえば洗浄、撹拌、振盪、ろ過等が必要に応じてアッセイ
に包含される。通常、洗浄工程は溶液中に残留するリガンドから膜結合リガンド
を分離したのち、および結合リガンドの量をたとえば放射性同位元素の計数によ
り定量する前に包含される。試験化合物の存在下に得られた特異的な結合を標識
リガンド単独の存在下に得られた結合と比較することによって、試験化合物が受
容体結合を置換した程度を決定する。
ルについての特異的な結合に到達させるため、非特異的結合を差し引かなければ
ならない。他の工程たとえば洗浄、撹拌、振盪、ろ過等が必要に応じてアッセイ
に包含される。通常、洗浄工程は溶液中に残留するリガンドから膜結合リガンド
を分離したのち、および結合リガンドの量をたとえば放射性同位元素の計数によ
り定量する前に包含される。試験化合物の存在下に得られた特異的な結合を標識
リガンド単独の存在下に得られた結合と比較することによって、試験化合物が受
容体結合を置換した程度を決定する。
【0038】 結合アッセイの実施に際しては、結合が何らかの他の機構によって実際に阻害
されたとき、試験化合物がニューロテンシン様受容体と相互作用するように見せ
るアーチファクトを避けるように注意しなければならない。たとえば、試験され
る化合物はNLRへのリガンドの結合をそれ自体実質的に阻害しない緩衝液中に
添加せねばならず、好ましくは数種の異なる濃度において試験する必要がある。
試験化合物のプレパレーションはまた蛋白分解活性についても調べることが必要
であり、アッセイにアンチプロテアーゼを包含させることが望ましい。最後に、
NLR受容体に対するリガンドの結合を置換するとして同定された化合物では、
結果の Scatchard 分析を実施するのに十分な濃度範囲で再試験することがきわ
めて望ましい。このタイプの分析は本技術分野において周知であり、受容体に対
する試験化合物の親和性の測定に使用することができる(たとえば Ausubelら,
Current Protocols in Molecular Biology, Workら編, N.Y., 1978 等参照)。
結果の解析の補助にコンピュータープログラムを使用することができる(たとえ
ば Munson,P., Methods Enzymol. 92:543-577, 1083; McPherson,G.A., Kinetic
EBDA Ligand, Lowry-A Collection of Radioligand Binding Analusis Program
s, Elsevier-Biosoft, U.K., 1985)。
されたとき、試験化合物がニューロテンシン様受容体と相互作用するように見せ
るアーチファクトを避けるように注意しなければならない。たとえば、試験され
る化合物はNLRへのリガンドの結合をそれ自体実質的に阻害しない緩衝液中に
添加せねばならず、好ましくは数種の異なる濃度において試験する必要がある。
試験化合物のプレパレーションはまた蛋白分解活性についても調べることが必要
であり、アッセイにアンチプロテアーゼを包含させることが望ましい。最後に、
NLR受容体に対するリガンドの結合を置換するとして同定された化合物では、
結果の Scatchard 分析を実施するのに十分な濃度範囲で再試験することがきわ
めて望ましい。このタイプの分析は本技術分野において周知であり、受容体に対
する試験化合物の親和性の測定に使用することができる(たとえば Ausubelら,
Current Protocols in Molecular Biology, Workら編, N.Y., 1978 等参照)。
結果の解析の補助にコンピュータープログラムを使用することができる(たとえ
ば Munson,P., Methods Enzymol. 92:543-577, 1083; McPherson,G.A., Kinetic
EBDA Ligand, Lowry-A Collection of Radioligand Binding Analusis Program
s, Elsevier-Biosoft, U.K., 1985)。
【0039】 リガンドの結合による受容体の活性化は、異なる多数のアッセイを用いてモニ
ターすることができる。たとえば、アデニルサイクラーゼのアッセイはマイクロ
タイタープレートのウエル中で細胞を増殖させ、ついでウエルを試験化合物の存
在下または不存在下にインキュベートすることにより実施される。cAMPをつ
いでエタノールに抽出し、凍結乾燥し、アッセイ緩衝液中に再懸濁する。このよ
うにして回収されたcAMPのアッセイはcAMPの濃度を測定する任意の方法
たとえばBiotrack cAMP酵素イムノアッセイシステム(Amersham)、もしくはCyc
lic AMP[3H]アッセイシステム(Amersham)を用いて実施される。通常、アデ
ニルサイクラーゼのアッセイは結合アッセイとは別個に実施されるが、細胞の単
一プレパレーションについて結合およびアデニルサイクラーゼアッセイを実施す
ることも可能である。受容体活性のモニターに使用できる他の「細胞シグナリン
グアッセイ」は以下に記載する。
ターすることができる。たとえば、アデニルサイクラーゼのアッセイはマイクロ
タイタープレートのウエル中で細胞を増殖させ、ついでウエルを試験化合物の存
在下または不存在下にインキュベートすることにより実施される。cAMPをつ
いでエタノールに抽出し、凍結乾燥し、アッセイ緩衝液中に再懸濁する。このよ
うにして回収されたcAMPのアッセイはcAMPの濃度を測定する任意の方法
たとえばBiotrack cAMP酵素イムノアッセイシステム(Amersham)、もしくはCyc
lic AMP[3H]アッセイシステム(Amersham)を用いて実施される。通常、アデ
ニルサイクラーゼのアッセイは結合アッセイとは別個に実施されるが、細胞の単
一プレパレーションについて結合およびアデニルサイクラーゼアッセイを実施す
ることも可能である。受容体活性のモニターに使用できる他の「細胞シグナリン
グアッセイ」は以下に記載する。
【0040】IV.細胞シグナリングアッセイを用いるNLRアゴニストおよびアンタゴニスト の同定 ニューロテンシン様受容体は、細胞シグナリングアッセイを用いる薬剤候補の
スクリーニングに使用することができる。NLRアゴニストを同定には、受容体
をコードするDNAを発現ベクター中に導入し、ついで適当な宿主中にトランス
フェクトする。トランスフォームされた細胞をついで一連の試験化合物と接触さ
せて、それぞれの作用をモニターする。使用できるアッセイ中には、cAMPの
産生を測定するアッセイ(上記参照)、レポーター遺伝子活性の活性化を測定す
るアッセイ、リガンドたとえばGTP−γ−Sの結合の修飾を測定するアッセイ
、または細胞内カルシウム濃度の変化を測定するアッセイがある。
スクリーニングに使用することができる。NLRアゴニストを同定には、受容体
をコードするDNAを発現ベクター中に導入し、ついで適当な宿主中にトランス
フェクトする。トランスフォームされた細胞をついで一連の試験化合物と接触さ
