JP3070763B2 - テクネチウムまたはレニウムでの抗体または他のタンパク質の直接放射能標識 - Google Patents

テクネチウムまたはレニウムでの抗体または他のタンパク質の直接放射能標識

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Description

【発明の詳細な説明】 関連出願へのクロス・リファレンス 本出願は、“Padiolabelling Antibodies and Other
Proteins with Technetium or Rhenium by Regulated R
eduction"という題目の1989年８月９日に出願の米国特
許出願第07/391,474号の一部継続出願である。前記出願
の教示は本明細書に参考として組み込まれる。
発明の背景 発明の分野（技術分野） 本発明は、抗体を包含するタンパク質をテクネチウム
またはレニウムの放射性同位体例えばテクネチウム−99
mで放射能標識するための方法、組成物およびキットに
関する。
37 C.F.R 1.97−1.99章に開示された情報を含む関連技
術の記載（背景技術） タンパク質を放射能標識するための放射性同位体の使
用は公知である。それらの組成物はアッセイにおいて利
用することができ、体の種々の部分の機能を視覚化また
はモニタリングするためにあるいは特定の抗原、抗体、
ホルモン等の存在および位置を決定するために人体に投
与することができ、そして種々の病的状態の治療に使用
することができる。様々な放射性同位体、例えばヨウ
素、テクネチウム、インジウムおよびレニウムの放射性
同位体が使用されている。タンパク質分子をテクネチウ
ム−99mで標識して診断剤または画像診断剤を形成せし
めることができることも公知である。
テクネチウム−99mは、過テクネチウム酸ナトリウム
を使用する方法により、タンパク質、キレート剤、ホス
ホネート骨走査用組成物等を放射能標識するのに使用さ
れている。ここでテクネチウムは最初は＋７状態にあ
る。テクネチウム−99mは通常、過テクネチウム酸ナト
リウムとしてのみ入手可能である。過テクネチウム酸塩
は、テクネチウムを＋3,＋４または＋５の酸化状態まで
還元するために、放射能標識しようとするタンパク質、
キレート剤または同様な物質の存在下において還元剤、
例えば塩化第一錫と接触させなければならない。テクネ
チウム分子と放射能標識しようとする基質と間の化学結
合を維持するためにテクネチウムをこの還元状態に維持
しなければならない。還元されたテクネチウムが、アッ
セイ媒質中、患者の血液中または放射能標識物質が使用
されるであろう他の媒質中に存在する別の分子または別
のタンパク質に転移しないように、テクネチウムをタン
パク質に強固に結合せしめることも必要である。
幾つかの異なる方法は、タンパク質、特にモノクロー
ナル抗体をテキネチウム−99mで放射能標識することを
使っている。この方法は２つの一般的アプローチを含
む。１つは間接アプローチであり、二価性キレート剤が
１つの官能基を介してタンパク質に取り付られ、そして
もう１つの官能基またはキレート基を介してテクネチウ
ム−99mが取り付けられる。この方法はKrejcarek,G.E.
およびTucker,K.L.（“Covalent Attachment of Chelat
ing Groups to Macromolecules,"Biochemical and Biop
hysical Research Communications 第77巻,581−585
頁,1977）により導入され、そして種々の二価性キレー
ト剤、例えばWenselおよびMeares（Wensel,T.G.およびM
eares,C.F.,“Bifunctional Chelating Agents for Bin
ding metal Ions to Proteins,"Radioimmunoimaging an
d Radioimmunotherapy,S.W.BurchielおよびB.A.Rhodes
編,Elsevier Publishing Co.,New York,185−196頁,198
3）に記載されたものを使って、多数の変形において広
く使用されている。別の方法がHnatowich,D.J.,米国特
許第4,668,503号および第4,479,930号により、Hablr,E.
およびKhaw,B.A.,米国特許第4,421,735号により、Fritz
berg,A.R.およびKasina,S.,米国特許第4,670,545号によ
り、並びにBaidoo,K.E.ら，“99mTc Labeling of Prote
ins:Initial Evaluation of Novel Diaminedithiol Bif
unctional Chelating Agent,"Cancer Res（Supp）第50
巻、799s−803s頁,1990により、開示されている。これ
らの二価性キレート方法は全て、放射能標識手順の複雑
さ、放射能標識を達成するのに要する時間、並びにタン
パク質に影響を与え得る物質の導入および存在といった
明白な制限を有する。
もう１つの一般的アプローチは直接標識である。幾つ
かの直接法が報告されているけれども、生体内適用のた
めのタンパク質とテクネチウム−99mとの間に十分に強
い結合を提供することができる最初の直接法は、“Meth
od for Radiolabeling Proteins with Technetium−99
m"という題目のCrockford,D.R.およびRhodes,B.A.への
米国特許第4,424,400号に記載された直接または予備錫
はんだ法であった。この方法では、塩化第一錫［Sn（I
I）］と酒石酸塩およびフタル酸塩から成る単一還元溶
液が使用される。この溶液は、（１）タンパク質を還元
し、それによって反応性スルヒド基を暴露せしめ、
（２）還元されたタンパク質の反応性スルフィド基を保
護し、（３）過テクネチウム酸ナトリウムを還元し、そ
して（４）還元されたTc−99mと錯生成させそれを還元
されたタンパク質のスルフィド結合部位に転移させるた
めに働く。この方法を使って、多数のタンパク質を好結
果にテクネチウム−99mで放射能標識することができ
る。何人かの発明者らがこの方法の利用について報告し
ている（Rhodes,B.A.ら、“Technetium−99m Labeling
of Murine Monoclonal Antibody Fragments,"Journal o
f Nuclear medicine,27巻,685−693頁,1986;Som,P.ら、
“Radioimmunoimaging of Experimental Thrombi in Do
gs Using Technetium−99m−Labeled monoclonal Antib
ody Fragments Reactive with Human Platelats,"Journ
al of Nuclear Medicine,第27巻，第８号,1315−1320
頁,1986）。
他の初期の直接標識法も報告されているが、安定なTc
−タンパク質結合を与えなかった。従来方法〔Stern,H.
S.ら、Radioactive Pharmaceuticals,U.S.Atomic Energ
y Commission（1966），テキスト19章,359−375頁;Lin,
M.S.ら、“Use of Fe（II）or Sn（II）Alone for Tech
netium Labeling of Albumin,"Journal of Nuclear Med
icine,第12巻，第５号,204−211頁,1970;Eckelman,W.C.
ら、“99mTc−Human Serum Albumin,"Journal of Nucle
ar Medicine,第12巻，第11号,707−710頁,1971;Wong,D.
W.ら、“A Rapid Chemical Method of Labeling Human
Plasma Proteins with 99mTc−Pertechnetate at pH7.
4,"International Journal of Applied Radiation and
Isotopes,第29巻,251−253頁,1978;Colombetti,L.G.
