KR20140001257A - 금속 추출 펩타이드(ｍａｐ) 태그 및 관련된 방법 - Google Patents

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KR20140001257A
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제니퍼 앤 스토웰 로렌스
안토니 앤드류 배르티아
마리 엘리자베스 클라우스
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유니버시티 오브 캔사스
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Abstract

서열 XC1C2를 갖는 트리펩타이드를 포함하는 조성물로서, X는 XC1C2가 사각형 평면 배향 또는 사각형 피라미드 배향 또는 둘 모두에서 금속과 결합할 수 있는 임의의 아미노산이고; C1 및 C2는 같거나 상이하며; C1 및 C2는 개별적으로 시스테인 및 시스테인-유사 비천연성 아미노산으로 부터 선택되는 것인 조성물, 금속-XC1C2 착물, 및 이러한 착물을 형성하기 위한 방법.

Description

금속 추출 펩타이드(ＭＡＰ) 태그 및 관련된 방법{Metal Abstraction Peptide(MAP) Tag and Associated Methods}
관련된 출원에 대한 교차-참조
본 출원은 본 출원에 있어 참조로 혼입되는 2008년 5월 13일 출원된 미국 가특허 출원 일련 번호 61/052,918에 대해 우선권을 주장한다.
정부 관심의 언급
본 발명은 건강 국가 위원회로 부터 허여하에(허여 번호 P20 RR-17708) 개발되었다. 미국 정부는 본 발명에 대해 특정 권리들을 가질 수 있다.
전에는, 조성물로부터 폴리펩타이드(예, 단백질 또는 단백질 단편들)를 추출하기 위하여 금속을 이용하는 것이 통상적인 기술이었다. 이러한 추출은 조성물내의 다른 물질에 비해 특정한 폴리페티이드와 착물을 형성하는(complex) 금속의 능력에 기초하였다. 두개의 상이한 펩타이드-기초 금속 결합 태그(tags)들이 조성물로부터 펩타이드를 분리하는데 사용될 수 있다고 알려져 있다. 그러나, 이들 결합 태그들은 특정한 타입의 아미노산, 및 본 발명과 연결하여 기술된 것과 실질적으로 상이한 결합을 달성하는데 이용될 수 있는 특정한 수 또는 특정한 서열의 아미노산을 갖는다. 예를들어, 이들 두개의 결합 태그들은 본 발명과 같은 유형의 금속과 결합할 수 없거나 기하도형적배열을 이용하여 결합할 수 없다. 첫번째 결합 태그에 관한 추가의 정보가 하룬 등(Haroon et al.)의 U.S. 7,208,138에서 얻을 수 있고, 서열 NXEQVSP를 포함하는 펩타이드에 속한다. 두번째 결합 태그에 대한 정보는 아보가스트등(Arbogast, et al.)의 미국 특허출원 공개 번호 제 20040018974 호에서 얻을 수 있으며, 본 명세서에 기술된 완전한 단백질로 보이는 태그의 서열에 속한다.
단백질의 재조합 발현을 위한 유기체의 유전물질에 암호화될 수 있는 태그는 단백질 생성물의 정제 및 동정에 광범위하게 이용되어 왔다. 이것의 가장 주목할만한 예는 His-tag 기술로서, 이는 고정화된 금속 친화력 크로마토그래피(IMPC)를 이용하여 완전한 세포로부터 태그된 단백질을 효과적으로 분리하는 용이한 수단을 제공한다. 펩타이드 태그를 인식하는 항체를 이용하여 세포 배양물 분석 또는 세포 용해물에서 태그된 단백질을 검출하기 위해 수많은 다른 펩타이드-기초 태그들이 개발되어 왔다. 이들 기술은 즉석(in situ) 또는 시험관내 분석에서 유용하나, 생체내 분석에서는 일반적으로 적용될 수 없다. 펩타이드 태그의 잇점은 태그가 단백질을 표지하기 위하여 추가의 화학적 단계에 대한 필요없이 관심있는 단백질에 공유적으로 부착한다는 것이다.
MRI 영상화는 살아있는 동물 또는 사람에서 구조적 특징을 조사하기 위한 보통의 방법이다. 이 기술은 안전하고 비-침입성(non-invasive)이다. 조영제들이 이방법의 민감성을 개선하기 위하여 개발되어왔고, MRI 영상에서 관찰되는 특징들을 향상시키기 위하여 사용된다. 이 개선은 조영제가 이웃하는 분자, 전형적으로 물로 부터의 신호를 변경시키는 금속을 함유하기 때문에 달성된다. 가장 흔히 사용되는 조영제는 Gd(III)를 킬레이트시키나, 다른 금속도 대비(contrast)를 향상시키기 위하여 사용될 수 있다. Gd-함유 조영제는 저항력 저하(compromised) 신장 기능을 갖는 환자에서는 사용될 수 없다. 이유는 신원성전신섬유증(Nephrogenic Systemic Fibrosis) 또는 신성 섬유증(Nephrognic Fibrosing Dermopathy)이라고 알려진 심각한 합병증이 결과로서 나타날 수 있기 때문이다.
대안적인 조영제가 이러한 환자의 필요성에 접근하기 위하여 요구된다. 금속을 킬레이트시키는 화합물은 또한 분자 수준의 상세한 사항을 보는 PET 및 SPECT 영상화에서 사용된다.
요약
본 발명은 일반적으로 트리펩타이드 모티프(motifs) 및 이 모티프를 사용하는 방법에 관한 것이다. 이들 펩타이드는 금속과 결합하는 능력을 갖고, 이는 이들을 다양한 적용에 있어 유용하게 만든다. 특히, 본 발명의 트리펩타이드는 영상화, 연구, 화학요법, 및 킬레이트화 치료법(chelation therapies)에서 적용된다.
특정 구현예에 따르면, 본 발명은 서열 XC1C2를 갖는 트리펩타이드를 포함하는 조성물을 제공하고, 여기에서, X는 XC1C2가 사각형(square) 평면 배향 또는 사각형 피라미드 배향 또는 둘 모두에서 금속과 결합할 수 있는 임의의 아미노산이고; C1 및 C2는 같거나 상이하며; C1 및 C2는 개별적으로 시스테인 및 시스테인-유사 비천연 아미노산으로 부터 선택된다.
다른 구현예에 따르면, 본 발명은 서열 XC1C2을 갖는 트리펩타이드 및 금속을 포함하는 조성물을 제공하고, 여기에서, 금속은 트리펩타이드와 착화되며; X는 트리펩타이드 및 금속이 사각형 평면 배향 또는 사각형 피라미드 배향 또는 둘 모두를 갖는 착물(complex)을 형성하도록 하는 임의의 아미노산이고; C1 및 C2는 같거나 상이하며; C1 및 C2는 개별적으로 시스테인 및 시스테인-유사 비천연 아미노산으로 부터 선택된다.
다른 구현예에 따르면, 본 발명은 금속-XC1C2 착물을 형성하도록 서열 XC1C2을 갖는 트리펩타이드를 금속과 착화시키는 것을 포함하는 방법을 제공하며; 여기에서, X는 금속-XC1C2 착물이 사각형 평면 배향 또는 사각형 피라미드 배향 또는 둘 모두를 갖도록 하는 임의의 아미노산이고; C1 및 C2는 같거나 상이하며; C1 및 C2는 개별적으로 시스테인 및 시스테인-유사 비천연성 아미노산으로 부터 선택된다.
본 발명의 특징 및 이점은 이어지는 구현예의 기술을 읽을 때 본 분야에 숙련된 자에게 쉽게 명백할 것이다.
본 발명의 보다 완전한 이해가 첨부된 도면과 조합하여 취해진 하기 기술을 참고로 하여 얻어질 수 있을 것이다.
도 1은 구조 1- 4N 배위를 갖는 GGH-유사 금속 착물 NGH, 구조 2 및 구조 3- 수개의 탈양자화된(deprotonated) 골격(backbone) N 원자에 의한 금속의 배위를 포함하는 GGH-유사 배열을 보여준다.
도 2는 PRL-1, PRL-2, 및 PRL-3를 포함하는 인간 PRL 효소의 C-말단 부분의 서열 배열을 보여준다. PRL-1의 H166은 푸른색으로 나타내진 NGH 모티프의 일부분이다. PRL-1의 잔기(residues) C170 및 C171은 붉은 색(박스화됨(boxed))으로 나타내진 CaaX 모티프의 일부분이다. NCC 모티프는 굵은체이다.
도 3은 A에서 pH 10에서 얻어진 니켈-결합된 트리펩타이드의 ESI-MS을 보이는데, 여기에서, 질량(mass)은 니켈이 펩타이드에 결합됐다는 것을 나타내고, B에서 샘플의 pH를 5까지 떨어트린 후의 ESI-MS 스펙트럼을 보이는데, 이는 니켈이 펩타이드로부터 방출됐다는 것을 나타낸다.
도 4는 Cu-NCC 자기 공명 영상(MRI)를 보여준다.
도 5는 His-tag의 절단 및 제거후의 Ni(II), pH 7.4의 존재하에서 정제된 정제 WT PRL-1의 사진을 보여준다. 사진은 그의 특징적인 적갈색(rust color)을 나타낸다.