せて、それぞれの作用をモニターする。使用できるアッセイ中には、cAMPの
産生を測定するアッセイ(上記参照)、レポーター遺伝子活性の活性化を測定す
るアッセイ、リガンドたとえばGTP−γ−Sの結合の修飾を測定するアッセイ
、または細胞内カルシウム濃度の変化を測定するアッセイがある。
【0041】 細胞シグナリングアッセイはNLRアンタゴニストの同定にも使用することが
できる。G−タンパク質共役型受容体は、それらの同種のリガンドの不存在下に
も異種システムにおいてそれらをきわめて高い濃度で発現させることにより、そ
れらを活性状態に置くことができる。たとえば受容体を昆虫Sf9細胞のバキュ
ロウイルス感染を用いて過剰発現させるか、NLR遺伝子をCMVプロモーター
に操作性に連結し、COSもしくはHEK293細胞中で発現させる。この活性化
構成状態で、受容体のアンタゴニストが、リガンドの不存在下に、試験化合物の
構成的細胞シグナリング活性を阻害する能力を測定することによって同定するこ
とができる。このための適当なアッセイはこの場合もcAMPアッセイ、レポー
ター遺伝子活性化アッセイまたはGTP−γ−Sの結合の修飾を測定するアッセ
イである。
できる。G−タンパク質共役型受容体は、それらの同種のリガンドの不存在下に
も異種システムにおいてそれらをきわめて高い濃度で発現させることにより、そ
れらを活性状態に置くことができる。たとえば受容体を昆虫Sf9細胞のバキュ
ロウイルス感染を用いて過剰発現させるか、NLR遺伝子をCMVプロモーター
に操作性に連結し、COSもしくはHEK293細胞中で発現させる。この活性化
構成状態で、受容体のアンタゴニストが、リガンドの不存在下に、試験化合物の
構成的細胞シグナリング活性を阻害する能力を測定することによって同定するこ
とができる。このための適当なアッセイはこの場合もcAMPアッセイ、レポー
ター遺伝子活性化アッセイまたはGTP−γ−Sの結合の修飾を測定するアッセ
イである。
【0042】 一つの好ましい細胞シグナリングアッセイは、NLRで安定にトランスフェク
トされ、リガンドの存在下におけるインキュベーションに応答して細胞内カルシ
ウムレベルに変化を示す細胞に基づくものである。したがって、上に論じた放射
性受容体アッセイと類似しているが、結合した放射能に代えてカルシウム濃度を
測定する操作が、NLRアゴニストまたはアンタゴニストの同定に使用できる。
試験化合物およびリガンドの存在下におけるカルシウムの濃度を、リガンド単独
の存在下におけるカルシウム濃度と比較し、試験化合物がニューロテンシン様受
容体で相互作用しているかどうかを決定する。試験化合物に反応した細胞内カル
シウムの統計学的に有意な増加は、試験化合物がアゴニストとして作用している
ことを指示し、一方、細胞内カルシウムの統計学的に有意な低下はそれがアンタ
ゴニストとして作用していることを指示する。
トされ、リガンドの存在下におけるインキュベーションに応答して細胞内カルシ
ウムレベルに変化を示す細胞に基づくものである。したがって、上に論じた放射
性受容体アッセイと類似しているが、結合した放射能に代えてカルシウム濃度を
測定する操作が、NLRアゴニストまたはアンタゴニストの同定に使用できる。
試験化合物およびリガンドの存在下におけるカルシウムの濃度を、リガンド単独
の存在下におけるカルシウム濃度と比較し、試験化合物がニューロテンシン様受
容体で相互作用しているかどうかを決定する。試験化合物に反応した細胞内カル
シウムの統計学的に有意な増加は、試験化合物がアゴニストとして作用している
ことを指示し、一方、細胞内カルシウムの統計学的に有意な低下はそれがアンタ
ゴニストとして作用していることを指示する。
【0043】 レポーター遺伝子の活性化を測定するアッセイもまた実施される。たとえば、
組換えNLR受容体を発現する細胞を、アデニルサイクラーゼまたはジアシルグ
リセロール応答エレメントに操作性に連結したレポーター遺伝子(たとえばクロ
ラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼまたはルシフェラーゼ遺伝子)で
トランスフェクトする。細胞をついで試験化合物とインキュベートして、レポー
ター遺伝子の発現を、組換えNLRは発現しないが他の点では本質的に同一であ
る対照細胞における発現と比較する。NLR発現細胞におけるレポーター遺伝子
の発現の統計学的に有意な変化は、試験化合物がNLR受容体と相互作用するこ
とを指示する。
組換えNLR受容体を発現する細胞を、アデニルサイクラーゼまたはジアシルグ
リセロール応答エレメントに操作性に連結したレポーター遺伝子(たとえばクロ
ラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼまたはルシフェラーゼ遺伝子)で
トランスフェクトする。細胞をついで試験化合物とインキュベートして、レポー
ター遺伝子の発現を、組換えNLRは発現しないが他の点では本質的に同一であ
る対照細胞における発現と比較する。NLR発現細胞におけるレポーター遺伝子
の発現の統計学的に有意な変化は、試験化合物がNLR受容体と相互作用するこ
とを指示する。
【0044】V.NLRの発現を修飾する能力のアッセイ NLRの生物学的作用を増大または低下させる一つの方法は、細胞内において
受容体が発現する程度を変化させる方法である。したがって、発現を阻害または
増強する化合物の同定のためのアッセイはかなり興味がある。これらのアッセイ
はNLRを発現する細胞を試験化合物の存在下に増殖させ、これらの細胞におけ
る受容体の発現を、本質的に同一条件下であるが試験化合物の不存在下に増殖さ
せた細胞における発現と比較する。上述の結合アッセイの場合のように、用いる
細胞は競合するG−タンパク質共役型受容体を実質的に含まないことが望ましい
。受容体の発現を測定する一つの方法には、NLR配列を容易に定量化できるペ
プチドまたは蛋白質をコードする配列に融合する方法である。たとえばNLR配
列はヘマグルチニンをコードする配列にリゲートし、細胞を安定にトランスフェ
クトするために使用する。試験化合物とインキュベーション後、ヘマグルチニン
/受容体複合体を免疫沈降させ、抗−ヘマグルチニン抗体でウエスタンブロット
する。別法として、結合アッセイのScatchard分析を標識リガンドについて実施
し、受容体数を測定する。結合アッセイは上述のように実施し、組換えによって
NLRを発現するように操作した細胞を使用することが好ましい。
受容体が発現する程度を変化させる方法である。したがって、発現を阻害または
増強する化合物の同定のためのアッセイはかなり興味がある。これらのアッセイ
はNLRを発現する細胞を試験化合物の存在下に増殖させ、これらの細胞におけ
る受容体の発現を、本質的に同一条件下であるが試験化合物の不存在下に増殖さ
せた細胞における発現と比較する。上述の結合アッセイの場合のように、用いる
細胞は競合するG−タンパク質共役型受容体を実質的に含まないことが望ましい
。受容体の発現を測定する一つの方法には、NLR配列を容易に定量化できるペ