ら、“A Rapid Method for Labeling IgG with 99m−T
c,"Journal of Nuclear Medicine,第20巻,652頁,1979;R
hodes,B.A.,米国特許第4,305,992号，“labeling Prote
ins With 99m−Tc by Ligand Exchange"〕におけるTc−
タンパク質結合の不安定性の理由は、タンパク質と還元
された放射性核種との間の強力な結合の形成に必要であ
る反応性スルフィド基を提供するようにタンパク質が還
元されなかったことであった。
その後、米国特許第4,424,200号の方法の変形を使っ
た多数の方法が報告された。それらの変形は一般に次の
ものの１つまたは複数を含む：（１）タンパク質を還元
するのにSn（II）以外のジスルフィド還元剤、例えば２
−メルカプトエタノール、ジチオトレイトールおよびそ
れらの類似体を使用する；（２）Sn（II）以外の反応性
スルフィド基保護剤、例えばZn（II）を使用する；
（３）Sn（II）以外の過テクネチウム酸塩還元剤、例え
ばジチオトレイトールを使用する；および（４）還元さ
れたテクネチウムを結合しそしてそれをタンパク質のス
ルフィド基に転移させるのに酒石酸塩以外の錯生成剤、
例えばホスホネートを使用する。
それらの方法は、一般に、米国特許第4,424,200号の
方法を上回る改善をもたらさなかった。開示された方法
はいずれも、本明細書において開示される方法、組成物
およびキットを使って達成されるものに匹敵する結果を
与えない。
Schwarz,A.およびSteinstruaber,A.,“A Novel Appro
ach to Tc−99m−Labeled Monoclonal Antibodies,"jou
rnal of Nuclear Medicine,第28巻,721頁,1987、並びに
Bremer,K.H.ら、欧州特許出願第0 271 806 A2（1987年1
2月８日出願）は、タンパク質のジスルフィド基をモノ
チオール、例えば２−メルカプトエタノールまたは２−
メルカプトエチルアミンで還元している。過テクネチウ
ム酸塩を還元するのにSn（II）を使用し、そして還元さ
れたテクネチウムをホスホネートまたはピロホスフェー
トと錯生成させる。この方法は、放射能標識を達成する
のに２以上のバイアルおよび多数の段階を必要とする。
使用されるホスホネートは最終生成物中にラジオコロイ
ド不純物を生成しうる。その上、ジスルフィド基を還元
するのに用いる化学物質、例えば２−メルカプトエタノ
ールは、潜在的に毒性である。
Reno,J.W.ら、米国特許第4,877,868号,Radionuclide
Antibody Couplingおよび欧州特許出願第0 237 150号
（1987年１月19日出願）は、タンパク質のジスルフィド
基を還元するのにジチオトレイトール（DTT）を使用
し、次いでZn（II）または他のスルフヒドリル基誘導試
薬で反応性スルフィドを保護している。それらは還元さ
れた放射性核種と錯生成しそしてそれらを転移せしめる
のに酒石酸塩を用いる。この方法は、抗体を還元するの
に潜在的に毒性の化学物質、例えばジチオトレイトール
を使用している。この方法もタンパク質を放射能標識す
るのに多数の段階を必要とする。
Pak,K.Y.ら、“A Rapid and Efficient Method for L
abeling IgG Antibodies with Tc−99m and Comparison
to Tc−99m Fab′ Antibody Fragment,"Journal of Nu
clear Medicine,第30巻,793頁,1989、および特許協力条
約（PCT）国際特許出願第WO 88/07382号（1988年４月１
日出願）は、抗体を還元するのにジチオトレイトールを
使用している。酒石酸塩もしくはグルコヘプトン酸塩ま
たはそれらの類似体を添加し、還元された放射性核種と
錯生成しそして転移せしめる。この方法も同様に潜在的
に毒性の化学物質を使用しており、放射能標識するのに
複数の段階を必要とする。
Schochat,D.ら、欧州特許出願第0 336 678号（1989年
４月３日出願）は、従来のジスルフィド還元剤、例えば
システイン、ジチオトレイトール、２−メルカプトエタ
ノール、ジチオニット等を使用する。それらは米国特許
第4,424,200号の予備はんだ法が十分に機能しないこと
を主張しており、血液もしくは他の体液または組織の存
在下で比較的不安定である部位に放射性金属がいくらか
結合することを指摘している。それらは用途において単
一の例、即ちTc−99m−抗−CEA−Fab′の調製、を与え
ており、この例は正確には上記特許第′200号のもので
あると思われる。過テクネチウム酸ナトリウムを還元す
るためのSn（II）の使用は従来技術において公知であ
り、そして上記特許第′200号や他の参考文献に開示さ
れている。
他の方法を上回るタンパク質のジスルフィドを還元す
るSn（II）法の利点は、Sn（II）がジスルフィド結合を
還元し且つ還元により形成されたスルフィドと錯生成し
て非反応性ジスルフィドに戻らないようにスルフィドを
保護することである。タンパク質のジスルフィド基を還
元するのにDTTのような有機還元剤を使用する時には、
スルフィド保護剤を付加する前に還元剤を除去しなけれ
ばならない。そうでなければ、通常は沈澱の形成によっ
て、保護基が還元剤と反応してしまうだろう。還元剤と
スルフィド保護剤との反応を回避するために還元剤を先
ず除去する場合、還元されたタンパク質は一定期間の間
放置され、その間に反応性スルフィド基が非反応性ジス
ルフィド結合を再形成し得る。本発明に記載されるSn
（II）還元法は、それがジスルフィドの同時還元・錯体
化を可能にするという点で新規である。
上記の４段階法とは化学的に異なる他の直接標識法も
報告されている。Paik,C.H.ら、米国特許第4,652,440
号，“Method of Stably Rabiolabeling Antibodies wi
th Technetium and Rhenium"は、還元された放射性核種
を目当てに競争する強いキレート剤DTPAの存在下でのSn
（II）還元によりタンパク質を標識している。タンパク
質の強力結合Tc−99m標識のみが好ましくはタンパク質
の生来の遊離スルフヒドリル基への結合によって起こ
る。しかしながら、相当な量のTc−99m−DTPAも形成さ
れるので、標識タンパク質を使用する前にこれを除去し
なければならない。この方法は、高収率の強力に結合し
た放射性核種を獲得するのに必要とされるジスルフィド
結合の還元の第一段階を欠いている。
Sundrehagen,E.,PCT国際特許出願WO 85/03231（1985
年１月18日出願）は、過テクネチウム酸塩を還元するの
に使用する低濃度のSn（II）を安定化するのにゲンチジ
ン酸を使用している。この方法は、ラジオコロイドおよ
び酸化された放射性核種といった放射化学不純物を最小
にするのに有用である。この方法は、高収率の強力に結
合した放射性核種を獲得するのに必要とされるジスルフ
ィド結合の還元の第一段階を欠いている。
Lees,R.S.,米国特許第4,647,445号，“Rabiolabelled
Lipoproteins and Method for Making Same"は、過テ
クネチウム酸塩とリポタンパク質を同時に還元するのに
pH8〜９でジチオニットを使用している。この方法は、
使用前に標識生成物をカラムクロマトグラフィーにより
精製して放射性核種不純物を除去することを必要とす
る。
Breedveld,F.C.ら、“Imaging of Inflammatory Arth
ritis with Technetium−99m−Labeled IgG."Journal o
f Nuclear Medicine,第30巻，第12号,2017−2021頁,198
9は、まず過テクネチウム酸塩を塩酸で還元し、次いで
放射性核種を抽出、転移、還元、乾固させる。この乾燥
した還元された放射性核種を含む容器にタンパク質を添
加する。40℃で60分間のインキュベーション中に標識が
達成される。この方法は、放射性核種の多大な前処理を
必要とし、よって薬剤を標識および製剤するためのイン
スタントキット法には容易に応用されない。
McKenzie,I.ら、“Coupling of the 99mTechnetium−
nitrido Group to Monoclonal Antibody and Use of th
e Complexes for the Detection of Tumors in Mice,"J
ournal of the National Cancer Institure,第77巻,431
−439頁,1986、およびPCT国際特許出願WO 87/04164（19
86年１月６日出願）は、抗体を還元して遊離スルフヒド
リル基結合部位を提供するかまたは遊離スルフヒドリル
基結合部位基を導入し、そして該部位を99mTcN（Cl）4 -
で標識する。その生成物は、使用前に放射性核種不純物
を減らすためのゲルクロマトグラフィーにより精製を必
要とする。
従来方法はいずれも、有意な放射化学不純物を含まな
い注入可能な生成物、標識しようとするタンパク質が抗
体である時は免疫反応性を変えずに放射性核種がタンパ
ク質に定量的に且つ強力に結合する生成物、を15分以内
に提供する一段階標識用キットおよび方法を提供するこ
とができなかった。その上、多くの従来方法は潜在的に
毒性の化学物質を使用する。CrockfordおよびRhodesの
予備はんだ法は、タンパク質に強力に結合した放射性核
種を約85％与える迅速な一段階標識方法を提供すること
ができたけれども、放射化学純度は全てのモノクローナ
ル抗体の臨床適用に十分なほど高くはなく、そして生成