도 6은 A) Ni2 + 이온의 존재하에서 정제된 PRL-1 변이체(variants)의 전자 흡수 스펙트럼들을 보여준다. 각 단백질 변이체의 세개(두개)의 스펙트럼은 800 내지 200 nm에서 기록되었고, 평균내졌다. 모든 변이체의 단백질 농도는 5 mg/mL 내지 A280 비교에 기초해서 10%이내이다. 700 내지 300 nm에서의 스펙트럼이 나타나있다. 보이는 특징은 삽입도에서 318 내지 421 nm에서 흡수가 최대이다. 600 내지 400 nm에서의 스펙트럼은 421 내지 526 nm에서의 최대 흡수를 시각화하기 위하여 보다 작은 크기(scale)로 나타나있다. 곡선은 다음과 같다: PRL-1-WT, 흑색(상부); PRL-1-H166A, 붉은색(상부 다음); PRL-1-C170-171S, 오렌지색(바닥); PRL-1-C170S, 녹색(바닥 다음); PRL-1-C171S, 푸른색(중간). B). PRL-1 WT의 분석된(resolved) 스펙트럼. 300과 700 nm사이의 Ni-정제된 PRL-1 WT 단백질의 UV-Vis 스펙트럼의 분석은 5개 곡선을 이용한 데이터와 맞았다. 318nm 어깨는 306, 325, 및 372nm 에서의 피크로 분석되었다. 분석된 흡수 피크들(회색 점선)의 합 및 가공하지 않은 데이터(연속된 흑색선) 모두가 보인다. 421nm 및 526 nm에서의 피크들이 또한 존재한다.
특허 또는 출원 파일은 칼라로 제작된 적어도 하나의 도면을 함유한다. 칼라 도면(들)을 갖는 본 특허 또는 특허 출원 공개서의 사본이 요청시 및 필요한 수수료의 지불시 특허청에서 제공될 것이다.
본 발명은 다양한 변형이 가능하고 대체적인 형태가 가능한 상태에서, 특정한 실시예 태양들이 도면에 나타나있고, 본 명세서에서 보다 자세히 기술되어 있다. 그러나, 특정한 실시예 태양의 기술은 본 발명을 개시된 특정한 형태로 제한하고자 하는 것이 아니고, 이 개시는 첨부된 특허청구범위에 의해 정의된 바 모든 변형 및 등가물을 커버한다.
본 발명은 일반적으로 짧은 펩타이드 모티프 및 이러한 모티프를 이용한 방법에 관한 것이다. 이들 펩타이드는 금속들과 선택적으로 결합하는 능력을 가지며, 이는 이들을 다양한 적용에서 유용하게 만든다. 특히, 본 발명의 펩타이드는 영상화, 연구, 화학요법, 및 킬레이트화(chelation) 치료법들에서 적용이 된다.
본 발명은 MAP 태그(들)라고 언급된 선태된 금속들과 강하게 결합하는 짧은 신규의 펩타이드 모티프(motifs)에 관한 것이다. 이와같이, 이들 MAP 태그는 다른 것중에서 조성물중에서 선택(select) 금속을 추출하기 위하여 사용될 수 있다. 본 발명의 MAP 태그는 길이가 3개의 아미노산이며, N-말단, C-말단, 또는 사이의 어느 위치에서 보다 긴 폴리펩타이드 및 단백질에 포함될 수 있다. 그러나, 특정 구현예에서 MAP 태그가 외부 루프(loop)에 존재하는 것과 같이 금속과 결합하기 위한 MAP 태그를 제공하는 폴리펩타이드 또는 단백질 입체배치(configuration)로 존재하는 것이 유리할 수 있다. MAP 태그는 또한 비-펩타이드 성분(entity)에 부착할 수 있다. 부가적으로, 하나 이상의 MAP 태그가 특별한 분자상에 존재할 수 있다.
많은 단백질이 금속과 결합한다는 것이 알려져 있다. 그러나, 이들 결합은 전형적으로 단단한 결합을 달성하기 위해 접힌 단백질 구조내의 불연속적인 아미노산 서열을 이용하며, 이는 이어서 비접힘시 쉽게 금속을 방출한다. 다른한편, MAP 태그에 의한 금속 결합은 매우 가까운 근접한 상태에 있는 원자를 사용하여 달성되며, 이와같이, 극도의 조건들이 금속을 방출하기 위하여 요구된다. 단백질의 열 및 화학적 변성은 금속이 서서히 방출되게 한다. 예를들어, 극도의 조건(예, 비등 온도, 강산)의 사용은 금속이 일정 시간에 걸쳐(예, 수 시간 내지 많은 시간) 서서히 방출되게 할 수 있다.
A. 화학적 구조
특정 구현예에서, 본 발명은 금속에 대한 신규의 펩타이드-기초 태그 또는 결합제(MAP 태그)를 제공한다. MAP 태그는 폴리펩타이드 또는 단백질에서 고친화력 금속 결합 부위를 직접 암호화 하는데(encode) 사용될 수 있다. 본 발명의 MAP 태그는 사각형 평면 및/또는 사각형 피라미드 기하 도형적 배열(geometry)로 금속과 결합하는 능력을 특징으로 한다.
1. 펩타이드 서열
본 발명의 MAP 태그는 일반적으로, 금속과 결합할 수 있는 적어도 세개의 인접하는 아미노산 잔기를 포함한다. 본 발명의 MAP 태그는 일반적으로 XC1C2에 나타내지는 서열을 가지고, 여기서 C1 및 C2는 같거나 상이할 수 있으며, 시스테인, 또는 시스테인-유사 비천연 아미노산(예, 황 함유 알파- 또는 베타-아미노산)일 수 있고, X는 형성된 펩타이드 태그가 사각형 평면/피라미드 기하 도형적 배열로 금속과 결합할 수 있는 한 또다른 천연 또는 비천연 아미노산 또는 아미노산 유사체일 수 있다. 본 명세서에서 사용된 바, L-에난티오머 아미노산에 대한 약어는 통상적이며, 다음과 같다:
천연 아미노산에 대한 약어
아미노산 한 문자 기호 세 문자 기호
알라닌 A Ala
아르기닌 R Arg
아스파라긴 N Asn
아스파르트산 D Asp
시스테인 C Cys
글루탐산 E Glu
글루타민 Q Gln
글리신 G Gly
히스티딘 H His
이소류신 I Ile
류신 L Leu
라이신 K Lys
메티오닌 M Met
페닐알라닌 F Phe
프롤린 P Pro
세린 S Ser
트레오닌 T Thr
트립토판 W Trp
티로신 Y Tyr
발린 V Val
몇몇 구현예에서, X는 아스파라긴(N), 글루타민(Q), 히스티딘(H), 라이신(K) 또는 아르기닌(R)일 수 있다.
아미노산 서열이 일련의 세 문자 또는 한 문자 아미노산 약어로 나타내질 때, 표준 사용법 및 관례에 따라, 좌측 방향이 아미노 말단 방향이고, 우측 방향이 카복시 말단 방향인 것이 이해되어질 것이다.
본 발명의 MAP 태그는 임의의 재조합 기술 체계를 이용한 발현용 유전자 또는 뉴클레오타이드 서열과 일치하여 암호화될 수 있다. 또한, 이는 펩타이드 또는 단백질 생산용 임의의 합성 또는 생합성 방법을 사용하여 펩타이드 또는 단백질에 혼입될 수 있다. 적용시, MAP 태그는 자발적으로 금속과 반응하여 펩타이드-금속 착물을 형성한다. 이러한 펩타이드-금속 착물은 용액에서 또는 금속교환반응 또는 어느 다른 공정을 통해 형성될 수 있다.
MAP 태그는 단독으로, 또는 N- 말단, C- 말단에 부착되거나 폴리펩타이드 쇄내의 유연성 있는 링커(linker) 또는 루프(loop)에 혼입될 수 있는 태그로서 사용될 수 있다. MAP 태그는 금속 배위(coordination)에 포함된 측쇄이외의 임의의 위치에서 변형될 수 있다. 따라서, MAP 태그는 Z-XC1C2-Z1(여기에서, Z는 임의의 아미노산 또는 임의 서열의 아미노산들일 수 있으며, Z1은 Z와 동등한 또는 동등하지 않은 임의의 아미노산 또는 아미노산들 서열일 수 있다)과 같은 서열을 포함할 수 있다. 아미노산은 상기 표 1에 나타나있다. 비-천연 및 아미노산 유사체는 표에 열거되지 않았으나, Z, Z1, 및/또는 X 에 포함될 수 있다.
특정한 구현예에서, MAP 태그는 또다른 분자에 부착될 수 있다. 예를들어, MAP 태그는 탄수화물(예, 히아루론산)같은 비-펩타이드 성분에 부착될 수 있다. 부착은 공유결합일 수 있고, 링커를 통해 영향을 받을 수 있다.
몇몇 구현예에서, MAP 태그는 다음과 같은 서열일 수 있다: NC1C2; Z-NC1C2-Z1; Z-NC1C2; NC1C2-Z1; QC1C2; Z-QC1C2-Z1; Z-QC1C2; QC1C2-Z1; HC1C2; Z-HC1C2-Z1; Z-HC1C2; HC1C2-Z1; KC1C2; Z-KC1C2-Z1; Z-KC1C2; KC1C2-Z1; RC1C2; Z-RC1C2-Z1; Z-RC1C2; 또는 RC1C2-Z1. 상기와 같이, Z는 임의의 아미노산 또는 아미노산 서열일 수 있고, Z1은 Z에 동등하거나 동등하지 않은 임의의 아미노산 또는 아미노산 서열일 수 있다. 아미노산은 상기 표 1에서 같이 나타내진다. 비-천연 및 아미노산 유사체는 표에 열거되지 않았으나, 화합물 Z 및 Z1에 포함될 수 있다.
한 구현예에서, MAP 태그는 다음 구조식을 갖는 NCC를 포함한다:
Figure pat00001

특정 구현예에서, 본 발명의 MAP 태그는 금속과 MAP 태그 착화 전이나 또는 금속과 착화 후에 MAP 태그의 표적화된 전달을 제공하는 유전자 또는 뉴클레오타이드 서열과 일치하여 암호화될 수 있다. 이는 유전자, 펩타이드, 또는 표적화에 유용한 것으로 알려진 기타의 모티프를 사용하여 달성될 수 있다. 예를들어, MAP 태그는 항체, 성장인자, 펩타이드 등에 혼입될 수 있다.