プチドまたは蛋白質をコードする配列に融合する方法である。たとえばNLR配
列はヘマグルチニンをコードする配列にリゲートし、細胞を安定にトランスフェ
クトするために使用する。試験化合物とインキュベーション後、ヘマグルチニン
/受容体複合体を免疫沈降させ、抗−ヘマグルチニン抗体でウエスタンブロット
する。別法として、結合アッセイのScatchard分析を標識リガンドについて実施
し、受容体数を測定する。結合アッセイは上述のように実施し、組換えによって
NLRを発現するように操作した細胞を使用することが好ましい。
【0045】 NLR発現アッセイに包含させるのが好ましい試験化合物のグループは、配列
番号2に示すNLR核酸配列の各種セグメントに相補性のオリゴヌクレオチドか
ら構成される。これらのオリゴヌクレオチドは長さが少なくとも15塩基であり、
受容体核酸配列の非保存的領域から誘導されなければならない。
番号2に示すNLR核酸配列の各種セグメントに相補性のオリゴヌクレオチドか
ら構成される。これらのオリゴヌクレオチドは長さが少なくとも15塩基であり、
受容体核酸配列の非保存的領域から誘導されなければならない。
【0046】 受容体の発現を低下させることが見いだされたオリゴヌクレオチドは、それら
の有効性を増大させるために誘導体化または接合させることができる。たとえば
、ヌクレオシドホスホロチオエートをそれらの天然のカウンターパートで置換さ
せる(Cohen J., Oligodeoxynucleotides, Antisense Inhibitors of Gene Expr
ession, CRC Press, 1989 参照)。オリゴヌクレオチドはDRRの発現を阻害す
る目的で、インビボにおいて患者に送達することができる。これを実施する場合
、オリゴヌクレオチドは細胞による取り込みが増大する型で投与することが好ま
しい。たとえば、オリゴヌクレオチドは、リポソームによって、または細胞によ
り摂取されるペプチドに接合させて送達することができる(たとえば、米国特許
第4,897,355号および4,394,448号参照。また米国特許以外の明細書、WO 8903849
およびEP 0263740参照)。オリゴヌクレオチドの送達効率を上昇させる他の方法
は本技術分野において周知であり、また本発明と矛盾しない。
の有効性を増大させるために誘導体化または接合させることができる。たとえば
、ヌクレオシドホスホロチオエートをそれらの天然のカウンターパートで置換さ
せる(Cohen J., Oligodeoxynucleotides, Antisense Inhibitors of Gene Expr
ession, CRC Press, 1989 参照)。オリゴヌクレオチドはDRRの発現を阻害す
る目的で、インビボにおいて患者に送達することができる。これを実施する場合
、オリゴヌクレオチドは細胞による取り込みが増大する型で投与することが好ま
しい。たとえば、オリゴヌクレオチドは、リポソームによって、または細胞によ
り摂取されるペプチドに接合させて送達することができる(たとえば、米国特許
第4,897,355号および4,394,448号参照。また米国特許以外の明細書、WO 8903849
およびEP 0263740参照)。オリゴヌクレオチドの送達効率を上昇させる他の方法
は本技術分野において周知であり、また本発明と矛盾しない。
【0047】 以上、本発明を説明したが、以下の実施例を参照することにより本発明の理解
はさらに容易になるものと思われる。これらの実施例は例示の目的で提供される
ものであり、本発明の範囲を限定する意図ではない。
はさらに容易になるものと思われる。これらの実施例は例示の目的で提供される
ものであり、本発明の範囲を限定する意図ではない。
【0048】 (実施例)実施例1:ヒトNLRのクローニング 多数のオピオイドおよびソマトスタチン受容体ファミリーのメンバー中に保存
されたペプチド配列に基づいて、1対の縮重オリゴヌクレオチドが設計された。
プライマー配列は次の通りである。 5′−AARMTSAARACIGCYACIAA−3′(配列番号:3)順
行プライマー 1I−Uおよび 5′−AYRGCGAYRTAICKRTCIAC−3′(配列番号:4)逆
行プライマー 2I−U ポリメラーゼ連鎖反応混合物(総容量100μl)は、約250ngのヒトゲノ
ムDNA(NOVAGEN)、1×PCR緩衝液(50mM KCl,1.5mM MgCl2,10
mM Tris-HCl(pH8.9), Pharmacia)、200μM dNTP(Pharmacia)、20
0pmolの上記各プライマーおよび5UのTaqポリメラーゼ(Pharmacia)を含
有した。増幅はRoboCycler Gradient 40(Stratagene)上で実施した。鋳型は9
5℃で1分間変性し、ついで変性、アニーリングおよび延長工程、それぞれ95
℃、42℃および72℃で1分間からなる35サイクルを行った。得られた産物
を1%アガロースゲル上で分割した。期待された220bpの付近の主要なバンド
を切り出し、Sephaglas BandPrepキット(Pharmacia)で精製し、pGEM−T
(Promega)にクローン化した。プラスミドをアルカリ溶解プロトコールによっ
て調製して、Sangerらのジデオキシターミネーション配列決定法によりスクリー
ニングした。クローン化されたPCR産物の大部分はヒトδオピオイド受容体で
あることが見いだされ、これは細菌コロニーハイブリダイゼーションによって除
去した。他の既知のヒトオピオイド(κおよびμ)受容体ならびにhORLI(
オーファニンFQまたはノシセプチン受容体)中、新規な候補G−タンパク質共
役型受容体を10−29と命名した。
されたペプチド配列に基づいて、1対の縮重オリゴヌクレオチドが設計された。
プライマー配列は次の通りである。 5′−AARMTSAARACIGCYACIAA−3′(配列番号:3)順
行プライマー 1I−Uおよび 5′−AYRGCGAYRTAICKRTCIAC−3′(配列番号:4)逆
行プライマー 2I−U ポリメラーゼ連鎖反応混合物(総容量100μl)は、約250ngのヒトゲノ
ムDNA(NOVAGEN)、1×PCR緩衝液(50mM KCl,1.5mM MgCl2,10
mM Tris-HCl(pH8.9), Pharmacia)、200μM dNTP(Pharmacia)、20
0pmolの上記各プライマーおよび5UのTaqポリメラーゼ(Pharmacia)を含
有した。増幅はRoboCycler Gradient 40(Stratagene)上で実施した。鋳型は9
5℃で1分間変性し、ついで変性、アニーリングおよび延長工程、それぞれ95
℃、42℃および72℃で1分間からなる35サイクルを行った。得られた産物
を1%アガロースゲル上で分割した。期待された220bpの付近の主要なバンド
を切り出し、Sephaglas BandPrepキット(Pharmacia)で精製し、pGEM−T
(Promega)にクローン化した。プラスミドをアルカリ溶解プロトコールによっ
て調製して、Sangerらのジデオキシターミネーション配列決定法によりスクリー