物によっては患者への投与前に最後の精製を必要とし
た。本発明では、一段階標識の簡便性を保持したまま、
タンパク質を還元するための最適条件と放射性核種を還
元するための最適条件の両方を達成することができる。
これは製造工程に段階を追加することにより達成され
る。CrockfordおよびRhodesにより記載された初期の予
備はんだ法と同様にしてタンパク質をSn（II）で還元す
る。還元が完了した後、還元されたタンパク質を精製ま
たは複合体形成段階に付し、過剰の還元剤および反応副
生成物、例えば塩化第二錫または他のSn（IV）剤を除去
する。あるいは、有機還元剤を使ってタンパク質を還元
し、有機還元剤および反応生成物を取り出し、そしてSn
（II）を添加してSn（II）および硫黄含有タンパク質複
合体を形成させる。Sn（II）放射性核種還元剤は、その
後の放射能標識に最適である濃度において且つその後の
放射能標識に最適である錯生成剤と共に、還元されたタ
ンパク質溶液に添加される。放射性核種還元溶液と還元
されたタンパク質とをアリコートに分け、凍結し、そし
て所望により放射能標識に必要になるまで凍結乾燥保存
する。
別法は、タンパク質を還元しそしてSn（II）および硫
黄含有タンパク質複合体を形成させるのに最適な試薬の
濃度において上記特許第′200号に開示されたCrockford
およびRhodesの予備はんだ法を使って抗体を還元し、次
いでこの溶液を試薬で希釈して、放射性核種を還元しそ
れをタンパク質に転移させるのに最適な条件を獲得する
ことである。
発明の概要 （発明の開示） 本発明によれば、タンパク質をテクネチウムまたはレ
ニウムで放射能標識する方法であって、還元剤を使って
タンパク質中のジスルフィド結合を還元し；過剰の還元
剤、反応副生成物およびあらゆる不純物を除去し；そし
て、最適な低濃度および限定量の過テクネチウム酸塩ま
たは過レニウム酸塩還元剤を添加し、過テクネチウム酸
ナトリウムまたは過レニウム酸ナトリウムを還元し、リ
ガンド交換反応による還元されたタンパク質の迅速な標
識を促進する方法が提供される。
好ましい態様では、放射能標識しようとするタンパク
質基質を、約4.5〜約8.5のpH、好ましくは約pH5.6を有
する塩化錫（II）組成物の溶液と混合する。該溶液は酒
石酸カリウムナトリウムとフタル酸水素カリウムの混合
物を更に含有し、pHは水酸化ナトリウムを使って約5.6
±0.05に調整され、生じた溶液は酸素パージされる。あ
るいは、該溶液が他の塩、例えば塩化ナトリウム、酢酸
ナトリウム、ゲンチジン酸、またはフッ化第一錫を含ん
でもよい。Sn（II）塩溶液は無酸素環境下でタンパク質
に添加され、タンパク質とSn（II）塩溶液は酸素の非存
在下で室温で数時間（通常は21時間）インキュベートさ
れる。あるいは、インキュベーション期間との対応する
逆変化を使って、例えばインキュベーション温度を増加
させるとインキュベーション期間を減少させるといった
ようにして、高いまたは低いインキュベーション温度を
使用することができる。ある種のタンパク質には、反応
時間を21時間未満短縮して抗体タンパク質の過剰な断片
化を防ぐことができ、タンパク質が既に反応性スルフィ
ド基を含む場合には更に反応時間を減少させることがで
きる。
あるいは、タンパク質をジスルフィド基還元剤、例え
ばジチオトレイトール（DTT）と共に、水溶液1mlあたり
タンパク質5mgあたり10mgのDTTの比においてpH7.5〜9.0
で室温にて30分間インキュベートすることにより、タン
パク質を一層迅速に還元することができる。任意の手段
による精製により還元剤を除去する。この後、希HClを
添加してpHを5.6±0.05に低下させ、次いでpH5.6±0.05
においてSn（II）酒石酸塩を添加する。
インキュベーション後、タンパク質とSn（II）塩溶液
を凍結させて還元反応を停止させるか、または塩類溶液
で平衡化されたカラム中の適当なゲルを使ってサイズ排
除クロマトグラフィーにより精製する。タンパク質およ
び緩衝化されたSn（II）塩溶液をカラム上に負荷し、塩
類溶液を使って溶出させ、溶出液の分子量をモニタリン
グし、そして関連する分画を収集する。必要であれば、
少量のSn（II）溶液を添加する。放射能標識しようとす
るタンパク質に該当する分画を収集し、プールし、限外
濾過により濃縮する。あるいは、タンパク質を他の任意
の適当な手段、例えば透析、限外濾過、沈澱、分取用高
性能液体クロマトグラフィー、アフィニティークロマト
グラフィー、他の形態のクロマトグラフィー、または分
取用等電点電気泳動により精製してもよい。過剰のSn
（II）溶液、Sn（IV）塩、汚染物または放射能標識しよ
うとするタンパク質以外の分子量のタンパク質を実質的
に含まない得られたタンパク質を、無酸素バイアル中で
凍結せしめることができる。
精製され還元されそしてSn（II）複合体形成された凍
結タンパク質に、塩類溶液中の過テクネチウム酸ナトリ
ウムまたは過レニウム酸ナトリウムを還元することので
きる溶液を、この２溶液の即座混合を防ぐような方法で
添加する。純粋な錫ペレットを各々のバイアルに添加す
ることもできる。得られた２溶液の組合せは凍結溶液の
層として調製されるか、またはそうでなければ、還元さ
れ精製されそして凍結されたタンパク質と、過テクネチ
ウム酸ナトリウムまたは過レニウム酸ナトリウムを還元
するための溶液との間の反応を起こすことのないように
調製される。還元され精製されたタンパク質の放射線分
解を防ぐために、そして表面、例えばバイアル壁への還
元され精製されたタンパク質の付着を防ぐために、担体
タンパク質を添加してもよい。担体タンパク質、例えば
非還元ヒト血清アルブミンまたは他の不活性希釈剤、例
えばイノシトール、または他の不活性な糖もしくはアミ
ノ酸、例えばグリシン、の層を添加し、そして層を凍結
させるかまたは他の方法で使用まで他の溶液と混合しな
いように調製する。２つの未混合の溶液を含むバイアル
から酸素を排気せしめる。放射能標識を希望する時の再
構成まで、このバイアルを凍結保存するかまたは凍結乾
燥して保存する。過テクネチウム酸ナトリウムまたは過
レニウム酸ナトリウムを還元するための溶液は、塩化第
一錫、および酒石酸ナトリウムカリウムとフタル酸水素
カリウムの混合物を含んで成り、pHは水酸化ナトリウム
を使って約5.6±0.05に調整され、生じた溶液は酸素パ
ージされる。実際には、同一のSn（II）溶液を使ってタ
ンパク質と過テクネチウム酸ナトリウムまたは過レニウ
ム酸ナトリウムの両方を還元することができる。しかし
ながら、過テクネチウム酸ナトリウムまたは過レニウム
酸ナトリウムを還元するのに使われるSn（II）塩の量お
よび濃度は、タンパク質を還元するのに使われるSn（I
I）塩の量および濃度よりも実質的に少ない。あるい
は、過テクネチウム酸ナトリウムまたは過レニウム酸ナ
トリウムを還元するのに使う溶液は、過テクネチウム酸
ナトリウムまたは過レニウム酸ナトリウムを効率的に還
元し且つ放射能標識しようとするタンパク質を変化させ
ないような任意の物質、例えば酒石酸第一錫、ホスホン
酸第一錫、グルコン酸第一錫、グルコヘプトン酸第一
錫、または過テクネチウム酸塩もしくは過レニウム酸塩
を還元することのできる他の物質から成ることができ
る。塩化第一錫およびあらゆるそのような他の第一錫化
合物を、明細書および請求項においてSn（II）と呼称す
る。過テクネチウム酸ナトリウムまたは過レニウム酸ナ
トリウムを還元するのに過テクネチウム酸塩または過レ
ニウム酸塩還元溶液以外のものは全く必要でない。これ
は、主として放射性核種還元剤の作用によるジスルフィ
ド結合の更なる開裂によって起こりうるタンパク質分解
を防ぐために行われる。
固体の高純度金属錫を、凍結時にまたは凍結後に、酸
化されていない錫ペレットの形でバイアルに添加するこ
とができる。金属錫の添加は、保存および再構成中の酸
化損失を防ぐことができる。
錫ペレット、担体タンパク質および他の不活性希釈剤
と一緒の、得られた還元・精製されたSn（II）および硫
黄含有タンパク質複合体と放射性核種還元溶液との凍結
または凍結乾燥組合せは、酸素の導入を避けながら、Tc
−99m過テクネチウム酸ナトリウムまたは過レニウム酸
ナトリウム溶液と混合される。次いでテクネチウムまた
はレニウムの還元および還元されSn（II）複合体形成さ
れたタンパク質へのテクネチウムまたはレニウムの結合
を考慮して、混合物をある期間（通常は15分間）室温で
インキュベートする。担体タンパク質がもとのバイアル
中に含まれなかった場合には、通常の塩類溶液中のヒト
血清アルブミンまたは他の同様なタンパク質の添加によ
り、この混合物を安定化することできる。
従って本発明は、タンパク質を第一の還元剤と共にイ
ンキュベートしてジスルフィド結合を部分的に還元し、
還元されたSn（II）錯生成されたタンパク質を精製して
過剰の第一の還元剤およびあらゆる不純物を除去し、そ
して過テクネチウム酸塩または過レニウム酸塩を還元す
るのに必要である分だけの第二の還元剤を添加すること
による、反応性スルフィド基を含むタンパク質をテクネ
チウムまたはレニウムの放射性核種で放射能標識して安
定な標識物を得る方法を提供する。好ましい第一の還元
剤は、約5.0〜6.0のpHを有するアルカリ金属フタル酸水
素塩とアルカリ金属酒石酸塩の混合物から成る溶液中の
Sn（II）源である。第一の還元剤は２−メルカプトエタ
ノール、1,4−ジチオトレイトール、2,3−ジヒドロキシ
ブタン−1,4−ジチオール、２−アミノエタンチオールH
Cl塩、２−メルカプトエチルアミン、チオグリコレー
ト、シアニド、システイン、またはジスルフィド結合を
還元することのできる他の物質である。次いでSn（II）
を添加して中間体のSn（II）および硫黄含有複合体を形
成せしめる。好ましい第二の還元剤は、好ましくは約5.
