JP3086301B2 - L−グロノ−ガンマ−ラクトン脱水素酵素 - Google Patents
L−グロノ−ガンマ−ラクトン脱水素酵素Info
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Description
からL−アスコルビン酸を微生物学的に製造する新規な
方法、L−グロノ−ガンマ−ラクトンの微生物学的酸化
に対応する酵素の製造法、およびL−グロノ−ガンマ−
ラクトン脱水素酵素である精製された状態の酵素に関す
る。
る新規なL−グロノ−ガンマ−ラクトン脱水素酵素(以
後、GLDHと称する)は、L−グロノ−ガンマ−ラク
トンからL−アスコルビン酸への酸化を触媒する。
−アスコルビン酸(II)への酸化を触媒する酵素は知
られている。
Biophy.,175,427−435,197
6)、ヤギの肝臓(Arch.Biochem.Bio
phy.,175,427−435,1976)及びニ
ワトリの腎臓(Biochemistry,21,50
76−5082,1982)からL−グロノ−ガンマ−
ラクトン酸化酵素を単離した。これらの酵素は、Iから
IIへの酸化において直接電子の受容体として酸素分子
を利用するが、本発明により提供されるGLDHはそれ
を利用しない。さらに、それらは、いずれも単一のユニ
ットから構成されているが、本発明で提供されるGLD
Hは、3種類のサブユニットから構成されている。ま
た、錦見らはパン酵母(baker’s yeast)
からL−ガラクトノ−ガンマ−ラクトン酸化酵素を単離
した(Arch.Biochem.Biophy.,1
91,479−486,1978)。この酵素は、L−
ガラクトノ−ガンマ−ラクトン及びL−グロノ−ガンマ
−ラクトン両者の、L−アスコルビン酸への酸化を触媒
する。他方、Bleegらは、サッカロミセスセレヴィ
シェ(Saccharomyces cerevisi
ae)からL−ガラクトノ−ガンマ−ラクトン酸化酵素
を単離した(Eur.J.Biochem.,127,
391−396,1982)。この酵素は、L−ガラク
トノ−ガンマ−ラクトンに対して活性を示す事が報告さ
れているが、L−グロノ−ガンマ−ラクトンに対しては
活性を示さない。しかし、本発明で提供されるGLDH
は、基質としてL−ガラクトノ−ガンマ−ラクトンを利
用できない。
は、その基質特異性において酵母のL−ガラクトノ−ガ
ンマ−ラクトン酸化酵素とは明らかに異なる。他方、重
岡らは、ユーグレナ ガラシリス(Euglena g
racilis)Z(Agric.Biol.Che
m.,43,2187−2188,1979)の粗精の
L−グロノ−ガンマ−ラクトン脱水素酵素、すなわちL
−グロノ−ガンマ−ラクトンとL−ガラクトノ−ガンマ
−ラクトンの両者の酸化を触媒し、電子受容体として酸
素を利用しない酵素の特徴を報告した。さらに藻類は、
それらの微生物の生育に対して遭遇する問題点(こわれ
やすさ、細胞***及び長期間を要することを含む)によ
って取扱うことが難しいことがよく知られている。
の基質特異性の点で明らかにそれとは異なる。加うる
に、ユーグレナ グラシリスZのL−グロノ−ガンマ−
ラクトン脱水素酵素の単離に関して、現在まで報告はな
い。
−ガンマ−ラクトンからL−アスコルビン酸への変換
は、現在まで報告されていない。しかし、本発明によれ
ば、バクテリアがL−グロノ−ガンマ−ラクトンからL
−アスコルビン酸を生産しうることが見出された。この
ことは、バクテリアを利用することによるL−グロノ−
ガンマ−ラクトンからL−アスコルビン酸の生産を、初
めて可能にする。
クトンをL−アスコルビン酸に酸化する脱水素酵素活性
を有する例えばバクテリア由来の精製酵素の開示は存在
しない。即ち、特定の微生物のバクテリア細胞の可容性
画分から単離した精製酵素がL−グロノ−ガンマ−ラク
トンのL−アスコルビン酸への酸化を触媒するというこ
とを発見し、本発明はこの発見に基いてなされたもので
ある。
L−グロノ−ガンマ−ラクトンに作用してL−アスコル
ビン酸を生産する新規なGLDHを提供するものであ
る。本発明のもう1つの目的は、細胞内に新規なGLD
Hを生産しうる微生物、例えば、グルコノバクター属に
属する微生物又はその突然変異株を培養し、細胞を破壊
し、破壊した細胞の無細胞抽出液、好ましくは微生物の