ニングした。クローン化されたPCR産物の大部分はヒトδオピオイド受容体で
あることが見いだされ、これは細菌コロニーハイブリダイゼーションによって除
去した。他の既知のヒトオピオイド(κおよびμ)受容体ならびにhORLI(
オーファニンFQまたはノシセプチン受容体)中、新規な候補G−タンパク質共
役型受容体を10−29と命名した。
【0049】 いずれのヒト組織cDNAライブラリーを元のPCRフラグメントに基づいて
設計された1対のプライマーによってスクリーニングするかを最初に決定するた
めにPCRを用いた(上記参照)。オリゴヌクレオチドの配列は次の通りであっ
た。 5′−TGGTCCTGCTCCTTGGAATGT−3′(配列番号:5)
29−1、順行プライマーおよび 5′−GCGAAGCACACGGTCTCAAA−3′(配列番号:6)2
9−2、逆行プライマー
設計された1対のプライマーによってスクリーニングするかを最初に決定するた
めにPCRを用いた(上記参照)。オリゴヌクレオチドの配列は次の通りであっ
た。 5′−TGGTCCTGCTCCTTGGAATGT−3′(配列番号:5)
29−1、順行プライマーおよび 5′−GCGAAGCACACGGTCTCAAA−3′(配列番号:6)2
9−2、逆行プライマー
【0050】 PCR混合物(総容量30μl)は、1μlのQUICK-ScreenヒトcDNAライブ
ラリーパネル(CLONTECH, Cat# k1003-1)、1×PCR緩衝液(Pharmacia),
200μM dNTP(Pharmacia),25pmolの各プライマーおよび1UのTa
q ポリメラーゼ(Pharmacia)を含有した。鋳型の最初の変性は95℃で1分間
行い、ついで変性、アニーリングおよび延長、それぞれ95℃、55℃および7
2℃で1分間からなる45サイクルを行った。脳、胎盤、骨格筋および、はるか
に低レベルの腎臓ライブラリーは陽性のクローンを含有することが見いだされた
(データは示していない)。ヒト脳λgt11 cDNAライブラリー(CLONTECH, C
at# HL3002b)を、プローブとしてランダムプライミング法(Ready-To-Go DNA
標識ビーズ (-dCTP), Pharmacia)で標識した元の220bp PCRフラグメント
で遺伝子をスクリーニングするために選択した。プレハイブリダイゼーションお
よびハイブリダイゼーションは2×SSC、5×デンハルト溶液、0.5%SD
Sおよび100μg/mlのヘリング***DNA中、62℃で実施した。プローブ
濃度は約0.5×106cpm/mlとした。一つの陽性クローンが同定された。この
クローンの挿入体を切り出してpBlueScriptにクローニングし、pBS10-29と
命名した。
ラリーパネル(CLONTECH, Cat# k1003-1)、1×PCR緩衝液(Pharmacia),
200μM dNTP(Pharmacia),25pmolの各プライマーおよび1UのTa
q ポリメラーゼ(Pharmacia)を含有した。鋳型の最初の変性は95℃で1分間
行い、ついで変性、アニーリングおよび延長、それぞれ95℃、55℃および7
2℃で1分間からなる45サイクルを行った。脳、胎盤、骨格筋および、はるか
に低レベルの腎臓ライブラリーは陽性のクローンを含有することが見いだされた
(データは示していない)。ヒト脳λgt11 cDNAライブラリー(CLONTECH, C
at# HL3002b)を、プローブとしてランダムプライミング法(Ready-To-Go DNA
標識ビーズ (-dCTP), Pharmacia)で標識した元の220bp PCRフラグメント
で遺伝子をスクリーニングするために選択した。プレハイブリダイゼーションお
よびハイブリダイゼーションは2×SSC、5×デンハルト溶液、0.5%SD
Sおよび100μg/mlのヘリング***DNA中、62℃で実施した。プローブ
濃度は約0.5×106cpm/mlとした。一つの陽性クローンが同定された。この
クローンの挿入体を切り出してpBlueScriptにクローニングし、pBS10-29と
命名した。
【0051】 クローンpBS10-29は候補受容体の完全なN−末端を含有するが、コード領
域は膜貫通領域5(TM5)の末端において停止コドンによって中断されていて
、hNTR1とのホモロジーもこの領域を越えて失われている。このcDNAで
はイントロンが完全に除去されていることが明らかである。ヒトP1ゲノムDN
Aクローンはプライマー29−1(順行プライマー、上記参照)および29−B
: 5′−GGGGAAGTAGTGGAACTTGATGC−3′(配列番号:
7)逆行プライマー を用いて得られた。このP1クローンをStu-I制限エンドヌクレアーゼで消化し
、消化物を電気泳動、サザンブロットに付し、前に設計した10−29プローブ
でスクリーニングした。ハイブリダイゼーション時に生じる強いシグナルによっ
てP1クローンの 8.5 kb StuIフラグメントを同定した。このフラグメントを
pBlueScriptにクローニングし、pBS10-29-8kと命名し、完全に配列を決定し
た。それは開始コドンの12bp上流およびTM−5領域までのコード領域を含む
ことが見いだされたが、それは受容体のC−末端についての配列情報は含んでい
なかった。
域は膜貫通領域5(TM5)の末端において停止コドンによって中断されていて
、hNTR1とのホモロジーもこの領域を越えて失われている。このcDNAで
はイントロンが完全に除去されていることが明らかである。ヒトP1ゲノムDN
Aクローンはプライマー29−1(順行プライマー、上記参照)および29−B
: 5′−GGGGAAGTAGTGGAACTTGATGC−3′(配列番号:
7)逆行プライマー を用いて得られた。このP1クローンをStu-I制限エンドヌクレアーゼで消化し
、消化物を電気泳動、サザンブロットに付し、前に設計した10−29プローブ
でスクリーニングした。ハイブリダイゼーション時に生じる強いシグナルによっ
てP1クローンの 8.5 kb StuIフラグメントを同定した。このフラグメントを
pBlueScriptにクローニングし、pBS10-29-8kと命名し、完全に配列を決定し
た。それは開始コドンの12bp上流およびTM−5領域までのコード領域を含む
ことが見いだされたが、それは受容体のC−末端についての配列情報は含んでい
なかった。
【0052】 8kbフラグメントとその3′末端からの約1.3kbで重複している他の11kb
のKpn1フラグメントもpBlueScriptにクローニングした(pBS10-29-11k)。
細菌内で増幅後に、Kpn1フラグメントを大量に単離し、Sau3AIで完全
に消化した。得られたフラグメントをpBluescriptにランダムにクローニングし
、配列を決定した。2つのクローン、8および74は同一であり、TM7領域を
コードするストレッチを含有することが見いだされた。この領域の周辺のプライ
マーを設計して、さらに上流の配列、完全なC−末端および3′非翻訳領域の配