0〜6.0のpHを有するアルカリ金属フタル酸水素塩とアル
カリ金属酒石酸塩の混合物から成る溶液中のSn（II）源
である。第二の還元剤は酒石酸Sn（II）、グルコン酸Sn
（II）、グルコヘプトン酸Sn（II）、ホスホン酸Sn（I
I）、ジチオニット、または過テクネチウム酸塩もしく
は過レニウム酸塩を還元することのできる他の物質であ
ってもよい。タンパク質複合体の精製後、精製されたタ
ンパク質複合体を凍結させ、第二の還元剤を添加し、そ
して使用のために解凍する前に精製タンパク質複合体と
第二の還元剤との間で化学反応が起こらないように第二
の還元剤を即座に凍結させる。タンパク質複合体と第二
の還元剤の凍結後、該組成物を凍結乾燥することも可能
である。第二の還元剤の添加時またはその後、タンパク
質複合体と第二の還元剤との組合せに、酸化されていな
い固体の金属錫を添加することができる。タンパク質複
合体をサイズ排除クロマトグラフィーカラムに通過させ
ることにより、または脱塩カラム、透析、限外濾過、沈
澱、分取用高性能液体クロマトグラフィー、アフィニテ
ィークロマトグラフィーもしくは分取用等電点電気泳動
の使用により精製を行うことができる。タンパク質複合
体と第二の還元剤中のタンパク質の濃度が少なくとも1m
g/ml溶液であり、そしてタンパク質複合体と第二の還元
剤の容量が少なくとも2mlである時、最適な結果が得ら
れる。
本発明は、テクネチウムまたはレニウムの放射性核種
の安定な標識を有するタンパク質を調製する際の使用に
適する組成物を提供する。この組成物は、放射性核種お
よび硫黄含有複合体を形成することができるように還元
されているタンパク質；該タンパク質の更なる還元を引
き起こすことなく過テクネチウム酸塩または過レニウム
酸塩を還元するであろう分だけの過テクネチウム酸塩ま
たは過レニウム酸塩還元用Sn（II）含有化合物；および
所望により、酸化されていない純粋な金属錫を含んで成
る。酸化されていない純粋な金属錫の源は錫ペレットで
あることができる。該組成物は還元されたタンパク質と
して還元された抗体または抗体断片を使って作製するこ
とができる。不活性な担体物質、例えば不活性なまたは
還元されない不活性なタンパク質を組成物に追加しても
よい。該組成物は凍結され、好ましくは４〜６のpHに緩
衝化される。
必要であれば安定剤と共に、精製されたSn（II）およ
び硫黄含有複合体と放射性核種還元溶液との凍結または
凍結乾燥組合せを単一の無酸素バイアル中に含む、放射
能標識にすぐ使用できるキットも提供される。
モノスルフィドまたはジスルフィド結合を有するタン
パク質は、第一のSn（II）剤または上述したような他の
還元剤とのインキュベーションにより放射性核種、例え
ばテクネチウムまたはレニウムで放射能標識することが
できる。インキュベーション期間は、Sn（II）および硫
黄含有複合体の形成を可能にするほど十分でなければな
らない。複合体形成の結果として、Sn（IV）反応副生成
物、例えば塩化第二錫、および他の不純物、例えばタン
パク質断片または重合体が形成され得る。次いで精製段
階を使ってSn（IV）および他の不純物を実質的に除去す
る。次いでSn（II）および硫黄含有タンパク質複合体
に、放射性核種を還元するのに十分な量の第二のSn（I
I）剤を添加する。放射能標識物を添加することにより
放射能標識を行い、それによって第二のSn（II）剤が放
射性核種を還元し、そして還元された放射性核種がタン
パク質中で放射性核種および硫黄含有複合体を形成す
る。
放射能標識は、第二のSn（II）剤の添加の段階を省略
することによって行うこともできる。この場合、残りの
第一のSn（II）剤が放射性核種を還元し、そして還元さ
れた放射性核種がタンパク質中で放射性核種および硫黄
含有複合体を形成する。これは、Sn（II）および硫黄含
有タンパク質複合体を形成せしめた後に反応混合物を希
釈することによって行うこともできる。
それらの方法は、特に過テクネチウム酸ナトリウムの
形のテクネチウム−99mに適用可能である。第一のSn（I
I）剤も第二のSn（II）剤も、最適には5.0〜6.0のpHを
有するアルカリ金属酒石酸塩を含む溶液中に存在する。
第二のSn（II）剤は、グルコヘプトン酸第一錫、グルコ
ン酸第一錫、ホスホン酸第一錫、ジチオニットといった
物質、または放射性核種を還元することのできる他の物
質から成ることもできる。
それらの方法は、特にモノクローナル抗体、モノクロ
ーナル抗体断片およびポリクローナル抗体に適用可能で
ある。この方法を使って生成物を製造することができ、
過テクネチウム酸ナトリウムまたは過レニウム酸ナトリ
ウムの導入およびインキュベーション期間によりテクネ
チウムまたはレニウムで放射能標識した時の生成物が、
85％またはそれ以上のタンパク質に強力に結合したテク
ネチウムまたはレニウムを有することにより更に特徴づ
けられる。更に、モノクローナル抗体またはモノクロー
ナル抗体断片を使って生成物を作る時、該生成物の免疫
反応性は、第一のSn（II）剤とのインキュベーション前
の抗体の免疫反応性と実質的に同じである。生成物は凍
結乾燥することができ、そして患者への生体内投与前に
濾過または精製を必要としない。
モノスルフィドまたはジスルフィド結合を有するタン
パク質は、上記方法の変形を使ってテクネチウムまたは
レニウムのような放射性核種で放射能標識することもで
きる。タンパク質を第一のSn（II）剤（これは上記と同
様であってもよい）と共にインキュベートする。インキ
ュベーション期間はSn（II）および硫黄含有複合体の形
成を可能にするのに十分でなければならない。複合体形
成の結果として、Sn（IV）反応副生成物および他の不純
物が形成され得る。次いでSn（IV）反応副生成物をポリ
アミノカルボン酸、例えばエチレンジアミン四酢酸（ED
TA）またはジエチレントリアミノペンタ酢酸（DTPA）と
錯生成させることができる。放射性核種を添加すること
によって放射能標識が行われ、これによって残余の第一
のSn（II）剤が放射性核種を還元し、そして還元された
放射性核種がタンパク質中で放射性核種および硫黄含有
複合体を形成する。
放射能標識は、最適には、ポリアミノカルボン酸のよ
うな錯生成剤の添加後、放射性核種の還元を促進するた
めに、第二のSn（II）剤の添加によって行うことができ
る。
ポリアミノカルボン酸を使った方法は、特に過テクネ
チウム酸ナトリウムの形のテクネチウム−99mに適用可
能である。好ましくは、第一のSn（II）剤も第二のSn
（II）剤も両方とも、5.0〜6.0のpHのアルカリ金属酒石
酸塩を含む溶液中に存在する。第二のSn（II）剤は、グ
ルコヘプトン酸第一錫、グルコン酸第一錫、ホスホン酸
第一錫といった物質、または放射性核種を還元すること
のできる他の物質から成ることもできる。
ポリアミノカルボン酸を使った方法は、特にモノクロ
ーナル抗体、モノクローナル抗体断片およびポリクロー
ナル抗体に適用可能である。この方法は、過テクネチウ
ム酸ナトリウムまたは過レニウム酸ナトリウムの導入お
よびインキュベーション期間によりテクネチウムまたは
レニウムで放射能標識した時の生成物が85％またはそれ
以上のタンパク質に強力に結合したテクネチウムまたは
レニウムを有することにより更に特徴づけられる生成物
を製造するのに用いることができる。更に、モノクロー
ナル抗体またはモノクローナル抗体断片を使って生成物
を作る時、該生成物の免疫反応性は、第一のSn（II）剤
とのインキュベーション前の抗体の免疫反応性と実質的
に同じである。生成物は凍結乾燥することができ、そし
て患者への生体内投与前に濾過または精製を必要としな
い。
上記方法は全て、Sn（II）と錯生成した反応性スルフ
ィド基を含んで成るSn（II）および硫黄含有複合体が認
められるタンパク様組成物をもたらし、該組成物はテク
ネチウムおよびレニウムといった放射性核種での放射能
標識に適当である。この組成物は、放射性核種を還元す
るのに十分な量のSn（II）還元剤も含んで成ることがで
き、そして錯生成剤、好ましくはポリアミノカルボン
酸、例えばEDTAまたはDTPAを更に含んでもよい。タンパ
ク質はモノクローナル抗体、モノクローナル抗体断片ま
たはポリクローナル抗体であることができ、そして生成
物に変換することができる。生成物は凍結乾燥すること
ができる。過テクネチウム酸ナトリウムの導入およびイ
ンキュベーション期間によりテクネチウムで標識する場
合、生成物がタンパク質に強力に結合した85％またはそ
れ以上のテクネチウムを有することにより更に特徴づけ
られる。それは15分間またはそれ未満のインキュベーシ
ョン期間を必要とすることによっても更に特徴づけられ
る。
従って、本発明の目的は、テクネチウムまたはレニウ
ムでのタンパク質の直接標識方法を提供することであ
り、該方法は最終生成物から望ましくない断片または分
解されたタンパク質成分を排除するであろう。
本発明の他の目的は、放射性同位体としてテクネチウ
ムまたはレニウムを使った放射能標識効率の増加をもた
らす方法を提供することである。
本発明の更なる目的は、放射能標識工程によって抗体
または抗体断片の親和力の低下を引き起こすことなく、
抗体または抗体断片を放射能標識する方法を提供するこ