可溶性画分から単離、精製することを特徴とする、新規
なGLDHの製造法を提供することにある。また、本発
明の他の目的は前記の酵素を利用するL−アスコルビン
酸の製造法を提供することにある。さらに本発明の目的
はバクテリアを用いた発酵法によるL−アスコルビン酸
の製造法を提供することにある。また、本発明の別の目
的は、前記した酵素活性を有する微生物を提供すること
にある。これらの目的は以下の記載からより明らかにな
る。
の物理化学的諸性質は、次の通りである:
は、以下に示す反応に従って電子受容体の存在下、L−
グロノ−ガンマ−ラクトンのL−アスコルビン酸への酸
化を触媒する:
ない。これは、上記の電子受容体として、酸素を用いた
時、L−グロノ−ガンマ−ラクトンをL−アスコルビン
酸に変換する酵素の触媒活性が認められなかった事によ
り、確認した。さらに、酸素電極によって検知される酸
素消費は、反応混合液中において見出されなかった。し
かし、電子受容体として作用する能力を有する従来のど
の化合物も、本発明の酵素に関連して用いることができ
る。そのような電子受容体として、補酵素又はそのよう
な補酵素作用を示す化合物、例えば、2,6−ジクロロ
フェノールインドフェノール(以後、DCIPと称す
る)、フェナジンメト硫酸、ウルスターブルー、フェリ
シアニド、補酵素Q、チトクロームCなどを用いること
ができる。
CIPの吸光度の減少を25℃で分光光度測定的に測定
することで行なった。酵素活性は、1分間当り、1μM
のDCIPを還元するに要する酵素量を1単位と定義し
た。pH7.0におけるDCIPの吸光係数は、14.
5mM-1とした。1cm光路のセルは最終容積0.5m
l中に0.16mM DCIP、1.6mMフェナジン
メト硫酸、200mMリン酸カリウム緩衝剤、400m
M L−グロノ−ガンマ−ラクトンと、酵素溶液及び水
を含む。対照用セルは、L−グロノ−ガンマ−ラクトン
を除く上記全ての成分を含む。反応は、L−グロノ−ガ
ンマ−ラクトンの添加によって開始した。酵素活性は、
DCIPの初期還元速度として測定した。
−グロノ−ガンマ−ラクトンの代わりに各種の基質溶液
(400mモル)を用いた以外前記したと同様な酵素活
性測定法を用いて測定した。測定結果を表1に示す。G
LDHは、L−グロノ−ガンマ−ラクトン及びD−キシ
ロースに強く作用し、D−グロノ−ガンマ−ラクトン、
D−グルコース及びD−マンノースに弱く作用する。
液中のpHとの相関関係は、各種pH緩衝液を用いた以
外1)に述べたと同様の酵素測定法を用いて調べた。結
果を表2に示す。該酵素は、7.0から8.0のpHの
範囲で最も高い酵素活性を示した。
pH緩衝液中に192時間放置した。残存酵素活性は、
1)に記載したのと同様な酵素測定法を用いて測定し
た。測定結果を表3に示す。精製酵素は、pH6.5か
ら9.2の範囲のいかなるpHにおいても比較的安定で
あった。
リン酸カリウム緩衝液(pH7.0)中、各種の温度で
5分間処理し、次いで冷水で急速に冷却した。残存酵素
活性を1)に記載したのと同様の酵素測定方法を用いて
測定した。この結果を表4に示す。精製酵素は、30℃
まで安定であり、55℃および60℃における処理後の
活性は、それぞれ約50%、及び80%失活した。
1)に記載したのと同様の酵素測定方法を用いて25℃
から55℃の温度で測定した。結果を表5に示す。測定
範囲内では本酵素は明瞭な至適温度をもたなかった。
0mM塩化ナトリウムを含む100mMリン酸カリウム
緩衝液(pH7.0)で平衡化した大きさ排除型(si
ze exclusion)ゲルカラム(TSK ge
l G3000 SW×Lカラム、7.8mm×30c
m)を用い、高速液体クロマトグラフィーで測定した。
分子量の標準としてシアノコバラミン(M.W.1,3
50)、ミオグロビン(M.W.17,000)、卵白
アルブミン(M.W.44,000)、ガンマ−グロブ
リン(M.W.158,000)及びチログロビン
(M.W.670.000)を用いた。GLDHの分子
量は110,000±2,000であった。
成分の分子量を測定した。精製したGLDHを、β−メ
ルカプトエタノールの存在下、ドデシル硫酸ナトリウム
(以後、SDS.と称する)で処理し、0.1%SDS
を含む100mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH7.