列を決定することが可能になった。この結果は、TM7に対して期待された位置
に認識可能なTM6が見いだされなかったことから、TM7の上流に他のイント
ロンが存在することを示唆している。
のKpn1フラグメントもpBlueScriptにクローニングした(pBS10-29-11k)。
細菌内で増幅後に、Kpn1フラグメントを大量に単離し、Sau3AIで完全
に消化した。得られたフラグメントをpBluescriptにランダムにクローニングし
、配列を決定した。2つのクローン、8および74は同一であり、TM7領域を
コードするストレッチを含有することが見いだされた。この領域の周辺のプライ
マーを設計して、さらに上流の配列、完全なC−末端および3′非翻訳領域の配
列を決定することが可能になった。この結果は、TM7に対して期待された位置
に認識可能なTM6が見いだされなかったことから、TM7の上流に他のイント
ロンが存在することを示唆している。
【0053】 3′非翻訳領域における配列に相当するプライマー3′−270r(5′−TCC
TCTGTGAAGTTTTGAGGC−3′(配列番号:8))を使用すると、
2つの10−29特異的な入れ子順行プライマー、29−1(上記参照)および
29−f3′:5′−ATCGTCTGGGGCTTCTCCG−3′(配列番
号:9)を用いた入れ子PCRにより 10−29遺伝子の完全なC−末端をク
ローン化することが可能であった。ヒト胎児脊髄から調製したcDNA 1μlに
DRGを結合させ、PCRの最初のラウンドの鋳型として選択した。入れ子PC
R増幅は鋳型として前のPCR産物(1μl)を用いて実施した。PCR条件は、
アニーリング温度(50℃)およびサイクル数(35)を除いて上述と同一とし
た。857bpフラグメントを増幅して、pGEM−T(容易)(Promega)にク
ローニングし、配列を決定した。このクローンは29−CT(C−末端について
)と命名し、最初のイントロンが開始する位置までpBS10-29と222bpを共
有することが見いだされた。両配列を合わせると全部で1245bpの受容体の全
コード領域が形成され、415アミノ酸の推定受容体タンパク質を有する。
TCTGTGAAGTTTTGAGGC−3′(配列番号:8))を使用すると、
2つの10−29特異的な入れ子順行プライマー、29−1(上記参照)および
29−f3′:5′−ATCGTCTGGGGCTTCTCCG−3′(配列番
号:9)を用いた入れ子PCRにより 10−29遺伝子の完全なC−末端をク
ローン化することが可能であった。ヒト胎児脊髄から調製したcDNA 1μlに
DRGを結合させ、PCRの最初のラウンドの鋳型として選択した。入れ子PC
R増幅は鋳型として前のPCR産物(1μl)を用いて実施した。PCR条件は、
アニーリング温度(50℃)およびサイクル数(35)を除いて上述と同一とし
た。857bpフラグメントを増幅して、pGEM−T(容易)(Promega)にク
ローニングし、配列を決定した。このクローンは29−CT(C−末端について
)と命名し、最初のイントロンが開始する位置までpBS10-29と222bpを共
有することが見いだされた。両配列を合わせると全部で1245bpの受容体の全
コード領域が形成され、415アミノ酸の推定受容体タンパク質を有する。
【0054】 合成cDNAクローンの全ヌクレオチド配列を図1に例示する。1245のヌ
クレオチドからなるオープンリーディングフレームは推定分子量約43.6キロ
ダルトンを有する415アミノ酸のタンパク質をコードする(図2)。タンパク
質配列はGPCRのすべての特徴的性質を含有する。7個の疎水性ヘリックスは
、膜貫通ドメイン、アミノ末端およびカルボキシ末端ドメインを表すものと考え
られる。N−末端細胞外ドメイン(位置9)にグリコシル化部位の可能性および
位置323−327に保存されたNPXXY配列が存在する。
クレオチドからなるオープンリーディングフレームは推定分子量約43.6キロ
ダルトンを有する415アミノ酸のタンパク質をコードする(図2)。タンパク
質配列はGPCRのすべての特徴的性質を含有する。7個の疎水性ヘリックスは
、膜貫通ドメイン、アミノ末端およびカルボキシ末端ドメインを表すものと考え
られる。N−末端細胞外ドメイン(位置9)にグリコシル化部位の可能性および
位置323−327に保存されたNPXXY配列が存在する。
【0055】 受容体10−29のヌクレオチド配列および一次推定アミノ酸配列は、ニュー
ロテンシンNTR−1およびNTR−2の配列にとくに密接に類似している。受
容体10−29の既知のニューロテンシン受容体との配列アラインメントにより
、ヒトならびにラットNTR−1およびNTR−2に約32%の同一性が明らか
である。膜貫通ドメイン中では、TM−2領域に最高度のホモロジー(61%)
が、またTM−4領域に最低のホモロジー(20%)が認められる。NTR−1
、NTR−2および受容体10−29の間のアミノ酸における類似性はとくに高
く(>55%)、ニューロテンシンは受容体10−29の内因性リガンドとして
働くことが示唆される。すなわち、受容体10−29はニューロテンシン受容体
の新規なサブタイプであると考えられる。
ロテンシンNTR−1およびNTR−2の配列にとくに密接に類似している。受
容体10−29の既知のニューロテンシン受容体との配列アラインメントにより
、ヒトならびにラットNTR−1およびNTR−2に約32%の同一性が明らか
である。膜貫通ドメイン中では、TM−2領域に最高度のホモロジー(61%)
が、またTM−4領域に最低のホモロジー(20%)が認められる。NTR−1
、NTR−2および受容体10−29の間のアミノ酸における類似性はとくに高
く(>55%)、ニューロテンシンは受容体10−29の内因性リガンドとして
働くことが示唆される。すなわち、受容体10−29はニューロテンシン受容体
の新規なサブタイプであると考えられる。
【0056】実施例2:in situハイブリダイゼーション実験 組織の調製:凍結成人および胎児ヒト脊髄および後根神経節は BaltimoreのUn
iversity of Maryland, Brain and Tissue Bank for Developmental Disorderか
ら厳格な倫理的ガイドラインに従って入手した。成熟雄性Sprague-Dawleyラット
(約250g:Charles River, St-Constant, Quebec)は頚椎脱臼によって屠殺
した。まだDRGに結合している脳および脊髄を直ちに摘出し、イソペンタン中
−40℃で20秒間急冷し、−80℃に保存した。凍結組織をMicrom HM 500 M
クリオスタット(Germany)で16μmに切断し、ProbeOn Plusスライドに解凍搭
載した。切片はin situハイブリダイゼーションまで−80℃に保存した。
iversity of Maryland, Brain and Tissue Bank for Developmental Disorderか
ら厳格な倫理的ガイドラインに従って入手した。成熟雄性Sprague-Dawleyラット