2. 금속 결합
특정 구현예에서, 단독 또는 폴리펩타이드 또는 단백질에 혼입되었을 때, 본 발명의 MAP 태그는 금속과 착화하여 사각형 평면/피라미드 기하도형적배열(geometry)을 갖는 MAP 태그-금속 착물을 형성할 수 있다. 금속은 2N:2S 배위를 통해 MAP 태그와 착물화할 수 있다. MAP 태그는 또한 본 분야에 숙련된자에게 인식될 수 있는 적절한 조건하에서 사각형 평면 기하도형적배열로 다수의 금속과 결합할 수 있다. 일반적으로, 본 발명의 MAP 태그는, IUPAC 그룹을 참조하여, Y와 같은 3족(group) 금속; V 및 U와 같은 5족 금속; Cr, Mo, W와 같은 6족 금속; Mn, Tc, Re와 같은 7족 금속; Fe 및 Ru와 같은 8족 금속; Co, Rh, Ir과 같은 9족 금속; Ni, Pd, Pt와 같은 10족 금속; Cu, Ag, Au와 같은 11족 금속; Zn, Cd, Hg와 같은 12족 금속; Al, Ga, In, Tl과 같은 13족 금속; Sn 및 Pb와 같은 14족 금속; 및 Bi와 같은 15족 금속과 결합할 수 있다. 특정 구현예에서, MAP 태그는 결합하여 Zn, Ni, Cu, Pt, Pd, Au, Ag, Pb, 및 Fe와 MAP 태그-금속 착물을 형성할 수 있다.
상기 언급된 바와 같이, 금속과 결합했을 때 MAP 태그는 사각형 평면 기하도형적배열을 갖는다. 본 발명은 또한 다양한 사각형 입체배치의 MAP 태그 금속배위를 고려한다. 예를들어, MAP 태그가 NCC이고, 금속이 상기 기술된 바와 같은 어느 금속이며, M으로서 나타나질때, MAP 태그는 화학식 1에 나타내지는 화학 구조를 가질 수 있다:
화학식 1
Figure pat00002

다른 구조적 입체배치가 또한 고려된다. 예를들어, MAP 태그가 NC1C2이고, C1이 (S)-2-아미노-2-머캅토아세트산과 같은 비천연 아미노산이며, C2가 시스테인일때, MAP 태그의 구조적 화학식은 화학식 2(여기에서, M은 상기 기술된 바와 같은 어느 금속이다)에 의해 나타내질 수 있다:
화학식 2
Figure pat00003

또다른 예에서, MAP 태그가 NC1C2이고, C2가 (S)-2-아미노-2-머캅토부탄산과 같은 비천연 아미노산일때, MAP 태그의 구조적 화학식은 화학식 3(여기에서, M은 상기 기술된 바와 같은 어느 금속이다)에 의해 나타내질 수 있다:
화학식 3
Figure pat00004

또다른 예에서, MAP 태그가 NC1C2이고, C2가 3-아미노-2-머캅토프로판산과 같은 β 아미노산일때, MAP 태그의 구조적 화학식은 화학식 4(여기에서, M은 상기 기술된 바와 같은 어느 금속이다)에 의해 나타내질 수 있다:
화학식 4
Figure pat00005

또다른 예에서, MAP 태그가 RCC이고, MAP 태그의 구조적 화학식은 화학식 5(여기에서, M은 상기 기술된 바와 같은 어느 금속이다)와 같이 나타내질 수 있다:
화학식 5
Figure pat00006

또다른 실시예에서, MAP 태그는 QCC이고, MAP 태그의 구조적 화학식은 화학식 6(여기에서, M은 상기 기술된 바와 같은 어느 금속이다)으로 나타내질 수 있다:
화학식 6
Figure pat00007

B. MAP 태그의 적용
1. 금속 추출용 MAP 태그
상기 언급된 바와 같이, MAP 태그는 고친화력으로 금속과 결합할 수 있다. MAP 태그는 또한 유체로부터 고체에 이르는 다양한 조성물로 부터 금속을 추출할 수 있다. 결과적으로, 배위를 공유(share)하기보다는 금속을 추출하는 MAP 태그의 능력은 이들을 하기에서 보다 충분히 기술되는 바와 같이 또다른 조성물로부터 특정(specific) 금속을 분리하는데 사용할 수 있게 한다. MAP 태그는 금속과 착화하고, 이어서, 킬레이팅제(예, EDTA) 또는 예를들어 IDA 또는 NTA와 콘쥬게이트된(conjugated) 고체 지지체와 같은 조성물중의 성분으로부터 금속을 추출하거나 제거하여 조성물로부터 금속 이온을 격리한다. 이와같이, MAP 태그는 금속 추출 펩타이드(MAP) 태그이다.
또한, 적어도 부분적으로는 금속과 선택적으로 결합하는 MAP 태그의 능력에 기인하여, 본 발명의 구현예는 킬레이트화(chelation) 치료요법에 유용할 수 있다. 따라서, MAP 태그는 납과 같은 생물학적으로 독성인 금속을 격리하는데 사용될 수 있다.
유사하게, MAP 태그는 또한 물, 다른 수용액, 또는 체외의 어느 조성물로 부터 금속을 격리하는데 유용할 수 있다. 상기 MAP 태그 자체는 다수의 용매중에서 일반적으로 가용성이다. 그러나, 특정 구현예에서, MAP 태그-금속 착물은 많은 유기 용매중에서 빈약하게 가용성이며, 일단 금속 결합이 일어나면 침전될 수 있다. 이는 유기 용매로부터 추출하는 동안 효율적인 분리를 가능케 한다.
2. 영상화 적용
특정 구현예에서, 본 발명은 MAP 태그를 이용한 영상화 방법을 제공한다. 이러한 방법은 치료적 및 의학적 영상화, 또는 다른 영상화 적용을 위해 사용될 수 있다. MAP 태그와 착화시키려고 선택되는 금속은 상기 특별한 적용 및 영상화 기술에 좌우된다. 예를들어, 상자성 금속은 MRI, NMR 및 EPR과 같은 영상화 기술과 함께 사용하기 위해 선택될 수 있는 한편, 금은 전자 현미경에 의한 검사와 같은 기술 경우에 선택될 수 있고, 아연은 형광과 같은 적용에 선택될 수 있다. 어떤 금속이 소정의 적용 및 영상화 기술에 적절한 지는 본 분야에 숙련된 자에게 잘 알려져 있다.
한 태양에서, MAP 태그는 영상화 기술에서 사용하기 위한 시약을 제조하는데에 이용된다. 즉, MAP 태그는 금속과 결합하고, 이는 다시 영상화에 이용될 수 있는(예를들어, 금속이 영상화에 사용될 수 있도록 대상자(subject)의 신체에서 사용되는 ) 착물을 제공한다. 적절한 영상화 기술의 예에는 단독 또는 조합하여 사용되는 컴퓨터 단층 촬영(CT), 자기 공명 영상화(MRI), 초음파, 양전자 방사 단층 촬영(PET), 단일 광자 방출 전산화 단층 영상(SPECT), 핵자기 공명(NMR), 전자 상자성 공명(EPR), 전자 현미경에 의한 검사(electron microscopy), 형광 영상화등이 있다.
또다른 태양에서, MAP 태그는 대상자의 일부에 국소화되는(localizes) 폴리펩타이드 또는 단백질 또는 비-단백질 성분(entity)에 혼입될 수 있다. 여기서, MAP 태그 금속 착물의 금속 부분은 조직 또는 종양과 같은 국소화 부위를 영상화하는 능력을 제공한다. 예를들어, MAP 태그-금속 착물은 MAP-태그된 분자의 표적 부분에 대한 수용체 및/또는 결합 상대자(partner)를 발현하는 조직 또는 다른 구조를 확인하기 위하여 사용될 수 있다. 금속을 보이게 할 수 있는 영상화 기술은 이러한 특징을 확인하는데 사용될 수 있다.
예를 들어, MRI 조영제는 이웃하는 원자의 이완(relaxation)을 변경시켜 조영제가 존재하는 영역과 존재하지 않는 영역사이의 검출된 신호에서 차이를 발생시키는 금속 중심을 전형적으로 함유하는 상자성 종(species)이다. MAP 태그는 Cu와 착화되었을 때 상자성일 일 수 있다. 그러므로, MAP 태그-금속 착물은 MRI 조영제로서 사용하는데에 잠재성을 갖는다. 대부분의 조영제는 현미경적 수준에서는 표적화되지 않지만, 신체 또는 조직에서 눈에 보이는(macroscopic) 구조 및 결함을 밝히는데 사용된다. 이 유형의 적용에서, 조영제의 농도는 매우 높다. 선택된 조직 또는 현미경적 특징에 조영제를 표적화시키는 것은 세포 수준에서 이상형(aberrations)을 확인하는 것을 가능하게 한다는 점에서 유익하다. 예를들어, MAP 태그는 특이적 수용체를 발현하는 암 세포를 인식하는 항체상의 태그로서 발현될 수 있다. 표적화된 전달은 투여하려는 조영제의 낮은 농도를 가능케 할 수 있어, 이는 다른 것중에서 독성 및 다른 부작용을 최소화하는 것을 도울 수 있다.
62Cu는 신체내의 분자적 상세 사항을 영상화할 수 있는 PET 및 SPECT 영상화에서 사용되는 방사성 동위원소인 것이 알려져 있다. 이와같이, MAP 태그는 Cu(또다른 금속)의 적절한 방사성 동위원소로 적재될 수 있고, 이들 영상화 기술과 함께 추적자(tracer)로서 사용될 수 있다. 유사하게, 태그를 세포의 서브셋(subset)과 결합하는 임의의 단백질 또는 펩타이드 또는 다른 분자에 융합시켜, 표적화된 영상화가 달성될 수 있다.