0)で平衡化した前記と同様のカラムにかけた。分子量
の標準としてリゾチウム(M.W.14,000)、大
豆トリプシンインヒビター(M.W.21,500)、
炭酸脱水素酵素(M.W.31,000)、卵白アルブ
ミン(M.W.45,000)、牛血清アルブミン
(M.W.66,200)、及びホスホリラーゼB
(M.W.92,500)を用いた。本酵素は各々の分
子量が61,000、32,500及び16,500の
3つのサブユニットから成る。これらの3種の分子量の
合計は、天然のGLDHの総分子量である110,00
0である。
色されないゲルに紫外線を照射すると強いケイ光を示す
事から最も大きな成分(M.W.61,000)は、お
そらくフラボプロティンであると思われる。ヘム染色に
よって染色される第2の成分(M.W.32,500)
は、おそらくチトクロームであると思われる
0)は、単純蛋白、たとえば、補欠分子族を持たない蛋
白である。要約すると、各々の分子量は、 61,000±1,000 32,500±1,000 16,500± 500 であり、標準偏差は、SDS電気泳動で普通に見られる
ようなものである。
べる様なAnalytical Biochemist
ry 75、168−176(1976)にP.E.T
homasらによって報告された方法に従って実施し
た。
チルベンジジン(TMBZ)溶液をメタノール中で新た
に調整した。使用直前にTMBZ溶液の3部をpH5.
0、0.25Mの酢酸ナトリウム7部と混合した。ゲル
を混合液中に浸し、室温、暗所で2時間間欠的に攪拌し
た。チトクロームを含む第2のタンパク質成分を染色す
るために、過酸化水素を最終濃度が、30mMになるよ
うに加えた。
ウムで還元した精製GLDHの吸収スペクトルは、可視
領域で416、521及び552nmに極大吸収を示
し、図1に示すようにチトクロームc成分の存在を示
す。
素測定方法を用いて、0.18mMから90mMのL−
グロノ−ガンマ−ラクトンの濃度変化に伴う酸化反応速
度を測定し、L−グロノ−ガンマ−ラクトンに対するK
m値を求めた。最大反応速度は、約71.8mMの基質
濃度においてみられた。ミハエリス定数(Km)は、電
子受容体としてDCIPを用いた時、34.8mMと算
出された。
たと同様の酵素測定方法を用いて、酵素活性に対する各
種金属イオンの影響を調べた。結果は表6に示した。C
u2+及びMn2+は、酵素の強い阻害活性を示した。
する各種インヒビターの影響を調べた。結果は表7に示
した。調べられたいずれの化合物もGLDHに対して阻
害作用を示さなかった。
ラクトン脱水素酵素の精製を、たとえば、イオン交換ク
ロマトグラフィー、液体クロマトグラフィー、吸着クロ
マトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、ゲル−
電気泳動、塩析及び透析など既知の精製方法の組合せに
よって行った。
ウム(Bacillusmegaterium)の存在
下、共に培養した時に、良好な増殖を示すグルコノバク
ター属に属する全ての株を含む。該微生物の突然変異株
及び誘導体も、本発明で使用しうる。好しい株はグルコ
ノバクターオキシダンスである。
of Determinatiue Bactcri
olgy,第8版、1974に参照し、特に菌株が以下
の様な特徴をもつという事実にもとづいて、グルコノバ
クター、オキシダンスとして命名、分類されている。
グロン酸を生産する、 b) エタノールを酢酸に酸化する。 c) D−グルコースをD−グルコン酸及び−2−ケト
−D−グルコン酸に酸化する、 d) 多価アルコールのケトジェネシス、 e) pH4及び5においてマンニトール培養液(24
時間培養)中、薄膜及 び環状の生育を示し、pH4.5においてD−グルコー
ス培養液中、薄膜状の生育を示す。
には生産しない、 g) D−ソルビトール及びD−グルカル酸から2−ケ
ト−D−グルコン酸を産生するが、D−グルコース、D
−フルクト−ス、D−グルコン酸、D−マンニトール又
は2−ケト−D−グルコン酸からは産生しない、 h) 多形であり、ベン毛はない、 i) D−フルクトースから茶色の色素を産出する、 j) バチルスメガテリウム又はその細胞抽出物と共に
培養すると成育が良い、 k) ストレプトマイシン感受性、
ス株は1987年3月17日にDSM4025としてG
oettingenのDeutsche Sammln
uugvon Mikroorgarismerに寄託