とである。
本発明の更なる目的は、潜在的に毒性のまたは危険な
化学物質を方法に使用しない、テクネチウムまたはレニ
ウムでタンパク質を標識する方法を提供することであ
る。
本発明の他の目的は、還元された抗体と第一錫イオン
の両方を含有し、そして酸化損失に対して保護する一方
で少量の第一錫イオンを維持するための手段を更に含有
する単一バイアルを使って、最終使用者により放射能標
識を行うことを可能にする方法およびキットを提供する
ことである。該方法は放射能標識を行うのに一段階のみ
を必要とし、即ち過テクネチウム酸ナトリウムの導入の
段階のみを必要とする。
本発明の他の目的、利点および新規特徴並びに更なる
適用可能性の範囲は、一部分は下記の詳細の記載におい
てそして一部分は下記を吟味する時に当業者に明らかと
なるであろうし、または本発明の実施によりわかるであ
ろう。本発明の目的および利点は、添付の請求の範囲に
おいて特に指摘される手段および組合せを使って実現お
よび達成することができる。
発明の好ましい態様の詳細な記載 （発明実施の好ましい態様） 還元され得る１もしくは複数のモノスルフィドもしく
はジスルフィド結合を含む任意のタンパク質、キレート
剤または他の基質を、本発明に従って放射能標識するこ
とができる。代表的な適当な基質としては、いずれかの
源の、ヒト血清アルブミン、フィブリノーゲン、ウロキ
ナーゼ、γ−グロブリン、糖タンパク質、他のタンパク
質および抗体、または抗体断片が挙げられ、そして任意
の手段により作製されたポリクローナル抗体およびモノ
クローナル抗体、並びにキメラ抗体および遺伝子操作さ
れた抗体、並びに上記の全ての抗体断片が挙げられる。
これにはヒトを含む任意の種起源の任意のクラスの免疫
グロブリン、例えばIgG,IgM,IgA,IgDまたはIgM、二また
は複数の抗原もしくはエピトープ特異性を有するキメラ
抗体またはハイブリット抗体、および上記の全ての断
片、例えばＦ（ab′）2,F（ab）2,Fab′,Fab、および他
の断片、例えばハイブリッド断片が挙げられ、そして更
に任意の免疫グロブリンまたは、特異的抗原と結合して
複合体を形成することにより機能的に抗体のように振る
舞う任意の天然の、合成のもしくは遺伝子操作されたタ
ンパク質が挙げられる。本明細書および請求の範囲を通
して使用される「抗体」なる用語および「モノクローナ
ル抗体成分」なる用語は、そのような抗体および抗体断
片を全て含むものを意味する。
精製段階および付随の過剰な還元剤の除去の包括か
ら、本明細書は多数の有意な利点を有する。放射能標識
しようとするタンパク質以外のあらゆる種の還元された
タンパク質（大きいまたは小さい分子量種を含む）の除
去により、還元されたTc−99mを目当てにした競合が排
除される。これは有意に高い放射能標識収率をもたら
す。過テクネチウム酸塩または過レニウム酸塩還元溶液
中の第一錫イオンおよび第二錫イオンの総量をできるだ
け低く維持することにより、追加の還元されたタンパク
質種の形成が最小限にされる。通常、タンパク質中のジ
スルフィド結合を還元するのに要するよりもずっと少量
の第一錫イオンが過テクネチウム酸塩または過レニウム
酸塩を還元するのに必要であり、従って放射能標識しよ
うとするタンパク質中のジスルフィドの追加の還元なし
に過テクネチウム酸塩または過レニウム酸塩の還元を可
能にする。この追加の還元は放射能標識しようとするタ
ンパク質以外のタンパク質種を生成し得る。
本発明は、最終使用者が放射能標識を行うのに一段階
のみ、即ち過テクネチウム酸ナトリウムまたは過レニウ
ム酸ナトリウムの添加および付随のインキュベーション
の段階のみを必要とするので、有意な利点を有する。こ
の有意な単純化は、第一錫イオンと還元された抗体の両
方が担体タンパク質および他の不活性希釈剤と一緒に同
一バイアル中で凍結され、所望により凍結乾燥されるの
で、可能である。錫ペレットまたは別の源の精製された
酸化されていない金属錫の添加は、低濃度の第一錫イオ
ンを保存しそして貯蔵または再構成中の酸化による放射
能標識の損失を防ぐのに役立つ。
本発明を次の非限定例により更に説明する。
実施例Ｉ 酒石酸塩−フタル酸塩溶液中の塩化第一錫から成るSn
（II）還元溶液を作製した。塩化第一錫は、濃塩酸中に
塩化第一錫結晶を0.5Mになるように溶解し、1mlあたり
約94.8mgの塩化第一錫の溶液を得た。使用するまでこの
溶液を密閉され窒素でパージされたバイアル中で保存し
た。塩化第一錫の他の源を使うこともでき、例えば濃塩
酸と接触させた酸化されていない固体の錫ペレットを使
用することができる。
酒石酸カリウムナトリウムとフタル酸水素カリウムの
混合物の酒石酸塩−フタル酸塩溶液を調製した。0.282g
の酒石酸カリウムナトリウムを100mlの蒸留水に溶解
し、これに0.817gのフタル酸水素カリウムを添加した。
10N水酸化ナトリウムを使ってpHを約5.0に調整し、次い
で1N水酸化ナトリウムを使ってpHを5.6±0.05に調整し
た。得られた溶液を攪拌し、そして不活性ガス、例えば
窒素、ヘリウム等をバブリングすることによりこの物質
から酸素をパージした。
パージされた酒石酸塩−フタル酸塩溶液の一部をフラ
スコ中に測り取り、それに一定量の塩化第一錫をゆっく
り添加することにより、Sn（II）還元溶液を作製した。
塩化第一錫を該溶液に添加する時に攪拌棒または類似の
機械を使って攪拌して塩化第一錫の混合を確実にするこ
とが好ましい。100容の緩衝液に対して約１容の塩化第
一錫を使った。pHを連続してモニタリングし、塩化第一
錫が添加されたら、10N水酸化ナトリウムを使ってpHを
約5.0に調整し、次いで1N水酸化ナトリウムを使ってpH
を5.6±0.05に調整した。
全ての段階は無酸素環境下で行われ、溶液に不活性ガ
スをバブリングしながら行ってもよい。得られた溶液に
不活性ガス、例えば窒素、ヘリウム等をバブリングする
ことによりこの物質から酸素をパージする。
あるいは、別のジスルフィド還元剤、例えば２−メル
カプトエタノール、1,4−ジチオトレイトール、2,3−ジ
ヒドロキシブタン−1,4−ジチオール、２−アミノエタ
ンチオール HCl、２−メルカプトエチルアミン、チオグ
リコレート、シアニド、システインまたは他のジスルフ
ィド開裂試薬を使って抗体還元用溶液を作製することが
できる。
還元しようとするタンパク質を窒素でパージされた密
閉バイアル中に入れる。モノクローナル抗体またはその
断片を標識しようとする場合、最小で0.1mg、好ましく
は少なくとも2mgのモノクローナル抗体またはその断片
を、1mg/mlまたはそれ以上、好ましくは1.7mg/mlの濃度
で使用する。モノクローナル抗体、断片または他のタン
パク質は通常の塩類溶液中に希釈することができ、また
は必要であるなら限外濾過により濃縮することができ
る。３容のタンパク質対２容のSn（II）還元溶液のおよ
その比において、タンパク質にSn（II）還元溶液を添加
する。次いでタンパク質とSn（II）還元溶液とを含むバ
イアルを、好ましくは無酸素環境中で、例えば窒素また
は他の不活性ガスが充填された容器中で、インキュベー
トする。タンパク質中のジスルフィド結合の還元を可能
にするのに十分な時間室温でバイアルをインキュベート
する。通常、室温で１〜24時間のインキュベーションが
適当であり、大部分の完全免疫グロブリンについては室
温で21時間のインキュベーションが好ましい。温度を高
くすればインキュベーション時間が減少し、逆に、低温
でのインキュベーションはそれに応じて長いインキュベ
ーション時間を必要とする。タンパク質とSn（II）還元
溶液の混合物を凍結させるか、希釈するか、またはすぐ
に精製に入ることによってインキュベーションを終了さ
せる。
別の還元剤、例えば２−メルカプトエタノール、1,4
−ジチオトレイトール、2,3−ジヒドロキシブタン−1,4
−ジチオール、２−アミノエタンチオール HCl、２−メ
ルカプトエチルアミン、チオグリコレート、シアニド、
システインまたは他のジスルフィド開裂試薬を使用する
時、インキュベーション時間は使用する特定の還元剤に
合わせて調整しなければならない。一般により短いイン
キュベーション時間が要求される。還元溶液を除去した
後、Sn（II）塩を添加してSn（II）および硫黄含有複合
体を形成せしめ、それによって還元されたジスルフィド
基を次の精製段階の間保存する。それらの還元剤を使っ
て行った精製段階は実質的に全ての還元剤を除去しなけ
ればならない。
タンパク質とSn（II）還元溶液または他の還元溶液と
の混合物は、好ましくはサイズ排除クロマトグラフィー
によって精製される。カラムには適当なゲル、例えば低
分子量モノクローナル抗体Ｆ（ab′）２断片の使用に
は、例えばSephacryl−200ゲル（Pharmacia,Piscatawa
y,NJ）が充填される。カラムを適当な溶出緩衝液、例え
ばゲンチジン酸塩緩衝化塩溶液で平衡化する。タンパク
質と還元溶液の混合物をカラムに適用し、溶出緩衝液を
使って分画する。紫外検出器または同様な装置を使って
分画プロフィールを得、そして放射能標識しようとする
タンパク質を含む分画を収集し、プールする。得られた
還元されたタンパク質を、必要であれば、好ましくは1.