MAP 태그는 특정 금속에 대해 고친화력을 갖는 짧은 서열이기 때문에 다른 것중에서도 유리하다. 따라서, 발현되는 단백질 또는 다른 분자중에 MAP 태그를 암호화하여, 유기체내의 특정 세포 유형에 표적화된 전달이 가능하다. 나아가, 세포의 서브셋의 표적화는 영상화에 필요한 조영제의 양을 감소시키는 것을 가능케 한다.
3. 화학요법
본 발명은 또한 화학요법에서 도움을 주기 위해 사용될 수 있다. 예를들어, MAP 태그는 백금 및/또는 방사성뉴클레오타이드와 착물을 형성할 수 있고, 특별한 세포 또는 세포 유형에 표적화된 전달을 제공하는데에 사용될 수 있다.
본 발명의 보다 나은 이해를 용이하게 하기 위하여,특정 태양들의 다음 실시예가 제공된다. 어떤 방법으로도 다음 실시예는 본 발명의 전 범주를 제한하거나 한정하는 것으로 읽혀져서는 안된다.
실시예
실시예 1
돌연변이유발 기술을 선택된 금속에 강한 결합 친화력을 갖는 펩타이드 모티프를 확인하기 위하여 사용하였다. 간략하게, 인간 PRL-1 유전자를 pET-30 Xa LIC 벡터(Novagen)에 클로닝시킨후, PCR-기초 퀵체인지(QuickChange) 방법(Stratagene)을 사용하여 돌연변이시켰다. C170S, C171S, 및 H166A 돌연변이체를 생성하는 프라이머는 5'에서 3'로 각각 ggtcatagaaacaactCttgcattcaataaggatc, ggtcatagaaacaactgttCcattcaataaggctgtaactc, 및 cgtttcaaacattccaacggtGCtagaaacaactgttgcattc(Integrated DNA Technologies, Coralville, IA)이다. 대문자는 돌연변이된 염기를 나타낸다. PCR 반응물을 DPnI(Promega)로 37℃에서 1.5 시간 동안 처리하여,NovaBlue GigaSingles Competent 세포로 직접적으로 형질전환시키고, 30 mg/mL 카나마이신 선택이 있는 LB상에 플레이팅시켰다. 개개의 콜로니를 선택적 LB에서 37℃에서 밤새 성장시켰다. 결과적인 DNA를 Wizard Plus Miniprep 시스템(System)(Promega)을 사용하여 정제하였다. 모든 돌연변이를 DNA 염료- 말단 서열화(Northwoods DNA, Inc., Bemiji, MN)로 확인하였다. 이중 돌연변이체 C170S/C171S를 제 2 라운드(round) 돌연변이유발로 제조하고, 유사하게 확인하였다.
PRL-1 및 관련 돌연변이 유전자를 함유하는 벡터를 BL21(DE3) 세포(Novagen)에 형질전환시키고, 선택적 LB상에서 37℃에서 밤새 배양시켰다. 선택된 콜로니를 선택적 M9ZB 육즙에서 37℃에서 밤새 배양시켰다. 이어서, 밤새 배양된 배양물을 500 mL 비표지된 최소 배지에 옮기고, 0.6 내지 0.8 사이의 OD550 에서 1mM IPTG로 유발하였다. NMR 실험용으로 발현되는 단백질을 15N-염화 암모늄을 함유하는 최소 배지에서 성장시켰다. 재조합 단백질의 과발현은 SDS-PAGE로 확인하였다. 세포들을 4400 x g에서 원심분리하여 펠릿화시키고 사용때 까지 -80℃에서 저장하였다.
금속 배위에 참여하는 잔기를 확인하기 위하여 일련의 PRL-1 돌연변이체를 조사하였다. GGH-유사 모티프를 함유하는 모델 펩타이드들은 매우 높은 친화력으로 Ni(II) 및 Cu(II)와 배위하는 것으로 나타났다. 이 모티프에서, 두개 Gly 위치중 어느 하나에서의 치환만 간소하게(modestly) 결합을 감소시키나, His의 돌연변이는 결합을 폐지했다. PRL-1은 그의 C-말단에 가까이 있는 GGH-유사 공통 모티프인 NGH를 암호화한다(도 2). 그러므로, PRL-1에 함유된 NGH 서열이 금속 결합에 관여한다는 가설을 시험하기 위하여 PRL-1-H166A를 만들었다. PRL-1 및 PRL-1-H166A는 각각 대략 120 및 60 μM Ni에 병행하여 결합하는 것으로 ICP-MS에 의해 분석되었다. 흡수 분광학으로 측정하였을 때 신호에서의 오직 20% 감소가 H166A에서 관찰되었다. 단백질 신호가 동등 정도에 따라 감소하고, 가시 지역에서의 신호 손실이 단백질 불안정성에 기인한다는 것이 흡수 스펙트럼으로부터 또한 나타난다. ICP-MS가 분석전 샘플의 조작을 실질적으로 보다 많이 요구하기 때문에, 단백질 불안정성이 아마 두 검출 방법에 있어서 불일치의 원인인 것 같다. 히스티딘 돌연변이체는 단단한 결합을 유지하기 때문에, C170 및/또는 C171에서의 돌연변이는 티올이 종종 Ni 배위(coordination)에 참여하기 때문에 만들어졌다. 이중 돌연변이체 뿐만 아니라 개개의 시스테인 돌연변이체에서의 Ni 수준이 야생형 단백질에 비교해서 크게 감소하여 양 Cys 잔기가 금속 배위에 영향을 끼침을 나타낸다. C170S 돌연변이체 또는 C170S-C171S 이중 돌연변이체에서 어떤 Ni도 검출되지 않았으나, 대략 17 μM의 작은 신호가 PRL-1-C171S에서 관찰되었다.
실시예 2
단백질 정제 기술을 단백질-금속 착물을 정제하기 위하여 사용하였다. 간략하게는, 세포 펠릿을 30 mL 버퍼 A(100 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, 10 mM 이미다졸, pH 7.4, Ar-살포된)에 재현탁시키고, 고압력 세포 파쇄기(French pressure cell)(ThermoElectron)를 사용하여 15,000 psi에서 용해시켰다. 버퍼의 아르곤 살포는 산소를 제거하기 위하여 수행되었다. 이어서, 샘플을 21,000 x g에서 원심분리시키고, 상등액을 0.2μm 나일론 필터를 통해 여과하였다. (His)6-태그된 PRL-1의 정제는 Akta Explorer 정제 시스템을 이용하여 1 mL/분의 유속으로 수행하였다. 샘플을 금속 충전된 5 ml HiTrap 킬레이팅(Chelating) 컬럼(GE Healthcare)에 가하고 적재후 5 컬럼 부피로 세정하였다. 용출을 60% 버퍼 B(100 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, 500 mM 이미다졸, pH 7.4, 아르곤 살포 또는 살포없이)까지 선형구배를 이용하여 13배 컬럼 부피 이상으로 용출을 수행하고, 100% B까지 선형구배를 이용하여 3배 컬럼 부피 이상으로 용출을 수행하고, 4배 컬럼 부피경우는 100% B로 유지하였다. 용출은 280 nm 에서의 흡수에 의해 모니터링하였고, 분획물을 SDS-PAGE를 사용하여 순도에 대해 조사하였다. 적절한 분획물을 모아 Ar-분사된 또는 분사되지 않은 100 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH7.4에 대해 투석하였다. (His)6-태그를 인자 Xa 프로테아제(promega)를 이용하여 실온에서 밤새 표적 단백질로부터 절단하였다. 프로테아제는 XarrestTM 아가로즈(Novagen)를 이용하여 제거하고, 태그 및 어떤 비절단된 단백질을 제거하기 위하여 컬럼에 적용하기전 0.2μm 나일론 필터로 여과하였다. 단백질을 투석 버퍼안의 컬럼에 적용하고,최초의 유동물을 모아 단백질 샘플로 하였다. 샘플을 (Amicon Ultra) 10 kDa MWCO 원심분리 필터를 이용하여 Ar-살포된 100 mM NaCl, 50 mM TrisCl, pH 7.4중에서 적어도 106-배로 농축하고, 교환하였다. 샘플의 순도 및 돌연변이체 증거를 각각 SDS-PAGE 및 ESI-MS에 의해 확인하였다. 컬럼을 1 M NaOH로 처리하고, 100 mM EDTA의 2배 컬럼 부피로 스트리핑하며(stripped), 각 사용직전 Ar-살포된 100 mM NiSO4, 100 mM CuSO4, 100 mM CuCl2 또는 100 mM ZnCl2 를 재충전하였다.
도 5는 His-태그의 절단 및 제거후 정제된 PRL-1을 보여준다. his-태그에 결합된 금속은 8면체의 기하도형적배열을 가지며, 이는 푸른-녹색이고, 이러한 배위 사건에 상응하는 흡수가 스펙트럼의 700-800 nm에서 나타날 것이다. Ni(II), pH 7.4이 존재하에서 정제된 WT PRL-1의 사진은 그의 특징적인 적갈색을 나타낸다. 정제된 야생형 PRL-1 단백질은 예상치 않은 적갈색을 가지며(도 5), 이는 방향족 잔기(즉, Trp 또는 Tyr)의 금속 착화 또는 산화로 부터 유래할 것이다.