されている。
は、端が丸い棹状である。グルコノバクターオキシダン
ス株細胞の直径は、平均で約0.3ないし0.6μmで
あり、その長さは約0.9ないし1.6μmであり、多
くは1ないし1.5μmである。
的条件下で、適当な栄養物を加えた水性培地中で培養し
てもよい。培養は、約4.0ないし9.0、好ましくは
約6.0ないし8.0のpHで行なうことができる。培
養期間は、pH、温度又は栄養培地によって種々異なる
が通常2〜5日間で好ましい結果が得られる。培養を行
なうのに好ましい温度範囲は約13ないし36℃、より
好ましくは、18ないし33℃である。
機物、ビタミン類、微量元素及び他の成育促進因子など
を含むことが通常必要である。同化炭素源として、L−
ソルボース、グリセロール、D−グルコース、D−マン
ニトール、D−フルクトース、D−アラビトール等を用
いることができる。種々の有機又は無機物質、例えば酵
母抽出物、肉抽出物、ペプトン、カゼイン、コーンステ
ィープリカー、尿素アミノ酸、硝酸塩、アンモニウム塩
等も窒素源として用いることができる。無機物質とし
て、硫酸マグネシウム、リン酸カリウム、塩化第一及び
第二鉄、炭酸カルシウム等を用いることができる。
離、精製の実施様態について要約する。
養液から回収する。 (2) その菌体を、緩衝液に懸濁し、ホモジェナイザ
ー、超音波粉砕機又はリゾチーム処理等によって破壊す
る。 (3) GLDHを、破壊細胞の無細胞抽出液、好しく
は、微生物の可溶性画分から単離、精製する。
ィ 4) セファクリル S−300 カラム クロマトグ
ラフィ又は 5) ポリアクリルアミド ゲル電気泳動等 のカラム クロマトグラフィを用いることが好ましい。
ノ−ガンマ−ラクトンからL−アスコルビン酸製造用の
触媒として有用である。反応は、マッキルベイン緩衝
液、リン酸カリウム緩衝液、トリス−塩酸緩衝液などの
溶媒中、DCIP、PMS、ウルステルブルー、フェリ
チアニド、補酵素Q、チトクロームCなどの電子受容体
の存在下、6.0ないし9.0のpH値において行な
う。
から55℃である。pHと温度をそれぞれ7.0から
8.0及び30から50℃に設定した時、通常最も好ま
しい反応結果が得られる。溶媒中の基質としてのL−グ
ロノ−ガンマ−ラクトンの濃度は、他の反応条件によっ
て種々異なるが、一般的に約10から150g/l、最
も好しくは約10から100g/lが好ましい。
に固定化状態で使用してもよい。当業界において一般に
知られているいかなる酵素の固定化方法を用いてもよ
い。例えば酵素を官能基を有する樹脂膜、顆粒等に直接
結合してもよく、又はグルタールアルデヒド等の二官能
性基を有する架橋化合物を介して樹脂に結合させてもよ
い。
タが適用され、その方法は、それぞれ次の様な方法に従
って好適に実施される:IIを産生しうる微生物を、化
合物Iの存在下、栄養培地中で培養するか、又はその成
育後、緩衝液中、Iと接触させ、さらに培養する。
ター属に属するバクテリア:例えば、アセトバクターサ
ブオキシダンス(Acetobacter subox
ydans)(DSM5935)、アセトバクターオキ
シダンス(Acetobacter oxydans)
(DSM5936)、アセトバクターメラノゲネス(A
ctobacter melanogenus)(NC
IMB8086)グルコノバクター属、に属するバクテ
リア:例えば、グルコノバクターオキシダンス(Glu
conobacter oxydans)(ATCC6
21) グルコノバクターオキシダンス(Gluconobac
ter oxydans)(DSM4025) さらに適当なバクテリアとしては:アクチノマイセス
属、に属するバクテリア:例えばストレプトマイセス、
例えば、ストレプトマイセス アンチバイオティカス
(Streptomycesantibioticu
s)(ATCC 8633)、ストレプトマイセス ユ
ーロシジカス(Streptomyces euroc
idicus)(ATCC 19551)、ストレプト
マイセス ラヴェンズラ(Streptomyces
lavendulae)(DSM 5926)、ストレ
プトマイセス オリバセウス(Streptomyce
s olivaceus)(ATCC 3335)、ス
トレプトマイセス ネトロプシス(Streptomy
ces netropsis)(NRRL 2268)
ization Researchand Devel
opment Division of U.S.D.