7mg/mlの濃度に濃縮する。濃縮は限外濾過によって行う
ことができる。得られた濃縮物を通常の塩類溶液に対し
て透析して残余のSn（IV）塩または他の残余の還元剤を
除去することも可能である。
あるいは、Sn（II）および硫黄含有タンパク質複合体
とSn（II）還元溶液または他の還元溶液との混合物は、
脱塩カラムに該混合物を通し、還元されたタンパク質を
収集し、そしてSn（IV）塩および過剰の還元剤を除去す
ることにより精製することができる。必要なら得られた
溶出液を濃縮しそして透析することができる。この方法
は、過剰のSn（II）溶液、Sn（IV）反応副生成物および
他の還元試薬を除去するであろうが、必ずしも他の不純
物、例えばタンパク質中のジスルフィド結合の過剰還元
から生じるタンパク質の小断片、または還元されたタン
パク質の凝集物を除去するわけではない。それらの小断
片または大凝集物は、モノクローナル抗体の場合、免疫
反応性でないことがあり、または所望のタンパク質のも
のは異なった生体分布を有することがあり、最終生成物
から除去する必要がある。
あるいは、還元されたタンパク質とSn（II）還元溶液
または他の還元溶液との混合物は、外の手段により、例
えば透析、限外濾過、沈澱、分取用高性能クロマトグラ
フィー、アフィニティークロマトグラフィー、他の形態
のクロマトグラフィー、分取用等電点電気泳動、および
当業界で常用される他の精製手段により、精製してもよ
い。
還元されSn（II）と複合体形成され精製されたタンパ
ク質を、好ましくは窒素のような不活性ガスを溶液にバ
ブリングすることにより酸素をパージし、そして無酸素
バイアル中で凍結させることができる。凍結されたタン
パク質溶液を含む各バイアルに、過テクネチウム酸塩還
元溶液を添加し、そして凍結されたタンパク質溶液と過
テクネチウム酸塩還元溶液との間で反応が起こらないよ
うに内容物を即座に凍結または凍結乾燥せしめる。酸化
されていない錫ペレットをこのバイアルに添加してもよ
い。この錫ペレットは極微量のSn（II）に取って代わ
り、そして過テクネチウム酸塩還元溶液中の低濃度の第
一錫イオンを安定化するのに役立ち、更に放射能標識生
成物の貯蔵中の再酸化による放射能標識の損失を防ぐの
に役立つだろう。過テクネチウム酸塩還元溶液は、約１
容の0.5M塩化第一錫を約5,000容の酒石酸塩−フタル酸
塩溶液に添加し、約0.1ミリモルの過テクネチウム酸塩
還元溶液を得ること以外は、Sn（II）還元溶液と同様に
して作製した。約１容の過テクネチウム酸塩還元溶液を
２容の還元されSn（II）と複合体形成され精製されたタ
ンパク質溶液に添加する。最適には、タンパク質溶液が
約1.7mg/mlであり、そして還元されSn（II）と複合体形
成され精製されたタンパク質溶液各1.32mlに、約0.68ml
の過テクネチウム酸塩還元溶液を添加する。
あるいは、グルコヘプトン酸Sn（II）、酒石酸Sn（I
I）、ホスホン酸Sn（II）、ジチオニットおよび他の常
用されるTc−99m放射性医薬キットを使って、過テクネ
チウム酸塩還元溶液を作製することができる。
過テクネチウム酸塩還元溶液は過レニウム酸塩を還元
するのにも使用することができる。本明細書を通した過
テクネチウム酸塩および過レニウム酸塩化合物の記載
は、過レニウム酸塩および過テクネチウム酸塩にも適用
することができる。同様に、本明細書を通したテクネチ
ウムおよびそれの化合物の記載は、レニウムおよびそれ
の化合物に適用することができる。
放射能標識するためには、所望の活性の過テクネチウ
ム酸ナトリウム−Tc−99mを添加し、混合し、そして混
合物をある期間、通常は約15分間、インキュベートす
る。この段階は、大気中の酸素の導入を避けながらまた
は最小にしながら行われる。所望であれば、通常の塩類
溶液中の１％ヒト血清アルブミンまたは他の適当な保護
タンパク質の添加により、得られた放射能標識タンパク
質を安定化することができる。
テクネチウム−Tc−99mの源は、従来99Mo/99mTc発生
器から過テクネチウム酸ナトリウム−Tc−99mとして得
られる。本発明では任意の源の医薬上許容されるテクネ
チウム−Tc−99m源を使用することができる。
あるいはテクネチウムの他の放射性同位体およびレニ
ウムの同位体、例えばRe−186およびRe−188を使用して
もよい。過テクネチウム酸塩よりもむしろ過レニウム酸
塩を還元する時、通常は反応を完了させるためにより高
温およびより長い放射能標識時間を必要とする。
実施例II この実施例は、免疫クロブリンＧ（IgG）を標識する
ための本発明の方法を例示する。IgGは、ヒツジ、ヤ
ギ、マウスまたはヒトといった動物から得られる。過テ
クネチウム酸ナトリウム−Tc−99m U.S.P.は任意の商業
的入手源から得られる。
濃HCl（12M）中の0.5M塩化第一錫0.2mlを40mMフタル
酸水素カリウムおよび10mM酒石酸ナトリウムの溶液（pH
5.6）20mlに添加することにより、Sn（II）ジスルフィ
ド結合還元剤を調製した。曇った色の酸化第一錫を含ま
ない表面を有する酸化されていないSnCl2ペレットに濃
塩酸を添加することにより、塩化第一錫溶液を調製し
た。次いで得られた還元溶液のpHを10M NaOHの添加によ
り5.5に調整し、そして1M NaOHの添加により最終のpH5.
6±0.05に調整した。
0.25mlの免疫グロブリン（ヒト）U.S.P.（Cutter Bio
logical;タンパク質含量15−18％,0.21−0.32Mのグリシ
ンで安定化されている）を7.25mlの注射用蒸留水U.S.P.
で希釈し、そして0.22ミクロンのフィルターに通して濾
過することにより、IgG製剤を調製した。5mlのSn（II）
還元溶液を7.5mlのIgG製剤と混合した。混合溶液を含む
バイアルを封管し、酸素を除去するためにN2ガスでフラ
ッシュした。この混合溶液を遮光下で室温にて21時間保
存してジスルフィド結合の部分還元を許容し、以後還元
されたタンパク質と呼称されるものを形成せしめた。21
時間インキュベーション後、バイアルの内容物をPD−10
脱塩カラム（Pharmacia LKB Biotechnology,Piscatawa
y,NJ）に通し、タンパク質含有分画を収集し、そしてSn
（II）,Sn（IV）および他の塩を含む残りの溶出液を捨
てた。還元されSn（II）と複合体形成されたタンパク質
分画を限外濾過により1.7mg/mlの濃度に濃縮した。還元
されSn（II）複合体形成されたタンパク質の0.5mgアリ
コートを、N2ガス充填され封管された血清バイアル中に
いれ、凍結させた。pH5.6の40mMフタル酸水素カリウム/
10mM酒石酸ナトリウム中の0.1mM SnCl20.5mlからSn（I
I）過テクネチウム酸塩還元溶液を作製した。還元され
た抗体を解凍させることなく、Sn（II）過テクネチウム
酸塩還元溶液を添加し、この溶液を再度凍結させた。無
菌の直径3mmの金属錫を添加し、バイアルをN2でフラッ
シュし、そして放射能標識に必要になるまで−20℃で保
存した。
ガンマグロブリン製剤をTc−99mで放射能標識するた
めに、2.5mCiの放射能を含む過テクネチウム酸ナトリウ
ム−Tc−99m U.S.P.1.0mlをバイアルに添加し、そして
バイアルと内容物を室温に戻し、混合し、15分間放置し
ておいた。生成物の薄層クロマトグラフィー分析は、放
射能の99.6％がタンパク質に結合していることを示し
た。UVとラジオアイソトープ検出器の両方を使った高性
能液体クロマトグラフィーは、Tc−99m溶出がタンパク
質溶出プロフィールと平行であることを示した。
実施例III この実施例は、IgGおよびIgMクラスのモノクローナル
抗体を標識するための本発明の方法を例示する。該抗体
をマウス腹水またはバイオリアクター液から得、95％以
上に精製し、そして0.9％NaCl溶液中1mg/mlより高い濃
度に調製した。
実施例IIと同様にしてSn（II）還元溶液を調製した。
２種類の完全抗体調製物、即ちIgGマウス抗体B72.3およ
びIgMマウス抗体抗SSEA−１を試験した。各抗体調製物
は1.7mg/mlのタンパク質濃度であった。精製タンパク質
溶液各1mlに0.66mlのSn（II）還元溶液を添加した。実
施例IIと同様に混合溶液をインキュベートし、PD−10カ
ラムに通した。還元されたタンパク質分画を限外濾過に
より2mg/mlの濃度に濃縮した。0.5〜2.0mgのタンパク質
を含む還元タンパク質のアリコートを、N2ガス充填され
封管された血清バイアルに入れ、凍結させた。
50mgのゲンチジン酸、0.375μｇのSuCl2および975μ
ｇの酒石酸カリウムナトリウムを、N2ガスを２〜３分間
バブリングさせることにより予め脱酸素されている蒸留
水50mlに溶解することにより、過テクネチウム酸塩還元
溶液を調製した。非常に希薄な（0.05M）NaOHの添加に
よりpHを7.0に調製した。同容量のこの溶液を、還元さ
れSn（II）複合体形成され凍結されたタンパク質溶液の
上に重層し、この溶液を凍結させた。無菌の直径3mmの