(約250g:Charles River, St-Constant, Quebec)は頚椎脱臼によって屠殺
した。まだDRGに結合している脳および脊髄を直ちに摘出し、イソペンタン中
−40℃で20秒間急冷し、−80℃に保存した。凍結組織をMicrom HM 500 M
クリオスタット(Germany)で16μmに切断し、ProbeOn Plusスライドに解凍搭
載した。切片はin situハイブリダイゼーションまで−80℃に保存した。
【0057】 リボプローブの合成:プラスミドpCDNA3-10-29(506bpフラグメント
を含有する)を、挿入cDNAのいずれかの側でポリリンカー中に切断するXab
IまたはHind III制限酵素のいずれかを用いて線状化した。アンチセンスおよび
センス10−29リボプローブをインビトロで、それぞれT7またはSP6RN
Aポリメラーゼ(Pharmacia Biotech)のいずれかを用いて[35S]UTP(約
800Ci/mmol;Amersham, Oakville, Ontario)の存在下に転写した。転写
後DNA鋳型をDNアーゼI(Pharmacia)で消化した。リボプローブは、ついで
ProbeQuantG-50マイクロカラム(Pharmacia Biotech, USA)上で製造業者の説明
書に従って精製した。標識リボプローブの品質はポリアクリルアミド−尿素ゲル
電気泳動によって確証した。
を含有する)を、挿入cDNAのいずれかの側でポリリンカー中に切断するXab
IまたはHind III制限酵素のいずれかを用いて線状化した。アンチセンスおよび
センス10−29リボプローブをインビトロで、それぞれT7またはSP6RN
Aポリメラーゼ(Pharmacia Biotech)のいずれかを用いて[35S]UTP(約
800Ci/mmol;Amersham, Oakville, Ontario)の存在下に転写した。転写
後DNA鋳型をDNアーゼI(Pharmacia)で消化した。リボプローブは、ついで
ProbeQuantG-50マイクロカラム(Pharmacia Biotech, USA)上で製造業者の説明
書に従って精製した。標識リボプローブの品質はポリアクリルアミド−尿素ゲル
電気泳動によって確証した。
【0058】 in situハイブリダイゼーション:切片を 0.1Mリン酸塩緩衝液(pH7.4)中
4%パラホルムアルデヒドに室温(RT)で10分間固定し、2×標準クエン酸
ナトリウム緩衝液(SCC:0.15M NaCl, 0.015Mクエン酸ナトリ
ウム,pH7.0)を3回変えて濯いだ。ついで切片を0.1Mトリエタノールアミ
ン中に平衡化し、トリエタノールアミン中0.25%無水酢酸で処理し、2×S
SC中で濯ぎ、一連のエタノール(50〜100%)にて脱水した。ハイブリダ
イゼーションは75%ホルムアミド(Sigma, St-Louis, Mo),600mM NaC
l、10mM Tris (pH7.5)、1mM EDTA、1×デンハルト溶液(Sigma)、
50mg/mlの変性サケ***DNA(Sigma)、50mg/mlの酵母t−RNA(Sig
ma)、10%デキストラン硫酸(Sigma)、20mMジチオスレイトールおよび[3 5 S]UTP−標識cDNAプローブ(10×106cpm/ml)を含有する緩衝液
中、加湿チャンバー内において55℃で18時間で実施した。ハイブリダイゼー
ション後、スライドを2×SSC中室温で濯ぎ、RNアーゼ緩衝液(10mM Tri
s, 500mM NaCl, 1mM EDTA,pH7.5)中20mg/mlのRNアーゼI
A(Pharmacia)により室温で 45分間処理し、最終緊縮度0.1×SSCに洗浄
した。切片をついで脱水し、Kodak Biomax MRフィルムへの17〜21日間露
出および/または蒸留水により1:1に希釈したKodak NTB2乳化液への浸漬およ
び6週間4℃で露出したのち、現像およびクレシルバイオレットアセテート(Si
gma)対向染色に付した。
4%パラホルムアルデヒドに室温(RT)で10分間固定し、2×標準クエン酸
ナトリウム緩衝液(SCC:0.15M NaCl, 0.015Mクエン酸ナトリ
ウム,pH7.0)を3回変えて濯いだ。ついで切片を0.1Mトリエタノールアミ
ン中に平衡化し、トリエタノールアミン中0.25%無水酢酸で処理し、2×S
SC中で濯ぎ、一連のエタノール(50〜100%)にて脱水した。ハイブリダ
イゼーションは75%ホルムアミド(Sigma, St-Louis, Mo),600mM NaC
l、10mM Tris (pH7.5)、1mM EDTA、1×デンハルト溶液(Sigma)、
50mg/mlの変性サケ***DNA(Sigma)、50mg/mlの酵母t−RNA(Sig
ma)、10%デキストラン硫酸(Sigma)、20mMジチオスレイトールおよび[3 5 S]UTP−標識cDNAプローブ(10×106cpm/ml)を含有する緩衝液
中、加湿チャンバー内において55℃で18時間で実施した。ハイブリダイゼー
ション後、スライドを2×SSC中室温で濯ぎ、RNアーゼ緩衝液(10mM Tri
s, 500mM NaCl, 1mM EDTA,pH7.5)中20mg/mlのRNアーゼI
A(Pharmacia)により室温で 45分間処理し、最終緊縮度0.1×SSCに洗浄
した。切片をついで脱水し、Kodak Biomax MRフィルムへの17〜21日間露
出および/または蒸留水により1:1に希釈したKodak NTB2乳化液への浸漬およ
び6週間4℃で露出したのち、現像およびクレシルバイオレットアセテート(Si
gma)対向染色に付した。
【0059】 結果:ヒト成人脊髄におけるクローン10−29の発現パターンはフィルムオ
ートラジオグラフィーのレベルおよび高分解能乳化液オートラジオグラフィーに
よる両者で明らかなように全くユニークである。調べたすべてのセグメントレベ
ル(頚椎、胸椎および腰椎)で、わずか数個のニューロンが10−29mRNA
を特異的に発現し、これらの細胞は脊髄白質の機能的に独特な3つの領域、すな
わち膠様質、クラーク核および前角に限定されていた。膠様質内では、あまり多
くない割合(<10%)の小さい、高度に標識されたニューロンが視野を通じて散
在していた。クラーク核におけるハイブリダイゼーションシグナルは、きわめて
高レベルの10−29mRNAを発現する数個の個々の細胞で劇的であった。顕
微鏡解析により、シグナルはすべてではないが大部分、クラーク核の大きなニュ
ーロンにもっぱら結合していることが明らかになった。これらのニューロンはそ
れらの軸索を側索に送って後方脊髄小脳路を形成し、また下肢の固有受容情報の
処理に関与する。前角内では、大きな運動ニューロンの少数(切片あたり細胞約
10個)が標識されていたが、その程度ははるかに低かった。
ートラジオグラフィーのレベルおよび高分解能乳化液オートラジオグラフィーに
よる両者で明らかなように全くユニークである。調べたすべてのセグメントレベ
ル(頚椎、胸椎および腰椎)で、わずか数個のニューロンが10−29mRNA