A.,Peoria,Illinois USA ATCC=American Type Cultur
e Collection,Rockville,Ma
ryland,USA NCIMB=National Collection
of Industrial + Marine B
acteria,Torry ResearchSta
tion,Aberdeen AB98DG,Scot
land〕
トバクター属及びグルコノバクタ−属に属する種で、特
にアセトバクターサブオキシダンス株とグルコノバクタ
ーオキシダンス株である。これらの株は、本製法の保全
のために寄託されている。
は、本発明の醗酵工程に供せられる前に栄養培地中で十
分生育すべきであることが理解される。その生育は、水
性培地中で可能である。
変換反応に用いることができる。
えていない緩衝液中で別個に生育させた微生物と基質
(educt)Iの溶液を合する等によってより単純な
ものでよい。
とが好ましく、更に好ましくは、約4ないし7の範囲で
ある。所望により、pH値は緩衝液系で調節してもよ
い。
(重量)の範囲の基質使用することが望ましい。
あり、特に4から72時間が好ましい。基質Iの連続供
給は、培養時間を延長せしめる。
解される。この様な条件は、空気下、又は追加的通気条
件下で反応培地を激しく振とう又は攪拌することによっ
て満足される。
明する。
の培養 グルコノバクターオキシダンスDSM4025を、マン
ニトール5.0%、MgSO4 ・7H2 O 0.25
%、コーンスティープリカー1.75%、パン酵母5.
0%、尿素0.5%、CaCO3 0.5%及び寒天2.
0%を含む寒天斜面培地上、27℃で4日間生育させ
た。寒天斜面培地に生育したグルコノバクターオキシダ
ンスDSM4025の一白金耳を500ml容のエレン
マイヤーフラスコ中、L−ソルボース8.0%、グリセ
ロール0.05%、尿素0.5%、MgSO4 ・7H2
O 0.25%、コーンスティープリカー1.75%、
パン酵母5.0%及びCaCO3 1.5%を含む種培地
50mlに接種し、回転型振とう機(180rpm)
上、30℃で1日培養した。この培養液5mlを、50
0ml容エレンマイヤーフラスコ中の同一の培地50m
lに移し、前記したのと同様の方法で培養した。このよ
うに調製した種培養2リットルを、L−ソルボース8.
0%、グリセロール0.05%、尿素1.2%、MgS
O4 ・7H2 O 0.25%、コーンスティープリカー
3.0%、パン酵母5.0%及びCaCO3 1.5%を
含む20リットルの培地が入った30リットル容醗酵槽
に接種した。醗酵槽を、30℃、400rpm攪拌及び
0.5vvm(空気の体積/培地の体積/分)の通気で
操作した。40時間培養後、培養液を1,500rpm
で10分間遠心して炭酸カルシウムを除去し、8,00
0rpm(10,000×g)で遠心して培養菌体を得
た。菌体を0.85%のNaCl溶液で1回洗浄した。
20リットルの培養液から、約100g(湿重量)の菌
体が得られた。
SM4025(95g、湿重量)の菌体を、0.85%
NaCl溶液で2回洗浄した。洗浄菌体を、10mMリ
ン酸カリウム緩衝液(pH7.0)380ml中に懸濁
し、菌体懸濁液の菌体を、フレンチプレスホモジェナイ
ザーを用い、1500kg/cm2で潰した。1800
×gで10分間遠心して菌体残査を除去し、次にその上
清(以後無細胞抽出物と称する)を、100,000×
gで、60分間遠心した。得られた上清(450ml)
を、グルコノバクターオキシダンスDSM4025細胞
の可溶性画分として集めた。
EAEと称する)セルロースカラムクロマトグラフィー 前記工程で得られた可溶性画分(450ml)を、10
mMリン酸カリウム緩衝液(pH7.0)で透析した。
透析物(500ml)を、10mMリン酸カリウム緩衝
液(pH7.0)で平衡させたDEAE−セルロースカ
ラム(2.5×120cm)にかけた。カラムを、同一
の緩衝液で洗浄し、次に0.25M塩化ナトリウムを含
む同一の緩衝液で洗浄した。GLDHを、0.5M N