방향족 잔기의 산화는 단백질의 완전한 트립신 분해 연구에 의해 질량 분석법 데이터에 기초하여 쉽게 배제되었다. 더구나, 본 발명자들은 적갈색 단백질이 고속 원심분리동안 튜브의 바닥에 농축되기 때문에, 단백질의 밀도가 예상치보다 높음을 관찰하였다. 금속 배위가 단백질 착물의 밀도를 증가시키기 때문에, 본 발명자들은 발색단이 단백질과의 금속 착물의 형성에 의해 생성되는 가능성을 추가로 조사하였다. 금속 킬레이트화 크로마토그래피가 PRL-1을 정제하기 위하여 사용되었기 때문에, 금속 이온의 가장 가능한 공급원은 IMAC 수지로부터의 Ni이었다.
재조합 WT PRL-1을 함유하는 세포 용해물이 동등하게 분할되고, Ni2 +-, Cu2 +- 또는 Zn2 +- 충전된 IMAC 수지를 이용하여 나란히 정제되었을 때, 단백질은 킬레이트화 수지에 결합된 금속을 추출한다. 금속 교환 반응의 속도는 니켈의 경우 가장 빠르고, 다음이 구리이다. 아연은 모든 샘플에 어느 정도 존재하여, 단백질이 생체내에서 아연을 픽업(pick up)함을 나타낸다. 아연이 상기 컬럼에 결합하였을 때, 오직 아연만이 단백질에서 관찰된다. Apo PRL-1은 빈약하게 가용성이고, 금속의 손실은 침전에 이른다. 유도 결합 플라즈마 질량 분석법(ICP-MS)에 의해 시험되었을 때, 각 정제로 부터의 가용성 물질은 동등한 비율의 결합된 금속을 가졌다.
실시예 3
ICP-MS를 결합된 금속을 특성화시키기 위하여 사용하였다. 간략하게는, 정제된 단백질 샘플을 PFA 미량 원심분리기 튜브(Savillex, #s 7240, 7241)중의 진한 질산중에서 68±1℃에서 16.5±0.7 시간동안 분해하였다. 분해전 단백질 정량화에 기초하여, 샘플을 이어서 20 mM 탄산수소암모늄, pH 8.2 중에서 1.5 μM 로 희석하고, 0.2 μm 나일론 필터를 통해 여과하고, 미세농축 네불라이저(microconcentric nebulizer)가 장착된 VG Elemental VGII+XS 유도 결합 플라즈마 질량 분석기에 주입하였다. 두개의 별도로 제조된 샘플의 최소량을 각 단백질 변이체에 대해 분석하였다. 각 샘플을 2회 스캐닝하고, 표본을 각 샘플 스캐닝전, 사이, 및 후에 런닝시켰다(run). 양 샘플의 스캔과 표본 주사 사이의 세척동안 표류를 추적하였다.
발색단이 충전된 IMAC 매트릭스의 금속의 단백질 추출로부터 발생한다는 가설을 조사하기 위하여, 샘플을 반-정량적 분석을 위해 ICP-MS에 주입하였다. 배경 금속을 제거하기 위하여 철저한 세척을 하기 때문에, 이 방법으로부터 얻어진 값들은 본래 결합된 금속의 양을 낮게 측정하나, 단백질에 대한 상이한 금속들의 상대적 친화력을 평가하는데 사용될 수 있다. 또한, 세포에서의 발현동안 PRL-1에 결합될 수 있었던 내생적 금속 리간드를 확인하기 위하여, ICP-MS를 주기율 표의 처음 두 줄(rows)의 전이 금속 뿐만아니라 다른 통상의 생물학적 관련 금속의 존재를 살펴보기 위하여 사용하였다. 현저하게, 데이터는 PRL-1이 오직 Zn 및 특정 금속, 예를들어, 정제동안 IMAC 컬럼상에서 사용된 Ni와 결합함을 보여주었다. 평균 500 μM Ni-정제된 단백질 샘플은 질산중에서 70℃에서 16 시간동안 분해되었을 때, 대략 180 μM Ni를 함유하는 것으로 측정되어, 1:2.7 ± 0.7의 Ni 대 단백질의 화학양론을 얻었다. Zn은 또한 Ni-정제된 샘플중에서 대략 60 μM로 검출되었다. 별도로, Zn-IMAC을 사용한 PRL-1의 정제는 Zn이 270 μM [1 Zn:1.8 단백질]의 높은 양으로 존재하는 유일한 금속임을 보여줬고, 이들 단백질 샘플은 Ni의 오직 배경 수준만 함유했다. 양 Ni- 및 Zn-정제된 PRL-1의 ICP-MS는 상당한 양으로 어떤 다른 금속을 보여주지 않았고, 이는 아연이 생체내에서 배위되고, 니켈 크로마토그래피 정제동안 Ni2 +에 의해 부분적으로 대체된다는 것을 제시한다. ICP-MS 분석은 Ar의 흐름하에서 수행되고, Ar의 가장 풍부한 동위원소가 Ca와 같은 질량을 갖기 때문에 Ca 결합은 1차 질량 신호로부터 측정될 수 없다. 그럼에도 불구하고, 훨씬 높은 양의 Ca가 Zn에 비해서 세포 배양 배지에 존재하였고, 더구나 ICP-MS 신호가 주로 아연에 상응하기 때문에, 단백질은 칼슘과 결합하지 않는 것 같다. ICP-MS 데이터는 PRL-1이 Ni-IMAC를 사용하여 정제될 때 인지할만한 양으로 존재함을 나타내어, Zn 결합이 세포에서 일어난다는 것을 제시한다.
실시예 4
UV-Vis 흡수 스펙트럼을 PRL-1 단백질의 농도를 측정하기 위하여 사용하였다. 간략히는, 정제된 PRL-1 유사체의 농도를 280 nm에서 측정하고, 19420 M-1 cm-1의 흡광도 계수를 사용하여 계산하였다. 고 200 nm 영역에서의 금속-단백질 흡수 간섭의 가능성 때문에, UV-Vis 정량화 방법의 유효성을 브래드포드(Bradford) 방법에 의해 확인하였다. 10, 5, 2.5, 및 1.25 mg/mL의 농도에서의 PRL-1 유사체의 스펙트럼을 800 내지 200 nm에서 Cary 100 UV-Vis 분광 광도계상에서 수집하였다. 분석에서, 산란 효과를 교정하기 위하여, PRL-1-WT 스펙트럼을 PRL-1C170S-C171S이 금속과 결합하지 않기 때문에 그의 스펙트럼을 빼서 조정하였다. 결과적인 스펙트럼을 분석하고, 피크 위치들을 GRAMS/AI 7.00 소프트웨어를 사용하여 평가하였다. 세개의 방법은 금속 치환에 목적을 두었다. 먼저, PRL-1-WT(예, 야생형) 샘플을 20 mM β-머캅토에탄올(BME)을 사용하여 환원시키고, 이미다졸을 10mM의 농도까지 첨가하였다. 0.5 mM 단백질 샘플의 경우, 이는 두개의 C-말단 시스테인 티올과 경쟁하는 BME의 400배 과다 용액 및 단일 C-말단 히스티딘 이미다졸 측쇄와 경쟁하는 이미다졸의 200배 과량 용액에 상응한다. 새로운 기준선을 취해 스펙트럼을 재계산하였다. 두번째 방법에서는, 기준선을 100 μM EDTA를 함유하는 버퍼에 대해 재계산하고, 100 μM EDTA에서 천만배 교환된 PRL-1-WT 샘플에 대한 스펙트럼을 기록하였다. 마지막으로, 10 mg/mL 단백질 샘플을 5.6 M 구아니디니움 하이드로클로라이드중에서 변성시키고, 90℃로 가열하며, 새로운 기준선을 취하여, 스펙트럼을 0, 2, 4 및 6 시간째에서 모았다.
따라서, PRL-1에 의한 금속 배위의 특성을 UV-Vis 흡수 분광학으로 측정하였다. PRL-1 및 그의 돌연변이체가 갖는 금속 배위 기하 도형적 배열을 800-200 nm에서 UV-Vis 흡수 분광학을 사용하여 분석하였다. PRL-1의 흡수 스펙트럼은 280 및 220 nm에서 피크를 생성하였으며, 이는 단백질내의 방향족 및 펩타이드 결합으로부터 일어나고, 브래드포드 분석을 사용하여 측정된 농도와 잘 상응한다. 금속-함유 화합물은 종종 가시 범위에서 수개의 파장들을 흡수하고, Ni- 및 Cu-정제된 PRL-1 단백질은 가시 범위에서 피크를 나타내고, 이는 샘플의 적갈색과 상응한다. PRL-1 WT는 318 nm에서 최대( 매우 큰 280 밴드상에서 어깨(shoulder)로서 명백), 421 nm에서 보다 넓은 시그날 및 526 nm에서 매우 넓은 피크(도 6A)를 보인다. Cu-정제된 PRL-1은 Ni 정제된 PRL-1에 유사한 스펙트럼 프로파일(데이터는 나타나지 않음)을 발생한다; 그러나, 작은 푸른색 시프트(shift)가 개개의 스펙트럼 피크의 경우 관찰되고, 이는 Ni 대신 Cu로 치환됐을 때 예상된다. 예상된 바와 같이, 단백질을 Zn으로 충전된 수지를 사용하여 정제하였을 때, 어떤 흡수 색 또는 볼 수 있는 색이 관찰되지 않았다. 이는 Zn(II)가 완성된 d-껍질을 가지며, 그것만으로 가시 스펙트럼에서 전자 전이를 나타내지 않아야 한다는 사실에 기인한다. WT 단백질과 관련하여, H166A 변이체는 같은 흡수 스펙트럼 파일을 보이나, ICP-MS 결과와 일치하는 정도로 강도에서 감소하였다. PRL-1-WT 및 PRL-1-H166A의 스펙트럼은 가시 지역에서 시스테인 돌연변이체의 것과 다르다. 동등한 농도에서, 시스테인 170 및/또는 171에서 세린으로 개개의 치환은 421 및 526 nm에서 신호의 완전한 상실을 나타낸다. 이들 돌연변이체 단백질을 10 mg/mL(0.5 mM)과 같은 높은 농도에서 조사하였으며, 어떤 특정 흡수 밴드가 검출되지 않았다. 상기 WT로 부터의 신호가 0.1 mg/mL에서 명백하여, Ni의 결합이 각 돌연변이에 의해 적어도 100배 감소됨을 나타낸다.