錫金属ショットを添加し、バイアルにN2ガスをフラッシ
ュし、そして放射能標識に必要になるまで−20℃で保存
した。
IgGまたはIgM製剤をTc−99mで放射能標識するため
に、2.5mCiの放射能を含む過テクネチウム酸ナトリウム
−Tc−99m,U.S.P.1.0mlを各バイアルに添加し、そして
バイアルと内容物を室温に戻し、混合し、15分間放置し
ておいた。生成物の薄層クロマトグラフィー分析は、放
射能の90.0％〜96.5％がタンパク質に結合していること
を示した。UVとラジオアイソトープ検出器の両方を使っ
た高性能液体クロマトグラフィーは、Tc−99m溶出がタ
ンパク質溶出プロフィールと平行であることを示した。
HPLC分析によりタンパク質に結合していない放射能は検
出されなかった。
実施例IV この実施例はモノクローナル抗体のＦ（ab′）２断片
を標識するための本発明の方法を例示する。この実施例
は、放射能標識生成物の組成が、使用する方法とジスル
フィド結合還元試薬の種類によって異なることも示す。
この実施例は、本方法が、この特定のモノクローナル抗
体断片については、“METHOD FOR RADIOLABELING PROTE
INS WITH TECHNETIUM−99M"という名称のCrockfordおよ
びRhodesの米国特許第4,424,200号の初期の直接標識法
よりも優れていることも示す。Ｆ（ab′）２断片は、マ
ウスモノクローナル抗体のペプシン消化後、ペプシン消
化物中に認められる他の物質からＦ（ab′）２断片を分
離するクロマトグラフィー精製により、95％より高い純
度で得られた。
この実施例で使用するモノクローナル抗体はSorin Bi
otechnica,Italyから入手した。それは予備実験によっ
て予備はんだ法を使った非常に乏しいTc−99m放射能標
識が示されているマウス抗−CEA F（ab′）２であっ
た。
４つの異なる放射能標識方法を使った。１つは米国特
許第4,424,200号に記載された初期の予備はんだ法であ
り、その他の３つは本発明において教示される方法を使
った。それらの４つの方法は下記のように要約すること
ができる。
1. 米国特許第4,424,200号に記載された初期の予備は
んだ法であり、実施例IIに記載のようにSn（II）還元溶
液を調製したが、精製段階を使用せず、そして過テクネ
チウム酸塩還元溶液を添加しなかった。
2. 実施例IIに記載のように抗体断片中のジスルフィド
結合を還元するのにSn（II）還元溶液を使い、第一錫塩
と錫ペレットから成る過テクネチウム酸塩還元溶液を使
用し、PD−10脱塩カラムを使った精製段階を含む本発明
の方法。
3. 抗体断片中のジスルフィド結合を還元するのに２−
メルカプトエタノールを使った本発明の方法。２−メル
カプトエタノールの５％溶液をpH8.0の0.1Mリン酸緩衝
液中に調製した。この溶液1mlを凍結乾燥させた抗体断
片タンパク質1mgに添加し、混合して溶解させた。室温
で１時間インキュベーション後、1.6mlの塩溶液を添加
し、そしてPD−10脱塩カラムに通すことにより溶液中の
他の成分から部分還元タンパク質を分離した。このタン
パク質を限外濾過により1.7mg/mlに濃縮した。次いで実
施例IIに記載のような第一錫塩と錫ペレットとから成る
過テクネチウム酸塩還元溶液を適用した。
4. 抗体断片中のジスルフィド結合を還元するのにジチ
オトレイトールを使った本発明の方法。15.4mgのdl−ジ
チオトレイトール（DTT）を50mM Trisおよび1mM EDTA,p
H8.0の溶液10mlに溶解した。還元しようとするタンパク
質1mgにつき、0.33mlの還元溶液を添加し、混合してタ
ンパク質を溶解させた。還元混合物を37℃で１時間反応
させた。部分還元されたタンパク質をサイズ排除クロマ
トグラフィーにより精製し、そしてもとのＦ（ab′）２
抗体断片の分子量に相当するタンパク質分画を収集し
た。クロマトグラフィー精製断片を限外濾過により0.9
％食塩溶液中1.7mg/mlに濃縮した。次いで実施例IIに記
載の第一錫塩と錫ペレットとから成る過テクネチウム酸
塩還元溶液を適用した。
この４つの調製物それぞれについて、凍結されバイア
ルに入れられた抗体断片を放射能標識し、実施例IIに記
載のようにして試験した。同一の抗体断片を使った４つ
の異なる方法の結果を表１に要約する。
表１は、精製段階を含まず、限定された量の過テクネ
チウム酸塩還元溶液の添加も含まない米国特許第4,424,
200号に開示された最初の予備はんだ法を使った時、こ
の特定のＦ（ab′）２マウスモノクローナル抗体断片を
効率的に放射能標識することができなかったが、本発明
の方法を使った時、特にジスルフィド結合を還元するの
にSn（II）以外の剤を使った時、該抗体断片が効率的に
放射能標識されたことを示す。同じ過テクネチウム酸塩
還元剤、ここではSn（II）、を各方法に使用した。85％
より高い結合を得るように操作条件を最適化しなかっ
た。比較の目的は、本発明の方法を使うことにより結合
がどれくらい大幅に改善されるかを示すことであった。
実施例Ｖ この実施例は、従来の直接もしくは予備はんだ法によ
りまたは他の同等な直接標識法により上手く標識するこ
とができないモノクローナル抗体を標識するための本発
明の方法を例示する。或る種のモノクローナル抗体を用
いた以前の直接標識法の失敗の原因は、抗体の還元中に
抗体の断片化または凝集が起こり、これが異なった分子
量のタンパク質種を生成するためであった。この例は、
Sorin Biomedia,Italyにより提供される抗−CEAマウス
モノクローナルIgGである。この抗体をSn（II）塩で還
元すると、還元されたTc−99mで優先的に標識される少
量の断片が形成される。この抗体をジチオトレイトール
または２−メルカプトエタノールで還元すると、還元さ
れたIgGの二量体またはポリマーが形成され、これもTc
−99mで標識される。本発明の方法では、ジスルフィド
結合還元段階の後、サイズ排除クロマトグラフィーカラ
ムへの通過により抗体が精製される。もとの抗体の分子
量にのみ相当するカラム溶出液は、より小さいまたは大
きいタンパク質種から分離されている。過テクネチウム
酸ナトリウムを還元するのには十分であるが抗体中のジ
スルフィド結合を更に還元しないような量の過テクネチ
ウム酸塩還元溶液を添加し、抗体を放射能標識した。得
られたTc−99m標識タンパク質は正しい分子量のもので
あり、それより小さいまたは大きい分子量の汚染物を含
まなかった。
実施例VI この実施例は高いHPLC収率を得るための精製およびED
TAの使用を例示する。
キメラIgGモノクローナル抗体の４つのアリコートを
実施例IIと同様にしてSn（II）還元剤で還元した。２つ
のアリコートをPD−10カラムへの通過により精製した
後、Sn（II）過テクネチウム酸塩還元溶液を添加した。
残りの２つのアリコートは精製せず、追加のSn（II）過
テクネチウム酸塩還元溶液を添加しなかった。この２組
のアリコートの各々の一方に、エチレンジアミン四酢酸
（EDTA）を放射能標識前に添加した。
HPLC収率により定量的放射化学純度を決定した。この
方法では、強力に結合したTc−99mの存在は、注入され
た全Tc−99m中のHPLCサイズ排除クロマトグラフィーに
おいて回収されるTc−99mの比率に、IgMタンパク質ピー
クの元でのTc−99mの比率をかけたものとして測定され
る。弱く結合したTc−99mはほとんど完全にHPLCカラム
に転移してカラムに結合し、そして未還元のTc−99mは
タンパク質ピークとは別個に溶出する。従ってこの方法
は強力に結合したTc−99mの測定を提供する。
実施例VII この実施例は、Sn（II）によるおよびジチオトレイト
ール（DTT）によるジスルフィド結合の還元の際の反応
性スルフィド基の形成を例示する。ヨードビーズ法を使
ってマウスモノクローナルIgM抗体をＩ−125で標識し
た。アリコートを実施例IIのように調製したSn（II）還
元溶液と共にインキュベートし、21時間までの様々な時
間間隔でアリコートを取り出し、そしてPD−10カラムに
通して還元反応を停止させた。アリコートをDTTともイ
ンキュベートした。塩化ナトリウムを対照として使っ
た。反応性スルフィド基の再酸化を防ぐために、窒素で
パージした塩溶液でPD−10カラムを溶出させた。各アリ
コートの一部を遊離の反応性スルフィド基の測定に使用
し、他の一部をTc−99m標識および強力に結合したTc−9
9mの比率の測定に使用した。
反応性スルフィド基形成は、Thio Avidgel F（Biopro
be,Justin,CA）へのＩ−125標識抗体の相対的結合によ
って決定した。Thio Avidgel Fは、遊離スルフヒドリル
基または反応性スルフィド基を有するタンパク質を結合
する。そのような基が還元剤とのインキュベーション中
に形成されるならば、抗体結合率は反応性スルフィド基
に比例するだろう。Tc−99m標識は、実施例IIのように
調製しこれにヒト血清アルブミンとイノシトールを添加
したSn（II）過テクネチウム塩還元溶液を使って行っ