aClを含む同一の緩衝液で溶出させた。
ラフィー 前記工程から得られた活性画分(200ml)を、10
mMリン酸カリウム緩衝液(pH7.0)2リットルで
2回透析し、同一の緩衝液で平衡にしたQ−セファロー
スカラム(2.5×50cm)にかけた。同一の緩衝液
でカラムを洗浄した後、0.3Mから0.5M NaC
lの直線勾配でGLDHを溶出させた。
−gel HTP)カラムクロマトグラフィー 前記工程から得られた活性画分(210ml)を、10
mMリン酸カリウム緩衝液(pH7.0)2リットルで
2回透析し、同一の緩衝液で平衡にしたハイドロキシア
パタイトカラム(2.5×25cm)にかけた。カラム
を同一の緩衝液で洗浄し、10mMから40mMリン酸
カルシウム緩衝液(pH7.0)の直線勾配でGLDH
を溶出させた。酵素活性をもつ画分を、合し、限外ろ過
膜(pM10、Amicom)を用いた限外ろ過法によ
って約20mlまで濃縮した。
ロマトグラフィー 前記工程からの酵素画分(2ml)の一部を、50mM
NaClを含む50mMリン酸カリウム緩衝液(pH
7.0)で平衡化したセファクリルS−300カラム
(1.0×100cm)にかけ、同一の緩衝液で展開し
た。電気泳動的に均質なGLDHを含む画分を合し、−
80℃で保存した。
00倍に精製した。GLDHの精製工程の要約を表8に
示した。
ルアミドゲル電気泳動(分離ゲル:10%ポリアクリル
アミド:電気泳動の条件:20mA、4℃で6時間)を
行なった。酵素は、クマシーブリリアントブルーR−2
50で染色される単一のバンドをもたらした。染色され
ないゲルを、50mM L−グロノ−ガンマラクトン、
ニトロブルーテトラゾリウム20μg/ml及びフェナ
ジンメト硫酸40μg/mlを含む50mMリン酸カリ
ウム緩衝液(pH7.0)に20分間浸した際、上記単
一バンドの位置にGLDH活性を示した。
mgタンパク)、0.5Mリン酸カリウム緩衝液(pH
7.0)1.0ml、L−グロノ−ガンマ−ラクトン
0.1g、10mMフェナジンメト硫酸0.1ml及び
最終容積を2.0mlにする水を含む反応混合物を、3
0℃で2時間インキュベートした。反応生成物を、薄層
クロマトグラフィー及び高速液体クロマトグラフィの両
方で分析した。薄層クロマトグラフィは次の様に行なっ
た:サンプル(1μl)を、シリカゲルプレート(Me
rck,U.S.A.)上にスポットし、室温で2時
間、n−プロパノール−水−1%リン酸−ギ酸(40
0:100:10:1)の溶媒系で展開した。次にプレ
ートを乾燥し、紫外線ランプのもとで観察した。生成物
は、L−アスコルビン酸の標準サンプルと同一の位置
(Rf値:約0.7)に、紫外線吸収スポットとして認
められた。高速液体クロマトグラフィーは以下の様に行
なった:サンプルを、アセトニトリル−水−酢酸(8
7:11:2)の溶媒系で平衡にしたLiChroso
rb NH2 カラムにかけた。流速を3.0ml/分に
し、254nmにおいて生成物の検出を行なった。結果
として、生成物は、L−アスコルビン酸の標準サンプル
と同一の保持時間で溶出した。
ビン酸であると同定された。L−アスコルビン酸の生産
能力は0.71g/l/時であった。
L−アスコルビン酸の生産
法で調製したグルコノバクターオキシダンスDSM40
25の種培養200mlを、3リットル容醗酵槽中のL
−グロノ−ガンマ−ラクトン8%、グリセロール0.0
5%、パン−酵母5.0%、MgSO4 ・7H2 O
0.25%、コーンスティプリカー1.75%、尿素
0.5%及びCaCO3 1.5%(初期pHを7.0に
設定)を含む2リットルの培地に接種した。培養を70
0rpmで攪拌し、0.5vvmで通気しながら30℃
で行なった。表9に示すように、66時間の培養でL−
アスコルビン酸8.6g/lが生産された。
アスコルビン酸の生産
法で調製したグルコノバクタ−オキシダンスDSM40
25の菌体0.1gないし0.67gを、L−グロノ−
ガンマ−ラクトン47.6mg/ml又は89.3mg
/lを含む50mMリン酸カリウム緩衝液(pH7.