보정된 WT 단백질의 UV-Vis 스펙트럼의 디콘볼루션(deconvolution)이 300 과 700 nm사이에서 수행되어, 318 nm 피크가 306, 325, 및 372 nm에서 3개의 별개의 흡수 밴드로 구성되어, 각각 총 복합(composite) 피크 흡수에 54%, 38% 및 7% 기여한다는 것을 밝힌다(도 6B). PRL-1-H166A의 흡수 프로파일이 야생형 단백질 스펙트럼과 매우 유사하다. 잔기 166에서의 이미다졸 그룹의 부재는 흡수 최대치를 이동시키지 않거나 318 nm 흡수의 성분 밴드들에 상당히 기여하여, 추가로 NGH 모티프내의 히스티딘으로부터의 이미다졸은 직접적으로 Ni와 배위하지 않음을 나타낸다.
PRL-1에서의 Ni 결합은 PRL-1의 활성 부위에 있는 디설파이드 결합의 환원에 의해 영향을 받지 않는다. 20 mM BME의 첨가는 스펙트럼 흡수 프로파일의 UV 또는 가시 지역을 변경시키지 않아, 금속 결합이 단백질의 환원 및 환원제의 존재에 의해 크게 영향을 받지 않는다는 것을 나타낸다. 산화된 상태로부터 환원된 상태의 스펙트럼을 빼면 환원된 WT 샘플과 산화된 것 사이에 금속 배위에서 상당한 차이는 없다는 것을 나타낸다. His로 부터의 작은 기여가 이뤄지는 지를 조사하기위하여, 추가의 이미다졸을 용액에 첨가하여 전이 결합의 신호 강도를 증가시켰다. 10 mM 이미다졸의 첨가는 흡수 프로파일에 영향을 끼치지 않았고, 이는 Ni에의 접근이 제한된다는 것을 나타낸다. 또한, Ni-정제된 샘플을 이미다졸의 존재하에서 환원시켰을 때, 어떤 스펙트럼 변화도 관찰되지 않았다. 100 μM EDTA를 함유하는 버퍼로 Ni-정제된 WT 샘플의 천만배 교환은 스펙트럼에 어떤 영향을 끼치지 않았고, 이 샘플에 대한 흡수치도 WT 흡수치의 오차 범위내이었다. pH를 7.4에서 8.5로 상승시키는 것은 분자 흡수 계수(ε)를 대략 6배 증가시켰어야 하나, 흥미롭게도, pH가 상승되었을 때 ε에서의 어떤 변화도 관찰되지 않아, 이는 결합된 Ni가 PRL-1안에서 용매 비접근성이라는 것을 제시하는 것일 수 있다. 그러나, pH를 6.5로 감소시키는 것은 가시 피크의 강도를 감소시키지 않는다(데이터는 나타나지 않음).
Ni-정제된 PRL-1로부터의 Ni의 치환이 적극적인(aggressive) 측정을 요구하기 때문에, Ni 결합은 pH 7.4에서 비가역적인 것으로 보인다. Ni-정제된 PRL-1을 90℃에서 5.6 M 구아니디니움 하이드로클로라이드로 처리했을 때, 318, 421 및 526 nm에서의 피크만이 6시간에 걸쳐 점차적으로 사라진다(데이터는 나타나지 않음). 750 nm에서 신호의 동반적인 나타남이 6시간에 걸쳐 관찰되어, 이는 Ni가 단백질로부터 방출되어 8면체 기하 도형적 배열로 물에 의해 배위됨을 나타낸다. 도 6A는 Ni+2 이온의 존재하에서 정제된 PRL-1 변이체의 전자 흡수 스펙트럼을 나타낸다. 각 단백질 변이체에 대한 세개의 스펙트럼이 800 내지 200 nm에서 기록되었고, 평균이 내졌다. 모든 변이체에 대한 단백질 농도는 A280 비교에 기초해서 5 mg/mL 내지 10% 내이었다. 700 내지 300 nm에서의 스펙트럼이 나타나있다. 보이는 특징은 318 및 421 nm 에서의 최대 흡수이다. 도 6A에서, 곡선은 다음과 같다: PRL-1-WT, 흑색; PRL-1-H166A, 붉은색; PRL-1-C170S-C171S, 오렌지색; PRL-1-C170S, 녹색; PRL-1-C171S, 푸른색.
도 6B는 PRL-1-WT의 분석된 스펙트럼이다. 300 과 700 nm사이의 Ni-정제된 PRL-1-WT 단백질의 UV-Vis 스펙트럼의 분석은 5개 곡선을 사용한 데이터와 맞는다. 318 nm 어깨를 306, 325, 및 372 nm에서의 피크로 분석했다. 분석된 흡수 피크들의 합(회색 점선) 및 원 데이터(연속적인 검은 색) 모두가 나타나있다. 421 및 526 nm에서의 피크들도 또한 존재한다.
도 6 B의 삽입도는 600 내지 400 nm에서의 스펙트럼이 421 및 526nm에서의 최대 흡수를 나타내기 위하여 확장된 크기로 나타나있다.
실시예 5
전자분사 이온화 질량분석기(ESI-MS)를 샘플을 분석하기 위하여 사용하였다. 간략하게는, ESI 스펙트럼을 MS 모드로 작동되고 민감성을 위해 8000 해상으로 디튠된(detuned) 비행시간 분석기(FWHH)로 데이터를 얻는 Q-Tof-2(Micromass Ltd., Manchester UK) 혼성 질량 분석기(Hybrid Mass Spectrometer)상에서 얻었다. 완전한 단백질 ESI 스펙트럼 경우, 정제된 단백질 샘플을 pH 8.2의 비처리된("산화") 20 mM 탄산수소암모늄(ammonium bicarbonate)중에서 1 μg/μL로 희석시키고 실온에서 배양했다. 시간 지점들을 정제후 1일, 4일, 및 7일째로 잡고 사용하기 위하여 준비까지 -80℃에서 냉동시켰다. 샘플을 짧은(3 cm x 1mm I.D.) 역상(RP) HPLC(Hamilton PRPI, Reno, NV) 컬럼상에서 탈염시켰다. 샘플을 단백질(5 μg)을 갖는 1% 포름산 용액으로부터 컬럼으로 적재시키고, 같은 용액으로 세척하며, 90% MeOH/0.5% 포름산으로 ESI 공급원으로 직접 용출시켰다. 콘(cone) 전압은 60 eV이었고, 충돌 세포상(collision cell)의 전압은 20 V이었다. 스펙트럼을 800 내지 3000 u의 질량 범위에 걸쳐 얻어, 주기당 5초 동안 데이터를 축적하였다.
트립신 분해경우, PRL-1-WT, PRL-1-H166A 및 PRL-1-C170S-C171S를 20 mM β-머캅토에탄올이 있거나 없는 pH 8.2의 탄산수소암모늄중에 1mg/mL로 희석시키고, 트립신(Promega)을 1:50(w/w)의 프로테아제:단백질 비로 첨가하고, 37℃에서 16 시간동안 배양했다. 완전한 분해를 확인하기 위하여, 다양한 시간 지점에서의 샘플을 SDS-PAGE상에서 런닝시키고, 은 염색으로 시각화하였다. MS 분석과 함께, 모세관(capillary) HPLC 분리를 10 μL/분으로 구배를 발달시키는 크로마토그래프(Waters capLC XL, Milford, MA)와 함께 Micro-Tech Scientific(Sunnyvale, CA)에 의해 패킹된 Zorbax SBC18 RP 컬럼(5 cm x 0.32 mm I.D., 3.5 μm 비드 사이즈, 300 Å 구멍 사이즈)을 사용하여 수행하였다. 20 내지 80% B의 선형 구배가 120분에 걸쳐 적용되었다. 용매는 A 99% H2O, 1% MeOH, B 99% MeOH, 1% H2O, 양쪽 모두 0.08% 포름산이었다. 아르곤을 빔을 약 20%까지 약화시키는 가압하에서 충돌 세포에 가하였다. 이는 공급 레귤레이터상에서는 16 psi나 충돌 세포 근처에 달려있는 게이지상에서는 5.3 x 10-5mBar에 상응한다. 충돌 세포는 최대 전달을 위해 8 V에서 수행되었고, 스펙트럼은 250 내지 2000 u 범위에 걸쳐 얻어, 주기당 8초 동안 데이터를 축적하였다.
[0001] NMR 실험을 샘플을 분석하기 위하여 수행하였다. 간략하게는, 2D 1H-15N HSQC 스펙트럼을 펄스 장(field) 구배가 장착된 극저온의(cryogenic), 3중 공명 프로브를 사용하는 Bruker Advance 800 MHz NMR 분광계상에서 얻었다. 물 억제(water supression)는 플립-백(flip-back) 펄스를 사용하여 달성하였다. 모든 스펙트럼은 37℃에서 얻었고, 1H에서 2048 포인트의 16회 스캔(scan)으로 얻었다. 256 또는 128 증가를 WT 및 C170S-C171S 각각의 경우 15N에서 모았다. 샘플은 50 mM 인산 나트륨, 100 mM NaCl, pH 6.5에서 제조되고, 5% D2O를 함유하였다. WT PRL-1 및 PRL-1-C170S-C171S의 농도는 각각 1.0 mM 및 0.8 mM이었다. 샘플 환원은 적어도 스펙트럼 취득 적어도 24시간 전 10 mM DTT첨가에 의해 달성하였다. 1H 화학적 시프트가 D2O(29)중의 외부 DSS 표본과 관련하여 참조되었다. 1H에 대한 간접적인 참조가 비 13C/1H=0.251449530 및 15N/1H=0.101329118을 가정하여 13C 및 15N에 대해 결정되었다. 데이터 가공 및 스펙트럼 분석을 위하여 컴퓨터 프로그램 nmrPipe 및 Sparky가 사용되었다.