を特異的に発現し、これらの細胞は脊髄白質の機能的に独特な3つの領域、すな
わち膠様質、クラーク核および前角に限定されていた。膠様質内では、あまり多
くない割合(<10%)の小さい、高度に標識されたニューロンが視野を通じて散
在していた。クラーク核におけるハイブリダイゼーションシグナルは、きわめて
高レベルの10−29mRNAを発現する数個の個々の細胞で劇的であった。顕
微鏡解析により、シグナルはすべてではないが大部分、クラーク核の大きなニュ
ーロンにもっぱら結合していることが明らかになった。これらのニューロンはそ
れらの軸索を側索に送って後方脊髄小脳路を形成し、また下肢の固有受容情報の
処理に関与する。前角内では、大きな運動ニューロンの少数(切片あたり細胞約
10個)が標識されていたが、その程度ははるかに低かった。
【0060】 クローン10−29受容体mRNAの発現は、ヒト胎児脊髄の膠様質および後
根神経節(DRG)にも観察された。成人DRGにおけるクローン10−29の
発現はまだ検討しないで残っている。35S−標識センスプローブによる標準ハイ
ブリダイゼーション対照は陰性であった。
根神経節(DRG)にも観察された。成人DRGにおけるクローン10−29の
発現はまだ検討しないで残っている。35S−標識センスプローブによる標準ハイ
ブリダイゼーション対照は陰性であった。
【0061】 ラット脳切片に対するヒト10−29プローブを用いた予備的な研究では陽性
の結果が得られている。弱いが特異的なハイブリダイゼーションシグナルが海馬
のCA錐体細胞上に検出された。
の結果が得られている。弱いが特異的なハイブリダイゼーションシグナルが海馬
のCA錐体細胞上に検出された。
【0062】 本明細書に引用されたすべての参考文献は引用により本明細書に加入される。
以上、本発明を詳細に説明したが、本技術分野の熟練者には、本発明は本発明ま
たはその実施態様の精神または範囲に影響することなく、広範かつ均等な範囲の
条件、パラメーター等で実施できることは容易に理解できよう。
以上、本発明を詳細に説明したが、本技術分野の熟練者には、本発明は本発明ま
たはその実施態様の精神または範囲に影響することなく、広範かつ均等な範囲の
条件、パラメーター等で実施できることは容易に理解できよう。
【0063】
【配列表】
【図1】 実施例の項に記載された方法で構築されたクローンの完全なヌクレオチド配列
を含有する。このクローンはInternational Depository Authority Deutsche Sa
mmulung Von Mikroorganismen Und Zellkulturen GmbH (DSMZ), Mascheroder We
g 1 B, D-38124 Braunschweig, Germany に寄託された。寄託(プラスミドpcD
NA 3-10-29-FL)は1998年4月9日に行われ、受入番号DSM 12021を与え
られている。ヒトNLRのアミノ酸配列はヌクレオチド65に始まり、ヌクレオ
チド1310に始まる停止コドンで終結する。
を含有する。このクローンはInternational Depository Authority Deutsche Sa
mmulung Von Mikroorganismen Und Zellkulturen GmbH (DSMZ), Mascheroder We
g 1 B, D-38124 Braunschweig, Germany に寄託された。寄託(プラスミドpcD
NA 3-10-29-FL)は1998年4月9日に行われ、受入番号DSM 12021を与え
られている。ヒトNLRのアミノ酸配列はヌクレオチド65に始まり、ヌクレオ
チド1310に始まる停止コドンで終結する。
【図2】 ヒトNLRの推定アミノ酸配列を示す。図1のポリヌクレオチドは長さ415
のアミノ酸のタンパク質をコードする。
のアミノ酸のタンパク質をコードする。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 FI テーマコート゛(参考) C12N 1/21 C12P 21/08 4H045 5/10 C12Q 1/02 C12P 21/08 1/68 A C12Q 1/02 G01N 33/15 Z 1/68 33/50 Z G01N 33/15 C12N 15/00 ZNAA 33/50 5/00 A (81)指定国 EP(AT,BE,CH,CY, DE,DK,ES,FI,FR,GB,GR,IE,I T,LU,MC,NL,PT,SE),OA(BF,BJ ,CF,CG,CI,CM,GA,GN,GW,ML, MR,NE,SN,TD,TG),AP(GH,GM,K E,LS,MW,SD,SL,SZ,UG,ZW),E A(AM,AZ,BY,KG,KZ,MD,RU,TJ ,TM),AE,AL,AM,AT,AU,AZ,BA ,BB,BG,BR,BY,CA,CH,CN,CU, CZ,DE,DK,EE,ES,FI,GB,GD,G E,GH,GM,HR,HU,ID,IL,IN,IS ,JP,KE,KG,KP,KR,KZ,LC,LK, LR,LS,LT,LU,LV,MD,MG,MK,M N,MW,MX,NO,NZ,PL,PT,RO,RU ,SD,SE,SG,SI,SK,SL,TJ,TM, TR,TT,UA,UG,US,UZ,VN,YU,Z A,ZW (72)発明者 ジャック・カウ カナダ国ケベック・エイチ4エス・1ゼッ ド9.サンローラン.フレデリック−バン ティング7171.アストラゼネカ・アール・ アンド・ディー・モントリオール (72)発明者 ダイアン・オドネル カナダ国ケベック・エイチ4エス・1ゼッ ド9.サンローラン.フレデリック−バン ティング7171.アストラゼネカ・アール・ アンド・ディー・モントリオール (72)発明者 フィリップ・ウォーカー カナダ国ケベック・エイチ4エス・1ゼッ ド9.サンローラン.フレデリック−バン ティング7171.アストラゼネカ・アール・ アンド・ディー・モントリオール Fターム(参考) 2G045 AA40 DA36 FB03 4B024 AA01 AA11 BA44 BA63 CA04 CA09 CA12 CA20 DA01 DA02 DA05 DA12 EA04 GA03 HA13 HA14 4B063 QA01 QA05 QA13 QQ21 QQ41 QQ61 QQ79 QR08 QR32 QR35 QR40 QR42 QR56 QR62 QR77 QR80 QS25 QS33 QS34 QX02 4B064 AG20 AG27 CA02 CA05 CA10 CA11 CA19 CA20 CC01 CC24 DA01 DA13 4B065 AA01X AA58X AA72X AA87X AA93Y AB01 AB05 AC14 BA02 BA08 CA24 CA25 CA44 CA46 4H045 AA10 AA11 AA20 AA30 BA40 CA40 DA50 DA76 EA20 EA50 FA72 FA74
Claims (24)
- 【請求項1】 機能的に配列番号1と一致するアミノ酸配列からなる天然に