0)に加え、総容積を3mlとした。反応混合液を攪拌
(280rpm)しながら、30℃で6時間インキュベ
ートした。結果を表10に示す。L−アスコルビン酸の
最大生産性は、20mg/時/g細胞であった。L−ア
スコルビン酸の最大収率は、13.92g/lであっ
た。
抽出液を用いてのL−グロノ−ガンマ−ラクトンからL
−アスコルビン酸の生産
と同様の方法で調製したグルコノバクターオキシダンス
DSM4025の無細胞抽出液(タンパク含有:10.
3mg/ml)1.0ml、0.5Mリン酸カリウム緩
衝液(pH7.0)1ml及び17.8%L−グロノ−
ガンマ−ラクトン0.5mlを含む反応混合液を、30
℃で17.5時間インキュベートした。結果としてL−
アスコルビン酸2.19g/lが生産された。
M5935) を、培地1(組成:pH6.5に調製した
水道水中の50%酵母水、5%マンニット)の寒天斜面
上で生育させた。30℃で2日間培養後、一白金耳の細
胞を、5mlの液体培地1(寒天以外は前記と同一の成
分)に接種した。試験管を、30℃,220rpmで3
日間攪拌した。1mlの予備培養液を基質Iと共に10
0mlの培地1に接種した。フラスコを、30℃,22
0rpmで攪拌した。72時間後に培養を終了した。分
析によって、3%の基質Iが生成物IIに変換してい
た。
M5935)を、前記と同様にして、生育させた。培養
液100mlを遠心(10,000rpm,10分)で
集め、液体窒素を用いてプラスチックバイアル中に凍結
した。培地1を含む100mlフラスコに、バイアルか
ら各々0.5mlずつを接種し、同時に1gの基質Iを
添加した。分析によって72時間以内に10%の遊離体
Iが生成物IIに変換していた。
M5935)を、実施例6に記載したと同様にして生育
させた。バイアルから0.5mlの接種を行なった10
0ml培養液を、他の成育培養のための予備培養液とし
て用いた。100mlの培地1を含むこれらのフラスコ
に、5mlの予備培養液を接種し、220rpm、30
℃で24時間攪拌した。生育菌体を、遠心(10,00
0rpm、10分)で集めた。湿菌体3g(1つのフラ
スコからの細胞に対応)を、10mlの総容積になるよ
うに、基質I(粉末として添加)と共に緩衝液(pH
6.0、0.05Mリン酸緩衝液)に懸濁させた。基質
Iの30%が、48時間以内に、生成物IIに変換し
た。
M5935)を、実施例1に記載したと同様にして寒天
斜面上で生育させた。生育菌体を生理食塩水(0.9
%)10mlに懸濁させた。この懸濁液1mlずつが1
0個のフラスコ(100ml培地1)に、接種された。
フラスコを、220rpm、30℃で4日間インキュベ
ートした。10個の培養物を、10リットルの回転羽型
バイオリアクター(9,000ml培地1)の接種に用
いた。培養条件:温度:30℃、通気量0.4vvm、
攪拌速度500rpm。44時間培養後、菌体を遠心分
離機(12,000rpmで連続遠心)で集めた。収率
は、lリットルあたり21g湿菌体であった。菌体はい
くつかに分けて凍結保存した。実施例中、凍結細胞1g
を急速解凍し、0.4gの基質Iと共に、pH7.0の
0.05Mリン酸緩衝液に添加した。反応混合液の総容
積は5mlであった。分析結果として、Iの19%が生
成物IIに変換した。
───────────
ン脱水素酵素の吸収スペクトルを示すグラフである。
Claims (15)
- 【請求項1】 酸素とは異なる電子受容体の存在下で、
微生物に由来する酵素であり、L−グロノ−ガンマ−ラ
クトンからL−アスコルビン酸への酸化を触媒する、精
製された状態のL−グロノ−ガンマ−ラクトン脱水素酵
素であって、以下の理化学的性質: a)基質特異性:L−グロノ−ガンマ−ラクトン及びD
−キシロースに高い活性を有し、 b)至適pH:約7〜8、 c)分子量:110,000±2,000(それぞれ6
1,000±1,000、32,500±1,000及
び16,500±500の分子量を有するフラビンタン