た。強力に結合したTc−99mの比率は、実施例VIに記載
のHPLC収率によって測定した。
実施例VIII この実施例は、実施例IIのSn（II）還元剤を使った後
でPD−10カラムへ通過させる本発明の方法が、モノクロ
ーナル抗体の免疫反応性に影響を及ぼさないことを例証
する。ミオシンに特異的なＦ（ab′）２抗体をＩ−125
標識ポリクローナル免疫グロブリンで短期標識した。一
部を記載のように還元し、PD−10カラムに通した。還元
されたＦ（ab′）２と未還元のＦ（ab′）２の両者のア
リコートを、標準としてＩ−125標識ポリクローナル免
疫グロブリンを使って同じ濃度になるように調整した。
減少する濃度のＦ（ab′）２抗体を使って両アリコート
において精製重鎖ミオシン抗原に対するELISAを行っ
た。1/2プラトー最大吸光度においてアフィニティー定
数を算出すると、同等であることがわかった。
一般的にもしくは特定的に記載した本発明の反応体お
よび／または操作条件を上記実施例で使用したものに置
き換えることにより、同様な成功を伴って上記実施例を
繰り返すことができる。特に、別のタンパク質、キレー
ト剤、または還元することのできるモノスルフィドもし
くはジスルフィド結合を含む基質をIgG,IgMおよびＦ（a
b′）２モノクローナル抗体の代わりに使用することが
でき；放射能標識しようとする物質中のジスルフィド結
合を還元するのに別の還元剤を使用することができ；還
元剤を除去するのに別の精製方法を使用することがで
き；過テクネチウム酸ナトリウムを還元するのに別の過
テクネチウム酸塩還元剤を使うことができ；そしてテク
ネチウムの同位体の他にレニウムの同位体を使用するこ
とができる。上記は単に例示であり、他の同等な態様も
可能であり、考慮に入れられる。
本発明をそれらの好ましい態様に関して記載してきた
が、他の態様も同じ結果を達成することができ、本発明
の変形および改良は当業者にとって明白であり、そして
そのような変形および同等物は全て、添付された請求の
範囲に包含されるだろう。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ Ｇ０１Ｎ 33/534 Ｇ０１Ｎ 33/60 Ｚ 33/60 Ａ６１Ｋ 43/00 (56)参考文献 特開 昭63−162628（ＪＰ，Ａ) 特表 平３−504858（ＪＰ，Ａ) 米国特許4424200（ＵＳ，Ａ) 米国特許4478815（ＵＳ，Ａ) 国際公開88／7382（ＷＯ，Ａ１) Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．，Ｖｏｌ. 27，Ｎｏ．５（1986）ｐ．685−693 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C07K 16/00 C07K 1/13 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ／Ｌ（ＱＵＥＳＴＥＬ)

Claims (13)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】モノスルフィドまたはジスルフィド結合を
    含むタンパク質を放射性核種で放射能標識して安定な標
    識を得る方法であって、次の段階： ａ）モノスルフィドまたはジスルフィド結合を含むタン
    パク質を第一の還元剤と共にインキュベートし、ここで
    インキュベーション期間は、タンパク質の過剰な断片化
    を防ぐ一方で、利用可能なジスルフィド結合をスルフヒ
    ドリル基に還元するのに十分であり； ｂ）還元されたタンパク質を精製して第一の還元剤およ
    び不純物を実質的に除去し； ｃ）Sn（II）含有および硫黄含有錯体を形成させ且つ次
    の段階で添加される放射性核種を還元するのに十分な量
    において、Sn（II）剤の源を前記還元されたタンパク質
    に添加し；そして ｄ）放射性核種を添加し、それによってSn（II）剤が放
    射性核種を還元し、そして還元された放射性核種および
    還元されたタンパク質が放射性核種含有および硫黄含有
    錯体を形成することにより、前記精製されたタンパク質
    を放射能標識する を含んで成る方法。
  2. 【請求項２】モノスルフィドまたはジスルフィド結合を
    含むタンパク質を放射性核種で放射能標識して安定な標
    識を得る方法であって、次の段階： ａ）モノスルフィドまたはジスルフィド結合を含むタン
    パク質を第一のSn（II）還元剤と共にインキュベート
    し、ここでインキュベーション期間は、タンパク質の過
    剰な断片化を防ぐ一方で、Sn（II）含有および硫黄含有
    錯体の形成を可能にするのに十分であり； ｂ）還元されたタンパク質を精製して錯生成していない
    Sn（II）剤および他の不純物を実質的に除去する一方
    で、次の段階で添加される放射性核種を還元するのに十
    分であるが有意な放射化学不純物を生成しないような量
    のSn（II）を保持し；そして ｃ）放射性核種を添加し、それによってSn（II）剤が放
    射性核種を還元し、そして還元された放射性核種が放射
    性核種含有および硫黄含有錯体を形成することにより、
    前記精製されたタンパク質をSn（II）含有および硫黄含
    有錯体により放射能標識する を含んで成る方法。
  3. 【請求項３】前記第一の還元剤が２−メルカプトエタノ
    ール、1,4−ジチオトレイトール、2,3−ジヒドロキシブ
    タン−1,4−ジチオール、２−アミノエタンチオールHC
    l、２−メルカプトエチルアミン、チオグリコレート、
    シアニド、システインおよびSn（II）から成る群より選
    択された少なくとも１つの化合物を含んで成る、請求項
    １に記載の方法。
  4. 【請求項４】前記第一の還元剤がSn（II）剤であり、こ
    こで前記Sn（II）剤は5.0〜6.0のpHを有するアルカリ金
    属酒石酸塩を含む溶液中に存在し、そして前記モノスル
    フィドまたはジスルフィド結合を含むタンパク質が、Sn
    （II）含有および硫黄含有錯体の形成を可能にするのに
    十分な期間、Sn（II）剤と共にインキュベートされる、
    請求項１に記載の方法。
  5. 【請求項５】前記Sn（II）剤の源が、酒石酸第一錫、グ
    ルコヘプトン酸第一錫、グルコン酸第一錫、ホスホン酸
    第一錫、塩化第一錫およびフッ化第一錫から成る群より
    選択された化合物を含んで成る、請求項１または２に記
    載の方法。
  6. 【請求項６】前記タンパク質がモノクローナル抗体、モ
    ノクローナル抗体断片およびポリクローナル抗体から成
    る群より選択されたタンパク質を含んで成る、請求項１
    または２に記載の方法。
  7. 【請求項７】段階ｃ）の後で且つ段階ｄ）の前に、前記
    Sn（II）含有および硫黄含有錯体をバイアル中で凍結さ
    せ、そして所望により凍結乾燥し、それによってバイア
    ルへの放射性核種の添加による段階ｄ）の放射能標識の
    前の不定期間の間、凍結乾燥された前記Sn（II）剤とス
    ルフヒドリル含有タンパク質を維持することができる、
    請求項２に記載の方法。
  8. 【請求項８】段階ｂ）の後で且つ段階ｃ）の前に、前記
    Sn（II）含有および硫黄含有錯体をバイアル中で凍結さ
    せ、そして所望により凍結乾燥し、それによってバイア
    ルへの放射性核種の添加による段階ｃ）の放射能標識の
    前の不定期間の間、凍結乾燥された前記Sn（II）剤とス
    ルフヒドリル含有タンパク質を維持することができる、
    請求項２に記載の方法。
  9. 【請求項９】前記放射性核種がテクネチウムまたはレニ
    ウムである、請求項１または２に記載の方法。
  10. 【請求項１０】前記放射性核種が過テクネチウム酸ナト
    リウムの形のテクネチウム−99mである、請求項９に記
    載の方法。
  11. 【請求項１１】前記放射性核種の85％以上が前記タンパ
    ク質に強力に結合している、請求項１または２に記載の
    方法。
  12. 【請求項１２】前記錯生成してないSn（II）剤を錯生成
    剤によって錯生成させることにより前記還元されたタン
    パク質を精製して、錯生成してないSn（II）剤と他の不
    純物を除去し、ここで前記錯生成剤がポリアミノカルボ
    ン酸である、請求項２に記載の方法。
  13. 【請求項１３】前記ポリアミノカルボン酸がEDTAまたは
    DTPAである、請求項12に記載の方法。
JP2514313A 1989-08-09 1990-08-08 テクネチウムまたはレニウムでの抗体または他のタンパク質の直接放射能標識 Expired - Fee Related JP3070763B2 (ja)

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