실시예 6
MAP 태그 모티프가 전적으로 금속 결합을 초래하는지를 확인하기 위하여, 본 발명자들은 NCC를 합성하였다. NCC 펩타이드를 합성하고 정제하였으며, 펩타이드를 금속-충전된 IMAC 수지와 함께 배양하였다. 음이온 모드에서 작동되는 전자분사 이온화 질량 분석법(ESI-MS)을 이용하여 착물 형성을 입증하였다(도 3).
NCC 펩타이드에서, 흡수 신호는 PRL-1에 끼워 넣어진 펩타이드-금속 착물에 대해 관찰되는 흡수 신호와 유사하지만, 착물은 트리펩타이드에서 더 노출되었다. 가시 범위에서의 흡수는 pH가 6에서 7.4로 증가할 때 세진다. 산성화는 신호 세기를 감소시키고, 보다 염기성의 pH로 되돌아올 때, 전체 신호는 회복되지 않아, 평면 사각형 기하도형적배열로부터 일부 금속의 비가역적 손실이 발생할 수 있음을 나타낸다. 10으로의 pH 상승은 5번째 리간드, 생각컨대 물 또는 수산화물이 배위되어 사각형 피라미드 배열을 생성시킨다는 것을 시사한다. pH 7.4에서, 아마도 이 리간드는 고도로 교환가능하고 너무 일시적이어서 흡수 분광법에 의해서는 탐지되지 않는다. 교환가능한 리간드는 벌크 용매의 상자성 이완(relaxation)에 대한 수단을 제공하고 MRI에 의해 탐지될 수 있다(도 4). 추가적으로 금속 염을 펩타이드를 함유하는 수용액에 혼합함으로써 금속을 첨가하였다. 조건에 따라, 펩타이드의 흡수 스펙트럼은 금속 이동을 통해 형성된 착물과 평행하거나 전체-길이의 단백질에 대해 얻어진 것과는 분명히 차이가 났다. 차이가 나는 스펙트럼은 이 경우에 금속이 오로지 황에 의해서 배위될 수 있음을 나타낸다. 비록 NCC 펩타이드가 충분히 금속 결합을 부여하지만, 생성되는 착물의 타입은 금속이 펩타이드에 도입되는 방법에 따른다. 금속 교환은 금속을 NCC 트리펩타이드에 투입하여 극히 높은 친화력의 평면사각형 착물을 생성시키기 위한 효과적인 경로를 제공한다.
NGH의 GGH-유사(like) 금속 착물은 도 1에, 구조 1로 도시되어 있다. 본 발명자들은 금속-결합 NCC 착물을 위한 두개의 가능한 화학 구조들을 고안하였으며, 이들은 도 1에, 구조 2 및 3으로 도시되어 있다. 구조 2는 GGH-형 배열로서, 수개의 탈양자화 골격(deprotonated backbone) N 원자들에 의한 금속의 배위(coordination)를 포함한다. 이 경우에, His로부터의 이미다졸리움 질소는 NCC에서 배위 착물의 제3 위치의 Cys로부터의 황으로 치환된다. 이 착물은 3N:1S 배위를 갖게되는데, 이는 본 발명자들의 흡수 스펙트럼과 일치되지 않는다. NCC에 의한 독특하고, 특수한 배위를 확인하기 위해, 또한 NGC를 합성하고 금속 결합에서 중심의 Cys 측쇄의 중요성을 확인하였다. IMAC 수지로 배양된 NGC 펩타이드는 금속-결합 NCC 또는 PRL-1 스펙트럼과 비슷한 흡수 스펙트럼을 나타내지 않는다. 따라서, 본 발명자들은 GGH-유사 배위는 사용하지 않고 특정 기하도형적배열의 금속을 결합시키기 위한 보다 낮은 친화력을 가져야 한다는 결론에 도달했다.
구조 3은 펩타이드 단독 및 보다 큰 단백질 환경 하에 있는 펩타이드 양쪽 모두에 대해 얻어진 데이타와 완전히 일맥 상통한다. 양쪽 모두의 흡수 스펙트럼은 두개의 황 원자들이 두개의 질소 원자와 함께 착물에 참여하고, 그중 하나는 탈양자화되고 다른 하나는 단일의 양자가 부착된다. 구조 3은 N-말단 아민 기를 포함하지 않을 수 있고, 이는 펩타이드와 단백질 스펙트럼의 차이를 야기할 수 있는데, 이 원자가 단백질의 펩티드 결합에 끼워 넣어질 수 있기 때문이다. 부분적으로 이 구조에 기초하여, Q, H, K 또는 P로부터의 질소는 모티프의 제 1 위치의 N을 치환할 수 있다.
금속 결합 위치 및 배위 기하도형적배열을 조사하였다. PRL-1이 2가 금속 양이온을 결합시킨다는 것을 알아냈는데, 이러한 사실은 다른 PTP아제들에 의한 특정 금속 배위결합이 보고된 바 없기 때문에 흥미롭다. PRL-1의 C-말단 서열이 이 효소 계통 중에서 특이하고, GGH-형 모티프(일정한 경우에 금속을 결합할 수 있지만 이 경우에는 그러하지 않음)와 새로운 MAP 태그 모티프 양쪽 모두를 암호화한다. GGH-유사(like) 모티프의 구조는 사각형 평면이다. 농축된 PRL-1 샘플들에서 관찰되는 특징적인 적갈색(rust)은 GGH 펩타이드의 빛깔과 유사하고, 이는 Ni 배위가 사각형 평면 구조에서 일어난다는 것을 시사한다. 추가적으로, 본 발명자들의 연구 결과 Ni이 PRL-1의 C-말단에 결합된다는 것을 알아냈다. 금속 배위결합은 PRL-1의 GGH-형 모티프에 의해 이루어지지 않았는데 본질적일 수도 있는 His의 돌연변이는 결합에 거의 영향을 미치지 않기 때문이다. 양쪽 모두의 트리펩타이드는 사각형 평면 배위를 사용하여 결합한다는 사실에도 불구하고, 각각에 대한 화학적 성질은 구별된다.
Ni-정제 WT PRL-1으로부터 유도된 UV-Vis 스펙트럼은 318, 421 및 526㎚ 근처의 밴드들을 나타낸다. Ni를 질소 리간드를 통해 사각형 평면 기하도형적배열로 결합시키는 펩타이드 및 유기 분자들경우, 420㎚ 근처의 특성 d-d 밴드들이 문헌으로 자주 보고된다. Maroney 등은 ab initio 계산을 수행하고 사각형 평면 구조를 이용하여 Ni(Ⅱ)와 Cu(Ⅱ)를 배위결합시키는 합성 펩타이드 모방물의 스펙트럼 배정을 하였다. 단일 밴드는 예외로 하여, 그들의 관찰결과 및 계산결과들은 PRL-1으로부터 관찰된 스펙트럼과 밀접하게 일치한다. 따로, 축소된, 사각형 평면 형태의 NiSOD는 밀도 기능 이론을 사용하여 분석되었고, 그 결과는 유사한 관련 특징들을 나타낸다. 밴드의 위치 및 이들 시스템의 상대적인 세기의 경향은 PRL-1 단백질 스펙트럼에 잘 보존되었다. 이들 및 다른 연구들에 기초하여, 526㎚ 밴드가 Nixy--> Nix2-y2 전이로부터 일어나는 것 같다. 비슷하게, 421㎚ 밴드가 Niz2--> Nix2 - y2 전이로부터 비롯될 수 있다. 강한 318㎚ 밴드는 리간드-금속 전하 전달 밴드(LMCT)를 반영한다. 스펙트럼 분석은 이 흡수가 306, 325 및 372㎚의 3 밴드들이 복합된 것일 가능성이 있다는 것을 나타낸다. 가이드로서 다른 구조를 사용하여, 306nm에서의 가장 날카롭고 가장 강한 밴드는 다른 두 밴드가 질소 공여 또는 가능하게는 보다 약한 황 공여로부터 생길 가능성이 있으면서 황 원자로부터의 전이에 상응한다.
일련의 C-말단 돌연변이체내에서, 오직 C170 및 C171을 포함하는 돌연변이 만이 이들 파장에서 신호를 폐지시킨다. 가장 주목할만하게는, LMCT에 상응하는 318 nm 인벨롭(envelope)이 시스테인 돌연변이체 스펙트럼에서 결여되어 있다. 전 흡수 프로파일과 관련해서, 시스테인 돌연변이체 경우의 낮은 300 nm 영역에서의 작은 매우 넓은 흡수는, 이것이 318 nm 성분 밴드들의 하나로 부정확하게 위치하므로, 보다 낮은 파장에서의 고강도 밴드로부터의 인공물 또는 산란 효과인 것으로 보인다. Ni d-오비탈(421 nm, 526 nm)내의 전이에 기인할 수 있는 밴드는 ,황이 산소에 의해 치환됐을 때, 또한 부재한다. C170 또는 C171의 돌연변이시 흡수 스펙트럼에 본래의 밴드는 부재하고 어떤 추가의 밴드도 나타나지 않는다. 또한, 이들 잔기를 포함하는 어떤 디설파이드 결합도 MS 데이터에서 관찰되지 않는다. 이와같이, 양 시스테인은 금속 배위에 직접적으로 참여하는 것으로 보인다. 본 발명자들의 ICP-MS 데이터는 C170 및 C171로부터의 양 황원자가, 어떤 황원자도 단독으로는 충분하게 나타나지 않으므로, 단단한 Ni-결합경우 요구되어진다는 것을 추가로 나타낸다.