存在する以外のタンパク質。 - 【請求項2】 上記アミノ酸配列は本質的に配列番号1のアミノ酸配列と一
致する請求項1記載のタンパク質。 - 【請求項3】 請求項1または2のいずれかに記載のタンパク質からなる医
薬的に許容される製剤を抗体産生可能な動物に注射する工程からなる方法により
作成される抗体。 - 【請求項4】 上記動物はマウスであり、上記方法はさらに上記マウスから
の脾臓細胞を骨髄腫細胞と融合させて上記タンパク質に結合するモノクローナル
抗体を産生させることからなる請求項3記載の方法。 - 【請求項5】 請求項2記載のタンパク質に優先的に結合する抗体。
- 【請求項6】 機能的に配列番号1の配列と一致するアミノ酸配列からなる
タンパク質をコードする天然に存在する以外のポリヌクレオチド。 - 【請求項7】 上記ポリヌクレオチドは本質的に配列番号1のアミノ酸配列
と一致するタンパク質をコードする請求項6記載のポリヌクレオチド。 - 【請求項8】 請求項6または7のいずれかに記載のポリヌクレオチドから
なる発現ベクター。 - 【請求項9】 請求項8記載のベクターによってトランスフォームされた宿
主細胞。 - 【請求項10】 請求項9記載の宿主細胞によって産生される組換えニュー
ロテンシン様受容体(NLR)。 - 【請求項11】 上記ポリヌクレオチドは本質的に配列番号2のヌクレオチ
ド65〜1309と一致する請求項7記載のポリヌクレオチド。 - 【請求項12】 請求項11記載のポリヌクレオチドから構成される発現ベ
クター。 - 【請求項13】 請求項12記載のベクターでトランスフォームされた宿主
細胞。 - 【請求項14】 試験化合物がニューロテンシン様受容体に結合する能力を
アッセイする方法において、 a) 上記ニューロテンシン様受容体を含有するソースを i) 上記ニューロテンシン様受容体に結合することが既知のリガンド ii) 上記試験化合物 とインキュベートし、 b) 上記リガンドの結合が上記試験化合物によって置換される程度を測定する ことからなるアッセイ方法。 - 【請求項15】 上記ニューロテンシン様受容体は配列番号1に示す配列を
有する請求項14記載の方法。 - 【請求項16】 試験化合物がニューロテンシン様受容体のアゴニストであ
るかどうかを決定する方法において、 a) 上記ニューロテンシン様受容体を発現する細胞を上記試験化合物とインキ
ュベートし、 b) 上記試験化合物が細胞内アデニルサイクラーゼ活性または細胞内カルシウ
ム濃度のいずれかの統計学的に有意な増加を起こすかどうかを測定する ことからなる方法。 - 【請求項17】 上記ニューロテンシン様受容体は配列番号1に示す配列を
有する請求項16記載の方法。 - 【請求項18】 試験化合物がニューロテンシン様受容体のアンタゴニスト
であるかどうかを決定する方法において、 a) 上記ニューロテンシン様受容体をコードするDNAをそれがプロモーター
に作動的に連結するように発現ベクター中に導入し、 b) 上記発現ベクターを宿主細胞にトランスフェクトし、 c)i) 細胞内アデニルサイクラーゼ活性の統計学的に有意な増加、または ii) 細胞内カルシウム濃度の統計学的に有意な増加 のいずれかによって明らかな構成的に活性なニューロテンシン様受容体を有する
工程b)においてトランスフェクトされた細胞を選択し、 d) 工程c)において選択された細胞を試験化合物と接触させ、ついで e) 試験化合物が、試験化合物と接触させなかった対照細胞に比べて上記アデ
ニルサイクラーゼ活性または上記カルシウム濃度のいずれかの統計学的に有意な
低下を起こすかどうかを測定する ことからなる方法。 - 【請求項19】 上記ニューロテンシン様受容体は配列番号1に示す配列を
有する請求項18記載の方法。 - 【請求項20】 試験化合物がニューロテンシン様受容体の活性を変化させ
る能力をアッセイする方法において、 a) 上記ニューロテンシン様受容体を含有するソースを i) 上記ニューロテンシン様受容体に特異的に結合するリガンド ii) 上記試験化合物 とインキュベートし、 b) 上記試験化合物が上記リガンドに反応して細胞内カルシウム濃度を増加ま
たは低下させるかどうかを決定する ことからなるアッセイ方法。 - 【請求項21】 上記ニューロテンシン様受容体は配列番号1に示す配列を
有する請求項20記載の方法。 - 【請求項22】 試験化合物がニューロテンシン様受容体の発現を変化させ
る能力をアッセイする方法において、 a) 上記NLRを発現する細胞を増殖させ、 b) 上記細胞を集め、 c) 上記試験化合物に暴露した細胞における受容体発現を本質的に同一な条件
下に増殖させたが上記試験化合物には暴露しなかった対照細胞の場合と比較する
ことからなるアッセイ方法。 - 【請求項23】 上記ニューロテンシン様受容体を発現する細胞は配列番号
1に示す配列と本質的に一致するアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする
ポリヌクレオチド配列からなる発現ベクターでトランスフォームされた細胞であ
る請求項22記載の方法。 - 【請求項24】 上記試験化合物は長さが少なくとも15ヌクレオチドのオリ
ゴヌクレオチドであり、上記ニューロテンシン様受容体の配列と相補性の配列か
らなる請求項22または23のいずれかに記載の方法。
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---|---|---|---|---|
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WO2001057524A1 (fr) * | 2000-02-04 | 2001-08-09 | Takeda Chemical Industries, Ltd. | Procede de criblage |
WO2001062924A2 (en) * | 2000-02-24 | 2001-08-30 | Pharmacia & Upjohn Company | Human g protein-coupled receptors |
WO2001068858A2 (en) * | 2000-03-16 | 2001-09-20 | Pharmacia & Upjohn Company | Human g protein-coupled receptors |
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-
2004
- 2004-07-14 US US10/890,407 patent/US7238780B2/en not_active Expired - Fee Related
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Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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