パク質、チトクロームCタンパク質及び単純タンパク質
を含む3つのサブユニットからなる)、 d)補欠分子族:フラビン、 e)金属イオンの影響:Cu2+とMn2+は、強い酵素阻
害を示す、 f)電子受容体:酸素とは異なる、 を有するL−グロノ−ガンマ−ラクトン脱水素酵素。 - 【請求項2】 酵素が、バクテリアに由来する請求項1
記載のL−グロノ−ガンマ−ラクトン脱水素酵素。 - 【請求項3】 微生物が、グルコノバクター(Gluc
onobacter)属であり、例えばグルコノバクタ
ー オキシダンス(Gluconobacter ox
ydans)であり、例えばグルコノバクター オキシ
ダンス DSM 4025株と同等の特徴を有するもの
である請求項1または2に記載のL−グロノ−ガンマ−
ラクトン脱水素酵素。 - 【請求項4】 微生物が、グルコノバクター オキシダ
ンス DSM 4025に対応するか、その機能的同等
物、継代培養物、突然変異株もしくは誘導体である請求
項3に記載のL−グロノ−ガンマ−ラクトン脱水素酵
素。 - 【請求項5】 細胞内に請求項1、2、3又は4のいず
れか1つに記載のL−グロノ−ガンマ−ラクトン脱水素
酵素を生産しうる微生物を培養し、細胞を破壊し、破壊
した細胞の無細胞抽出液から単離、精製することを特徴
とするL−グロノ−ガンマ−ラクトン脱水素酵素の製造
法。 - 【請求項6】 微生物が、グルコノバクター オキシダ
ンス DSM 4025株と同等の特徴を有する請求項
5に記載のL−グロノ−ガンマ−ラクトン脱水素酵素の
製造法。 - 【請求項7】 微生物が、グルコノバクター オキシダ
ンス DSM 4025株、その機能的同等物、継代培
養物、突然変異株もしくは誘導体である請求項6に記載
のL−グロノ−ガンマ−ラクトン脱水素酵素の製造法。 - 【請求項8】 請求項1、2、3又は4のいずれか1つ
に記載のL−グロノ−ガンマ−ラクトン脱水素酵素及び
電子受容体の存在下でL−グロノ−ガンマ−ラクトンを
酸化することを特徴とするL−アスコルビン酸の製造
法。 - 【請求項9】 バクテリア、それらの無細胞抽出液又は
細胞の可溶性画分の働きによって、請求項1、2、3又
は4のいずれか1つに記載のL−グロノ−ガンマ−ラク
トン脱水素酵素によりL−グロノ−ガンマ−ラクトンを
酸化することを特徴とするL−アスコルビン酸の製造
法。 - 【請求項10】 アセトバクター(Acetobact
er)属、グルコノバクター属又はストレプトマイセス
(Streptomycesa)属のバクテリア、それ
らの機能的同等物、継代培養物、突然変異株もしくは誘
導体又はその無細胞抽出液を用いる請求項9記載の製造
法。 - 【請求項11】 アセトバクター サブオキシダンス
(Acetobactor suboxydans)又
はグルコノバクター オキシダンスを用いる請求項10
記載の製造法。 - 【請求項12】 基質としてL−グロノ−ガンマ−ラク
トンの存在下、培地中、請求項1又は2に記載のL−グ
ロノ−ガンマ−ラクトン脱水素酵素を生産しうる、グル
コノバクター オキシダンス DSM 4025株と同
等の特徴を有する微生物、その機能的同等物、継代培養
物、突然変異株もしくは誘導体又はそれから得られた無
細胞抽出液の働きによってL−グロノ−ガンマ−ラクト
ンを酸化し、培養液からL−アスコルビン酸を分離する
ことを特徴とするL−アスコルビン酸の製造法。 - 【請求項13】 微生物をL−グロノ−ガンマ−ラクト
ン及び適当な栄養源を含む培地中で培養する請求項12
記載の製造法。 - 【請求項14】 基質濃度が10ないし150g、好ま
しくは約10ないし100g/リットルである請求項1
3記載の製造法。 - 【請求項15】 L−アスコルビン酸が約3ないし14
g/リットル以上の濃度で生産される請求項14記載の
製造法。
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