PRL-1에 의해 생성되는 스펙트럼 특징은 또한 남아있는 두 위치에서 Ni가 질소 원자에 의해 배위된다는 것을 제시한다. 빈번하게, His로부터의 이미다졸리움 N 또는 골격 아미드 N이 Zn, Cu 및 Ni와 같은 금속과 배위한다는 것이 관찰된다. 사각형 평면 기하도형적배열을 이용하여 Ni와 결합하는 모델 펩타이드 및 단백질에서, 결찰하는(ligating) 질소 그룹의 일부는 탈양자화되고, 음으로 하전된 종은 금속과 결합한다. 526 nm에서의 흡수 밴드는 PRL-1이 탈양자화된 질소를 통해 Ni와 배위한다는 것을 나타내고, 반면에 PRL-1 스펙트럼에서 발생된 421 nm 흡수는 단일 양자화(protonated) 질소에 의한 배위(coordination)를 반영한다. PRT-1-H166A를 만들기 위해서 GGH-유사 모티프에서 His의 돌연변이는 이 히스티딘 측쇄가 실질적으로 Ni 결합에 영향을 주지않는다는 것을 밝혀냈다. PRL-1은 서열의 먼 영역에 위치하고 변성 조건동안 단단하게 결합되어 있는 것 같지 않은, H166, H23, H64 및 H103외의 세개의 다른 His를 암호화한다. 금속을 방출하기 위하여 단백질을 풀려는 시도는 고온에서 수시간동안 고농도의 변성제로 격렬한 처리를 요구했다. 화학적 및 열 변성이 오직 Ni의 느린 방출을 허용하고 CD 데이터가 PRL-1이 Ni가 방출되기전에 완전히 풀리는 것을 보이기 때문에, 금속은 단백질의 짧은 단편(segment)에 뭉쳐있는 원자들에 의해 배위되는 것 같다.
GGH-유사 펩타이드는 모티프내의 탈양자화 골격 아미드 질소에 의해 부분적으로 달성되는 매우 단단한 결합(Kd ~10-17 - 10-18)을 달성한다. PRL-1경우 관찰되는 매우 단단한 결합 및 Ni 결찰에 대한 질소 원자의 예견된 기여에 비추어, PRL-1 로 부터의 골격 아마이드는 금속 배위에 참여할 수 있다. 어느 하나의 시스테인의 부재가 결합을 파괴하고, 끝을 자름(truncation)이 측쇄 및 골격 아마이드를 제거하기 때문에, 메탈레이션(metallation)이 C170 및 C171에 인접한 아마이드 질소를 포함한다는 가설을 돌연변이유발을 이용하여 시험하는 것이 용이하지가 않다. 구조적 연구가 추가의 배위 원자들을 확인하는 가장 좋은 방법이고, 이들 연구는 본 발명자들의 연구소에서 진행중이다.
실시예 7
생리적 pH에서 Cu-NCC를 염수 백(bags)으로 둘러싸인 튜브에 위치시키고 University of Kansas Medical Center에 있는 Hoglund Brain Imaging Center에서 표준 MRI를 사용하여 영상화했다(도 4). 도 4에서, 중심에 있는 밝은 신호가 Cu-NCC 착물에 상응하고, 반면에 덜 밝은 신호는 염수 용액에 상응한다. 검은 부분은 튜브와 공기에 상응한다.
그러므로, 본 발명은 본 명세서에 본래 있는 것 뿐만 아니라 언급된 목표 및 잇점을 얻는데 잘 적응된다. 본 발명은 취지 및 본질적인 특징에서 이탈됨이 없이 다른 특정 형태로 구현될 수 있다. 기술된 구현예는 모든 면에서 단지 예시적이며, 제한적이 아니라고 여겨져야 한다. 그러므로, 본 발명의 범주는 앞서의 기술보다는 첨부된 청구범위에 의해 나타내진다. 청구범위의 동등 의미 및 범위에 들어오는 모든 변화는 본 발명의 범주에 포함된다. 본 명세서에서 인용된 모든 참조는 특정 참고로 본 명세서에 혼입된다.
<110> THE UNIVERSITY OF KANSAS <120> Metal Abstraction Peptide(MAP) Tag and Associated Methods <130> ip-2013-0095 <140> PCT/US2009/43821 <141> 2009-05-13 <150> 61/052918 <151> 2009-05-13 <160> 3 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer C170S <400> 1 ggtcatagaa acaactcttg cattcaataa ggatc 35 <210> 2 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer C171S <400> 2 ggtcatagaa acaactgttc cattcaataa ggctgtaact c 41 <210> 3 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer H166A <400> 3 cgtttcaaac attccaacgg tgctagaaac aactgttgca ttc 43

Claims (21)

  1. 서열 XC1C2를 포함하는 단리된 펩타이드; 및 금속 원자 또는 금속 이온이 사각형(square) 평면 배향 또는 사각형 피라미드 배향으로 결합 되도록 상기 서열 XC1C2 안에 결합된 금속 원자 또는 금속 이온을 포함하고,
    상기 X는 서열 XC1C2가 사각형 평면 배향 또는 사각형 피라미드 배향으로 금속 원자 또는 금속 이온과 결합할 수 있게 하는 임의의 비-시스테인 아미노산이며; 상기 C1 및 C2는 같거나 상이하고; 상기 C1 및 C2는 개별적으로 시스테인 및 시스테인-유사 비천연성 아미노산으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 X는 아스파라긴, 글루타민, 히스티딘, 라이신 및 아르기닌으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 펩타이드는 폴리펩타이드 안에 포함되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  4. 제 1 항에 있어서, 상기 펩타이드는 비-펩타이드 성분(entity)에 연결되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  5. 제 1 항에 있어서, 상기 금속 원자 또는 금속 이온은 Pt 및 Pd로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  6. 제 1 항에 있어서, 상기 금속 원자 또는 금속 이온은 Zn, Ni, Au, Ag, Pb, 및 Fe로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  7. 제 1 항에 있어서, 상기 금속 원자 또는 금속 이온은 방사성 동위원소인 것을 특징으로 하는 조성물.
  8. 제 1 항에 있어서, 상기 금속 원자 또는 금속 이온은 Cu인 것을 특징으로 하는 조성물.
  9. 제 8 항에 있어서, 상기 금속 원자 또는 금속 이온은 62Cu인 것을 특징으로 하는 조성물.
  10. 금속-펩타이드 착물(complex)을 제조하는 방법으로서,
    i) 금속 원자 또는 금속 이온을 용액에서 또는 고체 지지체 상에서 킬레이팅제에 노출시키는 단계; 및
    ii) 서열 XC1C2를 포함하는 펩타이드를 상기 금속 원자 또는 금속 이온과 결합시켜 금속-XC1C2 착물을 형성하고, 상기 X는 임의의 비-시스테인 아미노산이며; 상기 C1 및 C2는 같거나 상이하고; 상기 C1 및 C2는 개별적으로 시스테인 및 시스테인-유사 비천연성 아미노산으로부터 선택되는 단계를 포함하고;
    상기 금속 원자 또는 금속 이온은 상기 서열 XC1C2 안에서 사각형 평면 배향 또는 사각형 피라미드 배향으로 결합 되는 것을 특징으로 하는 금속-펩타이드 착물을 제조하는 방법.
  11. 제 10 항에 있어서, 상기 X는 아스파라긴, 글루타민, 히스티딘, 라이신 및 아르기닌으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 금속-펩타이드 착물을 제조하는 방법.
  12. 제 10 항에 있어서, 상기 금속 원자 또는 금속 이온은 Zn, Ni, Pt, Pd, Au, Ag, Pb, 및 Fe로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 금속-펩타이드 착물을 제조하는 방법.
  13. 제 10 항에 있어서, 상기 금속 원자 또는 금속 이온은 방사성 동위원소인 것을 특징으로 하는 금속-펩타이드 착물을 제조하는 방법.
  14. 제 10 항에 있어서, 상기 펩타이드는 비-펩타이드 성분에 연결되는 것을 특징으로 하는 금속-펩타이드 착물을 제조하는 방법.
  15. 제 10 항에 있어서, 상기 펩타이드는 폴리펩타이드 안에 포함되는 것을 특징으로 하는 금속-펩타이드 착물을 제조하는 방법.
  16. 제 10 항에 있어서, 상기 킬레이팅제는 고체 지지체에 연결되는 것을 특징으로 하는 금속-펩타이드 착물을 제조하는 방법.
  17. 제 10 항에 있어서, 상기 킬레이팅제는 이미노디아세트산(IDA) 및 니트릴로트리아세트산(NTA)으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 금속-펩타이드 착물을 제조하는 방법.
  18. 제 10 항에 있어서, 상기 금속 원자 또는 금속 이온은 Cu인 것을 특징으로 하는 금속-펩타이드 착물을 제조하는 방법.
  19. 제 18 항에 있어서, 상기 금속 원자 또는 금속 이온은 62Cu인 것을 특징으로 하는 금속-펩타이드 착물을 제조하는 방법.
  20. 제 10 항에 따라 제조된 금속-펩타이드 착물을 포함하는 금속 펩타이드 착물로 영상화하기 위한 조성물로서, 상기 조성물은 생물학적 샘플에 투여되고, 영상을 얻는 것을 특징으로 하는 조성물.
  21. 제 20 항에 있어서, 상기 영상화가 대상자(subject)에서 일어나는 것을 특징으로 하는 조성물.
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